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[硕士论文] 许慧慧
生物学;植物学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:紫花苜蓿是中国重要的多年生的豆科植物,其具有高产、营养成分多样化及抗逆性强的特点,但恶化的土地条件仍限制了苜蓿的产量。多个研究表明RCI2/PMP3类基因作为多基因家族普遍存在于植物中,可响应多种非生物胁迫,包括低温、干旱、盐,且被激素诱导。且多个研究表明RCI2/PMP3基因在植物中的超量表达可通过提高膜的稳定性及保持细胞内的离子平衡来增加抗多种非生物胁迫的耐力。关于RCI2类基因在苜蓿中的超量表达是否可以提高苜蓿抗非生物胁迫的能力仍是未知的。本研究从紫花苜蓿中克隆了MsRCI2A,MsRCI2B和MsRCI2C基因,构建了三个植物表达载体以连接目的基因。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法转化紫花苜蓿子叶节,并通过分子生物学技术对所筛选的抗性植株进行检测。分析了MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因超量表达对苜蓿耐碱性的影响,为培育出耐逆性转基因苜蓿提供重要的理论依据以及为促进畜牧业的蓬勃发展奠定基础。
  本研究的主要研究结果如下:
  1.在紫花苜蓿中克隆了RCI2类基因家族成员MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因,蛋白质分子质量分别为5.931-kDa、5.946-kDa、6.05-kDa,它们的序列高度同源,都对碱、干旱、低温胁迫和ABA诱导产生响应,但它们对每种胁迫响应程度不同,并且在根和叶中具有不同的表达模式。本研究构建了三个连接目的基因植物表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化方法转化紫花苜蓿的子叶节。每个基因分别获得了两株超量表达的植株。
  2.对转基因株系及野生型株系扦插扩繁,对各株系进行100mM NaHCO3(pH调至8.5)处理。经碱处理15d后,超量表达MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的各株系仍能保持良好的生长状态,而WT株系的生长受到了明显的抑制,叶片变得枯黄且萎蔫。并且碱处理后超量表达MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的各株系相对于非转基因株系有更高的叶绿素含量,积累了更高水平的可溶性糖含量且抗氧化物酶SOD、POD及CAT的活性更高,而丙二醛的含量及相对电导率更低。在未处理和碱胁迫处理5d、10d时,超量表达MsRCI2A,MsRCI2B和MsRCI2C基因的各株系比非转基因株系积累了更多的脯氨酸,但碱胁迫处理15d时,由于非转基因株系受损伤的程度更为严重,以至于积累更多的脯氨酸响应胁迫。
  3.分析了碱处理后各转基因株系中的碱胁迫相关基因H+-ATPase及与所转基因相同源的RCI2类基因的表达情况。相对于对照条件下,碱胁迫处理12h后,H+-ATPase在WT及超量表达MsRCI2B基因株系B13与B19中的表达削弱,在超量表达MsRCI2A基因株系A12、A22中略有上调,而在超量表达MsRCI2C基因的株系C2、C10中的表达呈显著上调趋势。有趣的是,碱胁迫处理12h时,MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在野生型株系中的表达呈上调趋势,MsRCI2A、MsRCI2B基因在超量表达MsRCI2C基因株系C2与C10中呈上调表达趋势,其中MsRCI2A基因上调的程度较野生型大,而MsRCI2B、MsRCI2C基因在超量表达MsRCI2A基因株系A12、A22中的表达受到了抑制,MsRCI2A、MsRCI2C基因在超量表达MsRCI2B基因株系B13、B19中的表达受到了抑制。
[硕士论文] 张晴
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:豆科植物与根瘤菌共生形成一个特殊的器官-根瘤,根瘤是根瘤菌共生固氮的场所,其形成和发育都是根瘤菌与宿主植物相互作用的结果。在豆科植物中,存在两种不同形态的根瘤:即定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的分生组织活性周期短,且根瘤各个组织的发育阶段一致;不定型根瘤的分生组织活性延续时间长,根瘤菌则持续感染其分生组织,导致根瘤有明确的分生区、侵染区、固氮区和衰老区,各个区域处于不同的发育阶段。模式豆科植物蒺藜苜蓿根瘤属于不定型根瘤,其共生伙伴-苜蓿中华根瘤菌在侵染区与固氮区间开始分化成类菌体并行使固氮功能。为了揭示根瘤菌在根瘤中侵染、存活、定殖分化及固氮的机制,本研究以中华苜蓿根瘤菌Sm2011菌株为材料,开展了共生固氮相关基因突变体分离和鉴定的工作,主要研究结果如下:
  1.构建了苜蓿中华根瘤菌Sm2011菌株的突变体库:利用三亲本杂交技术,以Sm2011为受体,以E.coli S17-1/pMH1701为供体、E.coli/pRK2073作为辅助菌进行三亲本杂交。其结果表明,Tn5-sacB转座频率为1.84×10-6,经Km抗性、蔗糖敏感及Tc抗性筛选,分离得到约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体。随机挑选23个单菌落,通过PCR证实Tn5-sacB插入在根瘤菌基因组。
  2.筛选根瘤菌抑制苜蓿根瘤免疫相关基因的突变体:蒺藜苜蓿抑制根瘤免疫基因突变体(nad1),在接种野生型根瘤菌时,形成不能固氮根瘤(白色)。利用该突变体的根瘤表型,接种Tn5-sacB插入突变的根瘤菌,尝试筛选出能形成粉红色的根瘤。结瘤实验结果表明,在约1600棵nad1缺陷型植株中,未发现有结粉红色根瘤的植株。说明利用该方法难以筛选到根瘤菌恢复nad1突变体结固氮根瘤的表型。
  3.苜蓿根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定:利用巢式PCR检测技术,从约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体库中鉴定和筛选出4个特定目标基因的插入位点及其突变体,即固氮酶基因nifH-75-9,结瘤基因nodC-32-33,肽聚糖相关基因smc04024-76-79和smc01188-11-80,其中只有smc04024的插入位点位于基因F端上游,其他三个突变体中Tn5均插入在基因序列中。通过结瘤实验,考察突变体共生及固氮表型,得到野生型苜蓿种子接种nifH基因突变体28d后,形成不能固氮根瘤(白色);接种nodC基因突变体10d后,不能形成根瘤。该结果与已经报道的结果完全一致,证实了突变体库的完整性。而在接种smc01188基因突变体28d后,所得到的根瘤虽然呈粉红色,但红色区域较野生型根瘤大大减少,且植株叶片背面呈红褐色,植株呈现一定程度的缺氮表型;接种smc04024基因突变体28d后,植株根瘤及叶片与接种野生型根瘤菌相比基本相同,这说明该基因的插入位点未破坏该基因的正常表达。此举为鉴定苜蓿根瘤菌突变体提供资源及筛选程序,为后续深入研究根瘤菌共生固氮调节的分子机制提供科学资料。
[硕士论文] 彭丹
农业资源利用 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:紫花苕子、箭筈豌豆是四川常见的豆科绿肥作物,能与根瘤菌共生固氮,作为优质绿肥在农业生产中具有重要意义。目前尚未见到关于四川地区紫花苕子、箭筈豌豆高效根瘤菌的筛选与应用研究报道。本研究通过对采自四川地区的31株紫花苕子根瘤菌和66株箭筈豌豆根瘤菌进行砂培结瘤试验、促生抗逆性能力测定试验、初筛菌株的大田验证以及系统发育研究,从而筛选到高效紫花苕子、箭筈豌豆根瘤菌菌株;本研究还采用尼龙网袋法探讨接种高效根瘤菌与不接种根瘤菌的紫花苕子和箭筈豌豆绿肥腐解规律。主要研究结果如下:
  (1)采集自四川15个市县27个乡镇的紫花苕子、箭筈豌豆根瘤中分离得到紫花苕子根瘤菌24株,箭筈豌豆根瘤菌43株,均为快生型根瘤菌。
  (2)分离得到的67株紫花苕子和箭筈豌豆根瘤菌,用砂培法分别与两宿主紫花苕子和箭筈豌豆进行结瘤能力检测并初筛高效菌株。结果表明,供试菌株均能使紫花苕子和箭筈豌豆结瘤;紫花苕子结瘤数为13.0~81.0个/株,植株总生物量干重为83.3~231.1mg/株,有52株根瘤菌接种处理植株总生物量干重大于对照,其中12株根瘤菌处理植株干重达到显著增加(P<0.05)。箭筈豌豆结瘤数为6.3~45.7个/株,植株总生物量干重为69.8~228.7mg/株,有31株根瘤菌接种处理植株总生物量干重大于对照,其中11株根瘤菌接种处理植株总生物量达到显著性差异(P<0.05)。
  (3)以本课题组前期分离并回接试验验证的7株紫花苕子根瘤菌和23株箭筈豌豆根瘤菌,加上本研究分离的其中62株根瘤菌,作为促生性研究的供试菌,发现92个菌株均能分泌IAA,但菌株间分泌量差异较大,IAA分泌量为0.17~23.75mg/L;有12株根瘤菌(12/92)在有机磷平板上产生溶磷圈,这12株菌溶有机磷量为1.30~67.26mg/L;研究发现有57株根瘤菌(57/92)具有溶钾能力,溶钾量在0.48~3.73mg/L之间。对92株根瘤菌进行抗逆性研究,发现92株根瘤菌均能在pH4.0~11.0的YMA平板上生长,但过酸和过碱影响菌落生长;92株根瘤菌均能在0.2%~0.5%NaCl YMA平板上生长,有32株根瘤菌(32/92)能在0.2%~4%NaCl的YMA培养基上生长。
  (4)将砂培回接试验筛选出的7株紫花苕子初筛根瘤菌和8株箭筈豌豆初筛根瘤菌分别进行田间效果验证,发现接种根瘤菌能促进紫花苕子和箭筈豌豆总生物量和根瘤数增加。接种根瘤菌处理的箭筈豌豆总生物量与不接种相比增产43.8%~86.1%。接种根瘤菌处理的紫花苕子总生物量与不接种相比增产0.7%~32.5%。对箭筈豌豆增产效果最佳菌株为VS5-1,达到显著增产,紫花苕子增产最佳菌株为V14-2,达到显著增产。
  (5)对田间验证的11株根瘤菌进行16S rDNA、持家基因(recA、glnⅡ和atpD)和共生基因(nodC、nifH)系统发育学研究,研究发现11株根瘤菌均属于Rhizobium属,通过持家基因联合建树确定主要属于R.anhuiense、R.fabae和R,sophorae三个种。对11株根瘤菌的持家基因和共生基因系统分类结果比较发现共生基因普遍发生水平转移现象。
  (6)利用尼龙网袋法研究接种根瘤菌与不接种对紫花苕子和箭筈豌豆绿肥翻压后腐解规律与养分释放规律。结果表明,紫花苕子和箭筈豌豆腐解规律呈现出前期腐解较快、后期腐解较平稳的规律,接种与不接种根瘤菌处理之间差异不明显。紫花苕子氮、磷、钾元素释放规律基本一致,养分释放率表现为钾>氮>磷。箭筈豌豆钾、氮释放规律表现为前期腐解较快、后期腐解较平稳,磷释放则基本保持一个比较平稳的水平,养分累积释放率(y)与时间(t)之间的关系均可用方程拟合,拟合程度较好。绿肥纤维素累计腐解率呈现出一种随着时间推移,累积腐解率由快到慢的一个增长趋势,能用对数方程拟合,90d时纤维素腐解率达74.47%~86.56%。半纤维素和木质素的累积腐解率表现为总体呈现不断增加的规律,但无法用方程来表达腐解率(y)与时间(t)之间的关系,90d后累计腐解率分别为53.31%~70.93%、53.83%~73.36%。接种根瘤菌与不接种之间绿肥的纤维素、半纤维素和木质素之间的腐解规律基本一致,未有明显差异。
[硕士论文] 利培星
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在当前传统有机肥产量日益减少的形势下,通过绿肥种植和秸秆还田替代化肥、培肥土壤日益受到重视。本试验选择稻-油/肥混作和稻-油/肥间作模式,通过田间定位试验,探索油菜与紫云英间、混作对油菜、水稻产量、养分吸收、土壤肥力的影响,同时探讨油菜秸秆及其混作生产的绿肥联合还田替代化肥的效果,为稻油轮作区合理利用绿肥和秸秆提高耕地持续利用能力提供依据。主要结论如下:
  (1)油菜与紫云英合理间作、混作种植,不会对油菜产量造成显著的不利影响,同时还可以兼收一定产量的紫云英绿肥。间混作紫云英种植模式较单播油菜处理籽粒产量降幅为4.12%-8.82%,差异未达到显著水平。油/肥间作模式稻田土壤肥力有提升趋势,表现为土壤全氮、速效磷、速效钾、有机质含量有升高趋势。稻-油/肥间作模式当年直接收益有降低趋势,降幅244Yuan/ha,稻-油/肥混作模式收益有增加趋势,增幅701Yuan/ha。
  (2)油菜与紫云英间、混作的种植模式对当季油菜养分吸收无明显影响,对后季养分吸收、利用均有促进作用。稻谷中的氮、钾含量较油菜单种模式有增加趋势,增幅分别为8.03%、16.96%;8.35%、7.9%。紫云英与油菜间混作后后季水稻养分(N、P、K)利用效率均有高于单播油菜处理的趋势。油菜秸秆及兼收的绿肥还田有提高后季水稻产量的趋势,增加幅度为4.62%~7.73%。
  (3)油菜与紫云英混作,油菜收获后秸秆及紫云英还田可以替代水稻15%-30%的化肥,同时肥料的利用效率较常规施肥均有增高趋势,且70%CF处理水稻肥料回收利用效率、偏生产力较常规施肥处理有显著提高。水稻产量较常规施肥处理仍有增加趋势,增幅为1.54%~8.50%,节本增效841~1111Yuan/ha,同时土壤肥力有提高趋势,土壤全氮、速效磷、速效钾、有机质均有不同程度的增加趋势。
  综上所述,油菜与紫云英混作,不会降低油菜产量,同时可以兼收部分紫云英作绿肥,与油菜秸秆共同还田可以部分替代水稻季的化肥,并能保持水稻产量有增加趋势,增加稻-油轮作体系周年经济收入。
[硕士论文] 常娜
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:黄花苜蓿具有抗旱、耐寒、耐盐碱等优良特性,是苜蓿抗性育种的重要种质资源,也是十分重要的基因库。NAC转录因子是植物中特有的转录因子家族之一,在植物生长发育、成熟以及适应逆境胁迫中发挥重要作用。本研究克隆获得了黄花苜蓿MfNAC35基因启动子区序列,分析发现其含有抗逆调节相关作用元件。Real-time PCR分析显示MfNAC35在黄花苜蓿根部的表达量较大,在茎中的表达量较少,且在根、茎、叶中的表达均被盐和干旱胁迫上调。酵母实验结果显示MfNAC35具有转录激活功能,且功能域位于蛋白的C端。以植物双元表达载体pBI121(35S-NOS)为骨架,构建超表达载体pBI121(35S-MfNAC35-NOS),利用农杆菌介导叶盘转化法转化本氏烟草,PCR鉴定筛选获得15株T0代转基因植株,RT-PCR分析显示MfNAC35已在T0代转基因植株中获得表达,且盐或干旱胁迫可调节烟草抗逆相关基因CAT、SOD、P5CS表达的上调,初步表明MfNAC35可能是通过调节抗逆相关基因的表达,进而参与调节抗逆性的分子机理。
[硕士论文] 刘佳月
饲草遗传育种与种子科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:紫花苜蓿适应性广、根系发达、品质好、营养丰富、生产利用价值大,被誉为“牧草之王”,其蛋白质、能量、矿物质和维生素的含量能够满足多种家畜生产的营养需要,是当今牧草研究领域的热点草种。黄花苜蓿在我国分布广泛,虽然其再生性及生产性都低于紫花苜蓿,但因其耐瘠薄、抗旱性强,适宜在干旱地区推广种植。近年来,苜蓿的栽种面积不断扩大,成为我国草产业发展中的支柱产业。但是,在苜蓿生长过程中,通常会受到干旱胁迫的影响,导致产量下降甚至死亡,因此研究干旱胁迫对苜蓿生长发育的影响及苜蓿自身对干旱胁迫的响应具有重要意义。干旱胁迫可发生在苜蓿生长发育的各个阶段,并影响苜蓿的形态建成,是苜蓿生产的重要限制因素。
  本研究以课题组自主培育的抗旱型紫花苜蓿(M1)和抗旱型黄花苜蓿(M2)品种为材料,基于聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫下苜蓿在形态、生理上的响应,对M1、M2苗期根系进行了转录组分析,研究M1与M2的抗旱性,并揭示二者抗旱性差异产生的生理及分子生物学基础,初步挖掘了苜蓿的抗旱基因。主要研究结果如下:
  (1)在不同浓度(4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%、32%)的PEG-6000模拟干旱胁迫条件下,随着PEG胁迫浓度的增加,紫花苜蓿和黄花苜蓿的发芽率、相对发芽率、发芽势、发芽指数都呈下降趋势,在处理浓度为12%时,二者的大多数种子萌发指标与对照相比差异显著,12%的PEG浓度为二者苗期模拟干旱胁迫的最适浓度。
  (2)12%PEG干旱胁迫处理下,紫花苜蓿的电导率、MDA含量在多个处理时间点高于黄花苜蓿,紫花苜蓿的细胞膜受损程度大于黄花苜蓿;二者的SOD、POD、CAT活性均表现为先升高后降低的趋势,两种苜蓿22日龄的幼苗,在12%PEG处理6h时已经产生干旱胁迫,处理18h的干旱胁迫程度达到了它们能够自我修复的极限。
  (3)对12%的PEG干旱处理6h和18h的紫花苜蓿苗期根系进行转录组测序,获得94739个unigene,N50为1167bp。对照组有82408(8698%)个基因表达,6h处理有87841(92.72%)个基因表达,18h处理有87869(9275%)个基因表达。经过蛋白编码框预测与序列注释,共得到65846条有注释结果的unig ene蛋白。6h胁迫与对照相比有9346个差异基因,胁迫18h与对照相比有19443个差异基因,胁迫6h与18h处理之间表达量显著差异的基因3462个。
  (4)对12%的PEG干旱处理6h和18h的黄花苜蓿苗期根系进行转录组测序共得到114347个unigene,N50为1130bp。对照组有103077(9014%)个基因表达,6h处理有102658(8978%)个基因表达,18h处理有102608(89.73%)个基因表达。经过蛋白编码框预测与序列注释,共注释得到74900条unigene蛋白。6h胁迫处理与对照相比有6180个差异基因,18h胁迫处理与对照相比有6534个差异基因,6h与18h胁迫处理之间共有1050个差异表达基因。
  (5)通过对M1和M2干旱胁迫的转录组测序结果进行比较分析,获得两种苜蓿同源基因家族27848个,同源基因65812个;GO分析主要富集到在生物过程本体中的细胞加工、响应刺激等条目,细胞组分本体的各条目均未被显著富集;在分子功能本体中,结合和催化活性条目上富集到的差异表达基因最多。KEGG富集分析显著富集到植物-病原菌的交互和氰氨基酸代谢。
[硕士论文] 崔会婷
饲草遗传育种与种子科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:植物细胞色素P450(CYP450)超基因家族编码的单加氧酶参与多种催化反应,在植物防御非生物胁迫中具有重要作用。本文分析了豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中MtCYP450表达特性及功能,以期为改善豆科牧草耐盐性提供参考。主要研究结果如下:
  1、克隆蒺藜苜蓿MtCYP450并进行生物信息学分析。该基因编码508个氨基酸,蛋白分子量为58.31kDa,等电点为685。二级结构主要由α-螺旋(约44%)组成,β-折叠、转角结构和无规则卷曲分别约占20%。序列同源性分析显示,蒺藜苜蓿MtCYP450与豆科植物狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolus)和大豆(Glyctne max)中的CYP94亚家族氨基酸序列同源性较高,依次为75.7%和739%。因此,MtCYP450属于细胞色素P450的CYP94亚家族。
  2、分析MtCYP450在蒺藜苜蓿不同组织中的表达量及对胁迫处理的反应。荧光定量PCR结果显示MtCYP450在苜蓿根、茎、叶、花和果荚中均有表达,其中叶片中表达量最高,根中最低,仅为叶片的12%。在胁迫处理(200mM NaCl、5%PEG、100μM ABA和100μM MeJA)后,叶片中MtCYP450基因表达量显著上升。因此,蒺藜苜蓿MtCYP450受以上胁迫诱导表达。
  3、获得耐盐性增强的超表达tCYP450拟南芥。构建超表达载体pBI121-tCYP450,转化拟南芥并获得8个阳性转基因株系。qRT-PCR证明转基因株系中外源MtCYP450在拟南芥中成功转录。T2代超表达MtCYP450拟南芥在NaCl和PEG处理后MtCYP450表达量均上升。对转MtCYP50拟南芥的生长情况分析显示转基因拟南芥在NaCl(125mM)处理后根长是野生型的163倍,表明MtCYP450增强了拟南芥根系的耐盐性。
  4、分别获得了超表达和敲除MtCYP450基因的转基因苜蓿。将表达载体pBI121-MtCYP450转化蒺藜苜蓿,通过基因组水平和转录水平鉴定获得32个超表达M4tCYP50蒺藜苜蓿株系。同时,利用CRISPR/Cas9技术,构建基因敲除表达载体pRGEB31-MtCYP450并转化蒺藜苜蓿。测序结果表明已获得12个MtCYP450基因敲除的突变植株株系。该材料将用于蒺藜苜蓿MtCYP50基因耐盐性研究。
[硕士论文] 张喜斌
生物化学与分子生物学 宁夏大学 2018(学位年度)
摘要:本论文以60份紫花苜蓿材料为研究对象,对其进行了苗期的耐盐性评价及不同耐盐品种紫花苜蓿的遗传多样性分析,旨为紫花苜蓿新品种培育和种质资源开发利用提供理论依据。主要研究结果如下:
  (1)紫花苜蓿苗期的耐盐性评价:
  以60个国内外紫花苜蓿品种为试材,通过表型鉴定的方法初步筛选出5个耐盐、5个敏盐品种;利用IBM SPSS Statistics19软件对初步筛选出的品种的叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量、根长与株高的相对抑制率进行主成分分析、隶属函数、系统聚类等方法进行分析。根据综合评价值(D值)对耐盐性进行强弱排序,结果表明:在100mmol·L-1NaCl胁迫下,秘鲁>Asi>草原3号>兴平>国产苜蓿;在250mmol·L-1NaCl胁迫下,巨能>阿迪娜>巨能7号>骑士T>抗旱15。对D值进行聚类分析,结果表明:5份敏盐材料可划分为3类:秘鲁、Asi、草原3号为一类,属于强耐盐性;兴平为一类,属于中度耐盐性;国产苜蓿为一类,属于弱耐盐性;5份耐盐材料可划分为3类:阿迪娜和巨能为一类,属于强耐盐性;巨能7号为一类,属于中度耐盐性;抗旱15和骑士T为一类,属于弱耐盐性。
  (2)不同耐盐品种紫花苜蓿遗传多样性分析:
  ①用SSR分子标记的方法对5份耐盐紫花苜蓿材料和5份敏盐紫花苜蓿材料进行遗传多样性分析结果表明:从42对微卫星引物中,经过筛选获得具有多态性且条带清晰的微卫星引物有9条;利用9条微卫星引物在10个紫花苜蓿品种110个单株中共检测到738个位点,其中单态性位点331个,多态性位点407个,总多态位点百分率为55.149%;有效等位基因观察数与等位基因观察数的比为0.521;平均杂合度为0.799;平均香农指数为1.886;平均多态性息含量为0.799;利用IBM SPSS Statistics19软件对10份紫花苜蓿品种的平均多态位点百分率、平均杂合度、平均PNe/Ao、平均香农指数、平均多态性息含量进行综合评价,根据综合评价值(D值)对10个紫花苜蓿品种内的遗传变异程度大小排序:巨能>骑士T>巨能7号>Asi>兴平>阿迪娜>秘鲁>抗旱15>草原3号>国产苜蓿,说明这10份紫花苜蓿材料具有较高的遗传多样性。
  ②材料间的遗传分化系数(Gst)为0.100说明这10份紫花苜蓿材料的绝大部分遗传变异都发生在各品种的内部。
  利用MEGA6.0软件对Nei遗传距离进行Neighbor-Joining(NJ)、Minimum Evolution(ME)、UPGMA聚类分析可知:5份敏盐材料始终聚为一类,说明这5份材料的亲缘关系较近;巨能与巨能7号聚为一类说明它们的亲缘关系较近;抗旱15在NJ和ME聚类分析中始终相对独立与其他材料间的遗传距离较大亲缘关系较远;在ME聚类分析中阿迪娜和骑士T聚为一类而在UPGMA聚类分析中阿迪娜和抗旱15又聚为一类。说明阿迪娜与抗旱15和骑士T有较近的亲缘关系。
[博士论文] 骆凯
草学·饲草学 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:草木樨(Melilotus spp.)是一种广泛分布的豆科草本植物,具有较强的适应性和良好的抗旱、抗寒、耐贫瘠能力。黄花草木樨(M. officinalis)和白花草木樨(M. albus)是该属最常见的栽培种,具有优良的饲用潜质。但目前国内的草木樨品种含有较高香豆素,严重影响了其饲用价值。鉴于此,本研究以黄花草木樨和白花草木樨为材料,在系统评价草木樨种质引种适应性和香豆素含量基础上,研究了 F1代半同胞家系关键性状的数量遗传特性,分析了香豆素生物合成相关的差异表达基因,研究了种植株距和磷肥对种子产量的影响;以期为低香豆素草木樨遗传育种提供理论依据和材料支持,也为更好了解香豆素生物合成机理提供基础。主要研究结果如下:
  1.在甘肃省榆中对国内外引进的101份草木樨种质的适应性评价结果表明,有95份种质可成功建植,株高、干重、叶茎比、香豆素含量、白粉病抗性和生长习性在种质间存在显著的基因型变异。进一步分析19份优异二年生种质的农艺和品质性状的结果表明,株高、干重、灰分、香豆素含量变异较大;主成分和聚类分析将19份种质分成5类。
  2.在甘肃榆中和临泽两地对两种草木樨F1代半同胞家系进行了干重等产量相关性状以及香豆素含量的测定和数量遗传分析。用基于 REML的混合线性模型拟合的数据计算所测性状的遗传方差组分,所测性状都存在显著的基因型变异,其中,干重、株高、分枝数、茎粗和春季活力等性状受到显著的基因型×环境互作影响。进一步通过模式分析(pattern analysis)分别获得高产、低香豆素黄花草木樨11份和白花草木樨8份。使用Smith-Hazel选择指数对后代的干重、株高、分枝数和叶面积(在本研究中代替香豆素)预测显示,上述4个性状的在一个选择周期获得的预期遗传增益率分别为10.9%、3.5%、6.4%和-1.0%。
  3.对香豆素含量存在显著差异的5份白花草木樨近等基因系(NILs)进行RNA Seq分析,共获得104358条unigenes,其中2095条为差异表达基因(DEGs)。香豆素含量相近的种质其差异基因表达趋势相似。通过 KEGG分析鉴定出与香豆素合成途径相关的候选unigenes共111个;与香豆素含量变化相关的unigenes,编码到己糖激酶、脱落酸受体、苯丙氨酸裂解酶和过氧化氢酶等。初步提出了白花草木樨香豆素生物合成的基因表达通路,并对相关基因进行了qRT-PCR验证。
  4.在甘肃河西走廊地区连续两年研究了不同株距(30、45、60 cm)以及不同施磷肥量(0、40、80、120 kg/hm2P2O5)对黄花草木樨两个品种的种子产量及产量构成因素的影响。结果表明:株距和施肥以及二者的互作极显著影响供试品种的实际种子产量。两年平均种子产量,品种‘天水’在60 cm株距和80kg/hm2施磷肥条件下最高,为1234 kg/hm2;而品种‘Norgold’在45cm株距、80 kg/hm2施磷肥条件下的最高,为1520 kg/hm2。通径分析表明,对种子产量影响最大的种子产量构成因素为生殖枝数。
[硕士论文] 杨雪梅
农业推广 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:我国地形复杂,国土面积宽阔,土壤和气候类型多样,可利用耕地面积少。我国盐碱地面积达到可利用耕地面积的5%,如何充分利用盐碱地,并且有效改良盐碱地,是现如今的一个关键问题。紫花苜蓿是一种多年生豆科牧草,连续多年种植可以有效改良盐碱地,减少盐碱地表层土壤的盐分含量,提高土壤肥力。作为我国种植分布最广、面积最大的饲草之一,其种植产业是畜牧业良好发展必不可少的组成部分。
  本试验以陕西爱德生态农业有限公司在渭南市大荔县种植的两年限紫花苜蓿WL3060及其土壤为研究对象,对三类不同的土壤,标记为A、B、C,分别进行0-200 cm土层深度取样,测定每个土层的含水量,pH值,电导率,含盐量、全氮、全磷、全钾以及土壤有机质含量,对比三类土壤主要的理化养分状况,了解三类不同土壤紫花苜蓿的生长情况。同时,对各类土壤的紫花苜蓿在初花期时刈割,进行产量、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、无氮浸出物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的测定,并计算干物质采食量,干物质消化率以及相对饲用价值。分析不同土壤主要特性对紫花苜蓿产量品质的影响,探究紫花苜蓿产量品质差异的原因,为今后大田生产合理施肥、刈割提供科学依据,对指导紫花苜蓿的实际生产,及其产业发展具有重要意义。试验得出以下结果:
  1.0-60 cm土层土壤含水量平均值分别为:C:17.46%>B:12.84%>A:7.63%;土壤pH平均值分别为:C:8.33>A:8.09>B:7.64;土壤全氮含量平均值分别为:B:358.78 mg/kg>A:262.30 mg/kg>C:112.86 mg/kg;土壤全磷含量平均值分别为:A:584.07 mg/kg>B:555.99 mg/kg>C:482.86 mg/kg;土壤全钾含量平均值分别为:B:19155.55 mg/kg>A:14734.66 mg/kg>C:4764.14 mg/kg;土壤有机质含量平均值分别为:B:107.14 mg/kg>A:67.35 mg/kg>C:31.29 mg/kg;0-30 cm土层土壤含盐量平均值分别为:C:2.18%>A:1.00%>B:0.58%。
  2. A地紫花苜蓿干草产量4290.0 kg/hm2,粗蛋白23.89%,粗脂肪1.95%,粗灰分10.84%,粗纤维29.29%,无氮浸出物34.03%,中性洗涤纤维42.89%,酸性洗涤纤维19.00%,相对饲用价值161.08%;B地紫花苜蓿干草产量3894.2 kg/hm2,粗蛋白18.56%,粗脂肪1.26%,粗灰分9.88%,粗纤维38.05%,无氮浸出物32.25%,中性洗涤纤维56.57%,酸性洗涤纤维23.06%,相对饲用价值118.24%。A地紫花苜蓿干草产量、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、无氮浸出物、干物质采食量、干物质消化率、相对饲用价值显著高于B地(P<0.05),A地紫花苜蓿粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维显著低于B地(P<0.05)。
  3.紫花苜蓿干草产量,粗蛋白含量,相对饲用价值与0-200 cm土层土壤含水量之间呈负相关关系,与0-100 cm土层土壤含水量呈极显著负相关(P<0.01),10 cm土层相关系数最大;与30-60 cm土层土壤pH呈极显著负相关(P<0.01),60 cm土层相关系数最大;与0-20 cm土层土壤含盐量呈极显著负相关(P<0.01),10 cm土层相关系数最大;与0-200 cm土层土壤全氮含量呈正相关,与10 cm、30 cm土层土壤全氮呈极显著正相关(P<0.01),30 cm土层相关系数最大;与100 cm土层土壤全磷含量呈负相关,与其余土层呈正相关,与30 cm土层土壤全磷含量呈极显著正相关(P<0.01),相关系数最大;与0-200 cm土层全钾含量呈正相关,与10 cm土层土壤全钾含量呈极显著正相关(P<0.01),相关系数最大;与0-200 cm土层土壤有机质含量呈正相关,与10 cm土层土壤有机质含量呈极显著正相关(P<0.01),相关系数最大。
  综上所述,根据大荔不同土壤主要特性,综合考虑紫花苜蓿实际干草产量与品质,在本试验条件下,土壤含水量存在明显差异,土壤盐碱化程度与有机质含量不是限制紫花苜蓿产量与品质的主要原因。
[博士论文] 任海龙
草学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:苜蓿属(Medicago)大约有87个种,包括了最重要的豆科牧草——紫花苜蓿(Medicago sativa)和豆科模式植物——蒺藜苜蓿(Medicago truncatula),在畜牧业生产和农业中占有重要地位。金花菜(Medicago polymorphaL)属豆科苜蓿属一年生苜蓿,由于低光周期敏感性和春化性而广泛分布于世界各地。金花菜除能固定大气中的N2,生产出高质量的牧草外,还具有土壤修复、培肥地力、防止水土流失等作用,被广泛应用于牧草、饲料、绿肥、草地农业系统、冬季覆盖作物和救荒牧草等领域。除此之外,金花菜还有很多优良的农艺性状:如土壤和气候的适应性、持久性、良好的冬季生长能力和耐放牧等,可用于过度放牧或焚烧后退化草场的恢复,被认为是苜蓿改良的重要遗传资源。近年来,随着人们对食品安全的关注,金花菜作为绿色有机食品,日益受到消费者的喜爱和政府的重视,以市场为导向的金花菜产业迎来了前所未有的发展,种植面积不断扩大,总产不断增加,加工产品也越来越丰富,是极具发展前景的多用途豆科牧草。相比快速发展的产业化进程,金花菜的遗传育种工作明显滞后,生产上仍以地方乡土品种为主,缺乏品质优良的高产品种,生产中存在诸多问题尚待解决。开展金花菜的遗传多样性及遗传图谱构建无论是对金花菜的品种选育,还是对其他一年生苜蓿,乃至在多年生紫花苜蓿的理论研究都具有重要的参考价值。
  本论文的主要研究结果如下:
  (1)以不同来源的5份金花菜种子为试验材料,研究其在不同温度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)条件下的萌发情况。结果表明,种子硬实是限制金花菜萌发的主要因素,不同来源金花菜种子的硬实度差异较大,破除种皮可明显提高金花菜的萌发率;金花菜种子在20℃时萌发率最高,40℃时不能萌发,25℃时幼芽生长最快。
  (2)不同来源的金花菜在株高、分枝数、叶长、叶宽和刈割产量上普遍存在差异。金花菜草产量与第二次刈割产量呈极显著正相关,不同刈割茬次间存在补偿作用。金花菜的主要农艺性状对草产量的影响以第二次刈割产量最大,其后依次为株高、第三次刈割产量、第一次刈割产量、分枝数、叶长、叶宽、第四次刈割产量和根长。
  (3)金花菜在叶长、叶宽、株高、分枝数、茎粗、茎叶比、鲜重、干重、鲜干比等性状中存在着丰富的遗传变异,其中株高和分枝数的变异最大,可作为区分不同金花菜材料的重要形态学指标。相关性分析表明:叶长、叶宽和株高呈极显著显著正相关;分枝数、茎粗和茎叶比呈极显著正相关;鲜重和干重呈极显著正相关;茎粗与鲜重和干重呈著正相关。该结果对金花菜基于表型性状的品种选育具有重要的指导作用。
  (4)通过高通量测序共获得包括23.68 Mb个读长的6.26 Gb的数据量,87,207个高质量的SLAF标签,其中25,616个SLAF标签为多态性标签,平均测序深度为11.37×。在25,616个多态性SLAF标签中,共获得SNP标记52,237个。研究结果表明,金花菜的核酸多样性(θω=0.0045 andπ=0.0043)水平与蒺藜苜蓿相当。通过全基因组SNP标记可以把10份不同来源的金花菜材料分成野生型、栽培型和中间型3个类群,这种划分与基于表型性状的聚类相一致,但与地理来源不相关。野生型可能是栽培型的祖先种,并且具有较高的核酸多样性,栽培型和野生型类群遗传分化明显,群体间基因交流很少。本研究开发了大量的SNP标记,这些全基因组SNP标记将为我们更好的理解金花菜的遗传驯化历史及种群间的关系提供帮助。
  (5)以金花菜材料“海安”为父本,“温岭”为母本,进行人工杂交,构建了一个由124个单株组成的F2代作图群体。测序共得到85.18 Gb原始数据,包括了453.95M的长度在100 bp左右双端读长数据。通过信息分析,共得到261,501个SLAF标签,其中多态性的SLAF标签23,221,多态率为8.88%,亲本平均测序深度为32.39×;子代平均测序深度8.27×。在23,221个多态性SLAF标签中,有17,345个标签成功通过基因型编码,占74.70%。通过筛选去除质量低、缺少亲本信息、严重偏分离和其他不适合构建图谱的标记,最终共有2,408个SLAF标记连锁到图谱上。最终构建了含有7个连锁群,总图距839.01 cM,平均图距0.35 cM的高密度金花菜遗传连锁图谱。遗传图谱的标记总数为2,408个。最大的连锁群LG6,有324个标记,覆盖195.28 cM,相邻标记间最大距离为0.60 cM; LG1是最密的连锁群,包括760个标记,相邻标记间的平均距离为0.19 cM;最小的连锁群是LG4,含有162个标记,长度65.68 cM,相邻标记间的平均距离为0.35cM。本研究构建了金花菜首张遗传连锁图谱,这张高密度遗传图谱将为金花菜重要性状的QTL定位、比较谱图的构建和分子标记辅助育种提供帮助。
  同时,本研究共定位了与金花菜产量相关的7个农艺性状的9个QTLs,分别位于LG1、LG3和LG6上,包括控制叶长的2个QTLs、控制叶宽的1个QTL、控制分枝数的1个QTL、控制株高的1个QTL、控制初花期天数的1个QTL、控制单株干重的1个QTL和控制单株荚重的2个QTLs。
[硕士论文] 张振亚
园林植物与观赏园艺 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:南方型紫花苜蓿(Medicago sativa‘Millennium’)属于多年生异花授粉豆科草本植物,是滩涂覆绿的先锋植物,同时也有较好的水土保持效果,具有很好的挖掘和培育潜力。因此本研究通过预实验,以南方型紫花苜蓿30天苗龄的实生苗为实验材料,在250mmol/l盐溶液处理下,根据设立0h、24h、48h、72h、96h这5个时间处理梯度,测定生理指标,确定最佳盐处理的组合。研究实验结果如下:
  1、本研究首次将同位素相对标记与绝对定量技术结合双向液相色谱与串联质谱定量蛋白质组学技术,筛选出紫花苜蓿中可能潜在的耐盐蛋白。结果阐明,两次重复性实验均鉴定到定量蛋白3712个,其中变化倍数在1.2以上且超几何统计结果p≤0.05的蛋白具有统计学意义,其中包括417差异蛋白发生显著性表达变化,291个蛋白表达上调,126个蛋白表达下调。
  2、根据基因本体注释体系GO中的三个本体类目,对差异蛋白进行功能注释,揭示其主要生物学作用。京都基因与基因组百科全书数据库分析,结果表明代谢途径、次生代谢产物生物合成、吞噬体、脂肪酸代谢和光合作用等这些途径上有较为显著的富集(P<0.05,错误发现率(False discovery rate,FDR)<0.05)。在总体上调表达的蛋白中包含抗氧化物、能量产生与转运、防御和信号传递和代谢等功能蛋白。在总体下调表达的蛋白中,包含光合途径相关、蛋白加工、降解与合成等相关功能蛋白。成功鉴定的差异蛋白分别涉及光合(7%)、信号传递(3%)、防御(2%)、碳水化合物代谢(11%)、氨基酸代谢(7%)、脂类代谢(5%)、其它代谢(7%)、蛋白质合成、加工与降解(18%)、细胞结构、分裂和细胞骨架(3%)、抗氧化物(6%)、能量产生与转运(7%)、膜和胞内运输(7%)及未知功能蛋白类(16%)。
  3、本研究发现细胞色素P450(AES77744.1)、PSⅡ放氧增强蛋白(KEH20462.1,AES94818.1,KEH20462.1)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(AES71155.1)、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(KEH28149.1)、甘露糖-6-磷酸还原酶(AES74599.2)、海藻糖-6-磷酸合成酶(AES89804.1)、天冬氨酸转氨酶(KEH28759.1)、E3泛素连接酶(AET05535.1)和H+-ATP酶C亚基蛋白基因(AET05535.1)等可能是紫花苜蓿潜在的耐盐蛋白,这为日后的研究提供了新的靶标。采用定量蛋白技术和双向液相色谱与串联质谱技术,可以科学地分析紫花苜蓿的耐盐性蛋白,运用生物信息学技术初步阐明盐胁迫蛋白在紫花苜蓿生命过程中的作用机制,为创制南方型紫花苜蓿耐盐新品种奠定基础。
[硕士论文] 裴翠明
园林植物与观赏园艺 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:中国海域辽阔,滨海盐碱地只有小部分被利用耕种,大部分还为荒地和海涂地,海岸带拥有大量的盐碱土待开发利用,是重要的后备土地资源。滨海盐碱地改良和生态绿化是中国沿海城市化进程中一项异常艰巨的重要难题。根据近年来国内外实践经验,筛选耐盐植物是进行滨海盐碱地生物改良和生态绿化最具光明前景的经济有效的方法。紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是一种具有较强耐盐性的豆科植物,栽培历史悠久,在全球广泛种植,具有一定的观赏价值,是进行盐碱地改良和园林绿化的理想植物。本研究以高秋休眠级南方型紫花苜蓿‘Millennium’的耐盐突变体为材料,进行转录组测序分析,筛选盐胁迫响应差异基因,并对其进行GO功能显著性分析、KEGGPathway显著性富集分析和转录因子分子,已期探究耐盐相关基因参与的主要生物学功能和代谢途径,为进一步研究紫花苜蓿耐盐分子机制,培育耐盐新品种奠定基础。本研究结果如下:
  1、通过对南方型紫花苜蓿耐盐突变体幼苗进行250mmol/L NaC1处理0、24、48、72和96h时生理指标的测定,发现在盐胁迫72h内,叶片相对含水量持续降低,脯氨酸含量、相对电导率、MDA含量和SOD活性持续升高;在盐胁迫大于72h后,叶绿素含量和SOD活性明显下降,脯氨酸含量、相对电导率和MDA含量升高幅度增大。表明250mmol/L NaCl处理72h是紫花苜蓿耐盐突变体幼苗盐胁迫响应的最佳时间,为接下来耐盐分子机制研究提供了依据。
  2、利用RNA-Seq技术,经过250mmol/L NaCl胁迫72h,南方型紫花苜蓿耐盐突变体幼苗叶片样品中共检测到30900个基因表达量发生改变,其中7694个基因被定义为差异基因(4187个基因上调表达,3507个基因下调表达),包括隶属于50个转录家族的422个转录因子(268个转录因子上调表达,154个转录因子下调表达)。
  3、实时荧光定量PCR验证表明,随机选择的8个差异表达基因在盐胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致,表明了转录组测序数据的可靠性。
  4、GO功能显著性分析显示,差异表达基因的生物学功能主要表现在催化活性、结合、细胞组分、细胞、代谢过程和细胞过程。KEGG Pathway显著性富集分析显示,差异表达基因广泛涉及代谢途径和次生代谢产物生物合成。候选出MsGST、MsL-APX、MsGPX、MsRLK、MsSIK、MsSnRK、MsCMLs、MsCMO、MsMIP、MsP5CS1、MsP5CS3、MsABCB、MsWBC、MsLEA3和MsPP2C等重要耐盐相关基因。转录因子分析发现,应答基因数量最多的是MYB基因家族,其次是WRKY、NAC、bHLH、AP2-EREBP和GRAS等基因家族。候选出MsA lfin-like、MsERF110、MsANT、MsbHLH36、MsNAI1、MsbZIP、MsC3H、MsGRAS、MsNAD、MsMYB、MsMYB85、MsNAC、MsRWP-RK、MsTrihelix和MsWRKY等耐盐相关转录因子。
[硕士论文] 张绮芯
农村与区域发展 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:磷在植物整个生命过程中扮演重要角色,而我国一半以上耕地中的有效磷均低于植物所需要的含量。苜蓿是我国畜牧产业重要的饲草资源,并且在生长过程中同样需要大量的磷,但目前耕地缺磷已经严重影响到畜牧业的发展。为了探究不同品种紫花苜蓿的耐低磷特性,并为今后苜蓿低磷适应机制研究及实际生产应用提供理论依据,克服苜蓿生产磷供应不足等问题。本研究首先选取了10个国内外紫花苜蓿品种,采用溶液培养法,以常磷(500μmol?L-1KH2PO4)为对照组,以低磷(5μmol?L-1KH2PO4)为处理组,低磷胁迫20d后检测株高、茎叶干重、茎粗、分枝数、总根长、根干重、根表面积、根冠比、磷含量、磷利用率、酸性磷酸酶活性(ACPA),并计算其耐低磷系数,进一步利用主成分与隶属函数分析了不同品种的耐低磷能力,最终筛选出耐低磷较强苜蓿品种和耐低磷较弱苜蓿品种。随后,本研究进一步对筛选出的耐低磷较强与耐低磷较弱品种在低磷胁迫10d、15d、20d时的生理生态性状进行了详细的分析调查,探索不同品种在应对低磷环境时的表现及适应机制,以期为提高苜蓿磷利用效率及磷吸收效率提供参考。本实验主要得到以下结果:
  (1)低磷胁迫处理20d时,不同品种间的各指标均存在显著差异,其中低磷限制了苜蓿的生长,相对于对照而言,具体表现为株高降低(耐低磷系数为0.6848~1.0219),地上部干重减少(耐低磷系数为0.4098~1.2781),茎粗减小(耐低磷系数为0.82~0.96),分枝数减小(耐低磷系数为0.75~1.22),总根长增加(耐低磷系数为0.60~1.10),地下部干重增加(耐低磷系数为0.4274~1.5954),根表面积增加(耐低磷系数为0.58~1.22),根冠比增加(耐低磷系数为0.9325~1.6983),磷含量降低(耐低磷系数为0.40~0.66),磷利用率增加(耐低磷系数为1.51~2.50),酸性磷酸酶活性增强(耐低磷系数为0.7423~1.4969)。经过主成分与隶属函数分析可知耐低磷强弱依次为敖汉、甘农3号、陇东、WL168、牧歌、骑士T、中苜1号、新牧1号、MF4020、维多利亚。
  (2)在低磷胁迫10d、15d、20d时,比较了耐低磷较强品种敖汉和耐低磷较弱品种维多利亚的低磷相关生理生态性状及低磷应激机制,结果显示,相对于常磷环境,低磷环境下敖汉与维多利亚的株高、茎叶干重、磷含量、蒸腾速率、光合效率、气孔导度都有所下降,但整体来看敖汉的降低幅度都小于维多利亚;敖汉与维多利亚的总根长、根表面、磷利用率、根干重,酸性磷酸酶活性高于常磷条件,且增加幅度大于维多利亚,说明维多利亚受低磷环境影响大,对低磷较敏感,敖汉更耐低磷。综上结果得出,敖汉在低磷环境下表现出较高的株高、茎叶干重、根干重、磷利用率、蒸腾速率来适应低磷环境,且这几个指标的耐低磷系数差异较显著,而维多利亚对磷比较敏感,耐低磷系数小于敖汉,耐低磷性比敖汉差。
[硕士论文] 刘博文
遗传学 哈尔滨师范大学 2017(学位年度)
摘要:微生物菌肥替代部分化肥是实现化肥减量的重要技术途径之一。本研究利用实验室前期筛选出来的4株优良PGPR菌株,制作单一和复合菌肥,并通过盆栽试验,选出对紫花苜蓿促生效果最好的菌株组合。分别利用生物炭、玉米芯为载体,研制PGPR固体菌肥。采用平板计数法,对其质量及适宜储存期限进行检测。通过田间试验,研究微生物固体菌肥替代部分化肥,与化肥配施后对农田土壤条件下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)生长状况及营养品质的影响。主要研究结果如下:
  1.不同PGPR菌肥对盆栽种植紫花苜蓿的促生效果分析
  与不施加菌肥的对照组相比,单一菌株和双接菌株组合均能不同程度的促进紫花苜蓿生长,其中C-7+MJM-11共生菌株组合促生效果最为显著。与对照相比,株高增加了23.19%,根长增加了53.18%,地上鲜重增加了41.95%,地下鲜重增加了20.53%,地上干重增加了51.30%,地下干重增加了41.38%。在品质方面,与对照组相比,粗蛋白含量增加了19.57%;粗纤维含量减少了13.43%;磷含量增加了29.70%。
  2.以生物炭为载体的PGPR固体菌肥部分替代化肥对紫花苜蓿生长及品质的影响
  以生物炭为菌肥载体,制备PGPR固体菌肥,通过不同处理的菌肥替代部分化肥,探究不同形态的微生物菌肥对紫花苜蓿生物量(株高和产量)和品质(粗蛋白和粗纤维)的影响。结果表明,与对照相比,各处理紫花苜蓿的株高和产量均有增加,紫花苜蓿的品质均有提高。其中生物炭固体菌肥C-7+MJM-11处理替代15%化肥对紫花苜蓿促生效果最为明显,紫花苜蓿两茬株高较对照组相比,分别提高了12.09%和20.65%,两茬干草总产量为10820.88kg/hm2,较对照增加了32.02%;两茬粗蛋白含量为:21.88%和21.48%,较对照分别增加了23.27%和23.09%;两茬粗纤维含量为:28.38%和28.57%,较对照分别减少了11.95%和12.20%。
  3.以玉米芯为载体的PGPR固体菌肥部分替代化肥对紫花苜蓿生长及品质的影响
  以玉米芯为菌肥载体,制备PGPR固体菌肥,通过不同处理菌肥替代部分化肥,探究不同形态的微生物菌肥对紫花苜蓿生物量(株高和产量)和品质(粗蛋白和粗纤维)的影响。结果表明,与对照相比,各处理紫花苜蓿的株高和产量均有增加,紫花苜蓿的品质均有提高。其中玉米芯固体菌肥C-7+MJM-11处理替代15%化肥对紫花苜蓿促生效果最为明显,紫花苜蓿两茬株高较对照组相比,分别提高了14.20%和19.58%;两茬干草总产量为10851.27kg/hm2,较对照增加了32.39%;两茬粗蛋白含量为:21.66%和21.58%,较对照分别增加了22.03%和23.66%;两茬粗纤维含量为:28.56%和28.55%,较对照分别减少了11.41%和12.23%。
[硕士论文] 申清湄
生物化学与分子生物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是一种非常抗旱、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠的豆科牧草,是高寒地区人工牧草种植和天然草地改良的理想牧草,是苜蓿抗性育种不可或缺的种质资源。因此,从中挖掘抗寒基因,揭示抗寒机制具有重要意义。本研究以黄花苜蓿和抗寒性较差的柱花草(Stylosanthes guianensis)为材料,参照黄花苜蓿和截型苜蓿低温响应基因表达谱,从黄花苜蓿中克隆了一个响应低温显著上调表达的未知功能基因MfCML24,获得过表达MfCML24的转基因柱花草,分析它们的表型及抗冷性,初步探讨该基因的功能。主要研究结果如下:
  采用定量RT-PCR方法,分析了MfCML24的时空表达特征,结果表明MfCML24在叶片当中的表达量最高,其次为叶柄,在茎和根中的表达量最低,大约只有叶片表达量的1/5左右。分析了黄花苜蓿和截型苜蓿叶片中CML24基因响应低温的动态变化,结果显示,低温处理1 h后MfCML24开始受到诱导,4h达到最大,而MtCML24基因不受低温诱导。对MfCML24、MtCML24基因的启动子序列的顺式作用元件进行比对,发现MfCML24启动子序列中除包含基本的启动子元件及大量的CAAT盒(与增强转录效率有关)外,还包含低温响应元件LTR、生长素、水杨酸和茉莉酸等植物生长激素、病原菌和盐诱导元件等,而MtCML24启动子中没有低温响应元件LTR。根据LTR元件的位置和5’端缺失法的原理,设计特异引物ZG1313、ZG1314和ZG5232将MfCML24基因启动子截成距离转录起始位点-220 bp、-926 bp和-200 bp三段,其中ZG5232引物将低温响应元件LTR换成非顺式作用元件。分别构建了它们调控GUS基因表达的载体,并获得了两株携带MfCML24p(200 bp)调控GUS基因表达载体的T1代转基因拟南芥。在线预测MfCML24蛋白是定位在细胞核上,通过MfCML24-GFP融合蛋白在水稻原生质体细胞的瞬时表达,确定MfCML24蛋白在细胞质和细胞核都有表达。
  将MfCML24完整编码区装载到带35S启动子的表达载体pZG103.1上,构建过表达载体。农杆菌介导法将过表达载体转化柱花草,从11个抗性愈伤组织中获得了转基因柱花草。通过PCR证明MfCML24基因和Bar基因已经整合到转基因柱花草基因组中;采用实时荧光定量PCR检测,表明MfCML24基因获得了表达。对过表达MfCML24基因柱花草T1代幼苗进行Basta抗性筛选,野生型植株全部死亡,转基因柱花草部分死亡。进一步检测了转基因柱花草的抗冷性,低温(8℃)处理6 d后,测定最大光化学效率(Fv/Fm)和相对电导率。低温处理后转基因柱花草Fv/Fm高于野生型,而相对电导率低于野生型,表明转基因植株的抗冷性高于野生型。
[硕士论文] 王晓雨
植物营养学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:紫云英与黑麦草混作是南方稻田绿肥生产中一种高效的种植模式,相比于单作种植,能够更加充分地利用资源,获得更高的生物量和氮磷钾养分累积量,翻压还田后为后季作物提供养分及培肥地力。本试验以黑麦草和紫云英为研究材料,通过土培试验和根箱试验,研究了紫云英与黑麦草混作对其生长、养分吸收及土壤磷有效性的影响,探索紫云英与黑麦草混作优势产生的机制,为紫云英与黑麦草混作提高土壤养分资源的利用和绿肥生产效率提供依据。主要研究结果如下:
  (1)紫云英与黑麦草混作种植方式对黑麦草的促进作用大于对紫云英的抑制作用,混作系统生物量表现出混作优势,施磷水平下混作优势更明显。
  (2)紫云英与黑麦草混作显著促进了黑麦草磷吸收累积,混作系统磷吸收量表现出混作优势,且低磷水平下混作系统磷吸收优势更高。相比于单作系统,低磷水平下盛花期混作系统磷吸收量增加了20.4%,施磷水平下盛花期混作系统磷吸收量增加了18.6%。
  混作显著提高了黑麦草氮和钾吸收累积量,混作黑麦草氮和钾增加量大于混作紫云英的减少量,混作系统表现出氮钾吸收优势,施磷水平下混作系统氮钾吸收优势更高。相比于单作系统,盛花期低磷水平下混作系统氮吸收量增加了28.6%,施磷水平下混作系统氮吸收量增加了31.6%。相比于单作系统,盛花期低磷水平下混作系统钾吸收量增加了24.5%,施磷水平下混作系统钾吸收量增加了38.6%。
  (3)相比于单作黑麦草处理,紫云英与黑麦草混作能够提高黑麦草根际土壤有效磷含量,混作紫云英根际土壤有效磷含量与单作处理之间变化规律不明显,混作根区土壤有效磷含量高于单作紫云英和单作黑麦草处理。
  紫云英与黑麦草混作能够降低黑麦草和紫云英根际土壤无机磷Al-P和Fe-P含量,对O-P和Ca-P影响不明显,混作促进了部分难溶性磷向有效态转化,且低磷水平下表现更明显。
  (4)紫云英与黑麦草混作能够促进混作根际土壤酸性磷酸酶活性的提高,具有降低根际土壤pH的趋势,是两种作物混作提高磷吸收富集能力的重要原因之一。
[硕士论文] 崔慧萍
遗传学 哈尔滨师范大学 2017(学位年度)
摘要:自噬(Autophagy)是真核生物细胞对损坏或废弃的细胞、细胞器以及蛋白质降解和再利用的重要生理过程,能够对细胞内物质进行周转,对维持细胞的动态平衡以及抵抗生物和非生物胁迫起到关键作用。低温严重影响了植物的生长发育,导致作物产量的下降,制约着农业生产的发展。本研究以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为材料,克隆得到MsATG13基因,将其连至表达载体pCBM,对烟草进行遗传转化。低温胁迫处理后,通过生理指标的检测,初步证明ATG13基因具有抗寒功能。具体研究结果如下:
  1.MsATG13基因的克隆与生物信息学分析
  利用RT-PCR的方法从紫花苜蓿中克隆得到了MsATG13基因的全长cDNA,MsATG13基因的全长为1686bp,编码561个氨基酸,并含有一个ATG13结构域。将其氨基酸序列在NCBI中BLAST分析,发现与MtATG13相比,氨基酸具有同源性,相似性为95%。且在ATG13结构域内有5个差异位点。
  2.MsATG13基因的植物表达载体构建
  利用植物表达载体pCBM构建了含有MsATG13基因的重组表达载体pCBM-MsATG13,含有CaMV35S启动子和植物草丁膦(PPT)抗性。
  3.MsATG13基因对烟草的遗传转化
  将pCBM-MsATG13质粒转入农杆菌EHA105中,采取农杆菌侵染叶盘法完成对烟草的遗传转化。经草丁膦筛选共得到了42株抗性植株。通过PCR的初步鉴定共得到了15株烟草阳性苗,并且通过qRT-PCR法对转基因烟草中基因的表达情况进行检测,其中6号、20号、21号三个株系表达量较高。
  4.转MsATG13基因烟草的抗寒性分析
  对转基因烟草进行低温胁迫处理,野生型烟草叶片出现严重萎蔫,转MsATG13基因烟草受伤害程度较轻。在冷胁迫下,转MsATG13烟草的相对电导率的值、丙二醛含量都明显比野生型低,并且其可溶性蛋白含量、脯氨酸含量及抗氧化酶的活性均比野生型高,表明MsATG13基因具有抗寒功能。
[硕士论文] 亓春宇
遗传学 哈尔滨师范大学 2017(学位年度)
摘要:紫花苜蓿(Medicago sativa L.)这一牧草品种在全球内种植面积都比较大,它的适口性好而且营养价值高,同样也成为中国东北地区栽培面积最广的牧草,但东北的冬天气温过低,苜蓿经常存在冻害和死亡的现象,这使得北方地区的牧草生产面临很大问题,因此在北方苜蓿品种的选育过程中,培育出抗寒性优良的品种就是特别重要的研究工作。
  抗寒性这个性状属于数量性状,由多基因控制,因于遗传背景的不同,苜蓿属各种间的抗寒能力也存在明显的差异。本研究以抗寒性不同的肇东苜蓿、WL323以及二者杂交所得到的190株F2代紫花苜蓿群体为试验材料,在田间种植,调查越冬率;对其进行24h和48h的人工低温胁迫并对抗寒相关生理指标进行测定,以期了解低温胁迫对紫花苜蓿生理特性的影响,了解各项指标之间的相互关系,了解各项指标对紫花苜蓿抗寒性影响的大小,为紫花苜蓿的抗寒性研究提供理论参考,为抗寒相关性状基因图谱的绘制及相关基因的数量性状定位(QTL)奠定基础。研究结果如下:
  1.低温胁迫下,肇东苜蓿和WL323的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性均呈先升高后降低的变化趋势,且肇东苜蓿的增幅大于WL323;两者体内的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及脯氨酸含量均呈现出逐渐增加变化趋势,且肇东苜蓿的增幅大于WL323,表现出与两者耐寒能力的正相关。
  2.对F2代群体的抗寒相关指标进行分离分析以及分布检验,发现F2代群体各指标均分离明显,存在双向超亲分离;各项抗寒相关指标都呈连续分布,总体接近正态分布,符合数量性状的遗传特点。
  3.运用SPSS21.0对190株F2代紫花苜蓿群体进行聚类分析,发现F2代单株间存在很大的变异。在欧式遗传距离4.78处,F2代群体被归为4大类,其中分别含有85个单株、3个单株、1个单株、1个单株;在欧式遗传距离3.58处,F2代群体被归为8大类,类群间差异较大。
  4.利用SPSS21.0对190株F2代紫花苜蓿群体进行越冬率与各项抗寒相关指标的相关分析,得出各指标之间并不是彼此独立的,而是相互关联的。F2代群体的越冬率与SOD活性、POD活性、脯氨酸含量呈极显著的正相关关系,与可溶性糖含量、可溶性蛋白含量呈显著的正相关关系。
  5.利用SPSS21.0对190株F2代群体进行各项抗寒相关指标对越冬率的通径分析发现,SOD活性对于F2代群体越冬率的影响主要是直接作用,通过其他生理指标的间接影响要小一些,而其他四个生理指标均是通过直接作用与间接作用共同对F2代群体的越冬率产生影响。
[硕士论文] 张敏
农村与区域发展 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:紫花苜蓿不仅可以作为高产优质的饲料创造经济效益,还可以作为绿色屏障防风固沙创造生态效益。我国紫花苜蓿的种植区域主要分布在西北地区,但该区气候干旱、土壤贫瘠且盐渍化严重,种植紫花苜蓿所需要的水肥条件差、种植成本较高。在目前实施“粮-经-草”的三元种植结构和立草为业的大背景下,培育抗逆性强的紫花苜蓿品种势在必行。
  液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)和H+-焦磷酸酶(VP)在植物细胞阳离子区域化中起着重要作用,超表达NHX或VP均可显著提高植株Na+的区域化能力从而增强其耐盐性和抗旱性。生长在干旱覆沙地上的强旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)正是因为具有极强的Na+区域化能力,所以能适应极端干旱环境。因此,本文以成功转入霸王阳离子区域化基因ZxNHX和ZxVP1-1的转基因新疆大叶紫花苜蓿(GM)和其野生型植株(WT)为实验材料,通过进行大田双因素裂区实验设计,比较未施肥、减半施肥和正常施肥3种不同施肥处理下WT和GM的株高、冠幅、分枝数、地上部干重以及水分利用率(WUE)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、净光合速率(Pn)、叶绿素含量和粗蛋白含量等营养指标,以此来评价GM的田间生产性能及营养品质,为其今后的推广建立初步依据。主要结果如下:
  1.随着施肥量的增加,GM的株高、地上部干重均显著增加;在各处理下,GM植株的株高、分枝数均显著高于WT植株。与WT植株相比,GM植株具有更强的生长和田间生产性能。
  2.WT的冠幅在减半施肥和未施肥处理下均显著大于GM,说明WT植株倾向于匍匐生长;而GM植株冠幅小,植株高大、倾向于直立生长。
  3.大田干旱条件下,相较于WT植株,GM植株体内能积累更多的叶绿素;正常施肥处理下,GM的WUE、Tr、Pn比WT分别高15.3%、20%和12.0%。随着施肥量的增加,GM和WT植株的Pn均显著升高;与减半施肥和未施肥处理相比下,正常施肥处理下GM的Pn分别升高了35.5%和54%;正常施肥处理下WT的Pn比减半施肥和未施肥处理高31.4%和56%。说明相较于WT,GM具有更强的光合作用能力。
  4.随着施肥量的增加,GM和WT植株的粗蛋白、粗灰分积累量也呈上升趋势;减半施肥和正常施肥条件下GM的粗灰分含量均显著高于WT;GM植株内粗蛋白含量在减半施肥处理和正常施肥处理下分别比比WT高11.8%和7.1%,说明在减半施肥处理下,GM植株作为饲料可以为家畜的生长发育提供更充足的蛋白质。
  5.酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)含量随着施肥量的增加呈下降趋势,减半施肥和正常施肥处理下GM植株体内的NDF含量比相同处理下的WT低19.2%和10.4%;在未施肥和减半施肥条件下,GM植株ADF的含量比WT低11.9%和22.5%,正常施肥处理下差异不显著。未施肥处理下,WT和GM的RFV差异不显著,在减半施肥和正常施肥处理下,GM的RFV显著高于WT,所以施肥后,与WT相比GM植株作为饲料具有更高的营养价值和营养平衡性能。
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