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[博士论文] 李霄剑
控制科学与工程 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:体内生物学研究,特别是活体体内研究,对观察生物体整体生命活动、验证体外研究结果至关重要。开发一种可以在体内捕获并操纵单细胞的工具可以极大地促进对生物体内活动的研究。体内单细胞运输作为体内细胞操作的基础,可以控制在体内实验中细胞的数目与位置,有助于观察在体内特殊环境中目标细胞的特性。光镊的手动操作实验证明了它有能力进行活体体内单一细胞操作。然而人工操控的能力有限,特别是在多扰动高不确定性的体内环境中进行生物微粒操控存在着很大的难度。本文采用机器人与光镊技术相结合的方法开发出了一种自动细胞运输系统,旨在自动识别、捕获和运输体内环境中的单细胞。本论文研究从以下三个方面展开。
  第一,为了实现体内目标细胞的自动识别与跟踪,建立了一套体内细胞跟踪系统。通过利用诸如背景分割、阈值分割和霍夫变换等图像处理技术,系统可以对复杂体内环境中细胞的位置进行辨识,然后基于细胞运动的位置相关性跟踪被辨识出的细胞,可实现目标细胞的实时跟踪。
  第二,为了实现体内单个目标细胞的自动运送,构建了一套自动细胞运输系统。该系统将检测到的细胞位置作为反馈信息,采用抗饱和比例控制器对光镊位置进行控制,实现了体内细胞的自动运输。在此基础上,进一步开发了一种扰动补偿控制器,以减小血液流动所产生的粘滞阻力对细胞运输所造成的影响。这种控制方法具有细胞运输轨迹可调、轨迹矫正、最小化稳态误差、消除超调等优点,适用于复杂的体内环境。仿真和实验证明了所提方法可以有效地对斑马鱼体内单个血红细胞进行运输。
  第三,开发了一种具有避障功能的扰动补偿控制器,以处理在体内细胞运输过程中的碰撞问题。碰撞是体内运输任务失败的主要原因之一。本文提出了一种碰撞规避矢量法,并结合扰动补偿控制器实现了细胞运输过程中的避障。这种方法可以在一个单一步骤中实现障碍物检测和碰撞规避策略制定,以此减少了在线运算量,同时提高了避障的效率。该方法可以使用不同的避障策略来适应不同的运输环境。仿真和实验验证了所提出的控制器的有效性。
  综上所述,本文提出了一种体内单细胞自动运输控制系统,实现了斑马鱼体内单细胞的精确跟踪,控制与避障。本研究可以应用于诸多生物学研究中,如药物靶向递送,体内细胞提取和癌症转移机制的探索等,为这些领域的研究发展提供了新的研究工具与手段。
[硕士论文] 马婷
生物化学与分子生物学 西北大学 2017(学位年度)
摘要:细胞分选被广泛用于细胞生物学研究、疾病的诊断检测和治疗领域。基于磁性微粒进行细胞分选技术发展了三十多年,该方法较传统方法具有操作方便、分选效果佳、应用范围广等特点,体系中最重要的影响因素是磁性微粒的类型和性能。与微米级磁性微粒相比,纳米级磁性微粒以可稳定捕获细胞、不影响细胞活性并可兼容流式细胞仪,而备受关注。实际上,基于纳米级磁性微粒的细胞分选有一些关键技术需要突破。一方面,纳米级磁性微粒对外磁场响应性较弱,因而对永磁体所具备磁场强度大小有相应的适配要求;另一方面,目前广泛使用的磁性激活的细胞分选技术(magnetic activated cell sorting,MACS)必须以可提供强磁场的磁分离柱完成纳米级磁性微粒对细胞的分选。但这种特殊分离装置价格昂贵,作为一次性耗材有时会被堵塞。因此本研究拟通过对不同组成和构型的纳米级磁性微粒配合简便常规的磁分离装置在细胞分选中的应用进行探索,建立简便、快速、高效的细胞分选系统。
  本人所在团队前期积累了大量的GoldMag金磁微粒材料及其应用研究基础,基于间接细胞分选原理,将经典核壳结构纳米微粒Fe3O4@Au GoldMag NPs (50 nm)、Fe3O4@Au GoldMag NPs (30 nm),新型花瓣型纳米微粒Au@Fe3O4 GoldMag NPs (30 nm)及聚合物包覆磁性微粒Mono-Fe3O4 (50nm)四种纳米级磁性微粒修饰链亲和素(streptavidin,SA)以表面功能化。对上述纳米微粒理化性能和SA固定化容量进行表征,筛选出适合细胞分选的纳米磁性微粒。后以CD4+T细胞分选为模型,通过对捕获抗体、标记抗体、磁性微粒用量、细胞总数以及磁分离器类型的优化,建立CD4+T细胞分选体系,并与国际知名厂商德国美天旎MACS细胞分选体系进行对比,评估所建立方法的特异性及准确性。
  四种不同的磁性微粒经表征分析后,优选新型花瓣型Au@Fe3O4 GoldMag NPs (30 nm),生物素化的一抗结合靶细胞,通过生物素-链亲和素结合靶向锚定目的细胞,达到分选目的,与此同时,几种不同性能的磁分离器也相应做了评价。结果表明,使用DynalMag-Spin磁性分离器,在60μL的标记抗体、65μg的磁性微粒的体系中,分选3.5×106人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)中的CD4+T细胞,其回收率可达93.34%,纯度可达95.21%。基于上述建立的细胞分选系统,我们亦成功实现了CD8+T细胞的成功分离,其回收率为94.13%,纯度为95.86%。这表明花瓣型金磁微粒可作为人外周血免疫细胞分选的一个普适性载体。此外,在建立乳腺癌细胞(MCF-7)作为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)模型的磁性微粒捕获体系时,使用新型花瓣型Au@Fe3O4 GoldMag NPs可以在PBS缓冲液或100%新生牛血清(fetal bovine serum,FBS)环境中捕获约25个癌细胞(早期肿瘤患者外周血中CTCs为1-50个/mL),回收率可达88±2.5%,为系统构建稀有细胞的分选工作奠定了一定的工作基础。
[硕士论文] 陈映洲
物理电子学 江苏大学 2016(学位年度)
摘要:细胞作为生命有机体构成和生命活动的基本组成单位,其形态结构复杂多样,功能多种多样,能准确而及时地反映生物体的各项基能情况。细胞的识别和分析在多个科学领域受到越来越多的关注,尤其在生物医学方面,研究疾病的发病机制,诊断疾病以及评估治疗效果,都依赖于对生物细胞的检测和研究。近年来,多种数字定量相位显微技术发展迅速,因其快速、可定量、非侵入等巨大优势在生物细胞形态测量方面得到了广泛的应用。光路的稳定性、精确性和光信息提取的呈现方式是影响光学生物细胞检测的主要原因之一。因此、对生物细胞相位成像技术改进和提高,以获得高稳定性、高精确性的研究是一项十分有意义的工作。
  本文对细胞相位显微检测技术的几种典型光路进行特征分析,研究其光路结构和主要使用的光学器件,发现好的实验结果并不一定需要好的实验平台和高成本的光学器件。基于马赫-曾德尔干涉光路应用的普遍性,对传统马赫-曾德尔光路下的相位显微成像进行了动态仿真实验,并且设计搭建了两种结构不尽相同的马赫-曾德尔相位显微光路,开展了比较性研究,仿真结果和实验结果均表明了简单的实验结构获得的结果并不一定差。
  本文依据相位显微成像技术对简单性、低成本、高稳定性的需求,应用典型相位显微光路的基础结合几何光学的知识,设计了一款免显微物镜共光路的相位显微方法。该方法只需简单的光学器件,如透镜、反射镜,实验操作简单。并采用了共光路形式,避免了物参异路对实验结果产生的噪声等误差。根据所设计的免显微物镜共光路相位显微方法,搭建验证性实验光路,得到干涉图。与基于马赫-曾德尔光路实验获得的实验结果比较,验证了本方法的可行性和高效性。实验结果在生物细胞形态结构的重建方面具有很好的应用价值,为后期更加深入的研究提供了探究思路。
[硕士论文] 梁敏捷
物理电子学 江苏大学 2016(学位年度)
摘要:细胞是生命基本结构单位和功能单位,其形态不一,大小各异。对细胞大小和形态特征的研究在生物细胞学、生命科学等领域有着极其重要的作用,促使细胞光学定量检测技术成为各领域研究的重要课题。对细胞进行成像的方法众多,各有千秋,需要根据实际情况选取不同的成像方法,根据其成像理论,大致可分为干涉相位测量法和非干涉相位测量法。计算机断层成像技术,是探测样品多个角度的透射场数据进而重建物体内部结构的一类技术。但是在干涉相位成像技术方面,由于样品的厚度信息与折射率信息耦合在一起,导致异质样品的亚结构不能很好地被表达出来,并且由于衍射效应的影响,干涉图的分辨率也受到了一定的限制。对于成像重建技术而言,重建图像的过程往往耗时较长且重建质量的量化表征还不够完善。
  针对此类问题,本文以国家自然基金(11374130)正交相位显微下的有核细胞亚表面3D特征识别方法与技术、(11474134)神经细胞放电动力学行为的全域光相位成像分析方法与技术、江苏省自然基金(BK20141296)基于数字相位分布的生物细胞瞬态识别光学检测方法、以及江苏省“六大人才高峰”计划(2015 DZXX-023)基于双路相位光信息下的血细胞亚结构3D成像重建方法等基金项目为支撑,在查阅和分析大量文献资料的基础上,总结了各成像方法的原理及特征。基于MATLAB仿真系统,建立了细胞模型,展开了生物细胞特征分析的研究,主要分为以下几个部分:
  针对神经细胞结构特征和红细胞圆盘状结构特点,基于MATLAB系统建立了类神经细胞模型和红细胞模型。运用类神经元细胞模型,讨论了计算机断层成像技术中,投影个数、投影角范围及对称轴对图像重建质量的影响。考虑到实际应用中噪声情况的存在,同时在文章中增加了加入噪声、运用滤波函数除噪过程的重建效果分析。针对传统图像评价参数的不足,提出了一种改进的图像质量评价参数,并证实了其可行性。
  定量相位成像技术无论在数据采集速度还是在空间分辨率方面都取得了非常可喜的成绩,但是由于折射率与光程的积分作用,失去了光轴方向的结构细节信息,主要应用于均质相位体细胞的观察,尚不能解构异质相位体的内部结构;目前临床上常用的细胞检测分类技术大多基于光散射原理,但是由于散射光提供的信息是测量体积内的平均值,没有很好的空间分辨率,而且传统的检测原理一般都是基于Mie散射理论,该理论仅对球型模型有效,因而不能应用于白细胞亚类特征等其他复杂细胞的识别。基于干涉相位成像和光散射检测技术的优缺点,本文提出了一种可同时接收样品光散射和相位显微信息的装置,此装置基于共轴迈克尔孙干涉光路和米劳干涉装置,能同时接收样品的干涉图样和散射强度信息,基于散射理论和相位成像理论开展计算,最终可获得高精确度的相位体样品形态、结构和大小信息。
  干涉相位成像方法因其信息计算处理过程简捷,在相位显微成像中被广泛应用。但是由于衍射效应,干涉法相位成像的分辨率会有所降低。本文基于VirtualLab系统,对比分析了干涉相位成像和衍射相位成像的结果。
  干涉成像光谱技术是成像技术和光谱技术的有机结合,在实际应用中,干涉图在最大光程差处会突然截止,导致干涉图出现尖锐不连续变化,造成复原光谱扰动,因此需要采取一定的措施来缓和在最大光程处干涉图的不连续程度。本文基于实验所得的干涉图样,运用MATLAB系统,分析了4种切趾函数的作用,并给出了处理后的相应干涉曲线,结果表明,经切趾处理后干涉图两侧都是缓和变化的。
  本文的研究在细胞模型建立、图像重建效果影响因素分析均取得了预期结果。为细胞定量相位成像技术提供了一种新的装置选择,分析了干涉相位成像和衍射相位成像结果,并加以实验验证。所得结果可为生物细胞形态研究提供一定的应用基础。
[硕士论文] 冯奇亮
信息与通信工程 太原理工大学 2016(学位年度)
摘要:生物粒子的快速分离和提纯在医学诊断、生化分析和水质监测等领域有重要的现实意义。目前常用的分离方法和技术包括离心分离法、色谱分析法、流式细胞法和介电泳分离技术。基于介电泳技术的微流控芯片以其低损耗、易集成、低成本、快速分离等优点成为粒子操控与分离的一种重要手段,尤其在生物细胞的分离、提纯和分析中有重要的实用价值。
  本文调研了国内外介电泳芯片的研究现状及分离芯片的分类,在前人设计的基础上对分离芯片结构进行改进。采用文献和实验研究相结合的方法,仿真模拟出不同结构形状电极对粒子操控分离的影响,旨在通过优化分离芯片的结构,提高人体活死红细胞的分离效率。本文开展的具体研究工作包括:
  首先,对球形粒子在非匀强电场中的受力过程进行分析,在此基础上推导了介电泳力及行波介电泳力的数学表达式。抽象出细胞的球形模型,利用MATLAB计算出活死细胞的Re(K)、Im(K)值随频率的变化曲线。利用COMSOL仿真软件,对芯片的电极结构、形状进行仿真,确定最终的电极结构。模拟电场的分布及粒子在微流体通道中的运动轨迹。在此基础上进一步优化电极结构,确定了分离芯片的结构参数。
  然后,对分离芯片的基底材料和微流体材料进行选择,经对比分析,最终确定玻璃作为基底材料,聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)作为微流体材料。介绍微流体和电极阵列的具体加工过程,试剂、材料和仪器的使用,以及相关参数的确定。实现分离芯片的基底与微流体通道的等离子键合;利用金丝球焊机引线实现了分离芯片与PCB的封装。
  最后,本文设计制作了芯片分离区域的控制电路,搭建了实验测试系统平台。利用介电泳分离芯片对人体活死红细胞进行操控分离实验,在芯片的不同区域实现了活死细胞的操控与分离,结果表明该芯片对细胞有较好的操控与分离效果。本文为介电泳与行波介电泳的结合使用提供了全新的思路,具有进一步的研究价值。
[博士论文] 徐媛媛
机械工程 江苏大学 2016(学位年度)
摘要:细胞是生命体结构和功能活动的基本单位,其形态结构特征和内部组成成分决定了它的健康状态、功能和活动等等,这些都与生命科学中遗传、疾病、免疫与康复等密切相关。细胞的研究,尤其是内部结构和动力学行为的分析有赖于显微技术的水平。传统的显微镜已无法满足生命科学研究的要求,发展新的显微成像方法与技术用于实现细胞原态、无损、超快、精密、动态的显微成像是生命科学研究的迫切需求,也一直是研究员们长期追求的研究目标。
  定量相位显微成像技术凭借免染色、非侵入、无损伤、可定量化等优势,成为生物细胞显微成像非常有利的工具。近十几年来,研究员们相继提出了许多先进的定量相位成像技术,并成功用于细胞相位成像、类别识别、参数测量以及动力学行为分析等应用领域。大部分定量相位成像技术都是基于光波干涉原理,通常包括干涉图样采集、相位信息恢复以及可能需要的相位解包这几个过程,其中相位恢复技术主要决定着相位成像的质量、速度和精确度,因此相位恢复方法及其成像技术的研究具有极其重要的意义。本课题组通过系统查阅相关资料发现在相位恢复技术中尚有一些问题有待积极开展研究。诸如第一:在广义相移干涉相位恢复中相移-奇点问题;第二:兼容提高恢复处理速度及探测器空间带宽的问题;第三:在应用方面上存在着较多的限制条件。对此,本文以国家级、省级等多个项目为支撑,主要围绕相位恢复方法及其成像技术的不足和技术发展要求开展了系统性的基础理论及其关键应用技术的研究,并取得了预期效果,主要成果如下:
  (1)系统分析了目前各类典型相位成像的技术特征及其技术下的典型相位恢复方法特征,包括相移获取方法。找出了两步相移干涉中π相移奇点的成因,提出了在满足物光波与参考光波强度相等的情况下,通过数值计算两干涉图样的和与差可解决π相移奇点的方法,并给出了相位恢复的代数方法以及该方法的模拟验证。
  (2)针对干涉显微技术中一些传统相位恢复方法存在限制条件多、相移检测精度不够高、相位恢复处理速度不够快等问题,基于局部微分算子的灵敏特性和数值计算能力,分别提出了适用于所有载频干涉和任意记录模式下两步相移干涉的新型相位恢复方法,并且得到了仿真实验和光学实验的验证,这些方法可有效地解决上述的问题。此外,还提出了利用相位梯度粗略估计细胞形态信息的方法,其中非均质亚类白细胞的相位梯度结果表明了该方法的有效性,以及用于细胞类别识别的可行性。
  (3)针对干涉显微技术中噪声的存在,结合三步相移干涉,提出了抗噪声的矩阵二范数运算相移确定方法。该方法易于执行,对噪声不敏感,只需计算每两干涉图样强度差的二范数,无需计算其他物理量,降低了成像要求。针对二范数相移获取运算需满足条纹数目大于1的限制条件,提出了类一矩阵范数运算的相移确定方法,以及利用相移差为π的两干涉图样消除背景光强的方法。这些方法得到了仿真实验和光学实验的验证,结果表明了他们的有效性以及精确性。
  (4)通过对衍射相位场统计平均特性的分析,提出了在两步或是更多步相移干涉下利用统计平均运算和两干涉光波之间空间频率关系特征的相移拓展测量方法。该相移可以是完整周期(0,2π)内除奇点π外的任何值,从而真正实现了广义相移干涉,降低了对相移器精度和成像条件的要求。均质红细胞的定量相位模拟结果和聚苯乙烯小球的实验结果说明了该方法在理想以及噪声环境下的高性能。
  (5)基于本文在理论上的研究成果,依据所提及的相位恢复方法对成像实验的技术要求,开展了关键技术的设计研究。特别是提出了在单个探测器下利用两个相同侧向位移分束镜和在两个探测器下利用多个普通分束镜分别来实现的瞬时两步相移成像方法。考虑到相位成像系统的稳定性,本文提出了利用光栅衍射0级先后与+1级和-1级衍射光相干涉的两步衍射相位成像方法。该成像方法不仅保留了传统衍射相位显微技术高稳定和实时测量的优势,还拓展了其适用范围,提高了相位恢复的精度。
  本文的研究工作不仅仅从理论上取得了一些突破,而且从实验上也得到了支撑,为实现细胞快速成像和实时测量提供了更多的选择,也为细胞更深入的定量检测研究提供了参考。
[硕士论文] 罗宇峰
分析化学 中国科学技术大学 2016(学位年度)
摘要:点击反应作为一种高选择性和高反应效率的方法,在化学和生物学领域得到非常广泛地应用。目前,单一点击反应已广泛应用于细胞成像,但是利用多个正交反应对同一生物体系进行多重标记仍然是一个挑战。本研究将两种不同机理的点击反应—一种是tetrazine-alkene[4+2] Diels-Atder cycloaddition,(四嗪-烯烃[4+2]狄尔斯—阿尔德环加成反应),另外一种是CBT-Cys condensation reaction(2-氰基苯并噻唑-半胱氨酸缩合反应)——结合起来,验证其正交性,并将其运用于常见的HepG2细胞的细胞器成像中,实现了同时显示细胞线粒体和细胞膜的状态。实验结果说明在同一细胞中同时运用两个(或者多个)点击反应标记多个细胞器是可行的。
[硕士论文] 刘亚红
光学工程 南京邮电大学 2016(学位年度)
摘要:基于荧光强度的荧光显微成像容易受激发光功率、样品光漂白和荧光染料的浓度分布等因素的影响,因此难以做到定量测量。荧光寿命一般来说不受激发光强度、荧光团浓度和光漂白等因素的影响,仅与荧光团所处的微环境密切相关。因此发光寿命成像(PLIM)成为一种新的成像手段来弥补荧光显微成像的不足。在生物学的研究中常用到的染料,它们的荧光光谱有时非常类似,难以通过分析其荧光光谱将它们区分,但它们的荧光寿命一般不同,本论文利用PLIM技术解决上述生物学研究上的困扰。同时,本论文利用PLIM技术对细胞内两种活性物种进行检测。
  1.本文利用多种细胞染料对细胞膜、线粒体、细胞核同时进行标记,用共聚焦荧光显微镜成像和PLIM成像得出:共聚焦荧光成像能将发光光谱相差较大的不同染料区分开,当几种染料发光光谱重叠时,PLIM技术利用染料发射寿命的不同,也可以有效地将其逐一区分。
  2.正常的RAW细胞内次氯酸的含量很少,当利用LPS和PMA刺激RAW细胞时它会产生一系列炎症反应从而内源性产生大量次氯酸。本文将正常RAW细胞和被刺激后的RAW细胞共培养,利用一种对次氯酸响应的铱配合物结合共聚焦荧光成像和PLIM技术,实现对同一种细胞的不同状态的分辨。
  3.HeLa细胞在NEM和H2O2的刺激下,细胞内pH环境会产生变化。本文利用一种对pH响应的铱配合物探针结合PLIM技术,实现对HeLa细胞内部pH值的检测。
[硕士论文] 王凯军
生物物理学 中南林业科技大学 2016(学位年度)
摘要:表面等离激元(SPPs)是由电磁场辐射激发引起金属表面自由电子在金属/介质表面的固有振动,它是光和纳米金属完美结合的产物。由于对周围环境折射率变化非常敏感,在光学传感器的潜在应用受到广大国内外学者追捧。SPPs共振技术由于其独特的优点,在研究生物分子相互作用、生物分子检测及成像等方面展现了它独有的魅力。本论文基于SPPs与还原性细胞色素(cytochrome c,Cytc)分子之间的等离子能量转移(plasmon resonance energy transfer,PRET)的物理机制,采用时域有限差分方法,研究了还原性Cyt c分子对周期金属光栅及金属狭缝的光透射性质的影响。我们的研究工作可以为设计生物探测器件提供理论指导,在超灵敏生物传感器和进行活体生物分子成像方面具有很大的潜在应用。具体的研究内容如下:
  1、利用时域有限差分法,研究了含Cyt c分子的一维金属光栅结构的电磁波透射谱特性。研究发现这种周期结构产生的表面等离子激元和局域表面等离子激元混合模式,会对吸附在其上面的Cyt c分子有着明显的相互耦合。表面等离激元的能量会直接转移给Cyt c分子,导致了其透射峰上出现霹雳现象,我们的研究加强了对PRET现象的理解,研究结果在分子识别和检测方面有潜在的应用。同时,我们分析了该结构参量对其透射谱的影响。发现结构周期、狭缝宽度、狭缝长度以及分子层数可控制透射谱线的形状,但是透射峰凹陷的位置不会改变。这说明透射谱中的劈裂谷波长由Cyt c分子本身性质所决定。由于结构参数的不同,导致透射谱存在着很大的差异。在实际应用中,结构参数的优化对设计器件成功具有指导意义。
  2、我们讨论了基于局域表面等离激元单缝金结构的透射谱特性。通过和周期结构比较,发现在其透射谱上也会出现同样的物理现象,在对应Cyt c分子吸收峰的位置透射谱上出现透射谷,这也暗示狭缝的局域表面等离激元和Cyt c分子间存在能量转移机理。同样,我们研究了狭缝结构参量对其透射谱的影响,发现尽管其透射率较低,但相对透射效果明显。研究证实了基于PRET的局域表面等离子激元共振技术检测生物分子的可行性。
[博士论文] 胡芳馨
分析化学 西南大学 2015(学位年度)
摘要:细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单元,其中存在一些具有特殊生理功能的活性小分子物质,如活性氮分子(RNS)和活性氧分子(ROS)等。它们是一类含氮或含氧自由基或分子,对于脂类、蛋白质以及核酸分子均有较高反应活性。基于细胞内RNS和ROS的浓度,它们既可以充当“朋友”亦可以是“敌人”,其浓度处于正常值时,参与细胞信号传导、控制细胞的增殖、分化与凋亡、促进多种因子细胞生物学效应的启动;而当平衡打破,其浓度升高时,则会引起氧化应激、导致细胞膜脂质过氧化、引起DNA的氧化损伤、介导细胞内蛋白质的变性等,进一步造成细胞癌变和死亡、肿瘤发生和发展、甚至心血管疾病等。鉴于此,原位实时定量检测活细胞释放RNS和ROS,不仅能帮助我们从分子水平理解它们介导生理过程,而且有助于我们揭示其引发相关疾病的机制,从而进行疾病早期检测、预防及选择适当的治疗方法。然而,RNS和ROS的实时灵敏检测极具挑战性,其释放的量很少且半衰期短、活性高、易与生物环境中其他分子发生反应。因此,构建有效、灵敏的检测平台及生物相容性良好的细胞生长平台是RNS和ROS原位检测的关键。电化学方法操作简便、特异性强、响应快、灵敏度高且成本低,因而成为细胞释放活性小分子检测的常用技术手段。碳材料如碳纳米管、石墨烯等被广泛应用于电化学平台的建设及细胞相关实验的研究。
  本论文设计并合成了功能纳米材料协同催化的仿生酶,提高了检测稳定性和选择性,并构筑了具有生物兼容性和特异催化活性的纳米界面,实现了高灵敏度活细胞释放RNS和ROS小分子的实时动态检测,并深入探讨了其催化机理。在此基础上,进一步构建了活细胞直接生长的2D及3D自支撑传感膜,并系统研究了该传感膜的细胞粘附及电化学性能,结果表明将细胞直接生长在传感膜上可以大大提高检测的灵敏度。主要内容及结果归纳如下:
  1. NO是众多癌细胞病变过程中释放的一种信号传导分子。然而,由于NO极易扩散、浓度低、寿命短,实现 NO的实时检测仍是极大的挑战。本工作通过水热法合成了形貌可控的还原氧化石墨烯-二氧化铈纳米复合物(rGO-CeO2),并用它来构建高灵敏的NO实时检测传感器。rGO-CeO2纳米复合物中 CeO2的晶体形貌对rGO-CeO2传感器的性能有重要影响。其中,六边形的CeO2纳米晶体催化性能最佳,达到了最高的灵敏度(1676.06 mA/(cm2·mol/L)),较宽的线性范围(18.0 nmol/L到5.6μmol/L)及低的检测限(9.6 nmol/L)。这一最优性能主要归功于特殊形貌的CeO2良好的催化性能及rGO优良的导电性和高的比表面积。本工作展示了一个通用的方法通过有效调控复合物中单组分的优势来合成具有超强协同作用的传感平台,同时也为快速实时检测活细胞释放NO提供了极大的可能性。
  2. O2-是细胞释放的一种ROS小分子,正常情况下对细胞的多种生命活动起着重要的介导作用,但是当其含量超过正常水平时,会打破体内氧化还原平衡,导致氧化应激,进而损坏细胞、引发病变,因此,实时定量检测细胞释放的O2-对于疾病的诊断及预防非常重要。本工作中,采用DNA诱导合成的磷酸锰梭状材料(DNA@Mn3(PO4)2)作为O2-生物模拟酶功能化修饰氧化石墨烯(GO)。该材料制备的特异性生物模拟酶传感器表现出较高的灵敏度(1556.97 mA/(cm2·mol/L))、较宽的检测范围(6.5 nmol/L到8.85μmol/L)和极低的检测限(2.1 nmol/L)。此外, DNA@Mn3(PO4)2/GO传感器实现了原位实时检测药物刺激下人类皮肤癌细胞和正常细胞释放的O2-,表现出良好的实时定量检测性能。由实验结果可得,癌细胞释放的O2-量为正常细胞的5倍(平均值)。
  3.原位实时检测ROS对于研究各种基础的细胞生理过程极其重要,但是目前报道的工作大多检测的是生长在培养基中细胞释放的ROS,其半衰期短、浓度低、活性高,造成测试的灵敏度和选择性都受到极大的限制。本工作中,我们提出了一种新的方法将活细胞直接生长在 DNA/Mn3(PO4)2修饰的垂直生长碳纳米管(VACNT)阵列上来构建柔性支撑杂化膜,其中DNA/Mn3(PO4)作为一种高效的O2-仿生歧化酶,表现出很高的电催化活性;VACNT具有优异的导电性和生物相容性,提供了快速电子转移载体和细胞生长平台,此外细胞直接生长在传感膜表面大大缩短了检测底物与活性位点之间的扩散距离,从而实现了高灵敏实时检测癌细胞在药物刺激下释放的O2-。与检测培养基中细胞释放O2-相比,检测灵敏度增加了6倍多,证明活细胞分泌的O2-没有经过扩散过程或经过很短的扩散距离,直接被生物膜捕获并催化。这一设计缩短了细胞释放的检测目标物与传感器之间的距离,避免了在此扩散过程中,大部分目标物由于活性高、寿命短而衰减的可能性,大大提高了传感器的灵敏度。
  4.众所周知,细胞在生物体内的实时生长环境是三维(3D)的,为了研究人类的生理活动机理,我们必须在体外培养细胞,要想得到更准确的研究数据,创造体外3D细胞培养环境极其重要。然而,现在报道的大部分工作均是基于2D平台。本工作中,我们创造了一个3D细胞贴附/生长环境,首先通过化学气相沉积法制备3D泡沫石墨烯(GF),然后采用绿色、简易的基底增强-化学沉积法在GF上修饰Pt纳米颗粒。该Pt@GF复合物表现出良好的多功能性,其中3D大孔GF表现出了拟人体实时生物环境,为细胞的生长提供了良好的贴附/生长支架以利于后续细胞释放O2-的高灵敏实时检测,此外,Pt纳米颗粒对O2-表现出了超强的电催化活性。荧光显微镜和扫描电子显微镜的观察结果表明,细胞在3D Pt@GF复合物上的生长状态、表达、贴附及代谢活动相较其在2D Pt@石墨烯片(Pt@GS)复合物上,均表现出更优的性能。与生长在2D Pt@GS上的细胞相比,本文提出的3D装置检测细胞释放O2-灵敏度提高了1.4倍,这可能归功于电子可以在O2-和GCE表面直接沿着石墨烯骨架传递、迁移,形成一条电子传递捷径,极大地加快了电子转移速率。然而,对于GS来说,电子在其间的传递必须经过较长距离到达石墨烯层的缺陷边缘穿过石墨烯层到达GCE表面。因此,3D Pt@GF复合物更有希望应用于活细胞相关的研究,如药物递送、组织工程学及再生医学等。
[博士论文] 郑晓姗
物理化学 厦门大学 2015(学位年度)
摘要:细胞是组成生物体结构和功能的基本单元,一切生命现象都是细胞活动的体现。细胞的生命活动是一个时刻发生变化、同时又具有显著空间差异的过程,其增殖、新陈代谢、信号转导等生命活动直接影响着人类的生长和发育,一切疾病的发生发展机制也必须以细胞病变研究为基础。因此,细胞体系研究是现代生命科学和医学研究的重要基础。然而,由于细胞体系具有复杂性、动态性和具有生命活性等特点,发展和利用无损、可靠性好、灵敏度高的分析技术对复杂细胞体系的生命活动进行研究具有十分重要的学术意义及应用价值。
  表面增强拉曼光谱(SERS)技术因其具有极高的检测灵敏度、能从分子水平上获取待测体系的本征信息,谱峰窄、适用于多组分检测、无损且不受自发荧光和水的干扰等突出优势,特别适合于生物体系,尤其是活细胞体系的研究。目前,SERS作为一种新兴光谱技术已经在生物分子、病毒、细菌、细胞、组织甚至活体等生物体系的研究中都发挥了重要作用。SERS应用于细胞体系研究的基本方法主要有直接检测和间接检测两类。直接检测法充分发挥了SERS技术能获得细胞体系本征信息的优势,但细胞体系的SERS光谱信息通常十分复杂,需要各种生物分子的标准SERS光谱作为参考对其进行可靠归属和分析;然而,由于大部分生物分子的拉曼散射截面较小且与纳米结构的作用较弱,目前获得生物分子的高灵敏、可靠SERS光谱仍然存在挑战。由于细胞内含有大量生物分子,因此利用SERS直接检测方法可以获得细胞自身组分的本征光谱信息。但对于细胞内的一些重要参数,如pH和温度等,没有能直接提供该参数特征的细胞内物质,因此需要借助外来探针作为指示,继而利用SERS间接检测方法对这些细胞的重要参数进行传感。间接检测法利用有标记分子修饰的SERS探针强信号和多功能的优势,特别适合于细胞体系微环境传感、多组分检测以及细胞成像研究。但SERS探针获得的信息可能受到细胞复杂环境的影响,因此灵敏、可靠地对细胞体系进行监测是间接检测的核心问题。此外,如何在开展研究的同时尽量保证细胞活性以及生命活动的正常进行也是细胞体系研究需要重视的问题。
  针对以上问题,本论文发展了基于SERS技术的可靠、灵敏的直接和间接检测方法来开展细胞体系的相关研究,主要内容和成果如下:
  1.发展了适用于生物分子直接检测的亚稳态SERS检测方法,通过对样品制备和SERS检测方式的改进确保了用于生物分子检测时的灵敏度和可靠性。利用基于金纳米粒子的亚稳态SERS检测方法首次获得了构成生物体各种蛋白质的20种常见氨基酸分子的高灵敏、可重现的SERS光谱,并成功拓展至多肽以及蛋白的SERS直接检测。
  2.采用小牛血清蛋白(BSA)作为保护分子对探针表面进行修饰的方法制备了基于SERS技术的pH传感纳米探针并用于活细胞内的可靠pH传感。pH传感探针主要由三部分组成:金纳米粒子作为SERS增强基底,对巯基吡啶(4-MPy)作为pH传感分子吸附在金纳米粒子表面,最外层的BSA作为保护分子层起到了避免探针严重聚集、保护信号分子的稳定性以及改善探针生物相容性的重要作用。通过系统的表征,该pH传感纳米探针表现出了优越的pH响应效果以及应用于细胞体系时的稳定性、可靠性和生物相容性。将这种灵敏、可靠的pH传感纳米探针与活细胞共孵育后进行SERS成像,获得了单个活细胞内pH分布图像。在此基础上,进一步对探针进行了穿膜肽修饰用以提高探针的细胞内化效率,实现了细胞内pH分布的高效成像以及SERS-荧光双模式成像。
  3.通过对大面积、均一、具有高增强SERS效应的金纳米粒子组装基底进行pH传感分子(4-MPy)的修饰,制备了基于SERS技术的pH传感基底用于贴壁活细胞外的可靠pH传感。首先探究了4-MPy在金纳米粒子组装基底上的吸附行为和SERS光谱变化机制并系统地表征了pH传感基底的pH响应效果、灵敏度、稳定性、循环性能、响应速度和可靠性。随后,对在pH传感基底上的贴壁活细胞进行SERS成像,获得了单个活细胞外pH分布图像。
  4.为了尽量保证活细胞研究中细胞的活性,建立了细胞原位培养与显微检测平台。通过显微观察,活细胞在原位培养状态下的生命活动状态更为活跃,体现了原位培养对于开展活细胞研究的重要性。利用细胞原位培养与显微检测方法分别开展了pH传感纳米探针细胞内化过程的原位实时成像表征,肿瘤细胞分裂过程中的可靠pH监测以及TGF-β刺激后肿瘤细胞外pH微环境变化的动态监测等初步研究。
[硕士论文] 张强
材料学 青岛大学 2015(学位年度)
摘要:单细胞技术能够解析生命体系最深层次的异质性和运作机制,快速分离获取特定单细胞是单细胞研究的前提和关键技术。传统单细胞分离技术,如:连续稀释、显微操作、激光光镊、流式细胞术,往往费时费力且效率较低或需要昂贵的设备和专业化的操作技术,限制了普通生物实验室自主化开展下游单细胞分析的研究。本论文建立了一种操作高效、灵活易用的、成本低廉、基于液滴微流控技术获取单细胞的平台并成功应用于单细胞分析。
  第一章绪论中,首先说明单细胞分析、单细胞分离技术的意义和重要性;其次综述了各种单细胞分离技术及各技术的弊端;再次综述了基于微流控芯片的单细胞操纵技术,有望用于单细胞分离与分析;最后阐明本论文的研究目的和意义。
  第二章,主要介绍了本论文中所用的实验材料和实验方法,其中包括制作微流控芯片的材料及其制作方法。
  第三章,建立了一种毛细管调制的电磁阀吸吮微流控操纵技术。通过毛细管调整电磁阀管路系统的阻力,创新性地将电磁阀的扰动改变为微流控控制驱动力;且该吸吮效应简单易用、稳定可靠、大小可控,并成功将其用于细胞/液滴分选、液滴产生等微流控主动控制。
  第四章,基于电磁阀吸吮液滴分选建立了一种简单易用的PDMS材质的微流控芯片系统。该系统首次建立并集成包裹细胞液滴产生单元、毛细管调制的电磁阀吸吮单细胞液滴分选单元、被分选单细胞液滴经由横向嵌入的毛细管导出单元,实现了单细胞的简单分离获取。经分选导出的液滴单细胞包裹率达90%以上,单个酵母细胞存活率达到80%以上,单个酵母细胞成功地进行了实时荧光定量聚合酶链反应和全基因组扩增,为单细胞测序奠定了基础。该高效低成本、灵活易用获取单细胞的平台有望克服单细胞获取的瓶颈,加速单细胞研究进展。
[硕士论文] 宋建民
机械工程 哈尔滨工业大学 2015(学位年度)
摘要:生物细胞的力学特性与细胞的结构、功能以及细胞的“生老病死”息息相关。细胞本身是由诸多细胞器组成,其中细胞核作为遗传物质的主要载体细胞器,在整个细胞的生命周期中都占有至关重要的作用,研究细胞核的力学特性对于深层次探究细胞生命的奥秘有着重要的意义。研究细胞特性的诸多方法中,原子力显微镜(AFM)以其高精度、范围广、能够在活体环境下测量等优点,成为了纳米生物力学领域最重要工具之一。
  本文基于自主研发的AFM纳米机器人系统,结合改进的AFM探针,以及升级的AFM光学观测系统,对活体细胞及细胞核进行力学特性原位测试和分析。该方法实现了活体细胞及细胞核的静态力学特性原位测试,为活体细胞动态原位测试奠定基础。主要研究内容包括:
  首先,本文设计了新式的AFM探针。设计充分考虑了活体细胞原位测试问题、刚度问题、频率模态等问题,使得探针具有合理的结构和形态。该设计使得AFM纳米机器人系统能够在对细胞造成最小损伤的前提下,直接对细胞核进行原位测试操作。
  其次,为了获得更好的实验数据,提高实验的可视性,对原AFM纳米机器人系统进行升级改造,设计、搭建并调试了侧视-底视观测系统,改进了细胞测试所用左右操作手臂和细胞培养皿。改进后系统可以直接观测细胞测试过程中的探针与细胞的横向与纵向位置关系。
  最后,本文利用改进后系统对细胞及细胞核进行原位测试。使用不同探针在相同速度下,对细胞进行了压痕实验,得到力-位移数据,并进行分析处理,得到细胞在不同探针下的细胞静态力学特性结果。
  所研制的新式AFM探针及侧视系统能够更加直观有效进行活体细胞力学特性的原位测试,并将细胞测试从单一视角,转变为多视角同时观测,对纳米生物力学的研究具有推动作用,对于细胞内部的研究提供了一种新的途径。
[硕士论文] 王程
仪器仪表工程 桂林电子科技大学 2015(学位年度)
摘要:在生物医学、人类繁殖和畜牧业育种等方面,经过50多年的发展,细胞冷冻处理技术已经发展成为一项确实可行的保种、育种技术。但当前的细胞冷冻处理前的细胞换液过程大多是由人工操作完成,成本高、效率低、可靠性差。因此本文在分析了当前国内外运动控制技术的基础上,根据细胞冷冻前细胞换液的特点和需求,研究和设计了一种细胞冷冻自动机运动控制系统。
  本文分析了常用的步进电机加减速算法的优缺点后,根据余弦型三角函数的特点以及电机调速的要求采用余弦型S曲线调速算法,然后基于 ARM的Cortex-M3内核的STM32微控制器制作了运动控制系统的硬件电路,基于μC/OS-II操作系统编写了应用程序,并基于 LabVIEW设计了上位机监控界面。细胞冷冻自动机运动控制系统通过对多轴电机的控制,实现了模拟细胞自动化换液过程。在X-Y双坐标工作台速度不高于20mm/s下,达到了系统对1mm的定位精度要求。
  论文的主要工作及研究成果有:
  1、利用多个电动机机械构件按照预定的方式移动,以实现自动机对微流控芯片上的细胞进行自动换液。深入研究了步进电机的加减速控制算法,采用余弦型S形曲线调速算法,实现电机平滑地启动和停止。
  2、通过对自动机运动特性的分析,给出控制系统的总体设计方案,并对微处理器的型号、操作系统、电机调速算法等进行了介绍和选择。
  3、设计了控制系统的硬件电路总体方案,其中包括 STM32最小系统模块,脉冲幅值转换电路、28BYJ步进电机驱动电路、串口通信模块、温湿度监测电路模块等。分析了各个电路模块的功能,并进行了具体的电路设计。
  4、以μc/os-II操作系统为基础搭建系统软件平台,采用模块化的设计思维将系统软件按照功能进行划分与设计。基于 LabVIEW设计了上位机界面,实现室内温度湿度、电机转速等信息的动态显示和实时保存。
  5、完成了对系统的设计后,根据系统要求的性能指标对系统进行了测试分析。仿真和实验验证表明基于三角函数的S曲线调速算法是可行的,而控制系统的定位误差测试结果表明所设计的控制系统满足课题的性能指标要求。
[硕士论文] 施俊伟
预防兽医学 华中农业大学 2015(学位年度)
摘要:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)简称结核杆菌,是结核病的病原菌,目前世界上约1/3的人口感染结核分枝杆菌,其中5%-10%的感染者将发展成为活动性结核病,全球每年新增结核病患者约880万,死亡约300万。细胞凋亡是细胞发生的一种程序性死亡,在组织分化、器官发育、机体稳态等生理过程中发挥着重要作用。尽管细胞凋亡是一种正常的生理现象,但是异常的细胞凋亡常引起许多疾病。调节宿主细胞凋亡是结核分枝杆菌致病性的一部分,影响结核分枝杆菌的生存、繁殖、扩散等过程。
  快速准确的检测细胞凋亡是研究凋亡相关机制以及评价凋亡对疾病过程影响的基础。Caspase-3的激活是细胞凋亡的重要标志,常被应用于凋亡检测方法的建立。为了方便快速的检测结核分枝杆菌蛋白对细胞凋亡的影响,本研究将caspase-3的识别序列与萤火虫荧光素酶融合表达构建了一个新型的caspase-3报告质粒,用于细胞凋亡的检测,并筛选了部分结核分枝杆菌编码的蛋白,具体研究内容如下:
  1.Caspase-3报告质粒的构建及验证
  本研究构建了四种caspase-3报告质粒,将四种报告质粒分别转染HeLa细胞,在细胞凋亡阳性刺激物刺激下,四种报告质粒荧光素酶的值明显增加,同时荧光素酶被切割,说明报告质粒构建成功。细胞凋亡发生时,233-DnaE-DEVDG激活超过25倍,其对照的值处于较低水平,而另外三种报告质粒和相应对照的值同时升高。这些结果说明233-DnaE-DEVDG背景值低、敏感性高,更适合应用于检测细胞凋亡。
  2.结核分枝杆菌ESAT-6家族蛋白的筛选
  将结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族真核表达质粒、233-DnaE-DEVDG和TK共转染HeLa细胞,通过双荧光素酶试验检测结核分枝杆菌ESAT-6蛋白家族成员对细胞凋亡的影响。实验发现esxA、esxT和esxL能激活233-DnaE-DEVDG并呈剂量依赖性,esxC不能激活233-DnaE-DEVDG。
  3.筛选结果的验证
  为了验证筛选结果的可靠性,本研究通过经典的细胞凋亡检测方法验证。Caspase-3在细胞凋亡相关通路中处于中心位置,是评价细胞凋亡的核心指标。本研究通过Western Blot检测发现esxA和esxT可以促进caspase-3的活化,阴性对照esxC不能促进caspase-3的活化;细胞凋亡检测试剂盒染色后,通过流式细胞仪检测发现esxA和esxT可以上调凋亡细胞比率。
  4.核因子-κB(NF-κB)参与esxT诱导的细胞凋亡
  NF-κB通路与细胞凋亡密切相关,在一定情况下,NF-κB激活是细胞凋亡所必须的。为探究NF-κB通路是否参与esxT诱导的细胞凋亡,本研究通过双荧光素酶试验检测发现esxT能激活NF-κ3启动子并呈剂量依赖性,用BAY11抑制NF-κB的激活会导致esxT诱导的细胞凋亡水平部分下降,说明NF-κB的激活参与了esxT诱导的细胞凋亡。NF-κB通路主要通过促进其下游的促凋亡基因表达促进细胞凋亡,为进一步寻找esxT通过NF-κB调控了哪些促凋亡基因的表达,本研究通过Real-Time PCR和Western Blot检测发现esxT能在mRNA和蛋白水平上调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的表达。这些结果说明esxT可能通过NF-κB上调其下游的TNF-α和TRAIL促进细胞凋亡。
[硕士论文] 钱成
机械工程 苏州大学 2015(学位年度)
摘要:细胞显微操作技术是现代生物工程关键技术之一。大多数的细胞显微操作都需要对细胞的位置和姿态(简称位姿)进行精确调整,即先将细胞移动到指定的位置,然后旋转细胞至需要的姿态,以精确控制后续操作。传统的细胞位姿精确操控技术主要依赖人工完成,受人为因素影响,存在很多不确定性。在细胞位姿操控的精度、效率、成功率方面,均受到限制,极大的制约了现代生物微操作技术的发展。本文针对目前细胞显微操作的迫切需求,开展细胞位置以及姿态自动化调节的研究,对实现自动化的细胞显微操作具有重要的意义。
  首先,对国内外细胞位姿操控方法进行了总结分析,针对接触式及非接触式的细胞位姿调节的优缺点,课题组创新性地提出了一种基于介电泳配合微针拨动的细胞三维位姿调节策略,可有效降低细胞操作过程中所受到的损伤,并提高位姿调节的效率和精度。该方法通过行波介电泳力完成细胞显微操作中的细胞快速移动、定位以及通过电旋转介电泳力完成细胞平面姿态调节,配合基于最小拨动力的细胞拨动方法实现细胞三维姿态的调整。
  其次,对粒子极化理论进行了分析研究,给出了理想微球在电场中所受传统介电泳力、行波介电泳力、电旋转介电泳力矩的计算方法。在此基础上,对介电泳力影响因素进行了重点分析,并研究了芯片中细胞的受力情况和运动情况。同时,基于生物粒子单层匀质球形简化模型,建立了细胞介电泳模型,为下文细胞位姿调节的仿真及实验研究奠定了基础。最后,分析了介电泳法对细胞造成负面影响的两个因素,并基于国内外相关研究,对本文所提出的方案中介电泳对细胞活性的影响进行了详细评估。
  然后,在基于前述理论研究的基础上,根据本文所提出的细胞位置和平面姿态调节方法,设计了细胞位姿调节芯片。并应用COMSOL Multiphysics软件建立了电场仿真模型和细胞运动仿真模型,对芯片中的电势分布,介电泳因数分布以及细胞运动轨迹等进行了仿真分析,得出了合理的实验参数,为后续的实验设计提供了依据。
  最后,设计实验对本课题提出的细胞位姿调节方法进行论证。对实验用位姿调节芯片的制备工艺进行了研究,搭建了位姿调节实验平台。通过实验研究对比了电压大小、电场频率、溶液电导率以及有无微腔结构对细胞位姿操控的影响。通过对实验数据的分析,得到了最佳的实验参数配置,实现了细胞位置和平面姿态的快速调节。
[硕士论文] 刘威
生物医学工程 中国科学技术大学 2015(学位年度)
摘要:细胞膜渗透性是细胞的重要生物物理学性质之一,其在生物工程、再生医学、器官工程和生物保存中扮演着重要角色。而测量细胞膜的渗透性质是通过微装置内胞外溶液渗透压转变的实验测量得到的。然而大多数研究者们并没有对微装置及其相应的实验程序做过系统的研究,这就是为什么不同研究者的之间的测量结果相差很大的原因。
  本文基于传热传质和对流扩散原理的指导,设计并改进了微灌流腔装置。同时,还通过实验验证和利用有限元分析方法数值计算了微通道以及管路中的胞外溶液的浓度分布变化。对比数据结果后证明,在细胞渗透性实验中使用惯用的理想阶跃浓度函数去拟合细胞膜渗透性参数时会不可避免的带来较大的误差,而本研究中确定浓度函数保证了拟合得到的参数的精确性和可靠性。
  此外,本文还设计制作了专用来测量卵母细胞渗透的微灌流腔。收集并测试了共计57颗受精失败的卵母细胞的渗透性参数。所得到测量数据为将来的研究提供了有用的参考,同时也丰富了卵母细胞在不同低温保护剂条件下的卵膜渗透性。实验结果还表明,可以在低温保存之前记录卵母细胞添加低温保护剂时的体积变化来评估该卵母细胞的体外受精成功率。
  最后,本文还对微流控的液滴技术进行了探索,积累了大量相关经验。
  总之,所述的研究工作有利于更好的理解低温生物学,也有利于设计出更好更稳定的低温保存协议。通过提高实验测量细胞渗透性的精确性,本文的研究工作对改进低温生物学的研究有着巨大的潜力。
[硕士论文] 任亚运
控制科学与工程 中国矿业大学 2015(学位年度)
摘要:随着数字图像处理技术的飞速发展,显微镜视频图像序列中细胞的自动识别与跟踪技术得到了广泛的研究,并推动了如药物开发、疾病诊断和治疗等领域的发展。本文研究低信噪比多细胞图像序列中的多细胞跟踪方法,针对局部图像明暗不均匀、背景和前景对比度低以及存在大量噪声的低信噪比细胞图像,分别研究基于随机有限集(Random Finite Sets,RFS)跟踪理论和基于群智能(Swarm Intelligence,SI)的多细胞跟踪方法,以求用随机性的跟踪方法得到精确和稳定的跟踪结果,并构建了包含多种随机性跟踪方法的多细胞跟踪集成软件系统。
  自随机有限集理论应用于多目标跟踪后,就成为多目标跟踪领域研究的热点。针对随机有限集框架下的两种多细胞跟踪方法(即高斯混合概率假设密度函数滤波器和多贝努利滤波器)缺乏定量的跟踪性能比较,本文在高斯混合概率假设密度函数滤波器跟踪方法中设计了一种简易的细胞检测方法,在多贝努利滤波器跟踪方法中使用一种基于RGB直方图的细胞似然函数,把两种跟踪方法在同一细胞图像序列中进行实验,分析两种方法的异同,并对实验结果进行定量比较,为低信噪比图像中这两种随机有限集多细胞跟踪方法的选择提供依据。
  群智能是基于生物群体行为规律的技术,粒子群优化算法(Particle Swarm Optimization,PSO)是其中一种典型方法。本文提出了基于PSO的多细胞自动跟踪技术,以得到位置与轮廓的精确跟踪;构建两种不同的PSO跟踪模型以分别得到新生细胞和已存在细胞质心的粗略位置,然后在此基础上设计了一种 PSO的轮廓跟踪模型,用迭代的方式估计出细胞轮廓和精确的细胞质心。并引入了一种高斯模型,在细胞近邻或发生碰撞时跟踪效果良好。在实验仿真中,分别与多贝努利跟踪方法和蚁群跟踪方法进行比较,具有更高的跟踪精度,并能应对更加复杂的细胞环境。
  最后,构建了多细胞跟踪集成软件系统,集成了包含本文所提出的跟踪方法在内的几类随机性多细胞自动跟踪方法,可分为三类:基于随机有限集理论的方法,基于粒子滤波器的方法和基于群智能方法。此外,还包含了人工跟踪模块,可以手动标定出细胞的位置和数目,为自动跟踪方法提供比对数据。系统可以对特定的细胞图像序列进行跟踪,生成详细的报表数据,并且能对这些数据进行分析和比较,对比各个方法的特点和跟踪性能。
[硕士论文] 王鹏阳
分析化学 贵州师范大学 2015(学位年度)
摘要:碳纳米管(CNTs)是纳米科技领域里最有前景的材料之一,其在机械,电子学,光学等方面具有非常独特优异的性质,被广泛应用于信息存储,生物医学,材料学等领域。制备碳纳米管的主要方法有,化学气相沉积法(CVD)、激光蒸发法和电弧法,化学气相沉积法因其设备简单整个反应过程容易控制,成为目前研究最广泛的合成方法。碳纳米管的广泛应用为人们的生活提供便利的同时,我们也要考虑其潜在的生物学效应,及其可能带来的危害。本论文主要从三个方面着手,探究了碳纳米管的生物学效应:
  首先,我们研究了不同尺寸、不同分散剂中的碳纳米管对不同细胞系的毒性,碳纳米管对细胞活力的影响都有明显的时间依赖性和浓度剂量效应,随着孵育时间的增加和孵育浓度的加大,细胞活力都会大大降低。对于同一种细胞而言,在相同条件下,NM401碳纳米管的毒性是最大的,这可能与其长度有关。而不同细胞系对相同类型的碳纳米管的耐受力差异很大,16HBE>d-THP-1。另外分散剂的差异对细胞活力也有一些影响,但不是主要因素。该研究中探讨的细胞毒性影响因素为研究其他纳米材料的生物安全性提供的参考和借鉴。
  其次,我们针对NM401碳纳米管这一毒性最大的碳管进行了进一步的研究,从分子学的角度探寻其产生细胞毒性的本质原因,我们发现NM401碳纳米管能刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)产生活性氧自由基(ROS),而且随着孵育时间和浓度的增加,细胞内产生的活性氧自由基水平与细胞毒性保持一致,细胞内 ROS水平越高那么对细胞的毒性就越大。
  最后,研究了NM401碳纳米管对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)造成损伤后细胞功能的变化,随着活性氧自由基的产生细胞内与氧化应激有关的基因 GPX-1表达大幅上调,粘附因子VCAM-1和ICAM-1的蛋白表达水平上调,在单核细胞趋化蛋白MCP-1的趋化作用下能够促进单核细胞(THP-1)向HUVECs粘附,有发生早期动脉粥样硬化的风险。为此我们又对其发生的机理进行研究,发现NF-KB信号通路被激活。本论文的研究工作为碳纳米管在生物医学领域的应用提供了很好的安全性评价依据。
[硕士论文] 王振
计算机技术 厦门大学 2015(学位年度)
摘要:细胞因子的识别以及亚细胞结构定位的研究对于探索细胞因子的多样化功能以及生物化学机制有着重要的生物学意义。目前有关细胞因子的研究仍然存在大量问题:基准数据集规模过大;数据集不同类别样例数量的严重不平衡性;不断被发现的新的细胞因子家族等。本文采用了集成分类的机器学习方法来进行细胞因子的识别以及亚细胞结构定位预测的研究。
  本文主要研究内容包括:
  (1)细胞因子识别方法研究。分析特定理化属性的氨基酸在蛋白序列中的分布情况,我们提取到了120维属性专一有效的蛋白序列特征;针对基准数据集中正反例样本数的严重不平衡性,我们有效地集成了SMOTE与K-Means采样算法,利用集成采样算法重建了标准的训练集;构建动态选择性循环集成分类器LibD3C,对重建后的训练集进行10折交叉验证,保存训练模型。实验表明本方法得出的训练敏感性与特异性的几何平均值高达97.2%,集成采样算法、集成分类框架以及基于独立属性的特征提取算法是本文的亮点。
  (2)蛋白质亚细胞定位方法研究。本文依据实验以及文献资料重新整理了亚细胞蛋白的基准数据集,数据表现更全面更完整;分析每条蛋白质序列的位置特异性得分矩阵PSSM,得到20种氨基酸各自的位置特异性平均得分,即提取了蛋白质序列的20维有效序列特征向量;采用MeanEnsemble算法对7种多标记基分类器进行有效集成并对训练集进行学习,保存训练模型。实验得出本方法亚细胞定位的平均准确率是64.27%,与现有最好的效果基本相当,本文的亮点在于以上结果是基于更加完整全面的数据集得出的。
  (3)细胞因子的亚细胞结构定位分析。利用细胞因子识别的训练模型对Swiss-Prot数据库中下载的548758条未知蛋白序列进行细胞因子预测,对于识别出的4222条细胞因子序列,利用亚细胞定位研究中的训练模型进行测试,测试结果给出了4222条细胞因子在各个亚细胞结构上的分布对比情况,这也是本文的主要创新点之一。
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