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[硕士论文] 魏翠云
生态学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全氟辛基磺酸盐(Perfluorooctane sulfonate,PFOS),作为一种典型的全氟类化合物,具有生殖毒性、发育毒性、神经毒性、基因毒性等多种生物毒性效应,但目前关于PFOS影响脂代谢和糖代谢的分子致毒机制尚不清楚。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,Celegans)作为一种模式生物,体内的多不饱和脂肪酸合成通路结合了植物和动物的过程,与高等动物相比,具有完整的从头合成多不饱和脂肪酸的能力。本文以C.elegans作为研究对象,用不同浓度梯度PFOS暴露C.elegans研究其对脂代谢与糖代谢的影响,主要研究结果有:
  1.建立了C.elegans脂肪酸甲酯化方法,并用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)定量检测了C.elegans体内9种典型脂肪酸含量,实验结果表明用0.5%甲酯化试剂(H2SO4/MeOH),甲酯化时间2h,甲酯化回收率较高,且GC-MS检出限都在ng/mL范围,远远低于C.elegans体内的μg/mL浓度范围,分析方法灵敏度高。
  2.不同浓度梯度(0,0.01,0.1,0.5,1.5μmol/L)PFOS暴露L1期C.elegans72h,GC-MS定量检测结果表明PFOS会导致C.elegans中脂肪酸含量降低,与饱和脂肪酸相比,不饱和脂肪酸降低相对显著;进一步发现脂肪酸合成关键基因,如乙酰辅酶A羧化酶的相关基因acc-4,△9去饱和酶的相关基因fat-7相对表达量随PFOS浓度的增加而显著下调(p<0.05),说明PFOS可能通过影响脂肪酸合成初期反应关键酶的表达,而导致C.elegans体内各脂肪酸含量下降。
  3.脂质代谢与糖代谢与氧化磷酸化水平密切相关,PFOS暴露72h后,C.elegans中葡萄糖含量也随PFOS浓度的升高而降低,1μmol/L PFOS暴露后C.elegans中的丙酮酸和ATP含量都显著降低于对照组(p<0.05);我们分别测定了C.elegans体内与葡萄糖代谢有关的糖异生、糖酵解和胰岛素通路中相关基因pck-1,pyk-1,pyk-2,pfk-1.1,gpd-2,ctl-1,daf-2,daf-16的相对表达量,结果表明PFOS暴露可能通过影响C.elegans体内与糖代谢相关基因的相对表达,从而导致C.elegans体内糖代谢紊乱;PFOS暴露会导致C.elegans中脂肪酸、葡萄糖含量的降低,而丙酮酸和ATP含量下降,提示三羧酸循环也发生紊乱,这可能是PFOS暴露造成C.elegans死亡的原因。
  总之,本文建立了灵敏可靠的C.elegans体内脂肪酸的GC-MS分析方法,定量测定了PFOS暴露对C.elegans体内脂肪酸代谢及相关基因表达的影响,并进一步分析了PFOS暴露对C.elegans体内糖代谢和三羧酸循环的影响,实验结果表明PFOS可以显著抑制C.elegans体内脂代谢、糖代谢和ATP的合成,具有明显的毒性效应。
[博士论文] 褚欣奕
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:银屑病是一种在全球范围内发病率较高且难以治愈的慢性皮肤疾病。其发病机制十分复杂,涉及多个基因和调控通路间的相互作用,而目前还没有能够系统地整合这些因素的疾病模型。内源性网络理论(endogenous network theory)提出了一种从复杂疾病表型出发研究其内在机制的系统生物学框架。该理论认为控制生物表型的机制可以用一组关键调控者间通过相互作用构成的网络,以及该网络的稳定状态来进行描述。本研究借助内源性网络理论,尝试从系统的层面整合银屑病发病机制信息,阐释发病的调控机制,探索新的治疗方式。
  首先,本研究根据银屑病的主要症状以及发病机制中的关键因素,构建了银屑病内源性网络。该网络包含免疫调节、细胞周期控制和reactive oxygen species(ROS)平衡三个模块。网络的动力学模拟结果与银屑病的特征及患者的基因表达数据相吻合,表明该网络在一定程度上能够描述疾病背后的调控机制。之后,基于此网络的研究显示,现有的抗银屑病药物的作用机制多与网络的免疫调节以及细胞周期控制模块有关,而ROS平衡模块亦包含一些潜在的银屑病治疗靶标。这一结果不仅进一步证明了本研究中构建网络的准确性,同时也预示调节ROS是一种潜在的银屑病治疗方式。
  其次,本研究对ROS平衡的核心调控者Nrf2的激活剂进行了筛选,并进行了初步验证。基于connectivity map(cMap)数据的双聚类分析得到的候选化合物,本研究依据其分子结构和是否上市进行了二次筛选,共获得了22个非亲电子性药物。随后选取9个药物利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了其激活Nrf2靶基因表达的能力。结果显示其中6个药物能够显著上调Nrf2靶基因的表达。被测药物中阿司咪唑尤为突出,表现出了高于阳性对照-D,L-萝卜硫素的Nrf2激活能力。
  最后,本研究利用咪喹模特诱导的银屑病小鼠模型验证了阿司咪唑的抗银屑病活性。实验结果显示,腹腔注射阿司咪唑能够抑制模型小鼠中表皮过度增生相关的银屑病症状以及组织病理变化。另外,阿司咪唑与现有的抗银屑病药物甲氨蝶呤的组合显示出了较后者单药更强的抗银屑病效果。
  综上所述,本研究通过构建内源性网络对银屑病发病机制进行了系统地阐释,籍于此找到了潜在抗银屑病药物阿司咪唑,并利用实验手段初步验证了阿司咪唑的抗银屑病活性,为银屑病的治疗提供了有潜力的新药物。
[硕士论文] 赵晶
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究以4-壬基酚(4-Nonylphenol,NP)为受试物,以SD雄性大鼠和睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)为研究对象,应用生物光谱技术研究NP的雄性生殖毒性效应。
  方法:
  1、用对照组(玉米油)、系列浓度(25、50、100mg/kg)NP腹腔注射,每两天一次,连续20天染毒不同日龄(21、35、50日龄)SD雄性大鼠,构建动物模型;取睾丸组织、提取原代睾丸细胞后,分别用Raman光谱和ATR-FTIR光谱检测大鼠睾丸组织和细胞的生物化学改变;
  2、用对照组(DMSO)、系列浓度(2.5、5、10和20μM)NP对睾丸SCs进行染毒培养24h,细胞经消化、洗涤、固定后用ATR-FTIR检测;
  3、采用主成分分析和线性判别分析(PCA-LDA)对获取的图谱进行多变量分析。
  结果:
  1、ATR-FTIR检测不同日龄大鼠的睾丸细胞,NP暴露组和对照组之间集群分离明显;且除了脂质区50日龄组中25mg/kgNP暴露组(P>0.05),其他暴露组与对照组的差异均具有统计学意义(P<0.001),并且显示出剂量-效应关系;聚类向量分析显示不同NP暴露下各组发生变化的生物标记物不同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率相比对照组均存在显著性差异(尸<0.001);
  2、ATR-FTIR分析不同浓度NP暴露下体外培养的睾丸SCs,NP暴露组和对照组集群图是分离开的,且在LD1平面NP暴露组和对照组效应差异显著(P<0.001);聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  3、Raman分析不同日龄大鼠的睾丸组织,观察到各组大鼠的睾丸间质组织远离对照组,且不同NP暴露组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.001)。聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异;在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、不饱和脂肪水平与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  结论:
  1、通过体内体外实验发现,不同浓度的NP对于睾丸组织和细胞产生的效应是不同的,而且伴有剂量效应关系;同时对不同的日龄大鼠所产生的的效应也各不相同;
  2、通过检测细胞的生物分子特征性变化,发现NP暴露可以干扰睾丸SCs和睾丸间质细胞脂代谢和糖代谢等细胞代谢过程,对睾丸细胞增殖活性有影响,也可以诱导蛋白质二级结构发生改变.
[硕士论文] 董伟
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.以新上市的抗肿瘤药物奥拉帕尼为先导化合物,设计、合成新的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,并评价其抑制PARP-1酶的活性及其对肿瘤细胞抗增殖能力的影响,以期获得的具有PARP-1抑制活性的新型靶向抗肿瘤化合物。鉴于PARP-1也可能是治疗AD的新型靶点,本研究同时也检测了目标化合物对AChE和BuChE的酶抑制活性,以评价其作为抗AD的多靶点配体的潜力。
  2.以Pubchem数据库中现有的PARP-1抑制剂为筛选对象,通过计算机辅助药物设计技术,筛选出具有AChE抑制活性的小分子化合物,并进行分子动态模拟,以期获得具有PARP-1和AChE双靶点抑制的抗AD化合物,为新型抗AD药物研究提供基础。
  方法:
  1.目标化合物的设计和合成:保留奥拉帕尼的主要药效团,对分子尾部的环丙基进行改造。选取分子长度适宜且尾部链自由度较小的共轭结构—取代芳香基丙烯酰基结构,对环丙基进行结构替换,设计和合成16个奥拉帕尼类似物。其合成方法为:以2-甲酰基苯甲酸为原料,经环合、氧化、还原等反应,合成重要中间体2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸;以取代的芳香甲醛为原料,与丙二酸发生Knoevenagel反应,得到取代芳香基丙烯酸,与1-叔丁氧羰基哌嗪发生酰胺反应,脱去保护基团叔丁氧羰基后,与2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基]苯甲酸发生酰胺化反应,得到目标产物。
  2.目标化合物生物活性评价:(1)采用HT同源PARP荧光法抑制试剂盒(Trevigen,Cat#4690-096-K)检测所合成的目标化合物对PARP-1酶的抑制活性,然后采用MTT法测定目标化合物对人结肠癌SW-620和人乳腺癌MDA-MB-436细胞增殖能力的影响;(2)采用Ellman法评价目标化合物对AChE和BuChE的抑制能力。
  3.虚拟筛选:使用AutoDock Vina软件对具有PARP-1抑制活性的859个化合物进行虚拟筛选,寻找具有AChE抑制活性的潜力分子。使用GROMACS软件对目标分子进行动力学模拟,探究其分子识别机制和动态结合模式。
  结果:
  1.本研究设计、合成了16个(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物,其结构通过1H-NMR、13C-NMR、IR和质谱进行了确证。
  2.(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物生物活性的评价:PARP-1酶活性的测试结果显示,化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性(IC50分别为41.50±2.65、37.90±1.89和16.10±1.25nM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.20±1.06nM);MTT测试结果显示,化合物44d、44e、44n对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞有较强的抑制增殖活性(IC50分别为10.25±2.20、13.95±1.28和11.62±2.15μM,阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.63±1.25μM),而对人结肠癌SW-620细胞无明显的抑制作用,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1可能有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究;采用Ellman法评价了目标化合物对AChE和BuChE的抑制作用。结果表明,化合物44d、44e、44n对AChE酶的IC50分别为27.44±0.46、12.24±0.49和24.55±1.10μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为0.04±0.01μM),对BuChE酶的IC50分别为13.17±0.23、5.93±0.19和9.16±0.91μM(阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为12.01±4.05μM)。化合物44d、44e、44n对BuChE显示了较好抑制活性,而对AChE抑制作用稍弱。
  3.使用AutoDock Vina软件虚拟筛选出10个目标化合物,其中8个化合物都具有吡咯并咔唑母核结构,该结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有重要作用。CID71605390和CID57390505在与AChE的对接和分子动态模拟中显示出较高亲和力和稳定性。
  结论及创新点:
  1.本研究以奥拉帕尼为先导化合物,合成并确证了16个未见报道的(E)-4-{3-[4-[(3-取代芳香基)丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物。其中化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性,且对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞具有较强的抗增殖活性,提示化合物44d、44e、44n对PARP-1具有较好的选择性和靶向性,特别是化合物44n值得进一步研究。其中化合物44d、44e、44n还对BuChE显示了较好抑制活性。
  2.通过对Pubchem数据库中的PARP-1抑制剂进行虚拟筛选,初步筛选出具有较强AChE和PARP-1双靶点抑制作用的10个化合物,发现吡咯并咔唑母核结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有较重要作用,并对目标化合物进行进一步的分子对接和分子动态模拟,优选出化合物CID71605390和CID57390505,为寻找用于治疗阿尔茨海默病的新型AChE和PARP-1双靶点抑制剂提供了新的思路。
[硕士论文] 余静
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在基因治疗的过程中,病毒载体和非病毒载体作为两大转载工具被广泛运用。但是由于病毒载体具有较高的细胞毒性以及其他缺陷,它的使用已经越来越受到实际条件的限制。此时,阳离子脂质体(cationic liposomes,CLs),作为最有发展前景的非病毒载体逐渐被重视。CLs作为一种常用的非病毒载体,可用来输送基因或药物分子进入细胞,是一种具有巨大临床应用潜力的纳米载体。由于其能够反复、多次运用于转染实验,表面不含有抗原反应成分并且可以携带转染的外源性基因的容量大等优势,近年来在医学研究方向得到了快速的发展。但是,也有部分研究人员从另一方面指出,尽管CLs已经具备了多种优势,但是仍然无法避免细胞毒性现象的出现。尽管多年来研究人员致力于优化CLs的制备方法以及结构改良,但是都无法避免的存在一定的细胞毒性问题。由于脂质体粒径较小,进入生物体后,靶向聚集于肝脏等体内器官,引起炎症等不良反应以及毒副作用,更可惜的是,尽管CLs的毒性现象很早就被察觉,到目前为止,很多文献也仅报道了CLs出现细胞毒性的现象以及部分作用机制,对于CLs产生毒性的深层次研究并没有十分透彻。因此,想要在纳米毒理学方面获得全部的、准确的生物信息是目前研究面临的最大挑战,这也在一定程度上阻碍了CLs的临床应用。
  有研究指出,CLs具有较高的细胞膜活性,在进入机体穿过生物膜后,会影响细胞膜和细胞器膜的完整性和功能,引起毒性反应。本文通过整合多种系统生物学方法,构建CLs造成细胞毒性的蛋白-代谢层面分子网络机制图,用以阐述CLs细胞毒性的潜在机制。用于研究CLs毒性机制的细胞模型较多,但鉴于人体内摄入和产生的绝大多数化合物的代谢和清除主要经过肝脏,而肝脏也因此被公认是药物和纳米颗粒进行代谢的主要场所;同时,100-200nm范围内的纳米颗粒主要优先沉积于肝脏,肝细胞株作为机体致癌性和肝毒性有关研究的主要模型广泛应用于各类细胞毒性试验,也是大多数纳米载体作用的靶细胞。因此,本实验也选用人正常肝细胞L02作为靶向分析的对象进行后续研究。薄膜分散法因为操作简便、对仪器精密度要求不高而且操作方便等优势被广泛运用于制备过程中。本课题采用薄膜分散法制备出了一批物理特征明显、性质稳定的CLs,通过CCK-8实验计算得到这批CLs的半数致死量(IC50值),并以1/2IC50值作为后期实验组给药剂量。再利用多组学技术平台对L02细胞内物质进行全面分析和检测。
  通过对特定研究对象内全部的蛋白质的表达水平以及翻译过程进行探索和研究的方法就叫做蛋白质组学(Proteomics)。某一细胞或者组织内全部的蛋白、特定时间或条件生物体内全部的蛋白都可以作为蛋白质组学的研究对象,并可采取不同特性的技术平台对其进行定性、定量或者功能性分析研究。其中,同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ),是最近几年来建立起来的一种具有较多优势的蛋白质组学定性、定量检测技术。iTRAQ方法对于实验样品的选择性较低,无论是复杂样品、单一体液还是特殊成分的蛋白质鉴定分析都具有一定的精确性和准确性。代谢组学所研究的对象主要是某一特定时间下生物体内全部的、分子量小于1000的代谢物,通过对基因、蛋白下游的这些代谢物进行分析,不仅能够直观展示出生物体内发生的改变,也可用于探索外界刺激或药物对于机体的相互作用以及作用机制。其中,液质联用技术对测试样品的适应性非常好,而且还具备较高的精确性和灵敏度,因此被广泛应用于代谢组学研究中。通过对实验数据的深入挖掘,一共筛选出65个差异代谢物和368个差异蛋白质。再借助各类组学数据分析软件对寻找到的差异代谢物和差异蛋白质进行了整合分析,构建出CLs导致细胞毒性的蛋白-代谢整体网络机制图。
  随后,本实验利用了蛋白免疫印迹方法对前期聚焦寻找到的核心差异蛋白进行分析验证。根据免疫印迹试验数据结果,发现这些差异蛋白的含量变化趋势与iTRAQ数据完全一致。总而言之,本实验采用的基于iTRAQ技术的蛋白质组学方法用于分析CLs纳米粒细胞毒性机制具有准确性和适用性。本研究表明,单一的组学分析方法只能给出部分层面的信息,将多种组学技术结合进行研究是必需而可行的。因此本文选用的多组学技术整合策略方法能够进一步全面的探索CLs导致细胞毒性的潜在机制。
[博士论文] 蔡瞻
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:真菌耐药的情况日益严重,尤其是念珠菌属,对各类抗真菌药物均出现不同程度的耐药性,如唑类药物、多烯类药物和棘白菌素类药物。而且其耐药机制错综复杂。侵袭性真菌感染在全球的发病率急剧上升,日益严重的真菌耐药性被公认为导致免疫缺陷病人侵袭性真菌感染的发病率和死亡率逐年升高的主要原因之一。其严重威胁到广大人民群众的健康安全,为建设健康中国,如何解决真菌耐药问题,研究出新型抗耐药真菌药物成为当务之急,同时有必要深入探索机会性真菌的耐药机制,为开发抗真菌新药提供新的靶点。
  小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物已被发现可以作为抗耐药白念珠的增效剂。国内外也有报道钙调磷酸酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂和热休克蛋白90抑制剂等也可协同唑类药物抗耐药真菌。虽然已有大量不同种类的化合物已被发现和报道具有协同抗真菌药物抗耐药真菌的活性,然而目前为止鲜有药物作为抗耐药真菌的增效剂上市,甚至于进入临床研究的都是寥寥无几。大量目前已报到的增效剂具有协同抗耐药真菌的活性MIC值一般在1.0μg/ml,而小于0.1μg/ml的增效剂是不常见的。增效剂活性不够好,可能为其原因一。至今为止,如小檗碱、连翘酯苷A和黄芩素等天然产物没有形成其作用机制清晰的结论,更没有发现关键的生物大分子,可能为其原因二
  在之前的研究中发现小檗碱具有协同FLC抗耐药真菌的作用,并对其进行改造获得几类结构更为简化,活性与小檗碱相当或略优于小檗碱的化合物。在这个研究基础上,挑选出本课题组已发现的活性最优的两个小分子作为先导化合物1-1和先导化合物1-2。并对其进行全面的结构改造,分别对其左侧的胡椒基,中间的酰胺键,右侧的芳环和柔链进行结构优化。通过体外活性筛选实验,采用微量稀释法和棋盘式微量稀释法获得化合物的活性数据。数据结果显示,具有协同抗耐药白念珠菌活性的的化合物有99个。与8.0μg/ml氟康唑合用时,MIC80小于0.1μg/ml的化合物有10个分别为化合物F2,F6,F8,F13,F14,F21,G8,G9,G10和G15,其中化合物F2、F6和F8采用棋盘式微量稀释法进一步证实其活性数据的可靠性。这类化合物的构效关系表明,其中先导化合物1-1中的胡椒基是其发挥生物活性的重要部分,酰胺键也是必不可少的部分,将酰胺键转变为逆酰胺键可以略微提高其生物活性,将苯环替换成对位联苯结构可以进一步提高其生物活性,将联苯结构中的一个苯环替换成噻吩环,可以保持与联苯类化合物相当的活性,另外当柔链长度为5-6个碳为最佳。
  由此,选择活性最优的化合物F6(CZ-66)对其进行抗耐药白念珠菌机制研究,对耐药菌103的ROS实验中,FLC、F5(CZ-65)单用不能引起ROS升高,F5(CZ-65)与FLC联用ROS升高约3倍,F6(CZ-66)单用ROS升高约10倍,F6(CZ-66)与FLC联用ROS升高约26倍。结果表明化合物F6(CZ-66)单用和联用FLC都能显著提高ROS水平,然而结构与其相似的化合物F5(CZ-65)单用时并未能提高ROS水平。对耐药菌103的罗丹明外排实验中,加入葡萄糖(2mM)后,罗丹明6G外排增强,且随着时间延长而增长。各用药组罗丹明6G外排与对照组无明显差异,说明化合物F5(CZ-65)、F6(CZ-66)、FLC及联用药对耐药菌103荧光蛋白外排无影响。CT-LINK反向分子对接找靶,通过PDB数据库检索,经分析CT-LINK中获取的可能靶点,只有Mitogen-activated protein kinase,NADH-ubiquinone oxidoreductase chain1和Mothers against decapentaplegic homolog3在真菌中是有报道存在的。结合已报道的相关参考文献,本文推测F6(CZ-66)可能作用于ROS-MAPK通路。另外本课题挑选了靶点相对明确的HSP90抑制剂BIIB021作为先导化合物2-1。对其嘌呤环上的2位、6位和9位分别进行结构改造,当保留先导化合物9位取代基,在2位和6位上进行简单改造,2位和6位分别以氯或者氨基做为取代基时,对化合物的活性影响并不大。如化合物H1-H3的MIC80均为4.0-8.0μg/ml之间。当9位的芳香环替换为脂肪环时,活性略有提升,其中以六元脂肪环为最优。当2位上引入芳环后,活性消失。因此,2位保留氟或氨基这类小原子团结构是保留化合物活性所必要的。化合物H12和H19是由先导化合物2-1改造获得的活性最优的两个化合物,虽然它们的活性并未超越由先导化合物1-1和1-2改造获得的化合物F6,但其活性与小檗碱相当,FICI优于小檗碱。作为一类靶点比较明确的分子,值得进一步结构改造和优化。
[硕士论文] 夏清明
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:前列腺癌是目前西方发达国家中男性肿瘤发病率和死亡率最常见的肿瘤之一。近年来我国前列腺癌发病率也在逐年攀升。雄激素剥夺治疗一直以来是前列腺癌最经典的治疗方式,但随着治疗的前行,前列癌晚期几乎都会发展为雄激素非依赖性,传统的治疗方式对雄激素非依赖性前列腺癌疗效不佳。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤的一种新型治疗手段,在肿瘤临床治疗上已取得了较好的疗效。本课题选用含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)免疫激活剂,通过穿膜肽修饰的多壁碳纳米管为介导,研究其抗雄激素非依赖性前列腺癌的体内外作用。
  本课题第一部分报道了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体的构建和表征。通过多肽固相合成法合成含有3个组氨酸和6个精氨酸的多肽H3R6,利用制备液相进行纯化以及高效液相色谱和质谱进行纯度分析,检测其纯度符合实验要求。用浓硫酸和浓硝酸对多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)进行羧基化,然后再和多肽反应形成载体MHR。利用核磁共振氢谱,红外光谱、透射电镜和热比重分析鉴定复合物合成成功。利用MHR载体中精氨酸富含正电荷,CpG是核酸类物质带负电荷,通过静电作用形MHR/CpG纳米复合物。在N/P=6时,MHR载体能够有效负载CpG免疫激活剂,当N/P=20时电位处于一个较稳定的状态,电位约=25±2.62mV。通过HEK293转染实验,得出MHR载体在N/P=20转染效率较高。
  本课题第二部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂进行体外细胞学评价,RAW264.7细胞明显对负载CpG纳米免疫制有较高的摄取,CpG能够和胞内内吞体膜上的TLR9受体结合。CCK8细胞毒性实验中,MHR载体对DU145、RM-1和RAW264.7细胞的毒性较低。体外免疫活性ELISA和PCR实验结果显示,MHR/CpG对RAW264.7细胞刺激促进IL-6和TNF-α促炎因子的分泌明显高于单体CpG组,和LPS(10ng/ml)刺激效应具有可比性。
  本课题第三部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂体内的抗前列腺癌效应和免疫活性。我们成功构建了DU145前列腺癌BALB/c裸鼠和RM-1前列腺癌BALB/c小鼠模型,通过小动物活体成像系统观察结果显示,MHR/CpG可以有效的在肿瘤和肿瘤引流淋巴结部位蓄积,有靶向效果。体内药效结果表明MHR/CpG对前列腺癌的增殖有较强的抑制作用,从小鼠脾脏淋巴细胞流式分析看出MHR/CpG可以在体内有效刺激CD4和CD8T细胞的分化增殖。同时从小鼠的肾脏和肺肺脏的HE染色图看出,MHR/CpG的体内用药安全性较高。
  本课题成功构建了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体,为去势抵抗性前列腺癌治疗提供了新策略,同时也为其它肿瘤的治疗提供了好的参考和借鉴。
[硕士论文] 王卫平
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  临床上mTOR抑制剂应用于多种肿瘤的治疗,以依维莫司在转移性肾癌治疗中的应用较为广泛。但实际应用中疗效个体差异较大,耐药现象较为常见,大大限制了其疗效。在mTOR抑制剂耐药机制中,肿瘤的遗传学改变与之关系密切。现有相关研究多局限于从有限差异疗效病例中寻找耐药相关基因靶点,尚缺乏从全基因组水平评估基因的功能改变与mTOR抑制剂药敏之间相关性。而CRISPR/Cas9技术的发展应用为研究基因功能提供了巨大的便捷。将采用CRISPR/Cas9文库筛选的方法,从全基因组水平筛选mTOR抑制剂耐药相关靶点,并进行靶点功能验证及临床相关性分析,以期为逆转mTOR抑制剂耐药提供新的理论和依据。
  方法:
  1、通过质粒文库扩增、病毒文库制备、筛选条件摸索、耐药筛选等过程建立肾癌依维莫司耐药靶点CRISPR/Cas9筛选模型,并进行高通量测序。
  2、利用MAGeCK等一系列生物信息学方法,进行测序数据的质控和分析,结合体外耐药细胞株转录组测序分析,筛选若干潜在耐药靶点;
  3、利用CRISPR敲除、质粒转染方法,结合药敏实验、平板克隆和凋亡实验等,对靶点进行进一步的功能验证;
  4、利用实时定量PCR的方法,在接受依维莫司治疗的肾癌组织标本中验证耐药靶点表达水平与临床疗效的相关性;
  5、利用组织芯片的方法,结合临床数据库数据,分析新型靶点在评价肾癌预后中的临床价值。
  结果:
  通过CRISPR/Cas9耐药基因筛选、生信分析、临床疗效相关性分析以及药敏功能验证,发现,靶向敲除MAGIX后能够介导肾癌依维莫司耐药,而过表达则能逆转该过程。较正常肾癌细胞肾,在同样浓度依维莫司作用下,靶向敲除MAGIX后,细胞克隆形成能力明显增强,而凋亡细胞比例明显减少。同时,组织芯片分析和TCGA数据库分析发现,在肾癌患者整体人群中,MAGIX表达水平越低提示患者预后越差。
  结论:
  MAGIX的差异表达水平与肾癌依维莫司治疗药物反应性相关,可作为指导肾癌依维莫司个体化治疗的生物标记物。在临床病理标本中发现,MAGIX在依维莫司耐药组中表达水平低于敏感组。此外,MAGIX的低表达提示肾癌患者预后差,具有预测肾癌预后的潜在临床价值,相关作用机制尚需进一步探讨明确。
[硕士论文] 胡杰伟
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  中国已逐步进入老年社会,骨质疏松症是老年人尤其是中老年妇女的常见病,尽管降钙素是临床上用来治疗骨质疏松症的有效药物,但其也存在着诸如成本高、半衰期较短、免疫原性高等问题。因此,发掘更高效的降钙素具有重要临床意义。
  目的:
  通过对多种新型海洋来源的降钙素基因序列进行序列对比、进化树分析、活性检测,发现高效新型降钙素,为临床应用奠定基础;建立高通量挖掘验证活性多肽的技术平台,为发现新功能多肽提供技术储备。
  方法:
  1、利用鲑鱼降钙素序列进行BLAST获得其他物种的降钙素序列,由两部分组成:NCBI非冗余蛋白库和华大基因水生生物基因组数据库。
  2、通过clustal omega软件进行序列比对,结合物种选取具有代表性的序列使用MEGA7软件构建进化树。
  3、根据进化树结果,结合物种分类选择包括鲑鱼降钙素在内的13条序列进行化学合成。
  4、按照中国药典标准降钙素活性检定方法,对化学合成的13条降钙素在SD大鼠模型上进行活性验证。
  5、对包括鲑鱼降钙素在内的13条序列进行CD谱分析,使用ProtParam工具对各降钙素序列的各种理化性质进行计算,如等电点、GRAVY值、预计半衰期等;使用HeliQuest分析各降钙素序列的氨基酸组成比例、疏水性等。应用Swiss-Model、Swiss-PdbViewer、PEP-FOLD等软件对各降钙素序列的空间结构进行评估、预测。
  6、根据降钙素活性结果和序列、空间特点,总结活性规律。并在此基础上计算机辅助设计优化新的降钙素序列。
  7、设计降钙素序列的化学合成。
  8、按照中国药典标准降钙素活性检定方法,对化学合成的6条降钙素在SD大鼠模型上进行活性验证。
  9、用ELISA法初步分析设计降钙素序列的半衰期。
  10、用ELISA法初步分析设计降钙素序列的免疫原性。
  结果:
  1、利用鲑鱼降钙素序列进行BLAST获得其他物种的降钙素序列,分析各物种降钙素序列,共得到来自软骨鱼纲,辐鳍鱼纲,两栖纲,蜥形纲(鸟纲),合弓纲(哺乳纲)64种降钙素。
  2、通过序列比对和聚类,选取26种(条)具有代表性的降钙素序列构建进化树。
  3、根据进化树结果,结合物种分类选择包括鲑鱼降钙素和人降钙素在内的13条序列进行化学合成。
  4、对化学合成的13条降钙素在SD大鼠上进行活性验证,其中4种降钙素活性比鲑鱼降钙素活性高30%,3种与鲑鱼降钙素相当,4种比鲑鱼降钙素低。
  5、CD谱分析表明这11条天然降钙素二级结构与鲑鱼降钙素相似。
  6、软件分析表明活性较高的降钙素序列通常具有较高的亲水性。提示可能与降钙素整体“柔性”有关。
  7、序列对比分析发现16位或22位的苯丙氨酸/异亮氨酸的出现会显著影响降钙素序列活性。提示可能影响α螺旋的稳定与C端的折叠。
  8、结合前述这些结果,计算机辅助优化设计了6条降钙素序列。
  9、对这6条新设计的降钙素序列(CT-01~06)在SD大鼠上进行活性验证,其中2种活性比鲑鱼降钙素活性高50%,1种比鲑鱼降钙素高30%,3种比鲑鱼降钙素低。
  10、用ELISA法初步分析了CT-01、CT-04、CT-06这3条序列在SD大鼠体内的半衰期,发现与鲑鱼降钙素相当。
  11、用ELISA法初步分析了CT-01、CT-04、CT-06这3条序列在C57小鼠动物模型上的免疫原性,发现比鲑鱼降钙素低。
  结论:
  1、通过对天然海洋生物降钙素的活性检测,发现了Mdo、Oan、Gga、Cau4种序列活性比鲑鱼降钙素活性高30%,Tni、Pbi、Loc3种序列与鲑鱼降钙素相当,Cmi、Spa、Bpe、Hip4种序列比鲑鱼降钙素低。
  2、通过总结降钙素活性规律,最终优化设计得到3条活性较高、半衰期长、免疫原性低的降钙素序列。
  3、课题组通过对降钙素的研究,初步建立了高通量挖掘验证活性多肽的技术平台。
[硕士论文] 谢芳
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(sepsis)是指严重感染导致的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),宿主针对感染的特异性免疫反应失调,进而可导致脓毒性休克、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),乃至引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),是ICU患者的主要死亡原因,其发病率仍然很高。脓毒症急性呼吸窘迫综合征的病理生理学机制非常复杂,包括炎症激活、炎细胞浸润、凝血系统激活和肺上皮屏障损伤等,其中肺上皮是急性呼吸窘迫综合征时肺部防御损伤的一种重要结构。在ARDS的致病过程中,各种炎症因子、粘附分子、趋化因子和细胞因子等不断释放参与肺部炎症反应,如肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8、IL-1家族和干扰素。肺上皮细胞能够分泌多种细胞因子调控肺的天然免疫,目前却没有关于肺上皮细胞表达能够调控肺部天然免疫的分泌蛋白。因此,对于肺上皮细胞在脓毒症急性呼吸窘迫综合征的基因表达及相关分泌蛋白的机制探讨值得研究,肺上皮细胞表达的分泌蛋白有望成为临床上治疗脓毒症的新的分子靶点。
  sectm1b基因是一种新型人类编码基因,其基因表达的蛋白为sectm1b,即跨膜与分泌蛋白1b,属于免疫球蛋白超家族。目前sectm1b基因表达调控机制以及效应并不清楚,关于sectm1b的研究也非常少。有研究认为:sectm1b可以抑制TCR介导的T细胞活化从而发挥促炎的功能。炎症反应的失衡是脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征的主要原因。右美托咪定作为ICU临床常用的镇静药物,最近几年,因为发现其具有抗炎的作用而逐渐被大家所关注,但目前没有关于右美托咪定对脓毒症ARDS时sectm1b表达的影响及抗炎作用的研究。另外,肺上皮细胞分泌的sectm1b能够促进中性粒细胞表达和释放促炎症因子,对中性粒细胞募集到肺部感染部位具有调控作用。但是,sectm1b对脓毒症ARDS时肺上皮细胞功能的作用及其可能的机制,目前尚未见报道。
  本研究拟通过在体与离体实验,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS的影响及作用机制。首先,对脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证;其次,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制;最后,探讨右美托咪定对脓毒症ARDS小鼠抗炎作用及其机制的研究,同时探讨了右美托咪定在脓毒症ARDS发挥抗炎保护作用时对肺上皮细胞sectm1b表达的影响。
  第一部分 脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证
  目的:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的基因芯片筛选与分析,在体实验和离体实验验证脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b。
  方法:
  1.取雄性C57小鼠,构建CLP所致脓毒症ARDS小鼠模型,分离CLP术后0h、6h、12h、24h的左肺组织,利用基因表达谱芯片检测CLP术后不同时间及正常对照小鼠肺上皮细胞基因表达差异。利用基因表达热图分析、genecard软件分析及查阅文献重点分析细胞因子与趋化因子等分泌性蛋白的表达。
  2.取约8周龄雄性C57小鼠,随机分为四组,分别为:CLP术后0h、CLP术后6h、CLP术后12h、CLP术后24h。
  a.取每组小鼠肺组织,左肺组织行HE染色,并进行病理学评分;右肺组织提取mRNA,采取RT-PCR技术检测sectm1b mRNA的表达情况。
  b.取每组小鼠支气管肺泡灌洗液,采用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及流式细胞术进行中性粒细胞计数。
  c.于每组小鼠行眼球取血,离心后取血清,采用ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达情况。
  3.用LPS刺激小鼠肺上皮细胞MLE12,于LPS诱导后0h、6h、12h、24h提取mRNA,利用RT-PCR检测肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达,同时收集上清,采用ELISA检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
  结果:
  1.脓毒症ARDS小鼠肺组织中基因表达差异显著,其中sectm1b在CLP术后12h表达显著增高,24h表达下降。
  2.
  a.HE染色结果显示:CLP术后小鼠肺组织病理损伤明显加重,且术后12h损伤程度强于24h,病理学评分增高(P<0.05)。sectm1b mRNA表达差异显著(12小时大于正常约30倍)(P<0.05)。
  b.ELISA结果显示:与正常对照比较,肺泡灌洗液和血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05)。CLP术后中性粒细胞计数明显增多(P<0.05)。
  3.与正常相比,脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞sectm1b表达增高(P<0.05),上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。
  结论:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b,脓毒症ARDS小鼠在体实验模型与离体实验模型建立成功,为后续的在体和离体实验提供了可靠的实验基础。
  第二部分 肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制探讨
  目的:
  研究sectm1b对LPS诱导的肺上皮细胞在脓毒症ARDS炎症反应中的作用及其机制探讨。
  方法:
  采用siRNA转染技术沉默sectm1b基因的表达,研究在LPS诱导的肺上皮细胞MLE12在沉默sectm1b时对脓毒症ARDS炎症反应的作用及其机制。实验分为:NCsiRNA组和sectm1b siRNA组,转染48小时后,分别用LPS刺激,提取LPS刺激后不同时间点的细胞总mRNA、蛋白、上清。用RT-PCR技术检测sectm1b、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表达,用ELISA技术检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平,利用western-blot方法检测炎症相关信号通路(NF-κβ/MAPK)相关分子的表达。
  结果:
  1.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,RT-PCR显示sectm1b siRNA组sectm1b的mRNA表达水平明显低于NC-siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  2.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导6h、12h、24h后,sectm1b siRNA组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平较NC siRNA组降低(P<0.05),同时ELISA结果显示sectm1b siRNA组上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平较NCsiRNA组降低(P<0.05)。
  3.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,与NC siRNA组相比,sectm1bsiRNA组的p65/p38/erk磷酸化表达水平下降(P<0.05)。
  结论:
  肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS具有促炎作用,其促炎作用可能与NF-κβ/MAPK信号通路的激活有关,表明sectm1b在脓毒症肺上皮细胞的损伤具有重要作用。
  第三部分 右美托咪定对脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b表达的影响及保护作用研究
  目的:
  探讨右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)在脓毒症小鼠肺上皮细胞炎症反应中的作用及其对sectm1b表达的影响。
  方法:
  将C57小鼠随机分为3组:CLP组、CLP+Dex组、Sham组。给药组在小鼠CLP术前15min腹腔注射右美托咪定(50ug/Kg),CLP组小鼠在术前15min腹腔注射等体积的无菌生理盐水。收集每组CLP术后0h,6h,12h,24h的血清和肺泡灌洗液(BALF),用酶联免疫吸附试验检测血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,记录24h内小鼠的存活率。体外培养传代小鼠肺上皮细胞MLE12,分为空白对照组(未进行任何处理)、脂多糖组(LPS,1ug/ml)、脂多糖+右美托咪定组(LPS,1ug/ml+Dex,0.2ug/ml),RT-PCR检测总细胞中sectm1b mRNA的表达,酶联免疫吸附实验检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,蛋白质印迹实验检测ERK1/2和JNK磷酸化水平。
  结果:
  1.与CLP组相比,右美托咪定组脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达下降,小鼠24h内的存活率上升(P<0.05)。
  2.与脂多糖组相比,右美托咪定组上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达减少,并且ERK1/2和JNK的磷酸化水平下降(P<0.05)。
  3.与脂多糖组相比,右美托咪定组肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达下降(P<0.05)。
  结论:
  右美托咪定能够影响脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b的表达,同时能够减少脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子的产生,提高脓毒症小鼠24h内的存活率,对小鼠肺上皮细胞炎症反应发挥保护作用,且右美托咪定的这种作用可能与抑制ERK1/2和JNK的激活有关。
[硕士论文] 蔡文昌
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的和背景:随着肝脏外科手术技术的提高,器械设备和医用材料的发展,肝脏外科在各种肝脏良恶性疾病的治疗中发挥着越来越重要的作用。而且可进行手术范围更广、难度更大、危险度更高的肝脏外科手术。但是成功而又安全地完成这些手术后也需要更为理想的药物保证术后的顺利恢复。N-α-三甘氨酰-8-赖氨酸-加压素(Terlipressin,特利加压素,后简称为加压素)作为一种人工合成的血管加压素类似物,能选择性的收缩胃肠道的毛细血管床,从而显著的降低门静脉的压力,对肝硬化门静脉高压的一些常见并发症有良好的疗效。近期发现加压素能使肝大部切除术后肝功能得到明显改善,降低小肝综合征甚至肝功能衰竭的发生概率。更有研究证明加压素可以通过降低肝切除术后的高门静脉压力,从而促进残肝的再生。本研究旨在进一步探讨加压素对肝大部切除术后肝细胞再生的促进作用及其机制。
  研究方法:收集2016年11月至12月和2017年5月至12月在上海东方肝胆外科医院特需治疗一科/肝移植科行肝部分切除术的患者42例,其中术后静脉应用加压素21例,作为用药组;未应用加压素21例,为对照组,进行回顾性队列研究。监测其术后第一天和第三天的肝功能的结果进行对比。模拟人体肝大部切除建立小鼠肝大部切除模型,选取术后(24小时、48小时、72小时和96小时)4个时间点将应用加压素的实验组和安慰剂组的小鼠肝脏再生指标进行比较。然后对小鼠肝脏标本进行基因表达谱芯片的检测,探索加压素促进残肝细胞再生的可能机制。采用人正常肝细胞株(normal liver cells,HL7702)进行体外分组实验。以添加了加压素的培养基培养的细胞作为实验组细胞,普通培养基培养的细胞作为对照组细胞。利用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK8)对两组细胞的相对增殖活性进行比较。利用流式细胞仪(Flow cytometry instrument,FCM)进行两组细胞细胞周期的检测和比较。最后采用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)对基因芯片筛选出的可能的机制进行验证。
  研究结果:临床结果显示肝大部切除术后第一天用药组和对照组丙氨酸氨基转移酶(Alamine aminotransferase,ALT)分别为:188.71±136.22和444.43±290.40U/L,(P=0.004);天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)分别为:377.76±147.56和648.67±421.07U/L,(P=0.009);凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)分别为:13.41±1.47和14.76±1.54S,(P=0.028);总胆红素(Total bilirubin,TB)分别为:22.79±11.44和37.35±19.14μmol/L,(P=0.008)。上述指标两组间均具有显著差异。术后第三天两组的ALT分别为:166.24±96.91和273.62±133.89U/L,(P=0.025);TB分别为:33.92±18.71和45.19±24.61μmol/L,(P=0.008);白蛋白(Albumin,ALB)分别为:40.10±3.40和37.12±2.55g/L,(P=0.002);前白蛋白(Prealbumin,PA)分别为:88.57±27.71和57.00±20.56mg/L,(P=0.000);PT分别为:13.67±0.98和15.35±1.87S,(P=0.003)。上述指标两组间均具有显著差异。小鼠肝大部切除模型显示:实验组小鼠肝体重比显著高于安慰剂组。其中术后24小时,实验组和安慰剂组分别为:0.02533±0.000577和0.01667±0.002082,(P=0.002);术后48小时两组分别为:0.02881±0.004116和0.02174±0.000659,(P=0.043)。实验组的残肝细胞核分裂像显著多于安慰剂组,分别为:31.33±2.082和20.67±1.528,(P=0.002)。术后24小时和48小时实验组残肝组织免疫组化Ki67染色阳性率也显著高于安慰剂组。术后24小时两组分别为:30.1%±0.42和8.57%±1.06,(P=0.001);术后48小时两组分别为:42.14%±4.92和9.42%±1.11,(P=0.012)。术后24小时和术后48小时实验组血清HGF显著高于安慰剂组,术后24小时两组分别为:3663.35±200.86和1936.77±394.22pg/ml(P=0.002);术后48小时两组分别为:532.80±65.38和274.68±19.46pg/ml(P=0.003)。残肝组织的基因表达谱芯片结果显示用药组相较于安慰剂组高表达的基因主要与细胞周期相关。细胞实验显示加压素处理的实验组第96小时的CCK8检测值显著高于对照组,两组的倍增数分别为:6.28±0.18和5.46±0.01,(P=0.009)。FCM细胞周期检测结果实验组处于S期的细胞比例明显高于对照组,分别为:25.19%和17.55%。RT-PCR结果也证实了加压素分别处理24小时和48小时后实验组细胞Cyclin B1基因和CDC20基因的表达明显高于对照组。术后24小时和48小时Cyclin B1基因两组表达结果分别为:2.82±0.08和1.00±0.04,(P=0.001),以及3.11±0.06和1.00±0.03,(P=0.000);术后24小时和48小时CDC20基因两组表达结果分别为:3.27±0.07和1.00±0.03,(P=0.001),以及3.89±0.03和1.00±0.05,(P=0.000)。
  研究结论:加压素可以加速患者肝大部切除术后残肝功能的恢复,可以促进肝大部切除术后小鼠残肝的再生,也可以促进HL7702细胞株细胞的增殖;其促进残肝再生和肝细胞增殖可能的作用机制是通过上调Cyclin B1基因和CDC20基因的表达实现的。
[博士论文] 史文涛
流行病与卫生统计学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  自发呈报系统数据库是药品不良反应监测的重要依据,是实现有效药物警戒的基石,随着时间的推移、数据的积累以及国家对药品安全性问题的重视,上报至国家药品不良反应监测中心的不良反应报告日益增多,至2017年底中国自发呈报系统收集到的报告已超过1100万份。由于《药品不良反应报告和监测管理办法》要求药品生产企业、经营企业和医疗机构发现药品不良反应均应进行上报,以及录入跟踪报告时与之前的首次报告未进行关联等原因,故难以避免重复报告的问题。且近期国家食品药品监督管理总局颁布《关于药品上市许可持有人直接报告不良反应事宜的公告》,要求药品上市许可持有人必须报告药品不良反应,又会带来新的重复报告问题。重复报告的存在会引起假阳性或假阴性不良反应信号,从而影响药品不良反应信号检测的准确性。如何利用统计学方法从海量的不良反应数据中有效地识别并去除其中的重复报告,从而为之后的不良反应信号检测提供可靠的数据,是当前亟待解决的问题。
  研究目的:
  本研究以中国药品不良反应自发呈报系统数据库为依托,主要探索两部分内容。首先对中国不良反应数据库重复报告现状进行初步分析,构建适用于中国数据库结构的变量匹配模型、概率匹配模型和编辑距离法模型,经过比较筛选出去除重复报告的最优模型。其次使用最优模型识别并剔除中国不良反应数据库中的重复报告,重新检测不良反应信号,探索重复报告对信号检测的影响程度,为下一步药品不良反应信号检测提供高质量数据。
  研究方法:
  方法学研究:首先,按照报告日期随机抽取一个月的数据,使用变量匹配法找出疑似重复报告,然后通过双人分开对比报告中的其他变量,找出其中的重复报告,获得重复报告金标准数据库,为模型评判做准备;其次,以重复报告金标准数据库为依托,将三种方法运用到该数据中,从姓名、性别、出生日期、药品名称、不良反应、不良反应发生日期六个变量中,选择不同变量组合,组成四种情境(情境1:姓名、性别、出生日期、药品名称、不良反应、不良反应发生日期;情境2:姓名、出生日期、药品名称、不良反应、不良反应发生日期;情境3:姓名、性别、药品名称、不良反应、不良反应发生日期;情境4:姓名、药品名称、不良反应、不良反应发生日期),以查全率与查准率组成的综合指标F1-Measure为评判指标,构建最优的变量匹配模型、概率匹配模型和编辑距离模型。为了提高运行效率,概率匹配模型和编辑距离模型使用多次查找技术。
  实例应用:将三种模型应用到2014年国家药品不良反应数据中,识别其中的重复报告,将重复报告剔除后重新进行信号检测,并与未去除重复的信号检测结果进行比较,分析重复报告去除前后的新增信号和消失信号,将新增和消失信号与已知的不良反应数据库进行比对,对结果进行解释。
  研究结果:
  1.方法学研究:
  (1)重复报告金标准数据库
  本研究从2014年数据库中,按照报告日期,抽取3月份86882份报告,使用纳入不同变量的变量匹配法(出生日期、药品名称、不良反应、ADR日期;姓名、性别、出生日期、ADR日期;姓名、药品名称、不良反应),找到疑似重复报告1280组。经过双人分开对比民族、体重、电话、疾病史、病历号、报告人、就医单位等其他变量,确定重复报告359组。
  (2)模型结果
  经过4种情境的比较,变量匹配模型在情境4,纳入姓名、药品名称、不良反应、不良反应发生日期四个变量时,F1-Measure最高,为58.82%,查全率和查准率分别为57.10%和60.65%。概率匹配模型在情境2,纳入姓名、出生日期、药品名称、不良反应、不良反应发生日期五个变量,且阂值为38.5时,F1-Measure最高,为74.93%,查全率和查准率分别为71.59%和78.59%。而编辑距离模型在情境4,纳入姓名、药品名称、不良反应、不良反应发生日期四个变量,且阈值为3.85时,F1-Measure最高,为75.96%,查全率和查准率分别为74.37%和77.62%。变量匹配模型、概率匹配模型和编辑距离模型分别检测出205、257和267组真阳性重复组合。
  2.实例应用
  本研究基于国家药品不良反应自发呈报系统2014年1322641份数据,采用变量匹配模型、概率匹配模型和编辑距离模型分别筛选重复报告。变量匹配模型共发现4191组重复报告,重复报告发生率为0.35%,但对于姓名缺失的报告,其真实性令人怀疑。概率匹配模型共发现5230组重复报告,发生率为0.36%。但对于仅不良反应发生日期不同的高度重复报告中,该模型不能很好的进行识别,比如白细胞减少和骨髓抑制不良反应报告。编辑距离模型发现4309组重复报告中,发生率为0.32%,与变量匹配模型相比,编辑距离模型不仅将完全相同的两条报告筛选出来,同时也将存在微小差异的两条报告筛选出来;与概率匹配模型相比,编辑距离模型精确度更高,更值得信任。
  去除重复报告前ROR、PRR和IC三种方法分别检测出29921、32428和21994个药品不良反应信号,使用变量匹配模型、概率匹配模型和编辑距离模型去除重复报告,ROR方法得到三种模型结果分别为28803、28612、28739,PRR为31248、31086、31201,IC分别为21242、21050和21155,信号数量有一定的减少,但前后变化较小,说明现阶段重复报告对不良反应信号检测影响有限。将去除重复之后得到的信号检测结果与去除重复之前进行比较,发现消失的信号中90%以上都是假阳性信号。
  研究结论:
  综上所述,本研究建议使用变量匹配模型(姓名、药品名称、不良反应及其发生日期)或者编辑距离模型(姓名、药品名称、不良反应及其发生日期,阈值为3.85)去除中国药品不良反应数据库中的重复报告,并且需要进一步通过人工来确定模型筛选出的重复报告。虽然现阶段中国药品不良反应重复报告发生率不足1%,但由于《关于药品上市许可持有人直接报告不良反应事宜的公告》的存在,重复报告的发生率必将上升,因此一定要重视数据库中的重复报告。
[硕士论文] 华夏
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化1。在美国罹患NAFLD的人群已达到人口总数的30%2,国内流行病学的研究表明,NAFLD已成为我国引起肝功能异常以及慢性肝病的第二大元凶3。
  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又称为辅酶Ⅰ,是电子传递链中的ComplexⅠ的重要递氢物。NAD的合成包括从头合成途径(De novo pathway)和补救(Salvage pathway)合成途径两条途径,其中补救合成途径是维持NAD体内水平的主要途径。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是补救合成途径中的合成限速酶,维持体内NAD的水平4。NAD是生成ATP的必须物质,同时ATP还广泛参与机体发育、血管生成、细胞凋亡、组织炎症、神经退行性病变和肿瘤发生等病理生理过程5-7。
  在我们课题组之前关于NAMPT功能方面的研究发现,NAMPT和NAFLD之间存在重要关联。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝脏中,会随着年龄增大而表达量逐渐减低,而且NAMPT表达量的降低是老年鼠NAFLD发病和进展的重要促因8。但NAMPT的相关激活剂能否对NAFLD起到治疗作用,以及其治疗作用的机制都尚不明确。
  由于NAMPT是一个酶,因此我们期望能直接找到可以干预其作用的化合物。我们把目光瞄准了P7C3-A20这一化合物。P7C3-A20的CAS号1235481-90-9,属于氯丙基咔唑类化合物,是latrepirdine(一种神经元保护剂)的同源化合物。前期有报道发现该化合物可作为“潜在的NAMPT激动剂”升高脑内的NAD水平,发挥神经保护作用。我们猜测,P7C3-A20很有可能也能在肝脏内发挥作用,拟分三步对化合物P7C3-A20对NAFLD的治疗作用和机制进行了探讨。
  实验方法:
  1.将实验动物分成四组,每组不少于6只,分别为Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组。Chow组以普通饲料喂养,HFD组以高脂饲料喂养。HFD+A20组在HFD诱导16W后体外腹腔给药,给药量20mg/kg/d。给药2W后,先从体重、代谢率上对小鼠整体代谢水平对NAFLD造模进行评价,然后验证经过P7C3-A20治疗后的小鼠肝脏中是否存在NAD含量水平的改变。
  2.第二步检测P7C3-A20对NAFLD各项病理指标及并发症进程相关指标的影响。首先检测血清中的血脂、肝功酶系等指标各组之间的差异,然后再在肝脏组织中检测氧化应激、炎症因子、肝脏纤维化标志物、细胞凋亡标志物、胰岛素敏感度等指标,检测P7C3-A20对NAFLD病程进展和并发症的治疗作用。另外,我们还检测了另一NAD补充药物nicotinamide riboside(NR)与SIRT1过表达对NAFLD的治疗作用。
  3.第三步探讨P7C3-A20对NAFLD治疗作用的机制进行研究,根据实验结果中发现P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的浓度,推测P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的关系。所以对AMPK/CREB在肝细胞中的表达进行检测,同时检测磷酸化的标志物phospho-CREB和phospho-AMPK。将AMPKα2+/-小鼠进行杂交配种,制备AMPKα2-/-小鼠。将WT小鼠设置为对照组,AMPKα2-/-小鼠设置为实验组。两组小鼠均给予腹腔注射P7C3-A20,3天,20mg/kg/d。取血清检测血清中FGF1和FGF21的变化,取肝脏检测AMPK通路相关标志物的表达情况。
  实验结果:
  1.首先HFD组相较于Chow组,可以明确HFD诱导NAFLD模型成功。然后对NAFLD模型小鼠按照Chow组,Chow+A20组,HFD组和HFD+A20组四组分组进行NAD、NADH以及NAD/NADH的检测,首先验证P7C3-A20给药后确实提升对NAD在肝脏中的表达水平。
  2.HFD组给予P7C3-A20后,相比较于HFD对照组,小鼠减重明显,代谢率也有所提升;血清中肝功酶系指标有所改善;小鼠肝脏的脂质沉积、氧化应激水平、细胞炎症水平以及细胞凋亡水平均有所下降;肝脏的纤维化及纤维成分均有所好转,说明P7C3-A20对NAFLD确实有治疗作用。NR、SIRT1过表达对NAFLD也都有治疗作用,但是NR比SIRT1过表达作用更为明显。
  3.在NAFLD模型小鼠上给予化合物P7C3-A20,可上调血清中两种重要代谢调控因子FGF1和FGF21的表达。同时P7C3-A20给药可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表达。同时,此外,P7C3-A20还明显增加血FGF1和FGF21的浓度。肝脏以及血清中FGF1和FGF21表达明显提高,相对于对照组野生型小鼠,P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上对AMPK/CREB通路的激活作用被极大地抑制,且肝脏FGF1和FGF21的上调被抑制,血清中FGF1和FGF21的上调也被极大地削弱。
  实验结论:
  1.化合物P7C3-A20可有效提高NAFLD中NAD的含量。
  2.化合物P7C3-A20可有效缓解NAFLD的病程和并发症的进程。
  3.P7C3-A20对FGF1和FGF21的调控依赖于AMPK/CREB通路。
[硕士论文] 王昌理
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征是多器官功能障碍综合征在肺部的重要临床表现。急性肺损伤的病因包括脓毒症、烧伤、重症肺炎或者严重创伤等。其病理生理特点是肺泡毛细血管内皮-上皮屏障受损,炎症细胞浸润,失控的炎症反应以及氧化应激损伤等。虽然研究人员对急性肺损伤的早期诊断和治疗策略进行了深入研究,但急性肺损伤的发病率和死亡率一直居高不下,这对公共卫生健康造成极大影响。哇巴因(Ouabain)是一种钠钾ATP酶抑制剂,曾用于治疗充血性心力衰竭。近年来,有较多研究发现哇巴因在器官损伤、免疫反应及肿瘤治疗中发挥重要作用。目前,哇巴因在急性肺损伤中是否具有保护作用还未见报道。本研究的目的是探讨哇巴因是否抑制脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤,并初步探寻其潜在机制。
  研究方法:
  8-12周雄性C57BL/6小鼠(20g-25g)随机分为三组:对照组(Control);肺损伤组(LPS);哇巴因组(LPS+OUB)。对照组和肺损伤组小鼠腹腔注射无菌PBS溶液,连续3天;哇巴因组小鼠腹腔注射哇巴因,连续3天。第3天腹腔注射哇巴因1h后,肺损伤组和哇巴因组小鼠在七氟醚麻醉下,经鼻吸入溶解于无菌PBS的LPS溶液,对照组小鼠吸入等体积PBS溶液。LPS吸入6h和24h后,使用二氧化碳吸入法处死小鼠,收集各组小鼠肺组织和肺泡灌洗液进行肺损伤相关指标检测。
  实验结果:
  1.LPS处理6h和24h后,肺组织H&E染色病理切片显示肺损伤组小鼠肺间质水肿、出血、肺间隔增厚或受损以及显著的炎细胞浸润;哇巴因组小鼠的肺组织H&E染色切片显示肺组织病变程度减轻。肺损伤病理评分也表明哇巴因组病理评分显著低于肺损伤组,这说明哇巴因可降低LPS造成的肺组织损伤。
  2.LPS显著增加小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平;而哇巴因可降低肺泡灌洗液中上述细胞因子的含量。qRT-PCR检测结果表明,LPS可致小鼠肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达升高,哇巴因可抑制上述细胞因子的mRNA水平。
  3.LPS处理后,小鼠肺组织湿/干比升高,哇巴因可改善ALI小鼠的湿/干比;LPS可显著增加小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量,而哇巴因可减少小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量;Evans蓝尾静脉注射1h后,肺损伤组小鼠肺组织Evans蓝含量最高,而哇巴因可显著下调肺组织Evans蓝的含量。
  4.与对照组相比,肺损伤组小鼠肺泡灌洗液总细胞数、中性粒细胞和巨噬细胞比例显著增加,哇巴因可一定程度减少这些细胞浸润。此外,哇巴因也能降低小鼠肺组织MPO活性。
  5.肺损伤组小鼠肺组织NF-κB p65的磷酸化水平显著高于对照组,哇巴因可降低肺组织NF-κB p65的磷酸化水平;哇巴因组小鼠肺组织磷酸化的ERK、JNK和p38表达高于对照组,但低于肺损伤组。
  研究结论:
  哇巴因可改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤严重程度,其机制可能与哇巴因抑制ERK、JNK、p38和NF-κB p65磷酸化水平相关,从而调控TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子分泌并抑制炎性细胞浸润。
[硕士论文] 于金
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:便秘是一组临床常见的复杂症状,表现为排便次数减少、排便困难、粪便干硬。排便次数减少指每周排便少于3次。排便困难包括排出困难、排便费力、排便不尽感、排便费事以及需要手法辅助排便。由于缺乏有效的治疗方法,它给病人带来了巨大的经济负担,极大地影响了患者的生活质量,促使人们寻找新的、有效的方法来治疗便秘。2015年,Ron等人10进行了一项验证振动胶囊安全性和通过其来治疗便秘的潜在功效的研究。该胶囊是利用电磁信号和固定的振动档位(A或B,由医师推荐)预定延迟6-8h使胶囊到达结肠后开始振动。
  结果报告没有发生严重的不良反应,有暂时的轻微的副作用。26例患者中有23例肠蠕动平均数显著增加。但是该振动胶囊只有一种振动模式,且无法在体外对服用的胶囊进行监测和调试。
  目的:
  我们和上海安翰医疗技术有限公司合作,研制出一种经智能手机体外调控的、多档位的创新型振动胶囊系统(Vibrating Capsule,VC),该系统由振动胶囊本身和通常称为适配器的外部配置装置(external configuration device,ECD)组成。VC有各自的半导体芯片,每个芯片都有自己独自的序列号,以利于被ECD识别和控制。我们利用该系统先后对8条比格犬和便秘患者应用来验证其安全性,并探索其可能对排便的影响和便秘的治疗作用。
  方法:
  在第一部分实验中,8条比格犬均先后依次喂服低、中、高3个档位的VC并运用常规方法和设备测其相应的一般生理指标(包括体温、心率、呼吸、体重、行为活动状态,每日摄食量、每日饮水量等)、血液指标(血白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白,血小板计数,丙氨酸氨基转移酶,天冬氨酸氨基转移酶,总胆红素,直接胆红,总蛋白,白蛋白,尿素氮,血肌酐,钾,钠)、粪便指标(排便量、排便次数,排便的布里斯托大便性状评分,粪便常规及粪便潜血检查)等;之后对8条犬喂服超高档位的VC,并行腹部CT及安乐死后解剖取样行病理检查。
  在第二部分试验中,我们设计了一项计划45例功能性便秘患者的双盲、安慰剂对照研究,以评价振动胶囊对于缓解和治疗功能性便秘的有效性及对肠道传输的作用。包括2周不服用胶囊的基础期,6周双盲、安慰剂对照治疗阶段,及最后一次使用胶囊后14天随访阶段(随访至胶囊排出停止)。受试者参与这个试验的总持续时间约10至14周,包括基础期阶段、治疗阶段及试验后随访阶段。
  结果:
  在动物试验中(1)应用VC前后犬的一般生理指标和血液指标并无明显差异(P>0.05)。腹部CT及病理检查均未见明显异常。(2)应用VC后犬的排便次数增加(P<0.05或<0.01),但不同档位之间的VC没有显著差异(P>0.05)。(3)随着胶囊档位的不同,排出VC的时间呈缩短趋势,但统计学没有显著差异(P>0.05)。(4)VC对犬排便的性状未产生明显影响(P>0.05)。(5),能够顺利通过智能手机检测到犬体内的VC信号,并进行参数调试。
  在临床试验中的初步结果显示(1)已完成振动胶囊治疗的患者,无明显与试验器械有关的不良事件发生。(2)胶囊自服用到自发排出时间未发生超过14天的情况。(3)第6周达到≥3SCBM的受试者百分比:假胶囊组为33.3%,而振动胶囊组为60%。(4)临床试验目前仍在进行中。
  结论:
  在动物实验中,VC是安全的,应用VC能使犬的排便次数增加,随着胶囊档位的不同,排出VC的时间的均值呈现缩短趋势;VC对犬排便的性状无明显影响;体外通过智能手机调控VC是可行的。
  在临床试验中,初步认为振动胶囊是安全的,对受试者生活质量具有改善作用。
[硕士论文] 王瑜
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在中国胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在新增的胃癌患者中90%以上为进展期。对于此类患者,外科手术常难以获得根治性效果,因此,临床开展胃癌新辅助化疗,对于提高手术根治率、提高可切除率以及延长患者生存时间具有重要意义。然而,患者对化疗药物存在个体差异,甚至有部分患者化疗形成耐药后,肿瘤会形成报复性生长。是什么导致肿瘤呈现报复性生长?
  众多研究表明,衰老是凋亡、自噬之外细胞对于化疗介导DNA损伤反应的一种重要应答形式。通过新辅助化疗的人体内标本研究发现,胃癌新辅助化疗后很大一部分细胞发生衰老。因此,对化疗介导的DNA损伤诱导衰老这重要临床现象进行深入研究,对于提高临床化疗效果具有重要意义。化疗介导衰老细胞的产生,将对化疗本身产生两方面重要影响。首先,该群细胞本身处于不可逆的G0期,因此对放、化疗的反应性极低而难以被彻底清除,成为耐药与复发的重要来源;其次,该群细胞还维持活跃的生理学特性,其重要要特征是持续不断分泌大量生物生物活性物质,如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及相关生长因子等,即衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)。
  科室前期使用以紫杉醇类药物为基础的联合方案对胃癌患者进行新辅助化疗,化疗无效组胃癌组织IL-6表达水平显著高于有效组,说明由化疗介导的胃癌组织SASP相关因子IL-6与化疗不敏感密切相关。提示:SASP在胃癌新辅助化疗耐药过程中发挥了重要作用。那么SASP和肿瘤的报复性生长是否存在一定的联系?
  如果SASP和肿瘤报复性生长存在联系,那么它是通过什么机制产生的呢?近年来,有研究表明固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)在多种肿瘤中过表达,提示肿瘤细胞的快速增殖和脂类的快速合成具有密切相关性,抑制SREBPs表达可以显著抑制肿瘤细胞生长。SREBPs转录因子家族成员包括SREBP1和SREBP2。前者在非饱和脂肪酸和甘油三酯合成中起主要调节作用,而后者在调节胆固醇内环境稳态中起关键作用,它是调节脂类平衡的主要转录因子。SREBPs调控多种脂类合成相关基因的表达,如在人胶质母细胞瘤中SREBP1上调并促进及其下游靶基因ACC和FASN的表达;此外,在去年2月,Ayano Kondo等在Cell Reports上发表论文指出,细胞外H+通过激活SREBP2上调胆固醇合成相关酶基因如:IDI1、MSMO1、INSIG1的表达,促进胰腺癌进展。因此,推测SASP可能通过激活SREBP2来促进胃癌细胞增殖,从而促进肿瘤进展。
  方法:
  在科室前期研究基础上,提出如下科学假设:新辅助化疗药物紫杉醇能够诱导胃癌细胞发生衰老,衰老胃癌细胞通过分泌SASP激活SREBP2促进未衰老的肿瘤细胞增殖。
  (化疗→细胞衰老→SASP→SREBP2专细胞增殖)
  具体研究分两部分进行:一、现象验证,即SASP促进胃癌细胞增殖;二、机制研究即SASP通过激活SREBP2促进细胞增殖。
  一、现象验证
  体外实验方法利用紫杉醇(paclixel,PTX)处理BGC823细胞构建衰老细胞模型,使用β-半乳糖苷酶染色证实衰老细胞模型的建立;ELISA检测SASP-CM中主要的SASP因子的浓度;CCK8比色法及细胞克隆形成实验检测SASP-CM对BGC823细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。所获得BGC823细胞培养上清,即胃癌衰老细胞相关分泌表型条件培养基(senescence-associated secretory phenotype conditioned medium group,SASP-CM),以不加PTX处理的BGC823细胞培养上清为肿瘤细胞条件培养基组(control condition medium group,CTR-CM组)和正常培养基组(normal medium group,NOR-CM组)为对照,共计3组实验。
  体内实验方法裸鼠皮下成瘤实验分2组,即实验组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL等比例胃癌衰老细胞和正常肿瘤细胞混合悬液(5×107/mL)。对照组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL正常肿瘤细胞悬液(5×107/mL),观察成瘤大小。
  结果PTX35nmol/L诱导BGC823细胞72h可建立稳定的细胞衰老模型,此条件下衰老细胞比例最高(66.95±3.54)%。SASP-CM中主要SASP因子IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ浓度均高于CTR-CM。SASP-CM组细胞的相对克隆形成率高于CTR-CM组(P<0.001)和NOR-CM组(P<0.05)。48、72、96h时SASP-CM组细胞的增殖活性高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.05)。SASP-CM组的S期细胞比例高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.01),细胞凋亡率各组间差异无统计学意义。裸鼠皮下成瘤实验实验组瘤体重量、体积显著高于对照组(P<0.01)。
  二、机制研究
  1、用SASP-CM和CTR-CM培养BC823细胞72h后,提取总RNA做基因表达谱分析,并根据差异表达基因做GO分析。2、SREBP2是胆固醇合成通路中关键转录因子,因此,通过qRT-PCR验证SREBP2及其靶基因表达,免疫荧光及WB证实SREBP2激活。3、用siRNA干扰SREBP2表达,并利用qRT-PCR、验证干扰效果,然后用SASP-CM培养SREBP2干扰和未干扰的BC823细胞,cck8检测细胞增殖活性。
  结果:
  1、通过基因表达谱分析发现:衰老细胞条件培养基能够促进BGC-823细胞胆固醇合成通路中相关酶表达;2、胆固醇合成通路中关键转录因子SREBP2及其靶基因IDI1,MSMO1,INSIG1mRNA表达水平显著上调;衰老细胞条件培养基导致SREBP2激活并发生核转移;3、siRNA干扰SREBP2表达能够降低衰老细胞条件培养基促进BGC-823细胞增殖的能力。
  结论:
  新辅助化疗药物紫杉醇能诱导胃癌细胞发生衰老,衰老的胃癌细胞通过衰老相关分泌表型激活SREBP2促进未衰老的胃癌细胞增殖。
[硕士论文] 王燎原
外科学(胸心外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  1、观察CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和MDR1(rs1045642)基因多态性在华东地区汉族人群中的分布;
  2、观察年龄、性别、体重、身高、体表面积等临床指标以及MDR1(rs1045642)、CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)基因多态性等遗传因素对华东地区汉族人群华法林稳定剂量的影响。
  研究方法:
  收集自2016年3月至2018年1月期间于上海长征医院行机械瓣置换术的患者125例,年龄均在18岁以上(含),所有患者均需接受华法林长期抗凝治疗,且国际标准化比值(international normalized ratio,INR)稳定在2.0-3.0之间,均签署《MDR1基因多态性与华法林个体化剂量的研究》知情同意书。
  1、分别统计患者相关资料,包括年龄、性别、体重、体表面积(body surface area,BSA)(采用许文生氏公式,即BSA=0.0061×身高(cm)+0.0128×体重(kg)-0.1529)、凝血酶原时间(PT)、INR、服用华法林前后肝功能、肾功能;
  2、采用焦磷酸测序方法,通过抽取患者外周静脉血(5ml)检测CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和MDR1(rs1045642)基因单核苷酸多态性;
  3、结合患者临床相关资料、基因多态性分布情况,综合分析患者稳定INR下华法林剂量的差异,并推测不同基因型患者所需华法林剂量。
  研究结果:
  1、125例华东地区汉族瓣膜置换术后患者中,CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和MDR1(rs1045642)基因单核苷酸多态性分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。
  125例患者中男性62例,女性63例,年龄最大71year,最小28year,平均53.3±9.24year,体重60.77±11.34kg,身高164±8.08cm,BSA1.63±0.18m2,术前INR为1.26±0.27,凝血酶原时间为14.29±2.78s,丙氨酸氨基转移酶为25.82±8.93U/L,天冬氨酸转氨酶为26.02±8.25U/L,服用华法林治疗后3个月复查,INR为2.27±0.27,凝血酶原时间为24.33±3.90s,丙氨酸氨基转移酶为24.83±10.44U/L,天冬氨酸转氨酶为26.41±6.33U/L。
  2、125例患者中,男性患者为62例(49.6%),当抗凝强度达到目标INR(2.0~3.0)时所服用华法林稳定剂量为3.44±0.12mg/d,女性患者63例(50.4%),当抗凝强度达到目标INR(2.0~3.0)时所服用华法林稳定剂量为2.95±1.07mg/d,华法林稳定剂量存在明显性别差异,女性患者显著低于男性患者(P<0.05)。不同年龄患者华法林稳定剂量见表1-3,高龄组患者口服华法林稳定剂量为2.80±0.83mg/d,低龄组患者为2.94±0.89mg/d,两者间差异无统计学意义(P>0.05)。
  3、检测华东地区汉族人125例心脏瓣膜置换术后长期服用华法林的患者,其中CYP2C9(rs1057910)的多态性检测发现,野生纯合子AA型为114例(91.2%),突变杂合子AC型为11例(8.8%),没有发现突变纯合子CC型(0.0%);VKORC1(rs9923231)的多态性检测发现,野生纯合子AA型为110例(88.0%),突变杂合子GA型为14例(11.2%),发现突变纯合子GG型1例(0.8%);MDR1(rs1045642)的多态性检测发现,野生纯合子CC型为37例(29.6%),突变杂合子CT型为65例(52.0%),突变纯和子TT型为23例(18.4%)。
  4、单因素分析中,在抗凝强度达到目标INR2.0~3.0时,在长期接受华法林治疗的125例华东地区汉族人工心脏瓣膜机械瓣置换术后患者中,华法林稳定剂量在CYP2C9(rs1057910)AA型患者中为3.00±0.80mg/d,在AC型患者中为1.82±0.90mg/d。AC型患者的华法林稳定剂量明显低于AA型,且两者间差异具有统计学意义(P<0.05);VKORC1(rs9923231)AA基因型患者的华法林稳定剂量为2.81±0.85mg/d,GA基因型患者的华法林稳定剂量为3.53±0.80mg/d,GG基因型患者的华法林稳定剂量为3.75mg/d,AA型患者华法林维持剂量明显低于GA型和GG,其差异具有统计学意义(P<0.05);MDR1(rs1045642)CC纯合突变型的华法林稳定剂量为2.89±0.98mg/d,CT杂合型患者的华法林稳定剂量为2.85±0.81mg/d,TT野生型的华法林稳定剂量为3.07±0.86mg/d。CC、CT和TT型患者华法林稳定剂量之间的差异无统计学意义。
  5、通过协方差分析去除CYP2C9和VKORC1对华法林剂量的影响后,分析华法林稳定剂量和MDR1(rs1045642)基因单核苷酸多态性的关系,发现两者之间无显著关系。
  6、将125例达到抗凝标准的患者根据华法林稳定剂量的差异,分为低剂量组(华法林稳定剂量≤2.5mg/d),中剂量组(2.5mg/d<华法林稳定剂量<5mg/d)和高剂量组(华法林稳定剂量≥5mg/d),低剂量组中MDR1基因CC型的比例为41.3%,CT型比例为54.3%,TT型比例为4.3%,中剂量组中MDR1基因CC型的比例为24.6%,CT型比例为50.8%,TT型比例为24.6%,高剂量组中MDR1基因CC型的比例为16.7%,CT型比例为50.0%,TT型比例为33.3%,高剂量组中TT型患者明显高于低剂量组,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。
  研究结论:
  1、在接受华法林长期治疗的华东地区汉族人心脏瓣膜机械瓣置换术后达到抗凝稳态的患者中,女性患者平均日维持量比男性患者低;
  2、CYP2C9(rs1057910)的基因单核苷酸多态性与华东地区汉族人中华法林抗凝药物稳定剂量存在明显的相关性。CYP2C9(rs1057910)AC型患者的华法林稳定剂量低于AA型患者;
  3、VKORC1(rs9923231)基因单核苷酸多态性与华东地区汉族人中华法林抗凝药物稳定剂量的个体差异存在明显的相关性。VKORC1(rs9923231)AA型患者的华法林稳定剂量低于GA型的患者;
  4、MDR1(rs1045642)不同基因型与华东地区患者患者抗凝稳态时所需华法林剂量差异没有相关性。但是,在高剂量组中MDR1(rs1045642)TT型患者比例明显高于低剂量组中的TT型患者,两者间差异有统计学意义,提示TT型患者所需的华法林剂量较高。
  因此,得出如下结论,为了获得更好的治疗效果,并且最大程度的降低治疗带来的风险,使患者平稳、较快的达到抗凝治疗的标准,可以将CYP2C9(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)和MDR1(rs1045642)基因单核苷酸多态性的检测作为应用华法林治疗前的重要手段,作为华法林的个体化给药的重要参考。
[硕士论文] 林文婷
皮肤病与性病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  隐球菌性脑膜炎是预后十分凶险的深部真菌感染,它好发于免疫缺陷人群,若不积极治疗,死亡率高。两性霉素B(简称AMB)是国内外治疗指南中治疗隐球菌性脑膜的首选用药,但因为其副作用多且严重,难以透过血脑屏障,使隐脑治疗效果下降。鞘内给药能提高脑脊液中AMB的浓度,但神经毒性较大,而且需要反复腰穿,难以达到理想的药代动力学水平,对疾病控制不利。PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物是一种可注射性智能型水凝胶,生物兼容性良好,在低于体温时是液态,能够包载药物,达到体温时变为凝胶状态,能够缓慢控制释放药物。本实验用PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物来负载AMB,并进行鞘内注射,使AMB在脑脊液中得到缓慢释放,减少给药次数,减轻AMB的毒副作用,解决隐球菌脑膜炎目前的治疗困境。
  方法:
  第一部分,AMB凝胶的获取和相关性质检测。首先合成了PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物,用核磁共振和凝胶渗透色谱仪确定该聚合物的分子结构和并对其性能进行表征。用生理盐水将聚合物溶解成不同浓度的聚合物水溶液,测定其凝胶化温度,根据结果选择合适的浓度的聚合物水溶液进行后续研究;用物理载药方法将聚合物AMB负载于聚合物水溶液中(简称AMB凝胶),并对载药前后的聚合物水溶液进行流体力学检测,以判断AMB对该水凝胶是否有影响。
  第二部分,AMB凝胶的体外实验。配制2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶,置于缓释液中,定时更换缓释液,测定AMB凝胶体外缓释度,绘制体外释放曲线,计算累计释放度,用药物缓释曲线中的一阶方程对缓释数据进行拟合。
  第三部分,AMB凝胶的体内实验。在毒理学研究方面,选取健康大鼠为实验对象,将AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶、生理盐水分别进行鞘内注射,每天观察每组大鼠给药后的情况,用Tavlor's评分评估四肢活动能力,记录大鼠死亡或存活情况,在给药后的第7天取做大鼠脊髓做HE染色观察脊髓损伤程度,与以上三个指标比较各组药物对脊髓的神经毒性。在药效学研究方面,建立大鼠隐球菌脑膜炎模型,在建模后的第7天开始用AMB凝胶、普通AMB、空白凝胶进行鞘内注射,在造模后的第14天和第21天取脑脊液做脑脊液培养计数和乳胶凝集试验,进行治疗效果的评价。
  结果:
  第一部分,通过对三嵌段聚合物的结构和性能表征,结果显示该聚合物分平均分子量为1790-1500-1790,聚合物的结构分布控制非常好,是理想的产物。其液体-凝胶转变相温度为34℃,25wt%聚合物水溶液课用于医用。载药前后聚合物水溶液的流体力学行为不发生变化,说明AMB对该聚合物水溶液没有影响。
  第二部分,体外缓释结果表明AMB凝胶可以缓慢释放AMB长达36天,2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL三个浓度的AMB凝胶累积释放度分别为89.0%、77.1%、65.6%,AMB缓释数据符合药物缓释的一阶方程(R2>0.95)。
  第三部分,在毒理学实验中,AMB凝胶组大鼠四肢的Tavlor's评分高于普通AMB(P<0.05),AMB凝胶组大鼠的生存率明显高于普通AMB(P<0.05),HE染色结果显示AMB凝胶的脊髓损伤程度较普通AMB轻,以上结果表明AMB凝胶的神经毒性明显低于普通AMB。在药效学实验中,脑脊液培养结果显示AMB凝胶组大鼠脑脊液中菌体数量低于普通AMB组(P<0.05),乳胶凝集试验结果表明AMB凝胶组脑脊液隐球菌抗原滴度数低于普通AMB组(P<0.05),这都说明AMB凝胶的治疗效果优于普通AMB。
  结论:
  PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物水溶液负载AMB所得到的AMB凝胶较普通AMB有较多优势。它能缓慢释放AMB超过30天,体内的抗菌效果优于普通AMB制剂,此外它还能减轻鞘内注射AMB的神经毒性,减少鞘内给药次数,是比较理想的治疗隐球菌脑膜炎的药物,同时也是一种很好的鞘内缓控给药的手段。隐球菌性脑膜炎作为模式疾病,为其它疾病的鞘内缓控给药提供借鉴意义。
[博士论文] 王冬尧
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:尽管组合化学、超高通量筛选、后基因组计划、计算机技术的联合应用等多种技术快速发展,在药物研发的过程中仍然存在两个瓶颈,一是靶标生物大分子的确定和验证;二是具有生物活性小分子的设计和发现。本文主要关注第一方面,即其中的靶标分析方面。
  1.整合细胞膜色谱系统的构建及在VEGFR-2受体抑制剂靶标鉴定上的应用
  细胞膜色谱技术(cell membrane chromatography,CMC)是一种生物膜技术和色谱技术结合的分析方法,在一定程度上保留了细胞膜的生物学特征,可以模拟生理状态下生物活性小分子与其细胞膜上靶蛋白相互结合的过程。
  整合细胞膜色谱系统由多种细胞膜色谱模型、高效液相色谱、飞行时间质谱整合而成,其中,多种细胞膜色谱模型既相互补充,又相互验证,弥补了生物膜生命周期短、重现性差的内在缺点;高效液相色谱可以对复杂样品进行有效分离;飞行时间质谱可以准确鉴定其中每种组分,使得到的结论与常规的细胞膜色谱相比,更加真实、准确、可信。
  本部分应用SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC两种不同原发性肝癌的细胞膜色谱模型,构建了整合细胞膜色谱分析系统,并用于8个人工合成化合物的活性和靶点评价研究中,这8个喹唑啉类化合物是针对血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)进行设计合成的。在使用整合细胞膜色谱系统进行靶标验证的同时,也采用经典的激酶抑制方法测定了以上8个化合物对VEGFR-2的抑制率。结果表明,化合物在整合细胞膜色谱系统中的保留行为与激酶抑制率高低排序一致,即上述两种方法存在相关性。与分别测定每个待评价化合物样品的传统方法相比,整合细胞膜色谱系统可以直接分析含有多种样品的复杂体系,得到结论真实、可靠,同时,更加节约时间和成本,可成为药物研究中的一种实用分析方法。
  2.TCP-matrine探针的合成及在matrine靶标分析中的应用
  整合细胞膜色谱系统可以快速、有效地分析生物活性小分子与细胞膜蛋白质间是否存在相互作用,然而自然生物膜上含有成百上千种活性蛋白,小分子药物可能与多种受体存在协同结合,受到各种非特异结合因素的干扰,在没有其他关于可能结合靶标相关信息的线索下,很难鉴定、确证或排除某种膜蛋白作为潜在靶标的可能性,因此,将整合细胞膜色谱系统用于生物活性小分子结合靶标的准确鉴定和验证中,尚有困难,仍然需要其他更加深入、精细、直接的靶点鉴定技术的支持和配合,如基于亲和探针的靶点分析技术。
  三功能探针(tri-functional probe,TCP)是亲和探针的一种,是一种同时具有配体基团、光反应基团、标签基团三种功能基团的探针,是生物活性小分子靶标鉴定的有效手段。
  苦参碱(matrine)是一种天然生物碱,被发现具有抗肿瘤的活性,但其直接结合靶标和相关分子作用机制尚不明确,这也是阻碍将苦参碱进一步进行结构改造、活性增强、药物剂型改良等研究开发,最终成为临床一线治疗药物的众多障碍之一。因此,寻找并鉴定到苦参碱的直接作用靶标,意义重大。
  TC P-matrine探针是一个同时具有matrine、4-苯甲酸叠氮基、生物素的亲和探针,其中matrine作为配体基团,4-苯甲酸叠氮基作为光反应基团,生物素作为标签基团,与链霉亲和素构成生物放大系统,用于靶蛋白的纯化分析。本部分将TCP-matrine亲和探针用于matrine的靶点鉴定研究中,首次证明了膜联蛋白A2(annexin A2,ANXA2)是中药苦参中的活性成分苦参碱(同时也是一个有前景的抗癌药)的直接结合靶蛋白,通过抗体阻断实验和敲低表达实验进一步证实了ANXA2是苦参碱发挥抗迁移药效的关键分子,苦参碱可以有效抑制ANXA2介导的纤溶酶原(plasminogen,PLG)向纤溶酶(plasmin,PN)的生物转化,从而抑制肿瘤细胞的迁移。
  3.TCP-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用
  MLN8237是极光激酶A(Aurora Kinase A,AKA)的小分子选择性抑制剂,具有抑制细胞生长、发育,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移、侵袭等多种活性,Ⅰ期临床试验也表明MLN8237在恶性肿瘤方面具有较好的治疗作用,同时存在一定程度的不良反应,如恶心、呕吐、发热、贫血等,在理论上,MLN8237可能存在其他潜在靶蛋白。寻找并鉴定到小分子MLN8237的其他直接作用靶点,为阐明其作用机制,更全面地掌握该分子特性,最终实现其广泛的临床应用,具有重要的意义。
  在明确MLN8237构效关系的基础上,对其羧基部分进行结构修饰,首次合成了TCP-MLN8237探针,该探针含有MLN8237、4-苯甲酸叠氮基、生物素三种不同的功能基团,且探针与药物分子本身在促进细胞凋亡上没有明显差异。与对照探针(骨架相同但不含有配体基团MLN8237,只含有4-苯甲酸叠氮基、生物素基团的探针)处理组相比,经紫外光照射、磁珠纯化富集、凝胶电泳分离、银离子染色等操作后,只分离得到一个差异蛋白条带,经多级蛋白质谱技术分析鉴定,该蛋白为AKA,即目前公认的MLN8237的最强靶点,说明TCP-MLN8237探针是有效的,但由于探针为刚性结构,可能对配体基团与苴靶蛋白间相互结合过程有影响,仍然存在一些的局限,具有优化和改进的空间。
  4.DNA-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用
  在TCP亲和探针的基础上,将赖氨酸的刚性骨架更新为寡核苷酸链的柔性骨架,称为DNA亲和探针,由结合探针(binding probe,BP)与捕获探针(capture probe,CP)共同组成。
  本部分利用DNA亲和探针标记方法,合成了含有MLN8237的BP,含有4-苯甲酸叠氮基、荧光素的CP,经过BP(MLN8237)与靶蛋白结合、CP(4-苯甲酸叠氮基)与靶蛋白光交联、CP(荧光素)在聚丙烯酰胺电泳胶上成像的步骤,最终鉴定得到除AKA之外的7个潜在靶蛋白,在这些潜在靶蛋白分子中,对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen activated protein kinase,p38)和层粘连蛋白受体(laminin receptor,LAMR)进行了生物学验证,其中,MLN8237与p38亲和力约为8μM,相关生物学功能效应(促进细胞凋亡)可能被AKA所掩盖;MLN8237与LAMR亲和力约为1.8μM,可以部分解释其抗肿瘤迁移和侵袭的生物学功能,为更深入地理解MLN8237的药效、毒性、副反应提供有效信息,为全面评价MLN8237作为潜在临床候选药物提供进一步证据。同时,也说明,利用DNA亲和探针寻找小分子的靶点,是一种十分有效的分析方法。
[硕士论文] 刘诗怡
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  法米替尼是一个多靶点的酪氨酸激酶抑制剂,对多种实体瘤均有较好的疗效。然而,在其临床应用中仍存在着以下问题:(1)临床前实验表明法米替尼对中国非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者突变率较高的驱动基因表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)无抑制效果,而临床试验显示其对EGFR野生型的患者有较好的疗效,表明法米替尼的抗肿瘤机制尚不明确,仍需进一步验证;(2)法米替尼对转移性肾癌有较好的疗效,但临床上尚未找到与肾癌治疗相关的特异性较强的生物标志物,仍需对法米替尼的临床效应相关因素进行探索。综上,进一步探索法米替尼的作用靶点及作用机制,对推动法米替尼个体化用药具有重要意义。
  本课题组前期基于激酶酶谱筛查平台,检测了法米替尼对275个蛋白激酶的抑制率,并结合各激酶在肿瘤中的意义,初步确定了棘皮动物微管结合样蛋白4-间变-性淋巴瘤激酶(Echinoderm microtubule-associated protein-like4-Anaplastic Lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因的突变蛋白为其潜在靶点。因此,本课题将具有该遗传背景的NSCLC细胞株NCI-H2228为主要研究对象,在细胞水平及动物水平对该靶点进行相关验证,并初步阐明法米替尼作用机制。此外,本研究还将检测临床患者的血药浓度,综合临床基本信息考察法米替尼疗效及不良反应的相关性因素,为法米替尼的个体化给药提供科学依据。
  方法与结果:
  1.以克唑替尼为阳性对照药,用CCK-8(Cell counting kit-8)法检测法米替尼对NCI-H2228细胞的增殖抑制活性,同时考察法米替尼对该细胞凋亡、周期和迁移的影响。结果显示,法米替尼对EML4-ALK融合基因突变的NSCLC细胞具有较好的活性抑制作用,且20nM法米替尼处理48h后的NCI-H2228细胞与空白对照组相比,能使NCI-H2228细胞凋亡率显著增加且周期阻滞在G0/G1期,同时法米替尼还能抑制其迁移,提示法米替尼具有抑制EML4-ALK突变的NSCLC增殖及促进凋亡的能力。
  2.分别用不同浓度法米替尼(5,10,20nM)处理NCI-H2228细胞48h后,采用免疫印迹法(Western blotting,WB)分析细胞中ALK及其下游蛋白的磷酸化水平。结果显示,法米替尼能够显著抑制ALK及其下游蛋白的磷酸化并促进凋亡相关蛋白的上调且呈剂量依赖性,提示法米替尼抑制NCI-H2228细胞活性可能与ALK/Akt/ERK/STAT3通路抑制有关。
  3.采用裸鼠皮下接种NCI-H2228细胞,建立体内相应的荷瘤模型,以克唑替尼(100mg/kg·d)为阳性对照,观察给药后不同剂量下法米替尼组(2.5,5,10,20mg/kg·d)的体内抑瘤效果。结果显示,与空白对照组相比,克唑替尼和法米替尼中高剂量均能显著性地抑制肿瘤生长(P<0.01),表明法米替尼也可能对EML4-ALK突变的NSCLC生长具有良好的抑制作用,且呈剂量依赖的趋势。但后期克唑替尼和法米替尼均产生耐药情况,高剂量组法米替尼的效果优于克唑替尼,表明后期仍需进一步开展法米替尼对EML4-ALK二次突变耐药的相关研究。
  4.建立超高效液相色谱串联质谱(Ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass,UHPLC-MS/MS)方法同时检测人体血浆中法米替尼原型及主要代谢产物(M3、M7、M9-1和M9-5)并对临床晚期肾癌的患者进行血药浓度检测,结合临床患者的基本信息,疗效及不良反应发生情况进行法米替尼疗效及不良反应的相关性分析,结果表明法米替尼原型(M0)的血药浓度与患者的获益率相关(P<0.05),法米替尼代谢产物M3的血药浓度与与转移灶累及器官数相关(P<0.05),法米替尼代谢产物M9-1与手足综合征的发生率相关(P<0.05)。
  结论:
  首次发现并验证了法米替尼在细胞水平对EML4-ALK融合基因突变的NSCLC细胞具有显著的抑制作用,初步阐明了法米替尼抑制EML4-ALK突变的NSCLC细胞的可能作用机制,即抑制ALK/Akt/ERK/STAT3肿瘤调控通路。通过体内实验进一步证实了法米替尼对其活性的抑制效果,后期还可围绕法米替尼开展EML4-ALK二次突变导致耐药的相关研究。
  本实验中所建立的UHPLC-MS/MS方法可成功应用于临床样本的检测,并对晚期肾癌患者进行了血药浓度的检测,首次将其与疗效及不良反应进行了相关性分析,结果表明法米替尼原型及代谢产物可能与疗效及不良反应发生率相关,但后期仍需进一步考察验证。
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