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[硕士论文] 廖凯
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:细胞色素P4502C9(CYP2C9)是人体内重要的Ⅰ相药物代谢酶,参与了超过15%临床药物的代谢清除。CYP2C9基因具有高度的多态性,目前已发现60种CYP2C9突变体。这些基因多态性可能影响其底物药的代谢清除速率,并导致血浓度的改变,进而引发药物不良反应。故研究CYP2C9基因多态性对临床安全用药、药物不良反应的预测及指导合理用药具有重要的意义。本论文通过meta分析发现,CYP2C9基因多态性对其底物苯妥英维持剂量具有显著影响。但上述研究同时发现,目前研究的突变体主要为CYP2C9*2和*3,而150位精氨酸的突变在非裔美国人(CYP2C9*8)和中国人(CYP2C9*27)中出现的频率均高于这两个人群中CYP2C9*2的突变频率。为进一步研究CYP2C9第150位突变,本研究构建了稳定表达CYP2C9*8和*27的HKE293T细胞株,并通过体外酶活性实验,分析了CYP2C9*8和*27对其底物代谢活性的影响。本研究发现第150位的突变可能影响CYP2C9与P450氧化还原酶(P450oxidoreductase,POR)的相互作用。本研究又构建了POR的表达体系,为进一步分析150位突变如何影响CYP2C9与其辅酶的相互作用提供有力工具。论文主要内容包括如下三个部分。
  第一部分 亚洲癫痫患者中CYP2C9/2C19基因多态性与苯妥英维持量的相关性的meta分析
  目的:
  CYP2C9基因多态性可能影响其底物药物的药代动力学行为,并可能影响药物的安全性。苯妥英是抗癫痫的一线药物,其治疗窗窄,且疗效具有明显的个体差异。CYP2C9是催化苯妥英代谢清除的主要代谢酶(90%),此外CYP2C19对苯妥英的代谢清除也有少量贡献(约10%)。本研究旨在通过meta分析探讨亚洲癫痫患者人群中CYP2C9和CYP2C19基因多态性对苯妥英维持剂量的影响。
  方法:
  系统检索了PubMed以及EMBASE数据库,查阅2017年6月14日之前的相关发表文献。采用RevMan5.2.3分析CYP2C9/2C19酶基因多态性与苯妥英每日维持剂量的相关性。
  结果:
  包含993例患者的6篇文献符合纳入标准并纳入meta分析中。结果显示,携带CYP2C9突变体的患者需要PHT剂量调整,仅有一个野生型CYP2C9等位基因的患者PHT的维持剂量推荐下调22%。此外,在CYP2C9野生型的患者中,携带CYP2C19*1/*2或者CYP2C19*1/*3的患者不需要剂量调整,但携带CYP2C19*2/*2,CYP2C19*2/*3或者CYP2C19*3/*3的患者PHT维持剂量应当下降11%。。
  结论:
  研究结果显示,具有CYP2C9/2C19突变的患者需要降低苯妥英维持剂量。由于不同人群的基因多态性存在差异,人群差异也是影响苯妥英维持剂量的原因之一。此外,本部分研究中发现,目前CYP2C9基因型对药物代谢的影响的研究集中在CYP2C9*2和CYP2C9*3两个突变,而在亚洲人群中,包括CYP2C9的150位精氨酸突变在内的其他突变对药物的代谢的影响及其机制研究尚不足。
  第二部分 细胞色素P4502C9*8和*27的表达及活性研究
  目的:
  本研究的第一部分发现,目前研究最多的是CYP2C9*2和CYP2C9*3两个突变。但是CYP2C9第150位氨基酸突变在亚洲人群CYP2C9*27(499G>T)和非裔美国人CYP2C9*8(449G>A)中的频率均高于CYP2C9*2。本部分拟构建慢病毒表达质粒,将人细胞色素P4502C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8和CYP2C9*27稳定表达于人HEK293T细胞。并使用该表达体系获得的CYP2C9突变体,结合过氧化氢异丙苯绕过POR供电,考察代谢能力的变化,探讨第150位精氨酸改变CYP2C9代谢活性的机制。
  方法:
  反转录人肝组织总RNA获得cDNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,将其克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9。以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449G>A和449G>T点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8和MigR1-CYP2C9*27慢病毒表达质粒。在HEK293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8和CYP2C9*27的细胞,命名为293T-2C9、293T-2C9*8和293T-2C9*27。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测胞内CYP2C9表达。采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸,结合过氧化氢异丙苯,考察突变体对CYP2C9突变体是否影响其活性及与POR的相互作用。
  结果:
  成功构MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8建和MigR1-CYP2C9*27表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9*8和293T-2C9*27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR和western blot均表明有目标分子表达。提取这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸。在NADPH存在,通过POR传递电子的情况下,CYP2C9*8的代谢能力低于CYP2C9*1。当使用过氧化氢异丙苯绕过POR提供电子时,CYP2C9*1与CYP2C9*8微粒体催化双氯芬酸生成4-羟基双氯芬酸并无显著性差异
  结论:
  成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8和CYP2C9*27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8和*27两个突变体的功能研究。CYP2C9*8下调酶活性的机制可能与突变影响POR相互作用相关。
  第三部分 细胞色素P450还原酶的表达及对CYP2C9第150位精氨酸突变的代谢影响
  目的:
  第二部分研究发现,CYP2C9第150位单核苷酸突变可能影响其与辅酶的相互作用,为进一步分析150位突变对CYP2C9与其辅酶相互作用的影响,本部分构建CYPs的氧化还原搭档POR的慢病毒表达载体,在HEK239T细胞中的稳定表达,并探索POR对CYP2C9第150位精氨酸突变体代谢活性的影响。
  方法:
  反转录人肝组织总RNA获得cDNA,PCR扩增获得POR编码序列,将其克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-POR。在HEK293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达POR的细胞,命名为293T-POR。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测胞内POR表达。在体外酶活性实验中,比较添加POR对CYP2C9野生型及突变体代谢双氯芬酸的酶活性的影响差异。
  结果:
  成功构建MigR1-POR表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-POR在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR和western blot均表明有目标分子表达。向野生型CYP2C9中添加POR对其代谢活性无显著影响,但POR导致CYP2C9*8的活性下降。
  结论:
  成功构建稳定表达POR人源化细胞模型,添加POR对CYP2C9*8活性的影响较对野生型CYP2C9的影响强。
[硕士论文] 任静娜
药理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨异牡荆素(Isovitexin,Ⅳ)对大鼠心室肌细胞上的几个主要的离子通道电流(Ito、INa、ICa-L)及其动力学特征的影响。
  方法:
  采用MTT法检测Ⅳ对细胞活力的影响;主动脉逆行灌流酶解分离成年大鼠心肌细胞;全细胞膜片钳技术引导和记录电流;累积给药观察不同剂量的Ⅳ给药前后通道电流及其动力学特征的变化。
  结果:
  1、不同浓度的Ⅳ对乳鼠心肌细胞活力的影响
  利用MTT法检测Ⅳ对细胞活力的影响,结果显示:给药后24h,低浓度(1~3μM)Ⅳ对细胞活力无明显影响[对照组:(99.13±5.38)%,Ⅳ组:1μM(86.77±3.99)%,3μM(81.47±3.95)%(P>0.05,n=5)];当Ⅳ浓度为10μM时,细胞活力有所降低[(66.69±4.53)%(P<0.05,n=5)],而高浓度的Ⅳ(≥30μM)能明显抑制细胞的增殖[30μM(48.62±2.44)%(P<0.01,n=5)]。给药后细胞培养48h,随着给药时间和浓度的增加,Ⅳ对细胞活力影响显著[对照组(99.93±1.64)%vs给药组1μM(77.2±4.00)%,3μM(68.11±3.76)%(P<0.05,n=5),10μM(59.31±4.93)%和30μM(43.11±2.73)%(P<0.01,n=5)]。培养24h和48h后Ⅳ的IC50分别为27.60μM和22.43μM。
  2、不同浓度的Ⅳ对各离子通道电流的影响
  (1)Ⅳ对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的影响
  利用全细胞膜片钳技术记录和引导Ito,并观察不同剂量的Ⅳ对该电流的影响。结果显示:在低浓度(≤0.1μM)时,Ⅳ对Ito无明显影响,但随着药物浓度的增高(≥0.3μM),Ito峰值逐渐降低,由给药前的(42.32±2.93)pA/pF分别降为(31.83±4.30)pA/pF,1μMⅣ;(25.51±3.48)pA/pF,3μMⅣ和(16.35±2.50)pA/pF,10μMⅣ(P<0.01,n-6),呈浓度依赖性抑制。且随着Ⅳ浓度的升高(≥3μM),药物使Ito的I-V曲线明显下移。激活曲线结果显示:Ⅳ可使最大半数激活电位(V1/2)向正值方向移动,给药前V1/2为(19.59±1.60)mV,给予1μMⅣ后,V1/2变为(22.81±1.66)mV(P>0.05,n=6),而给予3μM和10μMⅣ后,V1/2分别升高至(28.86±141)mV和(36.29±0.69)mV,(P<0.01,n=6)。Ito稳态失活曲线的最大半数失活电位(V1/2):给药组(-44.71±0.71)mV,1μM;(-58.81±1.23)mV,3μM和(-70.11±1.13)mV,10μM(P<0.01,n=6)较给药前(-27.02±0.79)mV明显降低。就失活后恢复曲线的失活恢复时间(τ)而言,给药后的τ较给药前显著升高[给药前:(90.77±1.02)ms;给药后:(118.50±1.51)ms,1μM;(16240±1.42)ms,3μM;(227.80±0.73)ms,10μM(P<0.01,n=6)],且Ito的失活后恢复曲线右移,提示Ⅳ能延长瞬时外向钾通道的失活后恢复时间。
  (2)Ⅳ对大鼠心室肌细胞钠电流(INa)的影响
  随着给药浓度的增加,Ⅳ对INa抑制作用也逐渐增强。分别给予1μM、3μM和10μM的Ⅳ后,INa电流密度由给药前的(-99.28±2.63)pA/pF依次变为(-79.29±4.30)pA/pF、(-65.56±2.58)pA/pF和(-58.88±5.02)pA/pF(P<0.01,n=6),且I-V曲线明显上移。激活曲线:给药前的V1/2为(-15.6±0.42)mV,给予1μM、3μM和10μM的Ⅳ后,V1/2分别转变为(-7.28±0.43)mV、(1.24±0.48)mV和(11.55±0.44)mV(P<0.01,n=6)。失活曲线结果显示:随着给药浓度的增加,失活曲线显著左移,其V1/2逐渐向超极化的方向迁移[对照组的V1/2:(-74.98±0.52)mV;Ⅳ组中的V1/2:1μMⅣ,(-81.15±0.34)mV(P>0.05,n=6);3μMⅣ,(-93.27±0.55)mV;10μMⅣ,(-102.6±0.26)mV(P<0.01,n=6)]。同时,给药后INa的失活后恢复曲线右移,且恢复时间明显延长,1μM的Ⅳ使τ由给药前的(8.16±0.45)ms延长到(13.49±2.01)ms(P<0.01,n=6),而3μM和10μM的Ⅳ则使τ分别延长至(17.65±0.89)ms和(22.27±0.52)ms(P<0.01,n=6)。
  (3)Ⅳ对大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流(ICa-L)的影响
  给予Ⅳ前ICa-L的电流密度为(-23.69±2.34)pA/pF,随着药物浓度的增加,ICa-L峰值电流密度逐渐降低[1μM:(-18.14±2.10)pA/pF;3μM:(-12.81±1.97)pA/pF;10μM:(-6.61±1.30)pA/pF(P<0.01,n=6)],但药物洗脱后的ICa-L电流密度(-21.84±1.08)pA/pF(P>0.05,n=6)与给药前相比则无显著性差异。激活曲线:不同浓度的Ⅳ使ICa-L的V1/2由用药前的(-15.18±0.30)mV分别提高至(-6.03±0.43)mV,1μM;(1.98±0.39)mV,3μM;(10.69±0.71)mV,10μM(P<0.01,n=6)。同时,给药后ICa-L的失活曲线显著左移,即向膜电位的负值方向移动,药物浓度分别为1μM、3μM和10μM的Ⅳ使ICa-L的V1/2由(-17.56±0.93)mV分别降至(-28.03±0.72)mV、(-43.31±0.82)mV和(-53.10±0.63)mV(P<0.01,n=6)。而ICa-L的失活后恢复曲线τ随药物浓度的增加而增加,给予1μM和3μM的Ⅳ使τ由给药前的(13.45±0.36)ms分别升高到(18.36±0.61)ms和(22.64±0.18)ms(P<0.01,n=6),而浓度为10μM的Ⅳ与用药前相比τ升至(26.69±0.57)ms(P<0.01,n=6)。
  3、不同溶剂对大鼠心室肌细胞INa的影响
  以钠电流为参考指标检测不同浓度的溶剂(甲醇和DMSO)对INa的影响,结果显示:甲醇和DMSO的含量为0.1%时,对INa无明显影响;而随着细胞外液甲醇含量的增加,对INa具有抑制作用;另外,分别使用两种不同的溶剂(在细胞外液中含量为0.1%)对药物进行溶解对比发现实验结果无明显变化。
  结论:
  Ⅳ对大鼠心肌细胞上几个主要的离子通道(Ito、INa和ICa-L)均有不同程度的抑制作用,此作用可能与Ⅳ的心肌保护效应有关。
[硕士论文] 万丹
中药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:栖息于特殊生态环境的微生物,如:生活在高温、高寒、高渗、高压等极端环境的微生物、海洋微生物、植物内生菌、动物共生菌、稀有放线菌和粘细菌等,在其生命进化历程中,为适应外部特殊环境,形成特殊的代谢途径,因此,能产生特殊的次生代谢产物,为新药研制提供丰富的先导化合物。
  前期实验从牡蛎共生球毛壳菌C.globosum ML-4、黄花蒿内生菌M.roridum IFB-E012、白茅内生菌C globosun IFB-WQ、海带内生菌Alternaria sp.TSJ-HD-1和海洋真菌P.janthinellum HK1-6中分离获得21个天然化合物,本学位论文首先采用MTT法测定了这21个特境微生物天然产物的体外抗肿瘤活性,测试的肿瘤细胞株为人肝癌细胞株SMMC-7721和人胃癌细胞株SGC-7901,阳性对照药为顺铂和5-氟尿嘧啶。结果发现,mytoxin B对SMMC-7721细胞具有显著的增殖抑制作用,IC50值为0.15±0.04μg mL-1;guxi-2、penicilone C、penicilone D、H7和H8对SMMC-7721细胞有强增殖抑制作用,IC50值分别为2.15±1.51、11.00±1.40、13.74±2.09、12.13±1.53和8.76±1.44μg·mL-1;myrothecine A、tricycloaltemarene3a、2H-(2E)-tricycloaltemarene12a、penicilone B和penicilone A对SMMC-7721细胞有较强的增殖抑制作用,IC50值分别为25.5±1.19、45.81±4.58、49.72±1.13、15.29±1.82和28.62±4.03μg mL-1;chaetoglobosin V和tricydoalternarene F对SMMC-7721细胞有明显的增殖抑制作用,IC50值为60.5±0.93和80.31±3.84μg·mL-1;其它化合物无明显活性。还发现,化合物guxi-2对SGC-7901细胞有强增殖抑制作用,IC50值为15.21μg·mL-1。在上述研究基础上,本学位论文进一步研究了活性化合物guxi-2、chaetoglobosin V、mytoxin B和myrothecine A的体外抗肿瘤活性机制。
  Guxi-2是从黄花蒿内生菌M.roridum中分离获得的一个新环十肽化合物,研究发现,其能浓度依赖性地引起SGC-7901细胞G1期细胞周期阻滞;其能诱导SGC-7901细胞凋亡,50μg·mL-1时凋亡率为21.91±4.26%;guxi-2能明显降低SGC-7901细胞的迁移速率,50μg·mL-1时划痕宽度没有明显变化,且细胞过膜数量明显下降;guxi-2处理后的细胞中,Bcl-2表达下降、Bax表达增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达增加。结果表明,guxi-2对SGC-7901细胞的体外抗肿瘤活性与诱导G1期细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和降低细胞迁移速率有关,其诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径。
  Chaetoglobosin V是从牡蛎共生球毛壳菌C.globosum ML-4发酵液中分离获得的一个细胞松弛素化合物。研究发现,其能浓度依赖性地引起SMMC-7721细胞G2期细胞周期阻滞;可诱导SMMC-7721细胞凋亡,50μg mL-1时凋亡率达到21.89±5.52%;chaetoglobosin V处理后的细胞中,Bcl-2表达下降、Bax表达增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达增加,Akt蛋白表达和其磷酸化水平下降。上述结果表明,chaetoglobosin V对SMMC-7721细胞的体外抗肿瘤活性与诱导G2期细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关,且该诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径,并与PI3K/Akt信号通路活性相关。
  Mytoxin B(倍半萜部分含12,13-环氧基)和myrothecine A(mytoxin B的10,13-碳环衍生物)是从黄花蒿内生菌M.roridum IFB-E012中分离获得的两个单端孢霉烯大环内酯化合物。研究发现,mytoxin B能显著诱导SMMC-7721细胞凋亡,1μg·mL-1时凋亡率就达到22.62±0.64%,myrothecine A诱导凋亡作用较弱,50μg mL-1时凋亡率仅为8.85±0.11%;mytoxin B和myrothecine A处理后的细胞中,Bcl-2表达皆下降、Bax表达皆增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达皆增加;还发现,Akt蛋白及其磷酸化水平皆下降,使用PI3K抑制剂LY294002做对照实验发现,这两个化合物与LY294002具有相似的活性,且与LY294002存在一定的协同作用;此外,ERK蛋白表达和其磷酸化水平皆下降,p38蛋白表达和其磷酸化水平皆增加。综上可知,mytoxin B和myrothecine A对SMMC-7721细胞的体外抗肿瘤活性与诱导细胞凋亡有关,且该诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径,并与PI3K/Akt和MAPK信号通路活性相关。
[硕士论文] 游翔
药学(临床药学) 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  评价哌拉西林他唑巴坦(piperacillin-tazobactam,PZ)与碳青霉烯类经验性治疗粒细胞缺乏伴发热(febrile neutropenia,FN)的有效性与安全性,为临床合理用药提供循证依据。
  方法:
  根据PRISMA和Cochrane指南制定Meta分析方案,检索PubMed、EMBASE、The Cochrane Library、中国知网、维普数据库及万方数据库中关于PZ与碳青霉烯类用于治疗粒细胞缺乏伴发热的有效性与安全性的随机对照试验(randomized controlled trial,RCT)文献报道。根据纳入标准和剔除标准筛选符合标准的文献并对其进行质量评价。对纳入的研究数据进行分类和提取,使用RevMan5.3软件进行Meta分析,比较PZ与碳青霉烯类在治疗FN上的有效性与安全性差异。
  结果:
  1.初始检索到相关文献191篇,剔除重复和不符合纳入标准的文献,最终纳入RCT文献6篇。其中3篇文献为PZ与亚胺培南/西司他丁(Imipenem-Cilastatin,IMP)的比较,2篇文献为PZ与美罗培南(meropenem,MEM)的比较,1篇文献为PZ与碳青霉烯类(IMP或MEM)的比较,共纳入了1159例次患者。
  2.PZ对比碳青霉烯类治疗粒细胞缺乏伴发热的治疗成功率的差异无统计学意义[RR=1.13,95%CI(0.81,1.57),P=0.46],对治疗成功率按年龄进行亚组分析,在年龄较低组差异无统计学意义[RR=1.07,95%CI(0.85,1.35),P=0.57],年龄较高组中两者差异无统计学意义[RR=1.31,95%CI(0.74,2.35),P=0.36]。按药物进行亚组分析,PZ与MEM的差异无统计学意义[RR=1.23,95%CI(0.97,1.55),P=0.09],PZ与IMP的差异无统计学意义[RR=1.50,95%CI(0.69,3.28),P=0.006]。
  3.PZ与碳青霉烯类在治疗时间上的差异无统计学意义[MD=-0.09,95%CI(-0.58,0.40),P=0.72],治疗后再发热或再感染发生率上两者的差异无统计学意义[RR=1.11,95%CI(0.81,1.52),P=0.52]。
  4.碳青霉烯类与PZ相比能显著缩短退热时间[MD=1.04,95%CI(0.31,1.78),P=0.005]。
  5.PZ与碳青霉烯类在全因死亡率上差异无统计学意义[RR=0.86,95%CI(0.51,1.45),P=0.56]。
  6.在不良反应发生率上PZ明显低于碳青霉烯类[RR=0.64,95%CI(0.44,0.94),P=0.02]。在年龄较低组中,两者之间的差异无统计学意义[RR=0.80,95%CI(0.34,1.91),P=0.62],但是在年龄较高组中,PZ明显优于碳青霉烯类[RR=0.61,95%CI(0.41,0.93),P=0.02]。PZ与MEM不良反应发生率差异无统计学意义[RR=2.00,95%CI(0.62,6.46),P=0.25]。而在与IMP治疗方案进行对比时PZ不良反应发生率低[RR=0.53,95%CI(0.35,0.80),P=0.002]。
  结论:
  1.在经验性治疗FN时,PZ与碳青霉烯类药物有效性无明显的差异,但不良反应发生率低于碳青霉烯类。
  2.根据Meta分析结果,目前临床可选择PZ作为碳青霉烯类的代替药物用于经验性治疗FN。
[硕士论文] 刘传峰
药物化学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:癌症是当今发病率和死亡率比较高的疾病之一。在中国,每年癌症患者和癌症死亡人数在不断的增加。目前,癌症的治疗手段主要是药物治疗(化疗)和手术治疗。但是,化疗药物不仅可以杀死人体内癌细胞,同时也可以杀死正常细胞,并且抗癌药物引起的毒副作用给患者的身体带来巨大疼痛,甚至,有些患者对抗癌药物产生了耐药性。手术治疗对多种癌症是无法适用的。近年来,科研人员发现和开发了一些小分子抗癌药物,仍需要开发对肿瘤具有选择性和安全性的新型抗肿瘤药物。
  根据文献报道7-羟基-4-苯基香豆素及其衍生物具有广泛的药理活性。7-羟基-4-苯基香豆素的一些衍生物展现出了抗炎,抗菌,抗癌,抗氧化等生物活性,并且筛选出来了新的治疗药物。所以本文以苯甲酰乙酸乙酯为起始原料合成了7-羟基-4-苯基香豆素。
  使用点击化学方法合成了一系列新的7-羟基-4-苯基色烯-2-酮(1a)连接的1,2,4-三唑或1,2,3-三唑的衍生物。所有衍生物通过3-(4,5-二甲基噻唑基)-二苯基四唑(MTT)方法对6种不同人类癌细胞系(AGS,MGC-803,HCT-116,A-549,HepG2和HeLa)进行细胞毒性筛选以评估其细胞毒性。在所测试的分子中,一些衍生物显示出比7-羟基-4-苯基香豆素(1a)具有更好的细胞毒活性。在合成的1,2,4-三唑中,7-((4-(4-氯苯基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)甲氧基)-4-苯基-2H-苯并吡喃-2(4d)显示最佳活性,对AGS细胞的IC5。为2.63±0.17μM。在7-羟基-4-(4-甲氧基-苯基)-2H-香豆素和1,2,4,-三氮唑连接的衍生物(5a-5e)中,发现大部分化合物对癌细胞抗增殖活性明显降低,仅有化合物5a对AGS细胞表现出温和的抗肿瘤活性,其IC50值为16.80±0.83μM。在合成的1,2,3-三唑(7a-7e)中,7c化合物只对MGC-803细胞选择性的抑制作用,但其IC50值只达到了48.16±0.46μM。用流式细胞术测定进一步的表明,化合物4d通过阻滞细胞在细胞周期的G2/M期并通过诱导细胞凋亡发挥其抗增殖作用。总的来说,我们的研究结果表明在1,2,4-三唑衍生物系列中(4a-4m,5a-5e),4苯基的对位被甲氧基取代后的衍生物(5a-5e)抗肿瘤的活性明显降低。1,2,4-三唑衍生物比1,2,3-三唑衍生物有着更强的抗肿瘤活性。大部分化合物比阳性对照药5-氟尿嘧啶具有更好的抗肿瘤活性。
[硕士论文] 吴冠锐
公共卫生 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  研究壳聚糖/消炎止痛中药及两者联合应用对小鼠皮肤伤口愈合过程中的作用,分析不同用药组和不同浓度组与小鼠皮肤创口愈合情况的对应关系,进一步讨论壳聚糖、壳聚糖季铵盐和消炎止痛中药促进伤口愈合的作用机制,为壳聚糖外伤敷料的临床应用提供实验依据。
  方法:
  1.动物分组及造模
  采用306只健康昆明近交雄性小鼠,将其中300只小鼠随机分为9个用药治疗组和一个空白对照组,每组30只小鼠,剩余6只为正常组。每只小鼠背部造一个约0.5cm2的圆形皮肤全层切割伤口。所有创伤小鼠于制备皮肤缺损创面后立即实行治疗,连续9天,每天2次。9个治疗组分别为高、中、低(8mg/L、4mg/L、2mg/L)壳聚糖外伤敷料治疗组,高、中、低(8mg/L、4mg/L、2mg/L)壳聚糖季铵盐外伤敷料治疗组,4mg/L壳聚糖+1/2消炎止痛中药外伤敷料治疗组、4mg/L壳聚糖季铵盐+1/2消炎止痛中药治疗组和消炎止痛中药外伤敷料治疗组。
  2.小鼠创伤收缩率评价
  于术后第1、3、5、7、9天对各组小鼠创伤部位进行标准化摄影,记录每只小鼠创口的创面,采用ImageJ图像处理软件对其进行计算机图形处理。根据数据分布特征,对术后第1、3、5、7、9天各组小鼠创伤面积收缩率数据进行单因素方差分析。
  3.酶联免疫吸附法测定IL-1、TNF-α、TGF-β和PDGF的表达
  术后第1、3、5、7、9天,每组随机选取6只小鼠摘眼球取血,血液当天离心取上清液,使用酶联免疫试剂盒测定IL-1、TNF-α、TGF-β和PDGF的表达情况。
  4.组织病理学评价
  术后第3、5、7、9天,将取血完毕的小鼠脱臼处死,手术取其创面组织样本约1cm2。组织样本做石蜡切片,HE染色。普通光学显微镜下观察组织病理学变化。
  结果:
  术后第1天,各组创伤收缩率未见显著差异(P>0.05)。术后第3、5天,高、中壳聚糖组,高、中壳聚糖季铵盐组,壳+药组,壳季+药组,中药组创面收缩率明显大于空白组(P<0.05),高浓度组创伤收缩率高于低浓度组(P<0.05),壳聚糖组和壳聚糖季铵盐组创伤收缩率无统计学差异(P>0.05),联合应用组和高浓度组的创伤收缩率无统计学差异(P>0.05)。术后第7、9天治疗组创面收缩率明显高于空白组(P<0.05)。病理学切片镜下观察发现:治疗组的炎症反应较空白组轻,上皮细胞增殖加快,新生血管丰富,肉芽组织成熟。高浓度组与低浓度组相比,炎症减轻时间更早、上皮细胞增殖更快,肉芽组织出现时间更早,皮肤恢复完整结构时间更短。壳聚糖组和壳聚糖季铵盐组镜下恢复程度基本相同,联合应用组镜下恢复程度与高浓度组相似,术后第9天可见完整皮肤结构。治疗组IL-1和TNF-α的表达明显低于空白组(P<0.01),高浓度组IL-1和TNF-α的表达较低浓度组低(P<0.05),壳聚糖组和壳聚糖季铵盐组IL-1和TNF-α的表达无统计学差异(P>0.05)。联合应用组IL-1的表达较高浓度组低(P<0.05),TNF-α的表达与高浓度组无统计学差异(P>0.05)。治疗组TGF-β和PDGF的表达明显高于空白组(P<0.05),高浓度组TGF-β和PDGF的表达较低浓度组高(P<0.05),壳聚糖组和壳聚糖季铵盐组TGF-β和PDGF的表达无统计学差异(P>0.05),联合应用组PDGF的表达较高浓度组高(P<0.05),TGF-β的表达无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  1.壳聚糖、壳聚糖季铵盐和消炎止痛中药均具有减轻炎症反应和促进生长因子表达的作用,进而促进创口愈合。
  2.高浓度壳聚糖和壳聚糖季铵盐减轻炎症反应和促进生长因子表达的作用较低浓度组好,具有更强的促进创口愈合能力。
  3.壳聚糖和壳聚糖季铵盐减轻炎症反应促进生长因子的能力大致相同,促进创口愈合的能力相似。
  4.壳聚糖/壳聚糖季铵盐和消炎止痛中药联合应用的减轻炎症反应和促进生长因子表达的能力最好,促进伤口愈合的能力最佳。
[硕士论文] 王心佳
生物化学与分子生物学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探究钙黄绿素与奥司他韦对H7N9流感病毒神经氨酸酶的联合抑制作用,同时利用分子对接方式探究其复合物结构稳定性。
  方法:(1)虚拟筛选:利用Autodock42模拟软件从ZINC子集数据库ZIM数据库中筛选出与N9蛋白对接形成稳定复合物的小分子化合物;(2)酶学实验:测定小分子化合物对N9的抑制作用,探究其与奥司他韦的联合使用对N9的抑制作用,同时通过CalcuSyn2.0软件分析两种药物联合作用模式;(3)分子模拟:利用Autodock4.2软件评估小分子化合物与N9对接形成复合物的自由能,并对复合物的稳定性进行评估,同时利用Discovery Studio软件对复合物的氢键进行分析,从而判断复合物形成的稳定性;(4)分子动力学模拟:利用GROMACS软件测定小分子化合物与N9对接形成复合物的RMSD(Root Mean SquareDeviation)值及RMSF(Root Mean Square Fluctuation)值,对复合物结构稳定性进行评估。
  结果:(1)虚拟筛选:根据虚拟筛选的亲和能从ZIM中筛选排名前2位与N9结合最稳定的小分子化合物——脱氢胆酸及钙黄绿素;(2)酶学实验:脱氢胆酸对N9的抑制作用较弱,而钙黄绿素对N9具有较好的抑制作用。钙黄绿素对N9WT的IC50值为(12.6±2.2)μM,N9R294K的IC50为(30.1±1.6)μM,奥司他韦N9WT的IC50值为(1.7±0.1)nM,对N9R294K的IC50为(26.5±1.0)μM。钙黄绿素与奥司他韦联合应用时,对N9WT的ED50、ED75、ED90的CI值为别是0.71、0.48、0.33;对N9R294K的ED50、ED75、ED90的CI值分别是0.79、0.55、0.44;均小于1,因此,钙黄绿素与奥司他韦联合应用对N9WT及N9R294K的抑制均为协同抑制作用。(3)分子模拟:Autodock42软件评估钙黄绿素、奥司他韦与N9对接形成复合物的自由能,结果显示二者同时与N9对接形成复合物的自由能较各小分子化合物单独与N9对接所形成复合物的自由能值低,表明钙黄绿素与奥司他韦同N9对接形成复合物的构象更为稳定。Discovery Studio软件预测对接形成复合物氢键的结合位点,结果显示可形成氢键数目较多,复合物较为稳定;(4)分子动力学模拟:通过测定小分子化合物与N9对接形成复合物的RMSD及RMSF值发现,复合物结构稳定性较高。
  结论:(1)钙黄绿素与奥司他韦联合使用对H7N9流感病毒神经氨酸酶具有协同抑制作用,(2)计算机模拟结果验证钙黄绿素、奥司他韦与H7N9流感病毒神经氨可形成稳定复合物。
[硕士论文] 苏和毅
急诊医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:持续性炎症-免疫抑制-分解代谢综合征(PICS)描述了部分老年重症患者在脓毒症打击后期,机体出现持续性低水平炎症反应、进展性免疫抑制、代谢紊乱和脏器功能衰竭,临床往往表现为反复院内感染、严重营养不良、肌肉持续丢失和伤口愈合困难等。这一群体的患者对重症监护设备依赖程度高、滞留现象严重且住院开支大,给ICU临床医生造成了极大的困扰。目前临床中关于PICS的治疗仍存在两大困局:一是对老年脓毒症患者继发PICS的早期临床特征、危险因素及预后情况缺乏充分了解,是否有必要针对这类患者启动针对性干预方案及如何鉴别高危患者仍不明确;二是对已经进展为PICS的脓毒症患者缺少有效、可靠的干预措施。针对现状,本研究对继发PICS老年脓毒症患者进行了回顾性分析,并观察胸腺肽α1对这类患者的干预效果。
  研究目的:
  1.回顾老年脓毒症患者继发PICS的早期临床特征、危险因素及预后情况,探究PICS对老年脓毒症患者的危害性及筛查PICS高危患者的方法。
  2.观察分析胸腺肽α1干预对继发PICS的老年脓毒症患者的病情、预后影响,探究胸腺肽α1的治疗效果。
  研究方法:
  1.第一章回顾了MICU中2013年8月-2017年3月收容的298例老年脓毒症患者,筛选出其中符合要求的患者97例,将ICU住院10天后满足PICS诊断标准的36例患者纳入PICS组,其余61例患者纳入非PICS组。本研究一方面比较两组患者入科第1天的一般临床资料和检测指标,再将两组间存在统计学差异的指标纳入多因素logistic回归分析,探究促使PICS发生的独立危险因素,并进一步绘制ROC曲线判断其预测价值;另一方面观察两组患者各时期的死亡率,并绘制Kaplan-Meier曲线进行生存情况分析,判断两组各阶段预后的差异。
  2.第二章观察分析2014年1月-2017年1月在MICU进行治疗的继发PICS老年脓毒症患者68例。将入科后满足PICS诊断的第11天开始接受胸腺肽α1持续2周治疗的34例患者为干预组,未接受胸腺肽α1治疗的34例患者为对照组。本研究首先对比胸腺肽α1治疗前后两组患者检测指标变化的差异,分析胸腺肽α1对患者病情的影响。而后进一步比较两组间的一般临床资料,分析其中可能影响预后分析的差异性因素,并将该因素引入Cox回归中与胸腺肽α1干预共同进行生存分析,判断胸腺肽α1对患者预后的影响。
  研究结果:
  1.第一章研究纳入的97例患者中,符合PICS诊断的患者共36例,PICS在老年脓毒症患者中的发生率为37.1%。PICS组的APACHEⅡ评分、AGI分级显著高于非PICS组,差异有统计学意义(P<0.05);PICS组的血小板数量、CD4+T淋巴细胞数量和CD4+/CD8+显著低于非PICS组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,在五个差异性因素中APACHEⅡ评分是老年脓毒症患者发生PICS的独立危险因素,其预测老年脓毒症患者发生PICS的截取值为26.5。Kaplan-Meier生存分析显示PICS组总体预后情况较差。而各个阶段的生存情况分析显示,两组患者入科90天、180天及1年三个阶段的生存情况存在显著差异(P<0.05),而入科28天的生存情况不存在统计学差异(P>0.05)。
  2.第二章干预组的单核细胞数量、CD4+/CD8+和HLA-DR/CD14三项指标在胸腺肽α1干预前后变化的差值明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。胸腺肽α1的单因素和多因素Cox生存分析结果均表明,胸腺肽α1干预对整个研究观察阶段生存情况的影响无统计学意义(P>0.05),而入科前10天的肠内营养达标情况对总体生存情况的影响有统计学意义(P<0.05)。而28天、90天、180天及1年四个阶段生存情况的多因素Cox生存分析显示,胸腺肽α1干预对90天生存情况的影响有统计学意义(P<0.05),对28天、180天及1年生存情况的影响无统计学意义(P>0.05)。
  研究结论:
  1.老年脓毒症患者继发PICS的早期会表现出更高的APACHEⅡ评分,更为严重的胃肠功能障碍和血小板数量、CD4+T淋巴细胞数量和CD4+/CD8+下降。其中,APACHEⅡ评分是老年脓毒症患者发生PICS的独立危险因素,APACHEⅡ>26.5分是其最佳预测范围。继发PICS的老年脓毒症患者晚期预后和远期预后较差,有必要进行重点管理和针对性干预。
  2.胸腺肽α1可促进继发PICS老年脓毒症患者的单核细胞数量、CD4+/CD8+和HLA-DR/CD14升高或遏制其减少,对病情恢复有所帮助。同时,胸腺肽α1能有效改善患者的晚期预后,对患者早期预后和远期预后的作用暂不明确。
[硕士论文] 马睿
药学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:血清白蛋白(Serum albumin)是血浆中含量最丰富的蛋白质,具有极为重要的运载作用,药物进入血液后与之结合,影响其代谢和药理、毒理作用等,因此,血清白蛋白(人血清白蛋白和牛血清白蛋白)成为研究药物与蛋白质相互作用最为常用的模式蛋白之一。在结合过程中,会涉及药物与白蛋白的结合作用力类型、强弱等作用机制问题,以及与白蛋白的结合率高低问题,这些都会影响药物在体内生物活性的发挥。药物与血清白蛋白之间的作用机制通常采用多重光谱法,该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便、试样用量少等优点。而药物与白蛋白结合率的现有研究方法存在实验耗时较长、检测量较少等问题,进而使其研究受到制约。此外,很少有文献同时从上述两个方面进行药物与蛋白作用的研究,并探讨蛋白作用机制与蛋白结合率之间的关系。
  本课题从以下几个方面进行了化合物与血清白蛋白的作用研究:(1)由于光谱法在研究弱结合能力化合物与血清白蛋白相互作用时存在问题,因此本论文选取了中等结合能力的黄酮类化合物和高结合能力的利奥西呱和哌喹及其代谢物,利用光谱法研究其与血清白蛋白的结合作用;(2)建立测定上述化合物的定量分析方法,采用超滤法和HPLC法测定上述化合物与血清白蛋白结合率;(3)根据光谱法获得数据,结合函数关系和相关文献,推导上述化合物的血清白蛋白结合率,并与HPLC法测定结果进行比较,探讨建立光谱法预测血清白蛋白结合率方法的可行性。
  对中药单芽狗脊的化学成分进行了研究,从正丁醇部分得到7个化合物,通过核磁、高分辨质谱、红外光谱等方法对分离得到的化合物进行结构解析,其中化合物1为新化合物。采用荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色性光谱考察了黄酮类化合物与牛血清白蛋白的相互作用,建立了单芽狗脊中黄酮类化合物与血清白蛋白相互作用机制研究方法,实验结果表明化合物1-7均通过静态机理猝灭血清白蛋白内在荧光,以单一结合部位与血清白蛋白作用,且与蛋白发生能量转移。化合物2-6与血清白蛋白主要作用力为氢键和范德华力,化合物1和7与血清白蛋白主要作用力为疏水作用力。化合物改变蛋白二级结构,增加了α-螺旋百分含量。利用位点竞争试剂和分子模拟手段分析化合物6的结合位点,发现该化合物通过氢键和范德华力结合于白蛋白siteⅠ位点。
  将荧光光谱技术、吸收光谱技术和核磁波谱技术等手段相结合,在体外研究血清白蛋白与哌喹及其代谢产物相互作用,结果表明哌喹及其代谢产物均通过静态机理猝灭血清白蛋白内在荧光,以单一结合部位与血清白蛋白作用,主要作用力为氢键和范德华力。哌喹及其代谢产物均能改变血清白蛋白二级结构,增加了α-螺旋百分含量。利用位点竞争试剂和分子模拟方法研究发现,哌喹及其氮氧化代谢产物通过氢键和范德华力结合于蛋白siteⅠ位点,其羧酸化和氮去烷基化代谢物通过疏水作用力结合于siteⅠ。为了深入研究哌喹及其代谢产物抗疟活性机制,利用1H-NMR滴定研究血红素与哌喹及其代谢产物相互作用,结果显示血红素使哌喹及代谢产物的信号谱线变宽,提示哌喹及其代谢产物通过与血红素结合,产生抗疟活性。
  利用荧光光谱技术、核磁等光谱学手段研究利奥西呱与人血清白蛋白相互作用机制,结果表明利奥西呱通过静态机理猝灭人血清白蛋白内在荧光,以单一结合部位与血清白蛋白作用,主要作用力为氢键和范德华力。利奥西呱与人血清白蛋白作用改变蛋白二级结构,增加了α-螺旋百分含量。利用位点竞争试剂、19FNMR和分子模拟手段分析利奥西呱在人血清白蛋白的结合位点,发现该药物通过氢键和范德华力结合于蛋白siteⅠ位点。
  分别建立了单芽狗脊中黄酮,哌喹及其代谢物和利奥西呱在体外生理条件下含量分析方法,结合超滤法考察了与血清白蛋白的结合。黄酮的蛋白结合率为约为72.7%;哌喹蛋白结合率高达98%,其氮氧化代谢物较之稍弱,其羧酸化代谢物,去烷基化代谢物明显减弱;利奥西呱血清白蛋白结合率约为95.4%。结合公式推导和相关文献,根据光谱法获得数据,建立血清白蛋白结合率与化合物浓度、蛋白浓度、结合药物分子数量和猝灭参数的函数关系模型,推断上述化合物的血清白蛋白结合率。通过与超滤法和高效液相色谱法测定结果比较发现:(1)对于中等结合能力的化合物(如山奈酚-3-O-α-L-(2,3-O-二乙酰基)鼠李糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷),存在较大差异,大于20%;(2)对于较高结合能力的化合物(哌喹及其代谢物和利奥西呱)预测比较准确。提示该函数关系模型可以用来预测高结合能力化合物的蛋白结合率,而对于中等结合能力药物,有待进一步优化。
  本论文利用光谱技术和分子模拟技术研究了三类化合物与血清白蛋白的相互作用;并建立了体外含量测定方法,结合超滤法和液相色谱法测定了上述化合物的血清白蛋白结合率;建立了结合率与化合物浓度、蛋白浓度和猝灭常数的函数关系模型,用来推定上述化合物的蛋白结合率,通过测定结果比较,发现较高结合率的化合物计算值比较准确,中等结合能力的计算值与实测值存在较大差异,提示该函数关系模型可以用来预测高结合能力化合物的蛋白结合率,而对于中等结合能力药物,有待进一步优化。
[硕士论文] 韩爽
药学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  将临床路径的实施方法作为研究基础,深入探讨房颤患者的药学监护路径的制定和实施,以确保患者在用药过程中安全的同时保证患者合理用药。
  方法:
  通过查阅资料,并检索到2016年全年循环内科以房颤为入院诊断的病例839份,房颤患者已经达到全年患者的23.6%。确定疾病种类后,根据以往的治疗经验,首先制定房颤患者药学监护路径表,将病情相符的患者分为两组,以2017年10-12月期间循环内科房颤患者为对照组,2018年1-2月期间循环内科房颤患者为干预组。在干预组中,药师参与患者的治疗过程,并对其进行药学监护,包括对患者及家属的用药教育、患者在院期间的用药指导、药物不良反应的监测、出院带药和出院用药指导等,归纳其药学监护路径。利用SPSS19.0统计学软件分析房颤患者的临床用药,以药学干预前后患者的平均住院日、住院费用、药物不良反应发生率、患者的用药依从性相关指标反映药学监护的服务效果。
  结果:
  制定出房颤患者的药学监护路径表,总结房颤患者在住院期间的药学监护要点。在2017年2月-2018年1月期间共对53例房颤患者实施药学干预,结果显示,房颤患者的平均住院日、住院费用、不良反应发生率有显著下降且用药依从性显著提高。
  结论:
  药学监护路径可以促进临床合理用药,可以确保患者的用药安全,提高患者的治疗受益程度。药学监护使患者的治疗过程更加规范,并且也大大提高了患者的满意度。同时为药师提供了更好的服务思路。
[硕士论文] 黄超
内科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨姜黄素对LPS诱导的小胶质细胞损伤的保护作用及其作用机制。
  方法:将神经小胶质细胞BV2分为五组,分别是对照组、LPS模型组、10umol/L姜黄素组,20μ mol/L姜黄素组、40μ mol/L姜黄素组。其中姜黄素组细胞株分别用姜黄素注射液10μ mol/L、20μ mol/L、40μ mol/L预处理1h,然后加入1g/ml的LPS处理24h; LPS组细胞株仅用1g/mL的LPS处理24h。将细胞置于5%CO237℃培养箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。用MTT法检测,姜黄素对BV2小胶质细胞毒性作用进而显示不同组间细胞活力;通过Griess法,比较不同组间细胞NO的产生量。通过ELISA法观察TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的表达;通过Western blot法观察细胞iNOS、NF-κ B p65、p-AKT等蛋白表达的作用。
  结果:1 MTT结果显示,LPS模型组细胞活性显著降低,(P<0.05)(与对照组相比);10μmol/L姜黄素组细胞活力显著增加(P<0.05)(与LPS模型组相比);20μmol/L姜黄素组细胞活力显著增加(P<0.05)(与LPS模型组相比);40μmol/L姜黄素组细胞活力显著增加(P<0.05)(与LPS模型组相比)。不同浓度的姜黄素均对BV2细胞均无毒性作用。
  2 Griess法结果显示,LPS模型组能明显提高BV2细胞的NO产生,给予姜黄素处理后可明显减少NO的产生,并呈剂量依赖式减少。
  3 ELISA结果显示,在模型组中LPS可明显提高BV2细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的表达;其中20μmol/L、40μmol/L姜黄素组处理后能明显降低LPS激活的BV2细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的表达。
  4 Western blot结果表明,在模型组中LPS能明显提高BV2细胞的iNOS、细胞核内NF-κB p65、p-AKT蛋白的表达;其中20μmol/L、40μmol/L姜黄素组处理后能明显降低LPS激活的BV2细胞的iNOS、细胞核内NF-κB p65、p-AKT蛋白的表达。
  结论:
  1姜黄素可明显提高LPS诱导的小胶质细胞的存活率,并对其起保护作用。
  2姜黄素使LPS诱导的小胶质细胞的存活率升高,其机制主要通过激活PI3K/AKT途径抑制NF-κB的激活下调iNOS,减少NO的产生。
  3姜黄素通过抑制NF-κB的激活,减少iNOS、NF-κ B p65、p-AKT蛋白的表达,及减少细胞因子的产生从而发挥对LPS所致小胶质细胞的保护作用。
[硕士论文] 赵婧彤
内科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  哺乳动物的小脑是重要的与运动功能相关的中枢器官,来自外部信息通过攀爬纤维(CF)、苔藓纤维(MF)进入小脑皮层后,经小脑皮层神经元网络整合与计算后,由浦肯野细胞(PC)发出运动调节指令,来完成运动调节的相关功能。促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)是一种重要神经肽,参与调控哺乳动物应激反应和内脏功能活动,CRF神经纤维大量投射到小脑皮层,影响哺乳动物小脑皮层PCs的自发性放电活动,但其影响机制有待于进一步明确。本研究拟利用乌拉坦麻醉小鼠,采用活体动物电生理记录技术和神经药理学手段,研究CRF对小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发兴奋性谷氨酸能突触传递的影响,探讨CRH对小脑皮层PC自发兴奋性谷氨酸能突触传递影响的受体机制。
  材料与方法:
  6-8周龄的成年ICR小鼠,腹腔注射1.3 g/kg乌拉坦麻醉后,在其小脑Vermis区的相应位置开一个直径为1-1.5 mm的孔,轻轻剥除其硬脑膜,并在暴露部位持续灌人工脑脊液(ACSF)。PC自发性放电活动采用细胞外贴附式记录记录方法,通过Axopatch-200B膜片钳放大器及数据采集软件记录小脑皮层PC自发性活动;CRH及受体阻断剂采用小脑表面灌流给药;电生理实验数据分析采用Clampfit10.3软件。各组数据均用Mean士S.E.M.表示,记录细胞数用n表示,采用SPSS(Version21)软件进行数据统计学的分析,使用单因素方差分析进行均数的比较,P<0.05认为有统计学意义。
  结果:
  (1)脑表面灌流CRF(100 nM)显著增加PC SS自发性放电频率,SS放电的平均频率为给药前的118.2±3.7%,非选择性CRF-Rs阻断剂可以完全阻断CRF所导致的PC自发性SS放电频率的升高。
  (2) CRF-R1选择性受体阻断剂BMS-763534明显阻断CRF导致的PC自发性SS放电频率升高。
  (3) CRF-R2选择性受体阻断剂antisauvagine-30也可以明显抑制CRF导致的PC自发性SS放电频率升高。
  (4)在antisauvagine-30和BMS两种阻断剂共同存在下,CRF不能诱发PC自发性SS放电频率升高且CRF-R1的作用大于CRF-R2。
  (5) CRF可显著缩短mEPSCs时间间隔,但对mEPSCs的振幅没有影响。在CRF-R2阻断剂存在条件下,CRF不再缩短mEPSCs时间间隔。
  (6)PKA抑制剂-H-89可显著增加mEPSCs时间间隔,并显著降低mEPSCs振幅,并完全阻断了CRF对mEPSCs的频率的影响。
  结论:
  本研究结果表明,CRF可通过活化CRF-R2增加PC突触前谷氨酸能递质释放、增加PC的兴奋性传入导致其自发性SS放电频率升高,提示应激刺激可通过突触前CRF受体调节小脑皮层PC自发性活动,进而影响PC的指令输出以及运动调节功能。
[博士论文] 纪昊一
人文医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要分为以下几个部分:
  第一部分:鼻内给予缩宫素对母婴分离应激导致大鼠抑郁样行为的影响及其机制
  生命早期应激(Early Life Stress,ELS)可诱发重性抑郁症、创伤后应激障碍、儿童注意缺陷症及精神分裂症等疾病,是引发多种精神疾病的重要风险因素。缩宫素(Oxytocin,OXT/OT),又称催产素,是一种由下丘脑产生的神经调节肽,有研究显示新生鼠母婴分离(Neonatal Maternal Deprivation,NMD)可能会令大鼠在将来的生活中产生抑郁和焦虑症状。NMD大鼠模型是研究生命早期应激对成年动物行为影响的公认的模型之一。但目前关于OXT在早期母婴分离导致成年动物行为改变中的作用,尚未见系统报道,有待于进一步研究。该研究将为预防或治疗生命早期应激所产生的心理问题提供新的治疗手段。OXT是一个小分子九肽物质。
  目的:
  本研究以NMD作为母爱剥夺的手段,观察出生早期母爱剥夺对成年大鼠行为学的影响,探讨鼻内给予OXT对NMD成年大鼠类抑郁行为及神经生成的影响,并阐明其作用机制,以期为治疗留守儿童缺乏关爱造成的心理创伤提供新的研究和治疗途径。
  方法:
  1.NMD大鼠模型的建立:选取SD大鼠为实验动物,出生当天定为产后第一天(PNDl),将幼鼠从母鼠笼中取出,在PND2-15天每天的9:00-12:00被单独隔离3h,然后再将幼鼠送回与母鼠同笼直至断乳日(PND2-15天),构建NMD大鼠模型,而对照组幼鼠同期一直与母鼠同笼饲养。
  2.强迫游泳实验:将实验大鼠(n=10)单独放置于玻璃圆筒中,其内装有25℃、深度为40cm的水。大鼠不能接触圆筒底部或逃生,并被迫在筒中进行两次游泳,观察记录静止时间、游泳时间和挣扎时间。
  3.开放旷场实验:将一个大小为100cm×100cm×40cm方形黑色区域划分为25个等大的小正方形区域,将实验大鼠单独置于场地中央处,任其随意运动5min。观察记录大鼠水平和垂直运动的次数。
  结果:
  1.NMD大鼠的行为学评估:采用强迫游泳实验评估NMD大鼠的抑郁样行为,发现与对照组相比较,NMD组大鼠(n=10)静止时间显著延长(54±4%vs35±7%;P<0.01),挣扎时间显著缩短(37±2%vs57±11%;P<0.01),但两组游泳时间差异无统计学意义(9±3%vs8±6%;P>0.05)。应用开放旷场实验评价大鼠自觉探索行为能力,发现NMD组大鼠在实验中穿越标记线的次数(20±8vs52±7;P<0.01)与站立次数(8±2vs21±2;P<0.01)均较对照组明显减少。
  结论:
  1.新生鼠母婴分离(NMD)可诱导成年大鼠出现抑郁样行为,其机制可能与NMD大鼠血浆、下丘脑和海马组织中OXT显著降低有关。
  2.鼻内给予OXT能够明显改善成年大鼠的抑郁样行为,其机制可能与OXT促进海马神经元新生有关。
  第二部分:缩宫素在慢性束缚应激促进恶性黑色素瘤肺转移中的作用及其机制
  恶性黑色素瘤(Malignant Melanoma)是一种高度侵袭性的皮肤恶性肿瘤,易发生血管浸润、转移和复发,预后极差,目前尚无有效的治疗方法。深入研究恶性黑色素瘤远处转移的机制、筛选相关分子标记物、寻找新的治疗手段,对于提高恶性黑色素瘤患者的疗效、预防肿瘤转移、改善患者预后具有重要的临床意义。缩宫素(OXT)是下丘脑产生的一种神经激素,在哺乳及分娩中起着至关重要的作用。
  鉴于以上研究,我们推测慢性束缚应激通过提高血浆OXT水平促进恶性黑色素瘤肺转移。
  目的:
  本研究拟通过小鼠慢性束缚应激模型探讨应激对恶性黑色素瘤肺转移及血浆OXT水平的影响;研究应激导致的血浆OXT升高在恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭及体外血管生成中的作用;阐明OXT通过与细胞表面OXTR结合,激活β-arrestin2-ERK1/2信号通路,促进恶性黑色素瘤肺转移的分子机制,以期为恶性黑色素瘤的转移提供新的治疗思路。
  方法:
  1.建立小鼠慢性束缚应激模型,研究慢性束缚应激对血浆OXT水平及恶性黑色素瘤肺转移的影响:将C57BL/6小鼠置于特制的束缚器内,限制其行动,2小时/天,连续1周,制造小鼠慢性应激模型。尾静脉取血,ELISA试剂盒检测血浆OXT水平。小鼠接受束缚实验1周后尾静脉注射B16恶性黑色素瘤细胞,23天后颈椎脱日法处死小鼠,解剖肺部,计数小鼠肺脏肿瘤结节数目。同样方法处理小鼠观察生存时间。
  2.构建恶性黑色素瘤皮下荷瘤小鼠模型及肺转移瘤小鼠模型,研究OXT对恶性黑色素瘤生长及转移的影响。将B16小鼠恶性黑色素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右后肢皮下,1周后将小鼠随机分为两组,分别腹膜腔注射OXT或生理盐水2周,颈椎脱日法处死小鼠,解剖并观察黑色素瘤的生长情况。同样方法处理小鼠观察生存时间。肺转移瘤小鼠模型采取尾静脉注射B16细胞,3天后将小鼠随机分为3组,分别腹膜腔注射OXT、OXTR阻断剂阿托西班(atosiban)或PBS处理1周。B16细胞注射后16天处死小鼠,解剖肺部,计数小鼠肺脏肿瘤结节数目。同样方法处理小鼠观察生存时间。
  结果:
  1.慢性束缚应激能促进恶性黑色素瘤小鼠肺转移:体内实验显示,与对照组相比,束缚应激组恶性黑色素瘤小鼠肺转移瘤数量明显增多,且束缚应激组恶性黑色素瘤小鼠的生存时间明显缩短。
  2.慢性束缚应激能提高小鼠血浆OXT水平:ELISA结果显示,与对照组相比,暴露于慢性束缚应激后小鼠血浆OXT水平明显升高。
  3.恶性黑色素瘤高表达OXTR:Western blot及免疫组化显示,小鼠恶性黑色素瘤细胞株(B16)、人恶性黑色素瘤细胞株(A375)及人恶性黑色素瘤组织均高表达OXTR,提示OXT信号通路可能在恶性黑色素瘤的发生发展中发挥重要作用。
  4.OXT对恶性黑色素瘤细胞的增殖无明显影响:CCK8结果显示,应用OXT处理B16、A375恶性黑色素瘤细胞株后,细胞增殖与对照组无明显差异;体内研究显示,恶性黑色素瘤小鼠注射OXT后,肿瘤大小、重量、体积与生理盐水处理组无明显差异。
  结论:
  1.慢性束缚应激通过提高血浆OXT水平,促进恶性黑色素瘤肺转移。
  2.OXT能促进恶性黑色素瘤的迁移、侵袭及血管生成,对黑色素瘤的增殖无明显影响。
  3.OXT通过与OXTR结合,激活β-arrestin2-ERK1/2信号通路,促进恶性黑色素瘤的肺转移。
  第三部分:缩宫素对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响及其机制
  目的:
  本研究拟探讨OXT对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及体外血管生成等生物学行为的影响,阐明OXT参与卵巢癌侵袭转移作用的具体机制,以期为母乳喂养的保护作用提供理论学依据和实验室基础,为卵巢癌的治疗提供新靶点。
  方法:
  1.临床相关性分析:通过PrognoScan公共数据库(http://gibk21.bse.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html),根据卵巢癌组织中OXTR mRNA表达水平,将卵巢癌患者分为高表达组及低表达组。应用生存曲线分析卵巢癌患者预后与OXTR mRNA表达水平的相关性。
  2.细胞增殖实验:2000个SKOV3细胞种入96孔板中板,加入不同浓度(0,10-7,10-6,10-5 M)OXT或同时应用OXTR拮抗剂atosiban(10-5 M)孵育48小时,应用CCK8法检测SKOV3细胞的存活,评价OXT对卵巢癌细胞增殖的影响。
  3.卵巢癌细胞迁移实验:将SKOV3和A2780细胞接种于6孔板中,待细胞融合率达85-90%,用100μl枪头划板,加入缩宫素,浓度梯度或时间梯度孵育后观察,评价OXT对卵巢癌细胞迁移能力的影响。
  4.卵巢癌细胞侵袭实验:将A2780细胞接种于transwell上孔中,加入梯度浓度的OXT(0,10-9,10-8,10-7,10-6 M)孵育,培养24小时。应用侵袭实验检测A2780细胞的侵袭,评价OXT对A2780细胞侵袭能力的影响。
  结果:
  1.通过PrognoScan公共数据库,应用生存曲线分析发现卵巢癌组织中OXTRmRNA高表达与卵巢癌的远处转移显著相关。
  2.OXT抑制卵巢癌细胞增殖:应用浓度梯度的OXT处理SKOV3细胞株48小时,CCK8结果显示OXT可显著抑制SKOV3细胞的增殖,且其增殖抑制作用具有浓度依赖性。同时应用OXT(10-5M)和OXTR阻断剂atosiban(10-5M)处理,CCK8结果显示OXT的抑制增殖作用可被OXTR阻断剂所逆转。
  结论:
  1.OXT能够抑制人卵巢癌细胞SKOV3、A2780细胞的增殖、迁移和侵袭。
  2.OXT通过抑制MMP-2的表达进而抑制卵巢癌侵袭转移。
  3.OXT通过抑制VEGF的产生抑制体外血管生成。
[硕士论文] 穆永亮
免疫药物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.研究IL-12表达载体联合奥沙利铂抗HCC的作用,并阐述其抗肿瘤免疫机制。
  2.评价法舒地尔治疗肝纤维化的可行性,并研究法舒地尔治疗肝纤维化的作用机制。
  一、IL-12联合奥沙利铂治疗HCC的作用及机制
  方法:
  1.应用重组mIL-12表达载体对小鼠Hepal-6肝癌细胞系进行转染,设置Ctrl组、pSecTag空载体组、mIL-12过表达(mIL-12-over)组,利用PCR、ELISA的方法,分别对mIL-12mRNA和蛋白水平进行检测,观察mIL-12表达载体在Hepal-6细胞的转染效率。
  2.利用PCR和流式细胞术方法检测IL-12受体在HCC细胞上的表达水平。
  3.对Hepal-6细胞进行AnnexinV/PI染色,利用流式细胞术的方法检测mIL-12过表达后对HCC细胞凋亡的影响;利用PCR的方法检测mIL-12过表达对Hepal-6细胞增殖相关基因Ki67的表达水平。
  4.利用Transwell的方法检测mIL-12过表达后对HCC细胞迁移、侵袭的影响。
  5.利用Transwell的方法检测mIL-12过表达的HCC转染上清对脾脏淋巴细胞迁移的影响,并利用流式细胞术的方法检测其对不同免疫细胞亚群比例、活化水平的影响。
  结果:
  1.IL-12可成功转入HCC细胞并可稳定表达
  PCR和ELISA的结果显示,将mIL-12过表达载体转入小鼠HCC细胞系Hepal-6细胞后,无论是在基因水平还是蛋白水平皆可检测到mIL-12的稳定表达。
  2.HCC细胞表达IL-12受体并且IL-12可对肿瘤细胞凋亡、增殖产生直接作用
  通过Real-time PCR以及流式细胞术的方法检测到IL-12受体可在肿瘤细胞上表达。利用流式细胞术的方法发现,当转入IL-12质粒后,HCC细胞凋亡率上升,并且其增殖相关基因Ki67表达下调,说明IL-12促进HCC细胞凋亡、抑制其增殖。
  3.IL-12可抑制HCC细胞迁移、侵袭,抑制TGF-β的表达
  通过Transwell的方法发现,与空白对照组和空载体组相比,mIL-12过表达组可抑制HCC细胞Hepal-6的迁移和侵袭。并且,通过Real-time PCR和ELISA的方法发现,mIL-12过表达对Hepal-6细胞TGF-β的表达产生的抑制作用。
  4.HCC过表达IL-12可趋化脾的单个核细胞并活化CD8+T细胞
  通过Transwell法发现,含有IL-12的HCC细胞转染上清可有效促进脾的单个核细胞的迁移。利用流式细胞术以及Western Blot检测发现,IL-12促进了脾细胞中T细胞STAT1信号通路。流式细胞术检测其不同细胞亚群的变化以及细胞因子的变化发现,IL-12可有效促进CD8+T细胞的活化,并促进其IFN-γ、TNF-α的产生。
  5.IL-12可抑制HCC细胞PD-L1的表达
  利用流式细胞术的方法检测发现,当mIL-12载体转染24小时后,HCC细胞表达PD-L1的水平显著下调。
  6.IL-12可以提高脾单个核细胞对肿瘤细胞的杀伤能力
  将不同处理的肿瘤细胞上清体外孵育小鼠脾单个核细胞24小时,设置2.5∶1、5∶1、10∶1三个不同效靶比,用细胞检测仪观察杀伤过程发现,与空白对照和空载体组相比,IL-12过表达组杀伤效率显著上升,说明IL-12提高了脾细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。
  7.mIL-12与奥沙利铂联合治疗可有效抑制HCC在小鼠体内的生长速率
  通过对荷瘤鼠进行治疗发现,mIL-12与奥沙利铂联治疗组可有效抑制肿瘤生长速率,最终肿瘤体积与其它组相比较也显著下降。
  8.IL-12与奥沙利铂联合使用可有效促进免疫细胞的活化
  通过流式细胞术对治疗后小鼠脾脏、肝脏以及肿瘤内部免疫细胞亚群进行检测分析发现,mIL-12与奥沙利铂联用可以促进肿瘤组织中CD4+T、CD8+T细胞CD69的表达,并且可以上调NKT的比例;同时,联合治疗组脾脏中CD4+T和NK细胞活化比例也显著上调。三个不同治疗组与空白对照组相比,脾脏中CD8+T比例均有所上调,单独治疗可引起NKT细胞比例上调,但联合治疗组对NKT细胞作用不明显。在肝脏中,联合治疗组对CD4+T、CD8+T和NK细胞皆有促进活化的作用。另外,联合治疗可有效活化肿瘤浸润的巨噬细胞。
  二、法舒地尔治疗小鼠肝纤维化及其机制研究
  方法:
  1.利用TAA对小鼠进行造模,每隔两天一次,每次20mg;TAA注射一周后,注射法舒地尔(10mg/kg),每天一次,连续三周,同时设置TAA模型对照组和未注射TAA的健康鼠组。
  2.将小鼠处死后,称量其体重以及肝脏、脾脏重量,计算肝、脾比重。对肝、脾拍照,观察不同处理组间肝脏纤维化程度。
  3.利用HE染色法、AST/ALT检测不同处理组小鼠肝脏淋巴细胞聚集情况以及肝脏损伤情况。
  4.利用天狼猩红染色法检测不同处理组肝纤维化程度,利用Real-time PCR、Western Blot法检测与纤维化相关的Colla-1和α-SMA的表达水平。
  5.流式细胞术检测不同处理组间脾脏、肝脏中不同免疫细胞亚群的变化。
  结果:
  1.法舒地尔可对小鼠肝脏纤维化产生抑制作用
  通过对不同处理组的小鼠进行天狼猩红染色、检测纤维化相关蛋白colla-1、α-SMA的表达发现,法舒地尔可降低肝纤维化程度。
  2.法舒地尔可降低肝脏炎症
  通过对不同治疗组小鼠肝脏进行HE染色以及检测小鼠外周血中ALT、AST的表达量发现,法舒地尔可有效降低由肝损伤所引发的炎症反应。
  3.法舒地尔可以促进肝脏、脾脏中CD4+T细胞和NK细胞的活化
  通过对治疗后肝脏和脾脏中不同免疫细胞亚群进行流式检测发现,法舒地尔可有效促进肝脏、脾脏内CD4+T细胞和NK细胞CD69的表达,说明法舒地尔可促进CD4+T细胞和NK细胞的活化。通过用不同浓度法舒地尔体外刺激肝脾单个核细胞发现,法舒地尔可以促进CD69+NK细胞比例,同时也可对NK细胞受体NKG2A、NKG2D表达产生影响。
  4.法舒地尔可以活化NK-92细胞ERK信号通路,促进IFN-γ的表达
  经不同浓度法舒地尔孵育NK-92细胞,用Western Blot法检测其对不同信号通路的影响,发现法舒地尔可以活化NK-92细胞中ERK/P-ERK信号通路,Real-time PCR以及流式检测发现法舒地尔促进了NK-92细胞中IFN-γ的表达。
  5.法舒地尔可以促进LX2细胞的凋亡,影响其周期
  通过Real-time PCR以及流式检测发现,不同浓度法舒地尔可有效下调LX2细胞中抗凋亡基因Bcl-2的表达,上调促凋亡基因Bax的表达以及与其表达相关的ERK信号通路。并且,随着法舒地尔浓度的增加,LX2细胞凋亡率增加。通过周期检测发现,法舒地尔将LX2的分裂阻滞在了G1期。
  6.法舒地尔可抑制LX2细胞系中RhoA的表达
  PCR检测不同浓度法舒地尔孵育LX2细胞后RhoA基因表达水平显著下调,并且α-SMA蛋白水平表达下调。同时,检测到LX2细胞TGF-β表达得到抑制。
  7.法舒地尔可提高人外周血中NK细胞对LX2细胞的杀伤功能
  将人外周血中NK细胞分选出,体外加不同浓度法舒地尔孵育后,其对LX2细胞的杀伤率增加。
  结论:
  通过本文研究发现,IL-12过表达载体转入HCC细胞后可诱导HCC自身产生凋亡、增殖抑制的影响,并且下调免疫抑制性分子PD-L1、TGF-β在HCC中的表达,抑制HCC迁移和侵袭能力。IL-12过表达HCC细胞上清体外对肝脾单个核细胞具有显著的募集效果,其中对CD8+T细胞产生明显的活化作用,并且可以促进其IFN-γ、TNF-α的表达;同时,IL-12过表达HCC细胞上清可以提高淋巴细胞对HCC的杀伤能力。进一步我们利用荷瘤小鼠模型,探讨IL-12载体与奥沙利铂联合治疗HCC的效应。我们发现,联合治疗可以很好的抑制肿瘤生长,活化肝脏、脾脏和肿瘤组织中淋巴细胞。该部分研究说明,IL-12既可以对HCC细胞产生直接的抑制效果,同时可以活化免疫细胞,促进抗肿瘤免疫应答。为了更好的对肝癌进行预防,我们探讨了临床用药法舒地尔用于抗肝纤维化的效应和相应机制。我们发现,法舒地尔可以有效改善肝纤维程度,抑制肝癌进程。通过体外实验证明,法舒地尔可以有效促进肝星状细胞的凋亡,抑制其免疫抑制分子TGF-β的分泌,并且可以通过抑制RhoA的表达从而降低α-SMA的产生。通过体内、体外研究发现,法舒地尔可以通过活化肝脏内NK细胞,促进其IFN-γ的分泌来对肝星状细胞产生杀伤作用,对肝纤维化的发生具有良好的抑制作用。
  综上所述,IL-12与奥沙利铂联合治疗肿瘤疾病可以通过对不同免疫细胞的活化得到很好的治疗效果,为临床治疗肿瘤疾病提供新的治疗方案。另外,法舒地尔可以通过抑制肝纤维化的发生来组织肝癌进程,从而对肝癌起到一定的预防作用。
[硕士论文] 李金时
药学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  利用Meta分析评价前列地尔(Alprostadil)注射剂对糖尿病性视网膜病的疗效。
  方法:
  利用计算机检索多种电子数据库,其中包括中国生物医学文献数据库(CBM)、中文科技期刊全文数据库(VIP)、中国期刊全文数据库(CNKI)、万方数据库(Wanfang Data),PubMed数据库、OVID数据库、Cochrane Library数据库,检索时间均设置为建库至2017年12月。通过计算机共检索到前列地尔注射剂治疗糖尿病性视网膜病相关文献56篇,通过筛选相关研究,应用RevMan5.3软件对均符合纳入排除标准的8篇临床随机对照试验(RCTs),共计患者635例meta分析,其中试验组316例,对照组319例。采用Jadad评分标准对纳入本研究的8篇文献进行评价,观察其质量的高低。
  结果:
  由于对前列地尔治疗糖尿病视网膜病变的相关研究不多,所以纳入文献数量相对较少,且结果显示总体质量不高,但无明显高偏倚风险。对其中5项研究试验组与对照组两组疗效进行研究比较。Meta分析结果显示:所纳入的研究无显著统计学异质性,有统计学意义,合并OR(95%Cl)为3.27[2.10,5.11];对2项治疗后糖化血红蛋白(HbA1C)进行比较分析。Meta分析结果显示:所纳入的2项研究无显著统计学异质性,合并MD(95%Cl)为0.05[-0.46,0.57]。2项研究提到了试验组和对照组患者的眼底出血斑数情况并对两组治疗前后眼底出血斑数进行了研究比较,显示了两组眼底出血斑数比较的结果。Meta分析结果显示:所纳入的2项研究有统计学异质性,但未发现导致异质性的临床因素。有统计学意义,试验组治疗方案比对照组效果好。2项研究提到了试验组和对照组患者的眼底血管瘤数情况并对两组治疗前后眼底血管瘤数进行了研究比较,显示了两组眼底血管瘤数比较的结果。Meta分析结果显示:所纳入的2项研究无统计学异质性,有统计学意义,试验组治疗方案优于对照组。
  结论:
  前列地尔注射剂对改善或稳定糖尿病性视网膜病患者病情有效果,结果显示前列地尔注射剂对糖尿病性视网膜病有一定治疗作用,并为进一步的临床研究提供了方向和依据。由于对前列地尔治疗糖尿病视网膜病变的相关研究不多,所以纳入文献数量相对较少,且结果显示总体质量不高,存在一定的局限性,所以需要更多的RCT和更多高质量的研究来验证。
[硕士论文] 贾玉华
内科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:中药在抗肝损伤动物模型的作用已得到广泛学者的认可,但单一药物起效慢,真正在临床上得到充分应用的很少。目前国内外对中药抗肝损伤的研究,特别是对多种药物混合后的相互作用与作用机理的研究尚缺乏,直接局限了中药在临床疾病治疗的应用。本研究意在探究姜黄素、生态动力素(多种微量元素)抗急、慢性肝损伤的作用,且两者联合用药后有无协同抗肝损伤的作用,并进一步探讨其抗肝纤维化的机制。
  方法:
  第一部分:研究姜黄素和生态动力素的抗急性肝损伤作用
  提前1周给予BALB/c小鼠姜黄素、3个不同剂量的生态动力素混悬液灌胃干预,末次灌胃给药后给予腹腔注射0.2% CCl4油剂建立急性肝损伤模型。分别检测各组小鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平;进行小鼠肝组织HE染色,初步评价姜黄素和生态动力素的抗急性肝损伤作用。
  第二部分:探讨姜黄素联合生态动力素通过调节Nrf2氧化应激通路抗肝纤维化的作用及机制
  BALB/c小鼠被反复腹腔注射20% CCl4油剂,每周2次,连续6周。建立肝纤维化模型的同时给予姜黄素、生态动力素及联合药物的混悬液灌胃给药。检测各组小鼠血清ALT、AST和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)水平;行小鼠肝组织HE染色、天狼猩红染色,评价姜黄素、生态动力素及联合给药的抗肝纤维化效果。Real Time PCR检测小鼠肝组织内Nrf2、GSH-PX的mRNA表达,探讨姜黄素联合生态动力素通过调节Nrf2氧化应激通路抗肝纤维化的机制。
  结果:
  第一部分:研究姜黄素和生态动力素的抗急性肝损伤作用
  0.2% CCl4油剂单次腹腔注射可造成小鼠明显的急性肝损伤模型,表现为CCl4注射24h后小鼠血清ALT、AST水平较正常组明显增高(P<0.01);肝组织经HE染色镜下观察示小鼠肝组织内细胞呈现大量坏死的状态。姜黄素、生态动力素干预治疗后较模型组显著降低小鼠血清ALT、AST水平,组织学上减轻小鼠急性肝细胞坏死的程度。
  第二部分:探讨姜黄素联合生态动力素通过调节Nrf2氧化应激通路抗肝纤维化的作用及机制
  20% CCl4油剂持续的注射可有效的诱导小鼠肝纤维化模型的形成,表现为较正常组小鼠分离血清中ALT、AST水平模型组明显增高;肝组织HE染色呈现出肝细胞有大量片状的坏死,细胞脂肪样病变,小叶结构紊乱,并且伴随炎症细胞的浸润,脉管区纤维组织增生并蔓延,肝实质内纤维组织增生显著;姜黄素、生态动力素及联合给药能显著减低(P<0.01)小鼠血清ALT、AST水平,组织学上明显减轻小鼠肝细胞损伤和炎症细胞浸润。天狼猩红染色示小鼠肝纤维化程度较模型组同步明显减轻。姜黄素、生态动力素及联合给药组小鼠血清SOD、GSH-PX水平较模型组明显增高(P<0.01),MDA水平较模型组减低。Real TimePCR检测结果示姜黄素、生态动力素及联合给药组小鼠肝组织内Nrf2、GSH-PXmRNA表达水平较模型组明显升高(P<0.05)。但联合给药组与姜黄素组比较小鼠血清学检测结果无明显差异,肝纤维化程度差异不明显。
  结论:
  1.姜黄素和生态动力素均有抗急性肝损伤的作用。
  2.姜黄素和生态动力素均有抗肝纤维化的作用。
  3.姜黄素联合生态动力素抗肝纤维化的作用机制可能与Nrf2介导的氧化应激通路有关。
  4.联合用药未能明显增强姜黄素的抗肝纤维化作用。
[硕士论文] 洪小媚
应用统计学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:随着医药学的发展,药物混合试验越来越受到重视.药物混合因其多靶向性能削弱抗药性;药物之间的协同作用能有效地减少单个药物的剂量,从而能有效地削弱药物的毒性.因此,在特殊疾病治疗中被广泛使用.基于混合药物试验的数学模型能有效的帮助临床试验研究人员制定更优的治疗方法.本文提出用含潜变量的分层Hill模型对混合药物试验数据进行响应曲面建模.含潜变量分层Hill模型遗传了分层Hill模型对药物作用较强的解释能力.同时克服了分层Hill模型无法处理多药物混合的缺点.
  针对分层Hill模型,我们引入蒙特卡洛EM算法(MCEM)求解模型参数的极大似然估计.在误差正态分布假设下,我们给出了EM算法的M步的解析最优解.针对E-步中复杂的分布,我们采用抽样重要性重抽样算法(SIR).通过利用SIR抽样算法的效率,MCEM算法能得到有效的极大似然估计.为了检验新模型及模型求解算法,本文对三药物混合作用于肺癌细胞的实验数据进行建模分析.并与参考文献(Ning and Xu et al.(2014))中的结果进行了比较.计算结果显示我们的模型和求解方法能获得更好的拟合和预测MSE.由于含潜变量分层Hill模型中对应于药物效应的参数有解析解,相较于传统的复杂非线性分层Hill模型计算复杂度小很多.因此我们的模型可以更容易的推广到多药物混合试验建模分析.
[硕士论文] 黎海欣
药学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  针对卡维地洛对映体药理特性不明确,尤其是抗氧化作用机制不清楚的问题,研究体内外实验卡维地洛对映体对抗由阿霉素造成的氧化损伤的作用的区别,阐明左旋卡维地洛(S-CAR)保护阿霉素(DOX)诱导内皮细胞氧化损伤和大鼠血流动力学改变的机制,为开发优效的单一对映异构体提供理论依据。
  方法:
  体外实验:应用不同浓度阿霉素(Doxorubicin,DOX)(0-20μM)处理人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)24h后,CCK-8法确定最佳损伤浓度;实验分组:卡维地洛(CAR)5μM、左旋卡维地洛(S-CAR)5μM、右旋卡维地洛(R-CAR)5μM、氮乙酰半胱氨酸(NAC)lmM、美托洛尔(Met)5μM、DOX2μM、空白对照(Control)。各药物预处理6h后与DOX(2μM)共培养24h,CCK-8法检测细胞存活率;Hoechst33258染色法观察细胞凋亡;共聚焦显微镜检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP);荧光分光光度计法检测HUVECs活性氧(Reactive oxygen species,ROS);酶标仪法测定HUVECs超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA);Western blot法检测HUVECs p/t-PI3K,p/t-AKT和p/t-eNOS蛋白表达。
  体内实验:106只大鼠根据体重随机分为空白对照组(13只)和模型组(93只)。模型组大鼠腹腔注射阿霉素诱发大鼠心脏血流动力学改变。成模存活大鼠随机分为CAR(6mg/kg)16只、S-CAR(2mg/kg)17只、S-CAR(6mg/kg)19只、R-CAR(6mg/kg)17只、模型对照组16只。各组大鼠每日给予相应药物灌胃,连续36天。观察大鼠体重、存活、心脏血流动力学、血清酶学、腹腔病变、心脏重量指数。
  结果:
  体外实验:阿霉素单独刺激HUVECs,呈剂量依赖性地抑制细胞存活率;可见大量凋亡细胞,同时伴有MMP下降,SOD减少,MDA、ROS上升,p/t-PI3K,p/t-AKT和p/t-eNOS蛋白比例也减小。S-CAR预处理后,存活细胞明显增多,MMP处于正常水平,不仅抑制DOX对ROS生成的促进作用,还抑制DOX诱导的脂质过氧化反应,如抑制MDA的生成,同时升高SOD,提高PI3K,AKT和eNOS磷酸化水平。R-CAR预处理HUVECs没有表现出抵抗阿霉素所诱导的氧化损伤和细胞凋亡作用,MMP、SOD较低,而MDA、ROS升高。Met无明显的对抗阿霉素的氧化损伤作用。
  体内实验:(1)造模期间空白对照组大鼠体重保持增长,其他组大鼠无明显增加。(2)造模8周模型组死亡率为9%,S-CAR(6mg/kg)死亡率最低。(3)模型对照组收缩期左室后壁厚度(LVPW;s)、舒张期左室后壁厚度(LVPW;d)、收缩末期室间隔厚度(IVS;s)、舒张末期室间隔厚度(IVS;d)、射血分数(EF)、心输出量(CO)、左室短轴缩短率(FS)均较空白对照组低,S-CAR(6mg/kg)进一步降低EF、CO、FS。其余各组与模型对照组比较,各项指标都无显著性差异。(4)大鼠颈动脉压(MBP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP),左室压力最大上升及下降速率(±dp/dt)模型对照组均比空白对照组低。与模型对照组比,S-CAR(2mg/kg)和S-CAR(6mg/kg)能显著升高LVEDP(P<0.05),提高大鼠血清CAT(P<0.05)和SOD(P<0.05)活性,降低ROS含量(P<0.05)。(5)S-CAR(6mg/kg)能明显改善造模大鼠腹水形成和腹部粘连,改善血管功能,提高动物的存活率。(6)心脏重量指数各组之间无明显差异。
  结论:
  (1)S-CAR可以对抗由阿霉素诱导的氧化损伤和细胞凋亡,提高HUVECs存活率。(2)S-CAR可提高细胞抗氧化物酶系统的活性。(3)PI3K/AKT/eNOS信号通路的活化可能是S-CAR发挥抗氧化作用的机制,通过该通路的活化进一步影响其下游重要靶点调节血管内皮功能和防止心血管疾病发生。(4)S-CAR可提高阿霉素造模大鼠的存活率,改善由阿霉素引起的血流动力学异常,减轻大鼠腹腔腹水和炎症,而R-CAR对阿霉素诱导HUVECs凋亡损伤和大鼠心衰无保护作用。
[硕士论文] 张振
外科学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探究穗花杉双黄酮对破骨细胞(OCs)生成及骨溶解的抑制效果及可能的信号机制。
  方法:
  1、无菌性松动假体周围假膜破骨细胞及炎性因子的表达情况。
  ①免疫组织化学染色观察初次髋关节置换及翻修患者关节囊周围滑膜细胞因子(TNF-α/TRAF-6)的表达。
  ②TRAP染色观察初次髋关节置换及翻修患者关节囊周围破骨细胞生成的情况。
  2.1、AMF对破骨细胞生成及功能的影响
  ①CCK-8实验:AMF对BMMs活性的影响。
  ②TRAP染色:AMF对体外OCs生成的作用。
  ③F-actin环染色:AMF对生成成熟OCs的作用。
  ④骨片吸收实验:AMF对OCs功能的影响。
  2.2、AMF对钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解的影响
  ①Micro-CT:颅骨CT扫描,分析AMF对钛颗粒诱导的颅骨骨溶解的抑制作用。
  ②HE染色:AMF对钛颗粒诱导的骨溶解炎性反应的抑制效果。
  ③TRAP染色:AMF对小鼠体内OCs生成的作用。
  3、AMF抑制破骨细胞生成的可能机制。
  ①AMF(0,10μM)预处理BMMs4小时,RANKL分别刺激不同时间(0,5,15,30分钟),Western-blot验证AMF对MAPK及NF-κB信号通路蛋白表达的作用;
  ②AMF(0,10μM)与RANKL同时作用于BMMs,Western-blot检测不同时间(0,1,3,5,天)对NFATc1/c-fos蛋白表达的作用。
  结果:
  1、无菌性松动假体周围假膜生成更多的破骨细胞及TRAF-6、TNF-α。
  通过人体标本的免疫组织化学染色示:翻修假体周围假膜表达更多的关键转录因子TRAF-6,及促进破骨细胞生成的炎性因子TNF-α;通过抗酒石酸盐酸性磷酸酶染色(TRAP)结果示:翻修患者假体周围生成更多OCs。
  2.1、AMF抑制了破骨细胞生成及功能。
  CCK-8实验:高浓度的AMF对细胞有毒性作用,但在0-10μM时,AMF对BMMs未产生明显的细胞毒性作用。
  TRAP染色:OCs数量随着药物浓度的增加呈剂量依赖性减少,与对照组比较有统计学差异。
  F-actin染色:AMF抑制F-actin环形成,呈现出剂量依赖性,与对照组比较有统计学差异。
  骨片吸收:AMF干预后,骨破坏能力被抑制,陷窝逐渐减少,与对照组比较有统计学差异。
  2.2、AMF抑制钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解。
  Micro-CT:钛颗粒组,小鼠颅骨可及明显的颅骨破坏,颅骨表面可及大量的孔腔。AMF干预后,骨溶解得到抑制,并可及修复迹象,干预组BV/TV、骨孔数量等与对照组比较差异有统计学意义。
  HE染色:钛颗粒组可及严重骨破坏,骨质可及大量空腔,而AMF干预后颅骨表面出现修复想象。
  TRAP染色:钛颗粒组见大量的OCs,集中于骨孔周边。药物干预后,染色阳性的OCs数量明显减少。
  3、AMF能抑制MAPK及NF-κB信号通路。
  Western-blot:AMF能够抑制MAPK及NF-κB信号通路并抑制OC生成关键转录因子NFATc1、c-fos的表达。
  结论:
  翻无菌性松动患者假膜有大量的OCs,说明OCs在骨溶解中起重要作用;穗花杉双黄酮可能是通过抑制MAPK及NF-κB信号通路来抑制RANKL诱导的OCs生成及钛颗粒介导的骨溶解。
[硕士论文] 华夏
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化1。在美国罹患NAFLD的人群已达到人口总数的30%2,国内流行病学的研究表明,NAFLD已成为我国引起肝功能异常以及慢性肝病的第二大元凶3。
  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又称为辅酶Ⅰ,是电子传递链中的ComplexⅠ的重要递氢物。NAD的合成包括从头合成途径(De novo pathway)和补救(Salvage pathway)合成途径两条途径,其中补救合成途径是维持NAD体内水平的主要途径。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是补救合成途径中的合成限速酶,维持体内NAD的水平4。NAD是生成ATP的必须物质,同时ATP还广泛参与机体发育、血管生成、细胞凋亡、组织炎症、神经退行性病变和肿瘤发生等病理生理过程5-7。
  在我们课题组之前关于NAMPT功能方面的研究发现,NAMPT和NAFLD之间存在重要关联。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝脏中,会随着年龄增大而表达量逐渐减低,而且NAMPT表达量的降低是老年鼠NAFLD发病和进展的重要促因8。但NAMPT的相关激活剂能否对NAFLD起到治疗作用,以及其治疗作用的机制都尚不明确。
  由于NAMPT是一个酶,因此我们期望能直接找到可以干预其作用的化合物。我们把目光瞄准了P7C3-A20这一化合物。P7C3-A20的CAS号1235481-90-9,属于氯丙基咔唑类化合物,是latrepirdine(一种神经元保护剂)的同源化合物。前期有报道发现该化合物可作为“潜在的NAMPT激动剂”升高脑内的NAD水平,发挥神经保护作用。我们猜测,P7C3-A20很有可能也能在肝脏内发挥作用,拟分三步对化合物P7C3-A20对NAFLD的治疗作用和机制进行了探讨。
  实验方法:
  1.将实验动物分成四组,每组不少于6只,分别为Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组。Chow组以普通饲料喂养,HFD组以高脂饲料喂养。HFD+A20组在HFD诱导16W后体外腹腔给药,给药量20mg/kg/d。给药2W后,先从体重、代谢率上对小鼠整体代谢水平对NAFLD造模进行评价,然后验证经过P7C3-A20治疗后的小鼠肝脏中是否存在NAD含量水平的改变。
  2.第二步检测P7C3-A20对NAFLD各项病理指标及并发症进程相关指标的影响。首先检测血清中的血脂、肝功酶系等指标各组之间的差异,然后再在肝脏组织中检测氧化应激、炎症因子、肝脏纤维化标志物、细胞凋亡标志物、胰岛素敏感度等指标,检测P7C3-A20对NAFLD病程进展和并发症的治疗作用。另外,我们还检测了另一NAD补充药物nicotinamide riboside(NR)与SIRT1过表达对NAFLD的治疗作用。
  3.第三步探讨P7C3-A20对NAFLD治疗作用的机制进行研究,根据实验结果中发现P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的浓度,推测P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的关系。所以对AMPK/CREB在肝细胞中的表达进行检测,同时检测磷酸化的标志物phospho-CREB和phospho-AMPK。将AMPKα2+/-小鼠进行杂交配种,制备AMPKα2-/-小鼠。将WT小鼠设置为对照组,AMPKα2-/-小鼠设置为实验组。两组小鼠均给予腹腔注射P7C3-A20,3天,20mg/kg/d。取血清检测血清中FGF1和FGF21的变化,取肝脏检测AMPK通路相关标志物的表达情况。
  实验结果:
  1.首先HFD组相较于Chow组,可以明确HFD诱导NAFLD模型成功。然后对NAFLD模型小鼠按照Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组四组分组进行NAD、NADH以及NAD/NADH的检测,首先验证P7C3-A20给药后确实提升对NAD在肝脏中的表达水平。
  2.HFD组给予P7C3-A20后,相比较于HFD对照组,小鼠减重明显,代谢率也有所提升;血清中肝功酶系指标有所改善;小鼠肝脏的脂质沉积、氧化应激水平、细胞炎症水平以及细胞凋亡水平均有所下降;肝脏的纤维化及纤维成分均有所好转,说明P7C3-A20对NAFLD确实有治疗作用。NR、SIRT1过表达对NAFLD也都有治疗作用,但是NR比SIRT1过表达作用更为明显。
  3.在NAFLD模型小鼠上给予化合物P7C3-A20,可上调血清中两种重要代谢调控因子FGF1和FGF21的表达。同时P7C3-A20给药可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表达。同时,此外,P7C3-A20还明显增加血FGF1和FGF21的浓度。肝脏以及血清中FGF1和FGF21表达明显提高,相对于对照组野生型小鼠,P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上对AMPK/CREB通路的激活作用被极大地抑制,且肝脏FGF1和FGF21的上调被抑制,血清中FGF1和FGF21的上调也被极大地削弱。
  实验结论:
  1.化合物P7C3-A20可有效提高NAFLD中NAD的含量。
  2.化合物P7C3-A20可有效缓解NAFLD的病程和并发症的进程。
  3.P7C3-A20对FGF1和FGF21的调控依赖于AMPK/CREB通路。
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