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[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[硕士论文] 刘文迪
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:近年来,肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)的发病率和死亡率在全球范围内大多数国家和地区呈上升趋势。虽然ICC的发病率比肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)低,但由于ICC的预后较差,对ICC进行准确的分期十分重要。虽然目前已存十余种分期系统,但应用最广泛的是美国癌症委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)提出的TNM分期系统。但由于AJCC分期系统是在西方患者数据基础上提出的,能否准确的为中国ICC术后患者进行生存预测还需进一步验证。本研究旨在分析中国ICC术后患者的不良预后危险因素,进一步对第8版AJCC分期系统进行外部验证,评估其预测效能。
  方法:对828例行部分肝切除手术的ICC患者进行回顾性分析研究,以第7、8版AJCC分期系统、LCSGJ分期系统、NCCJ分期系统、Uenishi分期系统、NMU分期系统作为标准分别对患者进行分期。对所有患者的临床特征和手术病理资料进行统计分析,采用Kaplan-Meier法和Cox风险回归模型计算分析长期生存状况,进一步通过计算对数似然比值(-2log likelihood)和线性趋势卡方检验(Linear trend x2test)以及C指数(C-index)、赤池准则(Akaike information criterion,AIC)、受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下面积(area under the curve,AUC)来评估不同分期系统的检验效能大小。
  结果:最终纳入研究的780例患者的整体中位生存时间是15.18个月,1年、3年、5年生存率分别是50%、26%、16%。其中死亡632人,存活148人。男性有505例(64.7%),女性275例(35.3%),男∶女=1.84∶1,中位发病年龄为55.56(范围:23-85)岁。
  (1)多因素Cox风险回归模型结果显示:肿瘤多发(HR1.688;95%CI1.412-2.018),区域淋巴结转移(1.631;1.333-1.994),CEA>10μg/L(1.460;1.147-1.858),CA199>39U/ml(1.456;1.214-1.745),PreALB<170mg/L(1.454;1.192-1.773),AFP>20μg/L(1.441;1.133-1.832),肝内胆管结石(1.403;1.020-1.932),肿瘤直径≥5cm(1.319;1.079-1.613),血管侵犯(1.317;1.078-1.609)是不良预后的独立危险因素。
  (2)第8版AJCC分期系统TNM分期的Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ期的中位生存时间分别为46.90、27.53、12.43、15.07、9.00、7.10个月。各分期分别与Ⅰa期对比计算HR值,依次为:1.424(95%CI1.071-1.893),2.647(2.076-3.375),2.985(1.506-5.914),3.840(2.976-4.953),4.545(3.428-6.027)。第8版AJCC分期系统总体上具有显著差异(P<0.001),但只能区分Ⅰa和Ⅰb、Ⅰb和Ⅱ期。
  (3)第8版AJCC分期的T分期包括的T1a、T1b、T2、T3和T4期,对应的中位生存时间分别为46.9、27.53、12.4、15.07、10.2个月。各分期逐一与T1a期对比后的HR分别为:1.438(95%CI1.081-1.911),2.727(2.137-3.479),3.128(1.577-6.203),3.572(2.507-5.090)。整体的T分期具有显著的统计学差异(P<0.001),能够显著区分T1a和T1b、T1b和T2期。
  (4)与第7版AJCC、LCSGJ、NCCJ、Uenishi分期系统相比较,第8版AJCCTNM分期的C-旨数、Linear trend x2test值、AUC值高于上述4个分期的对应值(0.660、88.953、0.754),而AIC值以及-2Log Likelihood值则小于他们的对应值(7444.89、7430.094)。第8版AJCC T分期的C-于旨数、Linear trend x2test值、AUC值也均大于这4个系统的对应值(0.632、57.025、0.716),而AIC值以及-2Log Likelihood值小于他们的对应值(4836.79、4823.992)。但是,NMU分期系统的C哥旨数、Linear trend x2test值、AUC值在所有系统中最高,而AIC值以及-2Log Likelihood值最小。
  结论:第8版AJCC分期系统可能优于第7版AJCC分期系统、LCSGJ分期系统、NCCJ分期系统、Uenishi分期系统,但可能要劣于NMU分期系统,仍无法对每期患者进行准确分层,仍需进一步优化,并需多中心的大样本研究进一步外部验证。
[硕士论文] 黄晓培
公共卫生 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)是目前应用最为广泛的新型纳米纤维材料,在纤维特征和暴露方式上与石棉极其相似,故其对人体能否产生与石棉类似的危害效应受到高度关注。现有研究表明,MWCNTs能诱导动物间皮瘤(2017年被国际癌症研究机构列为2B类致癌物),对人类具有巨大的潜在威胁,但其作用机制不明;中国是MWCNTs的生产和消费大国之一。所以,研究MWCNTs致胸膜间皮瘤的分子机制,可为更准确地评价其安全性,制定有效防治措施提供科学依据,无疑具有重要的科学意义和实际意义。
  MWCNTs的炎性诱导作用是其目前较公认的主要毒效应机制之一,慢性炎症是石棉致胸膜间皮瘤发生发展中的重要因素,胸膜腔持续的慢性炎症也是MWCNTs致小鼠胸膜腔间皮瘤的显著特征。所以,慢性炎症在MWCNTs致胸膜间皮瘤过程中起什么作用,是通过何种途径实现,成为阐明MWCNTs致胸膜间皮瘤分子机制的关键问题。但目前对慢性炎症在MWCNTs致胸膜间皮瘤作用机制研究中,存在以下问题:(1)动物实验均采用高剂量、一次性注射的给药方式。MWCNTs致胸膜间皮瘤是一个长期、低剂量持续作用过程,一次性注射在暴露途径和暴露剂量上无法模拟MWCNTs的真实暴露情况。(2)体外实验多采用单细胞培养,无法模拟胸膜腔内的细胞环境。认为只有基于真实暴露剂量和暴露环境的实验体系,才有可能阐明MWCNTs致间皮瘤的分子机制。
  本研究采用低剂量、长期染毒的作用模式,通过人胸膜间皮细胞和巨噬细胞共培养体系探讨慢性炎性反应在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中的作用及其分子机制,以期为纳米材料从业人员的职业安全防护提供科学依据,为间皮瘤的治疗提供新的思路和借鉴。
  方法:
  本实验分为四组,人胸膜间皮细胞组、巨噬细胞+人胸膜间皮细胞组、MWCNTs+人胸膜间皮细胞组和MWCNTs+巨噬细胞+人胸膜间皮细胞组;MWCNTs的终浓度为0.1μg/mL;作用时间为3个月;利用以下实验进行研究:
  1.通过扫描电镜和透射电镜来考察受试MWCNTs的纤维特征是否符合“病理性纤维”的前提条件;
  2.通过比较不同组别间细胞因子的表达量变化,考察MWCNTs是否能诱导炎性反应以及间皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用;
  3.通过细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、克隆形成实验、染色体畸变实验和动物成瘤实验,考察炎性细胞在MWCNTs致人胸膜间皮细胞恶性转化中的作用;
  4.通过转录组测序技术筛选MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化中相关候选基因;并用qRT-PCR及western blot实验技术对候选基因进行验证,提出可能的分子作用机制;
  5.构建候选基因稳转敲低的胸膜间皮细胞株,在MWCNTs作用下与巨噬细胞共培养后,通过比较不同组别之间细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力,考察候选基因在MWCNTs致间皮细胞恶性转化中的作用;
  6.构建候选基因稳转敲低的间皮细胞株,通过western blot技术检测候选基因敲除的间皮细胞+MWCNTs+巨噬细胞体系中间皮细胞的蛋白表达含量,确定基因之间相互作用关系。
  结果:
  通过以上实验,得到了如下结果:
  1.本实验所用的MWCNTs平均长度范围为10-20μm,管径范围为30-50nm,符合病理性纤维的特征。
  2.MWCNTs作用于巨噬细胞可引起IL-1β细胞因子表达的显著改变;巨噬细胞与间皮细胞之间存在密切联系:MWCNTs作用于巨噬细胞所分泌的IL-1β能显著增强间皮细胞IL-8、TNF-α和IL-6等炎性因子的释放。
  3.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的间皮细胞染色体畸变增加;MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中,间皮细胞染色体畸变率均高于其它组,差异具有统计学意义;此结果表明,低剂量的MWCNTs体外长期作用于间皮细胞可使其染色体畸变有增加的趋势,巨噬细胞可能对MWCNTs致染色体畸变效应具有促进作用;
  4.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的间皮细胞发生恶性转化;MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中,间皮细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力均明显高于其它组,差异具有统计学意义;此结果表明:巨噬细胞对MWCNTs致间皮细胞的恶性转化作用具有明显的促进作用。
  5.皮下接种MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中间皮细胞的裸鼠,其肿瘤体积和成瘤组织中细胞的Ki67阳性率明显高于其它组,差异具有统计学意义;此结果提示与巨噬细胞共培养后的间皮细胞恶性转化程度更高。
  6.通过转录组测序,筛选出一系列差异表达基因;结合前部分的研究结果,认为其中NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因与MWCNTs致间皮细胞恶性转化关系最为密切;qRT-PCR及western blot实验结果显示,MWCNTs+巨噬细胞+间皮细胞共培养体系中间皮细胞的NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因和蛋白质表达量均明显升高,与其他组比较差异具有统计学意义。以上结果提示:NF-κB(p65),IL-6,STAT3基因在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中发挥作用。
  7.间皮细胞(sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬细胞共培养体系中,间皮细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力均明显低于间皮细胞(sh-NC)+MWCNTs+巨噬细胞组,差异具有统计学意义;此结果证明,NF-κB、IL-6、STAT3在MWCNTs致胸膜间皮细胞恶性转化中发挥重要作用。
  8.间皮细胞(sh-NC or sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬细胞共培养体系中,敲低NF-κB(p65)后,IL-6、STAT3蛋白水平表达量均降低;敲低IL-6R后,NF-κB蛋白水平表达量不变,STAT3蛋白表达量降低;敲低STAT3后,NF-κB(p65)、IL6R蛋白表达量均不变。此结果表明在MWCNTs致胸膜间皮细胞的恶性转化中存在NF-κB/IL-6/STAT3分子级联,且NF-κB/IL-6/STAT3通路具有重要作用。
  结论:
  通过上述研究,得出了以下结论:
  1.MWCNTs刺激巨噬细胞所分泌的以IL-1β为主的细胞因子能显著增强间皮细胞炎性因子的释放;
  2.在低剂量MWCNTs的长期作用下,体外培养的人胸膜间皮细胞可发生恶性转化;
  3.炎性反应可显著促进MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化作用
  4.NF-κB/IL-6/STAT3分子通路在炎性反应促MWCNTs致人胸膜间皮细胞的恶性转化中发挥重要作用。
[硕士论文] 石伟林
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  表没食子儿茶素表没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最丰富的成份,前期研究报道,EGCG具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,但其具体的作用机制还不明确。本研究旨在探讨EGCG抑制乳腺癌细胞迁移及炎症反应的分子机制,为EGCG的进一步开发及其在乳腺癌临床防治中的应用提供科学依据。
  方法:
  1.研究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响
  用不同浓度的EGCG(5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,分别在24h、48h、72h采用Alarmar blue染色法检测细胞活性,确定EGCG最适的作用浓度和时间。按照上述实验确定EGCG作用于乳腺癌细胞的合适浓度和时间,依次处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,进行划痕和Transwell实验,进而探究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响。
  2.EGCG影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过RT-qPCR和Western blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的表达水平,同时检测肿瘤抑制基因SCUBE2的表达变化,分析SCUBE2与迁移相关基因表达的关系。
  3.证明EGCG是通过影响SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移
  首先,利用免疫组化技术,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2的蛋白表达水平,确定SCUBE2与乳腺癌发生发展的关系;然后,构建SCUBE2基因的shRNA重组慢病毒载体,筛选得到干扰SCUBE2的稳转乳腺癌细胞系,检测干扰SCUBE2对E-cadherin和Vimentin基因表达的影响;最后,EGCG处理敲降SCUBE2的稳转细胞,采用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。
  4.确定EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区DNA甲基化实现的
  利用重亚硫酸盐处理及克隆测序的方法,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2启动子区的DNA甲基化水平差异。EGCG处理乳腺癌细胞后,与对照组比较,分析SCUBE2基因启动子区甲基化程度的改变,同时通过RT-qPCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin基因的表达,证明EGCG能够影响SCUBE2启动子区DNA的甲基化,进而影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达。
  5.探究EGCG对乳腺癌细胞炎症因子释放的影响
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和MCP-1的表达水平;此外,采用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用含EGCG培养基培养,检测细胞因子的变化,分析参与EGCG抑制细胞因子释放的可能信号通路。
  结果:
  1.细胞活性检测结果显示,当EGCG浓度为20μM、作用时间达到24h时,乳腺癌细胞活力受到显著抑制(p<0.05),因此本研究随后以此条件开展实验。划痕和Transwell结果表明,EGCG能够显著抑制LPS诱导的乳腺癌细胞迁移(p<0.01)。
  2.EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用,伴随着迁移相关标志基因E-cadherin的上调和Vimentin的下调,此外,我们发现肿瘤抑制基因SCUBE2显著上调,由此我们推测SCUBE2基因可能与EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用有关。
  3.免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,SCUBE2在乳腺癌组织中的表达明显降低,说明SCUBE2的低表达能够促进肿瘤的发生发展。干扰SCUBE2基因后,E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,说明SCUBE2在E-cadherin和Vimentin的上游对其进行调控。用EGCG处理干扰了SCUBE2的稳转细胞系后,我们发现EGCG的抑制作用减弱,证明EGCG是通过上调SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移。
  4.SCUBE2启动子区的DNA甲基化程度在乳腺癌组织中显著高于癌旁组织(p<0.05),这与基因表达检测结果一致。EGCG处理乳腺癌细胞后,检测SCUBE2的甲基化变化,结果显示EGCG可以显著降低SCUBE2的甲基化比率(p<0.05),由此说明EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区甲基化实现的。
  5.ELISA结果显示,EGCG处理能够显著抑制炎症相关因子(IL-6和MCP-1)的表达。用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用EGCG处理,我们发现EGCG对炎症相关因子表达的调控作用与单独S3I-201处理组相比变化不显著,因此,我们推测EGCG可能通过STAT3信号通路来调控乳腺癌相关炎症因子的表达。
  结论:
  EGCG通过影响SCUBE2启动子区的甲基化水平来实现对其表达的调控,SCUBE2进而通过调节迁移相关基因(E-cadherin和Vimentin)的表达,最终抑制乳腺癌细胞迁移。此外,EGCG可能通过STAT3信号通路来抑制的乳腺癌相关炎症因子的表达。
[硕士论文] 罗荣
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 臭氧化生理盐水治疗兔VX2肿瘤的有效性及安全性研究
  目的:研究瘤内注射臭氧化生理盐水治疗VX2肿瘤的有效性及安全性。
  方法:72只载瘤新西兰大白兔随机分为4组,每组18只,经耳缘静脉注射浓度为3%硫酸戊巴比妥钠(0.8-1ml/Kg)麻醉后,于心脏搏动最强处采血3ml,超声检测肿瘤大小,记录肿瘤最大切面的长径(a)及相垂直的短径(b),按公式V=1/2ab2计算肿瘤体积;B超引导下分别予以注射单次2倍肿瘤体积的低温生理盐水(A组)、单次臭氧化生理盐水(B组)、2次臭氧化生理盐水(连续2天,C组)、3次臭氧化生理盐水(连续3天,D组);于术后第4天、8天、12天分别心脏采血3ml,检测血液中白细胞计数、红细胞计数、血小板、血红蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐及尿素的变化,并用超声检测肿瘤的大小,计算肿瘤体积及肿瘤生长率。各组各时间节点随机选取6只经耳缘静脉注射空气15-20ml死亡后,切除肿瘤浸泡于10%福尔马林中。采用TUNEL法检测肿瘤内细胞凋亡情况。统计学方法采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
  结果:1、各组各时间节点肿瘤均不同程度增大,臭氧化生理盐水组的肿瘤生长速率明显低于生理盐水组,且B组效果最佳,于各时间节点B组与A组相比较均存在统计学意义(第4天时P=0.000,第8天时P=0.003,第12天时P=0.009),而臭氧化生理盐水组之间肿瘤生长率无统计学意义(P>0.05);2、各组各时间节点白细胞计数、红细胞计数、血小板、血红蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐及尿素之间均不存在统计学意义(P>0.05);3、各组各时间节点之间肿瘤内细胞凋亡之间亦不存在统计学意义。
  结论:瘤内注射臭氧化生理盐水能够明显减慢肿瘤的生长速度,单次瘤内注射似乎优于连续多次注射(未呈现统计学差异)。瘤内注射臭氧化生理盐水对肿瘤内的凋亡情况无影响,因此臭氧化生理盐水可能并不是通过增加肿瘤内的细胞凋亡来减慢肿瘤生长速度的,同时瘤内局部注射臭氧化生理盐水对肝肾功能、血常规无影响,因此瘤内注射臭氧化生理盐水是一种安全、有效的抗肿瘤方法。
  第二部分 臭氧化生理盐水瘤内注射对肿瘤浸润淋巴细胞的影响
  目的:探讨臭氧化生理盐水VX2瘤内注射对肿瘤内浸润性淋巴细胞的影响。
  方法:经臭氧化生理盐水或者生理盐水治疗后的肿瘤标本采用免疫组化技术检测肿瘤内CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的浸润情况,用Image proplus 6.0生物医学影像分析系统进行相应染色强度即累积吸光度检测,记录单位面积的累积吸光度值。统计学方法采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
  结果:1、C组、D组肿瘤内CD3+T淋巴细胞浸润在各时间节点均高于A、B组,但仅在第4天时与B组存在统计学意义(相对应的P值依次为0.009,0.03),其余各时间节点及各组间均不存在统计学意义。2、第4天时,C组肿瘤内CD4+T细胞浸润高于A、B组,且与A、B组均存在统计学意义(P<0.05),D组肿瘤内CD4+T细胞浸润亦高于A、B组,但仅与A组有统计学意义(P=0.010),其余各组间无统计学意义;第8天时C组肿瘤内CD4+T细胞浸润高于A、B、D组,但仅与D组存在统计学意义(P=0.036),其余各组间无统计学意义;第12天时D组肿瘤内CD4+T细胞浸润高于A、B、C组,但均无统计学意义,且高于第8天时D组肿瘤内CD4+T淋巴细胞(P=0.012),其余各组内无统计学差异存在。3、C组肿瘤内CD8+T淋巴细胞浸润在各时间节点高于A、B、D组,第8天时与A组存在统计学意义(P=0.030),第12天时与A、B组均存在统计学意义(P<0.05),D组肿瘤内CD8+T细胞浸润在各时间节点高于A、B组,但仅在第12天时与A、B组存在统计学意义(P<0.05),其余各组及各时间节点内无明显意义。
  结论:单次臭氧化生理盐水瘤内注射对肿瘤内浸润性CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的无明显影响,2次或者3次臭氧化生理盐水瘤内注射在某些时间节点能够增加肿瘤内CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的浸润,且以连续2天注射效果最佳。
[硕士论文] 王万敏
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性支气管肺癌(简称肺癌)是全球最常见的实体恶性肿瘤之一,是全世界每年癌症相关死亡最常见的原因。我国最新数据表明肺癌发生率及死亡率均居恶性肿瘤的首位,其中女性发病率仍处于逐年上升趋势,年平均增长约0.9%。
  作为全球重要的公共医疗问题,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)表面抗原阳性流行率目前约为3.61%,全球统计数据结果显示全球约20亿人曾感染HBV,其中约2.4亿人为慢性HBV感染者。我国作为HBV感染最严重的国家之一,1~59岁普通人群中乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性携带率的最新数据为7.18%。
  据前期研究报道称,恶性肿瘤患者中HBsAg阳性率可达12%。合并HBV感染的肿瘤患者预后较差,认为接受化疗、放疗、靶向药物等相关病因治疗时可引起药物性肝脏损伤,还可能因乙型肝炎病毒再激活(hepatitis B virus reactivation,HBVR)导致病毒复制、机体免疫应答等因素造成进一步肝功能损伤。合并HBV感染可能是恶性肿瘤患者预后不良的独立危险因素。肺癌合并HBV感染的患者在临床上较为常见,HBV感染相关的肺癌患者治疗期间出现肝功能损伤风险的相关研究目前报道较少。
  研究目的:
  分析HBV感染的肺癌患者抗肿瘤治疗过程中肝功能损伤及HBVR的风险,旨在探讨肺癌患者肝功能损伤与HBV感染的相关性及预防性抗病毒治疗的临床的意义,从而为此类患者的个体化综合治疗提供一定的理论依据。
  研究方法:
  收集2015年6月-2017年6月在长海医院住院治疗的HBsAg阳性肺癌患者共61例(HBsAg阳性组),根据有无预防性抗病毒治疗分为预防性抗病毒组29例(干预组),未预防性抗病毒组32例(对照组),收集同期住院未合并HBV感染的肺癌患者61例为(HBsAg阴性组)。干预组在抗肿瘤治疗前1周即开始口服使用抗病毒药物恩替卡韦10mg、拉米夫定100mg,1次/天。对照组抗肿瘤治疗前未进行干预治疗。观察上述患者第1次、第3次、第5次入院时血清肝功能水平及HBsAg阳性组患者乙型肝炎病毒脱氧核糖苷酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV-DNA)水平。
  研究结果:
  1.HB sAg阳性组与阴性组比较:第3次入院时两组患者丙氨酸氨基转移酶、(P=0.048)、总胆红素(P=0.012)、前白蛋白(P=0.01)异常人数存在统计学差异。
  2.HBsAg阳性组中干预组与阴性组比较:第1次住院时丙氨酸氨基转移酶异常人数分别为4/29(13.7%)和2/61(3.3%)(P=0.029);第3次、第5次住院时干预组转氨酶水平大致恢复正常,与阴性组比较无差异。
  3.HBsAg阳性组中对照组与阴性组比较:第1次住院时肝功能异常人数差异无统计学意义(P>0.05);第3次、第5次住院时天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、凝血酶原时间异常人数均明显高于阴性组(P<0.05)。
  4.HBsAg阳性组内干预组与对照组比较:第3次入院时丙氨酸氨基转移酶(P=0.003)、天冬氨酸氨基转移酶(P=0.007)、总胆红素(P=0.024)水平均低于对照组;两组肝功能损伤发生率分别为3.4%和25%,中重度升高者占所有肝损患者的比率分别为0%和75%,两组间统计学差异有显著性(P=0.003)。
  5.HBVR发生率干预组与对照组比较明显减低(9%vs19%)。
  研究结论:
  HBsAg阳性肺癌患者肝功能损伤较HBsAg阴性者升高。预防性抗病毒可降低肝功能异常的风险及HBV再激活发生率,预防性抗病毒治疗存在其必要性。
[硕士论文] 苗帅
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  神经系统副肿瘤综合征(PNS)是与肿瘤相关的、自身免疫性神经系统症候群。国外学者研究表明,PNS的发病与个体免疫差异、种群特征、遗传因素等相关。目前国内尚无大规模临床研究,有关汉族人群PNS临床特点的资料较少。本研究通过回顾性分析济南军区总医院PNS患者的临床资料,总结山东地区汉族人群PNS的临床特征,为进一步临床研究打下基础。
  研究方法:
  回顾性分析2011年1月至2014年12月于我院诊断的28例PNS患者临床资料,包括一般资料、临床表现、实验室检测、辅助检查、肿瘤筛查结果、治疗方案等,同时根据需要检测患者特征性抗神经元抗体(免疫印迹法)和抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体(免疫荧光法)。
  研究结果:
  28例PNS患者中,男性占71.4%,女性占28.6%,年龄分布在29-77岁,中位发病年龄为56(47,64)岁。4例(14.3%)患者为急性起病,24例(85.7%)为亚急性或慢性起病,最常见的临床症状为肌无力。经典临床综合征有21例,非经典临床综合征7例,其中感觉运动性周围神经病(7例,25.0%)、Lambert-Eaton综合征(6例,21.4%)和边缘叶脑炎(5例,17.9%)为最常见的三种临床综合征。7例感觉运动性周围神经病患者中,有6例感觉、运动神经同时受累,1例仅感觉神经受累。6例Lambert-Eaton综合征患者行重复神经电刺激(RNS),均出现低频(1-SHz)刺激时复合肌肉动作电位(CMAP)波幅递减,高频(>10Hz)刺激时波幅递增,且50Hz时递增大于100%。5例边缘叶脑炎患者脑脊液检测均见炎性改变,脑电图均为全头区弥漫性慢波,2例患者颅脑MRI出现异常信号,3例患者血清和脑脊液抗NMDA受体抗体阳性。血清肿瘤标志物阳性率为44.0%,CEA和NSE为阳性率最高的标志物,肿瘤标志物阳性组和阴性组的肿瘤发生率无统计学差异。血清特征性抗神经元抗体阳性率为40.7%,抗Hu抗体为阳性率最高的抗体,特征性抗体阳性组与阴性组的肿瘤发生率无统计学差异。25例(89.3%)患者神经系统症状出现在原发肿瘤之前,3例(10.7%)患者神经系统症状出现原发肿瘤之后。共有21患者发现肿瘤,其中最常见的为肺癌(10例,47.6%),其次为消化道肿瘤(3例,14.3%)。明确病理类型的肺癌患者中,小细胞肺癌最常见。经典临床综合征组肿瘤发生率为81.3%(13/16),非经典临床综合征组肿瘤发生率为75.0%(6/8),两组肿瘤发生率无明显统计学差异。17例接受肿瘤治疗和/或免疫治疗的患者,治疗前和治疗后1个月的mRS评分有统计学意义(P<0.001),患者短期生活质量改善,有效率为76.5%(13/17),特征性抗体阳性组和阴性组有效率无统计学意义。
  研究结论:
  大多数PNS患者呈亚急性或慢性起病,临床表现复杂多样,且神经系统症状往往出现在肿瘤之前。对于拟诊为PNS的患者,无论肿瘤标志物和/或抗神经元抗体阳性与否,应行肿瘤筛查。初次筛查未发现肿瘤的患者中,应长期随访、反复筛查。肿瘤治疗和/或免疫治疗能改善患者短期生活质量,抗神经元抗体阳性和阴性组有效率无差异。
[硕士论文] 李风伟
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,高居于癌症相关死亡率第三位1,2。全球超过一半的肝细胞癌死亡病例发生在中国1。目前肝细胞癌的治疗方法包括手术切除、肝移植、介入治疗、放化疗及靶向治疗。手术切除仍是治疗肝细胞癌的主要治疗方法,然而根治性切除后复发率高、转移率高仍是影响肝细胞癌患者术后预后的主要因素。因此,探索影响肝细胞癌生长、侵袭、转移的因素并针对此开发新的治疗措施,是当今肝细胞癌研究中的重点和难点。
  腺苷(Adenosine)是合成三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)的前体物质,同时,作为腺嘌呤核苷酸代谢的中间产物,腺苷几乎产生于所有的细胞,普遍存在于机体的各个系统。腺苷通过A1、A2A、A2B和A3四种腺苷受体作用于人体各个系统,参与多种生理病理过程的调节。越来越多的证据表明,腺苷对人体的多种疾病的发生过程都有十分重要的调节作用3。目前的研究发现,腺苷通过腺苷A2A受体参与了体内的多个病理生理过程的调节,在肿瘤微环境中亦起到了非常重要的调节作用。肿瘤微环境中的腺苷通过腺苷A2A受体抑制了免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。大量研究报道了选择性腺苷A2A受体拮抗剂可以重新激活肿瘤组织中的免疫细胞的免疫作用,因此,选择性腺苷A2A受体拮抗剂有望用于肿瘤的辅助治疗。肿瘤微环境中的腺苷通过腺苷A2A受体在胸腺瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、人头颈部鳞状细胞癌中促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用已有相关研究报道4-7。
  目前,国内外尚无有关腺苷A2A受体在肝细胞癌中的表达及作用的研究报道。本研究拟通过实验研究腺苷A2A受体在肝癌组织及肝癌细胞中的表达状况,对肝细胞癌的增殖、凋亡、血管生成、侵袭的影响,并结合临床,对腺苷A2A受体表达水平与患者预后的关系作出分析,并初步探索腺苷A2A受体的下游信号通路,通过研究,初步探索腺苷A2A受体在肝细胞癌的发生、进展过程中的作用。
  方法:
  一、肝癌组织和癌旁组织中腺苷A2A受体的表达水平
  1、肝癌组织及癌旁组织的收集:所有标本均采集自东方肝胆外科医院手术切除的肝癌及癌旁组织。(经东方肝胆外科医院伦理委员会批准,患者及家属知情并同意)
  2、肝癌及癌旁组织中腺苷A2A受体表达水平的检测:运用qRT-PCR、Western Blot免疫印迹检测每一组肝癌及癌旁组织中腺苷A2A受体表达水平。
  二、体外检测肝癌细胞株和正常肝细胞株中腺苷A2A受体表达的水平
  运用实时定量PCR技术检测腺苷A2A受体在人肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02中的mRNA的表达水平。
  三、构建腺苷A2A受体的干扰慢病毒载体并包装慢病毒
  通过在线软件设计腺苷A2A受体的基因序列,体外合成后经酶切连接到pds019-p16.3-SHRNA-BSD质粒载体上,获得质粒CL810_PDS19-shADORA2A,经验证,酶切验证测序结果正确。用构建好的腺苷A2A干扰慢病毒载体CL810_PDS19-ADORA2A和包装质粒共转染293T细胞,包装慢病毒,收集病毒液并测定滴度。获得滴度合格的腺苷A2A受体干扰慢病毒LV478_PDS19-ADORA2A。
  四、建立腺苷A2A受体稳定低表达肝癌细胞株
  用包装好的腺苷A2A受体干扰慢病毒感染HepG2靶细胞,感染72小时后观察到荧光比例分布达到90%以上,同时未观察到大面积细胞死亡的现象,用qRT-PCR技术检测腺苷A2A受体在两组中的表达水平,结果表明,实验组的腺苷A2A受体mRNA水平较对照组明显降低,沉默效率>70%。说明所构建的慢病毒对腺苷A2A受体表达的干扰效果好,可以用于研究腺苷A2A受体的功能及机制的实验。
  五、体外检测腺苷A2A受体对肝癌细胞株生物学行为的影响
  为了检测腺苷A2A受体对肝癌细胞株生物学行为的影响将通过质粒转染沉默表达腺苷A2A受体的肝癌细胞设置为实验组(shA2A组),将转染无序序列质粒的肝癌细胞设置为阴性对照组(NC组),将没有转染任何序列和质粒的肝癌细胞设置为空白对照组(KB组)。我们的预实验结果显示,腺苷在100μM浓度时,对肝癌细胞的促增殖、促侵袭、抗凋亡等作用最强,因此为研究腺苷对肝癌细胞生物学行为的影响,同时将三组细胞加入到100μM浓度的腺苷中,观察在100μM的腺苷环境中,肝癌细胞各种生物学行为的变化。因此同时设置了shA2A+adenosine组、NC+adenosine组和KB+adenosine组。一共有6组细胞进行体外细胞实验。
  1、腺苷A2A受体沉默对肝癌细胞株增殖的影响:CCK-8法检测六组细胞在培养24小时、48小时、72小时和96小时480nm处的相对吸光度值(OD值),并绘制相对吸光度曲线。
  2、腺苷A2A受体沉默对细胞凋亡的影响:将六组细胞AnnexinⅤ和7-AAD细胞染色后,用流式细胞仪检测其凋亡发生的比例。
  3、腺苷A2A受体沉默后对VEGF表达的影响:qRT-PCR检测六组细胞VEGFmRNA的表达量。
  4、腺苷A2A受体沉默对血管生成能力的影响:取等量六组细胞分别与HUVECs细胞共培养24小时后,在倒置200倍显微镜下观察HUVECs在基质胶上的管样结构生成数量,并随机取三个视野计算血管生成长度。
  5、腺苷A2A受体沉默后对肝癌细胞侵袭能力的影响:将等量的六组的细胞分别接种于有胶质的transwell小室,24小时后结晶紫染色,随机选取3个高倍镜(×400)视野,计数下室的细胞数即为穿透胶的细胞数。
  六、腺苷A2A受体高表达与肝癌患者预后的关系
  采用SPSS23.0软件进行数据分析。应用Kaplan-Meier法绘制总生存期(overall survival,OS)和无瘤生存期(disease free survival,DFS)曲线,应用Log-rank检验比较不同组生存曲线的差异。应用Cox比例风险回归模型行OS和DFS影响因素的单因素分析和多因素分析。采用X-tile软件确定腺苷A2A受体表达水平的最佳截断值为57.7,使2组患者进行术后生存期比较时P值最小(Pmin=0.0023),检验水准(α)为0.05。
  七、腺苷A2A受体介导的下游信号转导通路初探
  运用Western Blot免疫印迹的检测方法,检测六组细胞中AKT、p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表达水平在腺苷A2A受体沉默前后的变化。
  结果:
  1、qRT-PCR的结果表明,腺苷A2A受体在肝癌组织中的相对表达量为2.015±0.078,在癌旁组织中的相对表达量为1.329±0.071,肝癌组织中腺苷A2A受体的表达量高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001)。Western-blot结果也显示,与癌旁组织相比,肝癌组织内的腺苷A2A受体的表达水平升高。
  2、qRT-PCR的结果表明,HepG2细胞株的腺苷A2A受体的表达量明显高于L02细胞系,差异有统计学意义。
  3、CCK-8细胞增殖实验检测腺苷A2A受体表达沉默后,腺苷对肝癌细胞株的促增殖作用基本消失。
  4、流式细胞仪的结果显示,腺苷A2A受体沉默抑制了腺苷的抗凋亡作用。
  5、qRT-PCR的结果表明,腺苷A2A受体沉默减弱了腺苷促进VEGF表达的作用。
  6、HUVECs血管生成实验的结果表明,腺苷A2A受体沉默后腺苷促血管生成作用减弱。
  7、Transwell细胞侵袭实验表明,腺苷A2A受体沉默后腺苷促肝细胞癌侵袭能力减弱。
  8、腺苷A2A受体高表达患者的术后1年、3年OS率低于腺苷A2A受体低表达患者。多因素分析的结果表明,腺苷A2A高表达为影响肝癌患者OS的独立危险因素。
  9、Western Blot的初步结果表明,腺苷能够促进p-AKT和p-ERK蛋白的表达,腺苷A2A受体沉默抑制p-AKT和p-ERK蛋白表达。
  结论:
  我们的研究发现,腺苷A2A受体在肝癌组织和肝癌细胞中高表达。腺苷具有促进肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞凋亡、促进血管生成、促进肝癌细胞的侵袭的作用。腺苷A2A受体沉默后,腺苷对肝癌细胞生长的正向调节作用明显减弱。腺苷A2A受体高表达是影响肝细胞癌患者OS的独立危险因素。对腺苷A2A受体的下游信号通路的初步研究表明,腺苷A2A受体可能介导了PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK两条信号通路。
[硕士论文] 李江
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨长链非编码RNA XIST(lncRNA-XIST)在胃癌组织及血浆中表达水平与临床意义。原代培养人胃粘膜成纤维细胞(Human gastric mucosa fibroblast,HGMF),并在缺氧条件下刺激其活化。在此基础上验证长链非编码RNA-XIST基因(Long non-coding RNA,lncRNA-XIST)是否与胃癌相关成纤维细胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化相关。并寻找可能与RNA-XIST促GCAF活化相关的差异表达基因与信号通路(Pathway)。
  方法:
  收集40例胃癌患者手术切除的胃癌组织及癌旁组织标本,抽取90例胃癌患者术前血浆样本和90例健康体检者血浆样本。利用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测上述标本中lncRNA-XIST的表达水平。进行统计学分析并判断lncRNA-XIST表达水平与胃癌患者临床病理参数(年龄、性别、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、Ki-67阳性率)的关系。通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评价血浆lncRNA-XIST在诊断胃癌时的效能。
  收集胃癌患者术中切除的正常胃粘膜组织,用组织块培养法对胃粘膜成纤维细胞进行原代培养。成功培养后,光学显微镜下鉴定其形态特征,同时用免疫荧光染色鉴定确认细胞来源及纯度;将HGMF与胃癌细胞(SGC-7901和MGC-803)共培养,通过间隙性缺氧处理构建GCAF的体外活化模型。
  建模成功后,用ELISA法检测细胞培养液中α-SMA、FAP的表达情况,利用CCK-8试验、Transwell迁移试验及流式细胞技术分别检测细胞增殖、迁移及抗凋亡能力,验证是否建模成功;
  利用qPCR检测GCAF活化前后的lncRNA-XIST基因表达变化情况,验证lncRNA-XIST与GCAF的活化是否存在相关性。利用siRNA干扰GCAF中的lncRNA-XIST基因表达,用ELISA法检测相关活化因子表达水平。利用CCK-8法、Transwell侵袭试验及流式细胞技术分别检测siRNA转染后GCAF的增殖、侵袭及抗凋亡能力,证实lncRNA-XIST与GCAF活化明确相关;用转录组测序技术(RNASequencing,RNA-seq)检测和分析出siRNA转染GCAF后的差异基因和相关通路,探寻LncRNA-XIST参与GCAF活化的具体机制。
  结果:
  胃癌组织中lncRNA-XIST表达较癌旁组织升高,胃癌组血浆lncRNA-XIST表达高于健康体检组;差异均有统计学意义(P均<0.05)。胃癌组织及血浆中的lncRNA-XIST表达水平与胃癌TNM分期、淋巴结转移、分化程度相关(P均<0.05)。
  培养出的细胞贴壁生长,大小一致,呈长条形或梭状,排列方向大体一致,符合成纤维细胞形态特点。免疫荧光鉴定结果显示细胞结蛋白(Desmin)表达阴性,而波形丝蛋白(Vimentin)表达阳性,符合HGMF的蛋白特征,证明原代培养成功。
  建立GCAF活化模型后,细胞培养液中CXCL12、IL-6、TGF-β1及HGF表达水平均明显高于对照组(HGMF),差异均有统计学意义(P<0.05)。GCAF中α-SMA、FAP相关mRNA较对照组表达明显上调(P<0.05);GCAF活化后的细胞增殖、迁徙、抗凋亡能力较HGMF明显增强(P<0.05);GCAF的lncRNA-XIST表达量较HGMF显著上调(P<0.05)。
  慢病毒转染后,培养液中前述活化效应分子表达水平均低于空白组和阴性对照组(P<0.05),且细胞的增殖、迁移及抗凋亡能力下降(P<0.05);干扰lncRNA-XIST表达后,H19、PTP4A1、EIF3E、KLF5、ALB、CYP24A1等基因差异表达,主要参与组织细胞组成和生物合成的调节、有丝分裂细胞周期等生物过程;参与的细胞组织有囊泡、细胞骨架、膜组织等,参与粘附斑激酶信号通路、FcγR介导巨噬细胞吞噬作用等信号通路。
  结论:
  lncRNA-XIST在胃癌组织及血浆中表达升高,并可以促进GCAF的活化过程;下调LncRNA-XIST表达可以抑制GCAF的增殖与迁移能力,并促进其凋亡,提示LncRNA-XIST有可能成为胃癌新的肿瘤标志物和治疗靶点。
[硕士论文] 夏清明
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:前列腺癌是目前西方发达国家中男性肿瘤发病率和死亡率最常见的肿瘤之一。近年来我国前列腺癌发病率也在逐年攀升。雄激素剥夺治疗一直以来是前列腺癌最经典的治疗方式,但随着治疗的前行,前列癌晚期几乎都会发展为雄激素非依赖性,传统的治疗方式对雄激素非依赖性前列腺癌疗效不佳。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤的一种新型治疗手段,在肿瘤临床治疗上已取得了较好的疗效。本课题选用含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)免疫激活剂,通过穿膜肽修饰的多壁碳纳米管为介导,研究其抗雄激素非依赖性前列腺癌的体内外作用。
  本课题第一部分报道了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体的构建和表征。通过多肽固相合成法合成含有3个组氨酸和6个精氨酸的多肽H3R6,利用制备液相进行纯化以及高效液相色谱和质谱进行纯度分析,检测其纯度符合实验要求。用浓硫酸和浓硝酸对多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)进行羧基化,然后再和多肽反应形成载体MHR。利用核磁共振氢谱,红外光谱、透射电镜和热比重分析鉴定复合物合成成功。利用MHR载体中精氨酸富含正电荷,CpG是核酸类物质带负电荷,通过静电作用形MHR/CpG纳米复合物。在N/P=6时,MHR载体能够有效负载CpG免疫激活剂,当N/P=20时电位处于一个较稳定的状态,电位约=25±2.62mV。通过HEK293转染实验,得出MHR载体在N/P=20转染效率较高。
  本课题第二部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂进行体外细胞学评价,RAW264.7细胞明显对负载CpG纳米免疫制有较高的摄取,CpG能够和胞内内吞体膜上的TLR9受体结合。CCK8细胞毒性实验中,MHR载体对DU145、RM-1和RAW264.7细胞的毒性较低。体外免疫活性ELISA和PCR实验结果显示,MHR/CpG对RAW264.7细胞刺激促进IL-6和TNF-α促炎因子的分泌明显高于单体CpG组,和LPS(10ng/ml)刺激效应具有可比性。
  本课题第三部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂体内的抗前列腺癌效应和免疫活性。我们成功构建了DU145前列腺癌BALB/c裸鼠和RM-1前列腺癌BALB/c小鼠模型,通过小动物活体成像系统观察结果显示,MHR/CpG可以有效的在肿瘤和肿瘤引流淋巴结部位蓄积,有靶向效果。体内药效结果表明MHR/CpG对前列腺癌的增殖有较强的抑制作用,从小鼠脾脏淋巴细胞流式分析看出MHR/CpG可以在体内有效刺激CD4和CD8T细胞的分化增殖。同时从小鼠的肾脏和肺肺脏的HE染色图看出,MHR/CpG的体内用药安全性较高。
  本课题成功构建了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体,为去势抵抗性前列腺癌治疗提供了新策略,同时也为其它肿瘤的治疗提供了好的参考和借鉴。
[硕士论文] 李善心
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的与背景:
  近年来,结肠癌的发病率与死亡率不断升高,已成为导致我国癌症病人死亡的主要原因之一。结肠癌患者的死亡多是由于发生了肝转移,约有60%以上的晚期结肠癌病人均伴有不同程度的肝转移。结肠癌的发病机理十分复杂,干细胞理论认为肿瘤组织中具有干细胞样特性的细胞才是导致结肠癌发生的原因。
  不同于一般的肿瘤细胞,肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)可以在增殖过程中保持自我更新,同时还具有较强免疫逃逸能力;虽然CSC数目很少,但可引起肿瘤的发生或者转移;而且CSC对传统的治疗手段有着相当高的抗性,容易导致肿瘤复发。因此,靶向CSC被认为是新的、有效的治疗包括结肠癌在内的大多数肿瘤的重要手段之一。
  肿瘤的发生除了伴有重要功能基因的突变以外,还与一些特定基因的表观遗传学修饰有关系。表观遗传学修饰中甲基化修饰方面的报道居多,且机制比较明确。异常的DNA甲基化,会引起一些重要的基因表达发生变化,不断累积后会使细胞功能发生改变,进而导致细胞分化或增殖异常,致使各类疾病甚至是肿瘤发生。
  有趣的是,DNA甲基化是一种特殊的、可逆的生化修饰方式,通过DNA甲基转移酶(DNMT)进行调控。研究表明,DNMT的异常表达会导致肿瘤的发生或恶化。最近的研究发现,DNMT抑制剂可通过抑制肿瘤细胞内抑癌基因的DNA甲基化使其重新表达,从而有效抑制肿瘤细胞的生长。此外,DNMT抑制剂还能靶向肿瘤内的CSC从而降低肿瘤细胞的成瘤能力。因此,抑制DNMT可能是治疗结肠癌的有效策略。然而,关于DNMT在结肠癌细胞干性维持和肝转移中的作用与机制尚不清楚。
  在本文的研究中,我们检测了DNMT抑制剂对结肠癌干性相关特征与肝转移瘤生长的影响,并全面探讨了其作用机制。
  方法与结果:
  第一部分:首先,我们通过DNMT活性检测、生长计数、克隆形成、成球实验、皮下成瘤实验和transwell侵袭实验等检测了DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-AzaDC)对结肠癌HCT116和SW620细胞生长与干性特征的影响;同时,我们通过流式细胞术和Westen blot(WB)的方法检测了5-AzaDC对结肠癌细胞CD44和CD133表达的影响,从而研究DNMT在结肠癌细胞HCT116和SW620干性维持中的作用;采用HCT116细胞裸鼠肝转移瘤模型以及HE和IHC染色等方法检测了结肠癌细胞在裸鼠体内的生长,从而对体外相关结果进行验证。
  第二部分:我们采用了免疫荧光、WB、Q-PCR、MSP及IHC等方法,结合TCGA数据库研究了Wnt通路抑制基因甲基化在结肠癌细胞干性维持中的相关分子机制进行的探索;同时,通过基因过表达的方法研究了Wnt/β-catenin通路抑制基因SFRP1在HCT116细胞干性维持中的作用。结果表明:SFRP1在结肠癌临床样本和细胞株中的表达都非常低,且其mRNA的表达受甲基化的调控,而SFRP1去甲基化后可降低β-catenin的蛋白水平并抑制其入核,从而抑制Wnt通路下游靶基C-myc,CyclinD1与MMP7的转录和表达;IHC结果显示经DNMT抑制剂处理后,肝转移瘤组织细胞内的β-catenin的表达分布发生了明显的变化,β-catenin在核内和胞浆内的表达显著降低;SFRP1过表达后抑制了β-catenin的表达并降低了HCT116细胞的自我更新能力,使CD44阳性细胞比例显著减少。
  结论:
  我们的研究结果表明,DNMT可通过甲基化特异性抑制Wnt通路抑制基因SFRP1的表达,在结肠癌细胞的干性维持中发挥作用,DNMT抑制剂可以有效抑制结肠癌细胞的干性和肝转瘤的生长。因此,抑制DNMT有可能成新的对抗结肠癌的重要方法和手段之一。
[博士论文] 程玉强
外科学(肝胆外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界范围内死亡率占第三位的恶性肿瘤,预后极差,主要原因之一是其容易侵犯临近的门静脉系统而形成门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus,PVTT)。肝癌门静脉癌栓已成为制约肝癌预后的最大瓶颈问题。血小板(platelet,PLT)作为近年来肿瘤相关研究的热点,其在肝癌发生中的作用被逐渐认识,几乎参与了诸如肝脏炎症的损伤与修复、肝纤维化直至肝癌等慢性肝脏疾病的各个过程。但是,血小板与门静脉癌栓形成这一特殊的肝癌转移方式之间的关系尚未见报道。分析血小板在肝癌门静脉癌栓形成过程中的作用,不仅能为癌栓的形成机制做以新的阐释,更能为其治疗开辟新的思路。
  目的:
  通过回顾性分析术前伴有不同血小板计数的肝癌门静脉癌栓患者的预后,建立血小板与门静脉癌检之间的初步联系。进一步通过分析门静脉癌栓患者血小板活化情况及癌栓组织特异表达的基因谱,探讨血小板在肝癌门静脉癌栓形成中的重要作用,从而为肝癌门静脉癌栓的治疗寻找新的治疗靶点和方法。
  方法:
  一、术前血小板计数与肝癌门静脉癌栓患者预后关系的分析
  以肝癌伴门静脉癌栓患者为研究对象,结合术前临床资料数据及预后生存状况,以术前血小板计数的高低将病人分为三组:血小板减少组(PLT<100×109/L)、正常组(100×109/L≤PLT≤300×109/L)和升高组(PLT>300×109/L)。回顾性分析患者的预后,以确定术前血小板计数对肝癌门静脉癌栓患者预后的影响。
  二、肝癌伴门静脉癌栓患者血小板活性检测
  分离提取肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,通过分析血小板的聚集能力差异,探讨肝癌门静脉癌栓患者的血小板活化状态改变情况。并进一步用血小板活化相关分子通过流式细胞技术加以验证。
  三、癌栓组织特异性mRNA表达谱分析
  取三例肝癌伴门静脉癌栓患者的配对新鲜组织样本,包括癌旁组织(pritumoral tumor,PT)、肝癌原发灶组织(parenchyma tumor,T)和门静脉癌栓组织(portal vein tumor thrombosis,PVTT/P),行基因芯片检测。分别分析不同病人间的个体化差异和各组织间的特异性表达差异。通过Metascape(http://metascape.org)分析差异基因参与的生物学功能及相关信号通路,并最终确定目的基因。
  四、目的基因诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的作用机制研究
  通过扩大样本量,确定目的基因在不同组织中的表达。进一步用不同肝癌细胞系与血小板共培养,建立体外“癌栓”形成模型,并结合细胞系的成栓能力及目的基因的表达水平确定体外研究的工具细胞系。再通过该模型对目的基因在门静脉癌栓形成中的机制做探讨。
  结果:
  第一部分:门静脉癌栓患者血小板降低的的伴发比例较高(20.9%)。不同血小板计数患者之间的临床病理特征不同,肝硬化伴发率(p<0.001)、肿瘤大小(p<0.001)以及肿瘤是否存在包膜(p=0.032)差异明显。门静脉癌栓患者伴有血小板计数减少者的无瘤生存期RFS(recurrence free survival)和总体生存期OS(overall survival)均优于血小板计数正常组(p均小于0.001)和升高组(p=0.008和0.046),但血小板计数正常组和升高组之间无明显的统计学差异(p=0.578和0.877)。进一步通过倾向性匹配评分(PSM)排除各组间的病历资料差异的影响并作亚组分层,结果表明:Ⅱ型门静脉癌栓患者中血小板减少组的患者的无瘤生存期明显优于血小板正常组(p=0.011),但Ⅰ型癌栓和Ⅲ型癌栓病人的不同血小板计数组之间无明显差别(p=0.154和0.142)。Ⅰ型和Ⅱ型癌栓中血小板减少组的患者的总体生存期的分析均优于血小板正常组(p=0.021和0.029),但Ⅲ型癌栓患者的两组间仍无差异(p=0.451)。多因素风险回归分析结果表明血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后相关的独立危险因素,包括无瘤生存期(hazard ratio[HR]0.602,95%CI0.444-0.836,p=0.001)和总体生存期(HR0.582,95%CI0.415-0.816,p=0.002)。
  第二部分:通过分析肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者的洗涤血小板,结果表明肝癌伴门静脉癌栓患者的血小板聚集能力增强,血小板活化的比例增加。通过对肝癌伴门静脉癌栓患者配对的不同组织(癌栓组织、原发灶组织和癌旁组织)行基因芯片检测发现,病人之间存在交大的个体化差异;进一步汇总分析三例病人均有差异的基因显示:三种组织各自具有其独特的基因表达谱。将差异基因在基因功能网站进行分析发现,癌栓组织中特异表达的基因在细胞溶解、一元羧酸酸代谢、胰岛素样生长因子调节、小分子代谢以及有机羟基化合物运输等生物学功能上富集明显,且部分差异基因还与整合素信号通路和HNF3B信号通路等肿瘤相关的信号通路密切相关。进一步根据差异基因的表达水平及其生物学功能,最终将干细胞因子(SCF/KITLG)作为目的基因重点进行后续的机制研究。
  第三部分:通过扩大样本检测结果发现,目的基因KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中表达明显高于肝癌原发灶组织和癌旁组织,此外,KITLG的受体基因c-KIT表达水平与其相一致,在门静脉癌栓组织中表达升高。进一步检测肝癌相关的干细胞标志物发现,EpCAM、CD44、CD90和CD133在门静脉癌栓组织和肝癌原发灶组织中的表达均比癌旁组织高,除CD133在门静脉癌栓组织中与肝癌原发灶中表达水平相似外,EpCAM、CD44和CD90的表达水平在癌栓组织中最高。不同肝癌细胞系中KITLG的表达水平不一样,来源与肝癌门静脉癌栓的细胞系CSQT-2中KITLG的表达水平最高。通过将CSQT-2与血小板共培养建立体外“癌栓”模型的实验结果表明,细胞系中KITLG的表达水平与成栓能力有关,KITLG是肝癌门静脉癌栓形成中的重要分子。
  结论:
  1、血小板计数是肝癌门静脉癌栓患者预后的独立危险因素。伴血小板计数减少的肝癌门静脉癌栓患者预后相对较好;
  2、肝癌门静脉癌栓患者血小板活化增强;
  3、门静脉癌栓组织、肝癌原发灶组织和癌旁组织的基因表达存在差异,各有自身特异的基因表达谱;
  4、KITLG在肝癌门静脉癌栓组织中高表达,促进癌栓肿瘤细胞干性的维持,并可在体外诱导栓块形成而促进癌栓的发生。
  本课题创新点及潜在应用价值:
  确定了血小板计数与肝癌门静脉癌栓的预后关系,为肝癌门静脉癌栓的临床治疗提供指导。通过基因芯片分析明确了癌栓组织特异性基因表达谱,并分析其分子功能及相关信号通路,为癌栓形成机制的相关研究提供数据支持和参考;进一步分析明确KITLG通过诱导栓块形成促进肝癌门静脉癌栓发生的机制,为抗血小板治疗在肝癌门静脉癌栓的应用提供有力证据。
[硕士论文] 郭仲秋
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌KRAS基因突变的预测价值
  目的:探究18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌(CRC)患者KRAS基因突变的预测价值。
  方法:回顾性分析2011年11月至2017年8月在长海医院行18F-FDG PET/CT检查的150例CRC患者(男105例,女45例,中位年龄63岁)。入组条件:(1)所有CRC患者均为初诊患者,行PET/CT检查前均未行放化疗:(2)PET/CT检查后一个月内均行手术摘除原发灶并行基因检测,病理为腺癌或腺癌伴部分粘液腺癌。排除标准:(1)多原发癌;(2)其他病理类型(如神经内分泌肿瘤、鳞癌);(3)病例资料不完整者。测量18F-FDG PET/CT相关参数值包括SUVmax、MTV2.5、MTV20%、MTV30%、MTV40%、MTV50%、TLG2.5、TLG20%TLG30%、TLG40%、TLG50%。临床病理特征与KRAS基因突变关系采用x2检验,P<0.05为差异有统计学意义。PET/CT相关参数与KRAS基因突变的关系采用非参数检验(Mann-Whitney U test),P<0.05为差异有统计学意义。对于P<0.2的参数进行多因素回归分析,P<0.05为差异统计学意义。对于有意义的18F-FDG PET/CT参数通过ROC曲线获得最佳界值点并计算相应曲线下面积(area under the curve,AUC)。
  结果:(1)150例患者中KRAS基因突变78例,基因野生72例。150例患者基因突变率与年龄、性别、肿瘤位置、CEA、CA19-9、淋巴结转移、T分期、M分期、组织学类型均无显著统计学相关性。(2)基因突变型CRC患者的18F-FDG PET/CT相关参数SUVmax(P<0.001)、MTV2.5(P=0.001)、TLG2.5(P<0.001)、TLG20%(P=0.001)、TLG30%(P=0.001)、TLG40%(P=0.001)、TLG50%(P=0.001)较野生型患者高。多因素logistics回归分析PET/CT相关参数SUVmax(OR,1.122:95%置信区间(CI),1.058-1.190,P<0.001)、淋巴结转移(OR,2.429:95%CI,1.183-4.989,P=0.016)、组织学类型(OR,2.778;95%CI,1.099-7.025,P=0.031)是基因突变的独立预测因素,以SUVmax=15.5为界值,准确率为67.33%(灵敏度:58.97%,特异度:76.39%,阳性预测值:73.02%,阴性预测值63.22%);在直肠及乙状结肠癌亚组中,SUVmax对KRAS基因突变的预测效能升高,以SUVmax=15.5为界值,准确率为70.79%。
  结论:SUVmax对CRC患者KRAS基因突变有一定的预测价值,参数值越高,患者基因突变的概率越大;在直肠及乙状结肠癌亚组中预测效能升高:而各界值下的MTV、TLG无法预测KRAS基因突变。
  第二部分 18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌术后预后的价值
  目的:探究18F-FDG PET/CT相关参数对结直肠癌(CRC)根治术后的无病生存时间(DFS)及总生存时间(OS)的预测价值。
  方法:回顾性分析2011年11月至2016年10月在长海医院行18F-FDG PET/CT检查的132例CRC患者的临床资料(男93例,女39例,中位年龄63岁),患者行PET/CT检查前未行放化疗,PET/CT检查后一个月内均行结直肠癌根治术,术后依据患者具体情况施行术后辅助化疗。观察指标: (1)测量18F-FDG PET/CT相关参数值包括SUVmax、MTV2.5、MTV20%、MTV30%、 MTV40%、 MTV50%、 TLG2.5、TLG20%、TLG30%、TLG40%、TLG50%; (2)治疗情况。随访情况:采用门诊和电话方式进行随访。DFS为术后第1天至首次发现肿瘤复发、进展、患者死亡或随访截止;OS为术后第1天至患者死亡或随访截止。本研究的随访截止时间为2017年10月。18F-FDG PET/CT相关参数与临床病理特征的关系采用非参数检验(Mann-Whitney U检验),P<0.05为差异有统计学意义。以肿瘤复发为阳性事件,采用受试者工作特征(ROC)曲线获得18F-FDG PET/CT相关参数预测DFS的最佳阈值并计算曲线下面积(AUC)。如果AUC值较小,则以中位数为界值点。根据界值将患者分成两组,采用Kaplan-Meier法进行生存分析,单因素分析采用Log-rank检验,多因素分析采用COX比例风险模型,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:(1) 18F-FDG PET/CT相关参数与临床病理特征的关系 MTV2.5与CEA有统计学相关性;MTV20%、 MTV30%、 MTV40%与原发肿瘤部位、组织学类型有统计学相关性;MTV50%与原发肿瘤部位、临床分期有统计学相关性;TLG2.5、 TLG20%与CEA、淋巴结转移有统计学相关性;TLG30%、 TLG40%、 TLG50%与CEA、淋巴结转移、临床分期有统计学相关性。 (2) DFS预后分析 通过ROC曲线获得18F-FDG PET/CT相关参数的曲线下面积(AUC),通过ROC曲线获得预测DFS最佳阈值分别为SUVmax=19.36(敏感性:66.67%,特异性:73.96%);MTV2.5=22.64 cm3(敏感性:48.61%,特异性:76.67%);TLG2.5 =117.78g(敏感性:49.32%,特异性:77.97%);TLG20%=129.74 g(敏感性:47.06%,特异性:73.44%);TLG30% =107.05 g(敏感性:48.48%,特异性:74.24%);TLG40% =73.22 g(敏感性:47.30%,特异性:75.86%);TLG50%=56.13g(敏感性:48.48%,特异性:75.00%)。由于MTV20%、 MTV30%、MTV40%、 MTV50%的AUC值较小,不能通过ROC曲线分析获得界值点,以其中位数MTV20%=21.00cm3、MTV30% =14.28cm3、MTV40% =10.15cm3、MTV50% =6.25cm3作为分组的界值点。单因素结果显示:CEA、CA 19-9、淋巴结转移、临床分期、化疗、SUVmax、MTV2.5、TLG2.5、TLG20%、 TLG30%、TLG40%、 TLG50%是CRC患者DFS的影响因素(P<0.05)。多因素分析结果显示:SUVmax(P<0.001,OR值=3.308,95%CI:1.882-5.815)、临床分期(P=0.008,OR值=2.164,95%CI: 1.226-3.819)、CA19-9(P=0.011,OR值=2.098,95%CI: 1.182-3.724)是影响CRC患者术后DFS的独立危险因素(P<0.05)。 (3) OS预后分析单因素结果显示:CEA、CA19-9、组织学类型、SUVmax、MTV2.5、 TLG2.5、 TLG20%、 TLG30%、 TLG40%、 TLG50%是CRC患者OS的影响因素(P<0.05)。多因素分析结果显示:SUVmax(P=0.026,OR值=2.735,95%CI: 1.129-6.624)、TLG50%(P=0.006, OR值=5.699, 95%CI: 1.640-19.801)、CA19-9(P=0.001,OR值=4.550,95%CI:1.868-11.084)是影响结CRC患者术后OS的独立危险因素(P<0.05)。
  结论:18F-FDG PET/CT相关参数SUVmax是影响CRC患者术后DFS及OS的独立危险因素,TLG50%影响CRC患者术后OS的独立危险因素;18F-FDG PET/CT相关参数SUVmax、TLG50%可以用于评估CRC患者的预后,参数值越高,预后越差。
[硕士论文] 王卫平
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  临床上mTOR抑制剂应用于多种肿瘤的治疗,以依维莫司在转移性肾癌治疗中的应用较为广泛。但实际应用中疗效个体差异较大,耐药现象较为常见,大大限制了其疗效。在mTOR抑制剂耐药机制中,肿瘤的遗传学改变与之关系密切。现有相关研究多局限于从有限差异疗效病例中寻找耐药相关基因靶点,尚缺乏从全基因组水平评估基因的功能改变与mTOR抑制剂药敏之间相关性。而CRISPR/Cas9技术的发展应用为研究基因功能提供了巨大的便捷。将采用CRISPR/Cas9文库筛选的方法,从全基因组水平筛选mTOR抑制剂耐药相关靶点,并进行靶点功能验证及临床相关性分析,以期为逆转mTOR抑制剂耐药提供新的理论和依据。
  方法:
  1、通过质粒文库扩增、病毒文库制备、筛选条件摸索、耐药筛选等过程建立肾癌依维莫司耐药靶点CRISPR/Cas9筛选模型,并进行高通量测序。
  2、利用MAGeCK等一系列生物信息学方法,进行测序数据的质控和分析,结合体外耐药细胞株转录组测序分析,筛选若干潜在耐药靶点;
  3、利用CRISPR敲除、质粒转染方法,结合药敏实验、平板克隆和凋亡实验等,对靶点进行进一步的功能验证;
  4、利用实时定量PCR的方法,在接受依维莫司治疗的肾癌组织标本中验证耐药靶点表达水平与临床疗效的相关性;
  5、利用组织芯片的方法,结合临床数据库数据,分析新型靶点在评价肾癌预后中的临床价值。
  结果:
  通过CRISPR/Cas9耐药基因筛选、生信分析、临床疗效相关性分析以及药敏功能验证,发现,靶向敲除MAGIX后能够介导肾癌依维莫司耐药,而过表达则能逆转该过程。较正常肾癌细胞肾,在同样浓度依维莫司作用下,靶向敲除MAGIX后,细胞克隆形成能力明显增强,而凋亡细胞比例明显减少。同时,组织芯片分析和TCGA数据库分析发现,在肾癌患者整体人群中,MAGIX表达水平越低提示患者预后越差。
  结论:
  MAGIX的差异表达水平与肾癌依维莫司治疗药物反应性相关,可作为指导肾癌依维莫司个体化治疗的生物标记物。在临床病理标本中发现,MAGIX在依维莫司耐药组中表达水平低于敏感组。此外,MAGIX的低表达提示肾癌患者预后差,具有预测肾癌预后的潜在临床价值,相关作用机制尚需进一步探讨明确。
[硕士论文] 戴利和
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  在中国,膀胱癌(Bladder cancer,BC)发病率居泌尿系统恶性肿瘤之首。依据生长方式的不同,膀胱癌可以分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),前者占初诊膀胱癌患者的70%左右,主要采用经尿道膀胱恶性肿瘤电切术(TURBT),5年生存率达90%,NMIBC患者术后易复发进展,约15%术后会进展为MIBC,患者预后变差;后者占30%左右,主要采用根治性膀胱切除术,术后约50%发生转移,发生转移后5年生产率仅为5%。膀胱癌侵袭进展对人类健康造成很大的威胁,明确膀胱癌侵袭进展的机制,对改进膀胱癌现有治疗和预后判断具有重要作用。
  癌蛋白Gankyrin在众多恶性肿瘤的形成中发挥促癌作用。Gankyrin最初在肝癌研究中被发现,近来研究表明Gankyrin在结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肺癌和食道癌等多种恶性肿瘤发挥促癌作用,且与肿瘤恶性程度有关。目前,Gankyrin在膀胱癌发生、发展中的具体作用和分子机制尚未明确。
  前期对10例膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,结果显示Gankyrin在膀胱癌组织中表达高于癌旁正常组织,根据膀胱癌经典分子起源学说及最新膀胱癌组织高通量测序结果,P53信号通路与膀胱癌侵袭性高度相关,而根据文献检索,Gankyrin为P53分子的上游调控分子,因此推测Gankyrin在膀胱癌的侵袭进展过程中发挥重要作用。
  目的:
  研究Gankyrin在膀胱癌中的表达情况,探讨其在膀胱癌侵袭进展中的作用及机制,以期为膀胱癌靶向治疗和预后判断提供新依据。
  方法:
  1.对10对膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,根据膀胱癌发生分子机制假说及文献报道,筛选出Gankyrin作为研究对象。
  2.提取90对膀胱癌组织及癌旁正常组织的RNA及20对膀胱癌组织及癌旁正常组织的总蛋白,分别通过qRT-PCR和western blot验证Gankyrin在膀胱癌中的表达情况。
  3.通过公共数据库Oncomine挖掘数据,验证Gankyrin在膀胱癌患者的肿瘤组织中存在高表达。
  4.通过免疫组化,对3例肌层浸润性膀胱癌病理大切片行Gankyrin染色,分析肿瘤侵犯粘膜层、浅肌层、深肌层时的表达情况,研究其和膀胱癌侵袭性的关系;分析130例膀胱癌患者肿瘤组织中Gankyrin的表达量,探讨其与膀胱癌临床病理资料和预后的关系。
  5.通过western blot和qRT-PCR检测Gankyrin在正常尿路上皮、2种非肌层浸润性膀胱癌、2种肌层浸润性膀胱癌细胞系中的表达量。
  6.利用慢病毒载体构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞系和Gankyrin稳定敲减的UMUC3细胞系,通过EdU细胞增殖试验和NOD/SCID小鼠的皮下成瘤实验,研究Gankyrin过表达和敲低对膀胱癌细胞增殖、成瘤能力的影响。通过细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭实验,检测Gankyrin对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测Gankyrin对膀胱癌细胞凋亡的影响。
  7.利用BBN诱导小鼠自发产生膀胱癌,通过免疫组化检测Gankyrin在小鼠自发膀胱癌模型中的表达情况并探讨其意义。
  8.通过连续切片免疫组化染色,分析32例膀胱癌组织中Gankyrin和MDM2表达的相关性,利用western blot检测Gankyrin过表达和敲低后MDM2的表达水平,通过免疫荧光检测Gankyrin和MDM2在膀胱癌中的亚细胞定位,利用蛋白免疫共沉淀检测Gankyrin与MDM2在膀胱癌中的相互作用,以探讨Gankyrin调控膀胱癌侵袭进展的可能机制。
  结果:
  1.转录组测序结果表明Gankyrin表达量在9例膀胱癌组织中高于对应癌旁正常尿路上皮组织,对10对癌及癌旁组织RPKM值进行统计分析,Gankyrin在膀胱癌组织中表达显著上调(P<0.05),差异表达倍数为1.21倍。
  2.通过qRT-PCR检测90例膀胱癌患者中Gankyrin mRNA的表达情况,发现其中66例患者肿瘤组织中Gankyrin mRNA表达量高于癌旁正常组织,24例患者中肿瘤组织Gankyrin表达量低于癌旁组织,Gankyrin高表达比例为73.3%。对20对膀胱癌组织及癌旁正常组织进行western blot检测,发现其中17例样本的肿瘤组织中Gankyrin蛋白的表达量明显高于癌旁正常组织。
  3.公共数据库Oncomine检索发现Dyrskjot Bladder3数据集中,Gankyrin mRNA在膀胱癌患者肿瘤组织中的表达含量高于正常尿路上皮组织(P<0.01)。
  4.在3例膀胱癌病理大切片中,Gankyrin表达量从粘膜、浅肌层到深肌层逐渐升高;130例免疫组化的结果显示,Gankyrin表达量在肌层浸润性膀胱癌中显著高于非肌层浸润性膀胱癌(P<0.01)、在高级别膀胱癌组织中显著高于低级别组织(P<0.01),Gankyrin高表达患者总体生存期、疾病特异性生存期和无进展生存期显著低于低表达患者(均P<0.001),多因素分析显示,Gankyrin为膀胱癌不良预后的独立危险因素。
  5.western blot和qRT-PCR结果显示,Gankyrin在膀胱癌细胞系中的表达量高于正常尿路上皮细胞系,Gankyrin在NMIBC细胞系BIU87和SW780中表达量低,而在MIBC细胞系UMUC3和J82中存在高表达。
  6.成功构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞株和Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞株,EdU细胞增殖实验表明Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞增殖能力显著强于对照组(P<0.01),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞的增殖能力显著降低(P<0.001);Gankyrin稳定过表达后的BIU87细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力明显强于对照组(P<0.001),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力显著弱于对照组(P<0.001);划痕实验和Transwell小室迁移实验显示,Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞迁移能力显著增强,Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞迁移能力显著下降;Transwell小室侵袭实验显示,Gankyrin过表达可显著增强膀胱癌细胞的侵袭能力,而Gankyrin敲低可显著抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。流式细胞术检测结果显示Gankyring过表达或敲低并不影响BIU87或UMUC3细胞的凋亡。
  7.成功利用BBN诱导小鼠自发形成膀胱癌,免疫组化结果显示,Gankyrin在膀胱癌中的表达量高于正常尿路上皮组织,在NMIBC、MIBC及肺转移组织中表达量逐渐升高。
  8.32例膀胱癌连续切片免疫组化显示,Gankyrin和MDM2呈正相关(R=0.583,P<0.001)。上调BIU87细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应上调,下调UMUC3细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应下调,免疫荧光显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞及膀胱癌组织中存在共定位,蛋白免疫共沉淀显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞中相互结合。
  结论:
  癌蛋白Gankyrin在膀胱癌组织中显著上调,Gankyrin的表达水平升高与膀胱癌的分期分级升高密切相关,且是膀胱癌不良预后的独立危险因素。上调Gankyrin的表达可以增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调Gankyrin的表达显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Gankyrin在膀胱癌中与MDM2直接结合,为调控膀胱癌侵袭进展的潜在分子机制。
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