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[博士论文] 杨正飞
生物化工 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:腈水合(EC4.2.1.84)是微生物体内代谢腈类物质的关键之一,可以催化腈水合成相应的酰胺。由于其催化效率高、反应条件温和、环境友好等特点,腈水合已经成功的应用于化学工业中合成酰胺类物质。
  腈水合基因一般以基因簇形式存在,包含α亚基,β亚基和激活蛋白。本实验室前期将来源于Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1的腈水合基因NH08克隆并构建在重组大肠杆菌中。然而,β亚基的表达量远远低于α亚基,激活蛋白表达量也偏低。本文首先通过融合标签策略、双质粒策略、多顺反子策略等一系列研究,使激活蛋白的表达量提高了5.14倍,活提高了44.6%,达到120U/mL。其次,通过同义突变策略,使β亚基的表达量提高了33%,最终活达到160U/mL。比活达到了620.2U/mg,提高了52.9%。再次,通过摇瓶培养条件优化,活达到了1531.2U/mL,OD600达到了15.6。最后在15L罐中进行高密度发酵,活达到了9080U/mL,OD600达到123。
  目前谷氨酸棒杆菌被广泛的应用于代谢工程研究中,利用其为宿主进行蛋白表达的研究相对较少。本文首先通过不同组成型启动子与诱导型启动子比较、密码子优化、RBS序列设计和新型mmp诱导系统的应用等表达策略研究,实现腈水合在谷氨酸棒杆菌中的高效诱导表达,最终蛋白表达量占总蛋白的29.9%,活达到52.4U/mL。其次,通过摇瓶优化,活达到了143.1U/mL,OD600达到了15.6。最后,在10L发酵罐中进行高密度发酵,活达到了1420U/mL,OD600达到了200。
  使用重组大肠杆菌全细胞进行烟酰胺和2,6-二氟苯甲酰胺的制备,最终产物浓度分别达到了439.2g/L和314g/L,转化率都大于99%,具有潜在的应用价值。此外,使用重组谷氨酸棒杆菌全细胞进行烟酰胺的制备,最终烟酰胺的浓度达到了292.8g/L,转化率大于99%,证明了利用重组谷氨酸棒杆菌生产烟酰胺的应用潜力。
[博士论文] 王庆玲
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:在最近的二十年中,作为一个筛分比率逐年增加的海产品腐败菌及鱼类致病菌,嗜麦芽单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)对水产养殖业具有潜在的危害性,其低温下较强的蛋白水解能力是导致海产品腐败和鱼类致病的重要因素。S.maltophilia低温诱导产生的蛋白种类和特性,还没有文献详细报道,而且温度诱导蛋白产生的调控机制也不清楚。本课题针对以上两个问题进行初步的研究与探索:一是对低温诱导产生的蛋白分离纯化,详细了解该的特性及一级结构特征;二是对温度响应蛋白的调控机制进行初步探索。
  (1)通过富集培养的方法从冷冻的南极磷虾中分离得到一株低温下高产蛋白的菌株,通过16S rDNA和生理生化分析鉴定为嗜麦芽单胞菌,命名为S.maltophilia FF11。菌株在低温(15℃和25℃)下产生胞外蛋白活性高,而37℃下几乎检测不到蛋白活性。谱分析表明,S.maltophilia FF11主要的蛋白仅在低温下产生,在37℃并不产生,此蛋白命名为SmtP(S.maltophilia temperature-responsive protease)。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析(Q-Sepharose Fast Flow chromatography)和凝胶筛分层析(Superdex75),从S.maltophilia FF11发酵液中分离纯化出电泳纯的蛋白SmtP;该在高盐(4M)和有机溶剂(50%)环境下具有较高的活性及较强的耐受性。肽指纹图谱分析及基因克隆测序获得了编码该的全基因序列,基因全长为1854bp,编码617氨基酸蛋白的前体(GeneBank序列号为KP399635)。N端测序(LVPND)和质谱分子量(37.4kDa),确定成熟由368个氨基酸组成,获得了该的一级结构序列。
  (2)实时定量PCR和启动子融合分析表明,温度影响SmtP的产生至少发生在转录水平上。利用自杀载体pEX18Tc,采用双亲结合的方法,敲除S.maltophilia FF11一个cAMP受体类似蛋白(cAMP receptor protein-like,Clp),获得Δclp菌株。clp的敲除显著减少了S.maltophilia FF11在15℃和25℃下的蛋白活性,谱结果显示,Δclp菌株不再产生SmtP。实时定量PCR和启动子活性分析表明,Clp能够正向调控smtP的表达。同时,clp的表达同样具有温度依赖性的特征。
  (3)生物信息学分析显示,在S.maltophilia中,四个双组份系统Sm3706/Sm3705、Sm1829/Sm1828、Sm1911/Sm1912和Sm0737/0738涉及胞内第二信使环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)代谢。分别敲除4个响应蛋白发现,Sm3705减少菌株FF11低温下78-82%胞外活性,Sm1828减少50-53%,Sm1912减少了10-15%,Sm0737无影响。谱分析显示,敲除Sm3705完全消除了SmtP的产生,与Δclp菌株具有相似的性状,敲除Sm1828明显减少了SmtP的产生。Sm3706/Sm3705是一个新的未被鉴定的双组份系统,能够响应低温的刺激,命名为LotS/LotR(low temperature sensor and regulator);LotS是一个非经典的感应激,LotR是一个响应蛋白,此蛋白包含了与c-di-GMP代谢有关的GGDEF和EAL结构域及信号接收的REC结构域。LotS/LotR与Clp都能够调控smtP的表达,表明LotS/LotR与Clp处在同一个调控smtP表达的信号传导系统中;ΔlotR和ΔlotS菌株中clp启动子活性及表达分析表明,Clp是LotS/LotR下游的调控蛋白。重组表达LotR体外检测发现,LotR不能合成,也不能降解c-di-GMP。胞内c-di-GMP检测表明,高温生长增加S.maltophilia FF11中的c-di-GMP的水平,而ΔlotR菌株中的c-di-GMP的浓度并不表现明显的高温依赖性的特征,表明LotR参与了温度调控的c-di-GMP水平。ITC结果显示,S.maltophilia FF11中的Clp与c-di-GMP亲和常数在25℃下为Kd=20.3±0.9nM,37C下Kd=22.7±1.1nM,表明嗜麦芽单胞菌中的Clp与c-di-GMP能够结合,而且温度对两者的结合能力没有明显影响。
  (4)生物信息学分析显示,Sm1829/Sm1828与黄单胞菌中的双组份系统RpfC/RpfG具有较高的序列同源性。构建rpfF、rpfC及rpfG敲除菌株及各自的回补菌株,验证S.maltophilia FF11中RpfC/RpfG同样响应DSF分子调控胞外的活性。rpfC及rpfG的敲除对菌株的生长没有影响,却显著减少了菌株FF11在低温下胞外蛋白的活性,谱结果显示,敲除菌株显著减少了SmtP的产生,表明RpfC/RpfG能够响应温度变化调控胞外蛋白的产生。在低温培养下,缺失信号分子DSF明显减少了胞外蛋白的活性,在37℃下外源添加DSF或者过表达RpfF蛋白均不能增加胞外蛋白的活性,表明DSF仅在低温下能够调控胞外蛋白的表达。RpfG活性表明,S.maltophilia FF11中RpfG的活性依赖于DSF信号分子和低的生长温度两种信号。
  综上,本论文分析了S.maltophilia FF11中外泌蛋白SmtP的主要特性,并解析了SmtP的一级结构序列;发现调控smtP表达的转录因子Clp及其上游调控因子LotS/LotR,并对LotS/LotR/Clp信号传导系统响应温度变化的机制进行了初步研究;发现S.maltophilia FF11中,RpfC/RpfG作为感应群体信号分子DSF的双组份系统,可同时响应温度刺激,共同调控胞外的产生。
[硕士论文] 张丽洁
微生物与生化药学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:漆(laccase)是一种含铜的多酚氧化,具有广泛的底物谱,能够氧化多种有机物质,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。
  本研究从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆基因lac1,其全长1803bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS148.51(XP_001228806)的多酚氧化序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆基因。将lac1基因克隆入大肠杆菌表达载体pET30a时,构建重组表达载体pET30a-lac1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组并没有表现出活,且为不溶性表达,经优化培养条件,结果显示活没有提高,未改善可溶性表达的情况;将lac1的基因片段克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-lac1,活测定结果和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3L发酵罐中发酵培养,Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,活性达到1.3U/mL发酵液,是摇瓶发酵活结果的10倍。学性质分析结果显示,漆的最适作用温度为65℃,最适反应pH值为4.5,且在pH6-11的范围内的相对活力均在70%以上。为从真菌中发掘学性质优良的新的漆奠定了基础。
  为了提高地衣芽孢杆菌来源漆CotA的表达水平,本文从稀有密码子的同义突变方向对目标基因自身进行了优化。通过改善序列中精氨酸的密码子使用,将cotA基因中的使用精氨酸稀有密码子的位点进行密码子的同义突变,将CGT/CGA突变为CGA/CGT。cotA基因序列的第534/747/1317/1533位的T突变为A,以及第738/918位的A突变为T,同时将这些突变体基因克隆入表达载体pET30a,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,测定漆活,与野生型相比,第534位点突变体的活下降,第738位点的突变活没有改变,其它的突变体活均有所提高,突变位点越接近基因的C端活越高,最末尾的第1533位点突变体的活是野生型的2倍。为提升漆的表达量提供了新思路。
  此外,有报道称分子伴侣可以改善外源蛋白的分泌表达情况,为了改善毕赤酵母中漆的表达,将能够影响外源蛋白表达及分泌的分子伴侣与漆基因共表达。本研究中在已有报道的分子伴侣中筛选出8种功能型分子伴侣基因(GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1/PDI),分别克隆入载体pGAPZA或者pPICZA上,分别构建了10种重组载体(pGAPZA-GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1和pPICZA-GCN4/BMH2/PDI)。转入本实验室已成功构建的含有漆基因cueo的酵母菌株GS115/pPIC9-cueo中实现共表达,获得10种重组工程菌株,在培养的过程中,分别共表达载体pPICZA-GCN4/BMH2/PDI的菌株转化子多且有活,其它菌株转化子较少,并且没有检测到活。将有活的菌株发酵培养,并测定培养上清的活性,结果显示共表达分子伴侣BMH2和PDI的漆活分别提高了80%和20%。为提升漆的表达量提供了新思路。
  本研究首先筛选到了一株新的漆基因,并发现了该的最适温度、最适pH及稳定性的学性质,另外还得到了两种能够提高漆表达量的思路,一方面可以通过突变漆中精氨酸的稀有密码子,另一方面可以通过与分子伴侣共表达。为漆的应用奠定基础。
[硕士论文] 李春雨
发酵工程 哈尔滨商业大学 2018(学位年度)
摘要:过氧化物(POD)可用于催化过氧化氢氧化有机化合物。天然POD在处理工业废水、分析食品中微量酚、医学临床分析和合成酚类聚合物等许多领域被广泛应用。目前应用最广泛的是辣根过氧化物(HRP),天然HRP价格昂贵,而且容易失活,由于其分子较大,所以在联免疫分析过程中,抗原和抗体很难结合,难以被标记。因此在催化反应中,寻找一种模拟和催化体系来代替HRP,并提高模拟催化反应灵敏度是当代科学家们关注的焦点。本论文借助甲烷氧化菌素(Mb)的铜配合物具有过氧化物活性及纳米金大的比表面积和高的电子翻转速度等特点,采用甲烷氧化菌素功能化纳米金的铜配位组装来设计合成高效POD模拟。主要研究内容如下:
  利用甲基弯菌IMV(Methylosinus trichosporium IMV3011)产生的Mb,通过Cu(Ⅱ)添加过程中Mb的UV-可见光谱及荧光光谱变化,发现配合物中的配体4-羟基-5-硫酰咪唑(HTI)和4-硫酰-5羟基咪唑(THI)可能在金属配合物的高氧化态Mbn-Cu*稳定性中起着至关重要的作用,推测Cu(Ⅱ)与Mb可能存在Mb-Cu、Mb2-Cu和Mb4-Cu三种不同的配位形式,并对三种配位形式的催化能力进行研究,结果发现三种Mb/Cu配合物都具有较强的过氧化物活性,而且Mb/Cu不同配位形式影响其活性,Kobs分别为6.11×10-4s-1,8.28×10-4s-1和4.16×10-4s-1,不同配位的反应速率常数提高了400~800倍。其中过氧化物活性最高的是二配位,这可能是因为Mb2-Cu配合物结构可能更有利于在氧化剂作用下形成过渡态Mb2-Cu*,因此它活性表现为最高,由此确定Mb/Cu的最佳配位方式为Mb2-Cu。
  利用Mb和Cu之间的不同金属配位作用介导Mb功能化纳米金粒子的组装,构建纳米复合体系。向Mb修饰的纳米金中加入适量Cu(Ⅱ)或Mb-Cu诱导,发现Cu(Ⅱ)和Mb-Cu都在AuNPs表面形成了Mb2-Cu配位,这可能是由于Mb2-Cu形式的Cu(Ⅱ)和Mb之间具有高亲和力。对两种组装形式进行过氧化物活性的检测,结果发现它们的Kobs比直接加入Cu(Ⅱ)或Mb-Cu时分别快3个和1个数量级,这说明纳米金的高电子传递能力和纳米簇中多活性中心产生的协同效应可以大大提高模拟的催化效率。在此基础上,对Mb2-Cu稳定的纳米簇结构进行动力学研究,确定了最佳反应条件:最适pH为7.0,最适过氧化氢浓度为6×10-3mol/L,对苯二酚最适浓度为4×10-4mol/L,反应温度最适为70℃。实验结果表明构建的纳米比天然POD稳定性更高,符合一般生物催化剂的催化规律,可以用来作为天然POD的替代物。
  主要对甲烷氧化菌素功能化纳米金粒子的铜配位组装进行直接电化学研究,讨论了扫速、pH、修饰时间等因素对修饰电极的影响,确定最佳电化学反应条件。研究结果表明对于Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极,当扫速在100mV/s,pH7.0,修饰时间16h时是修饰电极的最适组装条件。对Mb2-Cu稳定的纳米金和Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极进行计时电流响应测试,结果发现两种修饰电极在5.0×10-5~5.0×10-4mol/L浓度范围内,电流与H2O2浓度之间线性关系良好,表观米氏常数分别为0.805mmol/L和0.793mmol/L,该数值较小,说明两种自组装电极对于H2O2的还原都具有高亲和力,对H2O2的检出限分别为1.1×10-5mol/L和0.9×10-5mol/L。综上所述,有理由认为Mb2-Cu介导的纳米金簇比Mb2-Cu稳定的纳米金具有更高的过氧化物催化活性,该结果与溶液中得到的结论一致。
[硕士论文] 张伟
食品科学 哈尔滨商业大学 2018(学位年度)
摘要:通过光谱法和电化学方法分析甲烷氧化菌素(Methanobactin,Mb)与铜的配合物模拟超氧化物歧化(superoxide dismutase,SOD)的活性,并进一步应用于电化学生物传感器。
  Mb是由甲烷氧化菌分泌到细胞外捕获和运输Cu2+的小分子荧光肽,它具有配合Cu2+等金属离子的能力,其铜配合物(Mb-Cu)可以清除超氧阴离子。实验第一部分从ethylosinus trichosporium3011发酵液中提取Mb并与Cu2+配合成Mb-Cu,分别采用紫外光谱和荧光光谱考察了邻苯三酚自氧化的线性时间以及有Mb-Cu参与的荧光激发波长,确定邻苯三酚的自氧化线性时间是90s,荧光激发波长为446nm。进一步考察了不同条件(EDTA-Na2的浓度、缓冲溶液的pH值、Tris-HAc缓冲溶液浓度、邻苯三酚浓度、温度和Mb-Cu浓度)对邻苯三酚自氧化的影响,从而评价Mb-Cu模拟SOD的活性。讨论认为,当EDTA-Na2的浓度为2mmol/L,溶液的pH值为8.2,Tris-HAc缓冲溶液浓度为0.05mol/L,温度为20℃,邻苯三酚浓度为0.363mmol/L时,浓度为0.8mg/L的Mb-Cu表现出良好的SOD生物活性,能有效抑制超氧阴离子(O2-)。在此光谱分析条件下Mb-Cu模拟SOD活性稳定。
  实验第二部分按照柠檬酸钠还原法制备了粒径大小在10~50(11.5、15、35、42、50)nm的纳米金(AuNps),并对其进行了TEM扫描,可以观察到制得的纳米金颗粒表面光滑、大小均匀。将粒径为15nm的AuNps依次组装Mb和Cu2+并进行了红外光谱的表征,证明Mb与Cu(Ⅱ)是通过Mb结构中的-OH或酚-OH配合。又将15nm的AuNps与具有不同类型官能团的交联剂缔合,并利用紫外光谱、荧光光谱、红外光谱和TEM透射电镜表征,其中β-巯基乙胺可与AuNps与Mb-Cu之间建立更紧密的结合,形成树状纳米簇结构。分别考察了AuNps粒径、AuNps∶Mb-Cu摩尔比、交联剂种类和Mb-Cu.交联剂摩尔比对邻苯三酚自氧化的影响,并通过光谱分析认为当AuNps粒径为15nm、AuNps Mb-Cu摩尔比为1∶150、交联剂选择β-巯基乙胺、Mb-Cu·β-巯基乙胺摩尔比为1∶3时,Mb-Cu-Au模拟活性最高。改变SOD活性测定体系发现,与黄嘌呤氧化法相比,模拟活性基本一致且方法稳定。
  实验最后一部分在01M的Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的探针溶液中对空白、Au/β-巯基乙胺/AuNps、Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb和Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极进行了比较,通过循环伏安(CV)和交流阻抗(EIS)扫描得出Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极是以单层膜组装到金电极上,AuNps的存在可以加速异相电子传递,Cu2+反之。在研究SOD模拟自组装膜时,分别讨论了邻苯三酚自氧化基质作为探针溶液时,不同电解质、电解质浓度、邻苯三酚反应时间、邻苯三酚添加量和扫速对电极感应电流的影响,讨论认为当电解质KCl的浓度为0.3mol/L、超氧阴离子积累时间为3min、邻苯三酚添加量为20μL及扫速为300mV/s时,电极对电流的感应程度最高。并考察了不同模拟及组装方式、不同交联剂种类对模拟在电化学中对抑制邻苯三酚自氧化的影响,认为以β-巯基乙胺作为交联剂,以层层组装的形式组装的Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极的SOD模拟活性最强。该自组装膜检验测定电流的重现性较好,且有良好的稳定性和使用寿命。
  本文利用Mb-Cu模拟SOD,通过光谱法和电化学方法确定了模拟的活性。建立的SOD模拟自组装体系具有良好的重现性、稳定性,在检验O2-浓度方面有较好的应用前景。
[博士论文] 田甜
结构生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:在有丝分裂的过程中,偶联的姐妹染色单体准确平均分配到两个子细胞中,完成遗传物质的传递,对于维持遗传稳定性和物种连续性至关重要。姐妹染色单体的平均分离主要依赖于动粒在着丝粒区的组装。着丝粒是染色质上一段结构和功能都高度特化的区域,在该区域H3被其变体CENP-A所替代。动粒是在着丝粒区组装的一个大的蛋白复合体,负责为姐妹染色单体与纺锤体微管的连接建立承载区。动粒主要包括:内层CCAN蛋白质网络和外层KMN蛋白质网络。CCAN蛋白网络又可划分成五组亚复合物:CENP-C、CENP-LN、CENP-HIKM、CENP-TWSX和CENP-OPQUR。其中,CENP-N能够特异性识别CENP-A核小体,招募CENP-L,完成CENP-A所携带遗传信息的解码和起始动粒蛋白的招募。
  在本文第一篇中,我们解析了CENP-LN/CENP-A-NCP复合物的冷冻电镜结构,整体分辨率为5.8(A)。CENP-N通过其C端约100个氨基酸与CENP-L相互作用,形成一个异二聚体,与溶液中聚集状态相吻合;通过其N端约200个氨基酸与CENP-A核小体直接相互作用,其中,CENP-A L1 loop上的R80、G81和D83对CENP-N特异性识别CENP-A核小体具有重要作用,另外,CENP-N氨基端的碱性氨基酸还可以与核小体DNA上的四个位点的磷酸骨架直接相互作用,进一步稳定两者的结合。DNA上的这四个位点分别为:第+37/+36位核苷酸、第-32/-31位核苷酸、第+26/+25位核苷酸和第-22/-21位核苷酸。我们通过体外结合实验验证了CENP-N上与DNA结合的关键氨基酸残基有K10A、R11A、R44A和H77A。在体内,与DNA相互作用的关键氨基酸位点的突变,显著减弱了CENP-N自身及CENP-L等动粒蛋白的定位,说明CENP-N与核小体DNA的结合,对CENP-N在动粒上的定位和其他动粒蛋白的招募至关重要。而且,在不同物种中,为了维持这种“解码”机制的保守性,CENP-N可与CENP-A共同进化。
  糖酵解过程是所有生物体进行葡萄糖代谢产生ATP供能的必经阶段。在糖酵解过程中,己糖激、磷酸果糖激、丙酮酸激被认为是关键,有它们催化的反应是不可逆的。其中,磷酸果糖激的催化效率较低,是最为重要的调控关键,功能单位为四聚体,以ATP为磷酸供体,催化F6P转变为FBP,并产生一分子ADP。它是一种经典的别构,通过R-state和T-state的构象转变来调节自身的催化活性。
  在本文的第二篇中,我们利用E.coli表达了金黄色葡萄球菌的Pfk,它在溶液中存在二聚体和四聚体两种状态,且蛋白浓度越高四聚体越多,而且这种四聚体状态可以被低pH,或ADP,或ATP,或AMP-PNP诱导解离为二聚体形式,但是也可以被其底物F6P所稳定。我们通过解析Pfk及其与不同配体复合物的结构发现:Sa_ Pfk、Sa_Pfk/ADP、Sa_Pfk/ATP和Sa_Pfk/AMP-PNP的结构为二聚体,Sa_Pfk/F6P和Sa_Pfk/F6P/AMP-PNP的结构为四聚体。通过结构分析,我们认为Sa_Pfk所特有的G150-L151 motif的柔性赋予了α7-helix“开关”的功能,在F6P的协同作用下,调节自身二聚体-四聚体间的转换,从而调控的催化活性。
[硕士论文] 张苹苹
分析化学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:尿嘧啶-DNA糖基化(UDG)对DNA中尿嘧啶特异性识别和移除,属于尿嘧啶损伤修复蛋白,它通过识别DNA中的尿嘧啶并切断尿嘧啶与脱氧核糖之间的N-糖苷键来移除尿嘧啶(U)碱基,产生无碱基或无嘧啶(AP)位点,启动碱基切除修复路径,然后结合其他蛋白完成整个DNA损伤修复过程。它在碱基切除修复路径中具有重要的作用,可维持基因组完整性。鉴于以上分析,本文利用碱基切除修复的荧光生物传感方法对UDG活性进行灵敏、准确检测。本文共分为三章:
  第一章为绪论,概述了碱基切除的产生原因和机理、UDG的结构和功能、研究意义以及分析归纳了目前关于UDG活性的传统检测方法和新型生物传感检测方法,并指出检测方法中存在的问题。
  第二章构建了一种基于自引物自模板循环滚环扩增(Self-RRCA)策略用于UDG活性的灵敏和准确检测。首先,设计了含有一个U的不成熟的模板链,它与引物链部分互补,形成一个前体扩增子识别探针。经UDG和内切Ⅳ(endoⅣ)作用后,前体扩增子探针发生构象转变,进而形成一个RCA扩增子。然后RCA扩增子被用于触发RCA反应,经Nt.BbvCI切刻作用,新的扩增子被释放来触发下一轮RCA,这就构成了一个Self-RRCA。在这个方法中,设计的不成熟模板与引物在连接部分不完全互补,这可有效地避免非特异性连接,最终有效地避免非特异性扩增。相比线性RCA,Self-RRCA展现了更高的扩增效率。由于以上优势,本方法实现了UDG的灵敏和准确检测,检测限低至5×10-5UmL-1。而且,这个方法用于筛选UDG抑制剂和分析HeLa细胞裂解液中的UDG活性。这个方法将会提供一种有前景的分析工具用于进一步的UDG生物研究和临床诊断。
  第三章构建了一种基于内源性触发的DNA walker用于胞内检测UDG活性。首先,金纳米颗粒上修饰有3'端标记荧光团FAM的且含有U碱基的底物链(SR)和DNA walker链(DW)。由于荧光共振能量转移,金纳米颗粒将SR上荧光淬灭掉。其次,DW上有一部分与SR碱基互补,在目标物UDG作用下,尿嘧啶碱基被移除,产生AP位点。紧接着在AP内切(APE1)作用下,将AP位点切割,底物链被切断后荧光恢复。随后,DW继续与下一条SR杂交,产生增强的荧光信号。此策略中,首先,DNAwalker的运行是由胞内内源性触发的,无需外加蛋白或其他任何物质,保证了DNA walker在胞内的正常运行。其次,由于金纳米颗粒上DNA局部浓度增大,可进一步促进切反应和底物链的卸载,这有利于DNA walker的快速反应和荧光释放,最后,由于DNA负载到金纳米颗粒上可有效避免胞内核酸对DNA链的降解。本文提出的这一策略将为胞内检测其他DNA修复提供一个重要的工具。
[硕士论文] 张斯然
化学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,以质谱为分析平台的糖链分析研究取得了很大程度进展。糖链的释放和衍生化等样品制备方法不断得到丰富和改进,糖链的各种分析策略相继建立起来,本文主要对糖链的定性分析方法做分析和总结。本论文采用化学标记法,标记是糖基化分析的最有前途的方法之一,因为其简单:标记发生在消化过程中,可以避免额外的试剂,额外的步骤和副反应。化学法因其温和的反应条件、高度的空间区域选择性,避免了化学合成繁琐的保护步骤而成为研究的热点,为研究糖蛋白中的N-糖链,提供了新的思路。
  第一章绪论的主要内容是糖蛋白糖链现状以及与疾病有哪些关联,并且详细说明糖蛋白的组成结构和应用。目前研究糖链的方法多用PNGase F,但本文使用了胰蛋白,所以绪论部分对此进行了简短介绍和说明,同时对最后一步转糖基Endo-M N175Q的作用及优点做出详尽解释。
  第二章实验部分,着重说明实验所需各种溶液的配制,以及实验过程中涉及的脱盐,胰蛋白切,丙酮富集糖肽,反应条件及方法,并且通过最后优化的方法对三种标准品进行定性检测分析,结果较好。
  第三章结果与讨论中,着重探讨了三种糖蛋白分析方法,其中方法一是糖蛋白在Endo-M N175Q的作用下,直接将寡糖转移到受体上。方法二使用PNGase F对糖链进行分析,将寡糖转移到受体。而第三种方法是本文着重讨论的方法,用胰蛋白将糖蛋白切,对肽链进行丙酮富集,而现在大多数论文的一般方法都是对肽段进行分析,而本文方法具有新颖性,采用丙酮富集糖肽的方法,将寡糖转移至受体后与175Q反应,经过谱图检测后发现丙酮富集糖肽方法效果非常好,随后细致的探讨了各步骤反应条件优化情况,确定了最终方法。然后将此方法应用于三种标准糖蛋白,分别是牛胰核糖核酸B,卵清蛋白,胎球蛋白。
  其中着重突出了丙酮在-25度冰柜中,以及5倍体积量富集糖肽效果最好,检测到的糖肽链最多。通过糖链在丙酮和水中的溶解度不同,而形成清液和沉淀,接着对沉淀进行丙酮富集,得到丰富的糖链信息。最后用Endo-M的突变体175Q进行转移,效率高,结果好。以牛胰核糖核酸B共检测到5种糖链,分别是M5N2,M6N2,M7N2,M8N2,M9N2。卵清蛋白检测到5种,分别是M5N2,M6N2,M8N2,M3N4,M3N6。胎球蛋白检测到6种,分别是M3N4G2,M3N4G2Ac2,M3N4G2Ac3,M3N5G3Ac, M3N5G3Ac2,M3N6G4Ac4。本文建立高效、高选择性的丙酮富集糖肽方法,利用175Q转糖基反应特性,使用化学衍生化法对糖蛋白进行定性定量分析。
[硕士论文] 李旭
药学 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:在现在的市场中,对手性醇的需求比较大,以及对生物体内的醛酮内物质毒性比较大,所以醛酮还原有较大的科研价值。醛酮还原是在NADH存在的情况下催化前手性羰基化合物韵不对称还原相应的手性醇的。这些通常在温和的反应条件下对很广的底物显示的高立体选择性。由于其优良的选择性和环境相容性,近年来醛酮还原已普遍用于工业药物的合成。酿酒酵母醛酮还原GRE2蛋白就是一种应激蛋白。GRE2是一种可以还原醛酮类化合物的氧化还原,可以减少醛酮类物质的累积。
  葡萄糖脱氢(GDH)是短链醇脱氢家族的成员,由四个相同的亚基组成,它催化氧化β-D-葡萄糖将它的羰基氧化成醇,它将还原型辅Ⅰ(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)上的质子氢转移到羰基上,余下烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+),它拥有双重的辅因子特异性。利用这个特性,把它和GRE2联用,组成一个循环反应,GRE2利用辅NADPH将醛酮类物质还原成醇,GDH又将NADP+还原成NADPH,可在反应中循环利用。
  在本文中我构建了三种GRE2和GDH的体系的质粒,分别是GRE2和GDH同时在一个含内含肽的载体上,分别将两种装在单载体上,还有将GRE2和GDH分别装在含多肽的单载体上,分别探索这三种体系的活和的稳定性以及二级结构。发现有内含肽和多肽的双体系,在的活性和稳定性方面都比混合单好。可以在后期运用于工业化生产中。
[硕士论文] 姜淑喆
生物工程 山东大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素是植物细胞壁的主要成分,是自然界中最丰富的聚合物,也是取之不尽用之不竭的生物能源,是目前最为热门的研究材料之一。利用纤维素将纤维素转化成单糖,通过微生物发酵过程将单糖转化成乙醇等生物燃料,其具有重要的应用前景。纤维素水解为单糖,需要一系列纤维素的作用,而β-葡萄糖苷作为这一过程中的限速,起着至关重要的作用,是利用天然纤维素材料的瓶颈。
  近年来,大量文献表明占据白蚁总数75%的高等白蚁具有较强的降解纤维素的能力。本文以高等培菌白蚁黄翅大白蚁Macrotermes barneyi为研究对象,前期在中肠克隆得到的β-葡萄糖苷基因(MbmgBG1),其属于GHF1家族,与其他来源的β-葡萄糖苷相比,具有较高的葡萄糖耐受性,但活力低、热稳定性差,限制了β-葡萄糖苷在食品领域以及工业领域的应用。为了得到学性质较好的β-葡萄糖苷,我们进行了以下研究:
  1.黄翅大白蚁由来β-葡萄糖苷的分子改造。先前研究了高等培菌白蚁黄翅大白蚁自身来源的β-葡萄糖苷,对其转录组进行分析,只有一个GHF1家族的β-葡萄糖苷(MbmgBG1)有活性,其葡萄糖耐受性高(1.5mol/L的葡萄糖,保持60%以上的活力),但活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。我们对其高度保守区域附近的非保守氨基酸进行定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比野生型分别高出约2倍和4倍。突变体的Kcat/Km值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比野生型强。当活力保留60%以上时,野生型所耐受的葡萄糖浓度为1.5mol/L,而F167L为2.0mol/L,R354K为3.0mol/L。
  2.大白蚁营发酵单胞菌Dysgonomonas macrotermitis由来β-葡萄糖苷的研究。高等白蚁是天然降解纤维素模式生物中降解能力最高的,几乎能完全降解自身食用的天然纤维素材料。白蚁自身的β-葡萄糖苷远远不能完全降解白蚁食用的纤维素材料,但白蚁肠道内的共生微生物具有较强的纤维素降解能力。其中黄翅大白蚁后肠内分离得到的D.macrotermitis菌株(后肠内的第二优势菌群)具有较高的纤维素活力。我们对在D.macrotermitis的β-葡萄糖苷基因进行分析研究,共发现了15个的β-葡萄糖苷基因,进行异源表达后,其中6个具有活性。
  3.大白蚁营发酵单胞菌Dysgonomonas macrotermitis由来β-葡萄糖苷(DysbglE)的表达与分析。对D.macrotermitis由来β-葡萄糖苷活性最高的DysbglE进行核苷酸序列分析。DysbglE的基因含有一个开放阅读框架(ORF),2286个碱基对编码一个多肽,其中66个碱基对编码的为信号肽,属于GHF3家族。去除信号肽,在大肠杆菌JM109中异源表达,分子量为80.15kDa,通过分子筛分析推测其可能为同源二聚体,在DysbglE的催化反应中Arg612和Phe623起到至关重要的作用。对DysbglE学性质分析,其最适反应温度和pH分别为45℃和5.5;以pNPG为底物时,Km值和Vmax分别为1.4mM和666.67U/mg;葡萄糖耐受性较差,IC50为0.1mol/L。
  4.β-葡萄糖苷基因(DysbglE)在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及产条件优化。在食品领域中,β-葡萄糖苷可作为食品添加剂和水果风味增香剂,这要求我们使用易于纯化、安全性高的表达系统。枯草芽孢杆菌具有长期制备发酵食品的历史,属于一般公认安全(GRAS)微生物范畴,具有蛋白质分泌能力。所以我们选择枯草芽孢杆菌WB800N异源分泌表达β-葡萄糖苷,更有利于促进β-葡萄糖苷在食品领域的应用。本实验在枯草芽孢杆菌WB800N中成功分泌表达了β-葡萄糖苷DysbglE,并利用响应面分析优化其发酵条件,比最初表达量提高了4-5倍。
  总之,本文首先改造了黄翅大白蚁自身的β-葡萄糖苷基因MbmgBG1,其次分析了D.macrotermitis由来的全部β-葡萄糖苷基因(15个),它们都属于GH3家族,其中6个在大肠杆菌中表达,对其中活性最高的β-葡萄糖苷(DysbglE)进行了详细的学性质研究。同时利用枯草芽孢杆菌表达系统成功分泌表达了β-葡萄糖苷DysbglE。本研究使我们更加深入的理解了白蚁对纤维素材料的降解能力,同时也为研究白蚁及其共生微生物的共生机制奠定了基础。
[博士论文] 齐恩凤
应用数学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:随着高通量技术在蛋白质组学中的应用,越来越多的蛋白质在被蛋白断裂之后,通过质谱鉴定出来。在这个过程中,需要预先对蛋白质组中的所有蛋白进行模拟切,如何选择合适的蛋白来对蛋白质进行裂解是非常重要的。用来切的蛋白要具有很强的特异性,这种特异性通常是在活性位点中通过与底物的相互作用来表现的。蛋白对裂解底物的特异性是研究蛋白的生化性质中很重要的一步,对于理解蛋白在新陈代谢以及疾病中所发挥的作用是非常重要的。而随着蛋白的底物信息量的增加,如何更全面地获取数据中有用的信息来分析蛋白的底物特异性,是生物信息学面临的一大挑战。
  目前,在蛋白的特异性研究中,无论是实验方法还是量化分析,通常都是基于这样的假设,即蛋白的活性中心区与底物序列上每个氨基酸残基的结合均是一个完全独立的过程。事实上,蛋白活性中心某个位点上结合的底物氨基酸残基经常会对别的位点上氨基酸残基的结合起到积极地促进或者消极地抑制作用。现有的量化方法,通常是针对于底物序列中单个位点上的氨基酸信息进行计算,无法反映出位点之间的相互影响。而目前在探讨位点之间关系的文献中,也仅仅是通过实验方法研究了个别蛋白在部分位点之间的作用,并没有给出量化的方法来衡量这种合作关系。
  了解位点之间的合作关系是全面理解蛋白的活性位点的作用以及怎样确定蛋白的活性的基础,同时也有助于开展相关的研究,如鉴定新的底物序列以及设计新的肽段来抑制蛋白的活性等。为此,我们首先从MEROPS数据库获取了底物序列信息,为避免假阳性,利用了贪婪算法除去冗余的底物序列,再对有效底物序列信息展开分析,建立了位点之间的组合模型,并给出了分析蛋白特异性的算法。另外,在基于底物序列信息的基础上,还提出了量化蛋白相似性的一个新方法。
  我们首先针对在底物序列断裂键附近连续位点的氨基酸,提出了一个基于块的量化的方法。结果发现,该数据集中大部分的蛋白在其底物断裂键附近常存在有显著性的氨基酸组合。这些组合表明了蛋白底物在距离断裂中心比较近的位点比距离断裂中心比较远的位点上具有更强的合作关系。
  在底物序列中的众多位点组合中,以底物的断裂键为中心,我们又提出了一种新的量化方法。我们给出三种类型的位点组合模型,分别是二元组、三元组和四元组。结果发现,在各类型的位点组合中均可以识别出偏好的氨基酸组合。结合了单位点特异性的三种类型的位点组合模型,能够更好的反应蛋白的位点组合特性。而且,我们的方法也可以推广到三种类型以外的其他位点组合。
  块的模型和多元位点组合模型主要分析了蛋白在底物中偏好的氨基酸组合。我们在分析了蛋白底物序列信息的基础上,提出了一个量化方法,首次对各位点之间可能不合作的氨基酸组合进行分析。与其它方法相比,该方法可以明确地找到每个位点上的每个氨基酸对其他位点上氨基酸的不合作性,为蛋白的特异性研究提供了一种新的思路。
  利用底物序列数据信息,我们还给出了一个新的衡量蛋白的相似性的量化方法。基于每个蛋白结合位点上的底物信息,构造出一个L×20维的向量,其中L是位点长度。为了使这个向量尽可能地反映出蛋白之间的关系,我们将向量中的元素进行排序,得到一个秩向量。根据秩向量计算得到蛋白之间的相似性,用可视化方法将蛋白之间的差异性用进化树表现出来。与其它方法相比,在我们构建的进化树中,几乎所有同源的蛋白都聚在小分支中,而且属于同一种催化类型的蛋白也较为集中的聚在一起,可以更好地反映蛋白家族成员之间的亲缘关系。
  综上,在基于底物序列信息的基础上,本文在位点组合模型以及蛋白相似性的量化分析中都得到了很好的结果,而且这些方法都具有可推广性,为蛋白特异性的研究做出了一定的贡献。同时,这些量化方法将为预测蛋白的断裂底物及蛋白相关的靶向药物的设计和研发提供理论基础。
[博士论文] 蒋绪恺
微生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源,通过纤维素的催化降解,纤维素能够水解成为可溶性糖,经过生物炼制可以转化为生物燃料和多种化工制品,这为解决当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。显然,纤维素催化性能的提升是加快纤维素生物转化过程的关键步骤,认识纤维素催化过程的分子动态机理变成了一项十分必要的工作。虽然纤维素的实验设计工作已经有很多成功的先例,但受限于传统实验方法的表征能力,目前对纤维素结构,分子动态和功能关系的理解尚不深入。因此,本文主要利用分子动力学模拟方法,结合其它生物信息学分析手段探究了决定不同糖苷水解家族中纤维素催化性能的分子动态行为,这为认识纤维素催化过程的分子动态提供了全新的内容,同时为蛋白质工程设计提供了策略上的指导。
  本论文开展的相关研究工作及主要成果如下:
  1.通过对GH12家族中具有相似折叠结构却有完全不同热稳定性的多个纤维素分子动态分析,阐明了活性中心的分子动态稳定性和三维结构的稳定性是GH12家族纤维素热稳定性的关键因素,两者协同决定了的最适催化温度,这为全面认识分子的热失活过程和蛋白质热稳定性的理性设计奠定了基础。
  通过构建温度梯度的分子动力学模拟体系,分析了在温度逐渐升高的过程中分子整体结构和活性中心动态的变化情况。结果显示:1)在常温条件下,所有的分子都能保持整体结构的稳定性;温度升高后,主成分分析结果表明活性中心的动态和协同运动模式被高温扰动,且扰动程度与GH12家族纤维素的热稳定性呈显著负相关。2)随着温度的逐步升高,中温纤维素的N末端区域首先发生去折叠,随后中等嗜热和超嗜热的N末端区域高级结构发生去折叠。更重要的是,N末端内部的相互作用与GH12家族纤维素的热稳定性呈显著正相关,这说明了N末端区域可能是GH12家族纤维素结构稳定性决定因子。3)分子的热失活过程分为可逆性阶段和不可逆阶段,GH12家族纤维素活性中心的动态稳定性以及N末端的结构稳定性是影响这两个阶段的重要机制,两者相互独立又相互协同决定了分子的最适催化温度。通过生物信息学分析揭示了嗜热内部具有更复杂的相互作用网络,它不仅帮助稳定活性中心的动态平衡,还增强了蛋白质整体结构的稳定性。
  2.建立了分子活性中心构象动态行为的表征方法,探究了活性中心构象动态的主要影响因素,多角度证明了活性中心天然构象动态在纤维素催化过程中的多个阶段发挥着至关重要的作用。
  基于分子动力学模拟,我们建立了一套活性中心在整体结构水平、二级结构水平和氨基酸残基水平的构象动态分析和表征方法。利用这种方法,研究了活性中心构象动态的主要影响因素。对活性中心构象动态及其协同运动模式进行了分析,结果显示,高温可破坏活性中心天然构象的动态平衡,从而导致分子的可逆性热失活过程。通过对活性中心周围loop运动状态以及氨基酸残基构象动态的分析,证明了活性中心的开关运动和功能残基的构象选择是对底物结合的必要条件。研究还揭示了底物结合对活性中心构象动态平衡的恢复具有抑制效应,而这可能是连续催化体系中纤维素活性逐渐丧失的关键因素之一。这些结果阐述了催化过程中活性中心的构象选择具有明确的路径,对活性中心构象动态平衡的破坏或是对构象选择路径的干扰都会对分子的催化性能产生不利的影响。
  3.通过对GH5、GH7和GH12三个家族的20种纤维素活性中心氨基酸残基的构象动态分析,揭示了氨基酸构象动态在活性中心不同位点上的选择偏好性,从分子进化的角度证明了活性中心构象动态的优化是蛋白质功能进化的另一种途径。
  研究中选择了GH5、GH7和GH12三个家族中20种纤维素作为研究对象,依次表征了它们活性中心数百个氨基酸残基的构象动态,通过分析同一家族内不同成员活性中心对应位点上氨基酸残基的构象分布情况,确定了活性中心各个位点的上氨基酸构象动态的偏好性。结果显示活性中心某些位点上的氨基酸残基只具有一种优势构象,而另外一些残基则具有多种不同的优势构象,而且这种规律在GH家族内是普遍存在的,这暗示着在催化过程中这两类残基可能发挥着完全不同的作用。更重要的是,对家族内不同成员活性中心整体动态特征的比较分析揭示了活性中心的构象动态具有明显的演化趋势,这从进化的角度证明了活性中心构象动态的组合优化可能是蛋白质功能进化的另一种途径。
  4.根据不同糖苷水解家族中功能机制的研究结果,提出了蛋白质动态组学的概念,并构建了以蛋白质家族为模型的比较分子动力学模拟体系。
  针对多个糖苷水解家族中纤维素的热稳定机制、蛋白质动态影响因素和蛋白质动态演化的研究过程中,采用了高性能计算集群,构建了一个包含蛋白质结构动态信息的大数据集合,对这些分子的分子动力学模拟系统分析挖掘了更多原子水平的信息来理解蛋白质功能发挥的分子机制。由于高性能计算资源的限制,只选择家族内有限数目的分子,通过对不同家族内分子动态特征的变化趋势与功能性质之间的相关性进行定量分析,可以判断某种结构动态特征是否具有真正的功能意义,这就是蛋白质分子动态组学的概念。蛋白质动态组学是一个包含蛋白质结构动态信息的大数据集合,其基本含义指的是在具有相同拓扑结构的蛋白质家族中,对不同蛋白质结构动态特征的表征和比较分析以及动态与功能之间的偶联关系。这一概念的提出,丰富了蛋白质与学研究的理论,相信其不仅可用于纤维素类的分析,也将适用于其它蛋白质家族中的功能机制研究。
[硕士论文] 赵若琦
应用数学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:催化反应是在生物体内普遍存在的生化反应,对于催化反应的研究已经有上百年的历史,其中最为经典的是Michaelis和Menten根据中间络合学说推导出了底物浓度与反应速率的关系,这个著名的公式又称为米氏方程。为后人继续研究的催化反应奠定了重要理论基础。分子的化学本质是一种具有催化作用的蛋白质,并且具有很强的专一性,它具有的催化剂的特性具体表现在:降低反应的活化能不影响反应的平衡常数以及加速反应的进程。近年来,逐渐发现,生物体内的生化反应,普遍都是处于高浓度或者至少与底物浓度相差不大的情形。因此,研究高浓度下的催化反应,对研究生物体内的催化机制有极其重要的意义。
  分子马达是一种广泛存在于细胞内的蛋白质,作为物质的输运的载体是它最重要的功能。同时还在生命体的很多重要生命活动扮演重要的角色,它们通过把化学能转换为动能,持续为自身沿着固定轨道进行物质输运的过程提供动力。分子马达的运输参与了机体内几乎所有的生命活动,研究分子马达的具体输运过程,我们就可以从微观分子水平上认识机体内的物质运输规律,从而把研究成果运用到完整的生命过程中,进一步认识细胞内部的微观世界。分子马达作为纳米层级的运输载体,我们由此可以设计更多种类的纳米分子机器,实现纳米尺度的可控操作,为人类造福。因此研究马达的运输过程具有非常重要的现实意义。
  本文通过利用促反应、反应动力学中的质量作用定律模型来研究马达运输货物,由于分子催化反应与马达物质运输的某些相似过程,利用分子的研究成果来研究分子马达的物质运输情况,会极大的促进马达物质运输方面的研究进展。这样可以把复杂的物质运输模型简单化,更容易分析出微观细胞内复杂的物质运输行为。
  第一章中,主要是对促反应、分子马达及其运输过程的介绍,我们分别从研究背景、国内外目前主要的研究进展、问题框架,发展历程等几个方面进行阐述。然后对本文中用到的数学分析方法进行简单的概述,最后简要介绍本文的主要内容及创新点。
  在第二章,主要研究了高浓度条件下的催化反应,在建立模型的基础上运用尺度化分析手段,结合扰动理论的分析方法对模型进行求解。对结果进行分析。通过对结果的比较得到了高浓度下的各反应物浓度变化。数值模拟,反应物的浓度在时间上一致有效,验证了该方法的有效性。并通过作图体现了各反应物浓度的分布不仅适用于初始浓度比较高的情况,对一些初始浓度较低的情况也适用。
  第三章中,基于高浓度促反应的多分子马达物质运输的模型,通过分析对比促反应与分子马达进行物质运输具体过程,建立马达运输模型,并运用扰动方法求解出模型的近似解析解。讨论不同参数对各种物质的浓度变化影响。
  第四章,总结全文,重点阐述了本文的不足和有待解决的问题,讨论了建立的模型在的可能,为以后分析打下基础;同时展望了本文研究方向的发展以及实际的研究意义。
[硕士论文] 钟汕
化学工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:碱性蛋白是一种蛋白水解,属于内切型丝氨酸蛋白。其突出的特点是有具有较广的pH应用范围,可以从中性到碱性的范围内发挥催化作用。普遍用于食品及洗涤行业。固定化相比于游离具有稳定性高及易回收等优点,本文使用生物法催化水解缬沙坦甲酯,以筛选合适的固定化材料为目标,从蛋白结合量及活力回收来考察固定化材料对碱性蛋白催化性能的影响,得出较好的固定化碱性蛋白载体,主要工作内容如下:
  首先从固定化方法和载体入手,以蛋白结合量和固定化活力回收为指标。初步筛选得到,1000EPN氨基树脂共价结合法固定化碱性蛋白回收达到79%,蛋白结合量达到49.5 mg/g载体;琼脂糖包埋法固定化碱性蛋白活力回收达到76%。
  再对初步筛选得到的1000EPN氨基树脂进行了固定化工艺研究,结果得到使用8%戊二醛活化1h,1000EPN氨基树脂,固定化条件20℃,0.1 M pH7.5磷酸缓冲溶液固载50mg蛋白,固定化4h,蛋白结合率高达99.5%,蛋白活力回收高达86%。在最佳固定化工艺条件下,1000EPN氨基树脂共价结合的蛋白储藏于2-8℃冰箱中,储存180 d,活力残余24.19%;
  接下来对筛选得到的琼脂糖,对其固定化工艺进行研究,结果表明,选用0.1 MpH9.5碳酸缓冲溶液,质量分数2.5%琼脂糖包埋100 mg蛋白,此时活力回收高达80%。在最佳固定化工艺条件下,包埋储藏于2-8℃冰箱中,储存70天后,活力残余30.37%;
  最后研究游离催化水解缬沙坦甲酯工艺,确定最佳催化水解工艺条件,结果表明在40℃下,20 g/L蛋白催化水解1 g/L缬沙坦甲酯,反应44 h后,催化率达到86%。以此游离催化工艺为基础,考察这两种固定化的催化工艺及其操作稳定性,结果表明,这两种固定化碱性蛋白催化性能和游离相差无几,以催化水解50%缬沙坦甲酯为目标,1000EPN氨基树脂固定化蛋白在重复使用5次之后,活力残余60.71%,琼脂糖包埋固定碱性蛋白在重复使用5次之后,活力残余35.52%。
[硕士论文] 王露
生物化工 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)是降血脂药物阿托伐他汀钙的关键手性中间体,利用卤醇脱卤催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)的脱卤氰化反应制备A7是很有潜力的合成方法。现有研究存在的主要问题是适用的卤醇脱卤种类少,对底物D3的催化活性很低,且鲜见有关卤醇脱卤分子改造提高其对D3催化活性的报道。本研究以D3为目标底物,对卤醇脱卤进行了筛选和分子改造,主要结果如下:
  (1)利用基因挖掘技术建立了一个卤醇脱卤库,筛选获得了一个对D3具有较高催化活力的卤醇脱卤HheAAM(来源于Agromyces mediolanus sp.),其全细胞催化反应活为13 U·L-1,比活为69.06 U·g-1,高于现有报道的HheC类卤醇脱卤HHDH和Mut-HheC2360;
  (2)分别利用定向进化和半理性设计方法对HheAM进行改造:通过易错PCR方法筛选得到6个阳性突变体,均在84/88位发生突变,对84位和88位进行定点饱和突变得到另外9个阳性突变体,突变体活分别为Wt-HheAAM的1.32-3.46倍;根据分子对接结果对底物结合区域附近的位点进行定点饱和突变,得到4个在136/144位发生突变的阳性突变体,活分别为Wt-HheAAM的1.78-3.13倍;
  (3)分别利用迭代饱和突变(ISM)和CASTing策略对4个关键位点(84,88,136,144位)进行组合突变:前者筛选得到14个阳性突变体,活分别为Wt-HheAAM的1.78-15.19倍;后者筛选得到19个阳性突变体,活分别为Wt-HheAAM的1.03-11.98倍。其中最优突变体M4-1(84S-88L-136T-144C)的比活为887.80 U·g-1,是Wt-HheAAM的13倍,对D3的催化活性得到了显著的提高。同时,M4-1的最适反应pH由7.5变为8.0,最适反应温度由55℃变为60℃,50℃下的半衰期(t1/2,50℃)由0.87 h变为2.38 h。
[硕士论文] 童超迪
生物化工 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:X射线衍射晶体学是解析生物大分子结构的重要技术手段之一,广泛用于的三维结构解析。通过解析以及/小分子复合物的晶体结构,结合分子动力学的研究,可以获取与小分子的相互作用机制,并在分子水平上探究结构与功能的关系,为进一步对的理性改造提供结构依据。
  DehDIV-R是本实验室发现的R-2-卤代酸脱卤,产自假单胞菌ZJU6,能专一性地水解R-2-氯丙酸,具有重要的应用前景。目前关于R-2-卤代酸脱卤的晶体结构报道较少,对于其底物立体选择性研究也仅仅在R,S-2-卤代酸脱卤的结构基础上间接进行解释。本文通过多步层析法制备得到高纯度的DehDIV-R蛋白,采用悬滴气相扩撒法,在0.1 mol/L HEPES(pH7),12% PEG6000,0.2 mol/LMgCl2,8mmol/L CHAPS条件下获得高质量晶体,并在上海同步辐射光源收集到一套分辨率为2.35(A)的数据,采用CCP4 online服务器分子置换法解析得到DehDIV-R的晶体结构。基于结构分析的结果显示,DehDIV-R是由多个α螺旋组成的假二聚体结构,且活性中心Asp205与Asn131形成氢键,有利于Asp205活化水分子。接着,基于DehDIV-R与R-2-氯丙酸以及与S-2-氯丙酸的分子对接结构,经限制性分子动力学模拟计算,推测活化的水分子的氧原子与R-或S-2-氯丙酸的Cα之间的距离以及角度上的差异导致了DehDIV-R的底物立体选择性。
  PaL是本实验室发现的脂肪,来自产碱假单胞菌CGMCC4405,能拆分d,1-薄荷醇丙酸酯生成光学纯的1-薄荷醇,具有重要的应用前景。但将PaL用于拆分四对外消旋的薄荷醇丙酸酯时,非对映体选择性较低,因此需要探究其手性识别机制从而为下一步理性改造提供指导。前期解析得到PaL的晶体结构,但其催化三联体处于不合理位置——His302位于分子表面。本文尝试采用多种方式来获得催化三联体位置合理的PaL结构,最终通过粗粒化分子动力学模拟计算,发现His302多次进出活性口袋,并最终通过常规分子动力学模拟计算优化得到了结构合理的PaL。基于上述结构,通过分子对接与分子动力学模拟计算来探究PaL非对映体选择性较低的原因。结果表明脂肪催化过渡态时,四对外消旋薄荷醇丙酸酯C1处的手性影响了His302质子化的氢原子与底物羟基氧原子之间氢键的形成,从而决定了其能否被水解。然而PaL仅能识别C1处的手性,而对于C2和C5处的手性无法识别,导致其非对映体选择性较差,因此无法专一性地水解1-薄荷醇丙酸酯。
[硕士论文] 黎梦
生物工程 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:核苷类化合物是抗癌、抗病毒药物的主要来源,阿糖鸟苷(ara-G)作为奈拉滨等的前药,能够有目的地抑制T细胞白血病的细胞活性,也是一种关键的抗癌类核苷类药物。目前利用化学合成法工艺比较麻烦,使用某些化学试剂对人体和环境都可能造成一定的危害;而生物催化法在一定程度上可以解决上述问题,但也存在野生菌株产量较低而导致成本较高、同时一些产的微生物菌体本身可能具有致病性,从而阻碍了工业化生产。本文通过分子生物学技术对ara-G生物合成过程中所用关键进行克隆表达,以获得催化反应所用的高产基因工程菌,大幅度降低成本,为工业化生产奠定基础。
  1.嘌呤核苷磷酸化基因(deoD)与尿苷磷酸化基因(udp)工程菌的构建:根据GenBank中的deoD与udp的序列设计引物,利用PCR扩增来源于埃希氏菌AEM0812菌株的deoD与udp基因,将基因片段分别与克隆载体pMD18-T连接得到重组质粒pMD18-T-deoD和pMD18-T-udp,再将重组质粒分别导入Escherichia coli DH5α获得目的基因的克隆;然后将目的基因分别与表达载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-deoD和pET-28a-udp,导入E.coli BL21(DE3),获得工程菌菌株E.coli(deoD)、E.coli(udp);经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测表明目的基因表达成功。工程菌E.coli(deoD)与E.coli(udp)粗活力分别是原始菌株的1.9倍与1.2倍。
  2.工程菌E.coli(deoD)或E.coli(udp)催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷(ara-DA):利用E.coli(deoD)或E.coli(udp)游离细胞或由其制备的粗液分别催化第一步反应,均能够生成ara-DA,并且E.coli(deoD)与E.coli(udp)游离细胞转化率比原始菌株AEM0812分别提高24.6%与22.3%,E.coli(deoD)与E.coli(udp)的粗液比原始菌株分别提高28.2%与2.0%;将E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞或粗液按照1∶1的比例混合参与反应时,转化率相对于原始菌株AEM0812有明显的提高,尤其是E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞的混合液效果最佳,转化率是原始菌株的2.5倍。
  3.腺苷脱氨基因(add)工程菌的构建:将来源于Pseudomonas aeruginosa TX16菌株的add基因克隆后导入E.coli BL21(DE3),得到含有重组质粒pET-28a-add的工程菌E.coli(add),经IPTG诱导后采用SDS-PAGE检测,表明目的基因表达成功。活测定表明E.coli(add)粗液的活力是原始菌株P.aeruginosa TX16的2.9倍。
  4.工程菌E.coli(add)催化合成ara-G:将E.coli(add)菌体直接加入到含有ara-DA的反应体系中,HPLC检验结果表明E.coli(add)菌体游离细胞几乎不能催化合成ara-G;将E.coli(add)菌体细胞破碎后制成粗液再进行反应,可以成功催化第二步反应生成ara-G,而且转化率比原始菌P.aeruginosa TX16有非常显著的提高,其转化率可达96.8%,是原始菌株的2.2倍。
[硕士论文] 李新新
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:糖基化修饰是生物体内最常见的一种蛋白质翻译后修饰,可以影响蛋白分泌、稳定性,以及免疫原性等生物学功能。自然界中真核微生物分泌大量糖苷水解用于降解植物多糖。这些糖苷水解经常发生N/O-糖基化修饰,从而影响的活性和稳定性。本论文中以来源于嗜热真菌篮状菌(Talaromyce leycettanus JCM12802)的β-葡萄糖苷bgl3A为研究材料,比较了该基因在三种真核表达系统(篮状菌,毕赤酵母和腐质霉)和一种原核表达系统(大肠杆菌)中不同程度糖基化修饰对学性质的影响。通过N/O-糖基化单点突变和毕赤酵母表达,初步分析了不同位点,不同类型糖基化修饰对的影响。主要研究结果如下:
  (1)四种重组Bgl3A的学性质比较
  β-葡萄糖苷Bg13A分别在四种系统中成功表达并纯化成单一蛋白。SDS-PAGE分析表明不同真核系统表达的重组Bgl3A存在不同程度的N-糖基化修饰和O-糖基化修饰,其中腐质霉表达系统中的糖基化修饰程度低于其他两种真核表达系统。学性质比较发现不同表达系统来源的重组Bgl3A性质差异较大,如pH稳定性(篮状菌>大肠杆菌>腐质霉>毕赤酵母)、纤维二糖催化效率(腐质霉,91s-1mM-1>毕赤酵母,89s-1mM-1>篮状菌,27s-1mM-1>大肠杆菌,12s-1mM-1)。结果表明不同系统表达蛋白存在不同程度的糖基化后修饰,这些糖基化后修饰对蛋白的性质有一定影响。
  (2)N-糖基化对β-葡萄糖苷Bgl3A学性质的影响
  通过定点突变构建N-糖基化突变体并进行学性质分析。突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到活力;突变体T44A和S299A的最适pH和温度没有改变,但二者的Tm值和70℃下的热稳定性都明显优于野生型。以纤维二糖为底物时,突变体T44A和S299A的催化效率基本不变。由此可知,N-糖基化主要影响Bgl3A的分泌和热稳定性,其中N226位点的N-糖基化在的折叠和分泌中起重要作用,且不同位点的N-糖基化修饰因其结构上的差异而导致了学性质的丰富性。
  (3)O-糖基化对β-葡萄糖苷Bgl3A学性质的影响
  同时构建O-糖基化突变体。与野生型相比,突变体的最适温度和pH均没有发生明显变化,但不同程度地拓宽了Bgl3A的pH稳定性,即T443A>T436A>T437A>WT。促反应动力学分析表明T443A对两种底物的催化能力明显降低,而突变体T436A和T437A对纤维二糖的催化效率具有一定的提高。结果表明T443位点的O-糖基化对维持Bgl3A的活性起到关键作用,而T436和T437位点的O-糖基化有可能影响到Bgl3A的三维结构,进而对催化效率起到一定作用。由于糖链与缓冲液相互作用,O-糖基化对Bgl3A的pH稳定性起到重要作用。
  本论文通过比较四种系统表达β-葡萄糖苷Bgl3A的学性质,初步得出不同糖基化对Bgl3A的性质影响不一。在毕赤酵母表达系统中,构建不同类型糖基化突变体并比较学性质,结果可知N-糖基化主要影响Bgl3A的催化效率,O-糖基化主要影响Bgl3A的pH稳定性。这一结论可为糖基化对β-葡萄糖苷Bgl3A影响机理的研究提供一定理论基础。
[硕士论文] 马慧姝
凝聚态物理 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:碳酸酐(Carbonic Anhydrase,CAs,EC4.2.1.1)是一类含Zn2+的金属,能够高效可逆地催化CO2水合反应,并且在人体的生理、病理等方面都发挥着重要的作用。其中,碳酸酐Ⅱ(CAⅡ)是催化CO2水合效率最高,同时也是研究最为透彻的一类碳酸酐。它在生物体内的功能与其结构及结构转换密切相关。因此,研究HCAⅡ对加深与碳酸酐相关的生物学过程和疾病形成原因的认识与理解具有十分重要的意义。
  本论文主要使用分子动力学模拟、聚类网络分析等方法研究了HCAⅡ在水环境中的构象变化过程,以期探讨其中所含的微观机制,得到了以下研究成果:
  首先,利用分子动力学模拟研究HCAⅡ在水环境中的运动,得到其动力学轨迹。通过对模拟轨迹的分析,我们选定特定氨基酸残基之间的距离来表征loop结构(loop1和loop2)的运动情况。
  其次,利用Wordom软件对模拟体系中HCAⅡ的loop结构进行聚类分析,研究结果表明: loop1和loop2都出现了多重构象,且构象之间可以相互转换。loop1出现了三种构象状态:关闭(类2)、半开(类1、类3、类4)和全开(类5)。而loop2在模拟中只出现了开(类1、类3、类4、类5)和超开(类2)两种构象状态。
  最后,选用HCAⅡ的实验结构与我们模拟得到的构象进行叠合,结合模拟分析的数据,我们发现:在我们的模拟中,有一半的构象允许CO2通过,一半的构象则不允许CO2通过。由允许CO2通过的构象到不允许CO2通过的构象之间转换所需的最长时间约占总时长的20%,这意味着有足够的时间允许CO2通过,但是CO2也需要选择合适的时间进入HCAⅡ,因而HCAⅡ的构象变化以及其结合CO2配体更倾向于构象选择机制。而在这个过程中,也存在着构象诱导的因素:一旦CO2进入结合口袋,loop1就会关闭阻碍活性口袋,CO2位于活性口袋中,且氨基酸残基His-119、Leu-198、Thr-199和Trp-209会将CO2固定在活性口袋中。此结果修正了我们之前对于配体结合构象变化机制的认识,对于今后HCAⅡ的研究具有重要意义。
[硕士论文] 郑芳芳
微生物学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:β-葡萄糖苷(EC3.2.1.21)是催化葡萄糖基在氧亲核试剂之间转移的一类。它能够同时催化β-葡萄糖苷键的断裂和合成,并且来源广泛,功能多样,在食品、制药、化工等领域有重要的应用。
  本研究从Streptomyces sp.GXT6中克隆到两个GH1家族的β-葡萄糖苷基因bgl2和bgl4,一个GH3家族的β-葡萄糖苷基因bgl5,构建重组质粒pSE-bgl2、pSE-bgl4和pSE-bgl5,并导入大肠杆菌E.coliXL1-bule中进行诱导表达,采用镍亲和层析技术成功获得具有活性的蛋白质BGL2、BGL4和BGL5。对重组蛋白质进行学性质研究、底物水解功能研究以及转糖苷功能研究。除此之外,在课题组的前期工作基础上,对来自Streptomyces sp.GXT6中的其它两个β-葡萄糖苷BGL1、BGL3的水解功能和转糖苷功能进行研究补充,并对BGL3的W81位点具有活的五个突变体进行转糖苷功能研究。
  以pNPG为底物对BGL2、BGL4、BGL5进行学性质研究。结果表明,BGL2的最适反应pH和温度分别为pH7.0和45℃,Km值为0.2871±0.01586mmol/L,Vmax值为10.24±0.1577μmol·min-1mg-1,葡萄糖抑制常数Ki值为75.63±5.499mmol/L。BGL2能够水解多种芳香类糖苷底物,对pNPG的活力最高,对海藻糖和pNPC只有微弱的水解活力,能够水解大豆异黄酮类、淫羊藿黄酮类和虎杖苷,终浓度为5%的乙二醇和1,3-丙二醇对BGL2活力有明显的激活作用。BGL4的最适反应pH和温度分别为pH6.5和55℃,Km值为0.4414±0.02575mmol/L,Vmax值为9.181±0.1673μmol·min-1mg-1,葡萄糖抑制常数Ki值为192.3±13.47mmol/L。BGL4能够水解大豆异黄酮类、淫羊藿黄酮类和虎杖苷,对pNPC、oNPG、龙胆二糖和乳糖只有微弱水解能力。BGL5的最适反应pH和温度分别为pH6.5和40℃,Km值为0.8562±0.03653mmol/L,Vmax值为0.09314±0.001156μmol·min-1mg-1,葡萄糖抑制常数Ki值为50.7±2.585mmol/L。BGL5能够水解多种芳香类糖苷底物和大豆异黄酮类、淫羊藿黄酮类、虎杖苷。
  对BGL2、BGL4和BGL5进行转糖苷活性研究。发现BGL2和BGL4都对乙醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇等少数醇类具有转糖苷活性。同时,BGL2对己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、辛醇有转糖苷活性,BGL4对庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷有转糖苷活性,然而BGL5在所研究的底物中未发现有转糖苷功能。
  对BGL1和BGL3进行水解功能和转糖苷功能的研究补充。发现BGL1和BGL3均能够水解淫羊藿黄酮类和虎杖苷。BGL1在所补充研究的底物中未发现转糖苷功能。BGL3在以pNPG为糖基供体,对己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、己醇、辛醇、壬醇、癸醇具有转糖苷活性。对BGL3的W81位点的五个突变体进行转糖苷功能研究,结果发现这五个突变体的转糖苷能力与BGL3相比并未提高。
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