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[硕士论文] 尹华
生理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究化疗药物羟基脲对非整倍体结肠癌细胞的作用效果,初步探讨非整倍体结肠癌细胞对羟基脲产生抗药性的可能机制。
  方法:1、采用可诱导性表达MAD2L1shRNA的HCT116细胞系(p53+/+HCT116-MAD2L1-shRNA),其中MAD2L1shRNA可通过盐酸强力霉素(doxycycline,Dox)诱导表达,经过Dox处理16h后撤药,可获得MAD2L1基因表达敲低的HCT116非整倍体细胞,即Dox(+);另取HCT116-MAD2L1-shRNA细胞加入同等量的Dox溶解液二甲基亚砜(DMSO),设为对照组,称为整倍体组,即Dox(-);2、在撤药后第3、6d,采用Western blot方法检测MAD2L1蛋白的表达;3、在撤药后第6d,采用染色体滴定法检测两组细胞非整倍体比率,运用CCK8方法检测两组细胞对不同浓度羟基脲(Hydroxyurea,HU)的抗药性;4、在撤药后第6d,加入5mM HU处理两组细胞48h,并设立空白对照组(未加HU处理的非整倍体组及整倍体组),采用RT-PCR法检测PUMA、BAX、NOXA、p21基因表达,采用Western blot方法检测Caspase-3、PUMA、BAX、p21、γ-H2AX蛋白表达水平;5、取敲除了p53基因的可诱导表达MAD2L1shRNA的HCT116细胞(p53-/-HCT116-MAD2L1-shRNA),经过上述相同方法处理,检测细胞生长及凋亡情况;6、用无血清培养基培养上述p53+/+和p53-/-细胞24h后,(设立有血清培养基培养的细胞为对照组),通过CCK8方法检测经不同浓度HU处理48h后的细胞活性;运用RT-PCR方法检测PUMA、BAX、NOXA、p21基因在药物处理后的表达情况。7、选取其他4种不同核型的结肠癌细胞,通过CCK8法检测其对HU的抗药性。
  结果:1、Dox撤药后第3d,与整倍体组Dox(-)细胞相比,非整倍体组Dox(+)细胞中MAD2L1蛋白质表达明显下降;撤药后第6d,Dox(+)细胞中MAD2L1表达基本恢复原有水平;2、p53+/+Dox(+)细胞在撤药后第6d,其非整倍体比率为92%,而DMSO处理的对照组Dox(-)细胞中非整倍体比率仅为6%;3、经不同浓度HU处理48h后,Dox(+)细胞的生长活性明显高于Dox(-)细胞,表明非整倍体Dox(+)细胞对HU具有抗药性;4、采用5mMHU处理Dox(-)和Dox(+)细胞后,两组绌胞凋亡基因表达均出现不同程度的上升,但Dox(+)细胞中PUMA、BAX、NOXA、p21mRNA水平上升程度较Dox(-)细胞低;随着HU药物浓度的增加,Dox(+)细胞中γ-H2AX、p21、PUMA、BAX、Caspase-3蛋白水平上升程度低于Dox(-)细胞;5、p53敲除细胞经不同浓度HU处理48h后,Dox(+)细胞对HU不具有抗药性;6、在p53敲除细胞中,随着HU浓度的上升,Dox(+)细胞中PUMA、BAX、NOXA、p21mRNA表达和Caspase-3、PUMA、BAX、γ-H2AX蛋白水平的上升程度与Dox(-)细胞无明显差别;7、相较有血清培养的HCT116细胞,经无血清处理的HCT116细胞对HU表现出抗药性,凋亡基因PUMA、BAX、NOXA、p21mRNA水平上升程度较有血清处理组小。8、在p53野生型的结肠癌细胞中,非整倍体Caco-2细胞相对整倍体HCT116细胞,对HU具有抗药性,而在p53功能缺失的结肠癌细胞中,非整倍体SW480细胞与整倍体HCT15细胞相比,对HU不具有抗药性。
  结论:1、相比于整倍体细胞,p53野生型的非整倍体结肠癌细胞对HU具有抗药性;2、在p53缺陷细胞中,非整倍体的抗药性消失;3、p53野生型非整倍体结肠癌细胞对HU抗药性的产生是由于非整倍体细胞中p53的激活抑制了细胞生长,而HU则特异性作用于生长期肿瘤细胞所致。
[硕士论文] 黄泽楠
外科学(骨科脊柱) 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  研究大鼠髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,NPMSC)的生物学特性及辛伐他汀对髓核间充质干细胞增殖及分泌功能的影响,探讨其作为内源性修复重建退变椎间盘的可行性。
  方法:
  取8周龄SD大鼠尾椎髓核组织,采用胶原酶及胰酶序贯消化法分离NPMSC并进行体外扩增培养。观察细胞形态并通过MTT法检测细胞增殖,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型及RT-PCR检测干细胞基因表达进行髓核间充质干细胞的鉴定。取第3代NPMSC施加不同浓度辛伐他汀干预(0mol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L及1μmol/L),在干预后1、3、7、14、21天通过CCK-8法检测细胞活力,RT-PCR检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter1,GLUT-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA表达。
  结果:
  原代细胞早期可形成葵花样细胞集落,传代后细胞生长较原代细胞明显加快,细胞形态以纺锤形为主。第3代细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD45及CD11b,与骨髓间充质干细胞具有相似的干细胞相关基因Sox2、Oct-4及Nanog表达水平。合适浓度(0.01μmol/L-0.1μmol/L)的辛伐他汀促进NPMSC增殖及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达,且0.1μmol/L浓度达到最强,而高浓度辛伐他汀(1μmol/L)对细胞增殖能力及HIF-1α、GLUT-1、VEGF的mRNA表达有明显抑制作用。辛伐他汀可使NPMSC中出现并促进Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA的表达,0.1μmol/L浓度达到最强。
  结论:
  合适浓度(0.01μmol/L-0.1μmol/L)的辛伐他汀可促进髓核间充质干细胞的增殖和细胞外基质的分泌,其机制可能与HIF-1α介导的信号通路有关。
[硕士论文] 周怀成
临床医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨术前2小时口服10%葡萄糖溶液对胃癌手术患者术前主观舒适度的影响,术后胰岛素抵抗、术后快速康复的影响。从而为胃癌手术患者术前禁食、禁饮方案的选择提供参考依据。
  方法:
  选取2017年06月至2018年03月在扬州市苏北人民医院胃肠外科进行胃癌根治术的60例患者为观察对象,随机分为治疗组(糖水组)、对照组(禁饮组)各30例,治疗组于术前2小时给予10%葡萄糖溶液500ml口服(15min内进食完毕);对照组术前12小时禁食,8小时禁饮。两组患者的围手术期管理均按照本科室常规的快速康复外科流程进行管理,并由同一组外科医师完成手术。分别在术前3小时和术前30分钟测定两组患者的主观舒适度,主要包括了口渴感、饥饿感。记录患者手术时间、术中出血量、首次排气时间、术后住院时间;记录患者术后并发症。在手术当天术前3小时、术后第1日和术后第3日清晨分别抽取患者外周静脉血,测定血糖浓度、血清胰岛素浓度,并用稳态模式评估法计箅胰岛素抵抗指数。
  结果:
  治疗组有1例患者未按要求口服葡萄糖溶液,将此1例患者剔出研究,其余共有59例入组对象完成实验,其中治疗组29例,对照组30例。研究过程中,无术中死亡病例,无因并发症死亡患者,所有患者均康复出院。
  1、治疗组29例,其中男性患者21例,女性患者8例,患者年龄64.07±6.81岁,BMI21.98±2.60kg/m2。对照组30例,其中男性患者21例,女性患者9例,患者年龄63.83±7.99岁,BMI21.92±2.59kg/m2。两组患者在性别、年龄、BMI指标等方面均无差异(P>0.05);
  2、治疗组患者术中出血量75.52±35.92ml、手术时间172.59±53.91分钟、其中行胃癌全胃切除术的患者14例,行胃次全切除术+淋巴结清扫的患者有15例。对照组患者术中出血量87.33±23.92ml、手术时间172.59±53.91分钟、其中行胃癌全胃切除术的患者16例,行胃次全切除术+淋巴结清扫的患者有14例。两组患者在手术时间、出血量、手术方式等两组数据上无统计学意义,(P>0.05);
  3、治疗组与对照组患者术前3小时饥饿感评分分别为3.21±0.89、2.75±1.01,口渴感评分分别为4.78±0.98、4.77±0.93,两组数据无统计学意义(P>0.05);两组患者术前30分钟饥饿感评分分别为1.63±0.37、3.14±0.92,口渴感评分分别为1.67±0.48、5.14±0.91,两组数据有统计学意义(P<0.01);
  4、治疗组与对照组患者术后首次排气分别为3.79±0.73d、3.73±0.58d,术后住院时间分别为10.69±1.23d、10.43±1.19d,两组数值无显著统计学差异(P>0.05);
  5、治疗组与对照组患者术前3小时血糖,术后第1天血糖,术后第3天血糖进行分析,均无统计学意义(P>0.05)。两组患者术前3小时的胰岛素浓度6.78±3.10mU/L、6.50±1.83mU/L,无统计学意义(P>0.05)。术后第1天胰岛素浓度分别为6.37±2.37mU/L、12.54±4.22mU/L,术后第3天胰岛素浓度分别5.56±1.86mU/L、10.03±2.56mU/L,均有统计学意义(P<0.01)。两组患者术前3小时的胰岛素抵抗指数分别为1.83±0.95、1.81±0.56,无统计学意义(P>0.05)。术后第1天胰岛素浓度分别为1.95±0.83、3.68±1.50,术后第3天胰岛素浓度分别1.58±0.60、2.84±0.96,均有统计学意义(P<0.01)。
  结论:
  1、术前2h口服10%葡萄糖水可减轻患者麻醉前的口渴感与饥饿感,提高患者的舒适度;
  2、术前2h口服10%葡萄糖水明显减轻胃癌患者术后胰岛素抵抗程度。
[硕士论文] 马宏昕
药理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探究川芎嗪(TMP)和丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)对SD大鼠心室肌细胞钠离子通道电流(INa)及其动力学特征的影响,并进一步探讨两种药物联合给予后通道电流及各动力学过程的变化。
  方法:
  室温下快速游离SD大鼠心脏,并迅速将其置于冰浴中,然后采用Langendorff主动脉逆向灌流酶解法获得单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录钠通道电流,以细胞外液灌流给药的方式观察不同剂量的TMP和TanshinoneⅡA单独和联合应用前、后INa的变化,进而分析药物影响前后钠离子通道电流的相关动力学特征变化。
  结果:
  1.TMP对钠通道电流的影响。
  (1)TMP作用的浓度依赖性
  TMP能浓度依赖性地抑制INa。当TMP浓度低于20μM时,其对INa无显著影响,但当药物浓度大于50μM时,随着药物浓度的增加,对电流的抑制作用也随之增强。其中,5μM和200μM的TMP使电流密度(INa-Peak)由给药前的(-81.32±3.28)pA/pF分别降为(-58.10±4.16)pA/pF和(-35.65±3.23)pA/pF(P<0.01,n=6)。
  (2)TMP对INa的电流-电压关系(I-V)曲线的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP能使INa的I-V曲线显著上移,但I-V曲线的轨迹变化趋势未发生变化。
  (3)TMP对INa激活动力学的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP能使INa的激活曲线右移。50μM和200μM TMP使半数激活电压(V1/2-ac)由给药前的(-42.92±0.24)mV分别变为(-41.20±0.19)mV和(-37.69±0.17)mV(P>0.05,n=6)。即TMP对通道的激活动力学无显著影响。
  (4)TMP对INa失活动力学的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP能使INa的失活曲线左移。50μM和200μM的TMP使半数失活电压(V1/2-m)由给药前的(-57.71±0.21)mV变为(-64.05±0.41)mV和(-69.85±0.39)mV(P>0.05,n=6)。TMP对通道失活动力学无显著影响。
  (5)TMP对INa失活后恢复动力学的影响
  在50~400μM浓度范围内,TMP使INa的失活后恢复曲线左移。50μM和200μM的TMP使恢复时间(τ)由给药前的(20.88±1.59)ms变为(18.65±1.38)ms和(15.62±0.8)ms(P>0.05,n=6)。即TMP对通道的恢复动力学无显著影响。
  2.TanshinoneⅡA对钠通道电流的影响。
  (1)TanshinoneⅡA作用的浓度依赖性
  TanshinoneⅡA能浓度依赖性地抑制INa。低于10μM的TanshinoneⅡA对INa无显著影响,但当浓度大于20μM时,随着药物浓度的增加,TanshinoneⅡA对INa的抑制作用逐渐增强,20μM和80μM的TanshinoneⅡA使INa-Peak由给药前的(-110.61±6.28)pA/pF分别降为(-87.28±5.76)pA/pF和(-54.53±3.15)pA/pF(P<0.01,n=6),呈显著的浓度依赖性抑制。
  (2)TanshinoneⅡA对INa电流-电压关系(I-V)曲线的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA使INa的I-V曲线显著上移,但I-V曲线的轨迹变化趋势未发生变化。
  (3)TanshinoneⅡA对INa激活动力学的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA对INa激活曲线无显著影响。20μM和80μM的TanshinoneⅡA使V1/2-ac由给药前的(-43.85±8.07)mV分别变为(-43.95±2.44)mV和(-43.99±0.79)mV(P>0.05,n=6),即TanshinoneⅡA对通道激活动力学特征无显著影响。
  (4)TanshinoneⅡA对INa失活动力学的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA使INa的失活曲线显著左移。20μM和80μM的TanshinoneⅡA使V1/2-in由给药前的(-52.15±0.96)mV分别变为(-64.87±0.99)mV和(-75.71±0.75)mV(P<0.05,n=6)。即TanshinoneⅡA使V1/2-m向超极化方向移动,加快了通道失活。
  (5)TanshinoneⅡA对INa失活后恢复动力学的影响
  在20~160μM浓度范围内,TanshinoneⅡA使INa的失活后恢复曲线右移。20μM和80μM的TanshinoneⅡA使τ由给药前的(11.52±1.18)ms变为(20.84±0.99)ms和(30.81±1.01)ms(P<0.05,n=6)。即TanshinoneⅡA可延迟通道的恢复。
  3.TMP和TanshinoneⅡA联合使用对钠通道电流的影响。
  (1)TMP和TanshinoneⅡA共同作用的浓度依赖性
  联合给予TMP和TanshinoneⅡA可浓度依赖性抑制INa。为了初步探讨药物联合应用后的效果及便于横向对照,设置了(20+50)μM、(40+100)μM、(80+200)μM和(160+400)μM四个浓度组合,结果发现随浓度梯度的增加,药物对INa的抑制作用增强,(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使INa-Peak(-103.94±6.58)pA/pF分别降为(-59.86±5.12)pA/pF和(-30.60±4.23)pA/pF(P<0.01,n=6)。相比两药单独使用,联合应用时对INa的抑制率更高,如50μM的TMP、20μM的TanshinoneⅡA和(20+50)μM的TanshinoneⅡA+TMP对的抑制率分别为(29.1±1.1)%、(19.1±1.1)%和(42.4±1.4)%(P<0.05,n=6),突出了两种药物联合使用的优势。
  (2)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa电流-电压关系(I-V)曲线的影响
  TanshinoneⅡA+TMP作用时同以上单独给药情况一样,可使INa的I-V曲线显著上移。(20+50)μM和(80+200)M的TanshinoneⅡA+TMP使Vpeak-30mV分别变为-25mV和-20mV(P<0.01,n=6),但I-V曲线轨迹变化趋势未发生变化。
  (3)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa激活动力学的影响
  TanshinoneⅡA+TMP使INa激活曲线右移,但无显著性影响。(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使V1/2-ac由(-42.74±0.43)mV分别变为(-42.32±0.4)mV和(-39.9±0.75)mV(P>0.05,n=6)。即TMP和TanshinoneⅡA联合给予对通道激活动力学特征无显著影响。
  (4)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa失活动力学的影响
  TanshinoneⅡA+TMP使INa的失活曲线左移。(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使V1/2-m由(-81.61±0.72)mV分别变为(-82.89±0.59)mV和(-88.21±0.49)mV(P>0.05,n=6)。即TMP和TanshinoneⅡA联合给予对通道失活动力学特征无显著影响。通过对比三种情况下V1/2-m的变化发现,两药联合给予对通道失活过程影响较小。
  (5)TMP和TanshinoneⅡA联合使用对INa失活后恢复动力学的影响
  TanshinoneⅡA+TMP使INa的失活后恢复曲线右移。(20+50)μM和(80+200)μM的TanshinoneⅡA+TMP使τ由给药前的(20.47±0.84)ms变为(30.22±0.97)ms和(31.62±1.02)ms(P<0.05,n=6),即TMP和TanshinoneⅡA联合给予可延迟通道恢复。通过对比三种情况下τ的变化发现,联合给予组可逆转TMP对通道恢复的加快,同时相比TanshinoneⅡA组,联合给予组对通道恢复过程影响较小。
  结论:
  川芎嗪和丹参酮ⅡA单独及联合应用时均可浓度依赖性抑制SD大鼠心室肌细胞钠通道电流,且两者联合应用后发挥的抑制作用更强,同时对通道激活、失活及失活后恢复动力学特征产生的影响较小。
[硕士论文] 徐蓉蓉
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:薏苡素(Coixol)是从薏苡、白茅、野甘草等植物中提取而来的无色针状结晶,也是薏苡种仁油抗癌制剂“康莱特注射液”中的主要活性成分之一。目前有很多关于康莱特注射液抗癌同时减轻癌症痛感的临床报道,也有文献报道薏苡素具有镇痛抗炎、抗菌、降糖等作用,研发薏苡素制剂可以满足临床用药的需求,具有实际应用价值。
  由于薏苡素的水溶性差,本实验采用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合薏苡素,同时考察薏苡素-HP-β-CD包合物的体外释药情况和稳定性等。此外,建立生物样品中薏苡素的HPLC测定方法,考察薏苡素及其包合物灌胃给药后在大鼠体内的药动学特征和组织分布情况,为薏苡素新制剂的应用提供基础实验依据。主要研究内容和结果如下:
  1、薏苡素-HP-β-CD包合物的制备及表征
  采用溶剂搅拌-冷冻干燥法制备薏苡素-HP-β-CD包合物,通过扫描电镜法、红外光谱法、差示扫描量热分析和X-射线衍射法对包合物进行表征,验证其包合成功。
  采用HPLC法测定包合物中薏苡素含量,并进行方法学考察。实验结果表明:薏苡素浓度(x)与峰面积(y)具有良好的线性关系,薏苡素含量测定回归方程为:y=108096x-48927(R2=0.9995)。方法的专属性、精密度、稳定性和加样回收率良好,适用于包合物中薏苡素的含量测定。
  2、优化薏苡素-HP-β-CD包合物的制备工艺
  在单因素影响实验的基础上,以包合率和包合物得率的综合评分为考察指标,筛选出HP-β-CD与薏苡素投料比、包合时间、包合温度三种因素进行星点设计-响应面实验,确定制备包合物的最佳工艺:HP-β-CD∶薏苡素投料比为3∶1,包合温度60℃,包合时间5h。
  3、薏苡素-HP-β-CD包合物体外释放实验及稳定性考察
  采用透析袋(截留分子量为8000~14000)法进行体外释药考察,实验结果表明,薏苡素-HP-β-CD包合物累计释药率比薏苡素单体的溶出提高了2.55倍,说明薏苡素-HP-β-CD包合物溶解度远大于薏苡素。稳定性实验结果显示:薏苡素-HP-β-CD包合物在高温和光照条件下稳定性良好;在高湿环境巾易吸湿潮解,因此在生产、贮存和运输过程中尽量保持避光密封干燥。
  4、薏苡素-HP-β-CD包合物药动学及组织分布研究
  采用HPLC法测定生物样品中薏苡素的含量,为更有效地避免生物组织中繁杂成分干扰,采用内标法进行定量分析并进行方法学考察。实验显示,薏苡素与内标物峰形良好,完全分离,有良好的专属性。血浆样品中,薏苡素在考察的0.16~25.00μg/mL浓度范围内线性关系良好;各组织样品中,薏苡素在考察的0.03~3.13μg/mL浓度范围内线性关系良好,精密度、样品稳定性及回收率RSD均良好,可用于生物体内样品的检测。
  采用血药浓度测定法研究薏苡素及其包合物在大鼠体内的药动学特征。以100mg/kg的剂量进行大鼠灌胃给药后,采用二室模型对数据进行处理求得药动学参数,确定:薏苡素的平均血药峰浓度Cmax=14.9±2.82μg/mL比薏苡素包合物的Cmax=17.48±2.33μg/mL为低;薏苡素及其包合物的消除半衰期t1/2Z分别为0.83±0.44h和1.97±0.63h,平均滞留时间MRT(0~10)分别为1.00±0.13h和2.37±0.23h。与薏苡素相比,薏苡素包合物的消除半衰期t1/2Z显著延长(p<0.01),平均滞留时间MRT(0~10)显著延长(p<0.01)。此外,薏苡素包合物在大鼠体内的药时曲线下面积AUC(0~10)显著提高(p<0.01),是薏苡素的232.83%。说明薏苡素经HP-β-CD包合后能增加其在体内的吸收,延缓薏苡素在体内的代谢消除,达到长效作用,提高其口服生物利用度。
  按给药量100mg/kg计,大鼠灌胃给予薏苡素及其包合物后,HPLC测定0.25h、0.5h、1h、3h、6h、10h大鼠各组织中薏苡素浓度,比较药物在各组织中的分布情况。结果表明,在0.25h时,包合物组在各组织中的浓度均低于薏苡素组;在0.5h时,包合物组在各组织中的浓度升高较快;在1h及以后,包合物在各组织的浓度均高于薏苡素组;在6h时,薏苡素组的心、脾、肺、脑中药物浓度已低于检测限;而包合物组的各组织中药物浓度均能检测到。此外,薏苡素组在0.25h时各组织中药物浓度达到最大值;而包合物组在0.5h时各组织(除肾)中薏苡素浓度达到最大值。通过对比可以说明HP-β-CD的包合可提高薏苡素在组织脏器中的浓度,同时使薏苡素缓慢释放而具有长效作用;包合物组在各组织中的含量下降速度比薏苡素组的缓慢,说明制成包合物后可延缓薏苡素在体内的消除过程。总的趋势来看,在肾、肝中薏苡素含量明显大于其他脏器;各组织器官中,薏苡素的浓度大小依次为:肾>肝>脾>心>肺>脑。与薏苡素相比,包合物在肾中的含量下降速度缓慢,说明包合物可延缓药物在体内的消除过程。值得注意的是,脑部也能检测到薏苡素的含量,说明薏苡素能透过血脑屏障,提示薏苡素可能作用于脑部的中枢神经而发挥镇痛作用;随着时间的延长,薏苡素包合物在脑部含量下降速度缓慢,说明包合物可减缓药物在脑部的消除速度,增加在脑部的滞留时间,提示“康莱特注射液”对癌患的镇痛作用很有可能是所含成分薏苡素所为。
[硕士论文] 孙若男
生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:RAS相关蛋白家族成员Rap2b是一种新发现的p53下游靶基因。当p53+/+细胞受到外源性刺激时(如阿霉素给药),p53被激活,导致细胞内Rap2b蛋白的表达量显著增加,从而促进肿瘤细胞的生存。推测,Rap2b是一个有效的肿瘤治疗靶点。为此,本文设计了一种以纳米材料为载体的药物/基因递送系统,用于评估Rap2b siRNA作为一种抗肿瘤治疗药物的潜力。同时本文通过研究Rap2b与p53之间的相互作用,为阐明Rap2b siRNA的抗肿瘤机制提供重要线索。
  首先,为了便于后续实验,制备了Rap2b单克隆抗体。共得到八个单克隆抗体稳定细胞株。酶联免疫吸附实验结果显示八株均为IgG1类抗体。同时免疫印迹法结果显示抗体的最低使用浓度为0.1μg/mL,所能检测到的蛋白最低量为5ng。
  然后,通过氯金酸法合成了金纳米壳颗粒,并将合成的Rap2b siRNA和阿霉素连接到金纳米壳上。纳米粒子与HCT116细胞共孵育后,在荧光显微镜下可见装载有阿霉素和Rap2b siRNA的金纳米壳被肿瘤细胞吸收。激光照射能显著促进金纳米壳释放阿霉素和Rap2b siRNA,而且释放的Rap2b siRNA能显著降低细胞内Rap2b的表达水平。
  接着,通过体外和体内实验评价了不同药物联用对肿瘤细胞的杀伤效应。结果显示,降低Rap2b的表达水平能显著增强阿霉素对于肿瘤细胞的杀伤效果。同时,激光照射纳米粒子产生的热能能对肿瘤细胞产生额外的杀伤作用,进一步提高了阿霉素的肿瘤治疗效果。
  最后,通过体外GST pulldown实验和体内双分子荧光互补实验证明了Rap2b与p53之间存在直接相互作用。为了确定这两种蛋白互作的结构域,构建了一系列Rap2b和p53的截短突变体,再通过体外GST pullldown实验和双分子荧光互补实验确定了Rap2b的第41-135位氨基酸残基和p53的DNA结合结构域是二者直接相互作用的区域。
  综上所述,本研究证明了Rap2b siRNA能显著增强阿霉素的抗肿瘤疗效,而且Rap2b能与p53直接结合,推测Rap2b可能通过与p53直接结合而负反馈调控p53的活性。这些发现有助于深入理解Rap2b和p53在肿瘤发生发展和耐药性形成中的作用,为抗肿瘤药物的研发提供了新靶点,对于恶性肿瘤的防治具有重要意义。
[硕士论文] 金槿
生物学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:不良的药代动力学特征,药物的毒副作用,特别是药物耐药性的出现,使化疗药物在临床肿瘤治疗中的效果大幅降低。而海洋复杂多变的生存环境,赋予了生活在其中的生物特殊的抵御手段,这些化学或者生物适应产生了许多具有特殊生物活性和潜在抗肿瘤效应的化合物。Thiocoraline即噻可拉林,为含硫缩肽,是一种DNA双嵌插剂,最初是从海洋单胞菌Micromonospora marina中分离得到,在抗癌活性方面有很好的效果。
  本课题以thiocoraline为研究对象,研究thiocoraline抗肿瘤活性及乳腺癌对thiocoraline产生耐药的分子机制。使用MTT法检测thiocoraline对MCF-7细胞,L-02细胞的毒性作用;利用MTT法和结晶紫染色比较thiocoraline和doxorubicin对MCF-7细胞的作用效果;流式细胞术检测thiocoraline对细胞周期的影响;Hoechst33342和Western Blot检测thiocoraline诱导细胞凋亡情况;通过浓度梯度递增法培养得到对thiocoraline耐药的MCF-7/T细胞株,并确定其耐药指数。利用生长曲线和克隆形成实验比较MFC-7细胞与MCF-7/T耐药细胞的生物学特征。通过半定量PCR初步筛选出与thiocoraline相关的耐药靶点;qPCR,Western Blot进一步分析比较耐药细胞MCF-7/T与MCF-7细胞之间的差异。针对Akt位点,用慢病毒构建的MCF-7/Akt1细胞株和Akt磷酸化抑制剂MK-2206HCl,通过MTT法及Western Blot实验深入研究thiocoraline引起MCF-7耐药的分子机制。利用MK-2206HCl抑制MCF-7/T耐药细胞中Akt蛋白的磷酸化,通过MTT法检测其逆转MCF-7/T耐药细胞对thiocoraline耐药性的作用效果。
  MTT法和结晶紫实验结果表明thiocoraline对MCF-7细胞具有显著的杀伤活性,在纳摩尔级的浓度下即可发挥抗肿瘤效应。肝正常细胞L-02对thiocoraline不敏感,当thiocoraline浓度为100nmol/L时,L-02细胞的成活率为69.43±13.48%。Thiocoraline对MCF-7细胞48h的IC50值为53.8±2.53nmol/L,与doxorubicin相比,对肿瘤细胞有更高的细胞毒性。流式细胞仪分析MCF-7细胞周期结果表明,thiocoraline可将MCF-7细胞的细胞周期阻滞在S期,从而抑制肿瘤细胞的增殖。Hoecst33342染色和Western Blot实验结果显示,thiocoraline可通过激活Caspase通路而诱导细胞发生凋亡。在前期系列天然产物抗肿瘤活性研究基础上,针对乳腺癌细胞耐药性这个突出问题,以乳腺癌耐药细胞MCF-7/T为研究模型,筛选与thiocoraline耐药相关的蛋白,深入探究影响肿瘤细胞对药物敏感性的因素。通过细胞生长曲线和克隆形成实验发现MCF-7细胞在体外的增殖速率高于MCF-7/T细胞。qPCR和Western Blot实验显示,thiocoraline作用MCF-7细胞后,引起Akt蛋白磷酸化,长期作用下使下游乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistant Protein,BCRP)的表达水平升高,通过PI3K/Akt/BCRP通路诱导细胞产生耐药性。MTT实验结果表明,MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,随着细胞内Akt蛋白磷酸化水平的提高而降低。使用Akt磷酸化抑制剂MK-2206HCl可显著提高MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,并且可部分逆转MCF-7/T耐药细胞对thiocoraline的耐药。
  总之,thiocoratine长期处理可使MCF-7细胞通过PI3K/Akt/BCRP通路产生耐药性,而MK-2206HCl通过抑制Akt蛋白磷酸化,显著提高MCF-7细胞对thiocoraline的敏感性,上述实验结果表明抗肿瘤活性化合物thicoraline联合Akt磷酸化抑制剂MK-2206HCl,或许可以避免化疗药物耐药性,为乳腺癌的临床治疗研究提供相关实验依据。
[硕士论文] 闫晨静
食品科学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:牛磺酸是人体内的一种非蛋白质氨基酸,具有特殊生理活性。近年来对于牛磺酸功效作用的研究有很多,但有关对抑郁的干预研究鲜有报道。国内外市售牛磺酸的来源主要分为天然提取和化学合成两种,因天然牛磺酸存在提取率低、成本高的问题,化学合成牛磺酸已占据市场主流,但对于合成牛磺酸与天然牛磺酸的功效是否存在差异一直备受争议,目前对于两种牛磺酸的生物活性对比也鲜有研究。本试验以天然与合成两种来源的牛磺酸为试验材料,主要研究牛磺酸的抗疲劳作用和对抑郁模型动物的干预效果及机理,并进行两种牛磺酸的功能对比。
  以天然牛磺酸和合成牛磺酸为试验材料,通过建立小鼠力竭运动模型,研究牛磺酸的抗疲劳作用,并对两种牛磺酸进行功能对比。结果表明两种牛磺酸在1和2g/kg·bw剂量条件下能够显著增加小鼠力竭运动时间,升高力竭运动小鼠血清葡萄糖水平,降低血清LD、BUN、AST、ALT水平,增强LDH活性,同时减少肝脏、肌肉中糖原的消耗,提高SOD活性,降低MDA含量,改善相关生化指标。提示牛磺酸具有缓解运动性疲劳的作用,且总体而言两种牛磺酸未出现明显差异。
  以天然牛磺酸和合成牛磺酸为试验材料,通过建立行为绝望模型、利血平诱导抑郁模型和慢性不可预知应激模型,研究牛磺酸对抑郁的干预作用,并对两种牛磺酸进行功能对比。结果表明两种牛磺酸在1和2g/kg·bw剂量条件下可显著降低小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间,增加小鼠自主运动水平,并缓解利血平诱导的小鼠眼睑下垂,同时升高抑郁小鼠脑组织5-HT、DA、NE含量,降低MAO活性,升高BDNF、T3、T4含量,降低CRF、ACTH、COR、TSH水平,改善相关生化指标。提示牛磺酸对行为绝望模型、利血平诱导抑郁模型和慢性不可预知应激模型均具有干预抑郁的作用,且总体而言两种牛磺酸未出现明显差异。
  本研究通过建立力竭运动模型和三种抑郁模型对两种牛磺酸的抗运动作用、抑郁干预作用进行了研究,并对相关行为学实验、生化指标进行了分析,为牛磺酸相关功能性产品的开发推广提供参考和理论依据。研究结果表明,牛磺酸具有显著的抗疲劳作用和对抑郁的干预作用,推测牛磺酸干预抑郁作用机制与神经单胺递质假说、神经内分泌假说和脑源性神经营养因子假说密切相关,具体作用通道及作用原理有待进一步研究探讨。试验结果显示,两种牛磺酸作用结果虽在数值上略有差异,但总体差异不大,表明合成牛磺酸的抗疲劳效果及对抑郁模型小鼠的干预作用与天然牛磺酸相当,可作为天然牛磺酸的有效替代品。
[硕士论文] 徐佳佳
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:胃癌作为一种起源于胃黏膜上皮的常见消化道恶性肿瘤,已对人类的健康产生了严重的威胁。近年来,尽管许多国家胃癌的发病率和死亡率都有所下降,但由于其病因极其复杂,目前胃癌尚未得到有效治疗。手术切除是目前胃癌治疗的主流手段,但术后易出现复发与转移。因此,寻找新型有效的抗胃癌药物对于胃癌的治疗显得十分重要。柯里拉京(corilagin)是单宁家族的独特成分,存在于多种药用植物中,是叶下珠属植物的主要活性单体,具有广泛的生物学活性如抗炎、保肝、抗病毒、抗肿瘤等。近年来,柯里拉京在抗肿瘤方面的作用越来越受到人们的关注。已有文献报道,其对肝癌、卵巢癌以及成胶质瘤细胞具有明显的抑制作用。然而,柯里拉京对胃癌的生物学效应及其机制尚不清楚。
  本课题以人胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823为研究对象,主要探讨柯里拉京诱导人胃癌细胞程序性死亡的作用机制。首先,我们采用MTT法和Edu染色实验分别检测人胃癌SGC-7901和BGC-823细胞经不同浓度柯里拉京作用24h后细胞的存活率。结果表明,柯里拉京能显著抑制人胃癌细胞SGC-7901和BGC-823的增殖,并且抑制作用呈现出显著的剂量依赖效应。同时用MTT法测定柯里拉京对人正常胃黏膜上皮细胞GES-1增殖的影响,结果说明,在一定剂量范围内,柯里拉京不会抑制正常胃黏膜上皮细胞GES-1的生长,表现出对肿瘤细胞的特异性。其次,通过Hochest33342染色实验、Annexin V-FITC/PI双染实验,Western blot实验检测经不同浓度柯里拉京处理24h后,相关凋亡指标的变化。结果表明,柯里拉京可诱导胃癌细胞SGC-7901和BGC-823发生caspase依赖的凋亡。接着,通过吖啶橙(AO)染色实验、MTT实验和蛋白免疫印迹分析实验,我们发现柯里拉京可诱导胃癌SGC-7901和BGC-823细胞发生自噬,且抑制自噬可提高柯里拉京对胃癌细胞的增殖抑制作用。因此认为自噬对胃癌细胞起到保护作用。此外,采用流式细胞术分析与MTT实验相结合的方法,研究证实柯里拉京能以剂量依赖的方式显著地诱导细胞内ROS的累积,并且ROS在细胞内的积聚会显著地抑制胃癌细胞的存活。最后,采用RT-PCR和Western blot等实验,证实柯里拉京不能诱导胃癌细胞SGC-7901和BGC-823发生程序性细胞坏死。
  综上所述,本研究结果表明,柯里拉京可诱导胃癌细胞SGC-7901和BGC-823发生凋亡和自噬以及ROS的大量积聚,但不会诱导胃癌细胞发生程序性坏死。本实验结果可为今后将柯里拉京开发成为临床新型抗胃癌药物提供一定的科学依据。
[硕士论文] 张少波
内科学 福建中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过建立大鼠胃壁全层穿孔动物模型,应用聚乳酸片封闭胃壁穿孔处,探讨聚乳酸片修复胃壁全层穿孔的有效性和早期胃壁密闭性变化,为临床上应用聚乳酸片封闭胃壁穿孔提供一定的实验依据。
  方法:
  96只8周龄SPF级Wistar雌性大鼠(体重201±23g),随机分为空白对照组、假手术组、单纯缝合组、实验组。各组进行相应处理后分三批取材,于术后1w、2w、4w处死取材后做相应检测,其中血清通过ELISA实验做EGF、TGF-β1表达量检测;愈合组织通过HE染色做组织学检测及通过免疫组化做VEGF、CD68表达量检测;全胃做可容受最大压力检测。
  结果:
  1)胃可容受压力检测:在第一周,实验组胃能承受最大荷载力明显高于同期单纯缝合组(P<0.05),低于假手术组和空白对照组(P<0.05)。
  2)胃愈合组织形态学结果显示:第一周:实验组及对照组黏膜下层可见大量渗出红细胞,伴有大量单核细胞及中性粒细胞浸润,其中实验组有新生血管形成。第二周:实验组黏膜下层红细胞、中性粒细胞及单核细胞大大减少;对照组黏膜下层单核细胞及中性粒细胞浸润较第一周减少,但炎性细胞浸润情况较同期实验组明显;假手术组及正常组黏膜下层正常。
  3)血清表皮生长因子EGF ELISA结果显示:第一周及第二周实验组表达量高于同期其他三个组(P<0.05);第四周:实验组表达量明显低于同期单纯缝合组(P<0.05)。
  4)血清TGF-β1ELISA结果显示:第一周及第二周实验组表达量高于同期其余三个组(P<0.05);第四周实验组表达量高于空白对照组(P<0.05),与单纯缝合组及假手术组比较则没有明显差异(P>0.05)。
  5)愈合处VEGF结果显示:第一周实验组表达量高于假手术组、空白对照组(P<0.05),而与单纯缝合组相比没有明显差异(P>0.05);第二周时,实验组表达量高于单纯缝合组(P<0.05)。第四周各组表达差异均没有统计学意义(P>0.05)。
  6)愈合处CD68结果显示:第一周实验组表达量明显高于同期另外三个组(P<0.05);往后实验组与其余各组差异没有统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  聚乳酸膜片应用于胃壁穿孔不仅早期密闭性优于传统的单纯缝合方法而且可促进炎症反应,加快创伤修复进程,有助于加快胃壁穿孔后愈合进程,其有望在未来临床上因医疗操作导致胃壁穿孔修复等方面发挥重要作用。
[硕士论文] 许靖熠
外科学 福建中医药大学 2018(学位年度)
摘要:近半个世纪以来,泡沫硬化剂已被广泛用于下肢静脉曲张的硬化治疗中,并取得了不错的成效。相对于液体形式的硬化剂,泡沫硬化剂可以迅速诱发血管痉挛,使之较少被受累静脉内的血液稀释,从而进一步增强了硬化效力。然而目前对泡沫硬化剂的最低有效作用时间和最低有效浓度还未取得共识,尚未有明确的病理学支持。
  目的:探索泡沫硬化剂(聚多卡醇),最低起效时间和最低起效浓度,以及聚多卡醇在不同浓度和不同时间对静脉壁所造成的病理变化的影响。
  方法:通过大隐静脉抽剥术,取直径为5-10mm的曲张大隐静脉主干近端10cm。将静脉段分割成长度为1cm的小静脉段数段。各静脉段分别放置于不同浓度的聚多卡醇泡沫硬化剂中(0.5%、1%、3%),进行不同时间的处理(1s,10s,30s,1min,5min,10min)。同时设立空白对照组:每10cm的静脉段留取1cm的长度的小静脉段置于10%的甲醛溶液中固定中。最后将药物处理后及空白对照组的各静脉段常规送病理切片检查。病理结果评价包括内膜坏死程度,内皮肿胀,内膜增厚,中膜水肿,平滑肌液化组成。最后得出评分采用统计学方法得出结论。
  结果:聚多卡醇泡沫硬化剂组总得分明显高于对照组总得分(P=0.025)。以浓度为变量的各组间差异,3%聚多卡醇组总损伤得分最高(中位数=3,P=0.043),差异有统计学意义,0.5%聚多卡醇和1%聚多卡醇之间总损伤评分P=0.072,差异无统计学意义;以时间为变量的各组间差异,10min组总损伤评分最高。试验组1s与对照组总损伤评分之间P=0.158,差异无统计学意义,试验组10s,30s,1min,5min,10min与对照组的总损伤评分之间存在明显差异(P对照组-10s=0.011,P对照组-30s=0.013,P对照组-1min=0.030,P对照组-5min=0.019,P对照组-10min=0.010),其中30s,1min,5min,10min四组之间总损伤评分,差异无统计学意义(P30s-1min=0.074,P30s-5min=0.071,P30s-10min=0.065,P1min-5min=0.085,P1min-10min=0.142,P5min-10min=0.183)。
  结论:即使是最低浓度0.5%聚多卡醇,也能对静脉壁造成明显的病理变化,3%聚多卡醇的作用效力较0.5%和1%的聚多卡醇更为明显。根据实验结果,我们建议在对下肢曲张静脉进行硬化治疗时,在对曲张静脉注射泡沫硬化剂时,保持压迫曲张静脉近心端至少30s,使泡沫硬化剂发挥其硬化效力。由于本实验为体外实验,泡沫硬化剂在体内环境对静脉的病理损伤与此结果是否一致还需要进一步的实验研究。
[硕士论文] 谢礼翔
全科医学 黑龙江中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过临床观察脓毒症心肌损伤患者,探讨化纤胶囊对脓毒症心肌损伤(气虚血瘀型)患者心功能的影响,为脓毒症心肌损伤患者中西医治疗提供新的思路和方法。
  方法:
  将2016年6月至2018年2月在黑龙江中医药大学附属第一医院重症医学科(ICU)收治的符合脓毒症心肌损伤(气虚血瘀型)纳入标准的68例患者,其入科后均按照随机数字表法分为对照组和实验组(各组34例)。并且根据2016年版的《脓毒症治疗指南》,两组患者均常规给予西医综合治疗。实验组患者采用化纤胶囊加西医常规治疗,而对照组用西医常规方法加用温水治疗。两组患者均在用药前及用药后第3天、第7天抽取外周静脉血,检测PCT、TNF-a、CRP、BNP、cTnⅠ、CK-MB、Lac、AST、ALT、BUN、Cr指标;治疗前和治疗后第7天对所有患者行床旁心脏彩超检查;并同时记录和分析治疗前、后第3天、第7天患者的SOFA评分、APACHE-Ⅱ评分、中医证候积分;并对比两组病患在重症监护室的住院天数(d)及28天的死亡率(%)。
  结果:
  在治疗前,两组观察对象的性别、年龄、APACHE-Ⅱ评分都无明显差异(P>0.05),具有可比性。在治疗后第3天、第7天,实验组患者的PCT、TNF-a、CRP、BNP、cTnⅠ、CK-MB、Lac指标、SOFA评分、APACHE-Ⅱ评分及中医证候积分均较对照组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。且化纤胶囊治疗后第7天与第3天的检测值相比改善较为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组患者LVEF、LVEDD、CO、E/A的变化幅度与对照组相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组患者住ICU的天数也比对照组患者时间更短,差异具有统计学意义(P<0.05),其28天后患者病死率明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1.化纤胶囊可以改善脓毒症心肌损伤(气虚血瘀型)患者的心功能。
  2.化纤胶囊可以有效改善脓毒症心肌损伤(气虚血瘀型)患者的PCT、TNF-a、CRP、BNP、cTnⅠ、CK-MB、Lac、AST、ALT、BUN、Cr指标水平。
  3.化纤胶囊可以改善脓毒血症心肌损伤(气虚血瘀型)患者的LVEF、LVEDD、CO、E/A指标水平。
  4.化纤胶囊能够改善脓毒血症心肌损伤(气虚血瘀型)患者的SOFA评分、APACHE-Ⅱ评分及中医证候积分。
  5.化纤胶囊可以缩短脓毒症心肌损伤(气虚血瘀型)患者住院的时间,提高脓毒症心肌损伤患者的28天的生存率。
[硕士论文] 蒋宗胜
药理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中80%是非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC),晚期患者可出现全身性的转移,五年生存率极低。而上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是癌症发生发展中的重要过程,是NSCLC发生侵袭转移的根源。研究表明肿瘤细胞在EMT过程中,大量转录因子向核内聚集而促进了EMT相关蛋白表达。近年研究发现叉头框转录因子(Forkhead box,FOX)家族在调控EMT过程中发挥了重要作用,其中FOXM1介导了多种肿瘤细胞的恶性进程,然而其对NSCLC细胞EMT的调控作用,尤其是对E-cadherin编码基因CDH1的转录调控作用尚不明确。本文以FOXM1为研究对象,探讨其在调控NSCLC细胞EMT过程中的机制及FOXM1特异性抑制剂硫链丝菌素对EMT的干预作用。
  方法:(1)通过FOXM1蛋白表达水平改变探讨其调控NSCLC细胞EMT的作用:HE染色观察过表达FOXM1后细胞的形态学变化;划痕实验、Transwell小室实验分别测定过表达、敲减FOXM1后细胞迁移和侵袭能力的变化;Western-Blot分析过表达、敲减FOXM1对EMT相关标志物表达的影响。(2)分子机制探讨FOXM1对EMT相关标志物的转录调控:双荧光素报告酶实验验证FOXM1对CDH1启动子的调控;核转录因子免疫共沉淀实验(ChIP)验证FOXM1对CDH1基因启动子的结合;在过表达FOXM1细胞中敲减Snail,通过双荧光素报告酶、免疫荧光整体揭示FOXM1对EMT标志物的转录调控。(3)FOXM1抑制剂硫链丝菌素体外抗NSCLC细胞EMT作用:MTT实验测定硫链丝菌素对NSCLC细胞活力的影响;克隆形成实验研究硫链丝菌素对NSCLC细胞克隆形成能力的影响;细胞形态学观察硫链丝菌素对TGF-β1诱导的EMT过程的作用;细胞迁移实验、Transwell小室实验测定硫链丝菌素对细胞迁移和侵袭的作用;Western-Blot分析硫链丝菌素对NSCLC细胞EMT相关蛋白表达的影响。
  结果:(1)GSEA分析以及在NSCLC细胞中的EMT蛋白、FOXM1表达检测表明,FOXM1与EMT具有一定的相关性;过表达FOXM1后的细胞呈现上皮-间质中间形态,而非完全的间质化形态;过表达FOXM1的A549细胞迁移能力和侵袭能力增强;N-cadherin,Snail,Vimentin的蛋白表达水平升高,E-cadherin的表达水平降低。在H1975细胞中敲减FOXM1的表达抑制了细胞侵袭迁移能力,E-cadherin表达水平升高,N-cadherin,Snail,Vimentin表达水平降低。(2)双荧光素报告酶实验表明FOXM1对于CDH1-2000-promoter荧光素报告载体具有抑制作用;ChIP结果证实了FOXM1能够内源性结合于CDH1基因启动子;在过表达FOXM1的细胞中敲减Snail后,E-cadherin的表达恢复。(3)MTT结果显示硫链丝菌素对NSCLC细胞增殖具有抑制作用;克隆形成实验表明硫链丝菌素能抑制NSCLC细胞的克隆形成能力;TGF-β1诱导的EMT过程中伴随着FOXM1的表达增加,细胞形态学发现这一过程能被硫链丝菌素所逆转;细胞迁移实验、Transwell小室实验表明硫链丝菌素能够抑制TGF-β1诱导而增强的细胞迁移和侵袭的作用,Western-Blot分析表明,硫链丝菌素能够下调TGF-β1所诱导的FOXM1,N-cadherin,Snail,Vimentin表达升高,阻断TGF-β1诱导的E-cadherin表达降低。
  结论:过表达FOXM1能够促进NSCLC细胞EMT过程,而降低FOXM1的表达能够抑制这一过程。FOXM1能够抑制CDH1的转录,并能够促进Snail间接对CDH1发挥转录抑制作用来介导EMT过程。FOXM1抑制药物硫链丝菌素对NSCLC细胞增殖、克隆及EMT过程具有抑制作用。以上结果表明可以通过改变FOXM1的表达来干预EMT过程。
[硕士论文] 严磊
临床兽医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:庆大霉素是一种广泛应用于临床的氨基糖苷类抗生素,具有较强的抗菌活性和较广的抗菌谱,若使用不当会引起多器官损伤。庆大霉素进入机体会在肾脏中蓄积,从而引起肾损伤。近些年发现细胞凋亡在庆大霉素诱导的肾损伤中有重要作用,但细胞凋亡作用机制仍未阐明。MPTP的开放会导致线粒体膜通透性转换的发生,进而激活线粒体凋亡途径,但庆大霉素能否诱导MPTP开放尚不清楚。本研究以体外培养MDCK细胞为模型,通过体外试验探究MPTP在庆大霉素诱导细胞线粒体凋亡途径中的作用机制以及依达拉奉在其中的保护作用。
  1、庆大霉素对MDCK细胞毒性的影响
  为研究庆大霉素对MDCK细胞的毒性作用,不同浓度(0、2、4、8mmol/L)庆大霉素处理MDCK细胞24h以及4mmol/L庆大霉素处理MDCK细胞不同时间(0、6、12、24h),CCK-8法测定庆大霉素对细胞存活率的影响,ELISA法检测KIM-1和NGAL损伤因子的分泌情况,流式细胞术检测细胞MPTP开放和细胞凋亡率,Hochest33258染色观察细胞核形态的变化,免疫印迹法检测Bax和Bcl-2蛋白表达量。结果显示,与对照组相比,随着庆大霉素染毒浓度的增加和时间的延长,MDCK细胞活力呈下降趋势(P<0.05或P<0.01)。随着庆大霉素染毒浓度的增加,KIM-1和NGAL含量先升高后降低,在庆大霉素为4mmol/L时达到分泌的峰值(P<0.05或P<0.01);随着庆大霉素染毒时间的延长,KIM-1含量先升高后下降,而NGAL含量呈上升趋势(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,随着庆大霉素染毒浓度的增加和时间的延长,MPTP开放和细胞凋亡率显著或极显著上升(P<0.05或P<0.01);细胞核出现固缩、浓染甚至碎裂的现象;Bcl-2/Bax比值显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)。说明庆大霉素对MDCK细胞有毒性作用,存在剂量-效应关系和时间-效应关系,并且其可以诱导MPTP开放、细胞凋亡,其毒性机制可能与MPTP开放、细胞凋亡有关。
  2、MPTP在庆大霉素诱导MDCK细胞凋亡途径中的作用
  为研究MPTP在庆大霉素诱导MDCK细胞线粒体凋亡中的作用,本试验用4mmol/L庆大霉素和2μmol/L抑制剂CsA单独或联合处理MDCK细胞24h。流式细胞术检测MPTP开放情况和细胞凋亡率;荧光检测线粒体变化和线粒体基质肿胀;JC-1探针检测线粒体膜电位的变化;免疫印迹法检测Bax与Bcl-2表达量、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情况、Cyt C和AIF释放。结果显示,抑制剂CsA能够显著或极显著抑制庆大霉素引起的MDCK细胞MPTP的开放、细胞凋亡率的上升、线粒体肿胀、ATP含量的减少、线粒体膜电位下降、Bcl-2/Bax比值下降、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白的活化以及CytC与AIF的释放(P<0.05或P<0.01)。说明MPTP正向调节庆大霉素引起的MDCK细胞线粒体凋亡。
  3、依达拉奉在庆大霉素诱导MDCK细胞凋亡中的保护作用
  为研究依达拉奉在庆大霉素诱导MDCK细胞凋亡中的保护作用,本研究用4mmol/L庆大霉素和40μmol/L依达拉奉单独或联合处理MDCK细胞24h。AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡率,Hochest33258染色观察细胞核形态的变化,比色法检测T-SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量,荧光染色检测ROS含量,免疫印迹法检测Bax与Bcl-2表达量、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情况以及Cyt C与AIF释放。结果显示,依达拉奉能够显著或极显著抑制庆大霉素引起的MDCK细胞凋亡率的上升;细胞核形态的改变;ROS含量的升高;T-SOD、GSH-Px活力上升,CAT活力下降,MDA含量上升;Bcl-2/Bax比值下降、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白的活化以及Cyt C与AIF的释放(P<0.05或P<0.01)。说明依达拉奉能抑制庆大霉素通过线粒体凋亡通路诱导MDCK细胞凋亡。
[硕士论文] 杨倩
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:肿瘤是典型的复杂性疾病,采用多靶标的设计策略才能解决化疗药物的耐药性问题,降低药物的使用浓度,减少毒副作用。多靶标药物设计可分为两个步骤:靶标组合的确定和多靶标药物的筛选与设计,前者是多靶标药物设计的关键。本论文基于NCI数据库中化合物对常见肿瘤细胞系的生长抑制活性数据以及BindingDB数据库中不同靶标的大量活性分子数据,采用两层相似性融合算法(Two-Layer Similarity Ensemble Approach,TL-SEA)建立了NCI抗肿瘤化合物与BindingDB靶标的相互作用网络,最终实现了抗肿瘤靶标组合的预测。
  首先,从NCI下载具有抗肿瘤活性的小分子数据,从BindingDB下载不同靶标的小分子活性数据,经保留分子最大片段,加氢,理化性质筛选等的预处理后,计算了NCI抗肿瘤活性分子和BindingDB靶标活性分子的相似性矩阵。然后,采用TL-SEA算法,计算NCI小分子与靶标之间的关联度打分(P值),建立了抗肿瘤活性小分子和BindingDB靶标蛋白的相互作用网络。再后,根据NCI活性分子对任意两个BindingDB靶标的关联度打分(P值)向量,定义任意靶标对之间的组合可信度打分Q=n∑i=1logPpro1,i*logPpro2,i。循环计算所有的靶标组合的可信度打分Q,获得潜在的抗肿瘤靶标对组合。进一步,计算了BindingDB数据库中靶标蛋白之间的关联打分,将上述获得的抗肿瘤靶标对组合中的同类蛋白或配基结构相似的蛋白剔除。最后,利用上述算法计算可购买化合物库Specs中的小分子与保留的抗肿瘤靶标对之间的关联打分,选取具有高打分的小分子,以组合或者单独的形式进行肿瘤细胞生长抑制实验,验证该靶标组合的有效性。结果表明有6个化合物,对K-562细胞系具有较高的生长抑制活性。
  本论文基于公开的生物活性大数据以及可靠的药物发现算法,建立了肿瘤靶标组合和药物筛选流程。论文研究有助于抗肿瘤多靶标药物的发现,而且还对糖尿病、老年痴呆等复杂性疾病的多靶标药物发现提供理论方法参考。
[硕士论文] 崔灿
食品工程 河南农业大学 2018(学位年度)
摘要:目的:近些年由于环境污染问题屡见不鲜,导致各种食源性铅污染层出不穷,对人们健康生活造成了严重影响。通过食物链并利用食物的天然成分来提高机体的抗氧化能力和应对氧化应激水平的能力,已成为目前功能性食品研究的新方向。叶酸是一种在蔬菜水果中含量丰富的维生素,它具有较强的抗氧化能力,对神经干细胞有促进作用。所以我们构建PC12细胞模型,以铅作为细胞损伤的诱导剂,叶酸作为细胞保护剂进行实验。研究铅对神经细胞的损伤机理,以及叶酸对铅暴露下受损的神经细胞增殖凋亡及抗氧化能力及培养液中Aβ40和Aβ42的影响。
  方法:在细胞稳定生长的条件下,用不含铅的完全培养液及10μmol/L的醋酸铅培养液对PC12细胞进行染毒24h,随后将培养液全部吸出,并分别用浓度为0mg/L,0.5mg/L,5mg/L,50mg/L的叶酸培养液继续作用,并分别在24h,48h及72h后收集干预过的PC12细胞,使用MTT对细胞的增殖或抑制情况进行检测。并提取细胞蛋白,检测各组细胞SOD、GSH-PX的活力及MDA的含量,使用免疫荧光法对凋亡蛋白Caspase-3蛋白表达水平的变化进行分析。使用ELISA检测细胞培养液中Aβ40及Aβ42的变化。
  结果:根据MTT结果显示,铅暴露可以抑制PC12细胞的生长,并且随着时间的增加,抑制率越来越高(P<0.05)。叶酸则对PC12细胞的增殖有显著促进作用(P<0.05),随着时间的增加(72h内)细胞的增殖率是下降的,但细胞总数是增加的,且在一定剂量范围内,叶酸浓度越大,PC12细胞的增殖率及细胞数量均呈现上升趋势。叶酸对铅暴露组PC12细胞具有显著促进作用(P<0.05),且随着叶酸剂量的增加,叶酸干预铅暴露组的细胞抑制率是逐渐降低,细胞数量不断升高。根据各氧化指标结果显示,铅能显著增加胞内MDA含量及SOD的活力,并显著降低GSH-PX的活力(P<0.05),50mL/L的叶酸显著提高胞内MDA含量及GSH-PX的活力(P<0.05),与铅暴露组相比,50mL/L的叶酸能显著降低铅暴露组MDA的含量,显著提高SOD及GSH-PX的活力(P<0.05)。免疫荧光结果显示,铅暴露组Caspase-3蛋白显著增加;与对照组相比,叶酸组Caspase-3的表达也是显著增加;与铅暴露组相比,叶酸能显著降低铅暴露组胞内Caspase-3的表达。ELSA结果显示,与对照组相比,铅暴露组细胞培养液中Aβ40显著降低(P<0.05),叶酸50mg/L组细胞培养液中Aβ40是增加的,但不存在显著性差异(P>0.05);叶酸50mg/L干预铅暴露组细胞培养液Aβ40的含量与对照组、叶酸50mg/L组、铅暴露组均不存在显著性差异(P>0.05)。但是各组细胞培养液中Aβ42均不存在显著性差异(P>0.05)。
  结论:铅可提高胞内脂质过氧化程度、氧化应激水平,诱导Caspase-3蛋白的表达来抑制细胞生长并促进细胞凋亡,叶酸能保护铅暴露后受损的PC12细胞其可能通过上调胞内SOD,GSH-PX的活力,下调MDA的含量,进而抑制或延缓Caspase-3蛋白的表达来保护受损的细胞。而高剂量的叶酸长时间作用细胞是否会产生副作用,还需要进一步的研究证实。
[硕士论文] 陈婉琼
药理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过构建EGFRvⅢ-CART细胞提高T细胞对GBM的靶向作用,再在此CART细胞上表达PD1CD28嵌合分子,旨在将PD-L1与PD-1结合诱发的T细胞抑制性信号转换为CD28传递的活化信号,从而减少CART细胞在免疫抑制性微环境中的失能,增强其抗肿瘤能力.
  方法:
  1.慢病毒表达载体EGFRvⅢ-CAR,EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1CD28的构建
  1)目的基因合成EGFRvⅢscFV序列前后加上XbaI和SgrAI酶切位点及相应保护碱基后合成目的基因.
  2)EGFRvⅢ-CAR载体构建双酶切获得目的片段(EGFRvⅢscFV)及含有CD137-CD3片段的载体后,将两片段连接获得EGFRvⅢ-CAR慢病毒载体.
  3)EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1载体构建双酶切含有PD1胞外段序列质粒及EGFRvⅢ-CAR后,将两片段连接获得EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1慢病毒载体.
  4)EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1CD28载体构建双酶切含有CD28序列质粒及EGFRvⅢ-P2A-PD1后,将两片段连接获得EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1CD28慢病毒载体.
  2.慢病毒的包装,浓缩和滴度测定
  1)磷酸钙法转染慢病毒表达载体和两个包装质粒至293FT细胞.
  2)收集48h,72h细胞上清液,去除细胞碎片后用超高速离心机将病毒离心至管底,用RIPM1640培养基溶解.分装后置于-80℃冰箱备用.
  3)将病毒浓缩液进行10倍,100倍,1000倍稀释后加到293细胞中,48h后用流式细胞术测定阳性细胞百分比,从而计算出病毒的生物滴度.
  3.PBMCs的转染
  1)分离健康人外周血单核细胞(PBMCs).CD3/CD28磁珠刺激其活化和增殖.
  2)48h后,加入病毒(MOI=30)与PBMCs共离心.
  3)转染72h后,用western-blot和流式细胞术检测CAR分子和PD1CD28在CD3+T细胞上的表达.
  4.CRISPR-PD-L1载体构建,病毒包装及稳转细胞株的建立
  1)针对PD-L1编码区设计三对不同sgRNA.
  2)合成三对sgRNA,引物磷酸化和退火.
  3)用限制性内切酶将lentiCRISPRv2载体线性化后与sgRNA连接.
  4)构建好的CRISPR-PD-L1转染目的细胞(EGFRvⅢ+U87MG).
  5)48h后取细胞检测其PD-L1敲除情况.
  5.EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞体外功能检测
  1)EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞分别与靶细胞共培养,对比两者的杀伤效果.
  2)EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞分别与靶细胞共培养,对比IL-2和IFN-γ释放量.
  6.EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞体内功能检测
  1)于NCG小鼠的右侧背部皮下注射EGFRvⅢ+U87MG细胞,建立小鼠人脑胶质瘤移植瘤模型.
  2)肿瘤体积达到约50-100mm3时,将小鼠每组6只,随机分为5组.
  3)将T细胞或CART细胞重悬于400μl PBS中,注射到小鼠尾静脉内.
  4)输注后,隔天观察小鼠精神状态,称量体重,并用游标卡尺测量肿块的长度和宽度.
  结果:
  1.慢病毒表达载体EGFRvⅢ-CAR,EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1CD28的构建
  酶切连接后挑取单克隆,双酶切鉴定,挑取正确克隆后进行DNA测序,序列结果正确.
  2.EGFRvⅢ-CAR,EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1CD28CART细胞的制备
  1)EGFRvⅢ-CAR慢病毒浓缩后滴度为2.16×108TU/ml,EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1CD28慢病毒浓缩后滴度为1.04×108TU/ml.
  2)EGFRvⅢ-CAR慢病毒转染T细胞的效率约为50%,EGFRvⅢ-CAR-P2A-PD1CD28慢病毒转染T细胞的效率约为30%.
  3.CRISPR-PD-L1载体构建和靶细胞PD-L1的敲低
  获得CRISPR-PD-L1gRNA正确序列的载体,包装成的慢病毒滴度为2×106TU/ml,成功构建PD-L1敲除的EGFRvⅢ+U87MG稳定细胞株.
  4.EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞体内外功能的检测
  1)体外试验显示CART细胞对EGFRvⅢ+U87MG细胞有抗原依赖性激活和特异性杀伤作用.
  EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞对EGFRvⅢ+U87MG细胞的体外特异性杀伤作用无显著差异.然而EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞比EGFRvⅢCART细胞分泌更多的IL-2.IFN-γ分泌量两者无显著性差异.
  2)EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞对胶质母细胞瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤作用.
  在NCG小鼠人脑胶质瘤移植瘤模型中,治疗21天后,EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞在控制肿瘤生长上无显著差异,均能有效消除肿瘤.然而,治疗后第28天,EGFRvⅢCART细胞组有3只小鼠肿瘤复发(3/6).EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞组无复发.治疗后第51天,EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞组复发率为33%,EGFRvⅢCART细胞组复发率为50%;EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞组复发肿瘤体积小于EGFRvⅢCART细胞组(P<0.05);EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞组中位生存期(75d)大于EGFRvⅢCART细胞组(51.5d),显示出更强大的体内控制肿瘤能力.
  结论:
  EGFRvⅢCART细胞和EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞体内外均具有特异性杀伤GBM肿瘤细胞作用.EGFRvⅢ-P2A-PD1CD28CART细胞在体外具有更强的抗原依赖性激活能力,在体内具有较强控制肿瘤细胞的能力.
[博士论文] 李脉泉
食品安全与营养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)多发于老年群体,具有病情发展缓慢、发病率高、治愈率低等特点,对患者的健康生活造成较大影响,氧化应激是该类疾病的重要发病机制。核转录因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2 related factor2,Nrf2)是内源性抗氧化系统中的关键元件,氧化应激条件下调控机体抗氧化系统,进而发挥对机体的保护作用。Nrf2激活剂可以增强机体抗氧化应激的能力,在多种神经退行性疾病中表现出良好的保护作用。
  本研究以已报道的178种天然抗氧化剂为研究对象,通过分子对接筛选出具有激活Nrf2活性的苯乙醇苷(Phenylpropanoid glycosides,PhGs),并利用氧化损伤细胞和动物模型,从基因和蛋白水平深入研究其神经保护作用及作用机制,为苯乙醇苷特别是毛蕊花糖苷应用于预防帕金森疾病(Parkinson's disease,PD)的发生奠定了理论基础。本文主要研究内容及结果如下:
  1.建立178种天然抗氧化剂数据库,利用分子对接筛选Nrf2的潜在激活剂。结果表明,不同类型化合物与Keap1的亲和力差异明显,亲和力排名较好的三类化合物为:苯乙醇苷类(7.31)>维生素E类(6.25)>黄酮类(5.03)。根据化合物与Keap1的亲和力将上述化合物分为Keap1高亲和力组(Total_ Score>6)、Keap1中亲和力组(3<Total_Score<6)和Keap1低亲和力组(Total_Score<3),高亲和力组化合物可以显著提高氧化应激损伤细胞模型细胞核中Nrf2的含量。24个高亲和力组化合物可以作为潜在的Nrf2激活剂,其中苯乙醇苷类化合物是较佳候选化合物。
  2.以与Keap1亲和力较高的红景天苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和松果菊苷四种苯乙醇苷类化合物为研究对象,研究其对氧化应激损伤细胞的保护作用。结果表明,苯乙醇苷可以显著提高PC12细胞增殖率(p<0.01)、细胞内抗氧化酶SOD和GSH-Px活性(p<0.01),同时显著降低PC12细胞内ROS水平(p<0.01)、细胞内MDA含量(p<0.01)和细胞凋亡率(p<0.01),显示出较强的抗氧化应激作用,其中毛蕊花糖苷效果较好。
  3.以红景天苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和松果菊苷为研究对象,结合免疫荧光、siRNA干扰、Western blot、RT-PCR等多种分子生物学手段,从蛋白质和mRNA水平阐明这四种化合物的抗氧化应激作用机制。结果表明,苯乙醇苷预处理,可以促进Nrf2向核内转移,同时,显著提高Nrf2下游Ⅱ相解毒酶的表达(p<0.01)。NRF2 knockdown和HO-1蛋白抑制剂验证实验表明,Nrf2的激活和HO-1的高表达是苯乙醇苷增强细胞抗氧化能力的主要原因。苯乙醇苷通过竞争性结合Keap1-Nrf2结合界面上的关键氨基酸残基,干扰Keap1-Nrf2结合,从而激活Nrf2-ARE信号通路。
  4.基于6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的斑马鱼PD模型,探讨毛蕊花糖苷对PD斑马鱼的保护作用。结果表明,毛蕊花糖苷能够减少大脑黑质多巴胺能神经元凋亡,中、高浓度显著改善斑马鱼运动行为,使其运动轨迹趋于正常,运动频率升高,其中高浓度组斑马鱼运动速度升幅达19.2%。毛蕊花糖苷显著降低MDA含量(p<0.01),显著提高抗氧化酶活性(p<0.01),综合三个抗氧化酶活性变化,三个浓度处理组的作用效果如下:中浓度组>高浓度组≈低浓度组。
  5.依据PD的发病机制和病理特点,从Nrf2信号通路、PD相关基因及血脑屏障三方面展开研究,探讨毛蕊花糖苷通过增强机体抗氧化应激能力预防PD发生的作用机制。结果表明,毛蕊花糖苷可以透过血脑屏障,显著提高Nrf2-ARE信号通路上主要作用元件的转录水平(p<0.01),显著提高PD相关基因的转录水平(p<0.01)。此外,随着PD斑马鱼运动障碍、多巴胺能神经元凋亡等症状的减轻,其血脑屏障功能障碍逐步改善。
  综上所述,苯乙醇苷类化合物与Keap1亲和力高,是Nrf2的潜在激活剂。在氧化应激损伤细胞模型中,苯乙醇苷类化合物通过竞争性结合Keap1-Nrf2结合界面上关键氨基酸残基激活Nrf2-ARE信号通路,进而提高细胞内抗氧化酶活性、降低细胞内ROS和MDA含量,最终减少由氧化应激损伤引起的细胞凋亡,其中毛蕊花糖苷抗氧化应激效果较佳。在氧化应激损伤动物模型中,毛蕊花糖苷可以透过血脑屏障、提高Nrf2-ARE信号通路及抗氧化应激基因转录,对氧化应激导致的PD起到改善作用,是预防PD发生的潜在药物。
[硕士论文] 穆亚榕
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种致死性的神经退行性疾病,目前尚无治愈手段。在确诊病例中,90%为散发性ALS,剩下10%为家族遗传性。目前已知多种致病基因,其中20%的家族性ALS患者携带突变的铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSuperoxide dismutase1,SOD1)基因,这些患者的运动神经元内往往有大量突变的SOD1G93A聚集物积累,进而导致运动神经元死亡。
  自噬是细胞对自身多余蛋白质和受损细胞器进行吞噬、降解和循环再利用的过程。在自噬发生过程中,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)扮演着非常重要的作用。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,它能够磷酸化ULK1的S757位点,从而抑制自噬体的组装。而另一方面,AMPK能够磷酸化激活ULK1的S555位点,从而诱导自噬的发生。来氟米特是一种免疫抑制剂,广泛应用于治疗类风湿性关节炎、自身免疫性疾病和器官移植。近期我们发现,来氟米特(Leflunomide)及其活性代谢产物A771726能够抑制S6K1的活性。S6K1位于mTOR下游,是一种可以被mTOR磷酸化激活的丝氨酸/苏氨酸激酶。有研究表明,在S6K1缺失小鼠和S6K1-/-肌管中,AMPK活性上调。但S6K1能否在哺乳动物细胞中调节自噬尚不明确。我们设想,来氟米特能够通过抑制S6K1的活性激活AMPK,诱导自噬发生,进而减少SOD1G93A在神经元中的聚集,延缓ALS。
  为验证假设,首先用A771726处理NSC34细胞,并对自噬相关蛋白进行Western blot分析。结果显示,A771726能够反馈激活PI3K通路,显著提高自噬标志物LC3II的表达,且呈时间剂量依赖效应。共聚焦分析显示,与阴性对照组相比,A771726组NSC34细胞胞浆内自噬体数量明显增加。这些实验说明,A771726的确能够诱导自噬。为进一步验证S6K1抑制是否能够引起自噬,分别用siRNA和S6K1抑制剂PF-4708671处理NSC34细胞,Westernblot分析表明,S6K1被抑制后,LC3II表达显著上调。共聚焦分析也显示,S6K1被抑制后,胞浆内自噬小体数量显著增加,说明抑制S6K1能够引起自噬。
  为深入探究A771726诱导自噬的机制,分别用A771726、S6K1 siRNA和PF-4708671处理NSC34细胞,Western blot结果显示,S6K1的抑制能够上调AMPKT172、ACCS79和ULK1S555的磷酸化水平,并反馈性激活ULK1 S757。为探究TAK1在A771726介导的自噬中扮演何种角色,我们用TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol或TAK1 siRNA作用于NSC34细胞,后经A771726处理。Western blot分析显示,A771726能够磷酸化激活TAK1T184/187,而其活性被抑制后,可显著降低AMPKT172、ULK1S555的磷酸化水平,以及LC3II的表达水平,提示TAK1可能是通过影响AMPK磷酸化,进而调节A771726诱导的自噬。
  最后,我们研究了A771726对SOD1突变蛋白聚集物的清除效果。GFP-SOD1WT和GFP-SOD1 G93A质粒分别转染NSC34细胞,后经A771726处理。共聚焦显微镜分析显示,A771726能够显著减少GFP-SOD1阳性细胞的数量。酶标仪及流式细胞仪分析显示,A771726显著减少了GFP-SOD1WT和GFP-SOD1G93A转染细胞的平均荧光强度。Western blot结果表明,A771726显著减少了SOD1G93A聚集物的表达。为进一步探究GFP-SOD1G93A突变蛋白聚集物的减少是否是通过自噬途径降解,我们将细胞中自噬相关基因ATG7沉默,后经A771726处理。Western blot分析显示,ATG7缺失能够抑制A771726诱导的LC3II表达,并阻断对SOD1G93A聚集物的清除作用。
  以上实验结果表明,A771726能够通过抑制S6K1的表达激活自噬,并促进SOD1G93A突变蛋白聚集物的自噬性降解。
[博士论文] 李青坡
药剂学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:借助于纳米药物传递系统实现药物的病灶部位靶向递送,实现时空可控的药物释放是增加药物治疗功效,降低毒副作用的有效手段。本研究首先以克隆重组技术成功制备抗人表皮生长因子受体2抗体(HER2ab),并采用两种设计实现了通过近红外光介导的药物靶向控制释放行为,以及针对HER2ab阳性表达肿瘤的多模式靶向联合治疗。
  首先设计了一种新型近红外光动力响应的药物控制释放系统。制备一种包含有特殊磷脂材料(1-(1Z十八碳烯基)-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,PLsPC)和近红外光敏剂吲哚菁绿(Indocyanine Green,ICG)的光敏性脂质体;以盐酸阿霉素(Doxorubicin,DOX)为模型抗肿瘤药物,将其包封于脂质体内;脂质体表面进一步修饰抗HER2抗体,可以主动识别HER2高表达的肿瘤细胞。所构建的光敏脂质体(HER2-I&D-LSL)在近红外照射下,能产生大量活性氧(ROS),实现对肿瘤的光动力治疗;同时氧化PLsPC中的乙烯醚键,使其发生断裂,导致该磷脂分子失去一条疏水脂质链,脂质膜结构紊乱,从而触发DOX的释放,发挥抗肿瘤的化疗作用。研究先验证了NIR(Near-Infrared)光照下HER2-I&D-LSL在体外溶液中以及在细胞内均能产生大量ROS。控制药物释放的程度主要与脂质膜中PLsPC比重、ICG-ODA量以及光照的条件有关。该脂质体能有效被肿瘤细胞摄取,由于其表面修饰有anti-HER2抗体,因此表现出对HER2受体高表达的肿瘤细胞均具有更高的内在化和累积能力。摄取了光敏脂质体的肿瘤细胞,经近红外光照射下,均能触发药物从脂质体中释放,导致细胞内游离DOX的浓度明显增加。体外肿瘤细胞杀伤力测试中,发现结合了NIR光照的脂质体同时产生光动力与化疗功效,引起的癌细胞损伤显著高于单纯的化疗作用。针对高HER2表达的癌细胞,由于HER2受体的介导,靶向光敏脂质体HER2-I&D-LSL比非靶向光敏脂质体I&D-LSL具有更强的抗肿瘤活性。在针对多种动物肿瘤模型的体内抗肿瘤实验中,证明较之单一的光动力和单一的DOX化疗,HER2-I&D-LSL结合NIR照射表现出更强的肿瘤生长抑制,同时并未导致明显的系统毒性。
  本研究进一步将DOX和具有近红外光热转化效应的中空金纳米球(HAuNS)包裹于脂质体中,HER2ab修饰于脂质体表面,构建了一种近红外光热效应的光敏脂质体(HER2-DOX-PSL)。为了实现高的HAuNS包封,采用了十八烷基-3-巯基丙酸酯(OMP)修饰HAuNS表面,进行疏水改性。在NIR激光照射下,HER2-DOX-PSL产生明显光热作用,导致DOX迅速从脂质体中释放出来。在同时荷有HER2ab阳性和阴性肿瘤的裸鼠双肿瘤模型实验中,证实了HER2介导的脂质体肿瘤靶向递送作用。HER2-DOX-PSL与NIR激光照射结合产生了明显的体内抗肿瘤效果,肿瘤抑制效率高达92.7%,显著优于单纯的光热治疗或化疗,这主要归因于该脂质体在HER2阳性表达肿瘤中的积累增加,以及产生的光热化疗的联合双重效果。更重要的是与非靶向脂质体DOX-PSL相比,HER2-DOX-PSL明显表现出更低的系统毒性,这主要是因为在获得好的抗肿瘤效果的前提下,HER2-DOX-PSL可以实现更小的DOX给药剂量,更少的正常组织中脂质体积聚以及更低的NIR照射功率。
  本论文设计新型载药光敏脂质体,以实现NIR介导药物触发释放和多模式的肿瘤联合治疗,为肿瘤临床安全有效治疗提供一条新的可能的途径。
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