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[成果]
1700470353
北京
TQ9
应用技术
调味品、发酵制品制造
公布年份:2017
成果简介:葡聚糖酶是一类重要水解酶,能够广泛应用于食品、饲料等行业。葡聚糖酶研究方面存在的问题主要有产酶水平低、应用适应性差、部分水解酶家族结构不清楚等。为了解决以上问题,近年来围绕葡聚糖酶如β-1,3-1,4-葡聚糖酶、β-1,3葡聚糖酶等的发掘、基因克隆表达、酶学性质、晶体结构解析、分子改造等开展系统研究。项目组取得的主要科学发现和价值如下:
1.发现了两种产新型β-1,3-1,4-葡聚糖酶的嗜热真菌,率先完成米黑根毛霉基因组的测序和注释。
选育出拟青霉属新种-嗜热拟青霉J18,首次从发酵液中纯化得到一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶和一种β-耐热葡萄糖苷酶。米黑根毛霉CAU432液体发酵产酶活力达6230 U/mL,为国际上已报道天然菌株产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最高值。同时米黑根毛霉固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达20025 U/g碳源。率先完成了米黑根毛霉基因组的测序和注释,预测10,345个蛋白质编码基因。
2.克隆多个新型葡聚糖酶基因,实现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达。
克隆米黑根毛霉中β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因与已报道的最高氨基酸序列同源性为58%。同时克隆和表达2个糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶基因,两种酶与其他序列同源性分别为68%和60%。另外,克隆嗜热拟青霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并采用密码子优化等策略在毕赤酵母中高效表达,5升发酵罐酶活力55300 U/ml,为已报道的最高水平。
3.率先解析了葡聚糖酶的两个水解酶家族的新结构,揭示了其催化作用机制。
解析了糖苷键水解酶(GH)81家族首个结构即米黑根毛霉β-1,3-葡聚糖酶(RmLam81A)的晶体结构,其催化机制为单一置换,其中Asp475和Glu557分别是质子供体和催化碱。解析了米黑根毛霉GH17家族新型β-1,3-葡萄糖基转移酶(RmBgt17A)的晶体结构,其整体结构呈现TIM桶状,揭示了葡萄糖基转移酶催化糖基转移的作用机制。这也是首个GH17家族葡萄糖基转移酶的结构报道。
4.改造了葡聚糖酶分子,提高了其应用适应性。
定向进化改造了嗜热拟青霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶,显著提高了该酶在酸性条件下的催化活性,最适pH由7.0降低至5.0。基于米黑根毛霉β-1,3-葡萄糖基转移酶RmBgt17A晶体结构,采用理性设计进行了分子改造,突变体水解昆布多糖的比活力较改造前提高了348.5倍。
近年来共发表直接相关SCI论文17篇,累计影响因子65,他引170次。10篇代表性SCI论文累计影响因子46.4,他引145次。获授权发明专利6项。这些成果为葡聚糖酶的研究和应用奠定了基础。