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[硕士论文] 杨红
生理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜(Brassica napus,AACC)是我国主要的油料作物之一,由白菜(Brassica rapa,AA)和甘蓝(Brassica oleracea,CC)天然杂交形成的异源四倍体物种。在甘蓝型油菜基因组中,大多数基因有多个拷贝,功能冗余严重,这阻碍了油菜基因组学的功能研究。CRISPR/Cas9基因组编辑技术广泛应用于动植物突变体的创制和基因的功能研究,但在甘蓝型油菜中CRISPR/Cas9产生的突变模式以及突变体的遗传特征尚不清楚。本研究中,我们针对12个甘蓝型油菜基因构建了10个CRISPR/Cas9基因编辑载体,以Westar为受体材料,对转基因株系的突变类型进行检测,分析了基因编辑在甘蓝型油菜中的模式、特异性和遗传规律。
  结果表明,在T0代转基因植株中,靶向单基因的sgRNAs平均突变频率为65.3%;靶向多基因的sgRNAs诱导突变的平均频率为66.3%。在T0代转基因株系中检测到多种基因型,其中基因型为纯合、双等位和杂合的株系,其突变位点以典型的孟德尔遗传规律稳定地遗传给下一代,并且在T1代中没有新的突变产生。在所有检测的T0代植株中发现了没有Cas9插入的一个突变体株系,这可能是由于Cas9的瞬时表达或者在愈伤组织再生过程中丢失所致。另外,在T0和T1代株系中未检测到脱靶情况的发生,表明CRISPR/Cas9介导的基因编辑在甘蓝型油菜中具有高度特异性。同时,对转基因材料的表型分析表明,赤霉素信号通路中的负调控因子BnaA6.RGA功能获得型突变体植株明显矮小;BnaRGA功能缺失型四突变体株高明显增高。
  以上结果表明,CRISPR/Cas9是一种有效的基因编辑工具,利用CRISPR/Cas9创制突变体大大加速甘蓝型油菜功能基因组学的研究,同时也为油菜的遗传育种提供重要的种质资源。
[硕士论文] 郭翔
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜隐性核不育系7365A是由两个位点控制的复等位遗传模式(BnaMs3/Bnams3,Bnams4a/Bnams4b/Bnams4c),其中BnaMs3和Bnams4a为恢复基因,Bnams4b为不育基因。Bnams4b会导致油菜雄蕊退化,不能产生成熟的花粉,BnaMs3则能恢复这种不育的表型,而且这种遗传模式在拟南芥也同样的适用。研究认为Bnams4a是在转录水平上调控Bnams4b表达,BnaMs3是在蛋白水平上与Bnams4b互作。BnaMs3的进化分析和遗传转化实验表明,BnaMs3是一个功能获得性变异基因,而且功能获得变异位点可能存在功能结构域TPR和Hop的六个氨基酸残基内。本研究利用CRISPR/Cas9技术对编码与BnaMs3和Bnams4b都互作蛋白的基因A41进行编辑,对BnaMs3的作用机理进行初步探究。另一方面对BnaMs3的六个预测功能变异位点定点突变,结合转有Bnams4b不育材料,探究BnaMs3的功能变异氨基酸位点和功能结构域。主要研究结果如下:
  1.A41基因编辑
  A41是编码通过酵母双杂实验筛选到的与BnaMs3和Bnams4b都互作蛋白的基因,A41有蛋白酶抑制剂功能报道,猜测它参与了BnaMs3恢复Bnams4b的过程。对野生型拟南芥的A41基因CRISPR编辑,结果获得了纯合A41编辑并且无转基因的植株。通过杂交方式转入BnaMs3和Bnams4b都存在的植株中,结果并没有得到预期关于育性改变的表型,推测A41可能并没有参与BnaMs3恢复Bnams4b的过程。
  2.BnaMs3功能变异氨基酸位点探究
  针对预测的六个BnaMs3功能变异氨基酸位点,分别构建六个BnaMs3的定点突变表达载体转化野生型拟南芥,并与转有Bnams4b的拟南芥杂交。对后代的表型观察和醋酸洋红染色结果表明,BnaMs3的321氨基酸位点突变之后,BnaMs3失去恢复功能,推测该氨基酸突变之后改变了BnaMs3的蛋白质结构,从而影响了BnaMs3的功能。
  3.BnaMs3在转录水平上调控Bnams4b的表达
  定点突变结果表明,在结构域TPR上的一个氨基酸变异,会导致BnaMs3失去恢复功能。TPR蛋白在质体发育和基因表达上有重要功能,参与了质体的RNA剪切。qRT-PCR结果表明,BnaMs3降低了Bnams4b表达水平。推测BnaMs3是在转录水平上调控Bnams4b的表达,BnaMs3作为TPR蛋白,恢复了质体的RNA剪切缺陷,从而解除了Bnams4b对质体的破坏使得育性恢复。
[硕士论文] 胡新鸽
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:角质层是保护植物适应外界胁迫的屏障,与植物的抗逆性有密切关系,角质是角质层的主要成分,也是角质层的基本结构,通过对角质的研究有助于阐明角质层形成和调控的分子机制,为角质层的功能研究奠定基础。本研究优化了油菜角质提取的方法,通过气相色谱-质谱技术(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术分析鉴定角质含量与成分,比较了两种环境下生长的油菜角质含量与成分的差异和油菜不同组织(茎,叶片,角果)中角质含量的差异,研究不同程度的干旱胁迫对8个抗旱性存在显著差异的油菜品种叶片角质的影响,并进行RNA-Seq测序检测油菜不同组织(根,茎,叶片,花,角果,种子)和干旱胁迫下的基因表达量,分析角质基因表达量,筛选出角质基因,并分析了398个油菜品种的角质含量与成分。
  主要研究结果如下:
  甲醇-浓硫酸-氯仿这种裂解液效果最好,分离鉴定出的角质单体成分最多,角质单体总量高于其他3种方法,适合用于油菜角质提取。
  实验田种植的油菜叶片的角质成分较为全面,且大多数角质成分的相对含量高于温室的。
  在中双11号油菜的角果,茎和叶片检测到81个角质单体,角果,茎和叶片中角质成分相对含量最高的都是2-hydroxy-Tetraco sanoic acid。其中Tetradecanoic acid、14-methyl-pentadecanoie acid、2-hydroxy-Tetracosanoic acid、hexadecanoic acid、20-methyl-2-hydroxy-docosanoic acid5种角质成分相对含量在角果,茎和叶片中差异较大。
  采用RNA-Seq测序技术分析中双11号油菜不同组织中基因表达量,经过对118个角质合成相关的基因表达情况的分析,结果表明有6个基因在不同组织中均无表达。BnaA05g09070只在种子中特异性表达,BnaC05g04230D只在花中特异性表达。其中BnaCnng13910D在根中和叶片中的表达量最高,BnaA04g20340D在花中的表达量最高,BnaC04g51420D在茎中的表达量最高,BnaA02g32750D在角果和种子中的表达量最高。
  比较8个油菜品种在不同干旱条件下角质含量。随着干旱胁迫程度的加深,与对照组相比,干旱胁迫组的角质总量呈现升高的趋势,而且在这8个品种中有27个角质成分的相对含量呈现显著性差异变化。
  分析中双11号油菜在干旱胁迫不同时间段(0h,1h,8h)的118个角质合成相关的基因表达量,有108个差异基因,其中有7个基因差异性显著,4个基因表达量显著上升,3个基因表达量显著下降。
  已经对398个品种油菜角质含量,成分进行分析,下一步对角质成分做全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)分析来定位一些与角质合成相关的位点。
[博士论文] 张彤
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:自交不亲和反应是高等植物进化出的一种阻止自花授粉、促进异花授粉的繁殖机制,有利于防止自交衰退,在育种及遗传上具有重要的研究价值。近年,甘蓝型油菜自交不亲和反应分子机制的研究取得了较大突破,然而其下游信号传导因子的鉴定仍非常有限。本研究以甘蓝型油菜Westar及拟南芥Col-0生态型为材料,利用序列分析、遗传转化、表达分析、酵母双杂交、转录组测序等手段,通过对亲和及不亲和反应信号传导途径的研究,成功鉴定甘蓝型油菜自交不亲和反应正调控因子BnCIMS1(Cobalamin-Independent Methionine Synthase1),为自交不亲和反应分子机制的研究提供了新的思路;同时证明了AtCIMS1在拟南芥自交不亲和反应中具有保守功能,为探索拟南芥属植物与芸薹属植物间自交不亲和系统的保守性提供新的证据。取得结果如下:
  1.BnCIMS1在甘蓝型油菜自交不亲和反应中的作用
  经共线性和进化树分析,发现CIMS1及其同源基因CIMS2的基因组序列和蛋白序列在十字花科物种中都是高度保守的。时空表达分析发现,BnCIMS1在甘蓝型油菜Westar柱头和茎的表达量最高,在其它部位表达量相对较低。BnCIMS2在Westar各部位中表达量极低,在柱头中几乎不表达。在甘蓝型油菜Westar柱头中通过RNAi技术下调BnCIMS1的表达,可部分打破甘蓝型油菜的自交不亲和性,说明BnCIMS1是自交不亲和反应的正调控因子。亚细胞定位结果显示BnCIMS1主要在胞质中表达。通过酵母双杂交技术验证BnCIMS1与自交不亲和反应相关基因BnSRK-1及BnARC1间的相互作用关系,发现BnCIMS1与两个基因间均无互作关系,说明BnCIMS1以一种新的未知途径调控自交不亲和反应。
  2.转基因自交不亲和拟南芥的创建及CIMS1功能保守性分析
  将自交不亲和A.halleri最显性的S13单倍型AhSRK13和AhSCR13以及自交不亲和相关基因AhARC1共同转入拟南芥Col-0生态型中,成功得到部分转基因自交不亲和拟南芥,而只转入AhSRK13和AhSCR13的转基因株系全部表现为自交亲和。说明ARC1确实为自交不亲和反应所必须。为验证AtCIMS1和AtCIMS2在拟南芥自交不亲和反应中是否具有保守功能,分别构建了转基因自交不亲和拟南芥与cims1、cims2T-DNA插入突变体的杂种F1,筛选纯合突变体背景的F2转基因株系,各单株均为自交亲和,证明AtCIMS1和AtCIMS2都在维持拟南芥自交不亲和反应中起作用,且CIMS1在甘蓝型油菜和拟南芥自交不亲和反应调控中具有保守功能。
  3.BC等其它自交不亲和反应候选基因的功能研究
  (1)BC的下调导致甘蓝型油菜和拟南芥叶片发育异常
  分别在甘蓝型油菜Westar和拟南芥Col-0中下调BC(Biotin carboxylase)的表达,发现转基因BnBC RNAi Westar株系和AtBC RNAi Col-0株系叶片发育异常,主要表现为叶片皱缩,且转基因AtBC RNAi Col-0株系柱头对花粉粘附力下降。
  (2)SLR1启动子的特异性分析
  克隆甘蓝型油菜Westar SLR1基因启动子,并连接GUS报告基因,转入拟南芥Col-0中。通过GUS染色分析SLR1启动子特异性,发现SLR1启动子在开花当天的雌蕊柱头特异表达,同时在幼苗期除子叶外其它部位及成熟叶片中均有表达。证明SLR1启动子在拟南芥中并非柱头特异启动子。
  (3)ANN1等三个候选基因的功能研究
  在甘蓝型油菜Westar柱头中特异下调自交不亲和反应候选基因ANN1(膜联蛋白基因)、FBA2(果糖二磷酸醛缩酶基因)以及MUR5(可逆的磷酸化多肽)的表达,发现三个基因分别被干涉后不能影响甘蓝型油菜的自交亲和性,且在转基因植株中未观察到其它表型变化。
  4.转录组分析亲和/不亲和反应基因表达的时相变化
  对甘蓝型油菜亲和及不亲和授粉后不同时间点的柱头进行转录组分析。根据差异表达基因的分布情况,将授粉事件分为早期授粉事件和晚期授粉事件,并发现自交不亲和反应信号传导路径比亲和反应更复杂。通过对差异表达基因的功能注释,提出了一些可能调控花粉-柱头互作机制的假设。根据对柱头富集表达基因的代谢途径的注释,发现SAM循环中所有基因都在柱头中高表达,包括本文已验证的自交不亲和反应正调控因子BnCIMS1。
[硕士论文] 韩少卿
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)基因家族编码一类小的分泌肽,广泛参与植物细胞间的信号转导、细胞增殖分化、自我调节以及响应外界刺激。目前,已在拟南芥、水稻、大豆、番茄和杨树等植物中鉴定了大量的CLE基因家族成员,而在油菜中还没有进行过系统地分析。在本研究中,我们对甘蓝型油菜的CLE基因家族成员进行了系统地鉴定和生物信息学分析,利用体外多肽处理的方法对一些油菜特异的CLE基因功能进行验证,并对BnCLE基因的组织表达特异性进行了分析。主要结果如下:
  1.在甘蓝型油菜全基因组中共鉴定出116个CLE基因家族成员,其中包括5个含有多个CLE基序、7个未注释的新基因。并对它们进行了信号肽、等电点、分子量大小和基因结构等特征的分析。
  2.染色体定位分析发现,A和C亚基因组各包含53和61个BnCLE基因。整体上,BnCLE基因总是成对的出现在两个亚基因组的同源区域。BnCLE基因家族的扩张方式以大片段复制为主(68%,79/116),其次为全基因组随机转录事件(27%,31/116),串联重复的形式很少(5%,6/116)。
  3.通过多序列比对和进化树构建,并参照拟南芥中AtCLE基因的功能将BnCLE基因分为三大类:A类主要作用于侧根的生长发育,B类主要维持根和茎顶端分生组织的干细胞动态平衡,C类主要对维管束的发育发挥作用。
  4.对5个含有多个CLE基序基因进行分析,发现它们各含有2-5个CLE基序,都主要在子房和角果中的表达量较高,暗示它们可能参与了种子的生长发育。
  5.共发现45个BnCLE基因具有29种新的CLE基序。通过体外多肽处理实验对其中的27种CLE多肽进行了功能验证,发现大部分多肽中的氨基酸变异并未导致其功能的显著分化,而少数CLE基序的变化会导致其功能的改变。
  6.对48个基因进行了组织表达特异性分析,发现大部分BnCLE基因存在一定的组织表达特异性,同时一些BnCLE基因的不同拷贝间出现表达分化。
  以上研究结果为油菜中深入开展CLE基因功能、鉴定油菜特异的CLE基因奠定了理论基础。
[硕士论文] 黄慧
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是我国重要的经济作物,也是世界上最重要的天然纤维作物。我国是棉花消费和进口第一大国,也是纺织服装生产贸易第一大国。由于纺织工业的不断进步,人们生活水平及对衣着品质要求的提高,纺织业对棉花纤维品质的要求越来越高,因此寻找优质基因,对棉花纤维品质进行定向分子改良显得十分重要。纤维伸长期和次生壁增厚期对纤维的长度,细度及强度具有重要影响,因此本实验将对一个伸长期和次生壁增厚期优势表达的基因进行功能验证,以期能创制优质棉花材料。
  实验室早期克隆了在纤维伸长期及次生壁增厚期优势表达的基因GhPCBER,本研究通过转基因的方法改变GhPCBER在纤维中的表达,探究其在纤维发育中的作用,取得的主要结果如下:
  1.对陆地棉中GhPCBER家族进行了序列及表达分析,发现GhPCBER与拟南芥AtPCBER1较为同源,具有NADPH结合区,且在进化上保守。海岛棉与陆地棉中GhPCBER的表达模式较为类似。
  2.通过表达量和Southern杂交检测得到符合预期表达量的低拷贝转基因植株。对成熟纤维品质进行考察发现干涉株系马克隆值变低,长度没有明显变化,EXPA2启动子驱动的超量表达株系纤维长度明显变长,马克隆值变低,35S启动子驱动的超量表达株系手梳纤维长度显示纤维长度变长。通过扫描电镜观察纤维横切面芨现EXPA2启动子驱动的超量表达株系纤维细胞的细胞壁变薄。
  3.木质素含量测定发现干涉株系中木质素含量升高,与木质素合成相关的基因CAD上调表达,在超量表达株系中正好相反,CAD表达下调。
  以上结果可以推测改变GhPCBER的表达可能改变体内木质素合成,进一步影响纤维发育,导致GhPCBER超量表达的棉花纤维变长变细,品质变好。本研究通过探究GhPCBER对纤维发育的作用为棉花纤维品质改良提供了一定的参考。
[硕士论文] 李贺欢
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:中国是第二大菜籽油产出国,菜籽油产量占我国自产食用植物油约45%。自然环境的变化,如干旱、冷害、盐碱及冻害等对油菜的生长以及含油量都产生了很大的影响,因此提高油菜对逆境的抗性成为了研究的重点之一。本研究主要探究油菜在生长发育过程中,细胞内鞘脂的组成及含量对油菜生长发育的影响,以及在响应逆境胁迫时鞘脂代谢途径中的关键酶基因是如何改变鞘脂的含量和组成来调控油菜的抗逆性。
  鞘脂是细胞膜的重要组成成分,同时作为生物活性分子参与调控细胞生长、细胞分裂、细胞凋亡和应激反应等。在植物中已经报道了鞘脂参与调控细胞程序性死亡、ABA信号途径、花粉发育和低温信号途径等现象,但具体调控机制不详细,尤其是鞘脂信号传导途径中的受体、靶蛋白和调控因子都未知。本研究利用质谱分析技术准确分析了油菜不同组织中鞘脂的含量和组成,发现鞘脂在不同组织中的含量和组成有着显著差异。进一步分析了在多种逆境胁迫条件下油菜叶片中鞘脂的含量变化,结果发现水分和盐胁迫导致油菜叶片中鞘氨醇长链Sph d18∶0和Sph d18∶1含量显著下降,暗示参与鞘氨醇(Sph)磷酸化的鞘脂激酶(SphK)活性增加。通过转录组分析,我们发现数了个编码鞘脂合成代谢途径的关键基因在水分和盐胁迫下表达量显著提高,以上数据表明鞘脂可能参与调控油菜逆境胁迫。我们进而在油菜中分别克隆了两个调控鞘脂代谢的鞘氨醇-1-磷酸(S1P)裂解酶基因(SPL1,SPL2)和两个调控鞘脂代谢水平的鞘氨醇-1-磷酸(S1P)去磷酸化酶基因(SPP1,SPP2),通过构建过表达载体和CRISPR/Cas9表达载体,进行油菜遗传转化并获得了阳性的转基因油菜。为下一步进行表型鉴定及鞘脂组成和含量检测,确定油菜中鞘脂代谢对油菜的生长发育及抗逆性的影响打下了重要基础。
[硕士论文] 石笑蕊
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜是世界上最重要的油料作物之一。油酸作为一种单不饱和脂肪酸,是油菜脂肪酸的重要组成部分。高油酸菜籽油因具有较高的食用品质、营养价值、存储和加工品质,在食用、工业和药用领域都具有极其重要的作用,成为品质育种的重要目标之一。本研究以高油酸的甘蓝型油菜J-3111为供体亲本,采用传统回交育种结合分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection,MAS)的策略,期望选育出具有受体亲本621R、L-135R(恢复系)和616A、195-14A(不育系)遗传背景的高油酸恢复系和不育系。主要结果如下:
  1.分别构建621R×J-3111、L-135R×J-3111、616A×J-3111、195-14A×J-3111四个组合的BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC3F2、BC3F3、BC4F1、BC4F2世代群体。通过前景标记和背景标记的选择,分别获得616A和195-14A BC3F3世代的高油酸可育双纯合基因型(RfpRfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)(恢复系)单株22株和19株,高油酸不育双纯合基因型(rfprfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)(不育系)单株30株和19株;分别获得616A和195-14A BC4F2世代基因型为RfpRfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a(恢复系)的单株7株和24株,基因型为rfprfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a(不育系)的单株l株和18株;分别获得621R和L-135R BC4F2世代的纯合高油酸基因型(RfpRfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)(恢复系)单株1株和16株。结合田间表型挑选10株(616A的2株可育株和2株不育株、195-14A的2株可育株和2株不育株和L-135R的2株可育株)背景最接近相应轮回亲本的纯合高油酸基因型的单株进行重测序分析。重测序结果表明,10个单株基因组绝大部分区域与相应的轮回亲本无差异,背景回复率达97.93%-99.45%,且油酸位点位于序列差异区段内。
  2.利用气相色谱法测定39株中选单株自交种子和亲本种子的油酸含量。高油酸亲本材料(油酸基因型BnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)的油酸含量为76.14%,受体亲本(基因型BnaA.FAD2.ABnaA.FAD2.A)的油酸含量在61.11%-65.32%之间,7份高油酸杂合(基因型BnaA.FAD2.ABnaA.fad2.a)中选单株自交种子的油酸含量在67.37%-70.57%之间,32份高油酸纯合(基因型BnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)中选单株自交种子的油酸含量在68.15%-75.18%之间。中选单株的油酸含量显著的高于受体亲本。
  3.考察10个与受体亲本遗传背景最接近的中选单株的角果长度(silique length,SL)、每角果粒数(number of seeds per silique,NSS)和干粒重(thousand seed weight,TSW)等产量性状,结果显示其主要产量性状都分别与受体亲本(616A、195-14A、L-135R)无显著差异。
[硕士论文] 薛慧影
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜是我国的重要油料作物,也在世界范围内广泛种植,它是由白菜和甘蓝杂交后形成的异源四倍体,其遗传基础较为狭窄。为了拓宽甘蓝型油菜的遗传基础,本实验室将白菜型油菜的Ar基因组和埃塞俄比亚芥的Cc基因组大规模地导入甘蓝型油菜中,形成了基因组组成接近为ArArCcCc的新型甘蓝型油菜,已有的分子标记分析表明,新型甘蓝型油菜与常规甘蓝型油菜有着显著的遗传差异,其基因组内存在大量新的遗传变异。但这些变异的详细特征,其在基因组内的位置和分布及其对性状改良有何影响,尚未可知。为了进一步详探外源导入和种间杂交给新型甘蓝型油菜基因组带来的新变异及其遗传效应,我们拟筛选优良的新型甘蓝型油菜纯合株系,与测序的甘蓝型油菜品种杂交,构建作图群体,获得高密度的遗传图谱,定位新型甘蓝型油菜内不同外源基因组导入的遗传变异,为后续深入分析甘蓝型油菜的基因组结构特征奠定基础。
  本研究从课题组创建的第三代新型甘蓝型油菜(G3)基因库中选择110份纯合株系,分别与测序品种中国半冬性油菜宁油7号(Ningyou7)以及欧洲冬油菜Tapidor杂交。将这些亲本及其所配置的F1先后种植于西宁和武汉,根据苗期性状初步观察生长势以及收获后进行产量评估,确定了最优的3对由新型甘蓝型油菜亲本与Ningyou7、Tapidor杂交的F1。选取这6个杂种F1的花蕾进行小孢子培育,并经秋水仙碱加倍,获得了6个群体共约3680个幼苗,收获了约1165份花粉育性正常的植株种子。利用流式细胞仪对其中一个群体(NG3-1)小孢子幼苗的倍性进行鉴定,最后获得该群体275个双单倍体(DH)株系。对NG3-1DH群体及其双亲的农艺性状和品质性状进行了初步考察。
  利用Illumina Hiseq PE150测序平台,对NG3-1DH群体的两个亲本进行了50倍覆盖深度的全基因组重测序,对275个DH系进行了5倍覆盖的全基因组重测序;两个亲本分别获得了71Gb和102Gb的高质量数据,群体获得了共2365Gb的高质量数据。以甘蓝型油菜基因组Darmor-bzhv4.1为参考基因组进行SNP Calling,对所获得的34万个原始标记进行了严格的筛选质控,共得到8422个标记(每个代表性标记包括若干个基因型一致的多态性标记)。使用MSTMap和Joinmap4.0软件对这8422个代表性标记进行分析并构建遗传图谱,最终得到含有2727个位点、覆盖长度为2664.01cM并且含有17条连锁群的高密度遗传连锁图谱。其中A02、C02这两条连锁群并未构建出,由于该群体亲本之一为含有外源基因导入成分的新型甘蓝型油菜,其A02、C02的染色体结构也较为复杂,在本研究中未进行分析,将在后续的研究中进行深入探索。本研究所获得的3对DH作图群体,以及NG3-1DH群体的高密度遗传图谱,将为后续开展新型甘蓝型油菜的基因组分析提供基础,并有助于发现作图亲本间的一些结构变异。
[硕士论文] 杨媛
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:苎麻(Boehmeria nivea L.)属于荨麻科苎麻属宿根性多年生草本纤维植物,是我国重要的天然纺织纤维作物,同时也是重要植物蛋白饲料的来源。全球干旱频发,长江流域麻区常受伏旱、秋旱与“火南风”的影响,使纤用苎麻二、三季麻生长不良,饲用苎麻也大幅减产。因此,研究苎麻遭受干旱胁迫时的变化机理,为改良和提高苎麻抗旱性已成为苎麻生产中必须解决的重大课题。本实验通过在不同时期对纤用苎麻(华苎5号)和饲用苎麻(中饲苎1号)进行干旱胁迫处理,测定叶片相对含水量、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛、超氧化物岐化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等7个生理指标,成熟收获后纤用苎麻测定株高、茎粗、单株鲜重、单茎鲜重、单株麻皮鲜重、皮厚等农艺性状和纤维含胶率、断裂强力、断裂伸长率、纤维细度等品质指标,饲用苎麻测定株高、茎粗、总鲜重、单株鲜重、单株干重、茎叶比等农艺性状和茎叶中营养品质成分的含量。分析干旱对苎麻生理指标及产量品质的影响;同时,对苎麻植株进行连续干旱处理,动态取样测定各项生理指标,分析干旱胁迫下苎麻生理生化指标变化趋势,研究苎麻受到干旱胁迫时的变化机理,为改良和提高苎麻抗旱性提供理论基础。主要结果如下:
  1.在苗期、旺长期和成熟期3个时期对纤用苎麻植株进行干旱胁迫处理,叶片相对含水量均比正常灌水处理显著减小,植株中的可溶性糖含量、脯氨酸含量、丙二醛含量均比正常灌水处理增加,抗氧化保护酶系统中的SOD活性、POD活性、CAT活性均比正常灌水增加。苗期干旱胁迫处理,株高、茎粗、单株鲜重、单茎鲜重、单株麻皮鲜重以及皮厚等较正常灌水相比均未受到显著影响;旺长期干旱胁迫下株高、茎粗、单株鲜重、单茎鲜重、单株麻皮鲜重均显著减小,皮厚未受到显著性影响;成熟期干旱胁迫时,苎麻株高、单株鲜重、单茎鲜重、单株麻皮鲜重也会显著减小,而茎粗和皮厚较正常灌水处理无显著性差异。
  2.纤用苎麻植株在苗期、旺长期和成熟期进行干旱胁迫,纤维中蜡脂质、水溶物、果胶和木质素含量与正常灌水处理相比均没有显著性变化;在苗期干旱胁迫下纤维中半纤维素的含量会显著减少,旺长期和成熟期干旱胁迫处理则无显著性影响;苗期和成熟期干旱胁迫处理对纤维素含量无显著性影响,但是旺长期干旱胁迫处理会显著增加。在苗期和旺长期干旱胁迫下,纤维断裂强力均未受到显著性影响,成熟期干旱胁迫处理会使断裂强力显著性下降;断裂伸长率在苗期、旺长期和成熟期3个时期干旱胁迫处理下均无显著性变化。分析可知,在苗期和旺长期适度的干旱胁迫能提高纤维的综合品质,成熟期干旱胁迫时纤维断裂强力下降,不利于纤维的品质,但纤维细度提高,利于纤维品质的形成。
  3.在苗期、旺长期对饲用苎麻进行干旱胁迫处理,苎麻叶片相对含水量均比正常灌水处理减小,植株中的可溶性糖含量、脯氨酸含量、丙二醛含量均比正常灌水处理增加,同样,抗氧化保护酶系统中的SOD活性、POD活性比正常灌水增加,但是CAT的活性在苗期干旱胁迫时增加,而在旺长期干旱胁迫时降低。在苗期和旺长期进行干旱胁迫处理,苎麻株高、茎粗、总鲜重、单株鲜重以及单株干重均会受到显著影响而降低,茎叶比则是在苗期干旱胁迫下显著升高,旺长期干旱胁迫下显著降低。
  4.饲用苎麻苗期干旱胁迫时,粗蛋白含量无影响,粗脂肪含量显著高于正常灌水处理,粗灰分含量显著下降,表明在苗期遭遇干旱胁迫时,苎麻植株的饲用营养价值提高;在旺长期干旱胁迫时,粗蛋白和粗脂肪含量均显著减少,且粗纤维含量显著增加,苎麻饲用品质下降,因此旺长期干旱胁迫会显著影响苎麻植株的饲用品质,要充分满足饲用苎麻旺长期的水分需求情况。
  5.纤用苎麻和饲用苎麻随胁迫时间延长,土壤相对含水量均随之减小。纤用苎麻的可溶性糖含量随着胁迫程度的加深呈现先上升后下降趋势,而饲用苎麻的可溶性糖含量则呈现先下降后上升的趋势;两种苎麻的脯氨酸和丙二醛含量均随胁迫时间延长而上升;随胁迫时间延长,SOD、POD以及CAT等3种酶活性均呈现先上升后下降的趋势。
[硕士论文] 周灿
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:何首乌(Polygonum multiflorum(Thunb.))野生资源近年来日益减少,而其人工栽培尚缺乏科学的指导。本试验选址于湖北省十堰市丁家营镇,采用“3414”不完全施肥方案,测定了不同时期不同施肥处理下何首乌的部分生长指标、生理指标、活性成分含量和单株产量,研究了何首乌不同部位药用成分动态积累的规律和化学指纹图谱,旨在摸索出配方施肥对何首乌生长发育及品质形成的影响,为实现何首乌优质、高产栽培提供理论依据。主要研究结果如下:
  1.何首乌主茎在每年9月之前生长较快,之后进入块根膨大期,地上部分生长变缓而地下干物质积累迅速增加。与N0P0K0(试验对照)相比,施肥处理显著增加何首乌主茎茎粗和地下干物质积累量,其中N3P2K2处理对何首乌主茎生长的促进作用最为显著,而N2P2K2处理对何首乌地下干物质积累的促进作用最为显著,说明合理的氮、钾配比施肥可促进何首乌生长、提高产量。
  2.与N0P0K0处理相比,施肥处理可提高何首乌总氮、总钾、总磷以及可溶性总糖含量,各指标均在N2或N3配合K2或K3水平下达到最大值,说明中、高水平的氮肥和钾肥处理有利于何首乌植株的养分累积。
  3.二苯乙烯苷在何首乌不同部位中含量高低顺序为:未膨大根>块根>茎>叶,其中根部二苯乙烯苷的含量在第1年和第2年期间持续增加,进入第3年后含量变化幅度较小;茎中的二苯乙烯苷含量在每年9月之前迅速增加,而进入块根膨大期后呈现下降趋势;叶中的含量极低。
  各施肥处理均显著提高何首乌各部位的二苯乙烯苷含量,在N1P2K2处理下达到最大值,说明低氮和中钾的施肥处理最有利于何首乌植株累积二苯乙烯苷。
  蒽醌类物质在何首乌不同部位中含量高低顺序为:未膨大根>块根>茎>叶。何首乌根部结合大黄素、结合蒽醌和总蒽醌的含量在第1年和第2年期间持续增加,进入第3年后含量显著下降;相比之下结合大黄素甲醚和游离蒽醌的含量在3年期间的变化较小。茎中结合大黄素、结合蒽醌和总蒽醌含量在每年9月之前迅速增加而进入块根膨大期后有一定程度的下降;叶中的含量极低。
  各施肥处理均显著提高何首乌中蒽醌类物质的含量,其中大黄素和大黄素甲醚分别在N3和K3水平达到最大值,说明高水平的氮和钾分别最有利于何首乌植株中大黄素和大黄素甲醚的累积。
  4.生长2年的何首乌单株产量(根干重)在N2P2K2处理下达到最大值302.53g,较N0P0K0处理增加了142.90%,说明中氮和中钾的施肥处理最有利何首乌产量的增加。第3年内何首乌单株产量增加幅度明显不如第2年,且活性成分的含量无增反减,因此,十堰地区何首乌人工栽培的最佳采收期为移栽后第2年冬季。
  5.化学指纹图谱的实验结果证明了不同施肥处理下何首乌块根中的成分组成一致,但含量存在一定差异,总体相似性很高;未膨大根亦然。何首乌块根和未膨大根指纹图谱的比较结果表明,块根和未膨大根中成分组成基本相同,且未膨大根中的各组分含量更高。
  本研究结果表明,综合考虑何首乌产量与质量,十堰地区人工栽培何首乌最适施肥量为每年每公顷施纯氮153.85kg、有效磷112.5kg、有效钾95.36kg,最佳采收期为扦插苗移栽后第2年冬季。此外,试验中发现何首乌未膨大根与其主要药用部位块根中物质成分基本相同且含量更高,具有深度开发的价值。
[硕士论文] AHMAD ALI
作物生物技术 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是芸薹科的一个异源四倍体作物,是世界上重要的油料作物,并有其它多种用途。随着全球对食用油、蛋白饲料及工业用品等日益增长的需求,甘蓝型油菜育种面临的主要挑战之一是提高单产。每角粒数是油菜产量构成因子之一,且每角果初始胚珠数与每角粒数紧密相关,但目前有关油菜初始胚珠数遗传调控的研究报道较少。本研究利用甘蓝型油菜自交系7-5(初始胚珠数多)和ZY50(初始胚珠数少)杂交F1所构建的包含180个DH系的群体为材料,重点对每角果初始胚珠数(ON)展开遗传解析,同时亦分析了每角粒数(SN)、初始胚珠数与每角粒数的差异(ON-SN)相关的QTL。获得主要结果如下:
  1、该DH群体中ON、SN和ON-SN均呈正态分布,各DH系基因型方差达到极显著水平,表明各性状均由多基因控制,且该群体可以用于相关性状的QTL解析。相关性分析表明,ON和SN极显著正相关,ON-SN和SN极显著负相关。
  2、利用本实验室前期构建的该DH群体的遗传连锁图(包含2236个SNP标记和66个SSR标记的遗传连锁图,覆盖了1951.5cM的遗传距离,标记的平均图距0.85cM),整合该DH群体在武汉和鄂州两年两点的表型数据,通过QTL扫描,总共检测到上述3个性状的14个QTL。其中,和ON相关的5个,包括qON-A3,qON-A7-1,qON-A7-2,qON-A10和qON-C6,其中qON-A7-1、qON-A7-2和qON-A10等三个位点具有较大的效应。SN、ON-SN相关的QTL,与ON既有重合,亦有独立遗传。
  3、针对ON相关的两个效应较大的QTL位点(qON-A7-1和qON-A7-2),采用回交和标记辅助选择的方式,利用分别包含各位点增效基因型且遗传背景与轮回亲本接近的DH系与对应亲本回交构建近等基因系,目前已经获得了BC3F1株系。而针对qON-A10的位点,目前已经得到了BC1F1单株。
  本研究通过对初始胚珠数、每角果粒数和二者差异的遗传解析,获得了控制上述性状的多个QTL位点,暗示不同的QTL可能在不同层面上共同调控每角果粒数的形成。本研究为油菜每角果粒数遗传机制的较全面分析奠定了良好的基础。
[硕士论文] 任丹凤
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是一种主要的经济作物,并且其副产物棉籽中含有丰富的蛋白质、脂肪酸等营养物质。棉酚虽然是棉花自身的植保素,但同时也对单胃动物和人具有较大的毒性,使得棉籽产品的利用价值受到很大的限制。培育出植株有酚而种子低酚或无酚的棉花品种一直是棉花科技人员的目标。本研究期望通过以下途径来降低种子中的棉酚含量,利用杜松烯合酶基因(CADl)在棉酚合成路径中所起的关键作用,一方面通过RNAi技术和种子特异启动子来降低种子中CAD1基因的表达量,另一方面利用CRISPR/cas9系统对CAD1基因进行编辑,以此使种子中棉酚合成量减少,最终获得种子低酚的新材料。本试验主要研究结果如下:
  (1)将αGP-CAD1-RNAi载体转入棉花中,得到52个转基因阳性再生植株,通过测定种子棉酚含量,初筛得到8个种子棉酚含量较低的株系。
  (2)对株系4的T1代不同单株间,蕾、铃、萼片、种子组织进行了棉酚含量的测定,其中蕾、铃、萼片三种组织中棉酚含量在单株间没有明显差异,而在不同单株的种子中,棉酚含量有着比较显著的差异,达到了降低种子中棉酚的目的。
  (3)从不同株系T1代的单株中,筛选出了13个CAD1基因表达量显著降低的单株。它们的种子棉酚含量介于1.58μg/mg-2.61μg/mg之间,与野生型材料相比,棉酚含量降低了38.4%-62.7%。对种子进行显微观察发现,转基因植株色素腺体的可见度比野生型对照要低。
  (4)对13个转基因T1单株进行了农艺性状的考察,与对照相比,它们的株高、百粒重、纤维品质等都没有明显的变化,证明了干涉CAD1基因对植株的正常发育没有明显影响。
  (5)构建并转化了CRISP R-CADl-A/C载体,目前己获得9株阳性的转CRISPR-CAD1-A基因的再生棉花,其种子的棉酚含量降低了25.7%。
[硕士论文] 张军
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是主要的纤维作物,也是重要的油料作物。在不占据额外的耕地面积和不降低纤维品质的前提下,通过基因工程技术提高种子含油量、降低棉酚含量,从而改善棉籽油品质增加我国植物油的供应。二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油合成最后一步反应酶,它的表达水平与油脂含量密切相关,前人的多项研究证明异源表达DGAT能显著的提高植物种子的含油量。本研究克隆了芝麻、蓖麻、油葵和花生4种油料作物的DGAT1基因,利用酿酒酵母表达体系验证功能后,转化至棉花以创造高油种质。另外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除棉花色素腺体形成基因GoPGF,创造无腺体的新种质,为解析腺体形成调控机理以及腺体与棉酚的关系提供了重要的研究材料。主要结果如下:
  (1)生物信息学分析表明克隆4种油料作物SiDGAT1、RcDGAT1、HaDGAT1、AhDGAT1基因均具有DGAT1特征,且酵母表达体系表明四种作物来源的DGAT1均有DGAT酶活性;
  (2)在棉花中过表达SiDGAT1、RcDGAT1、HaDGAT1、AhDGAT1,根据Southern杂交结果,分别筛选到4、8、11、10个单拷贝转化事件,并且在棉花中均可正常表达;
  (3)SiDGAT1转基因棉花T2代Si-94、Si-99两个转化株系与对照相比含油量分别提高6.37%、7.41%,百粒重提高11.16%、4.94%;
  (4)对SiDGAT1转基因棉花进行脂质组分析,共鉴定到8大类型、26个亚类、902种脂质分子,筛选到25个差异脂质分子,其中包括14种TAG,碳原子数在56个以上、分子质量900以上的甘油三酯呈增长趋势(R2=0.6771、R2=0.6987);
  (5)利用CRISPR/Cas9敲除棉花色素腺体形成基因GhPGF_A12、GhPGF_D12,阳性植株无腺体表型率100%,叶片棉酚含量下降98.8%,并且无腺体表型可遗传。
[硕士论文] 王岳
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在油菜杂种优势利用实践中,甘蓝型油菜(Brassica napus L.)波里马细胞质雄性不育(polima cytoplasmic male sterility,简称pol CMS)是油菜最重要的雄性不育类型之一。杨光圣等(1995,1998)在两个甘蓝型油菜品种杂交后代中发现了低温可育、高温不育的温敏型波里马细胞质不育(Temperature-sensitive polima cytoplasmic male sterility,简称pol TCMS)现象。借在此基础上,选育出制种产量高、容易繁殖的pol TCMS两用系,并陆续组配“华油杂10号”等几十个通过国审或省审的杂交油菜新品种。这表明pol TCMS具有广阔的应用前景。
  杨光圣等(1997)对pol TCMS进行了较深入的研究,结果显示细胞核中的多个数量基因可能调控其温度敏感性。为了进一步深入研究pol TCMS的育性转换机制,本研究将温度敏感型不育系(Y402)和稳定可育型(Rf48)两种甘蓝型油菜在花芽分化的关键时期,分别置于25℃和10℃条件下培养,在育性转换的关键时期提取0.5mm花蕾RNA。通过转录组分析,对比鉴定出温度特异调控pol TCMS育性转换的相关基因;同时结合pol CMS恢复基因研究进展,初步探讨了pol TCMS受温度调控的分子机制。
  结果总结如下:
  1、通过Illumina HiSeq-150平台测序产出Raw data共155.893G,过滤后获得Clean data共154.736G。通过Hisat2将Clean data与甘蓝型油菜中双11的参考基因组进行比对,比对率在90%左右。通过StringTie进行转录本组装得到199589个unigenes,总长度267Mbp。
  2、研究中通过联合使用Ballgown和DEseq2进行差异表达基因分析,将高温样本与低温样本进行比较,以FDR<0.01,差异表达倍数2倍以上(即|Log2Ratio|>1)为阈值并过滤掉低质量unigenes,共得到Y402差异表达基因910个,其中上调基因439个、下调基因471;Rf48差异表达基因1808个,其中上调基因990个、下调基因818个。
  3、用Blast2GO对Y402的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析发现,高温环境下Y402下调基因功能集中在细胞组成、合成代谢、生殖生长三类,上调基因功能集中在光合作用、氧化还原反应等能量供给相关分类。KEGG富集分析结果与GO富集分析结果一致,并富集到pol CMS育性变化相关基因orf224/atp6所在的氧化磷酸化途径。该途径存在一个重要基因MSTRG.5508.4,其在高温环境下沉默,在低温环境下有较高表达量,认为其可能是本研究中高温环境下造成pol TCMS育性转化的关键基因。
  4、通过双重比对的方法,在Y402差异表达基因中筛选与育性相关基因。结果发现pol CMS育性保持基因rfp在高温下表达量下调;在生殖生长阶段赋予花蕾耐热性的基因SPL1和SPL12在高温下表达量下调;在减数分裂前期调控花药发育相关基因ROXY1、MYB65和ER等在高温下表达量下调。
[硕士论文] 王涛
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是主要的经济作物,在分子生物学快速发展的今天,传统的育种方法存在较多的局限性,因此结合体细胞胚胎再生技术获得优良转基因品种已是大势所趋。到目前为止,只有少数的棉花品种具备快速高效获得再生植株的特性,而大部分栽培推广品种不具备这一特性。棉花体细胞胚再生过程中,影响胚性愈伤的分化和植株再生的因素有很多,其中供体的基因型、培养基的类型是体胚发生中影响较大的因素。通过正向遗传学的策略定位控制棉花体胚发生能力的位点,将控制高再生能力的基因从再生能力高的品种转移到再生能力低的品种中去,从而提高优良品种的再生能力,以获得高再生能力的优良棉花品种。
  本研究主要是以可快速获得再生植株的棉花品种(YZ-1)和长江流域主栽培品种(Emian22)为亲本,通过杂交后和多年的自交,构建的重组自交系群体,选取其中164个家系,采用IBA+KT(IK)和2,4-D+KT(DK)两种不同激素组合的培养体系,分别对重组自交系群体YE的愈伤组织诱导率(CIF)、愈伤组织继代繁殖力(CSC)、愈伤组织的出胚率(CRE)以及愈伤组织出胚时间(CET)进行统计分析,以及对两个体系下愈伤的颜色质地,培养流程进行对比分析。结果如下:
  1.利用IK和DK体系对YE家系进行再生能力筛选,结合愈伤继代繁殖力、胚性愈伤分化时间、分化率等数据,以及愈伤组织的颜色质地和不同体系下组织培养流程对比的综合分析,结果表明IK培养体系比DK体系更适合YE家系的培养。
  2.通过IK体系筛选得到36个可再生家系,DK体系筛选得到35个可再生家系,共获得46个可再生家系,两个体系下都可再生的家系有25个,获得31个可再生阔叶棉家系,得到16个再生能力接近YZ-1农艺性状较好的阔叶棉家系,并获得再生植株。
  3.基于本实验室构建的海陆种间高密度遗传图谱,以10cM遗传距离挑选了494个覆盖全基因组的标记,对每个培养体系筛选出的5个高再生能力家系材料进行全基因组背景检测。通过对5个高再生能力材料的YZ-1等位基因的鉴定,将其具有YZ-1等位基因的位点作为可能控制再生能力的遗传效应候选位点,共在15条染色体上筛选到25个控制再生能力的候选位点。
[硕士论文] 刘欣欣
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花既是重要的纤维作物,也是重要的油料作物。陆地棉棉籽的含油量十分丰富,在20%-40%之间。我国的食用油短缺,多数依赖进口,提高棉籽油的产量可以缓解这一问题。脂肪酸是生物膜的重要组成成分,因此脂肪酸对于生物体具有十分重要的意义。根据脂肪酸的合成路径,发现KASI是催化脂肪酸合成十分重要的酶。KASI主要催化C4-ACP生成C16-ACP的过程。本研究利用候选基因关联分析成功关联到陆地棉中与棉籽含油量相关的基因GhA05KASI,为提高棉花棉籽含油量提供了理论基础。
  本研究的主要结果如下:
  1.结合陆地棉503份自然种质材料和8个环境中的表型数据在TASSEL2.1中基于一般线性模型检测到1个标记与目标性状相关,该标记为GrKASI-3705。该标记与8个环境的陆地棉自然群体含油量性状都存在显著关联,解释率在7.46%-18.38%之间,平均解释率为14.23%。该标记对应的基因为雷蒙德氏棉中预测的KASI基因;
  2.将雷蒙德氏棉中KASI基因的序列比对到陆地棉基因组中,我们得到6个拷贝基因,分别位于A05、D05、A06、D06、A09和D09染色体上。针对这6个候选基因设计特异性引物,结合陆地棉表型数据在TASSEL2.1软件中基于一般线性模型检测到GhA05KASI-3705标记与目标性状相关,该标记位于A05染色体,与标记GrKASI-3705的关联结果一致;
  3.对GhA05KASI进行RT-PCR和qRT-PCR分析。结果发现高油材料和低油材料在30DPA时期存在显著差异,在低油材料中目的基因的表达模式与表达谱一致。对GhA05KASI的蛋白质序列进行预测,发现两个与酮脂酰相关的保守结构域;
  4.对GhA05KASI进行重测序,共测序10份陆地棉极端材料,其中包括5份低油材料和5份高油材料。结果在内含子区域和3'UTR区域各发现一个突变位点,启动子区域发现10处突变,尤其是位于起始密码子上游784bp位置处存在一处11bp的缺失,这11bp缺失位点包含一个ATTAAT的作用元件,该元件参与植物对光的响应反应。针对这些突变位点设计引物,结合陆地棉群体含油量表型进行关联分析,发现3处突变位点与8个环境中陆地棉自然群体含油量表型都显著相关,分别是位于内含子区域的突变,位于3'UTR区域的突变和启动子11bp的缺失;
  5.构建转基因载体。本实验构建了超表达载体、启动子GUS载体和Crispr载体对GhA05KASI进行后期验证。
[硕士论文] 柳亮
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系FM195AB是由宜3AB转育而来,其育性受复等位基因BnMS5控制。BnMS5的3个等位基因分别是BnMS5a(恢复基因)、BnMS5b(不育基因)和BnMS5c(正常可育或临保系基因),其显隐性关系为BnMS5a>BnMS5b>BnMS5c。通过细胞学观察发现造成FM195A雄性不育的原因是减数分裂停滞在减数分裂前期Ⅰ的细线期。辛强(2016)克隆了BnMS5基因,通过序列比对发现BnMS5只在芸薹属特异存在,是一个进化上新近产生的芸薹属特异的功能未知基因。为了进一步阐明BnMS5影响减数分裂的分子机制,本研究检测了近等基因系FM195R(纯合恢复系:BnMS5a BnMS5a)和FM195A(纯合不育系:BnMS5b BnMS5b)的雄蕊转录组,每个样品2个重复。通过比较分析得出如下主要结果:
  1.通过Illumina HiSeq-150平台进行测序产出Raw data共114G,过滤后的Cleandata共108G。通过Hisat2把过滤后clean reads比对到ZSll的参考基因组上,匹配率都在90%以上。比对到Exon(外显子)区域的clean reads占比也都达到90%以上。
  2.结合Ballgown与DEseq2的差异表达基因分析结果,发现在不育雄蕊中上调表达的基因有522个,下调表达基因有831个;在可育雄蕊中特异表达基因有1727个,在不育雄蕊中特异表达基因有1598个。
  3.通过Blast2GO对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。结果显示,BnMS5可能通过影响表达调控相关基因,进而影响了染色体和染色质形态、细胞周期调控过程、与细胞分裂有关的染色体运动过程,最终影响减数分裂。
  4.本研究分析了拟南芥中功能已知的影响减数分裂和雄性不育相关基因的差异表达,发现BnMS5调控了与染色体浓缩、重组解旋酶和拓扑异构酶相关基因的表达,进而影响了染色体形态建成,导致同源重组、联会、染色体配对等过程异常;BnMS5还调控细胞周期相关抑制因子、影响染色体运动和细胞分裂。BnMS5的功能缺失导致这些过程异常,致使减数分裂阻滞在了减Ⅰ细线期,间接引起绒毡层发育异常,最终导致FM195A雄性不育。
[博士论文] 易丽聪
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:开花是受多个基因控制的数量性状,适时开花有利于植物躲避不利外界环境并顺利繁殖后代;对于农作物而言,适时开花是获得稳定产量的前提条件。甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物,具有重要的经济价值。按照其开花对春化的需求甘蓝型油菜被分为三种生态型:春油菜、半冬性油菜和冬油菜。QTL定位结合与拟南芥的比较基因组分析在油菜基因组中检测到大量控制开花的主效QTL位点和候选基因。尽管如此,甘蓝型油菜的开花调控机制还尚未清楚:1)主效开花QTL缺乏深入的分子机理解析;2)多数易受环境影响的微效QTL位点很少被检测更缺乏分子水平的研究;3)开花QTL/基因间的互作缺乏研究。
  为了进一步揭示甘蓝型油菜的开花调控,本研究分析了开花主效基因BnaA3.FRI与油菜生态型和适应性之间的关系,并深入解析了BnaA3.FRI调控开花的分子机制。此外,实验室前期利用早花亲本No.2127为供体亲本,晚花亲本中油821(ZY821)为轮回亲本,构建了染色体片段代换系。本研究利用已构建的代换系,通过连锁分析在A2染色体上定位到一个调控油菜开花的微效QTL位点。主要结果如下:
  1.甘蓝型油菜开花调控因子BnaA3.FRI的功能分析
  FRI是决定拟南芥开花和生态型的关键基因,通过激活开花抑制基因FLC的表达来抑制开花。甘蓝型油菜共包含四个FRI同源基因:BnaA3.FRI、BnaA10.FRI、BnaC3.FRI和BnaC9.FRI,连锁分析和关联分析同时表明BnaA3.FRI变异与油菜的冬春性分化和开花调控相关。本研究对5份冬油菜和5份春油菜的4个FRI拷贝进行测序分析发现其中三个拷贝BnaA3.FRI、BnaA10.FRI、BnaC3.FRI包含丰富的遗传变异,其中在BnaA3.FRI的ATG上游200bp和2.2Kb的基因区范围内共检测到30个多态性位点、在BnaA10.FRI和BnaC3.FRI基因区分别检测到30和50个多态性位点,而BnaC9.FRI这个拷贝的序列高度保守,没有检测到多态性位点。进一步利用InDel标记分别检测17份冬油菜中BnaA3.FRI、BnaA10.FRI、BnaC3.FRI的单倍型发现,所有的冬油菜都包含相同的BnaA3.FRI单倍型,但包含不同的BnaA10.FRI和BnaC3.FRI的单倍型。
  随后对另外20份不同生态型油菜中BnaA3.FRI进行测序分析,最终在BnaA3.FRIATG上游200bp和2.2Kb的基因区共检测到33个多态性位点,包含5个InDel(两个InDel位于ATG上游)和28个SNP(全部位于基因区,其中16个SNP导致氨基酸序列缺失/突变)。这些多态性位点共构成了9种单倍型(其中包含3种主要单倍型hap1、hap2和hap8,分别出现10次、8次和5次)。将其中三个InDel开发为分子标记并对174份甘蓝型油菜品系进行BnaA3.FRI单倍型分析(marker-based haplotype,mHAP),共检测到三种主要单倍型:mHAP1(22.4%)、mHAP2(60.3%)和mHAP3(15.5%)。对不同生态型油菜的BnaA3.FRI基因型组成分析发现:冬油菜中mHAP1基因型的频率(17/17,100%)显著高于半冬性油菜和春油菜中mHAP1的频率(分别为8/118,6.8%和15/39,38.5%)。同时,对不同地区油菜的BnaA3.FRI基因型组成分析发现:亚洲地区油菜中mHAP1的频率(5/108,4.6%)和mHAP3基因型的频率(11/108,10.2%)显著低于mHAP2(90/108,83.3%);与之相反,欧洲地区的油菜中mHAP1的频率高达58.5%(24/41)。这些结果表明BnaA3.FRI基因型与油菜的生态型和地区适应性相关。
  分别对半冬性和春油菜中不同单倍型油菜的开花期进行比较发现,不同BnaA3.FRI单倍型的开花期存在显著性差异。进一步对BnaA3.FRI的hap1和hap2两种单倍型进行转基因功能互补验证发现:hap1和hap2都能激活拟南芥FLC的表达并推迟开花,但hap1的推迟开花的功能明显比hap2强。为了进一步分析BnaA3.FRI序列变异对其表达和功能的影响,我们利用hap1启动子驱动其他3种BnaA3.FRI单倍型表达(hap2,hap3和hap8),同时又用hap2的启动子驱动hap1表达。通过转化拟南芥进行功能比较发现:在替换启动子之后,hap1依旧可以显著激活拟南芥FLC表达并推迟开花;而hap2,hap3和hap8虽然可以推迟开花但功能明显比hap1弱。这些结果表明BnaA3.FRI基因区序列变异导致其功能弱化,并由此调控开花期变异。
  2.基于染色体片段代换系的花期QTL定位
  实验室之前通过构建全基因组染色体片段代换系(CSSL)得到多个表现为早花的家系,对BC4F1代进行前景选择和背景选择得到3个表现为早花的A2染色体片段代换系:3W066、3W071和3W081。3个株系的F2群体的平均开花期分别为:145.7±18.3天、84.3±34.14天和136.8±29.27天,都显著早于晚花亲本ZY821当年的花期(161.7±4.34天)。我们选择株系3W066(遗传背景恢复率为94.75%)进行后续的开花QTL定位,并利用16个SSR和InDel标记重新构建了A2染色体导入区段的遗传连锁图。分别在WH2011(2011/2012,半冬性环境)和GS2012(2012,春环境)中考察BC4F3和BC4F4群体的开花期,结合单株的基因型数据我们在两个环境中各检测到2个QTL位点:其中WH2011环境下qFTA2.1a和qFTA2.1b分别解释开花期变异的25.4%和49.1%;GS2012环境下qFTA2.2a和qFTA2.2b分别解释开花期变异的13.1%和3.7%。
  在半冬性环境下连续三年(WH2011、WH2012和WH2013)对BC4F3、BC4F4和BC4F5群体的基因型和表型进行分析,最终将qFTA2.1a定位在标记KH77和KH78之间,对应于甘蓝型油菜参考基因组245Kb的范围,该区段包含一个重要的开花基因BnaFT.A2。此外,利用精细定位过程中检测到的交换单株进行自交,共得到3种包含不同导入片段的近等基因系:NIL-1、NIL-2和NIL-3(NIL-1包含的片段最长并涵盖NIL-2和NIL-3中的导入片段,NIL-2包含qFTA2.1a和qFTA2.1b两个位点,NIL-3只包含qFTA2.1a位点)。这3个导入系和ZY821在2013/2014(WH2013)环境下的开花期分别为66.5±11天、140±8.94天、156.3±7.18天和163.1±2.03天;说明A2染色体导入片段包含两个以上开花调控位点且位点之间具有加性效应,而我们分离的qFTA2.1a只是其中一个微效QTL位点。
[博士论文] 周贵龙
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:自交不亲和性是开花植物抑制自交、促进异交的自然现象,是杂种优势利用的重要途径。已有研究表明,花粉端SP11/SCR(S-locus protein11or S-locus Cys-rich protein)与柱头端SRK(S-locus receptor kinase)相互识别及SRK下游信号传导导致甘蓝型油菜自交不亲和性。本文研究芸薹属BnSCR1-BnSRK1-BnARC1自交不亲和信号通路在拟南芥中的保守性,自交不亲和系“W-3”的BnSCR1基因和BnSRK1基因启动子顺式作用元件及反式调控因子,为进一步揭示甘蓝型油菜自交不亲和机理、芸薹属自交不亲和信号路径奠定基础。主要结果如下。
  1.构建pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1和pORE_O4-BnSCR1+BnSRK1+BnARC1两种过表达载体,分别导入Col-0和C24两种生态型拟南芥,获得Col-0和C24过表达BnSCR1+BnSRK1转基因植株21株和13株,Col-0和C24过表达BnSCR1+BnSRK1+BnARC1转基因植株12株和9株。通过授粉试验观察、角果长度和每角果粒数考察及外源基因表达检测,发现所有转基因植株自交亲和,说明在拟南芥Col-0和C24中,芸薹属自交不亲和信号通路BnSCR1-BnSRK1-BnARC1不起作用。
  2.克隆了BnSRK1基因2kb启动子序列;启动子分析表明,PR1-GUS(-1809~-1bp)和PR2-GUS(-1314~-1bp)能够驱动GUS基因在柱头中表达;启动子缺失分析结果表明,调控BnSRK1基因表达的关键调控区域位于-1314~1000bp。克隆了Ⅱ类S单倍型的BnSCR-1300基因翻译起始位点上游504bp启动子和BnSCR-6基因翻译起始位点上游416bp启动子,启动子分析表明60P-GUS(-504~-1bp)和15P-GUS(-416~-1bp)均能驱动GUS基因在转基因拟南芥花药发育的第9期至11期的绒毡层表达。
  3.通过酵母单杂交实验获得了与BnSCR1基因684bp启动子结合的转录因子BnPHL2α。两轮诱饵序列截短实验表明BnPHL2α与p16X-3-AbAi的16bp(TTTAATTTCTTGCATA)序列互作。亚细胞定位结果表明BnPHL2α定位在细胞核中。利用AH109酵母菌株没有检测到BnPHL2α的转录活性;通过BnPHL2α转录激活/抑制结构分析,发现BnPHL2α存在两个保守区域(位于136-185aa的MYB CC结构域、37-90aa的MYB DNA结合结构域)可能是该蛋白的抑制区域。双荧光素酶报告(Dual luciferase reporter,DLR)系统检测BnPHL2α基因对BnSCR1启动子P342活性表明,BnPHL2α基因抑制P342启动子的活性;P342启动子区域(-310至-295bp)序列(TTTAATTTCTTGCATA)的一系列突变实验表明,BnPHL2α对BnSCR1启动子P342活性调控的抑制位点位于-310至-295bp区域。EMSA实验验证,BnPHL2α蛋白能够与“TTTAATTTCTTGCATA”序列互作。利用CRISPR技术敲除“Westar”中BnPHL2α基因,获得了4株T0代阳性苗,测序分析阳性苗均为嵌合体突变的植株。
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