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[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[博士论文] 王田田
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),作为肝癌恶性肿瘤的一类,是中国发生率高且危害极大的恶性肿瘤之一。研究表明,肝内转移是肝癌的首要转移位点,也是肝癌致死的首要原因。目前对肝癌细胞的肝内转移过程虽有所了解,但是研究尚不深入,尚无有效治疗靶点和药物阻断肝癌肝内转移过程。因此需要进一步明确肝癌细胞肝内转移过程中的关键分子及其作用机制。
  除了自身抑癌或促癌基因的改变外,细胞与他们赖以生存的微环境之间的相互作用对于正常组织内稳态以及肿瘤组织的生长都是至关重要的。特别是肿瘤细胞与相关间质之间的相互作用形成了一个强大的关系网,可影响肿瘤的发生、进展和预后。肿瘤的转移是一个复杂的、多步骤、多因素参与的过程,包括原发肿瘤的形成、原发灶肿瘤细胞的局部侵袭,肿瘤细胞内渗入血管和淋巴管,在血管和淋巴管中的生存,外渗出血管和淋巴管,在远端定植灶的存活。肿瘤转移过程中,肿瘤的微环境发挥了重要的作用,其中包括肿瘤低氧环境、肿瘤相关的巨噬细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、肿瘤相关的成纤维细胞以及内皮细胞等。任何肿瘤转移的最终结局都是在远端定植灶上形成新的肿瘤,肿瘤是如何在远端定植灶的存活和再生这个问题一直是科学家想攻克的难题。为了研究肿瘤转移过程的最终阶段-在远端定植灶的存活,筛选出能够高定植的细胞显得尤为重要。
  为了研究肝癌转移过程的最终阶段-在远端定植灶的存活,构建了脾脏注射-肝定植(转移)模型,利用该模型筛选获得了一系列的高定植(转移)能力的肝癌细胞株。利用表达谱芯片检测,根据P值<0.05,差异倍数≥5倍,筛选到64条在高定植细胞中差异表达的mRNA。进一步在更多的高定植细胞中验证,以确保在除了芯片中的两株细胞以外至少还有另外两株高定植细胞表达符合差异基因的表达结果,以此筛选到31条基因,其中上调表达基因17条、下调表达基因14条。根据与肝癌临床病人预后之间的关系,最终筛选到SLC38A4、GJA1在高定植细胞株中普遍存在差异表达,在多个队列的肝癌组织样本中也存在差异表达,并且与肝癌病人的高复发率、差的预后相关。
  发现SLC38A4不仅在肝癌组织样本中下调表达并且随着肝癌的进展表达量逐渐降低,在肝脏发育过程中还呈现逐渐上调表达的趋势,且与肝癌病人的预后呈正相关,即肝癌病人SLC38A4含量越高,病人的预后情况越好。又对SLC38A4的临床预后进行研究,发现SLC38A4的表达情况与肝癌病人的肿瘤大小、TNM分期、BCLC分期、肿瘤转移以及血清AFP含量相关。随后进行了SLC38A4的生物学功能研究,干性球形成实验证实干扰SLC38A4增强肝癌细胞的干性能力;CCK8、乙炔脱氧尿甘结合染色(EDU)细胞增殖实验以及细胞周期检测证实干扰SLC38A4促进肝癌细胞增殖;划痕实验以及transwell实验证实干扰SLC38A4可以促进肝癌细胞的迁移、侵袭;裸鼠体内皮下荷瘤实验证实干扰SLC38A4促进肿瘤的增殖。上述结果证明SLC38A4为抑癌基因,干扰SLC38A4在体内体外条件下都可以促进肝癌的进展。Western blot结果显示干扰SLC38A4可以增加ERK和AKT磷酸化水平,表明干扰SLC38A4可以使肿瘤中的MAPK信号通路及PI3K/AKT信号通路活化,促进肝癌的进展和转移。
  对GJA1进行了研究,发现GJA1在高定植细胞中普遍高表达,在多个队列的肝癌组织中也是高表达,并且与肝癌病人的高复发率、差的预后呈正相关。裸鼠脾脏注射-肝定植体内实验证实,GJA1能够增强肝癌细胞的肝内定植能力。对过表达GJA1的细胞进行了体外功能学实验,CCK8、克隆形成、EDU检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,transwell实验以及细胞划痕实验检测细胞迁移侵袭能力,发现过表达GJA1对细胞本身的增殖能力、迁移侵袭能力没有统计学意义的影响。为了探究高定植肝癌细胞株高定植的原因,对高定植肝癌细胞株进行裸鼠皮下荷瘤,发现体内情况下高定植细胞株所形成的肿瘤增殖更快,有更强的血管形成能力。将过表达GJA1的细胞进行裸鼠皮下荷瘤,CD31、CD34染色显示过表达GJA1细胞形成的皮下荷瘤有更高的血管密度。为了探究GJA1对血管形成的影响,用过表达GJA1细胞及对照组细胞的条件培养基刺激脐静脉内皮细胞(HUVEC)发现小管形成并无差异性改变。由于GJA1可以使两种细胞之间形成缝隙连接(gap junction),使其相互之间传递物质,猜测过表达GJA1的细胞可能和HUVEC通过直接接触后形成缝隙连接促进小管的形成,于是将过表达GJA1及对照的肝癌细胞与HUVEC进行共培养,检测到过表达GJA1细胞相对于对照细胞与HUVEC共培养后形成小管能力增强。
  综上所述,对肝癌转移过程中的最终环节-在定植灶中的存活进行了研究,发现在肝癌转移晚期即在定植灶的存活阶段时,肿瘤细胞中的基因SLC38A4以及GJA1在其中发挥了重要的作用。该项研究为进一步理解肝癌转移进程中肿瘤本身因素及微环境因素发挥的作用提供了新鲜的思路和视角,为肝癌的转移提供了潜在预防及诊疗靶点。
[硕士论文] 王瑜
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在中国胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在新增的胃癌患者中90%以上为进展期。对于此类患者,外科手术常难以获得根治性效果,因此,临床开展胃癌新辅助化疗,对于提高手术根治率、提高可切除率以及延长患者生存时间具有重要意义。然而,患者对化疗药物存在个体差异,甚至有部分患者化疗形成耐药后,肿瘤会形成报复性生长。是什么导致肿瘤呈现报复性生长?
  众多研究表明,衰老是凋亡、自噬之外细胞对于化疗介导DNA损伤反应的一种重要应答形式。通过新辅助化疗的人体内标本研究发现,胃癌新辅助化疗后很大一部分细胞发生衰老。因此,对化疗介导的DNA损伤诱导衰老这重要临床现象进行深入研究,对于提高临床化疗效果具有重要意义。化疗介导衰老细胞的产生,将对化疗本身产生两方面重要影响。首先,该群细胞本身处于不可逆的G0期,因此对放、化疗的反应性极低而难以被彻底清除,成为耐药与复发的重要来源;其次,该群细胞还维持活跃的生理学特性,其重要要特征是持续不断分泌大量生物生物活性物质,如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及相关生长因子等,即衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)。
  科室前期使用以紫杉醇类药物为基础的联合方案对胃癌患者进行新辅助化疗,化疗无效组胃癌组织IL-6表达水平显著高于有效组,说明由化疗介导的胃癌组织SASP相关因子IL-6与化疗不敏感密切相关。提示:SASP在胃癌新辅助化疗耐药过程中发挥了重要作用。那么SASP和肿瘤的报复性生长是否存在一定的联系?
  如果SASP和肿瘤报复性生长存在联系,那么它是通过什么机制产生的呢?近年来,有研究表明固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)在多种肿瘤中过表达,提示肿瘤细胞的快速增殖和脂类的快速合成具有密切相关性,抑制SREBPs表达可以显著抑制肿瘤细胞生长。SREBPs转录因子家族成员包括SREBP1和SREBP2。前者在非饱和脂肪酸和甘油三酯合成中起主要调节作用,而后者在调节胆固醇内环境稳态中起关键作用,它是调节脂类平衡的主要转录因子。SREBPs调控多种脂类合成相关基因的表达,如在人胶质母细胞瘤中SREBP1上调并促进及其下游靶基因ACC和FASN的表达;此外,在去年2月,Ayano Kondo等在Cell Reports上发表论文指出,细胞外H+通过激活SREBP2上调胆固醇合成相关酶基因如:IDI1、MSMO1、INSIG1的表达,促进胰腺癌进展。因此,推测SASP可能通过激活SREBP2来促进胃癌细胞增殖,从而促进肿瘤进展。
  方法:
  在科室前期研究基础上,提出如下科学假设:新辅助化疗药物紫杉醇能够诱导胃癌细胞发生衰老,衰老胃癌细胞通过分泌SASP激活SREBP2促进未衰老的肿瘤细胞增殖。
  (化疗→细胞衰老→SASP→SREBP2专细胞增殖)
  具体研究分两部分进行:一、现象验证,即SASP促进胃癌细胞增殖;二、机制研究即SASP通过激活SREBP2促进细胞增殖。
  一、现象验证
  体外实验方法利用紫杉醇(paclixel,PTX)处理BGC823细胞构建衰老细胞模型,使用β-半乳糖苷酶染色证实衰老细胞模型的建立;ELISA检测SASP-CM中主要的SASP因子的浓度;CCK8比色法及细胞克隆形成实验检测SASP-CM对BGC823细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。所获得BGC823细胞培养上清,即胃癌衰老细胞相关分泌表型条件培养基(senescence-associated secretory phenotype conditioned medium group,SASP-CM),以不加PTX处理的BGC823细胞培养上清为肿瘤细胞条件培养基组(control condition medium group,CTR-CM组)和正常培养基组(normal medium group,NOR-CM组)为对照,共计3组实验。
  体内实验方法裸鼠皮下成瘤实验分2组,即实验组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL等比例胃癌衰老细胞和正常肿瘤细胞混合悬液(5×107/mL)。对照组:5周龄雄性裸鼠5只,每只裸鼠腋下接种200μL正常肿瘤细胞悬液(5×107/mL),观察成瘤大小。
  结果PTX35nmol/L诱导BGC823细胞72h可建立稳定的细胞衰老模型,此条件下衰老细胞比例最高(66.95±3.54)%。SASP-CM中主要SASP因子IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ浓度均高于CTR-CM。SASP-CM组细胞的相对克隆形成率高于CTR-CM组(P<0.001)和NOR-CM组(P<0.05)。48、72、96h时SASP-CM组细胞的增殖活性高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.05)。SASP-CM组的S期细胞比例高于CTR-CM组和NOR-CM组(P<0.01),细胞凋亡率各组间差异无统计学意义。裸鼠皮下成瘤实验实验组瘤体重量、体积显著高于对照组(P<0.01)。
  二、机制研究
  1、用SASP-CM和CTR-CM培养BC823细胞72h后,提取总RNA做基因表达谱分析,并根据差异表达基因做GO分析。2、SREBP2是胆固醇合成通路中关键转录因子,因此,通过qRT-PCR验证SREBP2及其靶基因表达,免疫荧光及WB证实SREBP2激活。3、用siRNA干扰SREBP2表达,并利用qRT-PCR、验证干扰效果,然后用SASP-CM培养SREBP2干扰和未干扰的BC823细胞,cck8检测细胞增殖活性。
  结果:
  1、通过基因表达谱分析发现:衰老细胞条件培养基能够促进BGC-823细胞胆固醇合成通路中相关酶表达;2、胆固醇合成通路中关键转录因子SREBP2及其靶基因IDI1,MSMO1,INSIG1mRNA表达水平显著上调;衰老细胞条件培养基导致SREBP2激活并发生核转移;3、siRNA干扰SREBP2表达能够降低衰老细胞条件培养基促进BGC-823细胞增殖的能力。
  结论:
  新辅助化疗药物紫杉醇能诱导胃癌细胞发生衰老,衰老的胃癌细胞通过衰老相关分泌表型激活SREBP2促进未衰老的胃癌细胞增殖。
[硕士论文] 刘斌
内科学(血液内科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是临床最常见的一种非霍奇金淋巴瘤,其发病与多种病原学及生物化学等因素相关,其具有发展迅速、侵袭性较高的特点。EBV(Epstein-Barr virus,EBV)是一种双链DNA病毒,已经有研究证实,EBV与许多肿瘤发病相关。而近年来EBV在DLBCL发病中的作用得到了越来越多的关注。在2016年NCCN非霍奇金淋巴瘤指南中,已将EBV+DLBCL单独列为弥漫大B细胞淋巴瘤中的一种亚型。针对EBV+DLBCL的相关临床调查报道提示,EBV感染和DLBCL起病具有一定相关性,而且这种亚型的DLBCL对于常规一线治疗疗效不佳,预后相对较差。而目前还鲜有针对EBV+DLBCL发病的机制性的研究报道。本文通过回顾性研究,统计EBV+DLBCL患者的临床信息,从而分析得出EBV+DLBCL独特的临床特征。并分析其相关基因及蛋白表达水平的变化,试图找出EBV+DLBCL的发病机制,为后续探寻更有效的治疗方法打下基础。本研究共分2部分,第一部分收集初发DLBCL患者的病理标本,检测EBV在DLBCL中的表达情况。结合临床资料,分析EBV的表达情况对DLBCL预后的影响。第二部分对结合EBER表达情况,对DLBCL标本进行基因突变分析及P53蛋白测定,分析EBV+DLBCL可能的致病机制。
  第一部分 弥漫大B细胞淋巴瘤中EBV表达情况及相关生存预后分析
  目的:明确DLBCL患者中EBV的表达情况,分析得出EBV+DLBCL生存预后情况。
  方法:收集本中心346例初发DLBCL患者的肿瘤病理标本,采用EBER原位杂交方法检测EBV表达情况。结合临床及病理资料,分析EBV和部分关键临床因素的相关性及EBV对DLBCL预后的影响。
  结果:在346例DLBCL患者中,EBV表达阳性共36例(10.4%)。相关性分析提示EBV阳性表达和患者性别、年龄、Hans分型、“双表达”、ECOG体力评分、Ann Arbor分期、IPI、B症状、LDH、β2微球蛋白、骨髓侵犯均无明显相关性。生存分析提示,EBV是DLBCL患者预后不良的一项独立危险因素。
  结论:EBV在DLBCL中的阳性表达率为10.4%,EBV是影响DLBCL患者预后的一项独立危险因素。
  第二部分 EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤中P53蛋白表达情况分析及TP53基因突变分析
  目的:检测EBV阳性DLBCL肿瘤标本中P53蛋白表达及TP53基因突变,了解EBV阳性DLBCL发病可能的分子学机制。
  方法:选取36例EBV+DLBCL及36例EBV-DLBCL标本,采用免疫组化的方法检测肿瘤组织内P53蛋白表达,了解P53蛋白在EBV+DLBCL中的表达情况;采用Sanger基因测序法,明确TP53基因在EBV+DLBCL中的突变情况。分析EBV在DLBCL疾病中对P53表达的影响,探寻发病可能的分子机制,为进一步精准治疗提供依据。
  结果:1.P53蛋白表达情况:72例患者中P53蛋白阳性表达为24例(33.3%)。其中,EBV阳性组为16例(44.4%),EBV阴性组8例(22.2%)。EBV阳性组P53蛋白阳性率明显高于EBV阴性组(44.4 vs.22.2%,P=0.046)。2.TP53基因突变情况:选取经免疫组化提示P53蛋白阳性的24例DLBCL患者肿瘤标本,在16例EBV+DLBCL患者中,发生TP53基因突变的共3例(18.8%)。
  结论: P53蛋白表达方面,EBV+DLBCL中P53阳性率为44.4%。而在P53蛋白表达阳性的16例EBV+DLBCL中,TP53基因的突变率仅为18.8%。根据P53蛋白在EBV+DLBCL中的高表达可以推断P53通路的异常激活是导致EBV+DLBCL发病的原因之一。而TP53突变率较低,证实EBV+DLBCL中P53通路的异常可能与TP53并无明显相关性,可能是由其它因素导致。而EBV+DLBCL组中P53的阳性率明显高于EBV-DLBCL组,因此可以推测,EBV感染很可能和P53表达密切相关。由EBV引起的P53通路异常可能是EBV阳性DLBCL一项重要发病机制。
[硕士论文] 傅郁华
内科学(血液病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系统发病率第二的恶性肿瘤,约占所有血液系统恶性肿瘤的10%,其疾病本质为骨髓中浆细胞恶性增生产生大量单克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白),并导致相关器官或组织损伤,至今仍无有效方法治愈。在传统化疗方案治疗下,MM患者中位生存期不足3年。近年来,随着以硼替佐米为代表的各种新药以及自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)的应用,MM患者的总生存期及生存质量得到了明显的改善,中位总生存期延长至5-7年。由于患者在疾病发展及预后方面存在明显的异质性,生存期从数月至十余年不等,因此进行准确的预后分层并行合适的个体化治疗是MM患者获得成功诊治的关键。2015年国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group,IMWG)在国际分期系统(International Staging System,ISS)的基础上制定了纳入遗传学高危因素以及乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)水平的修订版国际分期系幺充(Revised International Staging System,RISS),以期能更好的实现MM患者的预后分层。本研究对我院初发的259例MM患者进行临床特征及疗效、预后分析,目的在于分析RISS分期系统对MM患者预后及治疗的影响,并与传统Durie-Salmon(DS)分期系统及ISS分期系统进行相关预后分析比较,同时分析硼替佐米的应用对各分期系统预后的影响,旨在更好的认识多发性骨髓瘤的临床特征,同时验证RISS分期系统在预后分层及指导治疗意义上优于传统分期,值得在临床MM诊治过程中推广使用。
  资料与方法:回顾性分析259例我院收治MM患者的病例资料,分别用年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、血清白蛋白、血清球蛋白、β2-微球蛋白、乳酸脱氢酶、血肌酐、血清钙、尿酸、FISH检测结果(1q21基因、RB1基因、P53基因、D13S319基因)、免疫表型(CD56、CD20、CD19)、新药硼替佐米的应用、自体造血干细胞移植的应用、硼替佐米的注射方式、缓解深度、分期等影响因素对MM患者无进展生存期(progression free survival,PFS)及总生存期(overall survival,OS)进行单因素及多因素分析,并分析各影响因素对硼替佐米疗效的影响;分别用DS分期系统、ISS分期系统及RISS分期系统对MM患者进行生存及预后分析,同时分析新药硼替佐米的应用对DS分期、ISS分期、RISS分期预后的影响。
  结果:1.259例MM患者的收治年份以2010-2016年间为主,占84.1%;中位发病年龄58(34-87)岁,其中男性患者147例,女性患者112例,男女比例为1.31∶1,发病年龄以41-70岁区间为主,占86.1%;免疫分型以IgG型为主,占59.1%;中位随访45(4-188)个月,失访率为15.1%,总体MM患者中位PFS45个月,中位OS67个月;初诊实验室指标显示:大部分MM患者起病时伴有贫血、低蛋白血症、球蛋白及β2-微球蛋白水平升高;FISH检测提示有87.4%的MM患者检出异常,其中1q21基因扩增检出率为56.9%(58/102),RB1基因缺失检出率为44.1%(45/102),P53基因缺失检出率为17.5%(18/103),D13S319基因缺失检出率为42.7%(44/103),IGH基因重排检出率为38.8%(40/103)。2.单因素分析显示,性别(P=0.006)、32-微球蛋白(P=0.005)、尿酸(P=0.021)、是否行自体造血干细胞移植(P=0.025)、ISS分期(P=0.033)、RISS分期(P=0.022)与MM患者PFS显著相关,多因素分析显示性别(P=0.023)是影响MM患者PFS的独立预后因素;而年龄(P=0.038)、β2-微球蛋白(P=0.01)、ISS分期(P=0.028)、RISS分期(P=0.001)、缓解深度(P=0.001)与MM患者OS显著相关,多因素分析显示缓解深度(P=0.021)是影响MM患者OS的独立预后因素。3.259例患者中可行DS分期MM患者239例,DS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占4.2%、16.7%、79.1%,分期以DS分期Ⅲ期为主;中位PFS分别为68、41、44个月(P=0.496),中位OS分别为99、64、67个月(P=0.478),5年PFS率分别为60%、38.1%、31.3%(P=0.208),5年OS率分别为60%、60.9%、53%(P=0.533)。可行ISS分期MM患者236例,ISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占17.4%、41.1%、41.5%;中位PFS分别为53、48、38个月(P=0.033),中位OS分别为68、92、57个月(P=0.028),5年PFS率分别为36.8%、40%、25.6%(P=0.291),5年OS率分别为60%、63.9%、42.1%(P=0.119)。可行RISS分期MM患者173例,RISS分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占9.2%、81.6%、9.2%,以RISS分期Ⅱ期为主;中位PFS分别为68、47、16个月(P=0.022),中位OS分别为随访未达到、72、25个月(P=0.001),5年PFS率分别为55.6%、34.7%、11.1%(P=0.049),5年OS率分别为80%、59.2%、22.2%(P=0.012)。ISS分期Ⅲ期MM患者共98例,可进行RISS分期者52例,分期为ISS分期Ⅲ期、RISS分期Ⅲ期MM患者16例,分期为ISS分期Ⅲ期、RISS分期Ⅱ期MM患者36例,两组中位PFS分别为16个月与41个月(P=0.091),中位OS分别为25个月与64个月(P=0.042)。4.硼替佐米疗效分析显示,新药硼替佐米组疗效显著高于传统化疗组(P<0.0001),BADT化疗方案组CR率、ORR优于BAD与BDT组,且明显优于BD组(P=0.001);其中血红蛋白值(P=0.022)、血小板计数(P=0.007)与P53基因(P=0.002)显著影响硼替佐米疗效。5.RISS分期Ⅲ期患者预后差,应用新药硼替佐米可获益,新药组与传统化疗组中位OS分别为30个月与14个月(P=0.014)。
  结论:1.MM好发于中老年人,男性发病率略高于女性,免疫分型以IgG型为主,起病时多伴有贫血、低蛋白血症、球蛋白和β2-微球蛋白水平升高以及染色体异常;2.性别和缓解深度分别是影响MM患者PFS和OS的独立预后因素;3.RISS分期系统在预后分层意义上优于传统DS分期系统和ISS分期系统,且可进一步筛选出ISS分期Ⅲ期患者中高危MM患者;4.硼替佐米可使MM患者疗效显著提高,血红蛋白值、血小板计数与P53基因可影响硼替佐米疗效;5.RISS分期Ⅲ期患者预后差,中位总生存期为25个月,新药硼替佐米可改善其不良预后。
[硕士论文] 王超
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:细胞不可逆地脱离细胞周期,丧失增殖能力,达到一种相对稳定的状态,这种状态被称为细胞衰老(cellular senescence),它能够改变微环境和组织稳态。许多研究证明,肿瘤的发生、发展以及治疗都与细胞衰老有着密切的联系。一方面,表现出无限增殖能力的肿瘤细胞通常具有衰老障碍的特点,最终表现为细胞周期调控机制的紊乱。肿瘤发生的前提条件是细胞突破周期调控机制获得无限分裂增殖能力,即永生化,肿瘤细胞无限分裂增殖的必要条件则是细胞衰老相关调控信号通路的障碍,而这种细胞衰老相关调控信号通路的障碍则是肿瘤发生的早期事件之一。另一方面,我们知道细胞凋亡和细胞自杀是细胞抑制肿瘤形成的重要途径,除此之外,细胞还可以通过进入衰老的状态来阻滞细胞周期,影响细胞分裂,进而抑制肿瘤的发生。随着衰老研究的不断进行,细胞衰老是阻止肿瘤形成的天然屏障这一观点得到了越来越多研究者的认可。因此,探讨细胞衰老与肿瘤发生之间的关系,将细胞衰老与肿瘤形成机制及肿瘤治疗联系在一起,将为肿瘤发生机制和治疗方案的研究带来很多有益的启示。
  肝癌是一种严重危害我国人民身体健康的恶性癌症之一,近年来我国肝癌的发病率逐年上升,据统计全世界肝癌发病总人数的二分之一以上分布在中国,我国已经成为一个名副其实的“肝癌大国”。肝细胞癌在肝癌患者中的比例高达80%以上,通常发生在慢性肝损伤患者中。慢性肝损伤是一种由多种损伤因素如病毒感染、长期饮酒、药物毒性、遗传性物质代谢障碍所引起的进行性肝实质细胞破坏与再生的复杂病理过程,而这些病理变化往往通过不同的机制促进了肝病的进展,并成为肝癌发生发展的诱因。研究慢性肝损伤中细胞衰老与肝癌发生发展的关系,对阐明肝癌的发生机制与发展肝癌的治疗方案具有重要意义。
  本课题的研究内容主要分为四个部分。首先,我们建立了急性和慢性肝损伤的动物模型,并开展了急慢性损伤下肝脏的病理变化规律和肝细胞衰老规律的研究。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,Fah)基因敲除小鼠,简称Fah-/-小鼠,是由Grompe等建立的酪氨酸血症Ⅰ型小鼠模型。该模型由于FAH的缺失使得酪氨酸代谢受阻,产生具有DNA损伤作用的毒性代谢产物从而导致急性肝损伤,小鼠因肝衰竭8周左右死亡。添加药物NTBC能够抑制酪氨酸代谢上游代谢酶活性,从而抑制毒性代谢产物产生,Fah-/-小鼠表现为正常表型。当仅添加2.5%治疗剂量的NTBC饲养时,Fah-/-小鼠发生慢性肝损伤。我们分别对8周龄的Fah-/-小鼠给予停药处理和给予2.5%治疗浓度的NTBC处理,使得两组小鼠分别出现肝脏急性损伤和慢性损伤。我们发现给予2.5%治疗剂量NTBC的Fah-/-小鼠直到8周仅表现为较轻的慢性肝脏病变,如小的炎症坏死灶、小的脂肪变性病灶及轻微的核多态化和肝细胞肿胀,而完全停药组在8周时呈现出严重的急性肝损伤,主要表现为大量肝细胞多核化、广泛的弥漫性坏死、胆管增生性病变及严重的肝细胞脂肪变性和肿胀。由于细胞周期阻滞细胞不能完成正常分裂可导致衰老细胞的体积增大,因此细胞体积的变化可以用来指示细胞衰老。利用肝细胞面积作为分析肝细胞体积变化的指标,我们发现急性损伤4周和8周时,Fah-/-小鼠的肝细胞面积显著增大,而慢性损伤时Fah-/-小鼠其肝细胞面积在4周时没有明显增加,在8周时虽有所增加但仍显著低于急性损伤组。这提示我们不同肝损伤程度下肝细胞衰老的状况不同。为了进一步确认急慢性肝损伤下肝细胞衰老的情况,我们建立了综合的肝细胞衰老鉴定方案,包括衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、衰老相关的异染色质(SAHF)染色和细胞周期抑制因子p53及p21的表达水平检测。为了明确急性肝损伤下Fah-/-小鼠肝细胞的衰老规律,我们在Fah-/-小鼠急性损伤后0、2、4、6、8周等五个时间点分别取材,利用建立的衰老评价方案进行评价,我们发现随着急性肝损伤时间的增长,肝细胞衰老相关的各项指标表达不断升高,从而表明急性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞确实发生了衰老,Fah-/-小鼠肝细胞表现出稳定的衰老表型。为了进一步验证我们的推断:慢性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞未发生细胞衰老。我们在慢性损伤后0、4、8、12周等四个时间点分别取材,我们发现慢性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞并未表现出稳定的衰老表型。结合急慢性肝损伤下不同的个体命运,我们提出这样的假设:肝细胞衰老的诱导需要损伤程度达到一定阈值,慢性损伤下Fah-/-小鼠肝细胞不能衰老可能是其高发肝癌的主要原因。
  第二,为了明确肝细胞衰老的发生与否确实影响了急慢性肝损伤下肝癌的发生,我们进行了如下实验。首先我们通过肝功能指标检测进一步确认了Fah-/-小鼠呈现的急慢性肝损伤表型。我们发现完全停药处理下,Fah-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及总胆红素水平显著升高,白蛋白的含量显著降低,表现为急性肝损伤;低剂量处理下Fah-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及总胆红素水平仅有一定升高,而血清白蛋白的含量仅有一定的降低,表现为慢性肝损伤。接下来我们统计了急慢性肝损伤情况下Fah-/-小鼠的成瘤情况。我们知道急性损伤下Fah-/-小鼠在6-8周会因毒性代谢产物导致的肝衰竭而死亡,为了延长急性损伤时间到达慢性损伤所需的成瘤时间,即12周和26周,我们在急性损伤下Fah-/-小鼠损伤到达极限(体重下降至原始体重的70%-75%)时给予3天治疗剂量的NTBC,然后再次停药,如此循环往复使急性损伤时间延长至12周和26周。经统计比较,我们发现急性损伤12周时均未见Fah-/-小鼠成瘤,而慢性损伤12周时Fah-/-小鼠成瘤率为100%。急性损伤26周时,Fah-/-小鼠成瘤率为36%,相对于慢性损伤26周(100%)显著降低,同时急性损伤下Fah-/-小鼠肝脏中瘤状体的数量、大小均显著低于慢性损伤组。通过上述研究,我们可以看出在不给予任何干预的情况下,急性损伤的Fah-/-小鼠由于毒性代谢产物蓄积,引起了严重的肝损伤最终导致Fah-/-小鼠走向死亡;通过在损伤极限时给予短时NTBC使得急性损伤下Fah-/-小鼠逃避了因肝衰竭而死亡的命运,同时又利用急性损伤的特点保证了小鼠肝细胞衰老及衰老监控的正常激活,使得肝癌的发生得以有效抑制;慢性损伤下Fah-/-小鼠避免了严重的肝损伤,肝细胞未表现出稳定的衰老表型,Fah-/-小鼠中DNA损伤的肝细胞不能通过细胞衰老清除,导致了肝癌的发生。进一步,通过收集急慢性各个时间的样本进行RNA-seq分析,通过衰老相关信号通路、肝癌相关信号通路,细胞周期及细胞增殖相关通路变化规律的分析,从整体转录组水平印证了我们之前的实验推测,即肝细胞衰老抑制的同时伴随着肝癌的发生。
  第三,为了进一步证实慢性肝损伤下肝细胞未发生衰老是肝癌发生的主要原因,我们通过加重损伤程度诱导慢性损伤下肝细胞发生衰老,观察肝癌发生是否受到抑制。选取已经慢性损伤8周的Fah-/-小鼠,给予完全停药诱导急性损伤4周,诱导肝细胞发生衰老,12周后统计小鼠成瘤情况。我们发现慢性肝损伤8周再诱导急性损伤4周后,Fah-/-小鼠肝细胞再次呈现衰老表型,即肝细胞衰老被重新启动。而且12周时小鼠成瘤率仅为14.29%,相对于慢性肝损伤12周时Fah-/-小鼠的成瘤率显著降低。由此可见,慢性肝损伤下的Fah-/-小鼠,通过诱导急性肝损伤诱导肝细胞发生衰老,可以有效的阻止肝细胞癌的发生。
  第四,探究细胞衰老抑制肝癌发生的相关机制。细胞衰老是生物体内潜在的肿瘤抑制机制,虽然关于细胞衰老与肿瘤发生的相互关系越来越受到科研工作的重视,但肝细胞衰老抑制肝癌发生关系的机制仍不明确。肝细胞衰老抑制肝癌发生的重要机制是细胞衰老诱导的免疫监控。通过比较慢性损伤和慢性损伤诱导急性损伤肝脏中的免疫细胞数量,我们证实Fah-/-小鼠肝细胞衰老发生后重新激活了衰老相关的免疫监控,衰老细胞激活CD4+Th1细胞,进一步促进NK细胞和巨噬细胞的活化和增值,从而介导了细胞毒效应而清除衰老的肝细胞,从而发挥抑制肝癌的作用。
  本研究通过应用Fah-/-小鼠模拟不同损伤程度的急性和慢性肝损伤,使得肝细胞衰老的发生可以调控,作为肝癌模型完美的再现了肝细胞衰老与肝癌发生的关系,清晰表明肝细胞衰老是抑制肝癌发生的主要保护机制,从而为慢性肝损伤下调控肝细胞衰老抑制肝癌发生奠定了理论基础,为实现肝细胞衰老可调控性和肝癌衰老诱导治疗提供了理论依据和实验方案。这对于研究细胞衰老与肝癌发生的关系,对阐明肝癌的发生机制,完善肝癌的治疗方案,具有重要生物学和医学意义。
[硕士论文] 赵成帅
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过对比左半结肠癌与直肠癌患者在发病年龄、性别、首发症状、组织学类型、肿瘤分期、术前是否贫血、区域淋巴结阳性率、p53阳性率、Ki-67阳性率、KRAS、BRAF基因突变状态等之间差异,以及基因组特征、基因组变异频率、转录组之间的差异,探讨左半结肠癌与直肠癌之间的异同,为结直肠癌精准治疗提供依据。
  方法:①选取2011年1月至2012年1月在海军军医大学长海医院行手术切除的323例原发性结直肠癌患者为研究对象,收集患者临床特征资料,以手术日期或病理确诊日期为随访起点对患者或家属进行随访,以死亡为终点事件,随访时间截至2017年8月1日,分别对两组的数据进行统计分析。②通过下载TCGA数据库结直肠癌患者139例TMB数据,148例MSI数据,139例SNV数据、283例CNV数据及137例RNA-Seq数据,运用生物信息学的方法进行处理并行统计学分析。计数资料比较使用x2检验,计量资料比较使用t检验,KM法用于生存分析,运用COX回归分析哪些因素对生存期有影响,P<0.05有显著统计学差异。
  结果:①左半结肠癌与直肠癌患者在首发症状、组织学类型、肿瘤分期、术前是否贫血、p53阳性率及BRAF基因突变状态之间差异有统计学意义(P均<0.05)。②左半结肠癌和直肠癌中位生存时间均未观察到。③左半结肠癌、直肠癌的5年生存率分别为79.2%、74.3%。④Ⅰ期、Ⅱ期左半结肠癌和直肠癌患者生存曲线差异无统计学意义(P=0.840);Ⅲ期左半结肠癌和直肠癌患者生存曲线差异无统计学意义(P=0.106);Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期左半结肠癌和直肠癌患者生存曲线差异无统计学意义(P=0.524)。⑤Cox比例风险分析结果显示,病理类型[HR=1.759,P=0.047]和肿瘤分期[HR=2.104,P<0.001]是影响结直肠癌患者生存期的独立危险因素。⑥左半结肠癌和直肠癌在肿瘤突变负荷及微卫星不稳定方面差异无统计学意义(P均>0.05)⑦左半结肠癌和直肠癌在基因组变异频率上存在差异,其中KRAS等7个基因SNV差异有统计学意义(P均<0.05),ALK等1064个基因CNV差异有统计学意义(P均<0.05)。⑧左半结肠癌和直肠癌在转录组上存在差异,有259个基因表达及10条信号通路存在差异(P均<0.05)。
  结论:左半结肠癌多以腹痛、排便习惯改变为首发症状,直肠癌则以血便为主;左半结肠癌含粘液腺癌或印戒细胞癌成分的比例高于直肠癌;直肠癌初诊时的肿瘤分期早于左半结肠癌;左半结肠癌术前贫血的比例高于直肠癌;左半结肠癌与直肠癌生存期未见明显差别;病理类型及肿瘤分期为结直肠癌患者生存期的影响因素;左半结肠癌与直肠癌在TMB及MSI上未见差异,在基因组变异频率及转录组特征上存在一定的差异。
[博士论文] 杨阳
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌,又称大肠癌,为消化系统常见的恶性肿瘤,近十年来国内结直肠癌原发病率和年龄标准化发病率均持续增长。结直肠癌潜伏期较长、生长较慢、进展缓慢,其诊断分期对于患者愈后有着较大的影响。及时的检诊可以有效提高结直肠癌的治疗效果并改善患者预后。目前结直肠癌的诊断方法主要为生化检验、影像学检查和病理学检查。由于缺乏敏感度和特异性较好的生物标志物,其早期诊断率仍然较低。而诊断金标准结肠镜检查不适合用于大规模人群的早期筛查。因此,探索有效诊断结直肠癌的生物标志物具有重要的意义。
  近十年来,随着多种组学技术的发展,新型的生物标志物得以发现。作为组学的一个分支,代谢组学能够检测细胞信号转导、调节以及生物化学反应中的小分子物质,具有较高的敏感度和特异性。代谢组较目前临床使用的生物标记物更为敏感,对人体内任何微小的生化改变具有很强的监测能力,因而可以成为包括结直肠癌在内各种癌症的诊断和个性化治疗最有力的工具之一。基于代谢组学发现结直肠癌的肿瘤生物标志物,具有无创或微创、适合大规模人群筛查的优点,且用于分析的血浆和尿液等体液样本使用量少,容易获得。
  氨基酸在机体新陈代谢中起着至关重要的作用,是维持正常细胞功能和生物生存的必需。氨基酸的组成与含量随着肿瘤细胞代谢的改变而产生变化,因此在一定程度上能够反映原发肿瘤的形成、生长和浸润转移等情况。在结直肠癌代谢组学研究中,已有文献报道结直肠癌患者和健康志愿者的血液、尿液和粪便中氨基酸的组成不同,在癌组织与正常组织之间的氨基酸组成也存在一定的差异性。
  基于以上因素,首先,本论文建立了结直肠癌患者癌组织中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、门冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、门冬酰胺(Asn)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、瓜氨酸(Cit)、非对称二甲基精氨酸(ADMA)、胱氨酸(Cyss)、肌氨酸(Sar)、3-氨基丙酸(Apa)、3-氨基-2-甲基丙酸(Amp)、4-氨基丁酸(Aba)、5-氧代-脯氨酸(Opr)、羟脯氨酸(Hpr)、鸟氨酸(Orn)、2-氨基己二酸(Ahd)、马尿酸(Hia)、对称二甲基精氨酸(SDMA)、犬尿氨酸(Kyn)等34种氨基酸的液相-串联质谱联用(LC-MS/MS)检测方法,该方法仅需要100mg组织样本匀浆,避免了对待测氨基酸进行衍生化处理,且10min内完成分析,检测选择性好,34种待测氨基酸及内标氨基酸具有较好的色谱分离与质谱响应,标准曲线在线性范围内线性良好,提取回收率与基质效应、定量下限、日内日间准确度精密度、稳定性、稀释效应均符合生物样本分析要求,适用于临床大批量组织样本的高通量分析。
  运用该方法对94例结直肠癌患者癌组织、癌旁组织及正常组织样本进行34种氨基酸的含量测定,并进行结直肠癌组织靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明:癌组织中Gly、Asp、Glu、Pro、Cys、ADMA、Cyss、Kyn、Orn、Aba、Apa、Hpr,以及Ala、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Asn、Met、Trp、His、Opr、SDMA、Sar、Amp含量均显著高于癌旁组织、正常组织中的含量;结直肠癌组织与非癌组织的氨基酸代谢谱具有较大差异;建立的正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)模型具有较高的稳定性和较高的预测率,能够较好的区分癌组织与非癌组织;找到了Apa、Kyn、Cyss、Cys、Hpr、ADMA、Gly、Asp、Ala、Val、His十一个变量投影重要性(VIP)值大于1的差异性代谢物,其中VIP值大于1.5的差异性代谢物有Apa、Kyn、Cyss,可以作为潜在的区分肿瘤组织的生物标志物。
  其次,本论文建立了结直肠癌患者血浆中Gly、Ala、Val、Lys、Leu、Ile、Gln、Glu、Met、His、Phe、Arg、Tyr、Trp、Ser、Pro、Thr、Opr、Asn、Orn、Cit、Cyss、Cys、Hpr、Asp、ADMA、SDMA、Kyn、Apa、Sar、Amp、Hia等32种氨基酸的LC-MS/MS检测方法,该方法中待测氨基酸不用衍生化,直接通过反相C18柱进行色谱分离,血浆用量仅50μl,分析时间10min,检测选择性好,在线性范围内各待测氨基酸的标准曲线线性良好,提取回收率与基质效应、定量下限、日内日间准确度精密度、稳定性、稀释效应均符合生物样本分析要求,适用于临床大批量血浆样本的高通量分析。
  运用该方法对246例结直肠癌患者血浆、411例健康志愿者血浆、33例结直肠癌前病变患者血浆进行32种氨基酸的含量测定,并进行结直肠癌血浆靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明:结直肠癌患者血浆Gln、Ser、Glu、Asn、Opr、Orn、Lys、Cys、Amp、SDMA、Asp含量均显著高于健康志愿者血浆中的含量,Gly、Ala、Val、Phe、Trp、Pro、Arg、Met、Tyr、Cyss、His、Hia、Hpr、Sar、Apa、Leu、Kyn均显著低于健康志愿者血浆中的含量;结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆中的氨基酸代谢谱具有较大差异;建立的OPLS-DA模型具有较高的稳定性和较高的预测率,能够较好的区分结直肠癌患者与健康志愿者;找到了Trp、Sar、Glu、Ser、Met、Ala、Cys、Cyss、Tyr、Opr、Apa、Gln、Hia、Arg十四个VIP值大于1的差异性代谢物,其中VIP值大于1.5的差异性代谢物有Trp、Sar、Glu,可以作为潜在的诊断结直肠癌患者的生物标志物。通过Logistics回归,基于Trp、Sar、Glu三个氨基酸建立了联合因子诊断模型。诊断模型方程为:联合因子=0.001×Trp+0.029×Sar-0.002×Glu-9.427(Trp、Sar、Glu单位ng/ml),联合因子截断值为2.433(小于截断值,诊断为结直肠癌患者);对结直肠癌的诊断效能高于氨基酸单因子,高于临床常用的血清诊断指标癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白。该结直肠癌诊断模型对上述血浆样本的诊断准确率为91.9%、灵敏度为83.3%、特异性为96.6%、阳性预测值93.2%、阴性预测值91.3%,各项诊断评价指标均优于CEA诊断,可用于结直肠癌的辅助诊断。
  最后,本论文比较了154例结直肠癌患者与154例健康志愿者的血浆样本中Trp、Kyn含量,以及吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1酶)的含量及相对活性,比较了94例结直肠癌患者的癌组织与癌旁组织、正常组织样本中IDO1酶的相对活性,结果表明:结直肠癌患者血浆IDO1酶含量略高于健康志愿者,但含量差异无统计学意义;结直肠癌患者血浆IDO1酶相对活性极显著高于健康志愿者;结直肠癌患者癌组织IDO1酶相对活性极显著高于癌旁组织、正常组织。研究初步证实了结直肠癌患者体内存在着色氨酸代谢紊乱的异常情况。
[硕士论文] 王安邦
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,具有起病隐匿和高致死率的特点。大约有30%的患者在肾癌确诊的时候已经发生转移。肾癌对放疗及化疗均不敏感,靶向药物的应用改善了肾癌患者的总体预后,但用药一段时间后,患者大多会出现耐药。因此,研究肾癌发展和转移的机制,就显得十分迫切而重要。除此之外,肾癌缺乏有效的早期诊断标志物。近年来,长链非编码RNA的在细胞的多种生物学进程中发挥着重要作用,如细胞生长、凋亡、分化和转移。很多研究报道了长链非编码RNA在肿瘤进展和转移中发挥着重要的作用,这类非编码RNA可以通过多种途径影响编码基因的转录和翻译。然而,长链非编码RNA在肾癌中的研究仍存在很多不足,因此,通过对大样本中lncRNA表达谱的分析,探索lncRNA在肾癌发展和转移中的作用以及寻找肾癌相关的分子标志物,为肾癌的治疗提供可能的靶点。
  方法:(1)利用GEO和TCGA芯片数据库查找肾癌相关的数据集,通过质检和样本分析,选定GSE40911、GSE61763、GSE76207、GSE82122和TCGA数据库进行lncRNA的筛选。对这5个数据库进行深入的芯片分析,再根据p值和差异倍数筛选出有意义的lncRNA。(2)进一步增大样本量进行验证,筛选最有意义的lncRNA,确定研究对象。(3)分析选定标本的临床特征,检测研究lncRNA的表达量,分析lncRNA与患者临床特征和指标的相关性。(4)分析lncRNA的基因组学特点,设计功能实验,观察lncRNA对肾癌细胞增殖和迁移能力的影响。(5)根据基因组位置及既往文献报道,探索长链非编码RNA EGFR-AS1与EGFR的相关作用关系。(6)利用RNA免疫共沉定等,探索EGFR-AS1如何调控EGFR的表达,寻找EGFR-AS1直接作用的靶蛋白或靶基因。
  结果:(1)通过大数据分析,筛选出与肾癌发展和转移相关的长链非编码RNA EGFR-AS1。临床样本验证发现EGFR-AS1在肾癌组织中显著上调表达,并且EGFR-AS1的高表达与TNM分期,T分期和淋巴结转移有关。(2)细胞功能学实验表明,EGFR-AS1能促进肾癌细胞的增殖和转移,体外实验研究表明,下调EGFR-AS1后能降低肾癌细胞的增殖和转移能力。(3)在肾癌组织标本中,发现EGFR的表达和EGFR-AS1表达量呈显著正相关。EGFR-AS1可通过增加EGFR的稳定性,促进其表达。(4)RIP实验证实HuR与EGFR-AS1存在富集效应,并且HuR与EGFR mRNA存在比较明显的结合。沉默HuR的表达可以减少EGFR的mRNA的稳定性。HuR参与对EGFR mRNA稳定性的调节。(5)EGFR-AS1通过EGFR促进肾癌细胞的增殖和转移。并且EGFR-AS1和EGFR mRNA存在共定位现象。EGFR-AS1通过结合HuR维持EGFR的稳定性,抑制EGFR的降解。
  结论:EGFR-AS1在肾癌组织中高表达,EGFR-AS1通过结合HuR维持了EGFRmRNA的稳定性,进而促进肾癌的增殖和转移。在此研究基础上,EGFR-AS1有望成为肾癌诊断的标志物以及潜在的治疗靶点。
[博士论文] 李自雄
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  基于全球的肿瘤登记数据,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率在男性和女性肿瘤中分别位列第五位和第九位,而每年因HCC而死亡的患者,在男性和女性肿瘤中排列为第二位和第六位。中国每年新发HCC和因其死亡人数均约占到世界范围内的50%左右。中国HCC患者绝大部分是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染导致的;而且HBV慢性感染人群基数庞大,这是引起HCC高发的最主要原因之一。HBV large S基因(preS1/preS2/S)编码了病毒颗粒的表面蛋白,是病毒感染肝细胞、机体抗原识别表位和引起HCC发生发展的关键影响因素。前期大量的流行病学数据显示,该基因片段preS区的相关变异是促进HCC发生发展的危险因素。但是何种preS变异序列,以及这些变异是通过何种机制导致了HCC的发生,目前尚无相关研究能够完全阐明。
  研究目的:
  证实影响HBV慢性感染患者发生HCC的危险因素,阐明何种HBV preS区的基因变异能促进HCC的发生;在体外实验中,发现这些变异序列所引起的癌症相关表型的改变和调控的下游基因与其作用机制;在体内实验中,验证large S序列及变异的致炎、致癌效果。为后续如何预防慢性HBV感染患者发生HCC和进行相应的治疗,提供理论依据。
  研究方法:
  应用纳入2114位HBV慢性感染者队列,设计特异性引物扩增患者外周血中HBV基因组preS区片段,采用sanger测序的方法,序列比对后鉴定相关preS变异。纳入患者人口学资料、临床一般信息和治疗信息等,采用COX单因素和多因素风险回归模型分析方法,促进HCC发生和患者肝病相关死亡的风险因素。
  应用HBV large S基因野生型和筛选出的三种变异型序列,构建相关慢病毒载体,转染HepG2细胞系;通过检测细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、裸鼠皮下荷瘤等表型,观察相关基因序列对细胞恶性表型的影响。测定不同细胞内RNA表达谱芯片,比较分析large S基因及其变异调控的下游基因。通过实时荧光定量PCR(reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR)、免疫印迹实验(Western Blot,WB)等分子生物学实验研究其可能的调控机制。
  将相关基因序列构建Sleeping Beauty相关载体,用尾静脉注射的方式表达于小鼠肝脏。阐明变异型large S基因所致小鼠肝脏炎症状态和肝细胞癌的发生情况。通过小鼠肝脏RNA表达谱芯片的测定,比较分析large S基因及相关变异在动物体内的调控的基因及参与的信号通路。后续相关分子的免疫组化等实验来验证靶分子的表达水平,进一步验证large S基因及其变异调控的作用机制。
  研究结果:
  该研究第一部分,人群队列的研究结果显示,2114例HBV慢性感染患者队列,随访的中位时间为8.92年,总共随访18406人年。在随访期间内,共有209例患者发生HCC,发生率为9.89%(209/2114)。经COX回归分析后,得出男性患者、高年龄患者、肝硬化、HBV C2基因亚型、未使用抗病毒治疗、高直接胆红素(>7mmol/L)、甲胎蛋白阳性、低白蛋白水平(<35g/L)、低血小板计数(<100×109g/L)是促进HCC发生的危险因素(P<0.05)。此外,HBV基因组preS区中C3116T和T31C突变促进了HCC的发生发展。在HBV慢性感染者体内,C2为主要基因亚型(73.1%),由C2基因亚型所引起的HCC发生,占83.3%(125/150)。HBV C2基因亚型相关preS变异,如G2950A、G2951A、A2962G、C2964A、A3054T、C3063G、T3069G和A3120T,均促进了HCC的发生。preS区相关变异的组合,如G2950A/G2951A/A2962G/C2964A(mutation1),促进了HCC的发生(HR2.51,95%CI,1.10-5.74,P=0.030);联合突变C3116T/T31C(mutation2)变异也增加了HBV慢性感染患者HCC的发病风险(HR1.57,95%CI,1.07-2.31;P=0.022)。此外,preS2deletion(>5bp)在使用抗病毒治疗的人群中,促进了HCC发生(HR2.81,95%CI,1.27-6.22;P=0.011)。
  课题第二部分,体外实验结果显示,HBV large S基因deletion序列较wild type序列显著提高了细胞增殖能力、软琼脂克隆能力和裸鼠皮下荷瘤能力(P<0.05)。但三种变异型large S序列(mutation1、mutation2和deletion)对细胞迁移、细胞侵袭等细胞转移运动能力没有提升,差异无统计学意义(P>0.05)。在转染目的基因后,mRNA表达谱芯片结果显示,野生型large S基因主要影响了细胞内基因转录、细胞周期和促进细胞凋亡等生物学进程。Mutation1、mutation2和deletion序列与wild type基因比较后发现,三种变异均降低了细胞凋亡和细胞内免疫相关基因的表达,并上调了癌症相关的信号通路。基因定量的结果也证实了促进凋亡的相关基因OLR和MAIP1在变异组中低于wild type组,且抑制凋亡基因BIRC3和BIRC2则在变异组中高于wild type组。癌症相关基因的表达水平,如STAT3信号通路在deletion组中,其表达水平较wild type组高(P=0.027)。Western blot实验的结果显示,STAT3分子的表达水平在三种变异组中高于野生型large S组,但磷酸化后的p-STAT3蛋白表达量在各组间未见明显差异。在STAT3分子抑制剂stattic作用下,各组间的细胞增殖趋于一致。而在STAT3信号通路激动剂IL-6作用下,各组间的细胞增殖能力有显著的提高,并增大了组间差异。相关交互作用分析显示,三种变异型large S基因与炎症因子,协同通过IL-6/STAT3信号通路促进了HepG2细胞的增殖。
  通过构建好的小鼠模型,发现3种变异型large S基因导致小鼠的生存期受到不同程度的降低。三种变异型基因(mutation1、mutation2和deletion)引起小鼠肝脏肿瘤的发生率,较wild type有不同程度的提高,分别为36.4%(4/11)、57.1%(4/7)、66.7%(4/6),(Ptrend=0.023)。肝脏实物图和H&E染色镜下可见表达HBV large S基因的小鼠肝脏炎症状态明显,肝细胞呈现出水肿、变性;在严重挤压状态下,肝脏特征性结构不明显。肝癌相关特异性分子CK18、细胞增殖相关蛋白Ki-67和PCNA的免疫组化评分,在mutation1、mutation2和deletion组中均较vector组或wild type组显著提高(P<0.05)。小鼠肝脏的mRNA表达谱芯片结果显示:野生型large S基因的表达,调节了细胞凋亡、免疫应激,以及癌症相关相关信号的激活。Mutation1、mutation2和preS2deletion序列的表达后与野生型large S基因比较,这些相关均进一步的上调了小鼠肝脏细胞内炎症与癌症相关基因集,以及癌症相关信号通路的激活。小鼠外周血中相关分子ELISA结果显示,炎-癌转化相关细胞因子IL-5、IL-6和IL-12均表现为,wild type组中的表达较vector组高,而三种变异型组较wild type组高。此外,表达三种变异型large S基因的小鼠肝脏中,STAT3和p-STAT3分子的表达评分均较vector组与wild type组高,差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明,三种large S基因变异,尤其是preS2deletion可与小鼠体内的炎症状态,共同通过激活IL-6/STAT3相关信号通路,进而促进了HCC的发生发展。
  研究结论:
  本课题通过队列研究证实了众多临床指标和HBV基因preS区相关突变是慢乙肝患者发生HCC的危险因素。进一步研究发现相关preS区的组合突变(G2950A/G2951A/A2962G/C2964A,C3116T/T31C和preS2deletion),具有促进慢性HBV感染者发生HCC的作用。在体外实验中,证实三种变异型large S基因,尤其是preS2deletion序列可通过上调STAT3分子的表达,激活癌症相关信号通路,促进了HCC的发生发展。小鼠模型中,也证实了三种变异型large S基因的表达具有促进小鼠肝脏炎症、癌症的作用。本课题充分解释了HBV large S基因preS区相关突变促癌发生发展的作用机制,为防控HCC的发生,提供了新的思路。
[博士论文] 余建
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近年来的研究表明,环状RNA广泛存在于人体正常组织、癌组织、血清及血浆等。而且已有相关报道显示它们在膀胱癌、胃癌及结肠癌等癌症的进展中发挥了重要作用。然而,环状RNA在肝细胞癌(简称为肝癌)中的作用尚不清楚。在本研究中,探索了环状RNA在肝癌中的功能以及诊断价值。我们的研究由下面两个部分组成。
  在本研究的第一部分,利用高通量测序检测了五对肝癌及对应的癌旁组织的环状RNA的表达情况并以cSMARCA5(来自SMARCA5基因第15和第16外显子的环状RNA分子,其在CircBase数据库的编号为hsa_circ_0001445)为代表探索了环状RNA在肝癌中的功能。首先,通过环状RNA测序,发现了4727个较高丰度(在肝癌或癌旁组织的平均RPM≥0.1)的环状RNA。它们中的大多数来自外显子,而且大多数长度低于1000个碱基。重要的是,在人类肝组织中发现了513个新的环状RNA分子以及236个在肝癌癌旁差异表达的环状RNA分子,其中,108个环状RNA分子在肝癌组织中上调,128个环状RNA分子在肝癌组织中下调。通过实时定量PCR,琼脂糖凝胶电泳以及Sanger测序,成功验证了五个在肝癌组织中上调的环状RNA(cDNAJC6,cGPC3,cME1,cPVT1和cSATB2)和五个在肝癌组织中下调的环状RNA(cCYP2C8,cKCNN2,cLIFR,cPIK3R1和cSMARCA5)。
  其次,通过RNase R(一种5'→3'核酸外切酶,能特异性地消化线性RNA而保留环状RNA)消化实验,放线菌素D转录抑制实验,荧光原位杂交(FISH,fluorescence in situ hybridization)以及实时定量PCR实验等,证明了cSMARCA5是一种稳定的、高丰度的,主要存在于细胞质中的环状RNA分子,并且在肝癌组织中的表达低于癌旁组织。
  第三,通过构建野生型(从第14内含子到第16内含子全部克隆到过表达质粒中)以及I14RC(reverse complementary sequences in intron14,SMARCA5基因第14内含子上的一段序列,与I16RC反向互补)和(或)I16RC(reverse complementary sequences in intron16,SMARCA5基因第16内含子上的一段序列,与I14RC反向互补)缺失型的cSMARCA5过表达质粒,实时定量PCR,Northern blot,RNA干扰以及RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)等实验,证明了I14RC和I16RC在cSMARCA5的生成过程中是必不可少的,而DHX9(DExH-Box Helicase9,一种高丰度的细胞核内RNA解螺旋酶)能够通过结合I14RC和I16RC来抑制它们的配对,从而抑制cSMARCA5的形成。另外,DHX9的mRNA和蛋白在肝癌组织的表达高于癌旁组织,并且肝癌组织中DHX9的免疫组化评分与CSMARCA5的表达水平呈正相关。
  接着,在一个有163名肝癌患者的队列中,也证实了cSMARCA5在肝癌组织的下调。进一步发现cSMARCA5在肝癌组织中的低表达与侵袭性特征显着相关,包括增加的肿瘤大小(>5cm),较差的Edmondson分级,存在微血管侵犯,较晚的TNM及巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期。cSMARCA5的下调表明HCC患者的总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)较短。多因素分析表明cSMARCA5的下调是肝癌患者手术后OS和RFS的独立危险因素。
  然后,利用cSMARCA5过表达质粒在肝癌细胞系中成功地过表达了cSMARCA5,利用靶向其反向剪切位点的小干扰RNA(small interfering RNAs,siRNAs)在肝癌细胞系中成功地干扰了cSMARCA5的表达。CCK-8(Cell Counting Kit-8),细胞划痕、Transwell、皮下荷瘤、肿瘤肝脏原位种植肝内转移以及尾静脉注射肺转移等实验表明过表达cSMARCA5能抑制肝癌细胞的增殖和转移。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、细胞划痕和Transwell等实验表明干扰cSMARCA5能促进肝癌细胞的增殖和转移。
  最后,通过miRanda软件预测、AGO2抗体的RIP实验、circRIP实验、双荧光素酶报告系统、生物素标记的microRNA捕获以及RNA荧光原位杂交实验等,证明了cSMARCA5能结合miR-17-3p及miR-181b-5p。通过查阅文献以及实验验证,发现过表达或干扰cSMARCA5之后,miR-17-3p和miR-181b-5p的共同靶基因TIMP3变化最明显。因此,假设cSMARCA5主要是通过吸附miR-17-3p和miR-181b-5p来保护TIMP3不受降解,从而上调TIMP3,起到抑制肝癌生长和转移的作用。为了验证这个假设,进行了一系列的实验。首先,发现miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对TIMP3的降解作用可以被cSMARCA5所阻断。其次,CCK-8增殖实验表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对肝癌细胞增殖的促进作用可以被cSMARCA5所阻断。而Transwell实验表明miR-17-3p和(或)miR-181b-5p对肝癌细胞转移的促进作用可以被cSMARCA5所阻断。另外,TIMP3的mRNA水平在肝癌组织中的表达量低于癌旁,并且与cSMARCA5的表达量呈正相关关系。综上所述,cSMARCA5(至少部分)通过miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制肝癌的生长和转移。
  综上所述,环状RNA cSMARCA5能抑制肝癌的生长和转移,是潜在的肝癌治疗靶点。
  在本研究的第二部分,用环状RNA芯片检测了五例乙肝相关肝癌(简称肝癌)及五例慢性乙型肝炎(简称慢乙肝)患者的血浆。发现了371个差异表达的环状RNA分子,其中326个在肝癌血浆中高于慢乙肝血浆,45个在肝癌血浆中低于慢乙肝血浆。将326个上调的环状RNA与肝癌组织中检测到的环状RNA取交集后,获得了10个候选环状RNA分子。通过实时定量PCR,琼脂糖凝胶电泳,Sanger测序,RNase R消化以及室温孵育等实验,成功鉴定出了其中的四个(hsa_circ_0000976,hsa_circ_0003506,hsa_circ_000775和hsa_circ_0139897),证明它们是环状的并稳定存在于血浆和肝组织中。
  检测这四个分子在肝组织的表达时使用的是实时定量PCR,以β-actin为内参。由于血浆RNA没有公认的内参,检测这四个分子在血浆中的表达时使用的是绝对实时定量PCR。结果表明,hsa_circ_0000976和hsa_circ_0007750这两个环状RNA分子不仅在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后,而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系,在肝癌组织中的表达量高于癌旁组织。hsa_circ_0139897虽然在肝癌及癌旁组织的表达量未见显著差异,但是其在肝癌患者血浆中的表达量高于健康人、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者,在肝癌手术前血浆中的表达量高于手术后,而且在肝癌患者血浆中的表达量与肝癌组织中的表达量呈正相关关系。推测这可能是因为肝癌组织中的hsa_circ_0139897比癌旁或健康组织中的hsa_circ_0139897更容易分泌到血浆中。因此,选择hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897这3个环状分子作为肝癌诊断标志物进一步研究。
  通过Cut off Finder(http://molpath.charite.de/cutoff/)网站的ROC曲线(Euclidean distance)分析法确定了血浆中hsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897用于区别肝癌和非肝癌的最佳截断(cut off)点分别为1067,4324以及1108copies/ml plasma,大于或等于这些cut off值的记为1,诊断为肝癌,而小于这些cut off值的记为0,诊断为非肝癌。为了提高诊断效果,将这三个环状分子的组合(Panel of circRNAs,简称CircPanel)用于诊断肝癌。
  在两个独立的大规模队列(训练集:158名乙肝相关肝癌患者,53名健康人,52名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者;验证集:152名乙肝相关肝癌患者,50名健康人,54名慢性乙型肝炎患者和50名乙肝肝硬化患者)中用ROC曲线(receiver operating characteristic curve,受试者工作特征曲线)下面积(Area Under Curve,AUC),对血浆CircPanel的肝癌诊断效果进行了评价。
  CircPanel在区别肝癌组与非肝癌组时比AFP具有更高的诊断价值(训练集:AUC0.863[95%CI0.819-0.907]vs0.790[0.738-0.842],P=0.036;验证集:AUC0.843[0.796-0.890]vs0.747[0.6910.804],P=0.011),而CircPanel与AFP的联合进一步提高了诊断价值(训练集:AUC0.878[0.836-0.920]vs0.790[0.738-0.842],P=0.010;验证集:AUC0.863[0.819-0.908]vs0.747[0.691-0.804],P=0.002)。CircPanel在区别小肝癌(单发,直径≤3cm)组与非肝癌组时也比AFP具有更高的诊断价值(训练集:AUC0.862[0.796-0.928]vs0.680[0.589-0.770],P=0.001;验证集:AUC0.838[0.776-0.900]vs0.699[0.613-0.785],P=0.011),而CircPanel与AFP的联合进一步提高了诊断价值(训练集:AUC0.873[0.817-0.929]vs0.680[0.5890.770],P<0.001;验证集:AUC0.874[0.823-0.925]vs0.699[0.613-0.785],P=0.001)。重要的是,CircPanel在区别AFP阴性肝癌组与非肝癌组(训练集:AUC0.838[0.761-0.914],验证集:AUC0.857[0.793-0.922])以及AFP阴性小肝癌组与非肝癌组(训练集:AUC0.881[0.797-0.965],验证集:AUC0.897[0.827-0.968])时也具有较高的诊断价值。
  还将非肝癌组划分为健康组,慢乙肝组和乙肝肝硬化组,并对CircPanel在下列几对比较时的诊断价值进行了评价:肝癌组与健康组、肝癌组与慢乙肝组、肝癌组与乙肝肝硬化组、小肝癌组与健康组、小肝癌组与慢乙肝组以及小肝癌组与乙肝肝硬化组。
  综上所述,由外周血血浆三个环状(RNAhsa_circ_0000976,hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)所组成的组合CircPanel具有较高的诊断价值,可以单独或与AFP联合使用,并且能用于小肝癌以及AFP阴性肝癌的诊断。
[博士论文] 施晓磊
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球男性人群中最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居第二位,死亡率居于第六位,严重威胁着老年男性的健康。虽然目前中国的前列腺癌发病率低于欧美国家,但是其增长速度非常迅速,预计至2020年发病率接近欧美发达国家平均水平,达到40/10万男性人口。由于前列腺癌症状隐蔽,国内患者诊断前列腺癌时分期较晚,超过50%的患者确诊时已发生局部进展或转移,与美国确诊时超过80%以上都是局部前列腺癌相比差距巨大,除了PSA筛查尚未在国内大规模普及的原因外,可能存在的种族差异也是重要的原因。美国国家癌症中心SEER(Surveillance Epidemiology and End Results,SEER)数据库2006-2012年的资料显示,局限性前列腺癌的5年生存率达到100%,而转移性前列腺癌的5年生存率仅为29.3%。因此,探索前列腺癌早期诊断标志物对于中国前列腺癌诊疗和研究意义重大。
  人类基因组计划研究成果表明,仅有约19000个基因编码蛋白质,占整个基因组的1-2%,剩下98-99%都是“暗物质”非编码序列。随着下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的成熟,最初被认为转录噪声的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)逐渐展现出其重要的作用。正是这些lncRNA才使得基因组调控异常复杂,充分发挥生物学功能。lncRNA是转录本长度超过200个碱基的RNA,不编码蛋白质或只编码较短的多肽——微肽,具有广泛的组织表达谱,较强的组织和细胞表达特异性,lncRNA可在表观遗传、转录和转录后水平等多个层面调控基因表达,调节蛋白基因功能。越来越多的研究表明lncRNA可通过多项机制调节基因功能,从而影响肿瘤细胞的生物学功能,发挥促进或抑制肿瘤的作用。同时,也有大量的lncRNA用于前列腺癌的早期诊断和分子分型。
  研究目的:
  本课题的主要研究目的是基于前列腺癌组织的二代测序数据筛选出肿瘤相关长链非编码RNA,并研究其在调节前列腺癌增殖和侵袭迁移中的作用机制,探寻前列腺癌的治疗靶点,寻找前列腺癌微创体液诊断的生物标志物,为前列腺癌的个体化诊治提供参考。从而为研发新型的前列腺癌靶向药物、优化临床治疗方案提供可靠的理论依据。
  研究方法:
  本课题采用NGS技术对65例中国人前列腺癌组织样本进行测序,分析RNA-seq数据,筛选显著差异表达的肿瘤相关lncRNA分子。对于筛选出来的lncRNA分子进行组织学和细胞学验证,利用生物信息学方法验证lncAPP的编码能力。qRT-PCR检测长海医院单中心291例拟行前列腺穿刺患者的前列腺按摩后尿渣中lncAPP表达水平,分析其是否能作为早期诊断指标有效区分前列腺癌患者与良性前列腺增生患者,和作为分子分型标志物区分低级别前列腺癌与高级别前列腺癌。
  应用RNA荧光原位组织杂交技术与核质分离技术明确lncAPP在前列腺癌肿瘤细胞系中的功能定位。应用干扰lncAPP表达的siRNA和外源性表达lncAPP的质粒作用于前列腺癌肿瘤细胞系,研究其对于维持肿瘤细胞生长能力包括肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响。应用慢病毒介导的稳定外源性表达lncAPP细胞系建立动物体内皮下荷瘤模型,应用瘤内持续注射siRNA介导的干扰lncAPP表达的皮下荷瘤模型,研究lncAPP对于维持肿瘤生长能力的影响。应用尾静脉注射稳转过表达lncAPP细胞系构建裸鼠转移模型,研究lncAPP对于肿瘤细胞转移能力的影响。
  应用生物信息学分析预测可能与lncAPP结合的miRNA及其结合位点,构建lncAPP-MS2-12X质粒通过RNA免疫沉淀(RIP)实验验证lncAPP能够与miRNA结合,构建野生型和突变型荧光素酶报告基因明确lncAPP与miRNA的结合位点。探索miRNA靶向的mRNA分子,验证lncAPP通过与miRNA竞争性结合调节下游关键分子,从而发挥维持肿瘤细胞生长的能力。运用micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的表达谱,筛选出差异表达的重要基因和信号通路。
  研究结果:
  分析65对中国人前列腺癌组织的RNA-seq数据发现存在显著差异的肿瘤相关lncRNA表达谱,按照临床分期、Gleason评分及进展转移三个标准筛选出lncAPP。前列腺癌患者尿渣和血浆中可检测到lncAPP,且前列腺癌患者体液中的表达水平高于良性前列腺增生患者。按摩后尿液lncAPP可以作为早期诊断分子标志物,能够区分穿刺阳性和穿刺阴性患者,且能区分高级别和低级别前列腺癌。
  通过外源性过表达和RNAi敲减的功能实验,证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞迁移和侵袭。动物皮下荷瘤模型证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,且能够促进肿瘤的转移。尾静脉注射稳转细胞系的体内转移模型,证实lncAPP能够促进肿瘤细胞的转移能力。
  应用miRDB和Target Scan数据库分析预测可能与lncAPP结合的miRNA,qRT-PCR检测外源性表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系中miRNA表达水平。运用MS2-RIP实验验证lncAPP能够与miR218/646结合,构建包含lncAPP与miR218/646结合位点及结合位点突变的荧光素酶质粒,明确其具体结合位点。证实lncAPP通过结合miR218/646,调节miR218/646靶向的下游mRNA发挥调节作用。Micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的转录谱,发现显著差异表达的基因和重要信号通路。
  研究结论:
  本研究基于中国人前列腺癌组织的RNA-seq测序数据,筛选出肿瘤相关的lncRNA分子,证实lncAPP能够作为早期诊断前列腺癌和区分高级别前列腺癌的分子标志物。体外和体内实验证实lncAPP可维持前列腺癌肿瘤细胞增殖和迁移侵袭能力。机制实验证明lncAPP结合miR218/646,阻断miR218/646对下游关键分子的抑制作用。lncAPP不但能作为早期诊断标志物应用于前列腺癌的早期诊断和分子分型,提高前列腺穿刺的阳性率,减少过度穿刺带来的痛苦和经济负担有着重要的转化医学意义;还可作为肿瘤治疗和抗转移的新靶点,从而为研发新型药物、优化临床诊治方案提供可靠的理论依据。
[硕士论文] 王硕
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  肝癌是中国第二大肿瘤死因。随着老龄化和环境危险因素暴露增加,肝癌发病率居高不下。男性高发是肝癌一个重要流行病学特点。据估计,中国男性肝癌发病率约是女性3倍。生活方式如饮酒、吸烟等不足以解释所有的男性肝癌发病风险。饮酒、乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)、性激素受体以及它们之间的交互作用可能是男性肝癌高发的原因。性激素受体被认为明确与肝癌发生有关。目前认为,雄激素受体(Androgen Receptor,AR)发挥促癌作用,雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)发挥抑癌作用。HBV可能与性激素受体相互作用,共同促进肝癌发展。饮酒与HBV的交互作用也会增加HBV的致癌能力。
  目前在肝癌发病性别差异上的研究主要集中在两方面:第一,探究男性肝癌高发人群特征以及肝癌男性高发相关危险因素。第二,利用分子生物学手段研究某一特定分子和通路在男性肝癌高发中的作用。目前,尚没有研究对男性肝癌高发原因进行整体描述和分析。
  利用生物信息学的手段,全面描述男性肝癌的基因特异性表达模式,分析其与预后的关系,并预测可能调控机制。
  研究目的:
  根据转录组学分析男性肝癌基因特异性表达模式。从表观修饰、微小RNA(micro RNA,miRNA)和性激素受体角度预测男性肝癌基因特异性表达模式的调控机制。通过生存分析,探索男性特异性表达模式的临床价值,构建男性肝癌预后模型。
  研究方法:
  1.数据来源:本研究数据来源于癌症和肿瘤基因图谱计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)公共数据库中肝癌相关的RNA-seq、miRNA、甲基化数据和临床数据。本研究验证数据来源于本教研室收集并测序的男性肝癌患者癌症与癌旁组织的RNA-seq数据。
  2.样本纳入:采用频数配对法和倾向评分匹配的方法进行样本纳入筛选。首先保证肝癌和癌旁组织中病毒感染信息匹配。其次,根据年龄、肝癌病理分期、身体质量指数(Body Mass Index,BMI)等进行倾向评分匹配。
  3.本研究将肝癌性别特异性基因或表达模式定义为:1)存在性别差异的基因或表达模式,即某一性别基因或表达模式相对于另一个性别存在高、低表达;2)与肝癌有关的基因或表达模式,即排除正常人中与性别有关,与肝癌无关的基因或表达模式。
  4.在肝癌、癌旁组织中进行基因差异表达分析,筛选出男性特异性高、低表达基因和女性特异性高、低表达基因,并对差异基因进行功能富集分析。
  5.利用生存分析,探究男性特异性基因富集通路与肝癌患者预后的关系。
  6.利用验证集数据对男性特异性差异表达基因、富集通路的表达水平、富集通路与肝癌预后的关系进行验证。
  7.采用Spike-and-Slab Lasso Cox模型,构建基于男性特异性差异表达基因的男性肿瘤风险预后模型。
  8.在肝癌和癌旁组织中进行miRNA差异表达分析,筛选出男性特异高、低表达miRNA,女性特异性高、低表达miRNA。利用TARGETSCAN和miRANDA数据库预测miRNA靶基因。并将靶基因与差异表达基因相结合,寻找miRNA和基因相互作用关系。
  9.利用加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)寻找男性中具有类似表达模式的模块(module)。对模块内基因进行富集分析,确定模块相关功能。构建共表达网络,筛选模块中处于核心地位的基因。
  10.对纳入样本的甲基化数据进行分析,筛选男性差异甲基化位点和甲基化区域。结合差异表达基因,探究甲基化在男性肝癌中的作用。
  11.根据AR和ER转录因子识别模体预测其可能参与调控的靶基因。利用DNase-seq数据探究AR和ER的可能调控靶基因的染色质可接近性。筛选具有可接近性的、可能被AR、ER调控的基因,探究AR、ER在男性肿瘤高发中可能发挥的作用。
  研究结果:
  1.在基因差异表达分析中共筛选出男性特异性高表达基因633个,男性特异性低表达基因852个;女性特异性高表达基因713个,女性特异性低表达基因339个。基因富集分析结果显示男性特异性高表达基因富集在核蛋白复合体形成、非编码RNA、核糖体形成、细胞热反应通路上。男性特异性低表达基因富集于免疫相关通路中。女性特异性高表达基因富集通路与细胞形态、跨膜转运有关。女性特异性低表达基因未富集在任何通路上。
  2.男性特异性基因表达模式与男性肝癌患者预后有关。男性特异性低表达基因富集通路整体表达水平低,患者预后差;男性特异性高表达基因富集通路整体表达水平高,患者预后差。
  3.Spike-and-Slab Lasso Cox模型中共纳入29个基因,其中男性特异性低表达基因9个,男性特异性高表达基因20个。该模型可以较好预测男性肝癌患者预后。
  4.通过miRNA差异表达分析,共筛选出34个男性特异性高表达miRNA,34个男性特异低表达miRNA。18个miRNA与男性特异性差异表达基因存在相互作用关系,其中14个为男性特异性高表达miRNA。根据miRNA靶基因预测,481个男性肝癌特异性差异表达基因被miRNA调节。其中322个为男性特异性低表达基因,这些基因富集于免疫相关通路。
  5.加权基因共表达网络分析发现12个模块,免疫相关模块与RNA相关模块、甲基化模块、类固醇激素代谢模块呈负相关关系。
  6.甲基化芯片分析共检测出174551个差异甲基化位点,33444个位点位于启动子区。启动子区甲基化位点数≥3的基因中包含大量miRNA、lincRNA。本研究共检测出1506个差异甲基化区域。甲基化区域包含了97个男性特异性低表达基因,其中一部分为免疫相关基因。
  7.男性差异表达基因中有157个可能受到AR调控,其中80个具有可按近性。男性差异表达基因中有72个可能受到ER调控,其中40个具有可接近性。AR和ER调控的靶基因与RNA的形成与修饰有关。
  研究结论:
  1、免疫抑制是男性肝癌基因特异性表达模式。
  2、男性特异性表达基因富集通路与患者预后相关,男性特异性差异基因可以用于男性肝癌预后模型构建。
  3、miRNA可能通过降低免疫相关基因的表达,引起男性肝癌免疫抑制。
  4、甲基化可以通过参与RNA形成和修饰过程间接调节免疫功能,也可以通过DNA甲基化直接调节免疫功能。
  5、AR和ER作为转录因子可能通过参与RNA形成与修饰过程,进而调节男性特异性肝癌基因的表达。
[硕士论文] 余嘉惠
中医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:课题组前期发现lncRNA-ncRuPAR在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,且与胃癌的浸润程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤的大小及TNM分期密切相关,临床有效方药“滋阴化痰方”可抑制胃癌细胞增殖。本课题旨在通过一系列体内外实验探究ncRuPAR与胃癌增殖、侵袭、转移、凋亡的关系及其可能的作用机制,并验证“滋阴化痰方”是否通过干预ncRuPAR发挥其对胃癌的治疗作用,以期深化对胃癌发病分子机制的认识,并为阐释滋阴化痰方可能的作用机制提供数据支持。
  研究方法:(1)通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qPCR)技术检测AGS,HGC27,MKN45,MGC8034株胃癌细胞中ncRuPAR的表达水平。(2)重组慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分别感染HGC27细胞,构建HGC27过表达细胞株HGC27-ncRuPAR及对照细胞株HGC27-Empty Vector;重组慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分别感染MGC803细胞构建MGC803干扰细胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及对照细胞株MGC803-Empty Vector,嘌呤霉素2μg/mL筛选72h后形成慢病毒感染表达稳定株,qPCR检测各稳株中ncRuPAR的表达量。(3)CCK-8法检测ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803增殖的影响;流式细胞计数仪分析ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;细胞划痕实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803迁移能力的影响;Transwell实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803侵袭能力的影响。(4)将HGC27-ncRuPAR,HGC27-Empty Vector及HGC27-Control细胞株分别在裸鼠皮下接种造HGC27皮下移植瘤模型,观察各组裸鼠一般情况及比较瘤体体积和质量,比较ncRuPAR对HGC27皮下移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。(5)Affymetrix基因表达谱芯片技术筛选HGC27-ncRuPAR细胞株和HGC27-Empty Vector细胞株之间差异表达基因,并将芯片分析的差异基因结果进行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis,IPA)分析,推测ncRuPAR影响胃癌细胞增殖凋亡的可能通路;Western blot实验检测ncRuPAR对HGC27和MGC803细胞中PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响。(6)中药“滋阴化痰方”干预HGC27和MGC803细胞株,CCK-8法检测细胞增殖变化,观察滋阴化痰方对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞计数仪分析滋阴化痰方对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;qPCR检测滋阴化痰方对胃癌细胞ncRuPAR表达的影响,观察滋阴化痰方是否对ncRuPAR的表达存在调控作用;Western blot验证滋阴化痰方对PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响,探究滋阴化痰方可能的作用机制。
  研究结果:(1)qPCR结果显示:ncRuPAR在HGC27细胞中低表达,在MGC803细胞中高表达。(2)选择HGC27细胞构建ncRuPAR过表达稳定株,选用MGC803细胞构建ncRuPAR干扰稳定株,qPCR验证ncRuPAR过表达及干扰稳株构建成功。(3)CCK-8和流式细胞周期结果显示:过表达ncRuPAR可抑制HGC27细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并促进其凋亡,而干扰ncRuPAR表达则抑制MGC803细胞增殖、减少细胞凋亡。划痕实验和transwells实验结果显示:ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803的迁移及侵袭能力影响不显著。(4)体内实验中,HGC27-ncRuPAR组与对照组相比,实验组裸鼠成瘤减慢,瘤体减小。(5)Western blot结果显示:过表达ncRuPAR使HGC27细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达下降;而干扰ncRuPAR则可使MGC803细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达升高。(6)中药“滋阴化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803细胞,CCK-8和流式细胞周期结果显示:中药“滋阴化痰方”可以抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡;qPCR结果显示滋阴化痰方可以增加胃癌细胞中ncRuPAR的表达;Western blot结果显示滋阴化痰方可以抑制PI3K、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。
  研究结论:ncRuPAR可通过下调PAR-1的表达和抑制PI3K/Akt通路发挥其抑制胃癌细胞增殖及促凋亡作用。上调ncRuPAR的表达和抑制PI3K/Akt通路是中药“滋阴化痰方”抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的可能分子机制之一。
[硕士论文] 宫春爱
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一。在美国女性癌症中是除了皮肤癌之外的最普遍的癌症,占接近三分之一。美国癌症协会2018年最新数据表明,乳腺癌在预计新发人数上位居第一,预计死亡人数上排名第二(仅次于肺及支气管癌)。目前,乳腺癌治疗存在很多难点,特别是一些患者在接受治疗时发生耐药及术后放化疗后肿瘤复发、转移。近些年来,有研究表明,自噬在乳腺癌的发生发展以及治疗过程中发挥着重要的作用。如何改善乳腺癌的治疗效果已成为研究热点。自噬是一种广泛存在于真核生物的细胞中高度保守的一种依赖溶酶体的降解途径,是通过清除自身衰老、受损的细胞器,或通过降解蛋白质、脂类等生物大分子供细胞再次利用,以维持细胞内环境稳态。自噬常作为一种细胞在特殊情况下的保护自我的一种机制,例如在机体出现损伤、缺氧、应激等病理生理情况后一种调控细胞代谢活动的过程,可被认为是与化疗失败的重要耐药机制之一。本课题选用广谱抗癌药多西他赛(DTX)和自噬抑制ATG7siRNA(siATG7),通过硫辛酸修饰的固有无序多肽形成的多肽胶束加以介导,并载入化疗药多西他赛,从体内和体外对其抗乳腺癌的作用机制进行研究。
  本课题分为三个部分,第一部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束的构建及表征进行了报道。通过固相合成法合成了含有硫辛酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸的硫辛酸修饰的固有无序多肽的单体,然后进一步通过制备型高效液相色谱对产物进行纯化,且纯度检测结果显示符合实验要求。利用硫辛酸五元环内二硫键在一定比例的半胱氨酸催化下可实现分子间交联,进一步形成多个多肽单体聚合的载体。通过核磁共振氢谱对其结构进行了检测,结果显示了多肽单体聚合成功。然后采用超声乳化的方法制备胶束及载药,利用多肽胶束结构中分别含有疏水性的空腔以及富含带正电的阳离子型氨基酸,分别包载疏水性化疗药物多西他赛和包裹压缩带负电荷的siATG7基因药物。表征结果表明超声乳化法所制备的多肽胶束的平均粒径为165nm左右,电位值在31mV左右,且载药量在8.81%左右。
  本课题的第二部分进一步报道了共载化疗药多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌的体外评价。首先我们选用了以下五种不同种类乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-468,BT474,SKBR-3),对其进行抗增殖、促凋亡,以及周期阻滞实验研究,结果表明不同种类乳腺癌细胞对于自噬水平的依赖性不同,抑制自噬所引起的疗效也不相同。我们选择其中MCF-7细胞进一步研究通过siATG7对自噬的调控研究其抗乳腺癌的作用机制进行研究。用尼罗红代替多西他赛,荧光素FAM标记siATG7,对其摄取进行考察,结果显示尼罗红和siATG7可以在多肽胶束的介导下进入细胞。体外细胞实验表明,硫辛酸多肽胶束可以有效介导siATG7在MCF-7细胞内发挥作用并抑制了化疗药多西他赛引起的自噬,通过自噬抑制而实现增强化疗药的疗效的作用。多西他赛和siATG7可协同抗乳腺癌细胞增殖及周期阻滞并促进乳腺癌细胞凋亡。自噬抑制作用的考察上,我们通过构建稳定表达mRFP-EGFP-LC3的MCF-7细胞,然后对不同给药组的自噬流进行了考察,同时,通过Western Blot和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)对自噬相关的蛋白及ATG7mRNA的表达水平进行了考察,并通过电镜考察不同给药组产生的自噬泡的情况。结果显示共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束可以有效的抑制乳腺癌细胞MCF-7的自噬水平。
  本课题的第三部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌体内作用机制进行了报道。实验成功构建了MCF-7乳癌裸鼠移植瘤模型,通过siRNA用Cy5荧光标记后通过多肽胶束进行体内递送研究,活体成像结果显示胶束具有较好的体内靶向性。肿瘤生长抑制实验和肿瘤组织的HE染色切片观察显示,多西他赛和siATG7在硫辛酸多肽胶束介导下,可以起到协同抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长。最后进一步通过HE对其安全性进行了考察,结果表明该多肽胶束具有较低的系统性毒性。免疫组化实验也表明,多西他赛和siATG7硫辛酸多肽胶束可以有效抑制自噬水平。
  通过对本课题进行研究,以硫辛酸进行修饰的固有无序多肽胶束作为载体,共载疏水性化疗药物和siRNA基因药物。通过抑制化疗药引起的自噬实现增敏为临床治疗乳腺癌以及其他癌症的综合治疗提供了参考依据和借鉴。
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1、天猫--万方数据教育专营店

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