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[硕士论文] 华夏
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化1。在美国罹患NAFLD的人群已达到人口总数的30%2,国内流行病学的研究表明,NAFLD已成为我国引起肝功能异常以及慢性肝病的第二大元凶3。
  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又称为辅酶Ⅰ,是电子传递链中的ComplexⅠ的重要递氢物。NAD的合成包括从头合成途径(De novo pathway)和补救(Salvage pathway)合成途径两条途径,其中补救合成途径是维持NAD体内水平的主要途径。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是补救合成途径中的合成限速酶,维持体内NAD的水平4。NAD是生成ATP的必须物质,同时ATP还广泛参与机体发育、血管生成、细胞凋亡、组织炎症、神经退行性病变和肿瘤发生等病理生理过程5-7。
  在我们课题组之前关于NAMPT功能方面的研究发现,NAMPT和NAFLD之间存在重要关联。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝脏中,会随着年龄增大而表达量逐渐减低,而且NAMPT表达量的降低是老年鼠NAFLD发病和进展的重要促因8。但NAMPT的相关激活剂能否对NAFLD起到治疗作用,以及其治疗作用的机制都尚不明确。
  由于NAMPT是一个酶,因此我们期望能直接找到可以干预其作用的化合物。我们把目光瞄准了P7C3-A20这一化合物。P7C3-A20的CAS号1235481-90-9,属于氯丙基咔唑类化合物,是latrepirdine(一种神经元保护剂)的同源化合物。前期有报道发现该化合物可作为“潜在的NAMPT激动剂”升高脑内的NAD水平,发挥神经保护作用。我们猜测,P7C3-A20很有可能也能在肝脏内发挥作用,拟分三步对化合物P7C3-A20对NAFLD的治疗作用和机制进行了探讨。
  实验方法:
  1.将实验动物分成四组,每组不少于6只,分别为Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组。Chow组以普通饲料喂养,HFD组以高脂饲料喂养。HFD+A20组在HFD诱导16W后体外腹腔给药,给药量20mg/kg/d。给药2W后,先从体重、代谢率上对小鼠整体代谢水平对NAFLD造模进行评价,然后验证经过P7C3-A20治疗后的小鼠肝脏中是否存在NAD含量水平的改变。
  2.第二步检测P7C3-A20对NAFLD各项病理指标及并发症进程相关指标的影响。首先检测血清中的血脂、肝功酶系等指标各组之间的差异,然后再在肝脏组织中检测氧化应激、炎症因子、肝脏纤维化标志物、细胞凋亡标志物、胰岛素敏感度等指标,检测P7C3-A20对NAFLD病程进展和并发症的治疗作用。另外,我们还检测了另一NAD补充药物nicotinamide riboside(NR)与SIRT1过表达对NAFLD的治疗作用。
  3.第三步探讨P7C3-A20对NAFLD治疗作用的机制进行研究,根据实验结果中发现P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的浓度,推测P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的关系。所以对AMPK/CREB在肝细胞中的表达进行检测,同时检测磷酸化的标志物phospho-CREB和phospho-AMPK。将AMPKα2+/-小鼠进行杂交配种,制备AMPKα2-/-小鼠。将WT小鼠设置为对照组,AMPKα2-/-小鼠设置为实验组。两组小鼠均给予腹腔注射P7C3-A20,3天,20mg/kg/d。取血清检测血清中FGF1和FGF21的变化,取肝脏检测AMPK通路相关标志物的表达情况。
  实验结果:
  1.首先HFD组相较于Chow组,可以明确HFD诱导NAFLD模型成功。然后对NAFLD模型小鼠按照Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组四组分组进行NAD、NADH以及NAD/NADH的检测,首先验证P7C3-A20给药后确实提升对NAD在肝脏中的表达水平。
  2.HFD组给予P7C3-A20后,相比较于HFD对照组,小鼠减重明显,代谢率也有所提升;血清中肝功酶系指标有所改善;小鼠肝脏的脂质沉积、氧化应激水平、细胞炎症水平以及细胞凋亡水平均有所下降;肝脏的纤维化及纤维成分均有所好转,说明P7C3-A20对NAFLD确实有治疗作用。NR、SIRT1过表达对NAFLD也都有治疗作用,但是NR比SIRT1过表达作用更为明显。
  3.在NAFLD模型小鼠上给予化合物P7C3-A20,可上调血清中两种重要代谢调控因子FGF1和FGF21的表达。同时P7C3-A20给药可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表达。同时,此外,P7C3-A20还明显增加血FGF1和FGF21的浓度。肝脏以及血清中FGF1和FGF21表达明显提高,相对于对照组野生型小鼠,P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上对AMPK/CREB通路的激活作用被极大地抑制,且肝脏FGF1和FGF21的上调被抑制,血清中FGF1和FGF21的上调也被极大地削弱。
  实验结论:
  1.化合物P7C3-A20可有效提高NAFLD中NAD的含量。
  2.化合物P7C3-A20可有效缓解NAFLD的病程和并发症的进程。
  3.P7C3-A20对FGF1和FGF21的调控依赖于AMPK/CREB通路。
[硕士论文] 马冉
药理学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:药物相互作用目前已成为药物安全性评价的主要内容。CYP3A4是人体CYP450酶系中最大的亚家族之一,广泛参与临床药物的代谢。CYP3A4可被其他药物和化合物诱导或抑制,从而导致严重的不良反应和药物相互作用。黄连素广泛存在于多种中药材、食物和蔬菜中,在体外和体内对人及动物肝CYP450酶系有诱导或者抑制作用。随着黄连素及其制剂在日常生活中广泛的应用,其与CYP3A4相互作用的问题也日益突出。
  目的:
  本研究采用体内和体外实验的方法,研究黄连素通过对大鼠肝CYP3A4的作用,并阐明黄连素对咪达唑仑在大鼠体内药动学的影响及其机制,为临床合理用药及药物相互作用研究提供依据。
  方法:
  1黄连素对大鼠肝CYP3A4抑制常数(Ki)的测定采用钙沉淀法制备空白大鼠肝微粒体,在大鼠肝微粒体中加入咪达唑仑、磷酸钾缓冲液、肝微粒体蛋白混悬液,预孵育后加入NADPH启动反应,孵育后加入冰乙腈终止反应,涡旋、离心,取上清液进行分析测定咪达唑仑浓度。以咪达唑仑在大鼠肝微粒体中的转化率作为酶活性指标。在上述孵育体系中,测定不同浓度黄连素对咪达唑仑转化率的影响,计算黄连素对CYP3A4活性的抑制常数。
  2不同剂量及不同作用时间黄连素对大鼠肝CYP3A4的影响分别以低剂量(75mg·kg-1·d-1)、中剂量组(150mg·kg-1·d-1)和高剂量组(300mg·kg-1·d-1)的黄连素,给予大鼠连续灌胃8d,制备肝微粒体,以咪达唑仑在大鼠肝微粒体中的转化率作为酶活性指标,考察不同剂量黄连素对大鼠肝CYP3A4影响。
  以150mg·kg-1·d-1的黄连素,分别给予大鼠连续灌胃4d、8d和12d,制备肝微粒体,以咪达唑仑在大鼠肝微粒体中的转化率作为酶活性指标,考察不同作用时间黄连素对大鼠肝CYP3A4影响。
  3黄连素对大鼠体内肝CYP3A4的影响12只健康雄性SD大鼠,随机分为对照组(n=6)和试验组(n=6),对照组连续灌胃生理盐水8d,试验组连续灌胃150mg·kg-1·d-1黄连素8d后,两组均于末次灌胃后即刻,静脉推注10mg·kg-1咪达唑仑注射液,并于给药后不同时间点经眼眶内眦采血0.5ml,离心后应用高效液相色谱法(HPLC)测定大鼠血浆中咪达唑仑的浓度。数据采用DAS2.0软件进行处理,计算咪达唑仑药代动力学参数,其中峰浓度(Cmax)为实测值,考察黄连素对咪达唑仑药动学的影响。
  结果:
  1 黄连素对大鼠肝CYP3A4抑制常数(Ki)的测定大鼠肝CYP3A4代谢咪达唑仑的Km为28.67μM,Vmax为3.06nmol·min-1·mg protein-1,内在清除率CLint为0.11ml·min-1·mg-1。黄连素竞争性抑制大鼠肝微粒体CYP3A4对咪达唑仑的代谢,其抑制常数K1为116.4μM。
  2 不同剂量及不同作用时间黄连素对大鼠肝CYP3A4的影响黄连素低剂量组与对照组无显著性差异,黄连素中剂量组和高剂量组可显著抑制大鼠肝CYP3A4的活性,降低咪达唑仑在体外的代谢,Km分别28.66±7.89、28.88±8.11、30.99±7.78和36.37±8.22μM;Vmax分别为3.96±0.30、3.05±0.30、2.89±0.26和2.54±0.82nmol·min-1·mg protein-1;CLint分别为138.17±5.29、105.61±3.65、93.26±1.47和69.84±1.08ml·min-1·mg-1。
  黄连素连续灌胃4d组与对照组无显著性差异,连续灌胃8d组和12d组,黄连素可显著抑制大鼠肝CYP3A4的活性,降低咪达唑仑在体外的代谢,Km分别28.77±7.88、29.56±8.04、30.93±7.75和36.24±8.23μM;Vmax分别为3.06±0.29、3.08±0.31、2.89±0.86、和2.56±0.24nmol·min-1·mg protein-1;CLint分别为106.36±10.54、104.19±6.71、93.44±3.19和70.64±2.48ml·min-1·mg-1。
  3 黄连素对大鼠体内肝CYP3A4的影响单用咪达唑仑组和咪达唑仑合用黄连素组,主要的药动学参数Cmax分别为6.53±0.58和8.82±1.05μg·m1-1,T1/2分别30.00±8.75和27.42±5.08min,Vd分别为2.85±1.35和1.92±0.43L·kg-1,CL分别为4.03±1.24和2.98±0.76L·h-1·kg-1,AUC0-∞分别为2.81±1.11和3.59±0.95mg·h·L-1。
  结论:
  1.黄连素可竞争性抑制大鼠肝微粒体CYP3A4对咪达唑仑的代谢。
  2.黄连素对大鼠肝CYP3A4的抑制作用随剂量的增加而增强,随作用时间延长而增强。
  3.黄连素可显著改变咪达唑仑在大鼠体内的药动学,使Cmax和AUC显著性增大,同时CL显著性降低。其机制可能与黄连素竞争性抑制大鼠肝CYP3A4有关。
[硕士论文] 樊晓珍
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS),自1981年发现至今已有30多年,仍在严重威胁人类的健康。高效抗逆转录药物疗法(HAART)的发展有效控制了HIV患者病情的进展,使得HIV成为一种慢性病,一旦中断HAART治疗后,病毒会很快反弹,因此病人不得不终生服药。HIV难以治愈的主要原因是细胞中潜伏存在的病毒储存库。清除病毒储存库最有希望的策略之一是shock and kill,即先用药物激活潜伏HIV储存库的转录表达,然后利用机体免疫系统或细胞病变效应杀死这些激活后的感染细胞。目前已有多种类型的HIV病毒储存库激活剂正在研究开发中,例如IL-2、CD3单克隆抗体等会引起普遍的T细胞激活现象,但同时引起细胞毒性并且释放炎性因子;组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACis)丙戊酸钠(VPA)和环庚烷异羟肟酸(SAHA)也已被证明在体外可高效诱导HIV转录的,但其临床治疗效果不佳。因此研发新型的小分子化合物用以高效安全地激活HIV潜伏病毒储存库是非常有必要的。
  吡喃并吲哚类化合物被广泛用于药物研发,它已被证明具有抗炎、抗肿瘤、抗细菌感染等生物活性。在先前的工作中,我们的合作者发展了一种高效合成二氢吡喃吲哚衍生物的有机催化合成方法,得到了一系列吡喃并吲哚类化合物。在本研究中,我们对这些化合物可能的生物活性进行了研究。首先使用细胞模型—J-lat A10.6细胞系,对这些化合物进行了筛选以发现可能的病毒储存库激活剂。通过细胞模型筛选实验以及化合物结构优化改造,我们最终证实化合物GIBH-LRA002(2-氨基-3-氰基-9-甲基-4-(三氟甲基)-4,9-二氢吡喃并[2,3-b]吲哚-4-羧酸乙酯)具有最优的激活效果。由于细胞系潜伏感染模型并不能很好地代表艾滋感染者体内的病毒储存库情况,因此我们进一步验证了该化合物对SIV感染猕猴和HIV患者体内CD4+T细胞中潜伏病毒储存库的激活效果,研究结果表明了GIBH-LRA002可有效的激活这些原代CD4+T细胞中潜伏病毒储存库。此外,我们的研究也发现GIBH-LRA002对细胞活性没有显著影响。还初步证明了GIBH-LRA002不会导致T细胞的非特异活化,这将有利于阻止CD4+T细胞的过度活化,从而可降低病毒储存库激活后产生的新生病毒颗粒的扩散。总之,本研究表明了GIBH-LRA002对HIV潜伏病毒储存库有良好的激活效果,且不会引起明显的细胞毒性和非特异激活,是一个值得深入研究的HIV病毒储存库激活候选药物。本论为将对HIV的治愈或功能治愈提供重要参考。
[硕士论文] 龚华锐
神经生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:目的:水杨酸钠是退热、镇痛、抗风湿类药物阿司匹林在体内代谢后的主要活性成分。高剂量的水杨酸钠能够在人和动物体内可逆地诱导出耳鸣,因此常被用来制作动物耳鸣。已有的研究结果表明,在水杨酸钠诱导的耳鸣动物模型中,听觉通路中多个脑区的神经活动水平显著地提高了,其中就包括了对听觉信号加工和传递起着重要门控作用的神经核团内膝体。内膝体神经元的一个非常重要的特性是去极化反跳,它够调控听觉信息加工与传递的门控作用。本论文旨在探究不同浓度水杨酸钠对内膝体神经元去极化反跳的药理学特征,以理解水杨酸钠诱导耳呜的神经机制。
  方法:在本研究中,通过离体脑片和全细胞膜片钳技术记录VGAT-ChR2-EYFP转基因成年小鼠内膝体神经元的去极化反跳反应。该转基因小鼠全脑的GABA能神经元上表达ChR2光敏感通道蛋白。实验中通过细胞形态,电生理学特征和光遗传技术鉴别内膝体上的锥体神经元和GABA能神经元。主要记录内容包括了不同浓度的水杨酸钠对内膝体神经元静息膜电位、膜输入阻抗、去极化反跳的潜伏期、幅度和面积的影响。
  结果:在成年的VGAT-ChR2-EYFP转基因小鼠内膝体脑片上,(1)锥体神经元和GABA能神经元可通过两者不同的形态特征、电生理学特性及光遗传技术来鉴别。(2)1.4mM,0.8mM,0.5mM,0.3mM水杨酸钠均能可逆地超极化内膝体神经元静息膜电位,但只有1.4mM的水杨酸钠显著地并可逆地降低了神经元的膜输入阻抗,压抑了去极化反跳的产生,其他三个浓度对神经元的膜输入阻抗没有影响,且不能压抑去极化反跳的产生。(3)0.8mM,0.5mM,0.3mM的水杨酸钠在部分超极化电流刺激下能减小去极化反跳的潜伏期,幅度和面积。(4)在1.4mM水杨酸钠溶液中加入GABAB受体的阻断剂CGP55845,可以阻断水杨酸钠对成年小鼠去极化反跳的压抑作用。(5)通过加入GABAB受体的激动剂Baclofen,0.3mM水杨酸钠可以压抑去极化反跳的产生。(6)加入内向整流钾通道的阻断剂Tertinpin-Q后,1.4mM水杨酸钠和Baclofen仍能压抑去极化产生。
  结论:在本研究中,不同浓度的水杨酸钠均能超极化内膝体神经元的静息膜电位,而且超极化程度与水杨酸钠浓度成正比。1.4mM的水杨酸钠能可逆地压抑去极化反跳的产生,虽然低浓度的水杨酸钠没有压抑去极化反跳的产生,但改变了去极化反跳的相关特性,提示我们不同浓度的水杨酸钠可能对听觉脑区加工听觉信息的影响也是不同的。本研究表明1.4mM水杨酸钠压抑内膝体神经元的去极化反跳的过程中有GABAB受体的参与。但GABAB激活的下游离子通道不同于未成年大鼠研究中G蛋白门控的内向整流钾通道,可能是其他的与G蛋白偶联、对静息膜电位有调控作用的离子通道。本研究结果提示我们水杨酸钠可能通过改变内膝体的内在特性,影响了内膝体对听觉信息的加工与传导,进而对耳鸣产生贡献。
[硕士论文] 吕晓敏
药剂学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:马来酸氟吡汀(FM)是非阿片类镇痛药,作用于中枢神经系统,目前临床治疗效果明确,主要用于治疗各种急慢性疼痛,包括由于肌肉紧张增高引起的疼痛、关节疾病导致的疼痛、紧张型头痛、癌痛、痛经、骨伤科、外科手术后或运动损伤后疼痛等。FM的不良反应少且一般不严重,最常见的不良反应是疲倦,其他还有眩晕、口干、嗜睡。长期服用不产生耐受性和依赖性,而且副反应症状与剂量有关,当停止服药一段时间后,由副反应表现出来的症状会逐渐减轻直至消失。目前FM的市售剂型为普通型胶囊剂,口服剂型,每日3-4次,每次用量100mg,每日最大剂量600mg,目前国内作为进口药,暂时还没有其他剂型上市。查阅文献,有制备FM口服固体速释剂型、FM缓释片,并考察其相关制剂在动物体内的药动学指标,暂无其他相关剂型的研究。
  FM现有剂型少,难以满足临床用药需求,故需要开发出安全高效的FM新剂型。在成功制备FMSSD的基础上,本实验建立生物样品中FM的HPLC测定方法,在灌胃给予FMSSD后,对大鼠血浆经时浓度和小鼠各组织中浓度以及药效考察,了解FMSSD在大鼠体内的药动学特征及小鼠体内组织分布情况,为研究FM新剂型提供基础实验依据。主要研究内容和结果如下:
  1.建立生物样品中FM的HPLC检测方法
  色谱条件:色谱柱:Symmetry C18(5μm,4.6×250mm);流动相:甲醇∶水=50∶50(V/V),用1mol/L的甲酸调pH值至6.70;柱温:25℃;流速:0.5ml/min;检测波长:320nm;进样量:20μl。FM在大鼠血浆中0.015~5.00μg/ml浓度范围内,在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各组织中0.064~21.33μg/g浓度范围内均呈现良好的线性关系(R2>0.9991)。该方法具有良好的专属性、精密度RSD均小于6%、稳定性RSD均小于6%、回收率大于90%,均符合相关检测要求,可用于生物样品中FM的测定。
  2.FMSSD药动学及组织分布研究
  采用大鼠血药浓度测定法研究FMSSD在大鼠体内的药动学特征,以三个剂量(9mg/kg、27mg/kg、54mg/kg)大鼠灌胃给药后,采用二室模型对数据进行处理,确定药动学参数。三组剂量血药浓度的达峰时间分别为(3.318±0.308)、(3.326±0.548)、(3.333±0.516)h;达峰时FM的血药浓度依次为(0.740±0.031)、(1.825±0.083)、(4.014±0.183)μg/ml;大鼠血浆中药物吸收半衰期t1/2kα分别为(0.837±0.364)、(0.835±0.055)、(0.831±0.057)h;分布半衰期t1/2α分别为(4.463±1.984)、(4.477±2.186)、(4.474±2.429)h;消除半衰期t1/2β分别为(6.417±3.155)、(6.333±0.326)、(6.332±0.329)h;消除率CL/F分别为(1.004±0.034)、(1.202±0.035)、(1.546±0.017)L/h/kg;时间-血药浓度曲线下面积AUC0-24分别为(8.244±0.198)、(21.624±0.453)、(45.134±0.803)μg·h/ml。
  小鼠按78mg/kg灌胃给予FMSSD后,HPLC测定2、4、8、12、24h小鼠各组织(心、肝、脾、肺、肾、脑)中FM浓度,比较药物在小鼠各组织中的分布量;同时利用FM具有荧光特性,对同等剂量灌胃给药后的小鼠组织进行冰冻切片,将切片置于荧光显微镜下观察,统计出FM在组织中的大体分布趋势,其结果与用HPLC测定FMSSD在各组织中分布的定量分析结果一致。给药后各组织各时间点药物分布有显著差异,各组织药物分布量随时间变化而变化,在4h时达最大值,FM在各组织分布量:肝>脑>肾>心>脾>肺。
  3.自制FMSSD与市售胶囊剂的生物等效性研究
  对自制FMSSD及市售胶囊剂进行生物等效性评价,分别对主要药动学参数Cmax、TmaxAUC0-t、AUC0-∞采用方差分析、双单侧t检验及(1-2α)%置信区间的方法进行生物等效性统计学分析,结果表明两种FM不同剂型间存在着显著性差异(P<0.01)。以AUC0-∞计算的相对生物利用度F为(144.388±18.400)%,在参比制剂的80.0%~125.0%范围外,说明两种制剂在大鼠体内不具有生物等效性,自制FMSSD与胶囊剂相比,具有缓慢释放、缓速分布与消除的特点。
  4.FMSSD的药效学研究
  小鼠分别灌胃给予生理盐水阴性对照、低中高(13mg/kg、39mg/kg、78 mg/kg)剂量的FMSSD、(78mg/kg)剂量的市售胶囊,采用小鼠热板法、醋酸扭体法考察各组药物镇痛效果。结果显示各给药组均能提高小鼠痛阈值、减少由醋酸导致的小鼠疼痛扭体反应次数,与生理盐水对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。在给药后0.5~2h内,高剂量FMSSD组的小鼠痛阈提高率(36.14%~61.47%)、扭体抑制率(19.71%~49.97%)都低于市售胶囊组(45.85%~85.53%)、(28.82%~72.16%),但是高剂量FMSSD组在给药4h后小鼠痛阈提高率(95.38%)、扭体抑制率(81.64%)达最大值,市售胶囊组在给药2h后小鼠痛阈提高率(85.53%)、扭体抑制率(72.16%)达最大值。同时给药4~24h后,高剂量FMSSD组的小鼠痛阈提高率维持在(12.23%~95.38%)、扭体抑制率维持在(15.42%~81.64%);市售胶囊组的小鼠痛阈提高率维持在(1.02%~48.47%)、扭体抑制率维持在(9.84%~68.77%)。综合分析两种镇痛模型,表明在相同给药剂量下, FM市售胶囊在给药2h前迅速发挥药效,高于FMSSD,但是在2h达到最大药效后其镇痛效果下降速度快,各FMSSD组镇痛效果下降平缓,体现了缓释镇痛的优越性。同时FMSSD随着给药剂量的增加,小鼠痛阈提高率、扭体抑制率也逐渐增加,说明FMSSD的镇痛效果与剂量成正比,剂量越大,镇痛效果越明显。
[硕士论文] 张铭
眼科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分:阿帕替尼对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管的抑制作用
  目的:观察阿帕替尼对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用。
  方法:60只6-8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为4组,每组15只,即正常对照组及实验组(生理盐水组、低剂量阿帕替尼组和高剂量阿帕替尼组)。实验组构建激光诱导的小鼠CNV模型,均为右眼。建模后即采用灌胃的方式,实验组分别给予生理盐水、低、高剂量的阿帕替尼治疗7d;建模后第7d分别采用荧光素眼底血管造影(FFA)观察各组脉络膜新生血管区面积及渗漏变化;行脉络膜铺片进一步测量新生血管区面积的大小并作组织病理学检查。
  结果:
  (1) FFA结果显示:与正常对照组比较,生理盐水组可见大面积脉络膜新生血管区形成,证明造模成功。对每组各只小鼠激光点的渗漏等级进行评分,组间总体差异有统计学意义(F=51.76; P=0.000);其中,生理盐水组的渗漏评分为(8.43±0.50)分,低剂量阿帕替尼组的渗漏评分为(7.84±0.50)分,高剂量阿帕替尼组的渗漏评分为(6.13±0.90)分。与对照组比较,低剂量阿帕替尼组及高剂量阿帕替尼组渗漏评分显著降低(P=0.020;P=0.000),且高剂量阿帕替尼组较低剂量阿帕替尼组荧光渗漏评分低(P=0.000)。
  (2)脉络膜铺片结果显示:正常小鼠脉络膜铺片中视网膜色素上皮细胞被F-actin染色呈现规则的六边形结构;脉络膜铺片新生血管面积组间总体差异有统计学意义(F=143.72; P=0.001);生理盐水组被激光破坏掉的视网膜色素上皮层区域可见IB4标记的呈辐射状脉络膜新生血管区域,其脉络膜新生血管区的面积为(100.00±6.00)μm2;阿帕替尼干预组中可见IB4标记的脉络膜新生血管区面积明显减小,其中高剂量阿帕替尼组新生血管区面积为(28.00±4.00)μm2,低剂量阿帕替尼组新生血管区面积(66.88±8.41)μm2,两组新生血管区面积与生理盐水组比较差异具有统计学意义(P=0.001),高剂量组小于低剂量组新生血管区面积,差异具有统计学意义(P=0.000)。
  (3)对新生血管区域行HE染色,结果显示:组间总体差异有统计学意义(F=1899;P=0.000);与正常对照组比较,生理盐水组有明显的新生血管形成,且长度和厚度分别为(392.86±3.54)μm和(96.05±6.58)μm,差异有统计学意义(P=0.000);而与生理盐水组比较阿帕替尼组损伤区新生血管的长度和厚度明显减少,其中低剂量阿帕替尼组长度为(164.99±8.24)μm、厚度为(62.68±3.81)μm,高剂量阿帕替尼组长度为(81.16±6.53)μm、为厚度(25.58±4.02)μm,与生理盐水组比较差异均具有统计学意义(P=0.000);且高剂量阿帕替尼组与低剂量阿帕替尼组比较差异有统计学意义(P=0.000)。
  结论:阿帕替尼对激光诱导的小鼠CNV具有一定的抑制作用。
  第二部分:阿帕替尼对HRMEC增殖、迁移、管腔形成的影响及其分子机制的研究
  目的:探讨阿帕替尼对HRMEC的增殖、迁移、管腔形成的影响及其分子机制。
  方法:体外培养HRMEC,实验分组:对照组、rhVEGF诱导组、rhVEGF+5μM阿帕替尼组和rhVEGF+1μM阿帕替尼组。分别予以上述不同的干预后,检测各组细胞的增殖、迁移及管腔形成情况;Western blotting检测阿帕替尼对细胞p-VEGFR2、VEGFR2、ZO-1以及Occludin表达水平的影响。
  结果:
  (1)阿帕替尼抑制rhVEGF诱导的HRMEC增殖活性:CCK-8实验表明,与对照组比较,随着阿帕替尼浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,分别为0.05μM(96.8%)、0.1μM(84.5%)、0.2μM(74.2%)、0.4μM(63.5%)、0.8μM(56.0%)、1.6μM(45.5%)、3.2μM(42.0%)、6.4μM(35.6%),因此,阿帕替尼可以一定程度上抑制rhVEGF诱导的HRMEC增殖活性,并呈剂量依赖性(P<0.05)。
  (2)迁移实验显示,迁移细胞数量组间总体差异有统计学意义(F=119.30; P=0.000);与对照组细胞迁移数量(64.00±5.57个)相比,rhVEGF组细胞迁移数量(97.00±4.35个)显著增加(P=0.000);在rhVEGF诱导的同时加入高低剂量的阿帕替尼后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼组细胞迁移数量为(32.00±4.00个),rhVEGF+1μM阿帕替尼组细胞迁移数量为(44.67±3.51个),其中与rhVEGF组比较,rhVEGF+1μM阿帕替尼组细胞迁移数量显著减少(P=0.000),且rhVEGF+5μM阿帕替尼组比rhVEGF+1μM阿帕替尼组抑制细胞迁移的数量更明显(P=0.035)。
  (3)阿帕替尼抑制HRMEC闭合管腔的形成:管腔形成实验结果显示,各组间总体比较差异有统计学意义(F=112.10; P=0.000);与对照组中闭合的管腔数量(10.33±0.58)个/孔相比,rhVEGF诱导组的管腔形成数量(17.00±1.00个/孔)明显增加,差异有统计学意义(P=0.000);在加入rhVEGF诱导的同时加入阿帕替尼干预后,在rhVEGF+5μM阿帕替尼组管腔形成数量为(4.00±1.00)个/孔,rhVEGF+1μM阿帕替尼组管腔形成数量为(7.00±1.00)个/孔,与rhVEGF组比较rhVEGF+可帕替尼组两组管腔形成数量均显著减少(P=0.000),其中rhVEGF+5μM阿帕替尼组比rhVEGF+1μM阿帕替尼组抑制管腔形成的数量更明显(P=0.016)。
  (4)阿帕替尼抑制HRMEC中VEGFR2和p-VEGFR2的表达,促进紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达:Western blot结果显示,对照组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为0.29±0.02、0.28±0.02、0.29±0.02、0.23±0.01;rhVEGF刺激组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.52±0.04、0.56±0.04、0.11±0.003和0.08±0.002;低剂量阿帕替尼处理组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.26±0.02、0.20±0.002、0.54±0.02、0.41±0.02;高剂量阿帕替尼处理组VEGFR2、p-VEGFR2、ZO-1和Occludin灰度值分别为:0.17±0.01、0.06±0.004、0.54±0.02、0.61±0.04。四种蛋白间总体比较结果显示:VEGFR2(F=110.35;P=0.001)、p-VEGFR(F=274.98;P=0.000)、ZO-1(F=556.74; P=0.000)和Occludin(F=338.49; P=0.000);与对照组相比,rhVEGF刺激后的细胞组VEGFR2(P=0.001)和p-VEGFR2(P=0.000)增加;而紧密连接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表达水平均降低;而加阿帕替尼干预后,与rhVEGF组比较,VEGFR2(P=0.000)和p-VEGFR2(P=0.000)表达均下降;而紧密连接蛋白ZO-1(P=0.000)和Occludin(P=0.000)表达水平均增加。
  结论:阿帕替尼可以抑制HRMEC的增殖、迁移及管腔形成,并抑制VEGFR2、p-VEGFR2的表达,但促进ZO-1和Occludin表达。
[硕士论文] 徐玉彬
外科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:目的
  肝癌、肝移植等肝脏外科手术往往面临肝脏缺血再灌注损伤的难题,明显增加了肝脏外科手术的难度和风险。本实验在建立大鼠肝脏缺血再灌注模型的基础上,术前予黄芪甲苷预处理。通过对术后4h、8h、16h血清转氨酶、炎性相关因子的检测及肝组织显微结构的观察,判断黄芪甲苷预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用。用Western Blot及免疫组化染色分析各组大鼠肝组织中自噬相关蛋白Beclin-1的表达;电镜下观察各组大鼠肝脏细胞内自噬小体数量的变化。探讨缺血再灌注后大鼠肝脏自噬水平的变化,以及黄芪甲苷预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤可能存在的作用机制,为减轻患者肝脏缺血再灌注损伤提供潜在的理论依据。
  方法
  实验分组:90只纯系SD大鼠,随机分为假手术组(Sham组),肝脏缺血再灌注组(HIRI组)、黄芪甲苷组(干预组),每组30只。再按术后4h、8h、16h三个时间段,每个时间段各10只。Sham组大鼠行腹腔注射麻醉后,腹部正中纵形切口,分离肝蒂,不建立肝脏缺血再灌注模型。HIRI组和干预组大鼠麻醉后,建立肝脏缺血再灌注模型。干预组大鼠术前予黄芪甲苷溶液腹腔注射,1次/天,连续7天。
  观察指标:各组大鼠分别在术后4h、8h、16h采取血液和肝脏组织标本。用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平;用ELISA法测定大鼠血清炎性相关因子TNF-α,IL-6水平;使用苏木精-尹红(HE)染色后,观察各组肝脏组织病理学变化;Western Blot及免疫组化染色分析肝组织中自噬相关蛋白Beclin-1的表达;电镜下观察肝脏细胞内自噬小体数量的变化。
  结果
  1.血清中转氨酶水平的变化:同Sham组大鼠比较,HIRI组大鼠血清中ALT和AST水平在术后4h、8h、16h均明显升高(P<0.05),于再灌注后8h时达到顶峰。与HIRI组大鼠比较,干预组大鼠血清ALT和AST水平在术后4h、8h、16h均明显降低(P<0.05)。
  2.血清中炎性相关因子水平的变化:同Sham组大鼠比较,HIRI组大鼠血清中TNF-α,IL-6水平在术后4h、8h、16h均明显升高(P<0.05),于再灌注后8h达到顶峰。与HIRI组大鼠比较,干预组大鼠血清TNF-α,IL-6水平在术后4h、8h、16h均明显降低(P<0.05)。
  3.肝组织HE染色后观察:Sham组大鼠肝细胞索排列整齐、肝小叶结构清晰、中央静脉区无淤血、无炎性细胞浸润。HIRI组大鼠在再灌注后4h、8h、16h,出现了不同程度的肝细胞索排列紊乱、中央静脉区淤血、肝小叶结构模糊、炎性细胞浸润和肝细胞的水肿、坏死,其中以再灌注后8h的损伤最为严重。与HIRI组大鼠相比,干预组大鼠的肝脏组织病理变化在术后4h、8h、16h均有明显改善。
  4.肝组织自噬相关蛋白Beclin-1表达水平的变化:同Sham组大鼠比较,HIRI组大鼠Beclin-1蛋白的灰度比在术后4h、8h、16h均明显升高(P<0.05),于再灌注后8h达到顶峰。与HIRI组大鼠比较,干预组大鼠Beclin-1蛋白的灰度比在术后4h、8h、16h均明显降低(P<0.05)。
  5.免疫组化染色分析肝组织中Beclin-1的表达:与Sham组大鼠相比,HIRI组大鼠肝脏组织Beclin-1的平均标记指数(LI)在术后8h明显升高(P<0.05)。与HIRI组大鼠相比,干预组大鼠肝脏组织Beclin-1平均LI在术后8h明显降低(P<0.05)。
  6.肝脏细胞自噬小体数量的变化:与Sham组大鼠比较,HIRI组大鼠肝脏细胞的自噬小体数量在术后8h明显上升(P<0.05);与HIRI组大鼠比较,干预组大鼠肝脏细胞的自噬小体在术后8h明显减少(P<0.05)。
  结论
  本实验结果提示黄芪甲苷预处理可以降低大鼠肝脏缺血再灌注后转氨酶水平并减轻炎症反应,同时肝组织HE染色观察结果也显示黄芪甲苷预处理能明显减轻大鼠肝脏的病理损伤程度,由此推断黄芪甲苷预处理能够减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤。本研究还发现缺血再灌注后的大鼠肝脏组织Beclin-1呈高表达状态,且肝细胞内自噬小体数量也明显升高,而黄芪甲苷预处理可以明显降低自噬相关蛋白Beclin-1在蛋白水平和组织水平的表达,并且也减少了肝脏细胞内自噬小体的数量,表明黄芪甲苷可能通过降低大鼠肝脏自噬水平来保护大鼠肝缺血再灌注损伤。本研究为黄芪甲苷减轻肝脏缺血再灌注损伤提供了新的理论基础,具有潜在的临床应用前景。
[硕士论文] 顾欣
药理学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.通过前瞻性研究,分析患者华法林目标稳定剂量与VKORC1、CYP2C9等遗传因素的以及年龄、性别、身高、体重、体表面积、吸烟、饮酒、饮食、联合用药等非遗传因素之间的相关性,构建心脏瓣膜置换术后患者华法林目标稳定剂量预测模型。
  2.研究华法林抗凝治疗中,患者依从性与认知度、满意度及其他因素之间的关联性,通过多次患者药学干预,评估患者依从性、认知度、满意度的动态变化。研究患者抗凝治疗依从性与凝血功能达标率、不良反应发生率之间的相关性。
  方法:
  1.选取心脏瓣膜置换术后首次服用华法林的患者,利用相对定量RT-PCR法检测患者VKORC1-1639、CYP2C9基因多态性,测定患者抗凝期间多次INR值,设计华法林抗凝治疗的目标稳定剂量。评估患者目标稳定剂量与遗传、非遗传因素之间的相关性,使用多元回归分析构建心脏瓣膜置换术后患者华法林目标稳定剂量预测模型。
  2.对进行华法林基因检测并纳入目标稳定剂量预测模型的心脏瓣膜置换术后患者进行基线调研,依从性评估采用MMAS-8量表,满意度评估采用TSQM-9评分量表,根据说明书及相关指南设计认知度评分表。基线调研后对患者进行抗凝治疗的安全性、合理性药学干预,在基线后的第一个月、第三个月、第六个月再次对患者进行调研及抗凝治疗的安全性、合理性药学干预。检测患者在基线及之后的第一个月、第三个月、第六个月四个时间点的INR值,使用治疗窗内INR值的百分比判断患者抗凝控制情况,记录患者在这六个月中的不良反应发生情况。
  结果:
  1.150例心脏瓣膜置换术后的汉族患者中,VKORC1-1639AA野生型120例(80.00%)、VKORC1-1639AG突变型29例(19.33%)、VKORC1-1639GG突变型1例(0.67%); CYP2C9*2突变较罕见,本研究中仅CYP2C9*1/*2突变型患者1例(0.67%); CYP2C9*3位点CYP2C9*1/*1野生型140例(93.33%)、CYP2C9*1/*3突变型9例(6.00%)、CYP2C9*3/*3突变型1例(0.67%)。携带VKORC1-1639G突变基因的患者,目标稳定剂量是VKORC1-1639AA型患者的1.64倍(P<0.001);携带CYP2C9*3突变基因的患者目标稳定剂量较小,CYP2C9*1/*1野生型患者的目标稳定剂量是携带CYP2C9*3突变基因的患者的2.05倍(P<0.001)。非遗传因素中,年龄、体表面积与患者华法林目标稳定剂量之间存在相关性(P<0.05),性别、身高、体重、BMI指数、吸烟、饮酒、饮食等与华法林目标稳定剂量无关。
  多元回归分析得华法林目标稳定剂量预测模型:ln Dose(mg/d)=0.248-0.574×CYP2C9*1/*3或*3/*3+0.406×VKORC1-1639GA或GG+0.373×体表面积-0.004×年龄,校正R20.455,VKORC1-1639G>A、CYP2C9*3基因多态性对华法林目标稳定剂量的影响较大,标准化回归系数分别为0.404、0.488;而年龄和体表面积对华法林目标稳定剂量的影响较小,标准化回归系数分别为0.169、0.131。
  2.共纳入132例患者,基线依从性MMAS-8平均分为(4.87±1.27)分,满意度TSQM-9平均分为(60.33±9.66)分,认知度平均分为(4.38±2.48)分。患者依从性得分与认知度得分、满意度得分均呈正相关(r分别为0.649和0.651,P<0.01);文化程度越高患者对抗凝治疗的依从性越高(p<0.05);居住在城市的患者对抗凝治疗的依从性更高(P<0.01)。认知度、满意度、依从性的均值在每次回访时均呈升高的趋势,六个月后依从性MMAS-8平均分为(7.06±1.29)分,满意度TSQM-9平均分为(84.32±8.99)分,认知度平均分为(11.06±2.08)分,基线与第一个月之间上升的幅度最大,往后上升逐渐减缓。抗凝后凝血功能达标率、不良反应发生率与依从性密切相关(P<0.001)。
  结论:
  1.VKORC1与CYP2C9是预测华法林目标稳定剂量的重要因素,影响大于年龄、体表面积等非遗传因素,构建的华法林目标稳定剂量预测模型可以解释45.5%患者间剂量个体差异,对临床上实现华法林个体化给药有一定的指导意义。
  2.患者出院后对抗凝治疗的依从性仍较低。患者抗凝依从性与对抗凝治疗的认知度、满意度密切相关,而抗凝依从性影响凝血功能达标率、不良反应发生率。经过反复药学干预,患者的对抗凝治疗的认知度、满意度、依从性均不断提高。其中,首次药学干预效果最为显著。
  3.药学综合干预,有助于实现华法林个体化治疗,可以有效提升患者抗凝治疗的认知度、满意度、依从性,提高凝血功能达标率,降低出血等不良反应风险。
[硕士论文] 廖雁
药理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  雷帕霉素(Rapamycin)是一种特异性的雷帕霉素哺乳类靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制剂,以往的研究表明在脑外伤(Traumatic brain injury,TBI)后单次给予Rapamycin可以抑制早期的神经功能损伤,而对星形胶质细胞的活化无明显作用。然而,通过连续每日给予Rapamycin以长时程抑制mTOR对脑外伤引起的星形胶质细胞活化及胶质疤痕形成的调节作用尚缺乏相关研究。本研究利用冷冻伤建立的TBI损伤模型,旨在探讨连续每日给予Rapamycin对星形胶质细胞反应性增生的重要标志蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达、胶质疤痕形成以及对运动功能恢复的影响。
  方法:
  将成年雄性ICR小鼠随机分为对照组、TBI模型组和Rapamycin给药组。利用冷冻伤模型造成小鼠右侧运动感觉区域皮层损伤;在冷冻伤手术1 h后腹腔给予0.5或1.5 mg/kg的Rapamycin,随后连续每日给药一次。利用滚轮实验、垂直棒实验及平衡木实验评价运动功能;利用甲苯胺蓝染色法测定脑梗死体积;利用Western blot和免疫组化检测 TBI损伤侧皮层组织 GFAP、p-mTOR、mTOR、硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans, CSPGs),一种抑制轴突再生的抑制性分子和髓鞘轴突标记蛋白神经丝蛋白-200(neurofilament-200, NF-200)的表达水平,并测定胶质疤痕的厚度及面积。
  结果:
  脑冷冻伤后3 d和7 d GFAP的表达显著增高(P<0.05),mTOR在TBI后6 h时就被明显激活,表现为p-mTOR/mTOR水平明显升高(P<0.05)。在TBI后连续3 d给予Rapamycin可浓度依赖地下调TBI诱导的GFAP表达,其中1.5 mg/kg的Rapamycin能显著抑制TBI诱导的GFAP表达(P<0.001),同时对mTOR磷酸化(p-mTOR/mTOR)有明显抑制作用(P<0.05),增大皮层梗死体积(P<0.05),加重 TBI后早期运动神经功能障碍。而0.5 mg/kg的Rapamycin连续给3 d时对GFAP表达仅有下调的趋势,但无显著性差异,并且对梗死体积和神经功能均无显著影响。但0.5 mg/kg的Rapamycin连续给药可显著促进7 d或14 d时的运动功能恢复,并对14 d时的GFAP表达的具有明显抑制作用,同时显著减少胶质疤痕体积和厚度(P<0.01)及胶质疤痕组分 CSPGs的表达(P<0.05)。此外,Rapamycin可显著增加神经轴突标志蛋白NF200在胶质疤痕区域的表达。
  结论:
  Rapamycin(0.5 mg/kg)连续每日给药对TBI引起的星形胶质细胞活化及胶质疤痕的形成具有抑制作用,这可能是其改善TBI后期神经运动功能障碍的机制之一。此外,Rapamycin给药剂量增加至1.5 mg/kg尽管可以显著的抑制星形胶质细胞活化,但会加重TBI早期的神经损伤,并不利于神经功能的恢复。
[硕士论文] 袁菲菲
儿科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:胎龄小于37周出生的新生儿称为早产儿,呼吸停止时间>20秒,伴有心率减慢<100次/分或出现青紫、血氧饱和度降低和肌张力低下,称为呼吸暂停。早产儿呼吸暂停是目前新生儿重症监护中面临的主要临床问题之一,若不能妥善治疗将引起一系列非常严重的并发症。甲基黄嘌呤类药物是治疗呼吸暂停最常用的药物,包括枸橼酸咖啡因和氨茶碱两种。国内自2013年引入枸橼酸咖啡因,之前一直沿用氨茶碱,目前还没有足够证据支持枸橼酸咖啡因治疗效果。本文的目的就是以meta分析的方式比较枸橼酸咖啡因与氨茶碱治疗早产儿呼吸暂停的临床疗效。
  方法:对PubMed、Embase、Cochrane registry of controlled clinical trials、Sinomed、CNKI、WanFang Data以及CQVIP等数据库进行系统检索自数据库建立至2016年3月31日的所有对比枸橼酸咖啡因与氨茶碱治疗早产儿呼吸暂停临床效果的RCTs研究。文章语言设置为中文与英文。采用改良Jadad量表评价文献质量并提取数据进行meta分析。
  结果:meta分析共纳入26篇相关研究的文章,早产儿呼吸暂停采用枸橼酸咖啡因进行治疗1-3天的有效率明显高于氨茶碱(86.33% vs64.92%,RR=1.33,P<0.00001),采用治疗1-3天呼吸暂停次数进行比较两者并无显著差异(MD=-0.01,P=0.83)。氨茶碱治疗的早产儿呼吸暂停不良反应发生率明显高于枸橼酸咖啡因治疗的患儿(36.75% vs11.30%,RR=0.32,P<0.00001),尤其是心动过速(RR=0.20,P<0.00001)、喂养不耐受(RR=0.34,P<0.00001)、烦躁激惹(RR=0.35,P=0.0001)、高血糖(RR=0.24,P<0.0001)及血压升高(RR=0.16,P=0.03)的发生率明显高于枸橼酸咖啡因治疗组患儿。
  结论:目前研究结果表明,枸橼酸咖啡因治疗早产儿呼吸暂停有效率高且副作用小,因而更适宜用于早产儿呼吸暂停。
[硕士论文] 赵亚楠
内科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:比较核苷(酸)类似物(NAs)与干扰素(IFN)序贯治疗与NAs单药治疗对慢性乙型肝炎(CHB)患者的疗效,并进一步探索该三阶段治疗方法(经NAs初治,过渡期短暂联合IFN,IFN单药治疗)的最佳治疗方案。
  方法:采用RevMan5.3软件对纳入的24篇国内外随机对照试验及队列研究进行 meta分析,分析治疗结束时及随访时ALT复常率、HBV DNA转阴率、HBeAg转阴率、HBeAg转换率、HBsAg转阴率、HBsAg转换率,并进行不同治疗方案下各项指标的亚组分析。
  结果:⑴治疗结束时序贯治疗组的ALT复常率、HBV DNA转阴率、HBeAg转阴率、HBeAg转换率、HBsAg转阴率、HBsAg转换率分别为83.9%、78.4%、47.2%、41.6%、9.1%和5.6%,均高于单药治疗组68.6%、67.3%、26.8%、17.3%、0%和0%(P<0.05)。⑵根据NAs用药不同(ETV或LAM)行亚组分析发现,两亚组间ALT复常率和HBV DNA转阴率上差异有统计学意义,ETV组ALT复常率(92.1%)高于LAM组(85.7%),HBV DNA转阴率(78.9%)则略低于LAM组(79.0%),且差异均有统计学意义(P<0.05)。⑶根据IFN用药不同(COM IFN或PEG IFN)行亚组分析发现,ALT复常率在两亚组间差异有统计学意义(P<0.05),PEG IFN组(64.7%)低于 COM IFN组(86.5%)。进一步根据IFN治疗时间不同(≥48周和<48周)行亚组分析后提示,两亚组间差异无统计学意义。⑷余各项指标在不同的亚组内均提示,HBeAg转阴率、HBeAg转换率在序贯治疗组较单药组有优势。⑸治疗结束时ALT复常率、HBV DNA转阴率、HBeAg转阴率分别为84.4%、81.9%和85.0%,均高于随访时74.1%、63.1%和50%(P<0.05),HBeAg转换率在前者(48.8%)高于后者(47.4%),但差异无统计学意义(P>0.05)。治疗结束时HBsAg转阴率和HBsAg转换率(10.6%、8.3%)均低于随访时[(12.3%、10.3%), P>0.05]。⑹根据IFN用药时间不同(≥48周和<48周)行亚组分析后提示,在IFN用药时间<48周组,ALT复常率和HBV DNA转阴率在治疗结束时明显高于随访时(84.4%vs73.1%,81.0% vs63.4%),差异有统计学意义(P<0.05),余指标在两亚组内差异均无统计学意义(P>0.05)。
  结论:①治疗结束时,序贯用药组在ALT复常率、HBV DNA转阴率、HBeAg转阴率、HBeAg转换率、HBsAg转阴率、HBsAg转换率方面均优于NAs单药治疗组。②IFN治疗时间<48周时,在停药后随访时其ALT复常率和HBV DNA转阴率均低于治疗结束时,因此考虑长期停药有导致HBV复发的可能。③IFN治疗时间≥48周时,既往应用ETV或LAM经治的患者序贯IFN治疗后停药24周是安全可行的,但仍需长期随访观察。
[硕士论文] 殷莎
药理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨奈比洛尔对肾性高血压大鼠肾脏的保护作用及其与非对称性二甲基精氨酸(ADMA)的关系,为肾性高血压的治疗提供新思路。
  方法:
  选取体重150g雄性wistar大鼠,用内径0.2mm银夹夹闭左肾动脉,制备两肾一夹(2K1C)肾性高血压大鼠模型。术后4周用尾袖套法进行无创血压测量,若收缩压(SBP)大于160mmHg认为模型成功。同等体重健康大鼠仅分离左肾动脉,但是不夹闭肾动脉,作为伪手术对照组(i.g蒸馏水)。2K1C大鼠随机分成4组(n=6):①2K1C肾性高血压模型组(i.g蒸馏水);②2K1C+奈比洛尔组(i.g10mg/day);③2K1C+阿替洛尔组(i.g80mg/day);④2K1C+卡托普利组(i.g20mg/day),给药8周。术前和术后不同时间段测量SBP并收集24小时尿液,用以检测尿液中N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿肌酐(Ucr)、β2-微球蛋白(β2-MG)、微量白蛋白(mALB)和尿蛋白排泄量并计算内生肌酐清除率(Ccr)。实验结束时,大鼠麻醉后经腹主动脉采血,用以检测血浆一氧化氮(NO)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血浆肾素活力(PRA)、血管紧张素II(AngII)和非对称性二甲基精氨酸(ADMA)浓度;并快速分离左右肾脏,用于观察肾脏结构以及western blotting实验;HE染色观察肾脏结构;PAS染色观察肾小球系膜增生;Masson及α-SMA免疫荧光观察肾脏纤维化;KIM-1、nephrin免疫荧光观察肾小管和足细胞的损伤;透射电镜观察肾小球滤过屏障完整性,足细胞形态及基底膜厚度;蛋白印迹法测iNOS,eNOS,nNOS, DDAH1和2,PRMT1蛋白的表达。
  结果:
  与伪手术组比较,2K1C模型组肾动脉狭窄术后1周SBP开始升高,在第4周达到高值,并稳定持续至术后12周,高达183.22±2.64mmHg。奈比洛尔、阿替洛尔和卡托普利均可逐渐降低2K1C大鼠SBP。2K1C大鼠的尿液体积和饮水量在术后1周急剧升高,2周达到峰值,尿肌酐在术后4周内明显低于伪手术组(P<0.05),这种差异逐渐缩小,到实验结束时,此三项改变在两组之间无显著性差异。与伪手术组比较,2K1C组尿蛋白排泄量在术后持续稳定升高至术后12周,奈比洛尔和卡托普利均可降低2K1C大鼠尿蛋白,奈比洛尔效果较卡托普利显著(P<0.05)。2K1C组大鼠血浆、左肾组织中AngII和PRA与伪手术组比较有上升趋势但无统计学差异,但右肾组织中的AngII的含量明显高于伪手术组,三药都能降低右肾AngII水平。HE染色观察到2K1C组大鼠肾小球代偿性肥大,PAS染色和 Masson染色及α-SMA荧光染色显示肾小球系膜增生、肾小球和间质纤维化程度明显增加;透射电镜提示2K1C大鼠肾小球滤过屏障基底膜厚度明显高于伪手术组,足细胞足突广泛融合,nephrin免疫荧光显示足细胞nephrin表达减少,上述改变尤以右侧肾脏显著。除阿替洛尔外,奈比洛尔和卡托普利均可不同程度改善2K1C大鼠上述改变,尤以奈比洛尔显著(P<0.05)。2K1C组大鼠尿液β2-MG/Ucr,mALB/Ucr,NAG的浓度和肾小管KIM-1表达明显增加,给予奈比洛尔能够有效降低β2-MG/Ucr,mALB/Ucr,NAG浓度和KIM-1的表达。并且奈比洛尔能够降低Scr和BUN的水平,提高Ccr(P<0.05)。虽然2K1C与伪手术组血浆NO无明显差异,但2K1C组大鼠左肾nNOS和左右两肾eNOS表达明显低于伪手术组,左肾iNOS表达则明显高于伪手术组,奈比洛尔能够增加2K1C大鼠血浆NO水平,上调右肾nNOS和eNOS表达,下调左肾iNOS的表达。另一方面,2K1C组血浆ADMA增高,虽然两侧肾脏DDAH1表达无显著性差异,但PRMT1表达显著增加,且左肾DDAH2表达显著降低(P<0.05)。奈比洛尔,阿替洛尔,卡托普利虽然不同程度影响PRMT1,DDAH1,2表达,但仅奈比洛尔降低2K1C大鼠血浆ADMA水平。
  结论:
  奈比洛尔可显著改善2K1C肾性高血压大鼠肾功能损伤和结构变化,此作用可能与其调节 PRMT/ADMA/DDAH代谢轴有关。
[博士论文] 杨帆
计算机软件与理论 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目前,医疗安全正日益得到重视。其中,对药物不良反应信号的预测,在药物安全研究领域与新药研发领域具有重要的意义。药物不良反应每年会造成全球三分之一的医疗事故,以及上千亿美元的经济损失。因此,对药物不良反应的研究越来越受到世界各国的重视。为了监测药物不良反应,学者们基于医疗数据库提出了一些统计学模型和数据挖掘方法来监测/预测<药物-不良反应>关联关系。一方面,相关的数据挖据方法大都是基于关联规则或模式匹配算法,挖掘<药物-不良反应>的关联关系。由于这些数据挖掘算法只关注高频繁度的关联关系,因此存在两类缺点:(1)无法监测到低频的关联关系;(2)由于忽略了关联规则中混杂因子的影响,因此无法控制伴随药物对监测关联关系的影响,从而造成较高的错误率。另一方面,统计学对药物不良反应问题的建模,大都在小样本数据上基于列关联表计算<药物,不良反应>关联关系的强度,因此存在两类缺点:(1)小样本数据造成关联关系预测信号的偏差较大;(2)无法基于不同病人进行个性化预测。
  为解决上述问题,本文通过收集处理海量医疗数据,并基于机器学习方法针对药物不良反应监测的相关问题进行了研究。首先,本文的第一个研究问题是病人药物不良反应的个性化预测问题。药物不良反应的个性化,是指由于病人体质的差异,相同药物在不同病人体内会产生特定的不良反应,因此需要根据不同病人的特征来预测相应的药物不良反应。本文提出了一种基于病人特征相似度计算的多任务学习模型。该工作基于美国食品药品管理局公开的药物不良反应数据库FAERS,对病人信息构建特征空间,并首次提出将推荐系统中个性化推荐的方法应用在药物安全研究领域。本文基于FAERS数据提出多任务学习模型,通过计算病人与各种不良反应的关联强度,建立对应的个性化药物不良反应排序表。此外,本文原创性提出了一种新的衡量药物不良反应关联强度的验证标准HitRate@n。通过实验表明,该模型在预测病人个性化药物不良反应问题上,有较高的准确率。
  其次,本文的第二个研究问题是药物多频率不良反应的预测问题。由于不同频率的不良反应造成的问题和危害不同,尤其是低频药物不良反应在临床测试阶段很难被检测出来,因此需要根据不同病人特征及药物属性来预测不同频率的不良反应。为此,本文提出了一种基于多核函数学习的多任务学习模型。该工作通过分析FAERS结构化数据,提出根据药物分子结构差异进行特征分类,并构建多核函数池。该模型通过核函数学习方法找出每一类特征对应的最优核函数,并根据不同特征构建对应的凸优化限制条件以及规则化函数,令相同特征在不同的病人不良反应预测任务中实现权重自动调整,达到预测不同频率不良反应的要求。同时,该模型将基于历史任务学习中训练的药物特征权重及不同药物特征核函数间的关系权重,用于对病人新药组合的预测任务中,可以实现对病人新药组合不同频率不良反应的预测。在验证标准HitRate@n的基础上,本文提出了一种衡量不同频率不良反应的验证标准overall-HitRate@n。实验表明,该模型在预测病人不同频率不良反应的问题上,尤其是低频药物不良反应,均优于所比较的方法。
  最后,本文的第三个研究问题是计算<药物,不良反应>关联关系的正阳性/因果性问题。由于小样本数据以及混杂因子(即伴随药物)的影响,造成所监测的关联关系的准确率较低,即关联关系的正阳性/因果性较弱。本文基于收集处理的4百万条FAERS病人数据,提出了一种伽玛泊松衰减多变量线性回归模型。本文使用伽玛泊松共轭先验分布对<药物,不良反应>的出现频率建模,并提出在监测单一药物不良反应关联关系时,将特征空间中其他所有药物视作伴随药物,通过建立回归模型减少混杂因子对关联关系的影响。
  本文对药物不良反应监测相关问题进行了深入研究,针对特定问题,给出了针对性的解决方案。本文的创新点和贡献如下:(1)针对药物不良反应个性化预测问题,本文首次提出了一种基于病人特征相似度计算的多任务学习模型;(2)针对数据挖掘方法难以监测低频药物不良反应的问题,本文提出基于多核函数多任务学习模型,通过多核函数多任务凸优化学习来预测药物不同频率的不良反应,并能有效的监测到低频药物的不良反应;(3)针对<药物,不良反应>关联关系正阳性/因果性的准确率问题,本文提出一种基于伽玛泊松衰减多变量线性回归模型,通过控制混杂因子来提高预测<药物,不良反应>关联关系的正阳性/因果性。
  综上所述,本文在基础理论和关键技术方面的研究成果为监测药物不良反应问题提供了新的途径。
[博士论文] 刘杰
外科学(血管外科) 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:动脉粥样硬化引起的下肢动脉闭塞性疾病(peripheral artery disease,PAD)严重损害患肢功能并威胁患者的生存质量,显著增加冠状动脉疾病、脑卒中、主动脉瘤和肾功能不全的风险。我国已快速进入老龄化社会,60岁以上老年人口将达2.21亿,PAD患病人群将达到4400余万人,PAD的预防和治疗工作已经刻不容缓。腔内治疗由于其微创的特点得到迅速发展,药涂球囊在冠状动脉原发狭窄和支架内再狭窄等方面取得了令人满意的结果,但其在下肢动脉狭窄性病变的实验研究和临床应用方面尚处于起步阶段。本研究从新型药涂球囊的药代动力学和安全性、有效性出发,探讨新型药涂球囊对PAD的治疗。
  本研究第一部分运用液相色谱-质谱联用技术,从不同扩张时间药涂球囊残药量、不同扩张时间药涂球囊扩张段血管壁药物含量、不同随访时间药涂球囊扩张段血管壁药物含量、不同随访时间血药浓度和不同随访时间主要脏器含药量等方面对新型药物涂层球囊进行体内药代动力学研究。结果显示:(1)不同扩张时间球囊残余药量:未扩张的球囊残药量为649.04±60.17μg,占球囊总载药量的86.08±7.98%,输送过程中损失占比为13.92±7.98%;球囊分别扩张60秒、180秒和300秒,球囊残药量分别为63±9.14μg,62.71±12.87μg和62.94±19.09μg,分别1占球囊总载药量的8.36±1.21%、8.32±1.71%和8.35±2.53%;(2)不同扩张时间药涂球囊扩张段血管壁药物含量:药涂球囊分别扩张60秒、180秒和300秒,血管壁药物含量分别58.91±28.08μg/g,272.9±127.9μg/g和317.2±72.76μg/g;(3)不同随访时间药涂球囊扩张段血管壁药物含量:药涂球囊均扩张180秒,术后1小时、术后24小时、术后3天和术后7天的血管壁含药量分别为272.9±127.9μg/g,127.9±65.14μg/g,33.43±20.31μg/g和13.56±5.89μg/g;(4)不同随访时间血药浓度:血液药物浓度术后1小时、术后6小时、术后12小时、术后3天、术后7天分别为17.21ng/ml、19.50ng/ml、22.33ng/ml、30.67ng/ml、42.82ng/ml和31.38ng/ml;(5)不同随访时间主要脏器单位组织重量药物含量:术后1小时、24小时、3天和术后7天,心脏组织中单位重量药物含量分别为26.89ng/g、392.78ng/g、231.41ng/g和176.95ng/g,肝脏组织中含药量分别为23.2ng/g、425.12ng/g、221.69ng/g和239.26ng/g,脾脏组织含药量分别为35.54ng/g、425.47ng/g、206.90ng/g和194.03ng/g,肺脏组织含药量分别为886.96ng/g、955.35ng/g、217.16ng/g和253.36ng/g。上述结果提示此款新型药物涂层球囊能够实现药物的快速有效释放。
  第二部分采用猪外周动脉狭窄模型,运用定量血管造影、光学相干断层成像、病理学评价和扫描电镜等方法,从器械相关不良事件、主要脏器和外周组织总体评价、内皮化程度等方面对新型药物涂层球囊的安全性进行评价,从管腔丢失、血管狭窄百分率、新生内膜等方面对新型药物涂层球囊的有效性进行评价。安全性评价结果显示:(1)所有实验动物均未发生与器械相关的不良事件未发生肢体发绀、跛行、急性血栓、远端栓塞、严重夹层、血管破裂和器材折断等情况;(2)所有实验动物的主要脏器和外周组织总体评价和组织学损伤评价未现异常;(3)扫描电镜显示,28天时药涂球囊组内皮化程度弱于普通球囊组,90天时两组均已完全内皮化,内皮细胞排列规则,细胞间连接紧密。上述结果提示此款新型药物涂层球囊具有良好的安全性。有效性评价结果显示:(1)定量血管造影,随访28天时普通球囊组和药涂球囊组管腔丢失分别为1.29±0.68mm和1.05±0.87mm,两组血管狭窄百分率分别为24.34±11.95%和21.12±16.70%,90天时两组管腔丢失分别为1.19±0.51mm和1.01±0.29mm;血管狭窄百分率分别为24.71±7.98%和22.97±7.61%;(2)光学相干断层威像显示,两组内膜均完全覆盖支架,随访28天和90天时普通球囊组内膜增生较药涂球囊组明显;(3)组织病理学结果显示,随访28天和90天时普通球囊组和药涂球囊组均已形成完整内膜,普通球囊组较药涂球囊组内膜增生明显。上述结果提示,此款新型药涂球囊在动物实验中表现出良好的有效性趋势。
  本研究通过动物实验提供了新型药涂球囊治疗下肢动脉闭塞性病变的药代动力学数据和疗效数据,证明此款药物涂层球囊能够实现药物的快速有效释放并且显示出良好的有效性趋势。
[硕士论文] 叶洪涛
生物医学工程 安徽理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  军事医学科学院毒物药物研究所神经精神药理研究室长期从事抗抑郁药物研发及相关基础研究。前期以度洛西汀(duloxetine,DLX)为先导化合物,合成筛选出新型化合物盐酸阿姆西汀(ammoxetine,AMX),前期已经证实其具有显著的抗抑郁活性,并且肝毒性远远低于度洛西汀。小补心汤(XBXT)属于传统古方中药,最早见于南北朝时期的敦煌莫高窟遗书《辅行决脏腑用药法要》,由代赭石、旋复花、竹叶、淡豆豉四味中药组成。该研究室首次发现XBXT及其总黄酮提取物(XBXT-2)在多种模型上表现出明确的抗抑郁活性。
  近年来,研究发现糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase,GSK3β)及其相关信号通路与抑郁症的发生和治疗密切相关,GSK3β失活(磷酸化增加)会产生抗抑郁作用,本课题组前期实验发现AMX和XBXT-2均可以增加GSK3β磷酸化水平并激活其相关信号通路。本研究拟在前期工作的基础上,采用基因转染技术,使小鼠脑组织海马部位GSK3β过表达或者持续激活,进一步探究AMX和XBXT-2对GSK3β相关信号通路的影响,试图阐明GSK3β及其相关信号通路是否是AMX和XBXT-2抗抑郁作用发挥的关键环节。
  方法:
  本研究采用以腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)为载体的基因转染技术,构建包装有GSK3β(WT)野生型和GSK3β(S9A)突变型基因的腺相关病毒,通过海马立体定位微注射的方式,使GSK3β在小鼠海马过表达或者持续激活,通过一系列行为学和分子生物学实验探讨GSK3β是否是AMX、XBXT-2发挥抗抑郁、抗焦虑作用的关键分子靶标。
  (一)海马GSK3β过表达/持续激活对AMX抗抑郁作用的影响:
  进行小鼠海马脑区微注射,使GSK3β在海马过表达/持续激活,通过悬尾实验和强迫游泳实验,研究海马GSK3β过表达/持续激活对阿姆西汀抗抑郁作用的影响;并通过蛋白免疫印迹法(western blot)检测海马脑区PI-3K/Akt/GSK3β信号通路的功能蛋白及脑源性神经营养因子(BDNF)含量的变化。
  (二)海马GSK3β持续激活对XBXT-2抗抑郁作用的影响:
  进行小鼠海马脑区微注射,使GSK3β在海马持续激活,通过悬尾实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫实验、爬梯实验研究海马GSK3β持续激活对小补心汤总黄酮抗抑郁、抗焦虑作用的影响;进行小鼠海马脑区微注射,使GSK3β在海马持续激活,在获得性无助模型上探究GSK3β的失抑制是否会增加抑郁的易感性;并通过western bolt方法检测PI-3K/Akt/GSK3β信号通路各蛋白以及BDNF含量的变化,探讨GSK3β失抑制增加抑郁易感性的机制。
  结果:
  (一)AMX单次给药(2.5mg/kg)可以显著缩短阴性病毒组小鼠的悬尾不动时间,该行为效应能够被小鼠海马GSK3β过表达/持续激活所取消;AMX单次给药(5 mg/kg)可以显著缩短阴性病毒组小鼠的强迫游泳不动时间,该行为效应能够被小鼠海马GSK3β过表达/持续激活所取消;无论是药物还是海马GSK3β过表达/持续激活均对小鼠自发活动没有影响;western blot结果显示AMX可以上调p-Akt、p-GSK3β、p-CREB、BDNF的蛋白表达水平,但是该作用被GSK3β过表达/持续激活所取消。
  (二)XBXT-2长期给药(100mg/kg)可以显著缩短阴性病毒组小鼠的悬尾不动时间和强迫游泳不动时间,该行为效应均能够被海马GSK3β持续激活所取消;XBXT-2长期给药(100mg/kg),可以显著缩短阴性病毒组小鼠在爬梯实验中的站立次数,该行为效应能够被海马GSK3β持续激活取消;XBXT-2长期给药(100mg/kg),可以显著增加阴性病毒组小鼠在高架实验中进入开臂次数的百分比和在开臂停留时间的百分比,该行为效应不仅被海马GSK3β持续激活所取消,并且海马GSK3β持续激活显著降低了小鼠进入开臂次数的百分比;在获得性无助模型中,GSK3β持续激活小鼠逃避失败次数显著增加,糖水偏嗜度显著下降,并且XBXT-2的抗抑郁行为效应被完全取消;western blot结果显示在获得性无助造模之后,GSK3β持续激活小鼠的p-Akt、p-GSK3β、p-CREB、BDNF表达水平同阴性病毒组相比均显著下降,并且XBXT-2对这些蛋白的上调作用亦被完全取消。
  结论:
  通过本课题实验研究可得到如下结论:(1)在悬尾实验和强迫游泳实验中,海马GSK3β过表达或持续激活不能引起小鼠抑郁样表现,但是能够取消AMX和XBXT-2的抗抑郁行为效应;(2)在高架十字迷宫实验和爬梯实验上,GSK3β持续激活取消了XBXT-2的抗焦虑作用,并且在高架十字迷宫实验中产生致焦虑样行为表现;(3)在获得性无助模型中,GSK3β持续激活会导致应激易感性增加;(4) GSK3β过表达/持续激活对p-Akt、p-CREB和BDNF的蛋白表达水平无显著影响,但是能够取消AMX对这些蛋白含量的上调作用;(5) GSK3β持续激活在获得性无助模型之后,能够显著下调p-Akt、p-CREB和BDNF的蛋白表达水平,并取消了XBXT-2对这些蛋白水平的上调作用。
[硕士论文] 侯彩平
药剂学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  利用分子生物学技术,干扰Aha1的正常表达,分析干预前后斑马鱼运动能力、肌小节组分蛋白、肌球蛋白分子伴侣热激蛋白90(Hsp90α)和Unc45b的变化,探寻Aha1对肌小节组装的调控作用及其与Hsp90α、Unc45b的相互关系,以期为肌肉组装异常相关疾病的诊断治疗以及药物开发提供理论和实验证据。
  方法:
  运用分子生物学手段克隆Aha1基因,采用原位杂交及实时定量PCR技术检测Aha1基因在斑马鱼不同发育时期的表达和分布。采用TALEN、CRISPR-Cas9、siRNA、构建过表达载体等技术,通过显微注射的方法干扰斑马鱼Aha1的正常表达,采用测序及实时定量PCR等技术筛选Aha1基因受到干扰的斑马鱼,通过免疫组织化学染色的方法检测干预前后肌小节组分蛋白actinin的表达。行为学实验分析干预前后斑马鱼的运动能力改变。实时定量PCR法检测肌小节组装相关分子伴侣Hsp90α和Unc45b的变化,用以分析Aha1与Hsp90α、Unc45b的相关性。
  结果:
  通过原位杂交及实时定量PCR的方法确定:Aha1基因主要在斑马鱼骨骼肌及心肌中特异性表达,24 hpf时Aha1的两个同源基因ahsa1a和ahsa1b表达水平较高,故基本选取发育至24 hpf的斑马鱼完成之后的系列实验。利用TALEN基因敲除技术获得3个Aha1基因突变体品系,目标序列五个不连续碱基被敲除,且RT-PCR法证明TALEN突变体Aha1基因表达量降低;CRISPR-Cas9实验注射 CRISPR ahsa1a、ahsa1a+ahsa1b-3、ahsa1a+ahsa1b-4组成功敲除掉ahsa1a基因目标序列的五个连续碱基;siRNA实验仅显微注射ahsa1b749组使ahsa1b的表达量降低;表达载体ahsa1a和ahsa1b注射斑马鱼实验中,两基因在斑马鱼骨骼肌及心肌中均发生过表达现象。免疫组化实验表明采用CRISPR-Cas9及siRNA技术干预斑马鱼Aha1基因后肌小节组装蛋白辅肌动蛋白actinin未发生明显变化。斑马鱼行为学实验表明Aha1基因发生突变或表达量减少会降低斑马鱼的运动能力及发育水平。分子伴侣表达量实验显示, TALEN突变体斑马鱼Hsp90α和Unc45b的表达水平均明显降低,注射siRNA1b749和1a438+1b462组Unc45b的基因表达量降低,注射siRNA后Hsp90α表达水平未降低,结果表明Aha1作为一个辅助分子伴侣对肌小节的组装具有十分重要的作用。
  结论:
  本实验成功克隆了斑马鱼Aha1基因,检测出Aha1在斑马鱼肌肉特异性表达。实验成功筛选出Aha1基因突变体,且证实Aha1基因发生突变不仅会影响斑马鱼的发育及运动,也会使分子伴侣Hsp90α和Unc45b的表达水平降低,从而影响斑马鱼肌小节的组装。综上,Aha1基因作为一种肌小节组装的辅助分子伴侣,在肌无力和肌肉萎缩疾病防治中发挥重要作用。
  本课题为国家自然科学基金“Aha1基因对斑马鱼肌小节组装的调控作用(编号:3140070050)”。
  
[硕士论文] 吴逸
公共卫生预防医学;营养与食品卫生学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  (1)用木犀草素(Luteolin,Lut)及叶酸(Folic acid,FA)干预经黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)染毒的人正常食管上皮细胞,观察其对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因、叶酸受体1(folate receptor1/a,FOLR1/FRa)基因表达及MTHFR基因启动子区甲基化状态的影响,探索Lut及FA干预对AFB1毒性的保护作用及其机制,为Lut的临床应用及其与FA对预防、控制AFB1对人正常食管上皮细胞的毒性作用提供一定的实验基础和理论依据。(2)Lut干预食管癌Eca109细胞,探讨Lut诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的作用及其作用机制。
  方法:
  (1)AFB1染毒处理对人正常食管上皮细胞生理学的影响:用Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)测定AFB1对人食管正常上皮细胞增殖的影响;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。(2)Lut及FA对AFB1染毒处理的人正常食管上皮细胞的干预作用的研究:用Lut及FA干预AFB1处理的人类正常食管上皮细胞,CCK8法检测细胞生长状况,FCM检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。(3)Lut及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1基因影响的研究:Real-time PCR检测MTHFR、FOLR1mRNA的表达情况;Western blot检测MTHFR、FOLR1蛋白表达情况;MassArray甲基化定量检测细胞MTHFR基因启动子区甲基化水平。(4)Lut对人食管癌Eca109细胞生理学的影响及其作用机制的研究:四甲基氮唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)法检测Lut对Eca109细胞增殖的影响;FCM检测食管癌细胞周期和凋亡情况;Real-time PCR检测食管癌Eca109细胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3mRNA的表达情况;Western Blot检测食管癌Eca109细胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3蛋白表达水平。
  结果:
  1.AFB1染毒处理对人正常食管上皮细胞生理学的影响:(1)用13μM、25μM、50μM、100μM、200μM AFB1处理人类正常食管上皮细胞24h、48h、72h,均可以抑制细胞增殖;(2)FCM周期检测结果显示,AFB1主要作用于人正常食管细胞的G0/G1期及S期,50μM、100μM、200μM AFB1处理细胞24h,G0/G1期细胞比例明显升高(p<0.05),S期细胞比例明显降低(p<0.05),细胞被阻滞在G0/G1期;(3)100μM、200μM AFB1组细胞凋亡比例明显高于空白对照组(p<0.05),50μMAFB1组早期凋亡细胞比例明显升高(p<0.05)。
  2.Lut及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞的干预作用的研究:(1)Lut及Lut联用FA干预组细胞抑制率明显低于染毒对照组(p<0.05),FA单独干预的效果不明显(P>0.05);(2)Lut、Lut联合FA干预组G0/G1期细胞比例较染毒组明显降低(P<0.05),S期的细胞所占比例明显高于染毒对照组(P<0.05);FA干预效果不明显;(3)Lut、Lut联合FA干预组细胞凋亡率明显低于染毒对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  3.Lut及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1基因影响的研究:(1)Real-time PCR检测结果显示:AFB1染毒24h上调人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1mRNA的表达(P<0.05)。经Lut干预后,细胞MTHFR、FOLR1mRNA的表达明显减少(P>0.05)。用20μM、200μM FA进行干预,细胞MTHFR mRNA的表达未受明显的影响(P>0.05);而200μM FA组FOLR1mRNA的表达明显下降(P<0.05),20μM FA组下调效果不及200μMFA组(P<0.05)。Lut联用FA干预能明显减弱AFB1对MTHFR mRNA表达的上调影响(P<0.05),Lut联用20μMFA组与Lut联用200μM FA组对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞FOLR1mRNA表达产生不同的调节作用(P<0.05);(2)实验结果显示,AFB1染毒上调人正常食管上皮细胞MTHFR蛋白的表达(P<0.05),下调FOLR1蛋白的表达(P<0.05)。经Lut干预后,细胞MTHFR蛋白表达减少、FOLR1蛋白表达增加(P<0.05)。20μM、200μM FA干预组细胞MTHFR蛋白的表达程度与染毒组相近(P>0.05);FOLR1蛋白表达程度接近空白对照组(P>0.05),提示FA对MTHFR蛋白表达干预效果不明显,对FOLR1蛋白表达的干预效果明显。Lut联用FA干预能明显减弱AFB1对MTHFR、FOLR1蛋白表达的影响(P<0.05)。(3)MassArray甲基化定量检测细胞MTHFR扩增子中的CpG单位的甲基化水平,结果显示,CpG_5、CpG_6.7、CpG_16、CpG_35、CpG_42单位的染毒组甲基化水平明显高于空白对照组(P<0.05)。比较Cpg_5和CpG_35位点的甲基化水平,发现Lut组及Lut联用200μMFA干预组的甲基化水平明显低于染毒组(P<0.05),与空白对照组接近(P>0.05);CpG_6.7位点,染毒组细胞甲基化水平明显高于空白对照组(P<0.05),200μM FA组的甲基化水平明显低于染毒组(P<0.05);CpG_16、CpG_42位点,除20μM FA干预组,其余各干预组干预效果明显(P<0.05)。
  4.Lut对人食管癌Eca109细胞生理学的影响及其作用机制的研究:(1)MTT实验结果表明,用Lut浓度为40μM、80μM、120μM、160μM、200μM、240μM处理食管癌Eca109细胞24h、48h和72h,均可以抑制细胞增殖(P<0.05),且随Lut浓度的增加,呈倒U型;(2)选用40μM、160μM、240μM为后期实验干预浓度,经FCM检测,Lut浓度为160μM、240μM时,细胞阻滞于S期间,并在浓度为160μM时诱导细胞凋亡,细胞早凋率明显增加(P<0.05);(3)Lut可下调CDK2mRNA的表达(P<0.05),且随着浓度的增加,Lut对CyclinA、Caspase9及Caspase3mRNA表达的作用呈现出先促进后抑制的趋势;(4)Lut可下调CDK2蛋白表达(P<0.05),对CyclinA表达的作用表现为先促进后抑制,160μM、240μM Lut组CyclinA蛋白表达受抑制(P<0.05),蛋白表达水平随剂量的增加而降低。Lut对Caspase9、Caspase3表达呈现先增加后抑制的作用趋势,240μM Lut组Caspase9、Caspase3蛋白表达明显受抑制(P<0.05)。
  结论:
  (1)AFB1能够通过阻滞细胞周期,促进细胞凋亡,来抑制人正常食管上皮细胞增殖,并存在一定的剂量-效应关系,Lut和FA的干预能够减弱AFB1对人正常食管上皮细胞的增殖抑制、周期阻滞及凋亡促进作用,对AFB1的毒性作用起到一定的保护作用。(2)Lut和FA的干预可以减弱AFB1对人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1mRNA和蛋白表达的影响,改善细胞FA代谢,从而发挥对人正常食管上皮细胞的保护作用;Lut及FA可以减弱AFB1对人正常食管上皮细胞的毒性作用,保护人正常食管上皮细胞。Lut及FA的干预可以降低MTHFR基因启动子区因AFB1所致的甲基化水平的升高,不同CpG位点干预效果不同。(3)Lut通过抑制食管癌Eca109细胞的增殖,下调Eca109细胞CDK2及CyclinA将细胞周期阻滞于S期并诱导细胞凋亡,发挥抑制食管癌的作用;Lut诱导Eca109细胞凋亡,其作用机制涉及Caspase9、Caspase3的表达,但具体机制尚需进一步研究。
[硕士论文] 苗贝贝
药学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  比较无氟喹诺酮类药物(NFQ)奈诺沙星与氟喹诺酮类药物(FQ)左氧氟沙星、莫西沙星对肺炎链球菌(streptococcus pneumonia, S. pneumonia)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)的体外抗菌活性及防耐药突变选择能力,其中金黄色葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSAs)、氟喹诺酮耐药 MRSA(fluoroquinolone resistant-MRSA, FR-MRSA)和社区获得性 MRSA(community acquired-MRSA, CA-MRSA);比较不同基因位点突变类型的金黄色葡萄球菌在不同药物浓度时的细菌恢复生长情况,并以此初步探索奈诺沙星、左氧氟沙星和莫西沙星分别对金黄色葡萄球菌gyrA、gyrB、parC和parE基因作用的靶位优先顺序。
  方法:
  采用琼脂稀释法测定无氟喹诺酮类药物奈诺沙星和两种氟喹诺酮类药物左氧氟沙星和莫西沙星对50株MRSA、31株FR-MRSA和43株CA-MRSA及10株肺炎链球菌的MIC;随机测定奈诺沙星等三种抗菌药物对5株FR-MRSA、5株肺炎链球菌的MPC及43株CA-MRSA的MPC;计算选择指数(Selection Index, SI)MPC/MIC的数值;
  测定实验菌株 RN450和 RN450A1及其左氧氟沙星诱导突变株 RN450A2和RN450A3的基因突变位点,并用琼脂稀释法分别测定它们的MIC和MPC;菌落计数法测定细菌恢复生长情况并描记细菌恢复生长曲线。结果:
  奈诺沙星、左氧氟沙星和莫西沙星对50株MRSA的MIC90(可抑制90%细菌生长的药物浓度)分别为0.5μg/mL、16μg/mL和2μg/mL;奈诺沙星、左氧氟沙星和莫西沙星对31株FR-MRSA的MIC90分别为4μg/mL、>32μg/mL和8μg/mL;奈诺沙星、左氧氟沙星和莫西沙星对43株CA-MRSA的MIC90分别为0.5μg/mL、8μg/mL和2μg/mL。
  奈诺沙星、左氧氟沙星和莫西沙星对5株FR-MRSA的选择指数分别为4、2~8、4~8;奈诺沙星、左氧氟沙星和莫西沙星对5株肺炎链球菌的选择指数均为4~16;奈诺沙星、左氧氟沙星和莫西沙星对43株CA-MRSA的选择指数均为4~8。
  实验菌株RN450和RN450A1分别是野生型和gyrA基因(Ser84→Leu)单位点突变菌株。RN450A2来自 RN450的左氧氟沙星0.8μg/mL诱导突变,是 parC基因(Ser80→Phe)单位点突变菌株;RN450A3来自 RN450A1的左氧氟沙星7.0μg/mL诱导突变,共发生三处 QRDRs基因突变,分别是 gyrA基因(Ser84→Leu和Gly106→Asp)和parC基因(Ser80→Phe)突变。
  奈诺沙星对RN450、RN450A1、RN450 A2和RN450A3四株实验菌株的MIC分别为0.031μg/mL、0.062μg/mL、0.031μg/mL和0.5μg/mL;左氧氟沙星对四株实验菌株的MIC分别为0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.25μg/mL和8μg/mL;莫西沙星对四株实验菌株的MIC分别为0.031μg/mL、0.062μg/mL、0.062μg/mL和1μg/mL。
  奈诺沙星对四株实验菌株的MPC分别为0.125μg/mL、1μg/mL、1μg/mL和2μg/mL;左氧氟沙星对四株实验菌株的MPC分别为1μg/mL、8μg/mL、8μg/mL和32μg/mL;莫西沙星对四株实验菌株的MPC分别为0.25μg/mL、1μg/mL、4μg/mL和16μg/mL。
  从细菌恢复曲线上来看,在相同药物浓度时,对于不同药物来说,奈诺沙星的恢复生长细菌比例最小,而左氧氟沙星的恢复生长细菌比例最大;对于不同位点突变的细菌来说,在三种抗菌药物作用下RN450的恢复生长比例最小,而RN450A3的恢复生长比例最大。
  结论:
  奈诺沙星对 MRSA、FR-MRSA、CA-MRSA及肺炎链球菌的抗菌活性略优于莫西沙星,明显优于左氧氟沙星;奈诺沙星防止细菌发生下一步耐药突变的能力可能强于莫西沙星和左氧氟沙星。
  相较于左氧氟沙星和莫西沙星,奈诺沙星可在较低浓度时抑制金黄色葡萄球菌生长,且对不同基因位点突变细菌均有强大抑制作用;奈诺沙星和莫西沙星可能优先作用于金黄色葡萄球菌DNA旋转酶的gyrA基因或同时作用于gyrA基因和拓扑异构酶Ⅳ的 parC基因,而左氧氟沙星则可能优先作用于金黄色葡萄球菌拓扑异构酶Ⅳ的parC基因。
[硕士论文] 殷得莉
内科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过采用ICG001阻断β-catenin信号通路,观察阻断β-catenin通路对哮喘气道重塑的影响及相关机制。
  方法:将40只8周龄SPF级雄性Wistar大鼠,随机分为对照组(A组)、哮喘组(B组)、布地奈德组(C组)、ICG001组(D组),每组10只。采用卵白蛋白(OVA)致敏法,建立哮喘气道重塑模型。A组大鼠每次给予同等剂量的生理盐水。B、C、D组大鼠于d1、d8致敏,d15开始激发,20min/d,共8周;C组于每次激发前2小时雾化吸入布地奈德2mg;D组于每次激发前半小时腹腔注射ICG0015mg/kg。各组大鼠于末次激发后24小时内收集肺组织标本。大体上观察肺组织标本,光镜下观察HE染色切片,用BI2000分析系统测量支气管壁及平滑肌厚度。实时荧光定量PCR检测肺组织Snail、MMP-7 mRNA的表达。
  结果:行为学观察,B组大鼠整体毛发杂乱、活动减少、体型消瘦,每次激发后出现不同程度的立毛、尖叫、呼吸急促、口唇紫绀等,C、D组上述表现不明显,A组未出现上述表现。肺组织大体观察,B组肺组织表面不规则,颜色浑浊,呈不均匀性膨胀,可见不规则暗红色充血区,C、D组改变轻微,A组无上述改变。光镜下观察肺组织HE染色切片,A组支气管壁形态结构正常,管腔无狭窄,未见平滑肌增厚及炎细胞浸润,B组支气管管壁及平滑肌明显增厚,管腔变窄,支气管黏膜下有大量炎细胞浸润,C、D组较B组明显改善。测量支气管壁及平滑肌厚度,B组支气管壁、平滑肌厚度[(43.22±1.36)、(21.78±0.84)μm]显著高于A组[(26.32±0.24)、(14.21±0.13)μm];C、D组分别为[(36.51±0.44)、(19.67±0.92)μm]、[(32.69±1.57)、(17.39±0.91)μm],差异有统计学意义(均P<0.01)。实时荧光定量PCR检测肺组织Snail、MMP-7表达情况,结果提示Snail、MMP-7的mRNA表达情况B组>C组>A组>D组,差异有统计学意义(均P<0.01)。
  结论:⑴ICG001阻断β-catenin信号通路能够逆转哮喘气道重塑。⑵ICG001通过阻断β-catenin信号通路抑制下游Snail、MMP-7的表达逆转哮喘气道重塑。
[硕士论文] 史光玉
药剂学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  感染疟原虫的红细胞会特异性表达生成新渗透性通道(NPPs),并在红细胞膜上过表达胆碱转运载体(ECCs)。基于此,本课题以胆碱-聚乙二醇衍生物(CD-PEG-SA)为修饰分子,构建粒径<80 nm的胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒(CD-PEG-ARM-NLC),以期靶向红细胞膜上的NPP通道和ECC载体,达到长循环和靶向抗疟的作用。制备并表征CD-PEG-ARM-NLC;考察其对约氏疟原虫(PyBY265)、恶性疟原虫(Pf3D7)的体内外抗疟活性;并通过包载荧光探针香豆素-6研究CD-PEG-NLC对感染红细胞的靶向性。
  方法:
  1. CD-PEG-ARM-NLC的处方工艺考察
  在前期工艺研究基础上,采用高压乳匀法制备CD-PEG-ARM-NLC,通过对CD-PEG-SA的加入方式、用量进行单因素考察,优化制备处方。
  2. CD-PEG-ARM-NLC的质量表征
  对CD-PEG-ARM-NLC的形状、粒径、Zeta电位、包封率、载药量等理化性质进行表征,考察药物的体外释放特性,并进行体外溶血试验。
  3. CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价
  通过明胶沉降法从常规培养的Pf3D7中分离得到有/无knob结构的Pf3D7,以ARM为阳性对照,采用常规培养的、有/无knob结构的Pf3D7,应用SYBR Green I法,考察不同浓度的ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对疟原虫增殖的抑制作用,以药物的半数抑制浓度(IC50)为指标考察其体外抗疟活性。
  4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
  以香豆素-6(C6)为荧光探针,C6溶液为阳性对照,高压乳匀法制备C6-NLC、PEG-C6-NLC、CD-PEG-C6-NLC。将荧光纳米粒分别与体外培养的Pf3D7感染的红细胞、在体PyBY265感染的疟鼠红细胞孵育,荧光显微镜下观察荧光分布和强度。通过NPP通道和ECC载体抑制试验,比较不同纳米粒组的荧光亮度,分析NPP通道和ECC载体对纳米粒进入感染红细胞的影响。
  5. CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究
  采用约氏疟原虫BY265感染小鼠模型,以溶剂组、三种空白纳米粒组,不治疗(空白)组为阴性对照,以ARM组为阳性对照,通过四天抑制试验和28天治愈试验考察ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC三种纳米粒的抗疟活性。
  结果:
  1. CD-PEG-ARM-NLC考察后处方
  CD-PEG-SA的加入方式为外加乙醇法,加入量为m胆碱/m混脂=19.24%(g/g)。考察后的处方组成为:GMS1.9286 g,MCT1.0714 g,RH401.2 g,ARM0.768 g, CD-PEG-SA0.5772 g,去离子水100 ml。
  2. CD-PEG-ARM-NLC的质量表征
  CD-PEG-ARM-NLC是均一、略带蓝色乳光的半透明液体制剂,透射电镜结果显示纳米粒呈类球形,粒径分布均匀;测定平均粒径为65.10±0.64 nm,多分散系数为0.186±0.004;Zeta电位为-24.47±1.01 mV;包封率为87.03%±0.71%;载药量为11.62%±0.10%;在pH7.4的磷酸盐缓冲液中72 h内体外累积释放率为81.95%±0.85%,释药规律符合Weibull方程,t50为10.36 h;体外溶血试验无红细胞聚集及溶血现象。
  3. CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价
  SYBR Green I法测得ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对常规培养的Pf3D7的IC50值分别为4.28±0.05、3.69±0.07、3.22±0.05、2.68±0.05 nmol/L;对有knob结构的Pf3D7的IC50值分别为4.32±0.06、3.93±0.03、3.58±0.08、3.01±0.05 nmol/L;对无knob结构的Pf3D7的 IC50值分别为4.27±0.06、3.34±0.07、2.81±0.08、2.12±0.09 nmol/L。
  4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
  荧光显微镜观察结果显示,纳米粒基本不进入正常红细胞,但可进入感染红细胞,且能聚集于疟原虫周围,而不是弥散于整个红细胞;CD-PEG-C6-NLC组的荧光强度高于C6-NLC组和PEG-C6-NLC组;以上结果显示CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用。加入NPP抑制剂(呋塞米)可基本阻断C6-NLC和PEG-C6-NLC进入感染红细胞,但CD-PEG-C6-NLC仍可进入感染红细胞;同时加入NPP抑制剂(呋塞米)和ECC天然底物(胆碱)方能基本阻断红细胞对CD-PEG-C6-NLC的摄取。
  5. CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究
  阳性对照组ARM尾静脉注射的ED50值为0.266 mg/(kg·day),ED90值为0.945 mg/(kg·day),ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC的ED50值分别为0.245、0.233、0.228 mg/(kg·day),ED90值分别为0.927、0.905、0.872 mg/(kg·day),表明ARM制成纳米粒后抗疟活性有一定的提高。
  结论:
  采用优化后处方制备CD-PEG-ARM-NLC,其粒径、Zeta电位、包封率、载药量、体外释放特性和溶血试验等指标均符合预期要求;体内外药效实验均说明CD-PEG-ARM-NLC比ARM、ARM-NLC和PEG-ARM-NLC有更好的抗疟活性;靶向试验初步结果表明CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用,更深入的验证有待后续实验。
  本课题为国家自然科学基金“基于代谢机制靶向红细胞内疟原虫的青蒿素类药物纳米递药系统研究(编号:81373364)”。
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