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[硕士论文] 尹华
生理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究化疗药物羟基脲对非整倍体结肠癌细胞的作用效果,初步探讨非整倍体结肠癌细胞对羟基脲产生抗药性的可能机制。
  方法:1、采用可诱导性表达MAD2L1shRNA的HCT116细胞系(p53+/+HCT116-MAD2L1-shRNA),其中MAD2L1shRNA可通过盐酸强力霉素(doxycycline,Dox)诱导表达,经过Dox处理16h后撤药,可获得MAD2L1基因表达敲低的HCT116非整倍体细胞,即Dox(+);另取HCT116-MAD2L1-shRNA细胞加入同等量的Dox溶解液二甲基亚砜(DMSO),设为对照组,称为整倍体组,即Dox(-);2、在撤药后第3、6d,采用Western blot方法检测MAD2L1蛋白的表达;3、在撤药后第6d,采用染色体滴定法检测两组细胞非整倍体比率,运用CCK8方法检测两组细胞对不同浓度羟基脲(Hydroxyurea,HU)的抗药性;4、在撤药后第6d,加入5mM HU处理两组细胞48h,并设立空白对照组(未加HU处理的非整倍体组及整倍体组),采用RT-PCR法检测PUMA、BAX、NOXA、p21基因表达,采用Western blot方法检测Caspase-3、PUMA、BAX、p21、γ-H2AX蛋白表达水平;5、取敲除了p53基因的可诱导表达MAD2L1shRNA的HCT116细胞(p53-/-HCT116-MAD2L1-shRNA),经过上述相同方法处理,检测细胞生长及凋亡情况;6、用无血清培养基培养上述p53+/+和p53-/-细胞24h后,(设立有血清培养基培养的细胞为对照组),通过CCK8方法检测经不同浓度HU处理48h后的细胞活性;运用RT-PCR方法检测PUMA、BAX、NOXA、p21基因在药物处理后的表达情况。7、选取其他4种不同核型的结肠癌细胞,通过CCK8法检测其对HU的抗药性。
  结果:1、Dox撤药后第3d,与整倍体组Dox(-)细胞相比,非整倍体组Dox(+)细胞中MAD2L1蛋白质表达明显下降;撤药后第6d,Dox(+)细胞中MAD2L1表达基本恢复原有水平;2、p53+/+Dox(+)细胞在撤药后第6d,其非整倍体比率为92%,而DMSO处理的对照组Dox(-)细胞中非整倍体比率仅为6%;3、经不同浓度HU处理48h后,Dox(+)细胞的生长活性明显高于Dox(-)细胞,表明非整倍体Dox(+)细胞对HU具有抗药性;4、采用5mMHU处理Dox(-)和Dox(+)细胞后,两组绌胞凋亡基因表达均出现不同程度的上升,但Dox(+)细胞中PUMA、BAX、NOXA、p21mRNA水平上升程度较Dox(-)细胞低;随着HU药物浓度的增加,Dox(+)细胞中γ-H2AX、p21、PUMA、BAX、Caspase-3蛋白水平上升程度低于Dox(-)细胞;5、p53敲除细胞经不同浓度HU处理48h后,Dox(+)细胞对HU不具有抗药性;6、在p53敲除细胞中,随着HU浓度的上升,Dox(+)细胞中PUMA、BAX、NOXA、p21mRNA表达和Caspase-3、PUMA、BAX、γ-H2AX蛋白水平的上升程度与Dox(-)细胞无明显差别;7、相较有血清培养的HCT116细胞,经无血清处理的HCT116细胞对HU表现出抗药性,凋亡基因PUMA、BAX、NOXA、p21mRNA水平上升程度较有血清处理组小。8、在p53野生型的结肠癌细胞中,非整倍体Caco-2细胞相对整倍体HCT116细胞,对HU具有抗药性,而在p53功能缺失的结肠癌细胞中,非整倍体SW480细胞与整倍体HCT15细胞相比,对HU不具有抗药性。
  结论:1、相比于整倍体细胞,p53野生型的非整倍体结肠癌细胞对HU具有抗药性;2、在p53缺陷细胞中,非整倍体的抗药性消失;3、p53野生型非整倍体结肠癌细胞对HU抗药性的产生是由于非整倍体细胞中p53的激活抑制了细胞生长,而HU则特异性作用于生长期肿瘤细胞所致。
[硕士论文] 黄泽楠
外科学(骨科脊柱) 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  研究大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,NPMSC)的生物学特性及辛伐他汀对髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响,探讨其作为内源性修复重建退变椎间盘的可行性。
  方法:
  取8周龄SD大鼠尾椎髓核组织,采用胶原酶及胰酶序贯消化法分离NPMSC并进行体外扩增培养。观察细胞形态并通过MTT法检测细胞增殖,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型及RT-PCR检测干细胞基因表达进行髓核间充质干细胞的鉴定。取第3代NPMSC施加不同浓度辛伐他汀干预(0mol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L及1μmol/L),在干预后1、3、7、14、21天通过CCK-8法检测细胞活力,RT-PCR检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter1,GLUT-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA表达。
  结果:
  原代细胞早期可形成葵花样细胞集落,传代后细胞生长较原代细胞明显加快,细胞形态以纺锤形为主。第3代细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD45及CD11b,与骨髓间充质干细胞具有相似的干细胞相关基因Sox2、Oct-4及Nanog表达水平。合适浓度(0.01μmol/L-0.1μmol/L)的辛伐他汀促进NPMSC增殖及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达,且0.1μmol/L浓度达到最强,而高浓度辛伐他汀(1μmol/L)对细胞增殖能力及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达有明显抑制作用。辛伐他汀可使NPMSC中出现并促进Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达,0.1μmol/L浓度达到最强。
  结论:
  合适浓度(0.01μmol/L-0.1μmol/L)的辛伐他汀可促进髓核间充质干细胞的增殖和细胞外基质的分泌,其机制可能与HIF-1α介导的信号通路有关。
[硕士论文] 谭庆伟
药物化学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:天然产物作为新药先导化合物的重要来源,其独特的药理活性对某些人类疾病具有较好的治疗效果。但大多数天然产物因较强的毒副作用、水溶性差、活性选择性较差、代谢不稳定等缺点,而并不具备直接成药的特性。因此,对活性天然产物进行结构修饰和改造,消除不必要的官能团、引入对靶点作用具有选择性的基团和封闭代谢位点等,可以大大提高其成药性,为新药研发提供更多可选择的先导药物。
  细胞松弛素(Cytochalasins)是一类由Phomopsis sp.、Chaetomium sp.和Aspergillinia sp.等真菌代谢产生的具有聚酮-氨基酸杂合骨架结构的天然产物,因具有抗肿瘤、免疫抑制、神经细胞保护等多种药理活性而备受关注,是一类极具潜力的先导化合物。Chaetoglobosin F是从白茅内生菌C.globosum发酵产物中分离得到的一个细胞松弛素化合物,前期研究发现,其具有抗肿瘤、抗病毒、神经保护等作用。本学位论文尝试对Chaetoglobosin F的结构进行修饰和改造,以期获得结构较为新颖的Chaetoglobosin F衍生物,丰富细胞松弛素类化合物库,并为新药研发提供更多的先导化合物。
  根据Chaetoglobosin F的结构特征,本学位论文采用不同类型的化学反应对其进行结构修饰和改造,包括:C-20羟基的氧烷基化反应、乙酰化反应、卤化反应、消除反应和酯化反应;C-19/20水解反应;C-20羟基及C-13/14双键的氧化反应;C-13/14和C-17/18双键的烯烃复分解缩环反应;C-19/23羰基的还原反应等。实验中利用LC-MS进行反应分析,最终成功发生10个反应,获得11个衍生物,具体如下:通过m-CPBA氧化反应得到吲哚结构C-2'/3'双键氧化断裂的衍生物1;通过NBS溴代反应得到C-6/7环氧烯丙醇重排及C-2'/5'位溴代的衍生物2;通过三乙基氧鲻六氯化锑氧化反应得到C-6/7环氧重排及C-20羟基氧化的衍生物3;通过MeI甲基化反应得到1'/2位氮甲基化的衍生物4;通过HWE烯基化反应得到C-20碳链延伸的衍生物5;通过Petasis试剂反应和HG-Ⅱ催化剂反应都得到C-20羟基氧化的衍生物6和7;通过NaBH4还原反应得到C-19/23羰基还原的衍生物8和9,并成功培养获得衍生物9的单晶;通过钯-碳催化氢化反应得到双键还原的衍生物10;通过异氰酸苄酯反应得到C-20羟基酯化的衍生物11。进一步采用HR-ESI-MS、1D,2D-NMR、X-ray单晶衍射及文献比对的方法对衍生物进行鉴定结构,并采用SciFinder进行结构查新,衍生物1-5和8-11被鉴定为新化合物,衍生物6和7被鉴定为已知物Chaetoglobosin C。
  本学位论文还采用改进Ellman's法对化合物1、2、3、4、5、6、8和9进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测定,他克林为阳性对照药。结果发现,在100μg/mL浓度下,化合物1、2、3、4、5、6、8和9对AChE表现出一定的抑制作用,其抑制率分别为35.23%、15.42%、25.53%、14.04%、17.96%、35.34%、24.17%和33.23%。阳性对照药他克林具有显著的AChE抑制活性,其IC50值为0.7μg/mL。
[硕士论文] 廖凯
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:细胞色素P4502C9(CYP2C9)是人体内重要的Ⅰ相药物代谢酶,参与了超过15%临床药物的代谢清除。CYP2C9基因具有高度的多态性,目前已发现60种CYP2C9突变体。这些基因多态性可能影响其底物药的代谢清除速率,并导致血浓度的改变,进而引发药物不良反应。故研究CYP2C9基因多态性对临床安全用药、药物不良反应的预测及指导合理用药具有重要的意义。本论文通过meta分析发现,CYP2C9基因多态性对其底物苯妥英维持剂量具有显著影响。但上述研究同时发现,目前研究的突变体主要为CYP2C9*2和*3,而150位精氨酸的突变在非裔美国人(CYP2C9*8)和中国人(CYP2C9*27)中出现的频率均高于这两个人群中CYP2C9*2的突变频率。为进一步研究CYP2C9第150位突变,本研究构建了稳定表达CYP2C9*8和*27的HKE293T细胞株,并通过体外酶活性实验,分析了CYP2C9*8和*27对其底物代谢活性的影响。本研究发现第150位的突变可能影响CYP2C9与P450氧化还原酶(P450oxidoreductase,POR)的相互作用。本研究又构建了POR的表达体系,为进一步分析150位突变如何影响CYP2C9与其辅酶的相互作用提供有力工具。论文主要内容包括如下三个部分。
  第一部分 亚洲癫痫患者中CYP2C9/2C19基因多态性与苯妥英维持量的相关性的meta分析
  目的:
  CYP2C9基因多态性可能影响其底物药物的药代动力学行为,并可能影响药物的安全性。苯妥英是抗癫痫的一线药物,其治疗窗窄,且疗效具有明显的个体差异。CYP2C9是催化苯妥英代谢清除的主要代谢酶(90%),此外CYP2C19对苯妥英的代谢清除也有少量贡献(约10%)。本研究旨在通过meta分析探讨亚洲癫痫患者人群中CYP2C9和CYP2C19基因多态性对苯妥英维持剂量的影响。
  方法:
  系统检索了PubMed以及EMBASE数据库,查阅2017年6月14日之前的相关发表文献。采用RevMan5.2.3分析CYP2C9/2C19酶基因多态性与苯妥英每日维持剂量的相关性。
  结果:
  包含993例患者的6篇文献符合纳入标准并纳入meta分析中。结果显示,携带CYP2C9突变体的患者需要PHT剂量调整,仅有一个野生型CYP2C9等位基因的患者PHT的维持剂量推荐下调22%。此外,在CYP2C9野生型的患者中,携带CYP2C19*1/*2或者CYP2C19*1/*3的患者不需要剂量调整,但携带CYP2C19*2/*2,CYP2C19*2/*3或者CYP2C19*3/*3的患者PHT维持剂量应当下降11%。。
  结论:
  研究结果显示,具有CYP2C9/2C19突变的患者需要降低苯妥英维持剂量。由于不同人群的基因多态性存在差异,人群差异也是影响苯妥英维持剂量的原因之一。此外,本部分研究中发现,目前CYP2C9基因型对药物代谢的影响的研究集中在CYP2C9*2和CYP2C9*3两个突变,而在亚洲人群中,包括CYP2C9的150位精氨酸突变在内的其他突变对药物的代谢的影响及其机制研究尚不足。
  第二部分 细胞色素P4502C9*8和*27的表达及活性研究
  目的:
  本研究的第一部分发现,目前研究最多的是CYP2C9*2和CYP2C9*3两个突变。但是CYP2C9第150位氨基酸突变在亚洲人群CYP2C9*27(499G>T)和非裔美国人CYP2C9*8(449G>A)中的频率均高于CYP2C9*2。本部分拟构建慢病毒表达质粒,将人细胞色素P4502C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8和CYP2C9*27稳定表达于人HEK293T细胞。并使用该表达体系获得的CYP2C9突变体,结合过氧化氢异丙苯绕过POR供电,考察代谢能力的变化,探讨第150位精氨酸改变CYP2C9代谢活性的机制。
  方法:
  反转录人肝组织总RNA获得cDNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,将其克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9。以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449G>A和449G>T点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8和MigR1-CYP2C9*27慢病毒表达质粒。在HEK293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8和CYP2C9*27的细胞,命名为293T-2C9、293T-2C9*8和293T-2C9*27。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测胞内CYP2C9表达。采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸,结合过氧化氢异丙苯,考察突变体对CYP2C9突变体是否影响其活性及与POR的相互作用。
  结果:
  成功构MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8建和MigR1-CYP2C9*27表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9*8和293T-2C9*27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR和western blot均表明有目标分子表达。提取这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸。在NADPH存在,通过POR传递电子的情况下,CYP2C9*8的代谢能力低于CYP2C9*1。当使用过氧化氢异丙苯绕过POR提供电子时,CYP2C9*1与CYP2C9*8微粒体催化双氯芬酸生成4-羟基双氯芬酸并无显著性差异
  结论:
  成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8和CYP2C9*27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8和*27两个突变体的功能研究。CYP2C9*8下调酶活性的机制可能与突变影响POR相互作用相关。
  第三部分 细胞色素P450还原酶的表达及对CYP2C9第150位精氨酸突变的代谢影响
  目的:
  第二部分研究发现,CYP2C9第150位单核苷酸突变可能影响其与辅酶的相互作用,为进一步分析150位突变对CYP2C9与其辅酶相互作用的影响,本部分构建CYPs的氧化还原搭档POR的慢病毒表达载体,在HEK239T细胞中的稳定表达,并探索POR对CYP2C9第150位精氨酸突变体代谢活性的影响。
  方法:
  反转录人肝组织总RNA获得cDNA,PCR扩增获得POR编码序列,将其克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-POR。在HEK293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达POR的细胞,命名为293T-POR。实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测胞内POR表达。在体外酶活性实验中,比较添加POR对CYP2C9野生型及突变体代谢双氯芬酸的酶活性的影响差异。
  结果:
  成功构建MigR1-POR表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-POR在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR和western blot均表明有目标分子表达。向野生型CYP2C9中添加POR对其代谢活性无显著影响,但POR导致CYP2C9*8的活性下降。
  结论:
  成功构建稳定表达POR人源化细胞模型,添加POR对CYP2C9*8活性的影响较对野生型CYP2C9的影响强。
[硕士论文] 王暑光
外科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨他莫昔芬抑制成纤维细胞增殖预防硬膜外瘢痕粘连的作用及可能的机制。
  方法:选取24只雄性Wistar大鼠,随机分成四组,采用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,切除第一腰椎椎板,建立椎板切除模型,术毕冲洗、缝合切口。术后对四组大鼠分别采用0、2、4、8mg/kg的他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)灌胃治疗1个月后处死大鼠,取下第一腰椎椎体,用4%多聚甲醛固定24h,EDTA脱钙液脱钙,制作石蜡切片,采用HE和Masson染色检测不同浓度的TAM对大鼠硬膜外瘢痕粘连情况、成纤维细胞数目、胶原含量的影响,免疫组织化学技术检测不同浓度的TAM对大鼠硬膜外瘢痕组织中AKT的磷酸化水平的影响。体外培养人成纤维细胞,采用不同浓度(0、5、10、15、20、25μM)的TAM处理成纤维细胞24h,同时用10μM的TAM处理成纤维细胞不同时间(0、12、24、36、48、60h),采用CCK-8检测成纤维细胞增殖活性。用不同浓度(0、10μM)的TAM处理成纤维细胞24h,采用细胞周期分析检测TAM对成纤维细胞增殖的作用。用不同浓度(0、5、10、20μM)的TAM处理成纤维细胞24h,10μM的TAM处理成纤维细胞不同时间(0、12、24、48h),采用Western blot检测TAM对成纤维细胞中AKT的磷酸化水平及其下游基因cyclinD1、P21、P27的表达情况的影响。
  结果:术后大鼠一般情况良好,无因死亡等退组现象。在动物实验部分,HE和Masson染色后在显微镜下观察,发现随着TAM浓度的增加,硬膜外瘢痕粘连程度不断减轻,瘢痕中成纤维细胞数量不断减少,胶原含量不断减少,结果差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学技术分析结果表明TAM能够降低大鼠硬膜外瘢痕组织中AKT的磷酸化水平,随着TAM浓度的增加,硬膜外瘢痕组织中的AKT的磷酸化水平不断减低,结果差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞实验中,CCK-8分析结果表明,TAM可以抑制成纤维细胞的增殖活性,随着TAM浓度和用药时间的增加,成纤维细胞的增殖活性不断下降,结果差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞周期分析检测结果表明,TAM能够抑制成纤维增殖,将细胞阻滞在G1期,结果差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,TAM能够下调AKT的磷酸化水平及其下游增殖相关蛋白cyclinD1的表达,上调P21、P27的表达,且具有明显的药物浓度和时间依赖趋势。结果表明TAM可以通过调控AKT的磷酸化水平及其下游基因的表达,抑制成纤维细胞增殖,预防大鼠椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连。
  结论:TAM能够通过调控AKT磷酸化水平及其下游基因的表达抑制成纤维细胞增殖,预防大鼠椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连。
[硕士论文] 周怀成
临床医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨术前2小时口服10%葡萄糖溶液对胃癌手术患者术前主观舒适度的影响,术后胰岛素抵抗、术后快速康复的影响。从而为胃癌手术患者术前禁食、禁饮方案的选择提供参考依据。
  方法:
  选取2017年06月至2018年03月在扬州市苏北人民医院胃肠外科进行胃癌根治术的60例患者为观察对象,随机分为治疗组(糖水组)、对照组(禁饮组)各30例,治疗组于术前2小时给予10%葡萄糖溶液500ml口服(15min内进食完毕);对照组术前12小时禁食,8小时禁饮。两组患者的围手术期管理均按照本科室常规的快速康复外科流程进行管理,并由同一组外科医师完成手术。分别在术前3小时和术前30分钟测定两组患者的主观舒适度,主要包括了口渴感、饥饿感。记录患者手术时间、术中出血量、首次排气时间、术后住院时间;记录患者术后并发症。在手术当天术前3小时、术后第1日和术后第3日清晨分别抽取患者外周静脉血,测定血糖浓度、血清胰岛素浓度,并用稳态模式评估法计箅胰岛素抵抗指数。
  结果:
  治疗组有1例患者未按要求口服葡萄糖溶液,将此1例患者剔出研究,其余共有59例入组对象完成实验,其中治疗组29例,对照组30例。研究过程中,无术中死亡病例,无因并发症死亡患者,所有患者均康复出院。
  1、治疗组29例,其中男性患者21例,女性患者8例,患者年龄64.07±6.81岁,BMI21.98±2.60kg/m2。对照组30例,其中男性患者21例,女性患者9例,患者年龄63.83±7.99岁,BMI21.92±2.59kg/m2。两组患者在性别、年龄、BMI指标等方面均无差异(P>0.05);
  2、治疗组患者术中出血量75.52±35.92ml、手术时间172.59±53.91分钟、其中行胃癌全胃切除术的患者14例,行胃次全切除术+淋巴结清扫的患者有15例。对照组患者术中出血量87.33±23.92ml、手术时间172.59±53.91分钟、其中行胃癌全胃切除术的患者16例,行胃次全切除术+淋巴结清扫的患者有14例。两组患者在手术时间、出血量、手术方式等两组数据上无统计学意义,(P>0.05);
  3、治疗组与对照组患者术前3小时饥饿感评分分别为3.21±0.89、2.75±1.01,口渴感评分分别为4.78±0.98、4.77±0.93,两组数据无统计学意义(P>0.05);两组患者术前30分钟饥饿感评分分别为1.63±0.37、3.14±0.92,口渴感评分分别为1.67±0.48、5.14±0.91,两组数据有统计学意义(P<0.01);
  4、治疗组与对照组患者术后首次排气分别为3.79±0.73d、3.73±0.58d,术后住院时间分别为10.69±1.23d、10.43±1.19d,两组数值无显著统计学差异(P>0.05);
  5、治疗组与对照组患者术前3小时血糖,术后第1天血糖,术后第3天血糖进行分析,均无统计学意义(P>0.05)。两组患者术前3小时的胰岛素浓度6.78±3.10mU/L、6.50±1.83mU/L,无统计学意义(P>0.05)。术后第1天胰岛素浓度分别为6.37±2.37mU/L、12.54±4.22mU/L,术后第3天胰岛素浓度分别5.56±1.86mU/L、10.03±2.56mU/L,均有统计学意义(P<0.01)。两组患者术前3小时的胰岛素抵抗指数分别为1.83±0.95、1.81±0.56,无统计学意义(P>0.05)。术后第1天胰岛素浓度分别为1.95±0.83、3.68±1.50,术后第3天胰岛素浓度分别1.58±0.60、2.84±0.96,均有统计学意义(P<0.01)。
  结论:
  1、术前2h口服10%葡萄糖水可减轻患者麻醉前的口渴感与饥饿感,提高患者的舒适度;
  2、术前2h口服10%葡萄糖水明显减轻胃癌患者术后胰岛素抵抗程度。
[硕士论文] 马宏昕
药理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探究川芎嗪(TMP)和丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)对SD大鼠心室肌细胞钠离子通道电流(INa)及其动力学特征的影响,并进一步探讨两种药物联合给予后通道电流及各动力学过程的变化。
  方法:
  室温下快速游离SD大鼠心脏,并迅速将其置于冰浴中,然后采用Langendorff主动脉逆向灌流酶解法获得单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录钠通道电流,以细胞外液灌流给药的方式观察不同剂量的TMP和TanshinoneⅡA单独和联合应用前、后INa的变化,进而分析药物影响前后钠离子通道电流的相关动力学特征变化。
  结果:
  1.TMP对钠通道电流的影响。
  (1)TMP作用的浓度依赖性
  TMP能浓度依赖性地抑制INa。当TMP浓度低于20μM时,其对INa无显著影响,但当药物浓度大于50μM时,随着药物浓度的增加,对电流的抑制作用也随之增强。其中,5μM和200μM的TMP使电流密度(INa-Peak)由给药前的(-81.32±3.28)pA/pF分别降为(-58.10±4.16)pA/pF和(-35.65±3.23)pA/pF(P<0.01,n=6)。
  (2)TMP对INa的电流-电压关系(I-V)曲线的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP能使INa的I-V曲线显著上移,但I-V曲线的轨迹变化趋势未发生变化。
  (3)TMP对INa激活动力学的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP能使INa的激活曲线右移。50μM和200μM TMP使半数激活电压(V1/2-ac)由给药前的(-42.92±0.24)mV分别变为(-41.20±0.19)mV和(-37.69±0.17)mV(P>0.05,n=6)。即TMP对通道的激活动力学无显著影响。
  (4)TMP对INa失活动力学的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP能使INa的失活曲线左移。50μM和200μM的TMP使半数失活电压(V1/2-m)由给药前的(-57.71±0.21)mV变为(-64.05±0.41)mV和(-69.85±0.39)mV(P>0.05,n=6)。TMP对通道失活动力学无显著影响。
  (5)TMP对INa失活后恢复动力学的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP使INa的失活后恢复曲线左移。50μM和200μM的TMP使恢复时间(τ)由给药前的(20.88±1.59)ms变为(18.65±1.38)ms和(15.62±0.8)ms(P>0.05,n=6)。即TMP对通道的恢复动力学无显著影响。
  2.TanshinoneⅡA对钠通道电流的影响。
  (1)TanshinoneⅡA作用的浓度依赖性
  TanshinoneⅡA能浓度依赖性地抑制INa。低于10μM的TanshinoneⅡA对INa无显著影响,但当浓度大于20μM时,随着药物浓度的增加,TanshinoneⅡA对INa的抑制作用逐渐增强,20μM和80μM的TanshinoneⅡA使INa-Peak由给药前的(-110.61±6.28)pA/pF分别降为(-87.28±5.76)pA/pF和(-54.53±3.15)pA/pF(P<0.01,n=6),呈显著的浓度依赖性抑制。
  (2)TanshinoneⅡA对INa电流-电压关系(I-V)曲线的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA使INa的I-V曲线显著上移,但I-V曲线的轨迹变化趋势未发生变化。
  (3)TanshinoneⅡA对INa激活动力学的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA对INa激活曲线无显著影响。20μM和80μM的TanshinoneⅡA使V1/2-ac由给药前的(-43.85±8.07)mV分别变为(-43.95±2.44)mV和(-43.99±0.79)mV(P>0.05,n=6),即TanshinoneⅡA对通道激活动力学特征无显著影响。
  (4)TanshinoneⅡA对INa失活动力学的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA使INa的失活曲线显著左移。20μM和80μM的TanshinoneⅡA使V1/2-in由给药前的(-52.15±0.96)mV分别变为(-64.87±0.99)mV和(-75.71±0.75)mV(P<0.05,n=6)。即TanshinoneⅡA使V1/2-m向超极化方向移动,加快了通道失活。
  (5)TanshinoneⅡA对INa失活后恢复动力学的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA使INa的失活后恢复曲线右移。20μM和80μM的TanshinoneⅡA使τ由给药前的(11.52±1.18)ms变为(20.84±0.99)ms和(30.81±1.01)ms(P<0.05,n=6)。即TanshinoneⅡA可延迟通道的恢复。
  3.TMP和TanshinoneⅡA联合使用对钠通道电流的影响。
  (1)TMP和TanshinoneⅡA共同作用的浓度依赖性
  联合给予TMP和TanshinoneⅡA可浓度依赖性抑制INa。为了初步探讨药物联合应用后的效果及便于横向对照,设置了(20+50)μM、(40+100)μM、(80+200)μM和(160+400)μM四个浓度组合,结果发现随浓度梯度的增加,药物对INa的抑制作用增强,(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使INa-Peak(-103.94±6.58)pA/pF分别降为(-59.86±5.12)pA/pF和(-30.60±4.23)pA/pF(P<0.01,n=6)。相比两药单独使用,联合应用时对INa的抑制率更高,如50μM的TMP、20μM的TanshinoneⅡA和(20+50)μM的TanshinoneⅡA+TMP对的抑制率分别为(29.1±1.1)%、(19.1±1.1)%和(42.4±1.4)%(P<0.05,n=6),突出了两种药物联合使用的优势。
  (2)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa电流-电压关系(I-V)曲线的影响
  TanshinoneⅡA+TMP作用时同以上单独给药情况一样,可使INa的I-V曲线显著上移。(20+50)μM和(80+200)M的TanshinoneⅡA+TMP使Vpeak-30mV分别变为-25mV和-20mV(P<0.01,n=6),但I-V曲线轨迹变化趋势未发生变化。
  (3)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa激活动力学的影响
  TanshinoneⅡA+TMP使INa激活曲线右移,但无显著性影响。(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使V1/2-ac由(-42.74±0.43)mV分别变为(-42.32±0.4)mV和(-39.9±0.75)mV(P>0.05,n=6)。即TMP和TanshinoneⅡA联合给予对通道激活动力学特征无显著影响。
  (4)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa失活动力学的影响
  TanshinoneⅡA+TMP使INa的失活曲线左移。(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使V1/2-m由(-81.61±0.72)mV分别变为(-82.89±0.59)mV和(-88.21±0.49)mV(P>0.05,n=6)。即TMP和TanshinoneⅡA联合给予对通道失活动力学特征无显著影响。通过对比三种情况下V1/2-m的变化发现,两药联合给予对通道失活过程影响较小。
  (5)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa失活后恢复动力学的影响
  TanshinoneⅡA+TMP使INa的失活后恢复曲线右移。(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使τ由给药前的(20.47±0.84)ms变为(30.22±0.97)ms和(31.62±1.02)ms(P<0.05,n=6),即TMP和TanshinoneⅡA联合给予可延迟通道恢复。通过对比三种情况下τ的变化发现,联合给予组可逆转TMP对通道恢复的加快,同时相比TanshinoneⅡA组,联合给予组对通道恢复过程影响较小。
  结论:
  川芎嗪和丹参酮ⅡA单独及联合应用时均可浓度依赖性抑制SD大鼠心室肌细胞钠通道电流,且两者联合应用后发挥的抑制作用更强,同时对通道激活、失活及失活后恢复动力学特征产生的影响较小。
[硕士论文] 张瑞莲
皮肤病与性病学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本文从以下几个部分展开论述:
  第一部分 湿疹细菌学研究
  目的:通过对各期湿疹皮损区、皮损边缘及健康者皮肤细菌培养鉴定,探究各期湿疹中细菌的分布情况,为治疗湿疹合理使用抗生素提供理论依据,并对培养出的细菌进行常规药敏试验,指导临床用药。
  方法:按临床表现将360名湿疹患者分为急性湿疹、亚急性湿疹和慢性湿疹三组,每组120人,另选120名无皮肤疾病者作为健康对照组。用无菌棉签(已用无菌生理盐水浸湿)轻轻擦拭各取材区域后,换用无菌拭子擦拭各入选患者的皮损区、皮损边缘及健康者皮肤,无菌情况下将所取分泌物、渗液等接种于羊血培养皿中进行培养,最后采用全自动分析法对培养细菌进行常规药敏试验。
  结果:1.细菌培养情况:本次共培养出219株金黄色葡萄球菌、38株表皮葡萄球菌、8株溶血葡萄球菌,2株施氏葡萄球菌、7株不动杆菌、8株肺炎克雷伯杆菌、8株大肠杆菌,以金葡菌为主。
  2.取材区域细菌分布情况:急性湿疹皮损区细菌总检出率为82.50%,高于亚急性期68.33%和慢性期35.00%,三期皮损区细菌总检出率相比均有统计学意义(P均<0.05);所有皮损区细菌检出率均高于对应皮损边缘及健康皮肤,差异均有统计意义(P均<0.05)。急性期金葡菌检出率为68.33%,高于亚急性期54.17%、慢性期26.67%,三期皮损区金葡菌检出率差异无统计学意义(P均>0.05)。
  2.药物敏感试验结果:金葡菌对万古霉素、利福平和呋喃妥因的药物敏感性高达100%,表皮葡对利福平也有高达100%的敏感性,但两种细菌对红霉素的敏感性均较差,分别为25.57%、47.37%。
  结论:急性、亚急性、慢性湿疹均培养出细菌,急性湿疹细菌阳性率较亚急性、慢性期高,细菌以金葡菌为主,金葡菌对万古霉素、利福平和呋喃妥因敏感性最高。
  第二部分曲安奈德益康唑乳膏治疗湿疹的疗效观察
  目的:观察曲安奈德益康唑乳膏(派瑞松)治疗急性、亚急性、慢性湿疹前后细菌分布情况;治疗前后临床严重度的改善及有效率,不良反应的发生。
  方法:将急性湿疹病人随机分为试验A组(外用曲安奈德益康唑乳膏加莫匹罗星软膏,即派瑞松加百多邦)、试验B组(派瑞松)、试验C组(百多邦)和对照组(生理盐水);亚急性湿疹病人分为试验A组(派瑞松加百多邦)、试验B组(派瑞松)、试验C组(百多邦)和对照组(玉泽皮肤屏障修护身体乳);慢性湿疹病人分为试验A组(复方氟米松软膏,即奥深)、试验B组(派瑞松)、试验C组(百多邦)和对照组(玉泽身体乳)。每组30人、分别观察并记录治疗1周、2周后皮损区细菌分布、临床严重度改善、治疗有效率及不良反应等。
  结果:1.治疗前后细菌分布情况:各组治疗1周、2周后各期皮损区查菌率均下降,但三个实验组查菌率明显低于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。
  2.治疗前后临床严重度情况:治疗1周后急性、亚急性湿疹派瑞松加百多邦组和派瑞松组临床严重度较治疗前有改善,派瑞松加百多邦与派瑞松在改善急性、亚急性湿疹临床严重度方面疗效相当,差异无统计学意义(P>0.05);慢性湿疹派瑞松组与奥深组临床严重度较治疗前有改善,派瑞松和奥深在改善慢性湿疹临床严重度方面疗效相当,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗2周后急性、亚急性湿疹派瑞松联合百多邦组与派瑞松组的临床严重度评分进一步下降,但两组间临床严重度评分差异无统计学意义(P>0.05);慢性湿疹派瑞松组与奥深组临床严重度评分进一步下降,两组间临床严重度评分差异无统计学意义(P>0.05);亚急性、慢性湿疹玉泽身体乳组临床严重度与治疗前相比,差异有统计学意义(P=0.029、P=0.028、均<0.05)。
  3.治疗有效率:结果表明治疗2周后各组有效率均高于治疗1周后。治疗2周后,派瑞松联合百多邦组在急性期、亚急性湿疹中疗效最佳(均为96.67%),高于单用派瑞松组(有效率均为86.67%),两组有效率差异均无统计学意义(P>0.05);慢性湿疹奥深组有效率为90.00%,高于派瑞松组(有效率83.33%),两组有效率差异无统计学意义(P>0.05)。
  4.不良反应:整个治疗过程未见明显不良反应。
  结论:派瑞松联合百多邦和派瑞松均能明显减少急性、亚急性湿疹皮损处细菌;两种治疗方法都能改善急性、亚急性湿疹的临床症状,治疗疗效好;派瑞松和奥深都能降低慢性湿疹皮损表面的细菌,两者疗效相当。
[硕士论文] 徐蓉蓉
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:薏苡素(Coixol)是从薏苡、白茅、野甘草等植物中提取而来的无色针状结晶,也是薏苡种仁油抗癌制剂“康莱特注射液”中的主要活性成分之一。目前有很多关于康莱特注射液抗癌同时减轻癌症痛感的临床报道,也有文献报道薏苡素具有镇痛抗炎、抗菌、降糖等作用,研发薏苡素制剂可以满足临床用药的需求,具有实际应用价值。
  由于薏苡素的水溶性差,本实验采用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合薏苡素,同时考察薏苡素-HP-β-CD包合物的体外释药情况和稳定性等。此外,建立生物样品中薏苡素的HPLC测定方法,考察薏苡素及其包合物灌胃给药后在大鼠体内的药动学特征和组织分布情况,为薏苡素新制剂的应用提供基础实验依据。主要研究内容和结果如下:
  1、薏苡素-HP-β-CD包合物的制备及表征
  采用溶剂搅拌-冷冻干燥法制备薏苡素-HP-β-CD包合物,通过扫描电镜法、红外光谱法、差示扫描量热分析和X-射线衍射法对包合物进行表征,验证其包合成功。
  采用HPLC法测定包合物中薏苡素含量,并进行方法学考察。实验结果表明:薏苡素浓度(x)与峰面积(y)具有良好的线性关系,薏苡素含量测定回归方程为:y=108096x-48927(R2=0.9995)。方法的专属性、精密度、稳定性和加样回收率良好,适用于包合物中薏苡素的含量测定。
  2、优化薏苡素-HP-β-CD包合物的制备工艺
  在单因素影响实验的基础上,以包合率和包合物得率的综合评分为考察指标,筛选出HP-β-CD与薏苡素投料比、包合时间、包合温度三种因素进行星点设计-响应面实验,确定制备包合物的最佳工艺:HP-β-CD∶薏苡素投料比为3∶1,包合温度60℃,包合时间5h。
  3、薏苡素-HP-β-CD包合物体外释放实验及稳定性考察
  采用透析袋(截留分子量为8000~14000)法进行体外释药考察,实验结果表明,薏苡素-HP-β-CD包合物累计释药率比薏苡素单体的溶出提高了2.55倍,说明薏苡素-HP-β-CD包合物溶解度远大于薏苡素。稳定性实验结果显示:薏苡素-HP-β-CD包合物在高温和光照条件下稳定性良好;在高湿环境巾易吸湿潮解,因此在生产、贮存和运输过程中尽量保持避光密封干燥。
  4、薏苡素-HP-β-CD包合物药动学及组织分布研究
  采用HPLC法测定生物样品中薏苡素的含量,为更有效地避免生物组织中繁杂成分干扰,采用内标法进行定量分析并进行方法学考察。实验显示,薏苡素与内标物峰形良好,完全分离,有良好的专属性。血浆样品中,薏苡素在考察的0.16~25.00μg/mL浓度范围内线性关系良好;各组织样品中,薏苡素在考察的0.03~3.13μg/mL浓度范围内线性关系良好,精密度、样品稳定性及回收率RSD均良好,可用于生物体内样品的检测。
  采用血药浓度测定法研究薏苡素及其包合物在大鼠体内的药动学特征。以100mg/kg的剂量进行大鼠灌胃给药后,采用二室模型对数据进行处理求得药动学参数,确定:薏苡素的平均血药峰浓度Cmax=14.9±2.82μg/mL比薏苡素包合物的Cmax=17.48±2.33μg/mL为低;薏苡素及其包合物的消除半衰期t1/2Z分别为0.83±0.44h和1.97±0.63h,平均滞留时间MRT(0~10)分别为1.00±0.13h和2.37±0.23h。与薏苡素相比,薏苡素包合物的消除半衰期t1/2Z显著延长(p<0.01),平均滞留时间MRT(0~10)显著延长(p<0.01)。此外,薏苡素包合物在大鼠体内的药时曲线下面积AUC(0~10)显著提高(p<0.01),是薏苡素的232.83%。说明薏苡素经HP-β-CD包合后能增加其在体内的吸收,延缓薏苡素在体内的代谢消除,达到长效作用,提高其口服生物利用度。
  按给药量100mg/kg计,大鼠灌胃给予薏苡素及其包合物后,HPLC测定0.25h、0.5h、1h、3h、6h、10h大鼠各组织中薏苡素浓度,比较药物在各组织中的分布情况。结果表明,在0.25h时,包合物组在各组织中的浓度均低于薏苡素组;在0.5h时,包合物组在各组织中的浓度升高较快;在1h及以后,包合物在各组织的浓度均高于薏苡素组;在6h时,薏苡素组的心、脾、肺、脑中药物浓度已低于检测限;而包合物组的各组织中药物浓度均能检测到。此外,薏苡素组在0.25h时各组织中药物浓度达到最大值;而包合物组在0.5h时各组织(除肾)中薏苡素浓度达到最大值。通过对比可以说明HP-β-CD的包合可提高薏苡素在组织脏器中的浓度,同时使薏苡素缓慢释放而具有长效作用;包合物组在各组织中的含量下降速度比薏苡素组的缓慢,说明制成包合物后可延缓薏苡素在体内的消除过程。总的趋势来看,在肾、肝中薏苡素含量明显大于其他脏器;各组织器官中,薏苡素的浓度大小依次为:肾>肝>脾>心>肺>脑。与薏苡素相比,包合物在肾中的含量下降速度缓慢,说明包合物可延缓药物在体内的消除过程。值得注意的是,脑部也能检测到薏苡素的含量,说明薏苡素能透过血脑屏障,提示薏苡素可能作用于脑部的中枢神经而发挥镇痛作用;随着时间的延长,薏苡素包合物在脑部含量下降速度缓慢,说明包合物可减缓药物在脑部的消除速度,增加在脑部的滞留时间,提示“康莱特注射液”对癌患的镇痛作用很有可能是所含成分薏苡素所为。
[硕士论文] 任静娜
药理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨异牡荆素(Isovitexin,Ⅳ)对大鼠心室肌细胞上的几个主要的离子通道电流(Ito、INa、ICa-L)及其动力学特征的影响。
  方法:
  采用MTT法检测Ⅳ对细胞活力的影响;主动脉逆行灌流酶解分离成年大鼠心肌细胞;全细胞膜片钳技术引导和记录电流;累积给药观察不同剂量的Ⅳ给药前后通道电流及其动力学特征的变化。
  结果:
  1、不同浓度的Ⅳ对乳鼠心肌细胞活力的影响
  利用MTT法检测Ⅳ对细胞活力的影响,结果显示:给药后24h,低浓度(1~3μM)Ⅳ对细胞活力无明显影响[对照组:(99.13±5.38)%,Ⅳ组:1μM(86.77±3.99)%,3μM(81.47±3.95)%(P>0.05,n=5)];当Ⅳ浓度为10μM时,细胞活力有所降低[(66.69±4.53)%(P<0.05,n=5)],而高浓度的Ⅳ(≥30μM)能明显抑制细胞的增殖[30μM(48.62±2.44)%(P<0.01,n=5)]。给药后细胞培养48h,随着给药时间和浓度的增加,Ⅳ对细胞活力影响显著[对照组(99.93±1.64)%vs给药组1μM(77.2±4.00)%,3μM(68.11±3.76)%(P<0.05,n=5),10μM(59.31±4.93)%和30μM(43.11±2.73)%(P<0.01,n=5)]。培养24h和48h后Ⅳ的IC50分别为27.60μM和22.43μM。
  2、不同浓度的Ⅳ对各离子通道电流的影响
  (1)Ⅳ对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的影响
  利用全细胞膜片钳技术记录和引导Ito,并观察不同剂量的Ⅳ对该电流的影响。结果显示:在低浓度(≤0.1μM)时,Ⅳ对Ito无明显影响,但随着药物浓度的增高(≥0.3μM),Ito峰值逐渐降低,由给药前的(42.32±2.93)pA/pF分别降为(31.83±4.30)pA/pF,1μMⅣ;(25.51±3.48)pA/pF,3μMⅣ和(16.35±2.50)pA/pF,10μMⅣ(P<0.01,n-6),呈浓度依赖性抑制。且随着Ⅳ浓度的升高(≥3μM),药物使Ito的I-V曲线明显下移。激活曲线结果显示:Ⅳ可使最大半数激活电位(V1/2)向正值方向移动,给药前V1/2为(19.59±1.60)mV,给予1μMⅣ后,V1/2变为(22.81±1.66)mV(P>0.05,n=6),而给予3μM和10μMⅣ后,V1/2分别升高至(28.86±141)mV和(36.29±0.69)mV,(P<0.01,n=6)。Ito稳态失活曲线的最大半数失活电位(V1/2):给药组(-44.71±0.71)mV,1μM;(-58.81±1.23)mV,3μM和(-70.11±1.13)mV,10μM(P<0.01,n=6)较给药前(-27.02±0.79)mV明显降低。就失活后恢复曲线的失活恢复时间(τ)而言,给药后的τ较给药前显著升高[给药前:(90.77±1.02)ms;给药后:(118.50±1.51)ms,1μM;(16240±1.42)ms,3μM;(227.80±0.73)ms,10μM(P<0.01,n=6)],且Ito的失活后恢复曲线右移,提示Ⅳ能延长瞬时外向钾通道的失活后恢复时间。
  (2)Ⅳ对大鼠心室肌细胞钠电流(INa)的影响
  随着给药浓度的增加,Ⅳ对INa抑制作用也逐渐增强。分别给予1μM、3μM和10μM的Ⅳ后,INa电流密度由给药前的(-99.28±2.63)pA/pF依次变为(-79.29±4.30)pA/pF、(-65.56±2.58)pA/pF和(-58.88±5.02)pA/pF(P<0.01,n=6),且I-V曲线明显上移。激活曲线:给药前的V1/2为(-15.6±0.42)mV,给予1μM、3μM和10μM的Ⅳ后,V1/2分别转变为(-7.28±0.43)mV、(1.24±0.48)mV和(11.55±0.44)mV(P<0.01,n=6)。失活曲线结果显示:随着给药浓度的增加,失活曲线显著左移,其V1/2逐渐向超极化的方向迁移[对照组的V1/2:(-74.98±0.52)mV;Ⅳ组中的V1/2:1μMⅣ,(-81.15±0.34)mV(P>0.05,n=6);3μMⅣ,(-93.27±0.55)mV;10μMⅣ,(-102.6±0.26)mV(P<0.01,n=6)]。同时,给药后INa的失活后恢复曲线右移,且恢复时间明显延长,1μM的Ⅳ使τ由给药前的(8.16±0.45)ms延长到(13.49±2.01)ms(P<0.01,n=6),而3μM和10μM的Ⅳ则使τ分别延长至(17.65±0.89)ms和(22.27±0.52)ms(P<0.01,n=6)。
  (3)Ⅳ对大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流(ICa-L)的影响
  给予Ⅳ前ICa-L的电流密度为(-23.69±2.34)pA/pF,随着药物浓度的增加,ICa-L峰值电流密度逐渐降低[1μM:(-18.14±2.10)pA/pF;3μM:(-12.81±1.97)pA/pF;10μM:(-6.61±1.30)pA/pF(P<0.01,n=6)],但药物洗脱后的ICa-L电流密度(-21.84±1.08)pA/pF(P>0.05,n=6)与给药前相比则无显著性差异。激活曲线:不同浓度的Ⅳ使ICa-L的V1/2由用药前的(-15.18±0.30)mV分别提高至(-6.03±0.43)mV,1μM;(1.98±0.39)mV,3μM;(10.69±0.71)mV,10μM(P<0.01,n=6)。同时,给药后ICa-L的失活曲线显著左移,即向膜电位的负值方向移动,药物浓度分别为1μM、3μM和10μM的Ⅳ使ICa-L的V1/2由(-17.56±0.93)mV分别降至(-28.03±0.72)mV、(-43.31±0.82)mV和(-53.10±0.63)mV(P<0.01,n=6)。而ICa-L的失活后恢复曲线τ随药物浓度的增加而增加,给予1μM和3μM的Ⅳ使τ由给药前的(13.45±0.36)ms分别升高到(18.36±0.61)ms和(22.64±0.18)ms(P<0.01,n=6),而浓度为10μM的Ⅳ与用药前相比τ升至(26.69±0.57)ms(P<0.01,n=6)。
  3、不同溶剂对大鼠心室肌细胞INa的影响
  以钠电流为参考指标检测不同浓度的溶剂(甲醇和DMSO)对INa的影响,结果显示:甲醇和DMSO的含量为0.1%时,对INa无明显影响;而随着细胞外液甲醇含量的增加,对INa具有抑制作用;另外,分别使用两种不同的溶剂(在细胞外液中含量为0.1%)对药物进行溶解对比发现实验结果无明显变化。
  结论:
  Ⅳ对大鼠心肌细胞上几个主要的离子通道(Ito、INa和ICa-L)均有不同程度的抑制作用,此作用可能与Ⅳ的心肌保护效应有关。
[硕士论文] 万丹
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:栖息于特殊生态环境的微生物,如:生活在高温、高寒、高渗、高压等极端环境的微生物、海洋微生物、植物内生菌、动物共生菌、稀有放线菌和粘细菌等,在其生命进化历程中,为适应外部特殊环境,形成特殊的代谢途径,因此,能产生特殊的次生代谢产物,为新药研制提供丰富的先导化合物。
  前期实验从牡蛎共生球毛壳菌C.globosum ML-4、黄花蒿内生菌M.roridum IFB-E012、白茅内生菌C globosun IFB-WQ、海带内生菌Alternaria sp.TSJ-HD-1和海洋真菌P.janthinellum HK1-6中分离获得21个天然化合物,本学位论文首先采用MTT法测定了这21个特境微生物天然产物的体外抗肿瘤活性,测试的肿瘤细胞株为人肝癌细胞株SMMC-7721和人胃癌细胞株SGC-7901,阳性对照药为顺铂和5-氟尿嘧啶。结果发现,mytoxin B对SMMC-7721细胞具有显著的增殖抑制作用,IC50值为0.15±0.04μg mL-1;guxi-2、penicilone C、penicilone D、H7和H8对SMMC-7721细胞有强增殖抑制作用,IC50值分别为2.15±1.51、11.00±1.40、13.74±2.09、12.13±1.53和8.76±1.44μg·mL-1;myrothecine A、tricycloaltemarene3a、2H-(2E)-tricycloaltemarene12a、penicilone B和penicilone A对SMMC-7721细胞有较强的增殖抑制作用,IC50值分别为25.5±1.19、45.81±4.58、49.72±1.13、15.29±1.82和28.62±4.03μg mL-1;chaetoglobosin V和tricydoalternarene F对SMMC-7721细胞有明显的增殖抑制作用,IC50值为60.5±0.93和80.31±3.84μg·mL-1;其它化合物无明显活性。还发现,化合物guxi-2对SGC-7901细胞有强增殖抑制作用,IC50值为15.21μg·mL-1。在上述研究基础上,本学位论文进一步研究了活性化合物guxi-2、chaetoglobosin V、mytoxin B和myrothecine A的体外抗肿瘤活性机制。
  Guxi-2是从黄花蒿内生菌M.roridum中分离获得的一个新环十肽化合物,研究发现,其能浓度依赖性地引起SGC-7901细胞G1期细胞周期阻滞;其能诱导SGC-7901细胞凋亡,50μg·mL-1时凋亡率为21.91±4.26%;guxi-2能明显降低SGC-7901细胞的迁移速率,50μg·mL-1时划痕宽度没有明显变化,且细胞过膜数量明显下降;guxi-2处理后的细胞中,Bcl-2表达下降、Bax表达增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达增加。结果表明,guxi-2对SGC-7901细胞的体外抗肿瘤活性与诱导G1期细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和降低细胞迁移速率有关,其诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径。
  Chaetoglobosin V是从牡蛎共生球毛壳菌C.globosum ML-4发酵液中分离获得的一个细胞松弛素化合物。研究发现,其能浓度依赖性地引起SMMC-7721细胞G2期细胞周期阻滞;可诱导SMMC-7721细胞凋亡,50μg mL-1时凋亡率达到21.89±5.52%;chaetoglobosin V处理后的细胞中,Bcl-2表达下降、Bax表达增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达增加,Akt蛋白表达和其磷酸化水平下降。上述结果表明,chaetoglobosin V对SMMC-7721细胞的体外抗肿瘤活性与诱导G2期细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关,且该诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径,并与PI3K/Akt信号通路活性相关。
  Mytoxin B(倍半萜部分含12,13-环氧基)和myrothecine A(mytoxin B的10,13-碳环衍生物)是从黄花蒿内生菌M.roridum IFB-E012中分离获得的两个单端孢霉烯大环内酯化合物。研究发现,mytoxin B能显著诱导SMMC-7721细胞凋亡,1μg·mL-1时凋亡率就达到22.62±0.64%,myrothecine A诱导凋亡作用较弱,50μg mL-1时凋亡率仅为8.85±0.11%;mytoxin B和myrothecine A处理后的细胞中,Bcl-2表达皆下降、Bax表达皆增加,同时Caspases-3,-8,-9蛋白表达皆增加;还发现,Akt蛋白及其磷酸化水平皆下降,使用PI3K抑制剂LY294002做对照实验发现,这两个化合物与LY294002具有相似的活性,且与LY294002存在一定的协同作用;此外,ERK蛋白表达和其磷酸化水平皆下降,p38蛋白表达和其磷酸化水平皆增加。综上可知,mytoxin B和myrothecine A对SMMC-7721细胞的体外抗肿瘤活性与诱导细胞凋亡有关,且该诱导凋亡作用可能同时涉及线粒体途径和死亡受体途径,并与PI3K/Akt和MAPK信号通路活性相关。
[硕士论文] 孙若男
生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:RAS相关蛋白家族成员Rap2b是一种新发现的p53下游靶基因。当p53+/+细胞受到外源性刺激时(如阿霉素给药),p53被激活,导致细胞内Rap2b蛋白的表达量显著增加,从而促进肿瘤细胞的生存。推测,Rap2b是一个有效的肿瘤治疗靶点。为此,本文设计了一种以纳米材料为载体的药物/基因递送系统,用于评估Rap2b siRNA作为一种抗肿瘤治疗药物的潜力。同时本文通过研究Rap2b与p53之间的相互作用,为阐明Rap2b siRNA的抗肿瘤机制提供重要线索。
  首先,为了便于后续实验,制备了Rap2b单克隆抗体。共得到八个单克隆抗体稳定细胞株。酶联免疫吸附实验结果显示八株均为IgG1类抗体。同时免疫印迹法结果显示抗体的最低使用浓度为0.1μg/mL,所能检测到的蛋白最低量为5ng。
  然后,通过氯金酸法合成了金纳米壳颗粒,并将合成的Rap2b siRNA和阿霉素连接到金纳米壳上。纳米粒子与HCT116细胞共孵育后,在荧光显微镜下可见装载有阿霉素和Rap2b siRNA的金纳米壳被肿瘤细胞吸收。激光照射能显著促进金纳米壳释放阿霉素和Rap2b siRNA,而且释放的Rap2b siRNA能显著降低细胞内Rap2b的表达水平。
  接着,通过体外和体内实验评价了不同药物联用对肿瘤细胞的杀伤效应。结果显示,降低Rap2b的表达水平能显著增强阿霉素对于肿瘤细胞的杀伤效果。同时,激光照射纳米粒子产生的热能能对肿瘤细胞产生额外的杀伤作用,进一步提高了阿霉素的肿瘤治疗效果。
  最后,通过体外GST pulldown实验和体内双分子荧光互补实验证明了Rap2b与p53之间存在直接相互作用。为了确定这两种蛋白互作的结构域,构建了一系列Rap2b和p53的截短突变体,再通过体外GST pullldown实验和双分子荧光互补实验确定了Rap2b的第41-135位氨基酸残基和p53的DNA结合结构域是二者直接相互作用的区域。
  综上所述,本研究证明了Rap2b siRNA能显著增强阿霉素的抗肿瘤疗效,而且Rap2b能与p53直接结合,推测Rap2b可能通过与p53直接结合而负反馈调控p53的活性。这些发现有助于深入理解Rap2b和p53在肿瘤发生发展和耐药性形成中的作用,为抗肿瘤药物的研发提供了新靶点,对于恶性肿瘤的防治具有重要意义。
[硕士论文] 金槿
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:不良的药代动力学特征,药物的毒副作用,特别是药物耐药性的出现,使化疗药物在临床肿瘤治疗中的效果大幅降低。而海洋复杂多变的生存环境,赋予了生活在其中的生物特殊的抵御手段,这些化学或者生物适应产生了许多具有特殊生物活性和潜在抗肿瘤效应的化合物。Thiocoraline即噻可拉林,为含硫缩肽,是一种DNA双嵌插剂,最初是从海洋单胞菌Micromonospora marina中分离得到,在抗癌活性方面有很好的效果。
  本课题以thiocoraline为研究对象,研究thiocoraline抗肿瘤活性及乳腺癌对thiocoraline产生耐药的分子机制。使用MTT法检测thiocoraline对MCF-7细胞,L-02细胞的毒性作用;利用MTT法和结晶紫染色比较thiocoraline和doxorubicin对MCF-7细胞的作用效果;流式细胞术检测thiocoraline对细胞周期的影响;Hoechst33342和Western Blot检测thiocoraline诱导细胞凋亡情况;通过浓度梯度递增法培养得到对thiocoraline耐药的MCF-7/T细胞株,并确定其耐药指数。利用生长曲线和克隆形成实验比较MFC-7细胞与MCF-7/T耐药细胞的生物学特征。通过半定量PCR初步筛选出与thiocoraline相关的耐药靶点;qPCR,Western Blot进一步分析比较耐药细胞MCF-7/T与MCF-7细胞之间的差异。针对Akt位点,用慢病毒构建的MCF-7/Akt1细胞株和Akt磷酸化抑制剂MK-2206HCl,通过MTT法及Western Blot实验深入研究thiocoraline引起MCF-7耐药的分子机制。利用MK-2206HCl抑制MCF-7/T耐药细胞中Akt蛋白的磷酸化,通过MTT法检测其逆转MCF-7/T耐药细胞对thiocoraline耐药性的作用效果。
  MTT法和结晶紫实验结果表明thiocoraline对MCF-7细胞具有显著的杀伤活性,在纳摩尔级的浓度下即可发挥抗肿瘤效应。肝正常细胞L-02对thiocoraline不敏感,当thiocoraline浓度为100nmol/L时,L-02细胞的成活率为69.43±13.48%。Thiocoraline对MCF-7细胞48h的IC50值为53.8±2.53nmol/L,与doxorubicin相比,对肿瘤细胞有更高的细胞毒性。流式细胞仪分析MCF-7细胞周期结果表明,thiocoraline可将MCF-7细胞的细胞周期阻滞在S期,从而抑制肿瘤细胞的增殖。Hoecst33342染色和Western Blot实验结果显示,thiocoraline可通过激活Caspase通路而诱导细胞发生凋亡。在前期系列天然产物抗肿瘤活性研究基础上,针对乳腺癌细胞耐药性这个突出问题,以乳腺癌耐药细胞MCF-7/T为研究模型,筛选与thiocoraline耐药相关的蛋白,深入探究影响肿瘤细胞对药物敏感性的因素。通过细胞生长曲线和克隆形成实验发现MCF-7细胞在体外的增殖速率高于MCF-7/T细胞。qPCR和Western Blot实验显示,thiocoraline作用MCF-7细胞后,引起Akt蛋白磷酸化,长期作用下使下游乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistant Protein,BCRP)的表达水平升高,通过PI3K/Akt/BCRP通路诱导细胞产生耐药性。MTT实验结果表明,MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,随着细胞内Akt蛋白磷酸化水平的提高而降低。使用Akt磷酸化抑制剂MK-2206HCl可显著提高MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,并且可部分逆转MCF-7/T耐药细胞对thiocoraline的耐药。
  总之,thiocoratine长期处理可使MCF-7细胞通过PI3K/Akt/BCRP通路产生耐药性,而MK-2206HCl通过抑制Akt蛋白磷酸化,显著提高MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,上述实验结果表明抗肿瘤活性化合物thicoraline联合Akt磷酸化抑制剂MK-2206HCl,或许可以避免化疗药物耐药性,为乳腺癌的临床治疗研究提供相关实验依据。
[博士论文] 刘军
微生物与生化药学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:天然产物是新药发现的重要来源。自然界中存在许多含量及其丰富的大宗天然产物,这类天然产物具有含量大、种类多、结构复杂、廉价易得等特点,同时大宗天然产物价格普遍偏低、生产附加值微薄。萜类化合物在自然界分布广泛、种类繁多,是天然产物中最多的一类,其中又以二萜类化合物结构类型最为丰富,且具有如抗肿瘤、抗微生物、心血管保护等药理活性,成药性强,许多二萜类化合物已成为临床药物上市,如紫杉醇、穿心莲内酯等。
  借助天然产物复杂的骨架结构、广泛的生物学活性,一方而以大宗天然产物为原料,直接对其进行结构修饰与改造,提高生物活性、降低毒副作用,增强成药性;另一方面可以聚焦结构复杂、制备成本高昂的上市小分子药物,利用与其结构相似的大宗天然产物骨架或结构片断,对天然产物进行有针对性的结构改造,借助其核心骨架或结构片断,同时引入关键药效基团,制备结构新颖的衍生物,研制活性更强、安全性更高的创新药物。同时,能够简化制备工艺、降低生产成本,提高大宗天然产物的利用价值。
  蛋白酶激活受体-1(Protease-activated receptor1,PAR1)是近些年新发现的抗血小板药物靶点,抑制PAR1受体能够阻断由凝血酶介导的血小板聚集和病理性血栓扩大的过程,但不影响由TXA2和ADP参与的人体正常保护性止血过程。因此,PAR1抑制剂具有安全高效的特点。美国默沙东公司在天然产物喜巴辛结构的基础上,经结构优化研发出第一个小分子PAR1拮抗剂Vorapaxar,并于2014年在美国上市,主要用于有心脏病发作史的患者和下肢动脉栓塞的患者,临床效果明显。然而其结构复杂(具有7个手性中心)、合成路线长(线性合成步骤为16步)、制备成本高,同时该药生物半衰期较长(126-269h),当副作用发生时,没有合适的药品能够抵抗和缓解这种副作用,存在安全风险。
  同时,我们发现二萜类化合物穿心莲内酯结构中稠合二环手性中心的构象与Vorapaxar结构中对应部分的关键手性中心完全一致。因此,我们借助穿心莲内酯的骨架结构,在确保其关键手性中心构象不变的前提下,与Vorapaxar中的重要的药效团杂合,快速高效地制备了一系列结构新颖的Vorapaxar类似物。通过体外活性评价,筛选出活性优良的PAR1小分子拮抗剂,以PAR1抑制活性及药代动力学参数为指导,进行不断的结构优化,提高活性,改善药代动力学性质,最终发现具有全新结构的PAR1小分子拮抗剂Ⅰ-39。该化合物具有显著的PAR1抑制活性,IC50为1.1μM;体内外实验均证实其能够显著抑制由凝血酶及TRAP诱导的血小板聚集,IC50分别为0.65μM和1.6μM,同时对胶原蛋白和ADP诱导的血小板聚集没有抑制作用,显示出良好的选择性。同时药代动力学研究表明化合物Ⅰ-39口服生物利用度高达52.5%,且半衰期为3.1h,半衰期较Vorapaxar明显缩短,能够大幅降低Vorapaxar由于半衰期过长,药物易体内蓄积导致的出血风险。重要的是,借助于穿心莲内酯的手性骨架,化合物Ⅰ-39的合成路线(9步)较Vorapaxar明显缩短,收率显著提高(21%)、成本明显降低,是潜在的具有全新结构的新一代PAR1小分子拮抗剂。
  我们课题组前期在对化合物库中的萜类化合物进行抗真菌活性筛选时,发现许多四环二萜类化合物具有良好的抗真菌活性,其中大多含有α,β-不饱和酮基团,然而由于天然产物量的限制,无法对其进行多样化的修饰以进一步提高活性。大宗天然产物甜菊苷在酸性条件下的水解产物异甜菊醇是具有典型四环二萜结构的化合物。抗真菌活性评价发现其具有较弱的抗真菌活性,MIC为256μg/mL。在异甜菊醇骨架的基础上构建环外α,β-不饱和酮基团,其活性提高了4倍,MIC=64μg/mL。进一步在其结构的基础上,连接线粒体靶向基团三苯基磷阳离子,靶向线粒体,发现其抗真菌活性又提高了约8倍,MIC=8μg/mL。我们在此基础上,通过改变连接链的类型及长短等多样化的修饰,衍生出一系列化合物,活性筛选出活性最优化合物Ⅱ-31,其MIC达到0.5μg/mL,强于两性霉素B。
  进一步对其进行多种菌株活性评价,包括外排泵过表达株、临床耐药株等,都显示出强大的抑菌及杀菌作用,能够克服真菌耐药问题。同时继续深入的机制研究发现化合物Ⅱ-31能够升高线粒体膜电位、同时刺激胞内ROS的产生,从而损伤线粒体,另外线粒体外膜蛋白Tom70的分布由正常的管状分布变为聚集状分布,进一步证实化合物Ⅱ-31能损伤线粒体导致细胞死亡。被膜的形成是真菌耐药的主要原因之一,我们研究发现化合物Ⅱ-31不仅能抑制被膜形成,同时具有显著的清除成熟被膜的作用。进一步我们通过构建秀丽隐杆线虫-白色念珠菌感染模型,发现化合物Ⅱ-31能显著提高感染线虫的生存率,且毒性较低。
  总之,通过借助廉价易得的大宗天然产物异甜菊醇的基本骨架,衍生出一系列具有抗真菌活性的化合物,进一步结构优化得到活性最优化合物Ⅱ-31,其不仅能够抑制真菌生长,也能杀灭真菌,且能杀死耐药菌,同时能够抑制被膜形成,清除成熟被膜,是潜在的能够克服真菌耐药的新型抗真菌药物。
  另外,我们课题组在前期的研究中还发现,具有不饱和酮基团的四环二萜类化合物具有显著的抗肿瘤活性。我们对以异甜菊醇为骨架构建环外不饱和酮基团的化合物Ⅱ-14进行抗肿瘤活性筛选,发现其具有良好的抗肿瘤活性,IC50值在10μM。我们以其为底物,通过形成二聚体或连接多样化的不饱和酮基团,从而增加药效团。另外,通过连接碱性基团靶向溶酶体,得到一系列衍生物。进一步活性筛选证实部分新得到的衍生物抗肿瘤活性有所提高,然而未达到我们的期望值,我们需要进一步结构优化。由于A环除羧基外,缺少可修饰基团,尚无人做过改造。我们首次在A环构建不饱和酮及五元不饱和内酯活性基团,得到一系列结构新颖的衍生物,对其进行活性筛选,得到具有良好活性的先导化合物Ⅲ-32,IC50值为2μM。进一步以化合物Ⅲ-32为底物,进行结构优化,通过对D环引入曼尼希碱、肟等碱性基团,同时通过Baeyer-Villiger重排、Beckman重排等多样化的构建内酯、内酰胺环等,进一步得到一系列结构新颖的衍生物,对其进行活性筛选,发现D环具有肟甲醚基团的化合物Ⅲ-53活性最优,IC50值为0.29μM。进一步对其进行机制研究,表明化合物Ⅲ-53主要通过诱导LMP,破坏溶酶体,导致细胞死亡。化合物Ⅲ-53抗肿瘤活性显著,具有发展成为抗肿瘤候选药物的潜力。
  总之,我们借助大宗天然产物穿心莲内酯及异甜菊醇的骨架结构,简便快捷、有针对性地构建了几个系列结构新颖的衍生物,经过不断的结构优化,发现了几个活性显著,极具成药性的小分子化合物,实现了大宗天然产物的高值化利用。
[硕士论文] 伍欢
地理环境与污染控制 浙江师范大学 2018(学位年度)
摘要:碘代乙酰胺(Iodinated haloacetarnides,I-HAcAms)是饮用水中的新兴消毒副产物(disinfection by-products,DBPs),因为极强的细胞毒性受到广泛关注,是一类高毒性的含氮消毒副产物(N-DBPs)。但到目前为止,对I-HAcAm的研究报道却较少,大多集中于形成原理。仅有IAcAm有相对详细的毒理学报道,其他3种I-HAcAm的毒性机制仍有待研究。因此,有关I-HAcAm细胞毒性的相关研究工作十分值得开展,以期为水务工作者提供更好的毒理学依据,给他们调控DBPs提供方向。基于此,本研究选取4种I-HAcAms,分别是二碘乙酰胺(diiodoacetamide,DIAcAm),碘乙酰胺(iodoacetamide,IAcAm),溴碘乙酰胺(bromoiodoacetamide,BIAcAm),氯碘乙酰胺(chloroiodoacetamide,CIAcAm),并选用人肝癌细胞HepG-2细胞作为研究对象,探讨这四种I-HAcAms的细胞毒性及可能的毒性机制。结果如下:
  1)4种I-HAcAms均会引起HepG-2的细胞毒性,细胞毒性强弱为:DIAcAm>IAcAm>BIAcAm>CIAcAm。细胞毒性呈现浓度时间依赖性,随着浓度增加,暴露时间延长,细胞毒性增强。其中,DIAcAm、BIAcAm和CIAcAm的IC50值与正辛醇-水分配系数(logarithm of the octanol-water partition coefficient,log P)高度相关,log p值越大,亲脂性越强,穿过细胞膜的能力也越强,造成的细胞毒性越大。IAcAm的毒性高于二卤代的BIAcAm和CIAcAm是因为与之相比,卤素原子少,并且碘离子的键长长,解离能弱,很容易离去,对细胞造成毒性。
  2)4种I-HAcAms均会刺激HepG-2的ROS产生,ROS生成势大小为:DIAcAm>IAcAm>BIAcAm>CIAcAm。ROS的生成呈现浓度依赖性,随着浓度增加,ROS的生成量增加。除了ROS,Nrf-2和GCLC也是反映细胞氧化应激水平的关键指标。Nrf-2在机体内是维持氧化还原状态的一个元件,GCLC是其下游的一个抗氧化酶。实验表明,I-HAcAm会使HepG-2细胞中的Nrf-2和GCLC的基因蛋白表达水平上调,并且随着浓度的增加而增加,佐证了I-HAcAms会导致HepG-2细胞氧化损伤。
  3)4种I-HAcAms均会导致HepG-2的细胞凋亡产生。细胞凋亡率排序为:DIAcAm>IAcAm>BIAcAm>CIAcAm。细胞凋亡呈现浓度时间依赖性,随着浓度增加,暴露时间延长,凋亡率呈上升趋势。Bax和Bcl-2分别是促凋亡基因蛋白和抗凋亡基因蛋白。I-HAcAms会使HepG-2细胞中的Bax基因蛋白表达上调,Bcl-2基因蛋白表达下调。随着浓度的增加,Bax/Bcl-2比值越大,凋亡越明显。
  4)抗氧化剂NAC对细胞毒性有明显的缓解作用。当HepG-2细胞在抗氧化剂NAC的预处理下,再暴露于I-HAcAms时,由于I-HAcAms引起的细胞抑制和ROS的产生都会得到很好的缓解,甚至可以完全逆转细胞毒性和氧化损伤。对于细胞凋亡来说,NAC对BIAcAm和CIAcAm引起的凋亡没有任何影响,但却可以部分缓解DIAcAm和IAcAm引起的凋亡。说明了I-HAcAms致使的细胞凋亡主要通过线粒体通路。
[硕士论文] 何丹
病理学与病理生理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  利用永生化人支气管上皮BEAS-2B细胞为研究对象进行低浓度纳米钴颗粒(Co nanoparticles,Nano-Co)慢性刺激,观察Nano-Co长期处理诱导细胞发生低氧损伤、DNA双链断裂损伤和基因组不稳定性及同源重组修复因子Rad52表达变化,初步探讨HIF-1α/miR-210靶向抑制同源重组修复因子Rad52在Nano-Co诱导细胞转化中的作用及可能的机制,为Nano-Co的安全性评价提供可靠的科学依据。
  方法:
  1.免疫荧光染色法检测DNA双链断裂损伤位点(foci)的形成,Western blot检测γ-H2AX的表达水平。观察低剂量Nano-Co长期处理对BEAS-2B细胞DNA双链断裂损伤的影响。
  2.胞质分裂阻滞微核细胞组学试验分析Nano-Co长期刺激对BEAS-2B细胞染色体稳定性的影响。
  3.qPCR、Western blot检测对照组和0.05μg/mL、0.1μg/mL Nano-Co处理15周后细胞同源重组修复因子Rad52mRNA和蛋白的表达情况。
  4.qPCR、Western blot检测细胞miR-210水平和HIF-1α蛋白的表达情况,分析低剂量Nano-Co长期刺激对HIF-1α/miR-210通路的活化作用。
  5.应用miR-210mimics及inhibitor质粒转染细胞的方法调节miR-210的表达水平,qPCR、Western blot检测细胞Rad52mRNA和蛋白的表达情况。
  6.双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-210与Rad52之间靶标关系。
  结果:
  1.细胞免疫荧光染色结果显示:实验组中DNA双链断裂损伤位点(foci)明显多于对照组;Western blot结果显示:实验组细胞γ-H2AX水平显着升高(P<0.05)。
  2.胞质分裂阻滞微核细胞组学试验分析结果显示:实验组细胞的微核数较对照组显著增多(P<0.05),并见核芽和核质桥。
  3.qPCR、Western blot结果显示:0.05μg/mL、0.1μg/mL Nano-Co处理15周后的实验组细胞Rad52mRNA和蛋白水平均明显低于对照组(P<0.05)。
  4.Western blot、qPCR结果显示:0.05μg/mL和0.1μg/mL Nano-Co处理15周后的实验组细胞HIF-1α和miR-210水平显著高于对照组(P<0.05)。
  5.瞬时转染miR-210mimics,inhibitor,NC质粒至Nano-Co转化细胞,调控miR-210的水平,qPCR和Western blot检测RAD52mRNA及蛋白表达水平,结果显示:mimic组低于对照组、NC组(P<0.05);inhibitor组明显高于对照组、NC组(P<0.05)。
  6.双荧光素酶报告基因结果显示:miR-210inhibitor相对于miR-210inhibitor NC能上调野生型报告基因载体荧光素酶的活性(P<0.05),而空载和突变型载体无明显变化。
  结论:
  1.明确了Nano-Co长期刺激可引发细胞DNA双链断裂损伤及基因组的不稳定性。
  2.明确了Nano-Co长期刺激可引起细胞低氧损伤及同源重组修复因子Rad52的表达下调。
  3.Nano-Co长期处理促进HIF-1α/miR-210通路的活化及Rad52表达受抑是Nano-Co致细胞基因组不稳定性的重要影响因素,研究进一步证实Nano-Co长期刺激具有潜在的致癌性。
[硕士论文] 韩哲
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:国家计划生育政策的调整对希望孕育第二个孩子的家庭来说意义重大。但许多符合政策的妈妈年龄已超过最佳生育年龄。女性年龄超过35岁后生育能力显著下降,主要原因是卵泡数目减少和卵子质量明显降低。氧化应激造成的损伤逐渐积累被认为是卵巢发生老化的主要机制之一。卵巢内的活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)随着年龄增加而不断积累并影响卵子的质量。有证据表明通过食用某些抗氧化药物可减少细胞内ROS的积累,阻止卵子质量降低。藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,PC)是螺旋藻中一种具有抗氧化、抗炎和清除氧自由基功能的藻胆蛋白。本课题组前期研究结果表明,在D-半乳糖(D-Galactose,D-gal)诱导的致衰小鼠模型中,PC可以显著提高致衰雌鼠的产仔数量。体内实验进一步证明,PC可以显著改善卵子成熟质量,降低ROS水平,改善线粒体分布,抑制细胞凋亡。同时利用转录组学分析实验组与对照组小鼠卵巢组织,发现PC可以在一定程度上恢复因D-gal致衰引起的小鼠卵巢部分基因表达变化。但PC对自然衰老小鼠是否具有同样作用及其作用机理还不明确。
  本研究以自然衰老ICR雌性小鼠为研究模型,研究PC对其卵巢、卵子质量、产仔能力及幼仔发育的影响,并通过对卵巢抗氧化酶活力、端粒长度、端粒酶活性和卵子ROS水平、线粒体功能、细胞凋亡等的检测,研究PC对生殖能力的作用机理。
  实验结果显示,PC可以改善由自然衰老引起的卵巢重量和器官系数的降低。PC可以增加卵巢超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量以及阻止端粒缩短。同时,PC可以显著提高生发泡(Germinal vesicle,GV)期卵子生发泡破裂(Germinal vesicle breakdown,GVBD)及第一极体(The first polar body,PB1)排放率、降低DNA双链断裂数目、恢复H3K4me2水平。并且可以增加第二次减数分裂中期(Metaphase II,MII)卵子数目,提高卵子受精率。此外,PC可以恢复由自然衰老引起的纺锤体-染色体复合体异常(Spindle-chromosome complexs,SCCs)。PC还可以改善卵子线粒体分布,抑制ROS水平,减少卵子凋亡,进而提高小鼠生殖能力。
  综上所述,我们的结果表明PC可能通过ROS途径挽救由自然衰老引起的小鼠生殖能力下降,这些结果为PC在治疗衰老相关生殖缺陷的临床应用提供了依据。
[硕士论文] 闫晨静
食品科学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:牛磺酸是人体内的一种非蛋白质氨基酸,具有特殊生理活性。近年来对于牛磺酸功效作用的研究有很多,但有关对抑郁的干预研究鲜有报道。国内外市售牛磺酸的来源主要分为天然提取和化学合成两种,因天然牛磺酸存在提取率低、成本高的问题,化学合成牛磺酸已占据市场主流,但对于合成牛磺酸与天然牛磺酸的功效是否存在差异一直备受争议,目前对于两种牛磺酸的生物活性对比也鲜有研究。本试验以天然与合成两种来源的牛磺酸为试验材料,主要研究牛磺酸的抗疲劳作用和对抑郁模型动物的干预效果及机理,并进行两种牛磺酸的功能对比。
  以天然牛磺酸和合成牛磺酸为试验材料,通过建立小鼠力竭运动模型,研究牛磺酸的抗疲劳作用,并对两种牛磺酸进行功能对比。结果表明两种牛磺酸在1和2g/kg·bw剂量条件下能够显著增加小鼠力竭运动时间,升高力竭运动小鼠血清葡萄糖水平,降低血清LD、BUN、AST、ALT水平,增强LDH活性,同时减少肝脏、肌肉中糖原的消耗,提高SOD活性,降低MDA含量,改善相关生化指标。提示牛磺酸具有缓解运动性疲劳的作用,且总体而言两种牛磺酸未出现明显差异。
  以天然牛磺酸和合成牛磺酸为试验材料,通过建立行为绝望模型、利血平诱导抑郁模型和慢性不可预知应激模型,研究牛磺酸对抑郁的干预作用,并对两种牛磺酸进行功能对比。结果表明两种牛磺酸在1和2g/kg·bw剂量条件下可显著降低小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间,增加小鼠自主运动水平,并缓解利血平诱导的小鼠眼睑下垂,同时升高抑郁小鼠脑组织5-HT、DA、NE含量,降低MAO活性,升高BDNF、T3、T4含量,降低CRF、ACTH、COR、TSH水平,改善相关生化指标。提示牛磺酸对行为绝望模型、利血平诱导抑郁模型和慢性不可预知应激模型均具有干预抑郁的作用,且总体而言两种牛磺酸未出现明显差异。
  本研究通过建立力竭运动模型和三种抑郁模型对两种牛磺酸的抗运动作用、抑郁干预作用进行了研究,并对相关行为学实验、生化指标进行了分析,为牛磺酸相关功能性产品的开发推广提供参考和理论依据。研究结果表明,牛磺酸具有显著的抗疲劳作用和对抑郁的干预作用,推测牛磺酸干预抑郁作用机制与神经单胺递质假说、神经内分泌假说和脑源性神经营养因子假说密切相关,具体作用通道及作用原理有待进一步研究探讨。试验结果显示,两种牛磺酸作用结果虽在数值上略有差异,但总体差异不大,表明合成牛磺酸的抗疲劳效果及对抑郁模型小鼠的干预作用与天然牛磺酸相当,可作为天然牛磺酸的有效替代品。
[硕士论文] 李雯镜
环境工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:苯并三唑类紫外稳定剂(benzotriazole ultraviolet stabilizers,BUVSs)因具有良好的紫外吸收能力广泛应用于个人护理品与工业产品中,近年来在水环境中广泛检出。由于其环境持久性和生物富集性,BUVSs近年来得到广泛关注。然而目前关于BUVSs对水生生物的毒性研究刚刚起步,尤其是BUVSs对鱼类脑组织的毒性效应及其作用机制尚不明确。本论文以斑马鱼作为模式生物,选取环境中检出率较高的4种BUVSs(UV-234,UV-326,UV-329,UV-P)对斑马鱼幼鱼进行28天的暴露,暴露浓度为10,100μg/L。通过转录组测试、毒性作用通路分析,结合定量PCR验证,分析比较了4种BUVSs对脑组织的毒性作用。主要结论如下:
  通路分析表明,4种BUVSs的共有作用通路共81条,仅占总数的9.9%,其中,多条作用通路与免疫系统相关,这些通路包括B细胞活化、白细胞分化、T细胞浸润、免疫刺激、免疫调剂和补体激活交替。
  UV-234,UV-326,UV-329和UV-P的特异性通路分别有97、106、68、116条,其中UV-234主要影响线粒体呼吸链相关通路,可引起斑马鱼线粒体功能损伤;UV-326主要作用于斑马鱼中枢神经系统,可抑制HMGB1和IL1B相关通路;UV-329可影响多巴胺的摄取,引发神经毒性;UV-P则可能干扰肾上腺素信号传导,影响氧化应激。
  为了进一步验证转录组测试结果,选取aldob,bhmt,pck2,diabloa,mgst1.1这5个关键基因进行了mRNA水平的验证,结果表明目标基因的定量PCR结果和转录组测试结果一致,其中mgst1.1在100μg/L UV-329暴露组的表达水平显著上调4.93倍,而pck2则在10,100μg/L UV-P暴露组受到了显著抑制,分别下调31.40倍和23.11倍。
  综上,这些结果表明,BUVSs可能作用于斑马鱼的免疫系统,引起神经免疫毒性。同时,不同结构的BUVSs对斑马鱼脑组织的分子作用模式不同,可能导致其免疫毒性作用机制的差异。
[硕士论文] 焦冰清
食品加工与安全 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:我国稀土元素含量较为丰富,镧元素所占比例较大,其中镧元素化合物硝酸镧的毒性最大,且硝酸镧常作为稀土微肥运用到农作物生产中,长期使用会蓄积在农作物中,对机体产生一定的毒害作用。国内外研究学者也对其进行了探索,但对大鼠的免疫毒性方面的研究不够成熟,故本试验研究了硝酸镧对大鼠免疫功能的影响,将160只大鼠按照体重分为两批,每批80只,雌雄各半,分为灌胃剂量为2,20,60mg/kgBW的低、中、高剂量组及用等量蒸馏水灌胃的对照组,第一批探索硝酸镧对大鼠一般毒性、血液学指标及非特异性免疫指标的影响,第二批探索大鼠特异性免疫指标的影响,观察各指标间各组数据有无显著差异,试验结果如下:
  1.硝酸镧未对大鼠一般毒性产生显著影响。大鼠体重、进食量和总食物利用率,主要脏器比、脏体比硝酸镧各剂量组较对照组无显著差异(P>0.05)。病理结果表明,雌雄大鼠肝脏、肺脏产生病变,考虑与受试物有关,需进一步考察。
  2.硝酸镧对大鼠血液学方面产生一定影响,但未出现显著变化趋势。血常规指标白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、平均血红蛋白浓度、血小板计数、淋巴细胞比率、嗜酸性粒细胞比率、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、凝血酶原消耗试验、平均血红蛋白量与正常值相比均有显著性变化(P<0.05)。血生化指标碱性磷酸酶、胆固醇及血糖值与正常值相比均出现明显变化(P<0.05)。
  3.硝酸镧对大鼠体液免疫产生促进作用,未对其细胞免疫产生影响;对大鼠非特异性免疫方面产生了显著影响,出现了低浓度促进,高浓度抑制的趋势。
  特异性指标显示,雌鼠硝酸镧高剂量组空斑细胞数(PFC)显著高于对照组(p<0.05)。淋巴细胞增殖能力硝酸镧剂量组与对照组比较无显著性差异(p>0.05)。
  非特异性指标显示,血清细胞因子水平硝酸镧各剂量组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。雄性大鼠硝酸镧高剂量组CD4/CD8、T、B、NK、细胞数均有显著性差异(p<0.05)。
  BMDS软件分析得出基准剂量下限BMDL为7.77mg/kg BW。证明硝酸镧对大鼠具有免疫毒性作用。
  通过染毒硝酸镧对大鼠一般毒性、血液学指标、体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫功能的影响,为硝酸镧的免疫毒理学方面提供资料,为每日允许摄入量(ADI)的制定提供依据。
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