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[博士论文] 钱晔
耳鼻咽喉科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)是起源于上消化呼吸道粘膜上皮的恶性肿瘤,其发病率约占头颈部恶性肿瘤1.4~5%,占全身恶性肿瘤的0.5%。下咽鳞癌发生于下咽部的梨状窝区,环后区及下咽后壁区,其中发生于梨状窝区最常见,发生率约为70~80%,下咽后壁区约为5~22%。在全部下咽肿瘤的病理类型中,鳞状细胞癌约占90%,其次为腺癌,腺鳞癌,肉瘤等。下咽鳞癌患者的早期临床表现并不显著,仅表现为咽部不适或咽部异物感。随着肿瘤的浸润性生长,肿瘤发生破溃,患者可出现咽部疼痛。若肿瘤侵及喉部或声门旁间隙,患者可出现声音嘶哑、呼吸困难,而食道受累则会出现吞咽困难。下咽鳞癌患者淋巴结转移率非常高,部分患者以颈部淋巴结肿大为首发症状,咽部症状可不明显。早期下咽鳞癌(StageⅠ-Ⅱ)的5年生存率可高达70%,但由于其症状的不典型性及发病部位的隐匿性,极少的患者能在早期被发现。约70-85%的患者就诊时,肿瘤已发展为中晚期(StageⅢ-Ⅳ),患者5年生存率仅为15-45%。下咽鳞癌的治疗包括以手术为主辅助以术前或术后放化疗或以放疗为主的综合性治疗方案。虽然近年来下咽鳞癌的治疗方法不断进步,下咽鳞癌患者的预后仍远远不能令人满意。因此,进一步探索、发现下咽鳞癌高敏感性和特异性的肿瘤标记物,并寻找新的治疗靶点已成为一项十分迫切的任务。
  经典的分子生物学理论指出遗传信息通过基因编码的形式进行传递,RNA仅在DNA序列和编码蛋白质之间起媒介物的作用。随着分子生物学理论和人类基因组计划的发展,人们认识到,在人类基因组中仅有1.5%的基因为蛋白质编码基因,而90%以上的基因转录为不具有蛋白质编码功能的非编码RNA(noncoding RNAs)。长链非编码RNA是长度大于200个核苷酸,缺少有意义的开放阅读框而不具有蛋白质编码功能的RNA,约占全部非编码RNA的80%。
  通过调控基因表达等途径,LncRNA广泛参与了细胞生命活动的众多过程,如细胞的增值,分化以及染色体的失活等。迄今为止,多个LncRNA已被证实能够在转录、转录后水平以及通过表观遗传学机制,调控基因的表达,这其中包括:染色体的修饰,维持mRNA稳定性及阻碍miRNA对mRNA的降解等。在肿瘤研究领域,LncRNA也显示了重要的调节功能。研究发现,LncRNA可以调控肿瘤细胞的凋亡、增殖、细胞周期以及转移等生物学行为。并且,研究者在越来越多的肿瘤中发现了LncRNA的重要调节功能,其中包括:乳腺癌,肺癌,胰腺癌,骨肉瘤,肝细胞肝癌,白血病等。LncRNA在一系列的恶性肿瘤中异常表达,问接说明了其同时具有促进肿瘤形成和肿瘤抑制双重角色。
  目前,大多数癌症的生物标记物都是蛋白质编码基因,蛋白质编码基凶的转录产物或蛋白质本身。而近年来,非编码RNA却成为了该领域的一大热点,多种LncRNA被证实可以作为全新的肿痛标志物以及潜在的治疗靶点。尿路上皮癌胚抗原1(Urothelial carcinoma-associated1,UCA1)就是一种具有显著特征的LncRNA。LncRNA-UCA1最初被发现在膀胱移行细胞癌中高表达,属于人内源性逆转录病毒H家族,cDNA全长1439bp。进一步的研究发现LncRNA-UCA1有明显的促进膀胱癌形成并增强其侵袭能力的作用。此外,LncRNA-UCA1在其他恶性肿瘤中也呈现出差异性表达,表现为与癌旁组织相比,在癌组织中不同程度的高表达,并促进肿瘤的形成。更多的研究表明,LncRNA-UCA1在多个肿瘤同样起到了癌基因的作用。比如,Zuo等发现TGF-β1可诱导LncRNA-UCA1表达上调促进胃癌的侵袭和转移。Zhou等发现LncRNA-UCA1在前列腺癌组织中表达上调且与患者的预后不良相关。Zhao等发现LncRNA-UCA1能够促进神经胶质瘤细胞的增殖并能够通过其表达水平对患者的预后进行预测。Xiao等发现LncRNA-UCA1能够通过miR-203调控Snai12基因的表达,进而促进肝细胞肝癌的进展。根据这些研究,我们提出疑问LncRNA-UCA1是否可以用来作为下咽鳞状细胞癌的诊断指标、或评价其预后呢?另外,LncRNA-UCA1会通过哪些途径来影响下咽鳞状细胞癌的生物学行为呢?
  为此,我们首先对下咽鳞癌及癌旁组织进行了高通量LncRNA芯片筛查。实验结果显示,众多LncRNA在下咽鳞癌组织中相对癌旁组织显著高表达,其中也包括LncRNA-UCA1。根据此结果,我们推测LncRNA-UCA1在下咽鳞癌中也可能作为癌基因对肿瘤的发生发展起促进作用。
  本课题进行了以下2个部分的研究,(1)采用qRT-PCR的方法检测53例下咽鳞癌及对应癌旁组织标本中LncRNA-UCA1的相对表达量,分析其与下咽鳞癌患者临床病理特征的相关性,并且评价LncRNA-UCA1的表达量与下咽鳞癌患者预后的关系(2)构建干扰LncRNA-UCA1表达的慢病毒载体,并通过细胞凋亡实验,细胞周期检测实验,细胞克隆形成实验,细胞transwell实验等进一步研究LncRNA-UCA1对下咽鳞癌细胞生物学行为的影响。
  第一部分 LncRNA-UCA1在下咽鳞癌中的表达及临床意义
  研究目的:
  检测下咽鳞癌患者肿瘤组织及癌旁组织中LncRNA-UCA1的相对表达量,并进一步分析LncRNA-UCA1的表达与下咽鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。
  研究方法:
  收集山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉科2011年3月至2011年12月行下咽鳞癌切除患者的肿瘤组织及相对应的癌旁组织共53对,采用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)的方法,检测LncRNA-UCA1在下咽鳞癌及癌旁组织中的相对表达量,并统计患者的临床病理特征及预后。LncRNA-UCA1的表达量与临床病理特征的关系用Chi-square或Fisher精确检验评估。T检验用于比较两个实验组数据之间的差异。Kaplan-Meier法用于绘制LncRNA-UCA1高表达或低表达患者的生存曲线。Log-rank法用于比较患者的总体生存率。
  研究结果:
  LncRNA-UCA1在下咽鳞癌组织中的相对表达量为(0.0088±0.0050),明显高于LncRNA-UCA1在癌旁组织中的表达量(0.0051±0.0040,P<0.05)。高表达的LncRNA-UCA1与更差的T分级(P=0.034),更晚的临床分期(P=0.021)及阳性淋巴结转移(P=0.02)均显著相关。而LncRNA-UCA1的表达与其他临床病理特征未发现有显著的相关性,如忠者的年龄(P=0.213),肿瘤的分化程度(P=0.613)。另外,我们还发现,以LncRNA-UCA1相对表达量的巾位数为界,将患者分为LncRNA-UCA1高表达组和低表达组。LncRNA-UCA1高表达组的总体生存率要明显低于低表达组(P<0.0001)。
  研究结论:
  LncRNA-UCA1在下咽鳞癌中呈高表达状态且LncRNA-UCA1的表达水平与下咽鳞癌的T分级、临床分期、淋巴结转移,以及患者总体生存率均明显相关。而与患者的年龄,肿瘤的分化程度无明显相关性。由此说明,LncRNA-UCA1可能促进了下咽鳞癌的发生发展并且可以做一个评价下咽鳞癌患者预后的生物学指标。
  第二部分 LncRNA-UCA1对下咽鳞癌细胞功能的影响
  研究目的:
  研究LncRNA-UCA1对下咽鳞癌绌胞凋亡,增殖,侵袭及迁徙等细胞功能的影响
  研究方法:
  构建LncRNA-UCA1低表达慢病毒载体,并将病毒感染人咽鳞癌细胞株FaDu细胞,qRT-PCR法检测LncRNA-UCA1在FaDu细胞中的表达并评估干扰效率。细胞凋亡实验,细胞克隆形成实验及细胞周期实验检测LncRNA-UCA1
  对FaDu细胞增殖能力的影响,transwell实验检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞侵袭及迁移能力的影响。
  研究结果:
  qRT-PCR法检测结果显示干扰UCA1转染FaDu (Sh1 and Sh2)组细胞的LncRNA-UCA1的表达水平明显低于Control组细胞(P<0.05)。流式细胞仪检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞凋亡的影响。结果示,转染5天后,低表达LncRNA-UCA1 FaDu细胞的凋亡比例较对照组明显增高(P<0.05)。流式细胞仪检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞周期的影响,结果示,相比于对照组,降低LncRNA-UCA1的表达能够明显的诱导FaDu细胞聚集于G0/G1期,减少S期的细胞聚集(P<0.05)。细胞克隆实验检测LncRNA-UCA1对FaDu细胞的增殖能力的影响。结果显示:低表达LncRNA-UCA1的相对对照组,减少了FaDu细胞的克隆数(P<0.05)。transwell实验检验LncRNA-UCA1对细胞侵袭和迁移能力的影响。结果示,相比于对照组,降低LncRNA-UCA1的表达能够明显减低侵袭和迁移能力(P< 0.05)。
  研究结论:
  LncRNA-UCA1能够促进下咽鳞癌细胞增殖,抑制其凋亡,并提高下咽鳞癌细胞的侵袭和迁移的能力。
[博士论文] 孙睿杰
耳鼻喉头颈外科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squmous cell carcinoma,HSCC),是头颈部常见的恶性肿瘤,发病率约占头颈鳞状细胞癌的5%。早期可表现为咽异物感、吞咽阻挡感等,随着肿瘤逐渐长大,其表面可发生破溃,进而引起吞咽疼痛、同侧反射性耳痛,常伴进行性吞咽困难,累及喉腔时可引起声音嘶哑、呼吸困难等。下咽鳞状细胞癌大多分化程度差,易黏膜下浸润扩散,早期临床症状不明显,不易早期发现,所以,在临床就诊时多已累及舌根、喉腔和颈段食管等邻近部位,并出现颈部淋巴结转移或远处转移。近年来随着头颈外科诊疗技术的不断发展,多种不同方法例如手术治疗、放射治疗、化疗药物治疗以及三种疗法相结合综合抗癌治疗的应用,患者生存率有所改善,但期患者年生存率仍仅为25%-40%。此外,下咽癌手术当中所需切除的范围较大,术后患者常常会出现吞咽功能异常、发声功能丧失等状况,这严重影响了患者术后的生活质量,而正常生理功能的缺失也对患者心理状态造成不良影响。为了改善患者的生存状态,提高患者5年存活率,对于下咽癌的有效药物治疗方案成为目前亟须解决的课题。
  二甲双胍(metformin)是一种双胍类口服降糖用药,是治疗内分泌代谢异常所造成的二型糖尿病的一线用药。近年来,人们发现在二型糖尿病患者中,二甲双胍的使用能够明显减少多种肿瘤的发病率。因此,针对二甲双胍与恶性肿瘤发生关系吸引了广泛地研究兴趣,并开展了进行了大量研究调查。目前,体外实验亦证明二甲双胍具有抑制多种恶性肿瘤细胞(包括肝癌、前列腺癌、宫颈癌和卵巢癌等)生长增殖的作用,但尚未发现其对咽喉癌的作用报道。
  microRNA是真核生物中的一类非编码小分子RNA,人们在肿瘤细胞中发现了数类microRNA的表达量异常,其对细胞的形成、增殖等存在多种影响。随着microRNA的研究逐渐火热,在针对microRNA与肿瘤关系的研究过程中,人们在多种肿瘤细胞中发现了miR-21-5p这一microRNA的表达量异常,其下游靶基因程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4,PDCD4)的mRNA和相应蛋白表达水平也随之变化。PDCD4被认为是一种肿瘤抑制因子,其水平上升预示着肿瘤增殖受抑制。下咽癌细胞也是存在miR-21-5p显著上调的肿瘤细胞之一。
  目的:
  证明二甲双胍对人下咽癌细胞FaDu细胞系增殖的抑制作用,研究其对miR-21-5p和PDCD4基因表达水平的影响,初步阐明二甲双胍抑制FaDu细胞系增殖的可能机制:二甲双胍通过下调miR-21-5p表达水平及上调PDCD4蛋白表达水平而实现对FaDu细胞增殖的抑制作用。
  方法:
  1.细胞培养:于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC(@),Manassas,VA,USA)购买获得人下咽癌细胞FaDu细胞系,使用添加了10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DM EM),于37℃、5%二氧化碳浓度的培养箱中培养。
  2.细胞处理:细胞以2×104/ml/孔的密度接种至96孔板,37℃、5%CO2的培养箱中培养36小时,用磷酸缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)冲洗2次后每组用10μl应浓度二甲双胍进行处理。FaDu细胞被分为对0mmol/L对照组、25mmol/L二甲双胍处理组、50mmol/L二甲双胍处理组、75mmol/L甲双胍处理组、100mmol/L甲双胍处理组、125mmol/L二甲双胍处理组。各组分别在12小时、24小时和36小时取样进行细胞增殖检测。
  3.细胞增殖检测:利用CCK-8试剂盒(Dojindo,Kunamoto,Japan)检测细胞增殖情况。向96孔板的每个孔中加入10βl的CCK-8溶液。再次将96孔板放到上述条件培养箱孵育一段时间(1h-4h)。最后用酶标仪测定3次在光波450nm处的每孔的吸光度(optical density,OD),取平均值。以此计算生长抑制率,公式如下:(实验组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白OD值)×100%。
  4.核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)提取和实时定量逆转录聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,Real time qRT-PCR):用于检测miR-21-5p和程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4,PDCD4)mRNA的表达。将总RNA严格按照Trizol试剂盒((Invitrogen,Grand Island,NY,USA)的说明书从细胞当中提取。使用Poly(A)加尾方法反转录cDNA。miR-21-5p的反转录过程是使用U6RNA作为内参,使用复能基因公司生产的microRNA反转录PCR检测试剂盒(FulenGen Corporation,Guangzhou,China)进行逆转录。循环条件:95℃10min→(95℃10s,60℃20s,72℃10s)×40循环→4℃。PDCD4mRNA的反转录使用的是Roche公司出产的SYBR(@)GreenⅠ实时定量PCR试剂盒(Roche Corporation,Basel,Switzerland),使用β-actin作为内参。循环条件:95℃20s→(95℃3s,55℃30s)×40循环→4℃。所有PCR反应都进行了三次重复。PCR目的片段的表达水平通过与对照组对比用2-△△Ct法进行测定。
  5.蛋白质印迹法:用于检测PDCD4蛋白表达量水平。细胞经不同浓度二甲双胍(0mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、100mmol/L)处理24小时后,用PBS清洗2次,使用RIPA(Beyotime,Jiangsu,China)冰上裂解30min。将裂解后的液体以12000×g转速在4℃条件下离心5min。取上清液用BCA检测盒(Beyotime)测定蛋白浓度。总蛋白(40μg)使用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到聚偏氟乙烯膜,使用5%的脱脂牛奶常温封闭2小时。用小鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1000稀释,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)或兔多克隆抗人PDCD4抗体(1∶2000稀释,Abcam Corporation,Cambridge,UK)4℃孵育过夜,使用吐温20%Tris盐缓冲液冲洗3次,然后用辣根过氧化物酶山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1∶5000稀释,Santa Cruz Biotechnology)室温孵呼育1小时。免疫反应蛋白条带采用增强化学发光分析(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒(Beyotime)根据使用说明严格操作进行检测。并使用Image J((Image Processing and Analysis in Java)软件分析定量。所有检测都进行了二次重复。
  6.数据统计分析:使用单项方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)检测组间差异。使用q检验(Student-Newman-Keuls test,SNK法)进行配对检验。数据分析通过SPSS17.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)Windows版进行分析。P值<0.05时认为有统计学意义。
  结果:
  1.二甲双胍显著抑制FaDu细胞增殖,其抑制效应与剂量(P<0.05)及时间(P<0.05)相关。在25mmol/L-100mmol/L浓度范围内,二甲双胍浓度越高,抑制效应越明显。在以上浓度范围内,浓度不变时,12h-36h时间范围内,培养时间越长,细胞增殖抑制越明显。对于浓度100mmol/L和125mmol/L的二甲双胍处理后,所有时间点的细胞增殖状态都没有区别,抑制达到平台期。说明二甲双胍对FaDu细胞的抑制作用是存在剂量依赖的,但当二甲双胍浓度高于100mmol/L时达到饱和状态。
  2.以25mmol/L-100mmol/L浓度范围内的二甲双胍处理FaDu细胞24h,能够显著抑制miR-21-5p表达水平(P<0.05),而同时PDCD4mRNA和蛋白表达水平均呈现明显上升(P<0.05),说明二甲双胍很可能通过miR-21-5p调控PDCD4的表达,进而影响FaDu细胞的增殖情况。
  结论:
  1.二甲双胍能够显著抑制FaDu细胞的增殖,在25mmol/L-100mmol/L浓度范围内呈明显的剂量依赖效应。
  2.二甲双胍对细胞增殖的抑制作用可能通过下调miR-21-5p表达水平及上调PDCD4蛋白表达水平而实现。(二甲双胍↓miR-21-5p↓↓PDCD4↓FaDu细胞增殖水平↓)。
[硕士论文] 陈珂
耳鼻喉科 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  下咽癌(Hypopharyngeal carcinoma)是头颈恶性肿瘤中预后最差的一种,其具有的恶性肿瘤的生物学行为及特征:侵犯性、扩散性及转移性均很高,早期即容易出现粘膜下播散和淋巴转移。目前国内外较为确切的有效的治疗方法是以根治性手术为主,辅以局部放射和全身应用化学药物的综合疗法。综合治疗下咽癌的方法及技术在不断改进,但下咽癌患者总体的5年生存率并没有得到明显改善.近年来,药物在头颈肿瘤肿瘤的治疗中的作用逐渐受到重视,目前认为对于晚期以及复发、或转移的下咽癌患者化疗和或靶向药物治疗是主要手段。化学药物能降低头颈鳞癌远处转移率,减少肿瘤的复发、转移、提高患者生存率。研究下咽鳞状细胞癌在化学药物作用下的分子机制,希望产生新的治疗下咽癌的有效方法。
  在化学药物的作用下肿瘤会出现死亡,一方面是药物对肿瘤细胞的细胞毒作用,使肿瘤细胞的被动死亡即坏死,另一方面更在于其诱导肿瘤细胞凋亡.恶性肿瘤的基本特征之一是:凋亡受阻,并对凋亡诱导因子的敏感性降低,使机体不能清除肿瘤细胞。近年来,越来越多的研究表明:化疗药物对细胞产生诱导凋亡是其主要作用机制。化疗药物可以诱导肿瘤细胞发生凋亡而达到抑制肿瘤的作用。目前发现内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)能够介导细胞凋亡,这是一种新的细胞凋亡途径,关于内质网应激在细胞凋亡中的重要作用,越来越得到广泛的重视。内质网是真核细胞中最普遍和重要细胞器,是蛋白质与脂质、糖类的合成场所,蛋白质在内质网中合成、折叠、组装、运输。当细胞内源或外源的因素会导致内质网生理功能发生紊乱,未折叠蛋白和错误蛋白积累过量,激活一系列信号通路,引起内质网应激(ERS)。内质网应激时细胞存活和凋亡程序同时激活,如果内质网应激持续进行就会启动细胞凋亡程序。内质网应激决定了细胞的生存还是死亡。在肿瘤细胞中,内质网应激一方面直接诱导细胞死亡另一方面也使肿瘤细胞产生耐药性。
  阿霉素(Doxorubicin)是一种广泛应用于临床的有效抗肿瘤药物。它通过插入DNA碱基对使DNA降解,影响DNA转录而实现肿瘤的治疗作用。阿霉素是对肿瘤细胞的周期性非特异性药物,对各种生长阶段肿瘤细胞的都有杀死作用。其抗肿瘤谱超过任何其他类型的化疗药物。但阿霉素因其本身的细胞毒性的副作用,同时也限制了它的临床应用。其抗肿瘤谱超过任何其他类型的化疗药物。但阿霉素因其本身的细胞毒性的副作用,同时也限制了它的临床应用。
  大量文献报道阿霉素可诱导多种肿瘤细胞凋亡,但对人下咽鳞状细胞癌的凋亡作用还未见报道,其诱导凋亡的详细作用机制尚未明了。阿霉素是否可以通过介导内质网应激引发FaDu的细胞凋亡?因此建立阿霉素诱导下咽癌细胞系细胞(FaDu)凋亡的实验体系模型,在这个实验平台中研究下咽癌细胞系(FaDu)在内质网应激凋亡过程中的分子机制,探讨内质网应激在药物作用下对肿瘤细胞凋亡的影响,希望从肿瘤发生凋亡的分子生物学的基础上寻找内质网应激介导细胞死亡的药物作用靶点,以期将来在化疗药物研制上,能设计和开发针对ERS信号通路的有效药物来遏制下咽癌,这是本实验所具有的积极意义。
  方法:
  以人下咽鳞状细胞癌细胞系(FaDu)为实验材料,
  1.FaDu细胞培养。然后用SRB比色法,在阿霉素浓度和处理时间不同的情况下,检测FaDu细胞的存活率。
  2.应用梯度为0μM,0.5μM,1μM,2μM的阿霉素作用于FaDu细胞,Westernblot检测FaDu细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。
  3.在有效药物浓度1μM阿霉素作用不同时间后,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。
  4.0.5μM的阿霉素(DOX)和0.5μM的毒胡萝卜素(TG)联合用药,SRB法检测细胞存活率;Western blot检测FaDu细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。
  5.0.5μM的阿霉素(DOX)和1mM4-PBA(4-苯基丁酸)联合用药,SRB法检测细胞存活率;Western blot检测FaDu细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的表达水平变化。
  结果:
  1.结果显示,阿霉素(Doxorubicin)可以显著降低FaDu细胞相对存活率,其效应具有显著的时间和剂量依赖性。
  2.应用doxorubicin的时间梯度和浓度梯度,随着浓度增加和处理时间的增加,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割增强,TNFRSF10B表达水平上升,CFLARL表达下降;内质网应激相关蛋白EIF2AK3,ATF4,DDIT3表达水平下降,ERN1,XBP1s表达水平上升。
  3.敲低EIF2AK3,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割增强,TNFRSF10B表达水平上升,CFLARL表达下降。
  4.Doxorubicin联合TG,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割减弱,内质网应激相关蛋白ERN1,XBP1s表达水平明显上升。
  5.Doxorubicin联合4-PBA,Western blot检测结果显示凋亡相关蛋白CASP8,CASP3,PARP-1切割增强,内质网应激相关蛋白EIF2AK3,ATF4,DDIT3表达水平下降明显。
  结论:
  1.Doxorubicin能显著抑制FaDu细胞增殖、引起FaDu细胞凋亡。
  2.Doxorubicin能使内质网应激蛋白ERN1,XBP1s表达升高。
  3.Doxorubicin能使内质网应激蛋白EIF2AK3,ATF4,DDIT3表达下降。
  4.本实验证明Doxorubicin参与内质网应激并诱导FaDu细胞的凋亡,但还需要进一步研究肿瘤细胞在内质网应激下的凋亡途径,探索肿瘤发生、进展、转移和耐药的分子机制,为诱导肿瘤的凋亡和逆转肿瘤耐药提供新的方向。
[博士论文] 黄大兵
内科学(老年医学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  放疗是治疗鼻咽癌(NPC)的重要手段,放疗耐受极大的限制了鼻咽癌临床疗效和病人预后,因此,深入研究鼻咽癌放疗耐受机制及寻找一种可能的放疗耐受诊断分子标志物极为迫切。鼻咽癌的发生发展是一个极其复杂的过程,在此过程中蛋白编码基因无疑起到至关重要的作用,而microRNA在鼻咽癌的发病机制中同样发挥重要作用。在高等哺乳动物细胞的基因组中,仅有约2%的序列为蛋白编码基因,绝大多数转录是源于基因组的非蛋白编码区域(noncoding RNA)。其中一类长约21到23个核苷酸组成,称为微小RNA(microRNA,miR),miR以序列特异性方式与其下游基因RNA中的靶序列结合,在转录后水平(RNA的稳定性和翻译)抑制靶基因的表达,继而对高等生物个体发育过程中所有的生物学事件:细胞增殖、信号转导、细胞分化、DNA损伤修复、细胞黏附和运动、炎性反应、细胞衰老和死亡等施加影响。在多达2588个人的miRNA中,已知有超过100个miRNA在包括肿瘤在内的重大疾病中表达异常,参与疾病发生发展和病理学行为。miRNA的表达异常可显著地改变细胞生长、分化、凋亡以及肿瘤转移等生理及病理过程,推动肿瘤发生发展进程,也在众多肿瘤研究中被证实与肿瘤放疗耐受相关。
  研究目的:
  针对探索鼻咽癌放疗耐受机制这一核心课题,通过多种实验手段阐明:在鼻咽癌放疗耐受和放疗敏感细胞株中寻找表达具有显著差异的基因;在细胞和动物实验水平中阐明相关基因在鼻咽癌细胞放疗耐受形成中的分子机制;应用双荧光报告系统寻找miR-20a-5p、Rab27B基因可能参与的信号通路。为临床遇到的鼻咽癌放疗耐受难题提供新的思路。
  研究方法:
  1)结合软件分析,应用组学测序、real-time RCR和western等手段,发现、筛选与鼻咽癌放疗耐受密切相关基因包括miR-20a-5p,利用预测网站miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)、Targetscan(http://www.targetscan.org/)等预测miR-20a-5p的下游基因,real-time RCR和western实验初步确定Rab27B是miR-20a-5p的下游调控基因,而mimic和antagomir的转染实验,以及3'UTR实验确认了Rab27B是miR-20a-5p基因的下游调控基因。
  2)应用miR-20a-5p的mimic转染CNE-2细胞株模拟miR-20a-5p表达水平上调,使用real-time PCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并应用western检测Rab27B的表达变化;应用miR-20a-5p antagomiR转染CNE-1细胞株模拟其水平下调,使用real-time PCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并应用western检测Rab27B的表达变化。
  3)应用流式细胞技术检测CNE-2细胞内提高miR-20a-5p或降低Rab27B量对鼻咽癌细胞CNE-2细胞周期和细胞凋亡的影响。进而在体外裸鼠实验中应用western检测裸鼠瘤体中Rab27B表达差异。应用双荧光报告系统寻找miR-20a-5p、Rab27B可能参与的信号通路。
  研究结果:
  1)通过组学测序结果发现miR-20a-5p基因在鼻咽癌放疗耐受敏感细胞株中的表达具有明显差异,通过多个网站预测到miR-20a-5p可能调控的基因,western和real-time PCR检测,发现Rab27B基因的表达与miR-20a-5p具有显著的负相关性,Rab27B基因是miR-20a-5p的下游调控基因。
  2)应用miR-20a-5p的mimic转染CNE-2细胞株(放疗敏感株,内源性表达较低)模拟miR-20a-5p表达水平上调,使用real-time PCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并利用western检测Rab27B的表达变化。同时应用miR-20a-5p antagomiR转染CNE-1细胞株(放疗耐受株,内源性表达较高)模拟其水平下调,使用real-time PCR检测miR-20a-5p和Rab27B表达量变化,并利用western检测Rab27B的表达变化。结果进一步表明Rab27B是miR-20a-5p下游调控基因。3'UTR实验证实Rab27B是miR-20a-5p的下游调控基因。
  3)在CNE-2细胞中增加miR-20a-5p的表达量后CNE-2细胞对放疗耐受性显著增加,表明miR-20a-5p可能与鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性有关;而在CNE-2细胞中降低Rab27B的表达量,通过在CNE-2细胞内转染干扰Rab27B增加了CNE-2细胞的放疗耐受性,表明miR-20a-5p与Rab27B一起参与调控鼻咽癌细胞的放疗敏感性,为miR-20a-5p通过调节Rab27B表达参与调控鼻咽癌细胞放疗耐受敏感性的推测提供实验依据;在另一株放疗耐受性细胞CNE-1中进行类似机制验证,表明miR-20a-5p与鼻咽癌细胞的放疗耐受性密切相关;在CNE-1细胞中提高Rab27B的表达量,通过在CNE-1细胞内转染过表达Rab27B,与降低miR-20a-5p的表达量后CNE-1细胞对放疗耐受性检测结果一致,均降低了CNE-1细胞的放疗耐受性,这表明miR-20a-5p通过调节Rab27B表达量参与调控鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性。
  4)增加miR-20a-5p的表达量后CNE-2细胞的迁移能力显著增加,干扰Rab27B的CNE-2细胞显著促进了CNE-2细胞的迁移能力,表明miR-20a-5p通过Rab27B参与调控鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性可能与它们促进细胞迁移能力密切有关;同时,在CNE-1细胞中过表达Rab27B,与降低miR-20a-5p的表达量后CNE-1细胞结果一致,均显著抑制了CNE-1细胞的侵袭能力,表明miR-20a-5p通过调节Rab27B表达参与调控鼻咽癌细胞的放疗耐受敏感性可能与它们促进细胞侵袭能力密切有关。
  5)鼻咽癌放疗敏感细胞株CNE-2细胞内提高miR-20a-5p或降低Rab27B表达量后细胞凋亡显著减少;鼻咽癌放疗耐受细胞株CNE-1分别细胞转染miR-20a-5p的antagomir及其对应control后细胞早期凋亡明显增加。
  6)在CNE-2细胞中分别注射miR-20a-5p的mimic及其对应的control后裸鼠瘤体重量由0.45克增加到1.23克,这与miR-20a-5p促进鼻咽癌细胞放疗耐受性结论一致。而在CNE-1细胞中分别注射miR-20a-5p的antagomir及其对应的control后裸鼠瘤体重量由0.36克减少到0.01克,这也与miR-20a-5p促进鼻咽癌细胞放疗耐受性结论是一致的。体外裸鼠成瘤实验结果支持了miR-20a-5p通过调节 Rab27B表达显著增加了鼻咽癌细胞的放疗耐受性。
  7)利用双荧光素酶报告基因检测系统寻找miR-20a-5p、Rab27B可能参与的信号通路。结果表明,在与癌症相关的18条信号通路中,在CNE-1和CNE-2细胞中表达差异大于10倍的有3个信号通路:Hypoxia、Notch和MEF2通路。CNE-2和CNE-1细胞中分别注射miR-20a-5p的mimic和antagomir及其对应的control,Qiagen CignalTM reporter assay检测差异较大的3个信号通路的转录因子的变化,在CNE-2细胞中分别注射miR-20a-5p的mimic及其对应control后,3个信号通路(Notch、Hypoxia和MEF2通路)的转录因子表达分别变化0.81、6.88和8.74倍;在CNE-1细胞中分别注射miR-20a-5p的antagomir及其对应control后,3个信号通路(Notch、Hypoxia和MEF2通路)的转录因子表达分别变化3.41、0.39和4.34倍,结果表明miR-20a-5p/Rab27B可能是通过MEF2信号通路参与调节鼻咽癌细胞放疗耐受性。进一步的生物信息分析与Rab27B相互作用的基因,提示SYTL2、MLPH和DIT3基因可能与Rab27B有直接相互作用关系。
  研究结论:
  1)通过组学测序、实验验证等方法,首次发现miR-20a-5p基因在鼻咽癌放疗耐受/敏感细胞株中表达有显著差异,而Rab27B基因的表达与miR-20a-5p具有负相关性,表明Rab27B是miR-20a-5p的下游调控基因。
  2)在鼻咽癌放疗敏感细胞株CNE-2和放疗耐受细胞株CNE-1中发现miR-20a-5p基因通过负向调控Rab27B基因显著增加鼻咽癌细胞放疗耐受性。
  3) miR-20a-5p基因通过负向调控Rab27B基因表达可能是通过促进鼻咽癌细胞迁移能力、侵袭能力和减少鼻咽癌细胞凋亡等机制增加鼻咽癌细胞放疗耐受性。
  4) miR-20a-5p基因通过负向调节Rab27B基因表达可能是通过MEF2信号通路参与调控鼻咽癌细胞放疗耐受敏感性,与Rab27B相互作用的基因可能有SYTL2、MLPH、DIT3等基因。
[博士论文] 刘颖
耳鼻咽喉科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景:下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)是一种恶性肿瘤,属于头颈鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous CellCarcinomas,HNSCC)中的一种。HSCC这种恶性肿瘤发病率比较低:在HNSCC患者中HSCC患者大约仅占了5%-15%。但是,由于HSCC的患者早期症状不明显,所以诊断为晚期肿瘤的患者数量远多于诊断为早期肿瘤的患者。目前,HSCC的治疗手段依然依赖于手术,术后的放疗,化疗等,然而治疗效果并不乐观。鉴于HSCC具有诊断晚、预后差、治疗方式传统等特点,寻找一些新的与该肿瘤的发生、发展以及预后相关的生物学因子就显得尤为重要。但是由于HSCC发病率低,临床病例资料的收集相对困难,所以相对于其他常见的人类恶性肿瘤,HSCC的相关研究比较少见。
  程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4, PDCD4)是近年来发现的一个新的抑癌基因,PDCD4是通过调节其他基因的表达水平来发挥其抑癌基因的作用的。PDCD4可以通过MA-3功能域与真核细胞翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor4A, EIF4A)绑定,或者PDCD4本身可以直接与靶基因的MYB/c-MYB编码区结合,从而调节靶基因的转录和翻译,进而影响肿瘤的生长、分化、转移等生物学特点。研究表明,PDCD4在一些肿瘤中表达下调或者表达缺失,包括肺癌、直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、乳腺癌等,而且这种表达情况的改变对以上肿瘤的发生和发展起了非常重要的作用。在一些体外实验中还发现PDCD4能抑制肿瘤细胞的生长和侵袭,提高肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。此外还有报道称PDCD4对一些炎症相关的疾病也有影响。最近的一些研究发现,PDCD4是microRNA-21(miR21)的功能特异性的靶基因,PDCD4与miR21之间存在负相关的联系,并且它们很可能作为重要的预后因子影响着多种人类恶性肿瘤。
  综上所述,PDCD4是一个非常重要的抑癌基因,但是在HSCC中PDCD4发挥着什么样的作用并没有任何的相关研究以及报道,PDCD4很可能对HSCC的发生、发展以及预后产生重要的影响,PDCD4是否能成为HSCC的一种预后因子值得探究。
  目的:本课题的研究目的在于检测PDCD4在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织与癌旁非肿瘤组织中的表达情况,研究PDCD4表达高低与下咽鳞状细胞癌患者的临床病理学特征和术后生存情况的相关性,并且研究PDCD4对下咽鳞状细胞癌细胞系FaDu细胞的生物学特征的影响,从而了解PDCD4在下咽鳞状细胞癌的发生和发展中所起的作用以及PDCD4作为下咽鳞状细胞癌预后因子的潜在价值。
  方法:在本课题的研究中,应用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)的方法对66例下咽鳞状细胞癌患者的肿瘤组织和35例癌旁黏膜组织的蜡块标本中的PDCD4蛋白采用免疫特异性的染色,根据染色强度及范围确定IHC评分,以此来衡量PDCD4的表达情况,并用Mann-Whitney秩和检验方法分析下咽鳞状细胞癌蜡块标本中癌组织和癌旁组织里PDCD4蛋白的表达差异。用western blot的方法半定量检测来自于10位下咽鳞状细胞癌患者的新鲜组织样本(包括癌组织及对应的癌旁黏膜组织)中PDCD4蛋白的表达情况,并用配对资料t检验的方法分析相对灰度,以检测PDCD4蛋白在新鲜组织中表达的差异。
  在体外实验中,以下咽鳞状细胞癌细胞系FaDu细胞系作为研究体系,通过转染的方法构建PDCD4高表达的细胞FaDu-PDCD和对照组细胞FaDu-MOCK。应用活细胞计数的方法以及CCK8(Cell Counting Kit-8)生长曲线的方法检测PDCD4对下咽癌细胞生长及增殖情况的影响;应用transwell的方法检测PDCD4对下咽癌细胞迁移和侵袭特性的影响,在细胞实验的结果分析中应用非配对资料t检验的统计学方法进行两组间统计学差异的比较。
  此外,我们还统计了患者的临床病理信息以及术后生存情况,用Pearson卡方检验的方法分析了PDCD4的表达程度与患者临床病理资料包括年龄、病理分级(肿瘤分化程度)、临床分期和淋巴结转移情况的相关性;应用Kaplan-Meier生存分析方法研究了PDCD4表达高低对下咽癌患者的预后是否存在影响。
  在实验结果分析过程中,每个实验重复三次以上,所有的统计学差异的分析均使用SPSS19.0软件进行计算,当双侧检验结果P<0.05时,判定差异具有统计学意义。
  结果:IHC和western blot的实验结果均证明,与癌旁黏膜组织相比,PDCD4基因在下咽鳞状细胞癌的肿瘤组织中表达下调甚至缺失,而且在癌旁正常组织中,PDCD4在细胞核和细胞质中均有表达,但在某些肿瘤组织中PDCD4仅在细胞质中表达。通过将PDCD4表达高低情况与各项临床病理数据进行相关性的分析,我们发现PDCD4的表达情况与下咽癌患者肿瘤分化程度相关。在体外实验中,活细胞计数和CCK8生长曲线研究均表明,PDCD4的高表达可以抑制下咽癌细胞的生长和增殖;在transwell实验中,我们还发现PDCD4的高表达对下咽癌细胞的侵袭和迁移也具有抑制作用。除此之外,生存分析研究发现PDCD4的表达情况还与下咽癌患者的预后相关:PDCD4的低表达预示着患者的不良预后。
  结论:PDCD4在下咽鳞状细胞癌癌组织中存在表达下调的现象,而且PDCD4对下咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭都有抑制作用,PDCD4的表达情况与下咽癌的分化程度以及患者预后相关。这些结果提示PDCD4在下咽癌的发生和发展过程中起抑癌基因的作用,它能影响癌细胞的生长、分化和转移,而且PDCD4有望成为下咽癌的预后因子,为研究下咽癌治疗的新方法提供启示。
[博士论文] 臧艳姿
耳鼻咽喉头颈外科 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  在本研究中,我们分别应用RT-PCR以及Western-blot方法识别ECRG4在鼻咽癌组织以及细胞系等方面的mRNA与蛋白表达状态;通过免疫组化研究ECRG4在鼻咽癌方面的表达状态以及统计学要素,同时明确和临床病理的具体联系;建立ECRG4过表达脂质体,使用transwell以及裸鼠尾实验来明确ECRG4对细胞系5-8F、CNE2相关侵袭以及转移所构成的基础影响;Western blot研究ECRG4对于转移表达存在的基础影响;进一步使用RT-PCR以及明胶酶谱法来研究MMP2的mRNA表达以及酶活性;调整MMP2的表达,transwell观察MMP2对于ECRG4控制侵袭转移的基础影响;Western blot研究NF-kB p65的磷酸化状态;进行增殖以及克隆等实验,同时明确裸鼠身体中的成瘤实验ECRG4对于增殖能力所构成的基础影响;使用流式细胞仪的方案研究ECRG4对细胞周期所存在的影响;Western blot研究ECRG4对于配套调控蛋白所产生的基础影响。
  课题包含以下三个部分:第一部分:ECRG4在鼻咽癌组织和细胞中的表达及意义;第二部分:ECRG4通过NF-kB下调MMP2的表达抑制鼻咽癌的侵袭和转移;第三部分: ECRG4抑制鼻咽癌细胞的增殖
  第一部分 ECRG4在鼻咽癌组织和细胞中的表达及意义
  1.培养3个人鼻咽癌细胞系(5-8F、6-10B、CNE2)和1个永生化鼻咽上皮细胞系(NP69)。
  2.收集河南省人民医院及郑大一附院2006年至2012年切除的鼻咽癌组织及正常鼻咽组织石蜡标本。
  3.采用免疫组化的方法检测鼻咽癌组织及正常鼻咽组织的ECRG4的表达。
  4.收集2例活检的鼻咽癌新鲜组织及7例正常鼻咽组织。
  结果:
  1、ECRG4在鼻咽癌组织中的表达明显低于癌旁组织
  针对2例活检癌变组织和7例健康组织进行对比分析,研究其中的蛋白以及mRNA水平的ECRG4表达状态,最终得出不管是在mRNA或蛋白水平中,ECRG4于鼻咽癌组织方面的表达都明显低于正常的组织。
  2、ECRG4在鼻咽癌细胞系中的表达
  Western-Blot以及RT-PCR分析得出,ECRG4实际检测的3种癌变细胞6-10B、CNE2中都存在一定的表达,实际的表达量都低于永生化的上皮细胞系,同时得出存在高转移特征的5-8F细胞系,在实际的表达水平方面显著低于不转移性以及低转移性的CNE2细胞系。
  3、ECRG4在鼻咽癌组织中表达的临床病理学意义
  为有效分析ECRG4于鼻咽癌、正常组织之中存在的表达差异,笔者在分析环节中扩充样本规模,整理153例鼻咽癌以及30例非癌石蜡组织开展配套的检查工作,最终得出ECRG4于鼻咽癌方面集中于胞浆,较少的存在于胞核的位置。深入分析可得出ECRG4于非癌组织的高表达数量为28例(93.3%),低表达的数量为2例(6.7%),而对于鼻咽癌方面而言,构成高表达的数量为81例(52.9%),构成低表达的数量为72例(47.1%),两类组织的表达状况存在显著的区别,同时其中的区别存在显著的统计学意义(P<0.001)。
  4、ECRG4在鼻咽癌组织中表达的临床病理学意义
  深入探讨ECRG4于鼻咽癌方面的实际表达状况和临床病理学特征的基础联系时得出,ECRG4的实际表达状态和病忠实际的性别、年龄以及抽烟等并不存在显著的联系。而ECRG4表达强度和EB、浸润、分化、TNM分期和转移等存在密切的联系。即存在EB病毒感染问题的病患,在ECRG4阳性表达率方面低于无EB感染的群体;而伴随实际肿瘤分化度提升的同时,ECRG4表达率会相对更高;而在肿瘤分期较晚的情况下,ECRG4表达率则会相对更低;存在远处及淋巴结转移的实际阳性率显著低于不存在转移问题的群体,而两个组别的数据差异存在一定的统计学价值,p<0.01。Kaplan-Meier生存期研究得出ECRG4实际的表达状况和病患的预后存在紧密的联系,ECRG4低表达的病患,在各种生存期参数上都显著低于ECRG4高表达的群体。
  第二部分:ECRG4通过NF-kB下调MMP2的表达抑制鼻咽癌的侵袭和转移
  方法:
  1、ECRG4-pcDNA3.1载体的构建。
  2、构建ECRG4、MMP2过表达载体。
  3、构建稳定转染pcDNA3.1载体的鼻咽癌细胞系。
  4、Transwell小室实验测定5-8F、CNE2细胞和相关对照细胞具体的迁移与侵袭表现。
  结果:
  1、将p3.1/ECRG4-pcDNA3.11、p3.1/ECRG4-pcDNA3.12和p3.1空载体转染鼻咽癌5-8F以及CNE2细胞系,通过G418而开展配套的阳性克隆筛选工作,进一步得到可实现稳定转染效果的对应6株细胞系,将其名称依次界定为5-8F/pcDNA3.11、5-8F/pcDNA3.12、5-8F/control、CNE2/ pcDNA3.11、CNE2/pcDNA3.12以及CNE2/ control。成功构建了稳定转染pcDNA3.1载体的鼻咽癌细胞系。
  2、上调ECRG4的表达抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力
  与转染p3.1空载体细胞相比,ECRG4-pcDNA3.11、ECRG4-pcDNA3.12转染造成5-8F细胞方面的迁移细胞数依次降低78.3%与65.1%,而关于其中的侵袭细胞实际的降低比例则属于70.4%以及59.8%。进而令CNE2细胞实际的迁移细胞数降低82.5%以及52.7%,而侵袭细胞数的减少幅度属于76.9%以及69.4%。体外迁移以及相关的侵袭实验得出,上调细胞中的ECRG4表达可以有效的抑制鼻咽癌细胞所存在的基础迁移以及侵袭效应,代表着ECRG4或许具备抑制癌细胞侵袭效应的对应能力。
  3、ECRG4影响鼻咽癌细胞内转移相关基因的表达
  为有效的论述ECRG4怎样控制鼻咽癌细胞方面存在的迁移以及侵袭效应。在分析中采用Western blot来测定转移相关基因,探寻ECRG4潜在的相关靶基因。而在大量的和肿瘤转移存在联系的基因中,实际选定了曾报道为属于ECRG4基础裂解底物的MMP2、MMP9、Snail、P-catenin和VimentinE-cadherin,、N-cadherin,最终得出上调ECRG4的表达,能够控制鼻咽癌MMP2、Snail以及Vimentin的表达,体会E-cadherin的对应表达,同时MMP9、N-cadherin以及P-catenin在表达水平上并不存在显著的变化。
  4、上调ECRG4的表达降低鼻咽癌细胞内MMP2的表达水平及其酶活性
  细胞外基质降解作为相关的肿瘤细胞对于周边存在浸润,以及对于远处存在侵袭、转移等变化的必要基础,当前众多的分析得出基质金属蛋白酶MMPs和转移之间存在极为紧密的联系,例如MMP2于多类肿瘤转移之中起到一定的重要影响,尤其是MMP2也加入到鼻咽癌转移效应中。最新的分析得出ECRG4可下调MMP2的表达,进而抑制相关肝内胆管细胞癌所存在的转移变化。所以综合前文中Western blot的对应结果,推测ECRG4影响转移或许涉及MMP2的调节效应。针对该问题,使用RT-PCR在5-8F、CNE2两个细胞系方面再度验证上调ECRG4表达可导致MMP2表达的下降。进而依靠配套的明胶酶谱法而识别MMP2的酶活性状态。最终得出于5-8F、CNE2两个细胞系之中进行上调ECRG4的活动,都会导致MMP2酶活性的显著下降。
  第三部分 ECRG4抑制鼻咽癌细胞的增殖
  方法:
  1、细胞生长曲线的测定(CCK8实验)。
  2、细胞平板集落形成实验
  3、流式细胞仪分析细胞周期
  4、裸鼠体内成瘤实验
  结果:
  1、上调ECRG4抑制细胞增殖标志蛋白PCNA的表达
  2、上调ECRG4的表达显著降低鼻咽癌细胞的体外增殖能力
  3、上调ECRG4的表达显著地抑制鼻咽癌细胞克隆形成能力
  4、上调ECRG4表达抑制鼻咽癌细胞体内成瘤能力
  结论:
  1、发现ECRG4在鼻咽癌组织的表达明显低于正常鼻咽组织;发现ECRG4在鼻咽癌组织中的表达水平与EB病毒的感染、组织的分化程度、TNM分期、肿瘤的体积和转移相关;
  2、发现上调ECRG4的表达可以明显抑制鼻咽癌细胞转移、侵袭、增殖和成瘤能力;
  3、ECRG4抑制鼻咽癌细胞的转移、侵袭,可能是通过依赖NF-kB信号通路下调MMP2的表达来实现;
  4、上调ECRG4的表达可以阻止鼻咽癌细胞由G1期向S期进展,使细胞停滞于G0/1期,其潜在的机制可能是部分通过下调Cyclin D1、Cyclin D2和CyclinE,上调p27来实现。
[博士论文] 陈翰祥
病原生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分:低氧下Cdc6调控E7表达细胞越过G1期阻滞的研究
  研究目的:
  人乳头瘤病毒(HPV)感染是全球最常见的性传播疾病之一。高危型HPV是导致宫颈癌发生的首要启动因子。研究证实HPV-16 E7的持续性表达对于宫颈癌前病变及宫颈癌的形成及发展均至关重要。
  本研究提出以下研究目标:(1)探究低氧下HPV-16 E7表达细胞及宫颈癌细胞的增殖水平变化;(2)探究低氧下Cdc6调控HPV-16 E7细胞越过G1期阻滞的作用及机制。以上研究将有助于阐明HPV致癌新机制,为发现宫颈癌治疗新靶点提供实验依据。
  研究方法:
  1. HPV-16 E7表达细胞在低氧条件下增殖水平的检测
  1.1 低氧模型的构建:采用三种方法对RPE1 vector和RPE1 E7细胞进行低氧处理,分别是1)将细胞置于1% O2浓度低氧培养箱8小时;2)采用不同浓度去铁铵(DFO)模拟低氧;3)采用不同浓度氯化钴(CoCl2)模拟低氧(但实验过程中发现其对DNA有损伤后弃用)。
  1.2 HPV-16 E7表达细胞在低氧条件下细胞活力检测:用不同浓度DFO或CoCl2对RPE1 vector和E7细胞进行处理,培养72h后使用细胞增殖检测试剂盒(CCK8)检测细胞活力水平。
  2. 宫颈癌细胞中E7蛋白在细胞低氧抵抗中的作用
  2.1 siRNA选用策略:在HPV-16中,E6与E7由同一个双顺反子转录而来,共用同一个启动子和同一个早期多腺苷酸化位点,单纯靶向E7的siRNA(siRNA198)也会同时抑制E6的表达。因此,本研究采用已报道的siRNA198(siE6E7)来同时沉默E6和E7,siRNA209(siE6)特异性干扰E6。siE6作为siE6E7的对照干扰来研究E7的功能。
  2.2 低氧下CaSki细胞中干扰E7检测细胞周期变化:在宫颈癌CaSki细胞中用RNAi干扰HPV-16 E6E7或E6,通过蛋白质免疫印迹法(WB)检测p53和Rb蛋白、RT-qPCR方法检测E6、E7 mRNA表达水平,以验证干扰准确性和效率。采取1.4所述方法检测细胞周期以及S期细胞差异。
  研究结果:
  1. HPV-16 E7表达细胞能越过低氧导致的G1期阻滞:CCK8实验结果表明,低氧处理后,虽然RPE1 E7和RPE1 vector细胞活力均有降低,但与vector细胞相比E7细胞活力相对较高,其差异在100~200μM DFO,0.4~0.6 mM CoCl2处显著且具有统计学意义。细胞周期检测结果表明,虽然在低氧下Vector与E7细胞均出现了G1期阻滞,但与vector细胞相比,E7细胞G1期细胞比例较少(为65.1%),而vector细胞则高达74.5%。低氧下vector细胞比E7细胞表现出更高的阻滞水平,说明E7蛋白的存在能帮助细胞越过低氧导致的G1期阻滞。BrdU实验结果显示,低氧处理后E7细胞和vector细胞中S期比例分别为30.33%和16.15%,差异显著。低氧下E7细胞的S期比例显著高于vector细胞,说明HPV-16 E7表达细胞能够更多地越过低氧导致的G1阻滞,进入DNA复制的S期。
  2. 低氧下敲低宫颈癌细胞中E7蛋白表达导致G1期阻滞:宫颈癌CaSki细胞含有600多个HPV-16拷贝。在CaSki细胞中干扰E6E7或E6后,Rb或p53蛋白表达增加,E6、E7表达水平降低说明干扰实验成功。流式细胞术检测结果显示,在低氧下虽然细胞均表现出低氧诱导的增殖抑制,但与CaSki-siE6细胞相比,CaSki-siE6E7细胞表现出更显著的G1期阻滞,两组相比差异显著,说明低氧下敲低E7表达的宫颈癌细胞表现出更多G1期阻滞,进一步验证了低氧下HPV-16 E7能够帮助宫颈癌细胞越过G1期检验点,促进细胞增殖。BrdU标记实验显示,低氧下CaSki-siE6E7与CaSki-siE6细胞中S期比例降低,分别为4.1%与7.8%,两者有统计学差异。敲低E7表达可使宫颈癌细胞进入S期的细胞比例明显减少,说明HPV-16 E7促进了宫颈癌细胞低氧下G1/S期转换。
  研究结论与意义:
  本研究揭示了Cdc6调控宫颈癌细胞G1/S期转换的一个新功能,即在低氧状态下,Cdc6参与了HPV-16 E7蛋白诱导的细胞周期紊乱。此发现有助于深入阐明HPV E7蛋白的致癌机制,为发现宫颈癌治疗的新靶点提供实验依据。
  第二部分:新式HPV-16病毒整合位点检测方法的建立
  研究目的:
  口咽鳞状细胞癌(OPSCC)属于头颈癌的一种,与人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关。因此,深入探究口咽癌的发病机制,寻找新的治疗靶点和防治方法非常重要。近年来,随着高通量测序技术(NGS)的迅速发展,很多基于此技术的HPV检测方法被建立起来。我们创新性地建立了一项基于PCR的DNA高通量测序技术,利用96孔板快速构建DNA文库,通过对HPV基因组的针对性测序发现HPV在宿主基因组的整合位点。此方法取材小,时间短,灵敏度高,适用广泛,推广性强,能够为外源DNA掺入等相关基础研究提供良好的检测方法,为临床精准治疗提供可靠基础。
  研究方法:
  1 口咽癌FFPE样本中HPV阳性率的检测
  1.1 口咽癌FFPE样本中提取RNA:实验所选口咽癌样本皆为p16免疫组化染色阳性(p16在临床中常用来预测HPV阳性的癌症)。使用基于QIAGEN石蜡切片RNA提取的标准操作方法在免疫组化p16阳性的美国口咽癌患者FFPE标本中提取RNA。
  1.2 特异性HPV引物设计:根据已发表文章,使用针对HPV16型,18型,31型,33型35型,39型,45型,52型,56型,58型,59型,66型与68型早期基因E6,E7特异性引物进行HPV筛查。GAPDH和β-actin作为实验对照。
  1.3 HPV筛查模板的准备:在384孔板中,每个样品分32孔进行HPV水平筛查,每板12个样品。将上述引物用TE buffer稀释到0.5μM,每孔5μL。将备好引物的384孔板放到真空抽干机中处理1小时(直到每孔液体不可见),放入-20℃储存。
  1.4 实时定量PCR检测口咽癌FFPE样本中HPV表达水平:将石蜡包埋样品中提取的RNA反转录成cDNA,将cDNA放入已备好的HPV筛查模板中,进一步通过RT-qPCR方法检测样本中HPV类型及表达水平。
  2 新式DNA测序技术的建立以及在口咽癌中检测HPV整合位点的应用
  2.1 口咽癌FFPE样本中提取DNA:使用基于QIAGEN石蜡切片DNA提取的标准操作方法在HPV-16阳性美国口咽癌患者FFPE标本中提取DNA。
  2.2 基于Illumina测序平台,针对HPV-16基因组的引物设计:本技术采用双向测序方法,设计两个index序列,一个molecular index序列。Adapter部分序列与Illumina测序平台Oligo A相同,通过连接引入到DNA文库中,Oligo B序列通过PCR过程引入。在HPV基因组引物设计方面,我们用Perl语言编写程序,在HPV-16型基因组7900多个碱基中,依以下原则进行引物设计:a,长度为21到25个碱基;b,Tm值在61.5℃到63℃之间;c,GC含量在40%到60%之间;d,高复杂性,无重复序列;e,无自身互补序列。最终针对HPV正义链和反义链两个方向各选择19个引物,同向引物相隔400左右碱基数,双向引物每条相隔200左右碱基数,完整、全面地覆盖HPV-16基因组全长。
  研究结果:
  1. p16阳性口咽癌患者中HPV阳性率高于90%:口咽癌FFPE样本提取的RNA质量满足HPV筛选的要求。在135例口咽癌样本(免疫组化p16阳性)中,通过HPV基因表达谱(HPV profiling)方法同时筛查13种常见高危型HPV,结果发现122例患者HPV阳性(阳性率为90.4%)。其中115例患者为HPV-16型阳性,3例患者为HPV-18型阳性,3例患者为HPV-33型阳性,1例为HPV-59型阳性,HPV阴性患者为13例。蛋白p16表达与HPV阳性率密切相关。选择HPV-16型阳性的患者样本进行下一步测序研究。
  2. HPV整合位点检测模型成功建立并在口咽癌患者样本中应用:口咽癌HPV-16阳性的FFPE样本DNA质量满足Illumina平台测序的要求。以CaSki为阳性对照,293T细胞作为阴性对照,在口咽癌细胞系UM-SCC-47中成功建立起满足测序条件的DNA文库,通过测序并以TP63基因举例展示分析方法。将此实验模型运用到102个HPV-16型阳性的口咽癌样本中进行测序,以样本0450R_0461F为例展示测序读取数据分析、DNA文库质量分析以及HPV-16整合位点所在宿主基因位置。将本方法与目前靶向测序、全基因组测序技术作了比较,体现出其方便、快捷的特点,填补了口咽癌患者基因组HPV-16病毒整合研究的空白。
  研究结论与意义:
  本研究建立了一个新式基于PCR的HPV-16病毒整合位点检测方法。进一步研究将深入分析HPV-16在口咽癌患者基因组中的整合几率及整合特点,以及比较HPV感染在宫颈癌和口咽癌中的异同,通过详细研究被整合基因的生物学功能深入挖掘HPV导致口咽癌发生发展的更多线索。
[硕士论文] 谢亚学
耳鼻咽喉科学 河北北方学院 2017(学位年度)
摘要:喉癌是头颈部最常见的肿瘤之一,其中以喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)为主,约占喉癌的96%~98%。最新研究显示喉癌的总生存率有下降趋势,而影响喉癌预后的关键因素是癌细胞的侵袭性和转移性,因此进一步了解喉癌侵袭转移的相关分子机制,可为喉癌患者的预后评估及个体化治疗提供必要的依据。
  肿瘤的侵袭转移是一个动态且复杂的过程,是多种蛋白分子参与多个步骤共同作用的结果。RhoA作为“信号通路分子开关”介导了多种信号转导通路而参与调节细胞的活动。近年研究发现RhoA的表达水平与肿瘤的发展密切相关。Ezrin为膜细胞骨架连接蛋白,在多种恶性肿瘤中呈高表达,被认为是肿瘤转移的关键调节因子,在肿瘤的浸润转移中发挥着重要作用。活化的RhoA可通过激活ROCK-1进而促进Ezrin的磷酸化,增强Ezrin与细胞骨架的联系,从而改变细胞骨架结构并参与细胞的运动过程。本研究旨在通过检测Ezrin及RhoA在喉鳞癌细胞中的表达情况,以了解这些参与肿瘤侵袭转移的基因表达在喉鳞状细胞癌发生发展的作用及其相关性,进一步探讨喉癌细胞局部浸润及淋巴结转移的作用机制。
  一、RhoA和Ezrin在新鲜喉癌组织及新鲜喉粘膜组织中的表达
  本实验应用免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)、免疫蛋白印迹(Western blot,WB)及实时荧光定量聚合酶链反应(Quantita-tive reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)法分别检测30例喉鳞状细胞癌患者手术切除新鲜癌组织及30例相对应正常喉粘膜组织中RhoA和Ezrin的蛋白表达量及mRNA的基因表达水平,并结合临床病理特征进行统计学分析。应用SPSS22统计分析软件进行统计学处理,P<0.05时差异具有统计学意义。
  免疫组化结果显示在LSCC组织中RhoA和Ezrin的阳性表达率(60%和70%)明显高于正常喉粘膜组织(13.3%和16.7%);Western blot结果显示RhoA和Ezrin在LSCC组织中的蛋白表达量均明显高于正常喉粘膜组织;qRT-PCR结果显示RhoA和Ezrin在LSCC组织中的mRNA表达量也均高于正常喉粘膜组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。两者的表达与淋巴结的转移、临床分期密切相关(P<0.05);而与肿瘤分化程度、年龄、性别、吸烟程度无关(P>0.05)。同时一致性检验结果显示RhoA和Ezrin在喉鳞状细胞癌细胞中的表达呈正相关(Kappa=0.638)。
  二、回顾性分析RhoA和Ezrin在喉鳞癌组织及正常喉粘膜组织中的表达
  本实验应用免疫组织化学染色方法检测近10年的喉癌组织石蜡块68例及正常喉粘膜组织石蜡块35例中RhoA和Ezrin的表达情况,并结合临床病理特征进行统计学分析。结果显示LSCC组织中RhoA和Ezrin的阳性表达率(80.9%和82.4%)明显高于正常喉粘膜组织(28.5%和25.7%),差异具有统计学意义(P<0.05);且两者的表达量与淋巴结的转移、临床分期密切相关(P<0.05);而与分化程度、年龄、性别、吸烟程度无关(P>0.05)。一致性检验结果显示RhoA和Ezrin在喉鳞状细胞癌细胞中的表达呈正相关(Kappa=0.363),与上述新鲜组织中RhoA和Ezrin的表达情况基本一致,进一步验证结果的可靠性。
  综上所述,RhoA和Ezrin在LSCC组织中不论从细胞分子水平还是mRNA的基因表达水平较正常喉粘膜组织均呈高表达,并同时与喉癌患者淋巴结转移、临床分期密切相关,且两者在喉癌细胞中的表达呈正相关,提示两者可能共同参与喉癌细胞的浸润转移过程。免疫组化结果显示RhoA分布于细胞浆及细胞膜,Ezrin主要分布于细胞膜,提示Ezrin可能通过与细胞膜蛋白结合使肌动蛋白与细胞膜相连从而改变细胞骨架结构,调节细胞结构及粘附性而参与肿瘤细胞的浸润转移过程,两者之间表达的一致性提示RhoA可能作为Ezrin上游信号通路促进Ezrin的活化后参与肿瘤的浸润转移过程。为喉癌的早期诊断和预后评估提供新的依据。
[博士论文] 王萱怡
中西医结合临床 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种上皮细胞的恶性肿瘤。我国是世界上鼻咽癌发病率和死亡率水平较高的国家之一。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤,其治疗失败的主要原因仍然为局部区域性复发与远处转移,因而侵袭和转移仍是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因。从组织学的角度分析,鼻咽癌绝大部分(95%以上)属于恶性度高的未分化或低分化癌,癌细胞易于扩散转移。故研究鼻咽癌的侵袭机制有重要意义。
  zeste基因增强子同源物2(Enhancer of Zeste Homolog2,EZH2)是多梳抑制复合物2(Polycomb Repressor Complex2,PRC2)的核心组分,其高度保守的SET区域具有组蛋白甲基转移酶活性,通过催化靶基因启动子区组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(Trimethylatedlysine27 of histone H3,H3K27me3),从而抑制基因转录,在染色体水平调控基因活性。有研究表明,EZH2可通过不依赖于其组蛋白甲基转移酶活性的作用影响细胞骨架聚合,从而在肿瘤侵袭转移过程中发挥作用。已发现EZH2在鼻咽癌、前列腺癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中过表达,且其表达水平与肿瘤大小、浸润深度、肿瘤分期、淋巴结转移、迁徙及侵袭能力、预后等因素密切相关,提示EZH2有望成为鼻咽癌诊断及抗肿瘤治疗的新靶点。
  Rho相关的卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase,ROCK)是RhoA的下游效应蛋白,在哺乳动物体内主要有ROCK1和ROCK2两种异构体。ROCK1蛋白的过表达能够调节细胞骨架的重组、促进应力纤维和点状粘附的形成,从而调节细胞的运动和迁移能力。
  南蛇藤(Celastrus orbieulatus Thunb),卫矛科南蛇藤属植物。始载于清代《植物名实图考》,又名过山枫、过山龙、黄果藤、香龙草等。我国南蛇藤属植物30种,分布广泛,多野生于山地沟谷、山坡灌木丛中。主要用于治疗风湿性关节炎、痢疾、小儿惊风、跌打损伤、肿毒等病症。南蛇藤含有多种药理成分,如萜类、脂肪类以及苷类等。这些成分具有广泛的药理作用,如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物以及抗纤维化和抗生育等。特别值得关注的是其在抗肿瘤方面的显著作用。本课题组前期研究显示,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(C orbiculatus ethyl acetate extracts,COE)有显著的抗肿瘤作用,但其机制还未完全阐明。目前已知的南蛇藤茎乙酸乙酯提取物抗肿瘤的机制主要为抑制消化系统肿瘤增殖、侵袭和转移,促进其凋亡,并抑制胃癌细胞上皮间质转化。在本研究中,我们将研究南蛇藤茎乙酸乙酯提取物对鼻咽癌EZH2基因的抑制作用及其对鼻咽癌增殖和侵袭抑制作用的分子机制。
  研究共分为四部分内容。
  第一部分鼻咽癌中EZH2、ROCK1蛋白表达及其临床意义
  目的:确定EZH2、ROCK1蛋白在鼻咽癌中的表达,并评估EZH2、ROCK1蛋白与鼻咽癌的临床病理学特征之问的关系。确定EZH2在鼻咽癌细胞中可以调控ROCK1蛋白的表达。
  方法:免疫组织化学检测NPC患者病理切片标本中EZH2和ROCK1的表达水平。Western blot及PCR检测慢病毒敲低EZH2表达的人鼻咽癌5-8F细胞(shEZH25-8F)与转染scramble shRNA慢病毒的对照组人鼻咽癌5-8F细胞(shCtrl5-8F)中ROCK1的表达。
  结果:对肿瘤病理切片进行免疫组织化学染色,检测肿瘤中EZH2、ROCK1蛋白表达情况及其与临床因素的联系。发现鼻咽癌患者组织中EZH2与ROCK1蛋白表达显著正相关。EZH2蛋白表达水平与患者的T分期、N分期、AJCC分期正相关。ROCK1蛋白表达水平与患者的N分期正相关。Western blot结果表明,shEZH25-8F细胞ROCK1蛋白表达显著低于对照组,PCR结果表明,shEZH25-8F细胞中ROCK1的表达比shCtrl5-8F组显著下降。
  结论:EZH2和ROCK1高表达与鼻咽癌的进展有关。敲低EZH2基因可以抑制鼻咽癌细胞中ROCK1蛋白和基因的表达。靶向EZH2/ROCK1通路可以给鼻咽癌的治疗提供新方向。
  第二部分EZH2影响鼻咽癌增殖和侵袭的实验研究
  目的:研究EZH2对5-8F鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响。PCR芯片分析shEZH25-8F与shCtrl5-8F细胞中差异表达的癌基因及抑癌基因。研究EZH2对裸鼠鼻咽癌5-8F细胞皮下移植瘤生长的影响。
  方法:MTS实验观察增殖能力的改变;Transwell实验检测体外迁移、侵袭能力的变化;裸鼠10只,随机选择5只皮下接种人鼻咽癌细胞株shCtrl5-8F,其余5只皮下接种人鼻咽癌细胞株shEZH25-8F。接种14d后处死老鼠,剥脱肿瘤组织,检测肿瘤体积及重量。PCR芯片比较shEZH25-8F与shCtrl5-8F细胞癌基因及抑癌基因改变。
  结果:MTS法检测5-8F、shCtrl5-8F、shEZH25-8F细胞种板24、48、72小时后的细胞增殖情况。结果提示shEZH25-8F较shCtrl5-8F增殖能力均明显降低(P<0.05),5-8F与shCtrl5-8F细胞增殖能力无统计学差异。
  Transwell小室法检测5-8F、shCtrl5-8F、shEZH25-8F细胞迁移及侵袭(24小时),shEZH25-8F较shCtrl5-8F细胞迁移及侵袭能力降低(P<0.05),5-8F与shCtrl5-8F细胞迁移及侵袭能力无统计学差异。
  PCR芯片结果提示shEZH25-8F较shCtrl5-8F细胞,APC、ATM、ESR1、MYCN、RET、TGFB1、WT1和ZHX2这8个基因表达上调>3倍,NFKB1和TP53这两个基因下调>3倍。
  体内研究证实,与阴性对照组相比,shEZH25-8F组细胞肿瘤体积显著减小。shEZH25-8F组瘤重显著低于阴性对照组(P<0.05)。
  结论:EZH2被敲低后能抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖、侵袭和迁移,并且可以抑制裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤的生长。因此,EZH2可能成为治疗鼻咽癌转移的靶点。其机制可能与其调节癌基因和抑癌基因相关。
  第三部分南蛇藤提取物通过阻断EZH2/ROCK1通路抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭的体外研究
  目的:明确南蛇藤提取物(Extract of Celastrus orbiculatus,COE)通过EZH2/ROCK1信号通路对鼻咽癌细胞的增殖和侵袭具有调控作用,阐明COE在抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭中的作用和机制。
  方法:鼻咽癌5-8F细胞分别经不同浓度(0,6.25,12.5,25,50及100ug/mL)的COE处理后,MTS法观察增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞的凋亡;Transwell实验检测体外迁移和侵袭能力的变化;Westernblot及实时荧光定量PCR法分析EZH2、ROCK1蛋白和基因的表达水平,Westernblot及实时荧光定量PCR实验以EZH2抑制剂(DZNeP)作为阳性对照。
  结果:不同浓度(0,6.25,12.5,25,50及100ug/mL)的COE作用24h,对5-8F细胞的增殖有抑制作用,并呈明显的剂量依赖性。药物作用24h时,5-8F细胞在12.5-100μg/ml浓度组的生长存活率与本细胞对照组相比均有统计学差异(P<0.05); COE对5-8F细胞的半数抑制浓度(IC50)为70.02μg/ml(24h)。
  不同浓度(0,6.25,12.5,25,50,100μg/ml) COE作用24 h可促进5-8F细胞凋亡,并有明显的剂量依赖性。5-8F细胞在100μg/ml浓度组的凋亡率与对照组相比有统计学差异(P<0.05);因此使用低于100μg/ml浓度的COE进行以下实验,以确保COE对鼻咽癌细胞的作用不是通过直接的细胞毒作用。
  使用Transwell检测细胞迁移和侵袭。迁移和侵袭实验结果提示不同浓度(12.5,25,50μg/ml) COE作用24 h时,5-8F细胞在12.5-50μg/ml浓度组穿过小室的细胞与对照组相比均有统计学差异(P<0.05);并有明显的剂量依赖性。
  使用WB检测不同浓度(0,12.5,25,50μg/ml) COE或2μM DZNeP(EZH2抑制剂)作用24 h后5-8F细胞EZH2和ROCK1蛋白变化。EZH2蛋白在COE25-50μg/ml浓度组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。 ROCK1蛋白在COE12.5-50μg/ml浓度组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05);并有明显的剂量依赖性。COE高剂量组与DZNeP对EZH2、ROCK1蛋白的抑制作用接近。
  使用PCR检测EZH2和ROCK1 mRNA变化。不同浓度(0,12.5,25,50μg/ml)COE或2μM DZNeP作用24 h时,EZH2和ROCK1 mRNA在12.5-50μg/ml COE浓度组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05);并有明显的剂量依赖性。DZNeP与COE高剂量组对ROCK1 mRNA的抑制作用接近,但DZNeP不能降低EZH2 mRNA的表达量。
  结论:南蛇藤提取物可通过下调EZH2/ROCK1信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖、促进其凋亡,并降低其体外迁移和侵袭的能力。
  第四部分南蛇藤提取物通过阻断EZH2/ROCK1通路抑制鼻咽癌细胞增殖的体内研究
  目的:证实COE通过EZH2/ROCK1信号通路对鼻咽癌皮下移植瘤增殖具有调控作用,阐明COE在抑制人鼻咽癌皮下移植瘤增殖中的作用和机制。
  方法:裸鼠42只,随机选择6只进入正常组,其余36只均于右侧背部皮下接种人鼻咽癌5-8F细胞株。待瘤块直径约5mm-6mm大小时,将裸鼠随机分为对照组(1%DMSO)、COE高、中、低剂量(50,25,12.5mg/kg)组及替吉奥组(10mg/kg),参一胶囊组(10mg/kg),每组6只。分组当天开始给药,COE连续21d,替吉奥连续14d,参一胶囊连续21d,末次药24 h后,检测肿瘤重量,免疫组化检测移植瘤组织内EZH2、ROCK1蛋白表达水平的变化,HE染色检测瘤组织内肿瘤坏死区域。
  结果:与阴性对照组相比,COE各治疗组肿瘤生长速度减缓。阴性对照组瘤重(1.58±0.74g),COE低、中、高剂量组平均瘤重分别为1.36±0.53g,1.26±0.52g和0.88±0.53。COE高剂量组移植瘤重量与对照组相比有显著性差异(P<0.05),抑制作用具有剂量依赖性。阳性对照替吉奥组平均瘤重为0.86±0.43g,与COE高剂量组抑制作用接近。中药对照参一胶囊平均瘤重为1.26±0.41g,与COE中剂量组抑制作用接近。
  使用免疫组化法分别检测鼻咽癌移植瘤组织切片内EZH2、ROCK1蛋白的表达,结果提示COE低、中、高剂量组肿瘤细胞EZH2、ROCK1阳性染色细胞数较阴性对照组下降,抑制作用具有剂量依赖性。表明COE能有效抑制移植瘤组织中EZH2、ROCK1的表达。
  结论:南蛇藤提取物可通过下调EZH2/ROCK1信号通路抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长。
[硕士论文] 王畕
耳鼻咽喉科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:鼻咽癌是原发于鼻咽粘膜被覆上皮的一种恶性肿瘤,是我国东南沿海地区居民常见的恶性肿瘤,其恶性程度高,覆盖年龄广,放疗敏感是它的典型特征。对于初发鼻咽癌患者,单纯放射治疗疗效显著。部分鼻咽癌患者可在首程放疗后复发,对于鼻咽癌首程根治性放疗一年后出现复发的,可给予常规外放射二程放疗。鼻咽癌复发时间各有不同,但一般多在首次放疗后2年左右复发。对于二程放疗后再次复发的,以及首程放疗2年后复发的,患者往往由于严重的并发症而无法耐受再次放疗。对于这类鼻咽癌复发患者,外科手术可以较完整切除位于鼻咽部、鼻腔、鼻窦及颅底的肿瘤,避免放射性损伤,提高患者的治疗效果和生存质量。本研究通过对低温等离子、内镜动力切割系统手术治疗局部复发性鼻咽癌的临床疗效进行初步探讨,为今后的临床应用提供依据。
  目的:通过对鼻内镜下低温等离子、内镜动力切割系统手术治疗复发性鼻咽癌的临床疗效进行分析总结,并将传统开放式手术的临床资料作为参照,初步探讨鼻内镜下手术治疗局部复发性鼻咽癌的近期疗效。
  方法:收集并整理我科自2012年1月-2016年3月间临床收治诊断明确并经全身麻醉、鼻内镜下手术治疗的20例复发性鼻咽癌患者的病例资料,对低温等离子、内镜切割系统治疗局部复发性鼻咽癌的近期疗效进行初步探讨。本研究中的传统手术方式病例均来自2012年以前的病例档案搜集。
  结果:20例患者全部在鼻内镜下完成手术,术后鼻内镜及影像学检查可见鼻咽癌复发病变均获得较完整切除。术后病理示:非角化型癌9例,鳞状细胞癌5例,低分化癌2例,浆细胞瘤1例,腺癌1例,纤维肉瘤1例,炎性坏死、中心见癌灶1例。鼻内镜低温等离子组术中出血为5-15ml,手术时间为20-40min。鼻内镜动力切割系统组术中出血为100-400ml,手术时间为120-210min。手术并发症情况:低温等离子组8例患者中1例术后出现咽部肿胀,1例出现轻度吞咽时异物感,术后两年内均无复发。鼻内镜动力系统组1例患者术后并发颅内出血死亡,1例侵犯眼球行眼球摘除,1例患者并发糖尿病死亡。术后两年有2例患者复发。20例患者术后回访12-48个月,1年总生存率100%,3年生存率90%。死亡2例,复发2例,余下病例近期复查未见复发,局部控制率为80%。
  结论:(1)鼻内镜下直视手术能够完整的切除鼻咽癌一期放疗后复发的病变,为鼻咽癌患者一期放疗后复发提供除传统手术治疗之外的确实有效的治疗方法。
  (2)低温等离子应用于鼻咽癌放疗后局部复发患者的挽救性治疗,具有损伤小、出血少、恢复快、并发症少等优点。本研究病例较少,但作为放疗复发的补救治疗,只要手术适应证选择得当,可在今后的临床研究中扩大样本量,采用前瞻性研究。
[硕士论文] 李飞
耳鼻咽喉科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  了解喉癌干细胞与喉癌化疗耐受之间的关系,并利用转录组测序技术筛选出干细胞与普通喉癌细胞之间的差异基因,从中找到多药耐药相关基因,初步分析喉癌干细胞多药耐药的机制。
  方法:
  1.用流式细胞仪检测Hep-2、TU177细胞中CD133、CD44的表达率,并使用RTCA法检测 Hep-2、TU177细胞在顺铂、5-fu、紫杉醇三种化疗药物作用下的生长曲线,计算不同时间的IC50值,比较两种细胞系中CD133、CD44的表达率与化疗耐受之间的关系。
  2.用免疫磁珠分选法从Hep-2、TU177细胞中分选CD133+CD44+细胞,使用qPCR法检测CD133+CD44+细胞与亲本细胞中MDR1、MRP2基因的表达,验证干细胞与化疗耐受的关系。
  3.将分选出的CD133+CD44+、CD133-CD44-及正常的Hep-2、TU177细胞进行转录组测序,检测干细胞与普通喉癌细胞之间的差异基因,进行耐药相关基因筛选,初步分析干细胞耐药机制。
  结果:
  1.Hep-2细胞中CD133、CD44阳性率大于TU177细胞。并且,Hep-2细胞在三种药物作用下不同时间的IC50值均高于TU177细胞,说明同为喉癌细胞,Hep-2细胞相对于TU177细胞耐药性更强,同时与CD133、CD44阳性表达率呈正相关。
  2.Hep-2、TU177经免疫磁珠分选后CD133+CD44+细胞比例可高达80%-90%,这表明MACS富集CD133+CD44+细胞有效。Hep-2分选后MDR1较亲本细胞升高2.68倍,MRP2较亲本细胞升高1.68倍;TU177分选后MDR1较亲本细胞升高6.72倍,MRP2较亲本细胞升高42.69倍,可以看出干细胞富集后,多药耐药相关基因表达增加,说明干细胞的表达与喉癌化疗耐受呈正相关。
  3.通过转录组测序找出两个喉癌细胞系共有的差异基因12个,通过对它们进行功能及表达通路分析,发现FOS、JUN和NR4A1参与耐药相关的PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路及Wnt信号通路,可能和喉癌多药耐药有关,推测这三种基因可能是通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡发挥抗化疗的作用。
  结论:
  喉癌干细胞与多药耐药有关,并且可能是通过FOS、JUN和NR4A1基因通过促进细胞增殖、抑制凋亡发挥作用,但具体功能及作用机制仍需进一步实验验证。
[硕士论文] 陈志飞
耳鼻咽喉科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过Meta分析的方法,对比评估经口激光显微手术(TLM)和放射治疗(RT)对于早期声门型喉癌的临床疗效,为临床上制定早期声门癌的治疗方案提供循证学依据。
  方法:
  通过PubMed、EMBASE、the Cochrane Library、Web of knowledge、Google Scholarthe、the Wiley online library、中国知网、万方数据库、中国生物医学文献数据库(CBM)、中文科技期刊全文数据库(VIP)检索有关激光手术与放射治疗早期声门型喉癌的全部文献。通过制定纳入标准及排除标准,对文献进行筛选、质量评价,选定最终纳入研究的文献,并提取相关评价指标的数据。运用RevMan5.3软件对数据进行Meta分析,二分类变量资料采用OR值、95%CI表示效应量,以患者的局部复发率(LR)、总体生存率(OS)、局部控制率(LC)、喉保存率(LP)、并发症发生率(CR)、死亡率(MR)作为观察指标,对比分析两种治疗方法的疗效。
  结果:
  经文献筛选,最终选定18篇符合要求的文献,均为观察性非随机对照试验。共纳入2397个研究对象,经口激光显微手术(TLM)组1165例,放射治疗(RT)组1232例。
  Meta分析结果显示:(1)局部复发率(LR)的比较:共纳入9篇文献,研究对象1240例,其中TLM组539例,RT组701例。TLM组与RT组的LR无统计学差异[OR=1.04,95%CI(0.72,1.51)Z=0.20,P=0.84]。(2)局部控制率(LC)的比较:共纳入14篇文献,研究对象总计1830例,其中TLM组876例,RT组954例。TLM组与RT组在肿瘤局部控制方面无统计学意义[OR=1.14,95%CI(0.86,1.51),Z=0.92,P=0.36]。(3)5年总生存率(OS)的比较:共有11篇文献纳入研究,参加病例数总计1597例,其中TLM组713例,RT组884例。TLM组与RT组的5年总生存率有统计学意义[OR=1.31,95%CI(1.00,1.70),Z=1.97,P=0.05]。(4)喉保存率(LP)比较:共有13篇文献纳入研究,病例数总计1995例,其中TLM组977例,RT组1018例。TLM组与RT组在喉器官保存率上有显著统计学差异[OR=4.41,95%CI(2.81,6.94),Z=6.44,P<0.00001]。(5)并发症(CR)的比较:共有4篇文献纳入研究,病例数总计513例,其中TLM组184例,RT组329例。有中度异质性,不能合并。通过敏感性分析,引起异质性的研究数据来自Spector JG(1999),并且是权重最大的文章,去掉其重新Meta分析,结果显示:TLM组与RT组在并发症发生率方面没有统计学意义[OR=0.50,95%CI(0.18,1.40),Z=1.31,P=0.19]。(6)死亡率(MR)的比较:共有8篇文献纳入研究,病例数总计1293例,其中TLM组615例,RT组678例。TLM组与RT组的死亡率有统计学差异[OR=0.57,95%CI(0.38,0.85),Z=2.77,P=0.006]。
  结论:
  (1)在局部复发、肿瘤的局部控制方面,经口激光手术与放射治疗可以获得相似的治疗效果。
  (2)经口激光手术的患者5年总生存率优于放射治疗,死亡率明显低于放射治疗。
  (3)经口激光手术的喉保存率高于放射治疗。
  (4)经口激光手术与放射治疗在并发症发生率方面无明显差异。
[硕士论文] 张亚娜
耳鼻咽喉科学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:采用系统评价的方法,比较晚期喉癌(Ⅲ、Ⅳ期)喉部分切除术与全喉切除术后的远期疗效,探讨喉部分切除术治疗晚期喉癌的合理性及可行性,为临床实践提供一定的循证医学证据。
  方法:系统全面检索PubMed/Medline database、Springerlink、万方数据库、中国期刊全文数据库(CNKI)、中文科技期刊全文数据库(VIP)等文献数据库,检索已发表的喉部分切除术与全喉切除术治疗晚期喉癌的临床对照研究,截止时间为2016年12月。纳入文献的评分标准采用纽卡斯尔-渥太华量表(Newcastle-Ottawa Scale, NOS)。采用Cochrane协作网提供的系统评价RevMan5.3软件进行Meta分析,根据异质性检验结果选择相应的效应模式,本系统评价的二分类变量采用喉部分切除术组与全喉切除术组间的比值比(0R)及其95%可信区间(95%CI)表示,并做“漏斗图”进行发表性偏倚。
  结果:纳入12篇文献,均为回顾性分析临床对照研究,共1093例晚期喉癌患者,其中喉部分切除术组(观察组)615例,全喉切除术组(对照组)478例。Meta分析结果显示:(1)3年生存率:[OR=0.80,95%CI(0.57,1.11), P=0.18],晚期喉癌喉部分切除术组与全喉切除术组的3年生存率差异无统计学意义(P>0.05);(2)5年生存率:[OR=0.93,95%CI(0.71,1.22),P=0.58],晚期喉癌喉部分切除术组与全喉切除术组的5年生存率差异无统计学意义(P>0.05);(3)5年肿瘤复发率:[OR=1.39,95%CI(0.72,2.67),P=0.32],晚期喉癌喉部分切除术组与全喉切除术组的5年肿瘤复发率差异无统计学意义(P>0.05)。2种治疗方案对晚期喉癌的远期预后差异无统计学意义。
  结论:晚期喉癌喉部分切除术后的远期预后(生存率、肿瘤复发率)与全喉切除术者差异无统计学意义。对于晚期喉癌,掌握严格的手术适应症,选择行喉部分切除术不会降低患者的远期预后,且保留了其发音、呼吸及吞咽等喉功能,保证了患者术后较高的生存质量。
[硕士论文] 郑巍
耳鼻咽喉学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨喉部肿瘤智能分光比色技术(flexible spectral imaging color enhancement, FICE)特点及FICE内镜在喉部肿瘤早期诊断中的应用价值
  方法:收集自2015年3月至2016年12月63例疑似喉部肿瘤的患者,使用EG-590ZW电子胃镜,它具有白光内镜(white light endoscopy,WLE)和FICE内镜两种观察模式,分别对喉部病变进行观察、摄图并保存。通过对黏膜及黏膜下毛细血管形态及走形、病灶边界,比较两种观察模式下图像清晰度;比较两种内镜模式下正确诊断率;对比两种模式下的喉癌前病变、喉癌的敏感性及特异性;FICE内镜模式下对喉部病变血管分型。
  结果:⑴FICE内镜在血管形态、走形及病灶边界的显示上都明显优于普通白光内镜(<0.05)。⑵在63例喉部肿物中共发现85个病灶,其中良性病变28个(包括慢性炎性、息肉、单纯性增生),轻度不典型增生9个,中度不典型增生3个,重度不典型增生3个,原位癌6个,浸润癌36个。FICE内镜对喉癌病变的正确诊断率是91%,高于普通白光内镜的68.2%,两者比较差异有统计学意义(<0.05);FICE内镜对喉癌前病变及喉癌的敏感性92.4%,高于普通白光内镜的74.6%,具有统计学意义(<0.05);FICE内镜对于喉癌前病变及喉癌的特异性91.8%,普通白光内镜的87.8%(>0.05),无统计学意义。⑶FICE分级与病理诊断关系:Ⅰ型患者:息肉8例,Ⅱ型患者:慢性炎症18例,息肉2例,其诊断对良性病变的敏感性为92.8%;Ⅲ型患者:轻度不典型增生8例,中度不典型增生3例,其诊断不典型增生的敏感性为100%,Ⅳ型患者:轻度不典型增生1例,中度不典型增生2例,重度不典型增生及原位癌6例,浸润癌1例,差异有统计学意义(<0.05);V型患者:浸润癌占100%,其诊断浸润癌的敏感性为97.2%(35/36)。
  结论:①与普通白光模式相比,FICE模式对于病变的轮廓、黏膜层及黏膜下层微血管的形态及走形变化可清晰地显现出来,增强病变识别度。②FICE内镜对喉癌前病变和喉癌病变诊断的正确率、敏感性,比普通白光模式具有明显优势,从而增强内镜在喉癌前病变和喉癌术前诊断和术后随访中的作用。③通过FICE模式下对血管形态分型,可更早发现喉部肿瘤早期病变及微小病灶。
[硕士论文] 辛晓磊
生物化学与分子生物学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 干扰素α-1a通过激活内源线粒体凋亡通路和内质网应激凋亡通路诱导喉癌Hep-2细胞的凋亡
  目的:喉癌传统的手术切除与放射治疗,可能会造成病人失声、毒性反应等不良后果,针对喉癌的新疗法亟待发掘。干扰素具有抗病毒、抑增殖、调节免疫系统的作用。α干扰素对人类喉癌细胞具有抑增殖的作用。但是,α干扰素调节细胞生长抑制的机理没有被充分的研究。本论文利用喉癌Hep-2细胞为模型,旨在研究IFNα-1a能够抑制喉癌Hep-2细胞增殖的分子机制。
  方法:选取喉癌Hep-2为细胞模型,通过瞬时转染质粒过量表达IFNα-1a和外加重组蛋白IFNα-1a这两种方式,研究IFNα-1a对Hep-2细胞增殖的影响。利用CCK8和MTT等方法检测IFNα-1a对Hep-2细胞增殖的抑制作用,流式分析检测IFNα-1a是否对Hep-2细胞具有促凋亡作用,用Western Blot方法检测IFNα-1a激活的具体的凋亡信号通路。研究IFNα-1a对组织细胞的特异性时,检测了IFNα-1a对其他细胞系,如人胚肾上皮细胞HEK-293T、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549,是否具有促凋亡作用。
  结果:IFNα-1a能显著的抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,该抑制过程是通过诱导Hep-2细胞的凋亡来实现。IFNα-1a能抑制抑凋亡蛋白Bcl-XL的表达,促进细胞色素C由线粒体释放到胞浆,并最终激活caspase3的切割活化,并进一步诱导caspase3底物PARP-1的切割活化,从而激活了内源线粒体凋亡通路。IFNα-1a也能刺激内质网应激反应(ER-stress)通路相关基因GRP78和CHOP的表达上调,以及caspase4的切割活化,并进一步激活caspase3的切割活化,也即IFNα-1a激活ER-stress介导的细胞凋亡通路。但外源凋亡通路的标志物蛋白caspase8、caspase10未被切割活化,因此IFNα-1a未激活外源凋亡通路。另外,IFNα-1a对HEK-293T、HepG2、A549未发现有明显的促凋亡影响。
  结论:IFNα-1a通过诱导Hep-2细胞的凋亡抑制了其增殖,IFNα-1a主要是通过内源线粒体凋亡通路和ER-stress凋亡通路来促进Hep-2细胞的凋亡,外源凋亡通路未被激活。IFNα-1a对其他HEK-293T、HepG2、A549细胞的凋亡无显著性影响,也即IFNα-1a对组织细胞的促凋亡作用具有组织特异性的特点。总之,我们的研究揭示了IFNα-1a抑制喉癌细胞增殖的具体的分子机制。
  第二部分 微流控蛋白印迹杂交与传统Western蛋白印迹杂交对目的蛋白的检测效果的比较
  目的:传统的Western蛋白印迹杂交在研蛋白质研究领域有相当广泛的应用,是实验室最常用研究技术之一,能对蛋白质进行定性和半定量的分析方法。虽然传统Western蛋白印迹杂交有广泛的应用市场,但其本身还是存在诸如:样品需求量大、费时、费力等的缺点。这里,基于反向蛋白杂交Reverse phase proteinarray(RPPA)的点杂交原理,我们发明了一种新型微流控纸芯片蛋白印迹杂交,相比传统的Western蛋白印迹杂交,新型微流控纸芯片蛋白印迹杂交具有样品需求量低至1μL,节省试剂至20mL,节省时间至1h,节省劳动力、高通量检测等诸多优点。尤其的,纸芯片蛋白印迹杂交,由于微流控纸芯片本身具有的优点:高比表面积、毛细作用力等,使得纸芯片蛋白印迹杂交可以检测到更微量的蛋白。
  方法:本篇文章以06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)蛋白为例,选用高表达MGMT蛋白的MCF7细胞为细胞模型,比较传统Western蛋白印迹杂交和纸芯片蛋白印迹杂交分别对经过药物—MGMT阻断剂处理后MCF7细胞的MGMT蛋白表达量的定性以及相对定量结果。
  结果:纸芯片蛋白印迹杂交可以成功进行MGMT的定性、相对定量,而且上样检测蛋白低至10-25pg,这相比于传统Western蛋白印迹杂交的上样检测蛋白1-5ng,提高了3个数量级。整个操作流程只需要1个小时,所用试剂量少,实验成本更低,而且纸芯片的多通道构造可以实现像反向蛋白杂交分析(RPPA)一样高通量的检测组织蛋白表达量。
  结论:本篇文章的微流控蛋白印迹杂交,能检测到更微量级的蛋白,更节省试剂、样品,省时省力,省钱,高通量检测。微流控纸芯片蛋白印迹杂交的优势被估计可以用于实验室中蛋白的定性以及相对定量。
[硕士论文] 潘智育
药理学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:构建稳定沉默和过表达RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2细胞系,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,在体内研究靶向调控RAC1与鼻咽癌放射敏感性的关系,证实RAC1作为鼻咽癌放射治疗增敏靶点的可能性。
  方法:1.利用RNA干扰和基因过表达基因重组技术,构建沉默和过表达RAC1基因的慢病毒表达载体,感染鼻咽癌CNE-2细胞,通过荧光显微镜和Western blot法筛选出最佳感染条件和最佳沉默靶序列,建立稳定沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞系。2.对沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞,采用MTT法绘制生长曲线,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,Western blot法检测RAC1/NADPH信号通路中关键蛋白P67、P47和RAC1的表达情况。3.将沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞悬液接种于裸鼠皮下,构建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,接种14d给予4 Gy单次照射处理,照射10d后处死裸鼠。记录裸鼠一般情况、体重和移植瘤重量及体积变化,绘制裸鼠体重变化曲线、移植瘤生长曲线。取瘤体组织,HE染色观察瘤体的病理学变化,免疫组化和Western blot法检测RAC1/NADPH信号通路中RAC1、P67和P47关键蛋白表达情况,透射电镜观察瘤体组织细胞中超微结构的变化。
  结果:1.成功构建沉默和过表达RAC1基因的慢病毒表达载体,测序结果显示插入序列正确。病毒颗粒转染鼻咽癌细胞后分别获得RAC1沉默的RAC1(-)细胞,RAC1过表达的RAC1(+)细胞,荧光显微镜下观察其感染效率高于95%,Western blot结果显示RAC1(+)细胞RAC1蛋白表达显著高于对照组,RAC1(-)细胞RAC1蛋白表达显著低于对照组。2.体外实验表明,与对照组比较,鼻咽癌RAC1(-)细胞生长增殖速度增加,迁移速度减慢,细胞中P67、P47和RAC1蛋白表达明显下降(P<0.05);RAC1(+)细胞增殖速度没有改变,但是迁移速度加快,并上调NADPH氧化酶的关键亚基P67、P47和RAC1蛋白表达(P<0.05);但不管是沉默还是过表达RAC1基因,其细胞周期各时相比例无明显改变。3.成功构建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率100%。照射前各组裸鼠体重稳步上升,各组间无统计学差异;裸鼠移植瘤生长迅速,其中RAC1(+)组和RAC1(-)组的瘤体生长速度略快于对照组。但在第14d进行4 Gy照射后,各组裸鼠体重均下降,尤其是RAC1(-)组体重下降最明显。而各组的瘤体体积均比相应未照射组有不同程度的缩小,其中RAC1(+)和RAC1(-)组的瘤体与照射前相比急剧缩减。裸鼠处死后,照射组移植瘤体重量均比相应不照射组减轻,其瘤重下降率RAC1(+)组最为明显,高达68%。瘤组织的HE染色可见,照射后RAC1(-)组角质纤维化、核固缩明显,RAC1(+)组细胞大面积坏死、核碎裂明显,其他组间差异不明显。Western blot和免疫组化结果显示,RAC1(-)组瘤组织P67、P47和RAC1表达下调,联合照射的RAC1(-)组下调更为明显。RAC1(+)组P67、P47和RAC1表达增高,而联合照射的RAC1(+)组上调更为明显。透射电镜下可以观察到除对照组外,各瘤组织细胞出现出不同程度的超微结构改变,其中照射后RAC1(-)组线粒体肿胀、空泡样改变明显,线粒体内膜和外膜模糊不清,嵴消失,部分嵴融合;而照射RAC1(+)组细胞结构不完整,出现细胞溶解坏死,细胞膜破裂,核碎裂,细胞器损坏消失,可见大量细胞碎片形成。
  结论:1.成功构建沉默和过表达RAC1基因慢病毒表达载体及沉默和过表达RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2细胞系。2.沉默或过表达RAC1基因能有效抑制或上调NADPH氧化酶关键亚基P67、P47和RAC1蛋白表达。3.建立了慢病毒介导沉默和过表达RAC1裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,体内实验证实,联合4 Gy照射,过表达RAC1能明显增加瘤体对辐射敏感性,RAC1有望成为鼻咽癌放射增敏调控新靶点。
[硕士论文] 葛雅男
耳鼻咽喉科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:喉鳞状细胞癌是头颈部肿瘤中的常见的恶性病变,占头颈部肿瘤的13.9%,目前对于喉癌的研究较广,在蛋白、通路及各种方面的研究呈集中性,但是喉癌具体通过哪一个机制发生主要作用,目前还没有很确切的表述,喉癌的发生、发展是多个因素或途径同时作用造成的,近年信号通路方面的研究已成为喉癌发生、发展的研究热点,为喉癌的治疗寻找新的治疗靶点,为喉癌的预后提供参考指标。
  信号转导通路以Wnt/β-catenin通路为最典型,是和肿瘤关系密切的信号转导通路之一,其主要的表现模式为:当wnt信号被始动因子激活后,通过下游一系列蛋白的影响,使β-catenin的磷酸化抑制,降解减少,导致胞核内的β-catenin异常积聚,与胞核内的因子(TCF/LEF)结合后形成复合物,从而调控细胞的生长。Dvl和Wnt2是wnt信号通路的主要成员,位于整个信号转导通路的上游,两个蛋白在通路中的表达是wnt通路的在信号传递的关键环节,两个蛋白的表达异常,最终可导致β-catenin在胞浆内水平增高累积入核,与转录因子相互作用,诱发靶基因的转录,参考以往的文献Wnt/β-catenin通路的dvl和wnt2在食管癌、非细胞肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌、结肠癌中均有异常的表达。
  本研究通过免疫组化法检测Dvl蛋白与Wnt2在喉鳞状细胞癌及癌症周边正常组织中的表达,探讨两个蛋白在年龄,发生部位,临床分期、转移情况、是否吸烟在癌症及周边的组织的表达水平,探讨Dvl蛋白与Wnt2在喉癌的表达情况及相关性,分析探讨Dvl与Wnt2在喉癌中的发病机制,为寻找新的治疗途径提供一个新思路。
  方法:
  1.研究对象
  1.1.石蜡标本的收集
  选取河北医科大学第四医院耳鼻喉-头颈外科2014年10月至2016年11月期间在河北医科大学第四医院住院的喉肿物手术患者,其中实验组为48例,经病理确定为鳞状细胞癌的患者,经证实病历资料采集证实此组患者选择在术前均未行放、化疗等治疗,年龄43~71岁,平均58岁,对照组为24例喉癌患者的癌旁正常粘膜组织,距离癌原发部位0.5厘米。使用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)S-P法对实验组和对照组中的Dvl及Wnt2的表达情况进行检测。
  1.2.所有实验数据结果均使用SPSS21.0软件进行统计学分析,采用χ2检验,P<0.05为有统计学意义。
  结果:
  1.Dvl的表达结果
  Dvl蛋白的蛋白阳性表达均呈棕黄色或棕褐色,主要定位在细胞质中,大多呈弥漫性表达。Dvl的表达在喉癌组织中的阳性表达率(79.2%)明显高于癌旁正常组织的阳性表达率(33.3%),两组经检验比较有统计学意义(P<0.05)。
  1.1.Dvl在低分化、中高分化病理分型的阳性表达率分别为89.4%,65.5%,说明Dvl的在癌组织的表达随着分化程度的降低而升高,经统计学分析差异有统计学意义(P<0.05)。
  1.2.Dvl蛋白的表达和临床分期有相关性,临床分期Ⅰ+Ⅱ的阳性表达(57.1%)明显低于Ⅲ+Ⅳ的表达(85.5%),经统计学分析差异有统计学意义(P<0.05)。
  1.3.Dvl蛋白表达在有淋巴结转移的癌症组织表达(84.6%),明显高于无淋巴结转移的表达(63.6%),经统计学分析差异有统计学意义(P<0.05)。1.4 Dvl蛋白在喉癌组的表达与患者的年龄、性别无明显相关性(P>0.05)。
  2.Wnt2表达结果
  2.1.Wnt2的阳性物质主要在细胞质,呈黄色或棕黄色颗粒。Wnt2在喉癌组织中的阳性表达(75.0%)明显高于癌旁组织的阳性表达(45.8%),两组经检验差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.2.Wnt2的表达在低分化及中高分化喉癌组织中的表达分别为84.20%,58.60%,患者分化程度越低,wnt2的阳性表达越高,相反分化程度高的表达阳性率偏低,经统计学分析差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.3.Wnt2的表达与临床分期有相关性,临床分期越晚,wnt2表达就越强,在Ⅲ、Ⅳ期的阳性表达率(80.0%)明显高于Ⅰ、Ⅱ期的阳性表达率(60.7%),经统计学分析差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.4.Wnt2在伴有淋巴转移的喉癌组织中的表达(84.6%)明显高于无淋巴转移的癌组织表达(59.1%),经统计学分析差异有统计学意义(P<0.05)。3 Dvl与Wnt2表达之间的相关性
  Dvl与Wnt2在喉鳞状细胞癌中的表达相关性分析,两者的表达属于正相关关系(r=0.537,P<0.001)。
  结论:
  1.喉鳞状细胞癌组织中的Dvl和Wnt2的均有表达,但喉癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜组织,提示两者可能参与喉癌的发生和发展,并激发癌组织的恶性程度和淋巴结转移。
  2.喉癌组织中的Dvl表达与临床分期,分化程度和淋巴结转移都存在高表达,提示Dvl蛋白的高表达可能在喉癌的发展、浸润及转移中起重要的作用。
  3.Wnt2在喉癌的临床分期、分化程度和淋巴结转移中都有高表达,提示Wnt2蛋白可能促进喉癌的发展,并可能是喉鳞状细胞癌的特征性的标记物。
  4.Dvl蛋白与Wnt2蛋白在喉癌中的表达有正相关性,两者可能通过某一个机制在喉癌的发生及发展中起促进作用,为喉癌的靶向治疗提供了一个新的依据,但是是否能成为喉癌的新治疗方法还需临床进一步验证。
[硕士论文] 罗忍
肿瘤学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:研究:
  1.鼻咽癌病人放疗后甲状腺功能低下列线图的建立
  目的:
  研究鼻咽癌病人放疗后甲状腺功能低下与患者临床特征、甲状腺受照射剂量的关系并建立列线图。
  资料和方法:
  回顾性入组在汕头大学医学院附属肿瘤医院初治的鼻咽癌病人,入组条件为:
  1.患者无远处转移;
  2.患者治疗前无甲状腺功能的紊乱及治疗前甲状腺功能检查未及异常;
  3.患者治疗前无颈部手术史。
  排除标准:患者接受放疗后接受颈部残余淋巴结推量或手术清扫。一共入组164人。本研究甲状腺功能低下定义为:TSH升高,fT4的正常或降低。记录患者临床信息:性别、年龄、TNM分期(AJCC第七版)及有无化疗。收集患者甲状腺的剂量参数:Vx(甲状腺接受至少xGy的相对体积,每隔5Gy,收集从V10至V60共11个Vx剂量参数),Dmin(最小剂量),Dmean(平均剂量),Dmax(最大剂量)。统计学方法:套索分析(LASSO,least absolute shrinkage and selection operator)为通过对最小二乘估计加入惩罚约束,使某些系数进行压缩,甚至压缩为0,从而实现避免过拟合和变量选择。本研究应用套索方法从收集的临床及剂量学参数中筛选出的重要的预测因素。应用被选出的预测因素的各种组合(每种组合至少包含一种剂量学参数)建立多因素Cox回归模型。通过C-index大小比较各个Cox模型的预测能力,并考虑模型的简洁性,确定最优模型。在最优Cox回归模型基础上构建列线图。绘制校正曲线以比较此列线图预测与实际观察到的甲状腺功能低下发生率。
  结果:
  在中位数等于24个月的随访时间中,38个患者(23.2%)发生了甲状腺功能低下,在套索分析中,性别、有无化疗及Dmean、V50被选为重要的预测因素,这四个因素的11种组合构建成11个多因素Cox回归模型。经过C-index比较,最优Cox回归模型包括参数:性别(P=0.005),有无化疗(P=0.051)及V50(P=0.000)。列线图建立在此三因素Cox模型基础之上(图2),其C-index为0.72。校正曲线(图3)显示该列线图对患者在放疗后18、24、30个月甲状腺功能低下的发生具有良好的预测能力。
  结论:
  本研究基于2个患者临床因素及1个剂量学因素,构建了预测放疗后甲状腺功能低下的列线图。临床放疗科医生可通过此图获得每个病人个体化的甲状腺器官的剂量学限制。
  研究:
  2.鼻咽癌病人放疗后甲状腺功能低下的危险因素及剂量限制探索
  目的:
  探索鼻咽癌患者放疗后甲状腺功能低下的危险因素并据此推算甲状腺器官的剂量限制。
  资料和方法:
  收集本院2007年12月至2014年2月单组鼻咽癌患者160人,其中38人发生了放疗后甲状腺功能低下,为病例组。根据患者随访时间及N分期进行1:1配对,在剩余122人中,得到未发生甲状腺功能低下的38人,为对照组。收集患者临床信息:性别、年龄、TNM分期(AJCC第七版)及有无化疗。收集患者甲状腺的剂量参数:Vx(甲状腺接受至少xGy的相对体积,每隔5Gy,收集从V10至V60共11个Vx剂量参数),Dmin(最小剂量),Dmean(平均剂量),Dmax(最大剂量)。垂体参数包括:Pmin(垂体最小剂量), Pmean(垂体平均剂量),Pmax(垂体最大剂量)。统计学方法:单因素及多因素分析使用条件logistic回归。得到的独立危险因素予ROC曲线分析,根据约登指数,得到最佳切割值。
  结果:
  Dmean、V40-V55为鼻咽癌病人放疗后发生甲状腺功能低下的危险因素。多因素logistic回归分析发现,仅V45为放疗后甲状腺功能低下的独立危险因素。ROC分析发现,V45的曲线下面积为0.72,最佳切割值为V45=47.6%。
  结论:
  本研究得出V45为鼻咽癌患者放疗后甲状腺功能低下的独立危险因素。甲状腺器官的限制剂量为V45小于47.6%。
  研究:
  3.鼻咽癌病人放疗后甲状腺功能低下的正常组织并发症概率模型建立
  目的:
  建立鼻咽癌患者放疗后甲状腺功能低下的正常组织并发症概率(normal tissue complication probability,NTCP)模型,并与现有的4个放疗后甲状腺功能低下的NTCP模型比较。
  资料和方法:
  共174位治疗前无甲状腺功能紊乱史、甲状腺功能检查无异常及无颈部手术史的鼻咽癌患者纳入此项研究。生化甲低的定义为:TSH升高,fT4的正常或降低。收集患者临床信息包括性别、年龄、 TNM分期(AJCC第七版)及有无化疗。收集患者的剂量参数:Vx(甲状腺接受至少xGy的相对体积,每隔5Gy,V10至V60),Dmin(最小剂量),Dmean(平均剂量),Dmax(最大剂量),垂体最大剂量(Pmax)及平均剂量(Pmean)。应用逻辑回归对患者临床及剂量学参数进行分析并建立 NTCP模型。通过比较5个模型在各自研究队列及本鼻咽癌人群中的曲线下面积(AUC),以此比较模型对放疗后甲状腺功能低下的预测能力高低。
  结果:
  中位随访24个月,39位患者(22.4%)发生了生化甲状腺功能低下。在多因素逻辑回归分析中,性别、有无化疗及 Dmean、Pmax被选为重要的预测因素,并据此建立4因素NTCP模型。经过AUC比较,在各自人群中,模型之间的预测能力并无显著统计学差异。在预测本鼻咽癌研究人群时,本研究建立的NTCP模型的预测能力明显优于其余4个来自非鼻咽癌人群的NTCP模型。
  结论:
  本研究基于患者性别、有无化疗及 Dmean、Pmax建立了鼻咽癌患者放疗后甲状腺功能低的NTCP模型,该模型对鼻咽癌患者放疗后甲状腺功能低下具有较好的预测能力。
[硕士论文] 周恩
耳鼻咽喉头颈外科学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨miRNAlet-7a调控HMGA2对人喉癌裸鼠移植瘤生长的影响及其分子机制,为喉癌发病机制的研究提供新的思路,为let-7a在喉癌的诊断、治疗及早期防治中的应用提供相关实验依据。
  方法:
  化学合成人let-7a mimics和let-7a mimics negativecontrol(let-7a/NC),通过Lipofectamine2000转染至人喉癌Hep-2细胞。将Hep-2细胞分为3组,即空白组(单纯Hep-2细胞)、let7组(转染let-7a mimics的Hep-2细胞)、NC组(转染let-7a/NC的Hep-2细胞)。将let-7组、NC组、空白组Hep-2细胞注射于裸鼠皮下,观察裸鼠的饮食、活动、健康及成瘤情况等,绘制瘤体生长曲线。实验终点(种瘤30天后)剥离肿瘤后测定体积并称重,并予以计算抑瘤率;对肿瘤予以切片并行HE染色观察细胞形态;采用qRT-PCR法检测microRNAs let-7a和HMGA2 mRNA水平;采用免疫组化、Westernblot法测定HMGA2蛋白的表达。
  结果:
  (1)所有裸鼠均在种瘤5~6天后形成可见肿瘤,成瘤率为100%,开始可触及右侧颈背部种瘤部位小圆形肿块,之后逐渐生长为不规则形。HE染色观察到移植瘤细胞核大,核仁深染,细胞异型明显,与Hep-2细胞移植瘤特点一致,提示喉癌Hep-2细胞移植瘤动物模型构建较为成功。
  (2) let7组、NC组、空白组细胞最终肿瘤体积分别为(232.201±28.342) mm3、(507.808±51.48) mm3、(529.657±44.43) mm3;3组最终肿瘤体积不全相同,具有显著差别(F=75.961,P=0.000);其中NC组与空白组间最终肿瘤体积无显著差别(q=21.849,P=0.432),余各组间相互比较均有显著差别(P<0.01)。let7组、NC组、空白组细胞最终移植瘤质量分别为(0.194±0.040)g、(0.813±0.106)g、(0.863±0.110)g;三组间质量不全相同(F=99.887,P=0.000);三组间两两比较发现,空白组与NC组间无显著差别(q=0.498,P=0.360),其余各组间比较均有显著差别(P<0.01)。
  (3) qRT-PCR检测发现,let7组皮下移植瘤中miRNAs let-7a明显上调,HMGA2 mRNA下调,较NC和空白组均有明显差别(P<0.05);免疫组化显示,空白组和NC组HMGA2蛋白阳性表达率明显高于let7组,有明显差别(P<0.05);Western blot发现,空白组和NC组HMGA2蛋白灰度值明显高于let7组,有明显差别(P<0.05)。
  结论:
  本研究通过利用Hep-2细胞株构建人喉癌裸鼠移植瘤模型,在体内水平证实let-7a靶向下调HMGA2蛋白的表达,并对喉癌在裸鼠体内的生长产生了抑制作用。为喉癌增殖、转移的分子机制及药物靶点研究提供了一定的根据。
[硕士论文] 林烈浩
病理学与病理生理学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤之一,具有高度的侵袭性和转移性,其中以中国广东和广西两省发病率最高,达到25-40/10万人/年。早期鼻咽癌患者的5年生存率高达95%,而晚期患者生存率不到75%。用于筛查和辅助诊断鼻咽癌的血清标志物主要是EB病毒相关抗体(如VCA-IgA)或EB病毒DNA(EBV-DNA),但这些检测方法的敏感度及特异度仍不够理想。由于缺乏早期的筛查方法,临床上鼻咽癌诊断时往往已到中晚期阶段,严重影响治疗效果。最近有研究表明,某些肿瘤相关抗原的自身抗体在肿瘤早期,甚至是癌前病变阶段就已在患者血清中出现,检测其含量可能成为早期肿瘤诊断方法;并且,多种肿瘤自身抗体联合检测可以显著提高检测的敏感度。我们先前研究发现,肿瘤自身抗体是鼻咽癌潜在的早期诊断分子标志物。基于此,本研究拟通过应用血清蛋白质组分析技术,筛选新的鼻咽癌自身抗体分子标志物,并进一步扩大样本量,采用酶联免疫吸附试验检测验证自身抗体在鼻咽癌中的诊断价值;最后,联合VCA-IgA,建立新的自身抗体联合 VCA-IgA鼻咽癌诊断模型。通过本研究,可为鼻咽癌早期诊断提供新的分子标志物,弥补检测 EB病毒在鼻咽癌诊断方面的不足,进一步提高鼻咽癌早期诊断率。
  方法:
  收集汕头大学医学院附属肿瘤医院7例鼻咽癌患者和7例年龄性别匹配的正常人血清标本。培养人鼻咽癌细胞CNE2,提取CNE2总蛋白,运用血清蛋白质组学分析技术,即将CNE2总蛋白经双向电泳分离后,凝胶进行银染或转膜后做免疫印迹(以鼻咽癌患者血清和正常人血清作为一抗),比较差异表达蛋白点,取差异蛋白点进行质谱鉴定,筛选可以诱导鼻咽癌患者产生自身抗体的肿瘤相关抗原。应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA),检测汕头大学医学院附属肿瘤医院129例鼻咽癌患者和100例正常对照者血清中自身抗体和 VCA-IgA的水平,联合运用受试者工作特征(ROC)曲线和 logistics回归分析,评价新鉴定的自身抗体分子标志物在鼻咽癌中的诊断价值,以及新的EB病毒抗体-自身抗体模型在鼻咽癌中的联合诊断价值。
  结果:
  血清蛋白质组学分析技术,筛选鉴定了PRDX2、PRDX3、Nucleoside diphosphate kinase、ENO1、HSPA8、Serine-threonine kinase receptor-associated protein、HSPD1、Serpin B5、L-lactate dehydrogenase B、Gamma-glutamylcyclotransferase、Vimentin、Isoform2 of Macrophage-capping protein、Annexin A2等14种鼻咽癌潜在的肿瘤相关抗原。在此基础上,我们采用间接ELISA,检测分析了PRDX2自身抗体和PRDX3自身抗体在129例鼻咽癌患者和100例正常对照者血清中的水平,结果显示PRDX2自身抗体和PRDX3自身抗体在鼻咽癌患者组血清中的水平均显著高于正常对照组(P<0.01)。ROC曲线分析显示,在鼻咽癌中,PRDX2和PRDX3自身抗体的诊断敏感度分别为26.4%和24.5%,特异度分别为96.0%和95.0%,曲线下面积分别为0.614(95%置信区间为0.542-0.686)和0.600(95%置信区间为0.528-0.673);RDX2自身抗体和PRDX3自身抗体联合检测对鼻咽癌的诊断敏感度为36.4%,特异度为95.0%,曲线下面积为0.632(95%置信区间为:0.561-0.703),对早期鼻咽癌的诊断敏感度为40.0%,特异度为95.0%,曲线下面积0.664(95%置信区间为0.550-0.779);联合检测PRDX2自身抗体、PRDX3自身抗体和VCA-IgA进一步提高了对鼻咽癌的诊断效能,敏感度66.7%,特异度95.0%,曲线下面积为0.811(95%置信区间为0.753–0.869),对早期鼻咽癌的诊断敏感度50.0%,特异度95.0%,曲线下面积为0.754(95%置信区间为0.652–0.857)。
  结论:
  ⑴运用血清蛋白质组学方法,我们筛选鉴定了PRDX2、PRDX3、Nucleoside diphosphate kinase、ENO1、HSPA8、Serine-threonine kinase receptor-associated protein、HSPD1、Serpin B5、L-lactate dehydrogenase B、Gamma-glutamylcyclotransferase、Vimentin、Isoform2 of Macrophage-capping protein、Annexin A2等14种潜在的肿瘤相关抗原,提示针对这些肿瘤相关抗原的自身抗体可能是鼻咽癌潜在的诊断分子标志物。⑵PRDX2自身抗体和PRDX3自身抗体在鼻咽癌患者血清中水平升高,可能作为鼻咽癌潜在的诊断分子标志物。⑶相对于单独检测,PRDX2自身抗体、PRDX3自身抗体和 VCA-IgA的联合检测进一步提高了对鼻咽癌的诊断效能,证实自身抗体和VCA-IgA联合检测,能有效提高鼻咽癌早期诊断效能。
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