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[硕士论文] 贾羽
轻工技术与工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本研究构建了一种针对人表皮生长因子受体-2(HER-2,human epidermal growth factor receptor-2)的双特异性纳米抗体(BsNb,bispecific nanobody)。
  通过噬菌体库筛选出7个针对HER-2的纳米抗体的不同序列。将这7个序列分别连入pET-28a高表达系统进行诱导表达,通过镍柱-中高压蛋白层析系统纯化蛋白。将纯化后的蛋白进行抗原-抗体和抗体-靶细胞的结合鉴定。鉴定完毕后,挑选出两个结合活性最好的纳米抗体,将相应片段分别与pFUSE-CH,CL载体构建人源化抗体表达质粒。经细胞表达产生完整IgG形式的双表位的抗体,之后进行细胞杀伤实验。筛选出特异性较强的纳米抗体片段;成功构建pET28a-BL21可溶性蛋白高效表达菌株;构建人源化抗体表达载体,获得的双特异性纳米抗体杀伤效果明显。构建的人源化的HER-2纳米双抗,对于肿瘤细胞的亲和和杀伤效果显著。相较于其他类别的人源化抗体,人源化的纳米双抗无论在成本还是亲和力方面都是不错的选择。如果能够产业化,将具有良好的应用前景。
[博士论文] 金龙
动物遗传育种与繁殖 延边大学 2018(学位年度)
摘要:体细胞核移植(SCNT)是一种哺乳动物生物医学研究方面的有价值的工具。但是SCNT效率一直很低,困扰着克隆猪的应用。目前认为克隆效率低的主要原因是异常的表观遗传修饰导致的。利用组蛋白去乙酰化抑制剂(HDACi),可以修正异常的表观遗传重编程,进而提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat和CI994是HDACi,他们都具有促进组蛋白乙酰化水平的能力,但是尚未在猪SCNT研究中报道。本研究是第一次使用这五种HDACi探究其对猪核移植胚胎发育的影响。
  方法:利用不同浓度的HDACi(MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat和CI994)处理猪克隆胚胎24小时,找出最佳处理浓度,随后用最佳处理浓度处理不同时间,找出最佳的HDACi处理时间。确定好五种HDACi的最佳处理条件后,通过免疫荧光染色方法和PCR等方法确定猪SCNT胚胎中组蛋白乙酰化水平、DNA甲基化水平、凋亡水平以及多能性和凋亡相关基因表达水平。每种HDACi处理后的克隆胚胎将被移入待遇母猪体内,观察胎儿发育情况。
  结果:(1)与对照组相比,0.2μM的MGCD0103处理猪克隆胚胎24 h可以显著提高猪SCNT胚胎的囊胚形成率(25.5% vs.10.7%;P<0.05)。之后用MGCD0103处理6小时的猪SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗体进行免疫荧光染色。结果显示,MGCD0103处理的假原核期猪核移植胚胎中组蛋白H3K9的乙酰化水平(AcH3K9)和组蛋白H4K12的乙酰化水平(AcH4K12)均显著地高于对对照组。体内移植实验结果表明CI994处理的猪SCNT胚胎移入2头代孕母猪后,获得3个克隆胎儿。这些结果说明MGCD0103可以增强核重编程并提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。(2)与对照组相比,0.5 nM的PCI-24781处理猪克隆胚胎6小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(25.3% vs.10.5%;P<0.05)。之后用PCI-24781处理6小时的猪SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗体进行免疫荧光染色。结果显示,PCI-24781处理的假原核期猪核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12均显著地高于对对照组。而且TUNEL结果表明PCI-24781处理可以显著抑制SCNT胚胎的凋亡的细胞数。体内移植实验结果表明PCI-24781处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得2个猪胎儿。综上所诉,PCI-24781处理可以明显提高体细胞核重编程的能力和猪SCNT胚胎的发育能力。(3)与未处理对照组相比,5μM的M344处理猪克隆胚胎6小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(25.1% vs.10.9%;P<0.05)。而且M344处理可以显著提高假原核期猪克隆胚胎中AcH4K12平均荧光强度。但是多能性相关基因Oct4,NANOG和SOX2的mRNA表达水平在M344处理组和未处理组之间没有显著性差异。体内移植实验结果表明CI994处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得3个克隆胎儿。综上所诉,M344处理可以提升组蛋白乙酰化水平、促进核重编程的能力并且提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。(4)与未处理对照组相比,10nM的Quisinostat处理猪克隆胚胎24小时可以显著提高猪SCNT胚胎的体外囊胚形成率(19.0% vs.10.2%;P<0.05)。而且Quisinostat处理可以显著提高假原核期猪克隆胚胎中AcH3K9平均荧光强度。同样,免疫荧光结果证实Quisinostat处理可以明显促进猪核移植囊胚中POU5F1的表达水平。PCR结果证明Quisinostat处理明显提升了BCL2的mRNA表达水平,但是BAX的mRNA表达水平没有显著性差异。体内移植实验结果表明Quisinostat处理的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得6个猪克隆胎儿。综上所诉,Quisinostat处理可以调整表观遗传修饰、促进核重编程,进而提高猪SCNT胚胎的发育能力和囊胚质量。(5)与对照组相比,10μM的CI994处理猪克隆胚胎24小时可以显著提高猪SCNT胚胎的囊胚形成率(21.9%vs.11.4%; P<0.05)。虽然CI994处理可以显著提高假原核期猪核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12的平均荧光强度,但是在囊胚期中AcH3K9和AcH4K12的平均荧光强度没有显著性差异。免疫荧光结果证明CI994可以显著促进SCNT囊胚中POU5F1的表达,但不影响5mC的平均荧光强度。TUNEL结果表明CI994处理可以显著抑制SCNT胚胎的凋亡的细胞数。PCR结果表明多能性相关基因POU5F1和SOX2的mRNA表达水平在CI994处理组中显著高于未处理组。体内移植实验结果表明CI994处理(10μM for24 h)的猪SCNT胚胎移入3头代孕母猪后,获得3个猪胎儿。综上所诉,CI994处理可以提升组蛋白乙酰化水平、增强体细胞核重编程的能力,进而提高猪SCNT胚胎的体外发育能力。
  结论:组蛋白去乙酰化抑制剂MGCD0103(0.2μM,24小时)、PCI-24781(0.5nM,6小时)、M344(5μM,6小时)Quisinostat(10nM,24小时)及CI994(10μM,24小时)处理猪核移植克隆胚胎可以显著增强组蛋白乙酰化水平、抑制细胞的凋亡、促进多能性相关基因的表达、提高体细胞核重编程能力和体外发育能力。
[硕士论文] 刘若男
动物遗传育种与繁殖 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎移植技术(Embryo transfer,ET)是胚胎工程的最后一个步骤,对胚胎的妊娠率起着关键性的作用。在小鼠、牛羊以及人类的胚胎移植过程中,常常会有一定量的空气伴随胚胎被移植进入子宫。这些气泡是否影响胚胎移植的结果,至今没有定论。研究表明在豚鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类动物中,体内雌、孕激素水平在一定条件下,宫腔内空气能诱导子宫内膜发生蜕膜化反应。同时小鼠胚胎移植结果显示,子宫内气泡能够导致早期胚胎死亡。蜕膜化能否正常进行是胚胎着床发育的关键因素。因此为了探究子宫内气泡对胚胎发育的影响,向假孕3.5d、正常妊娠3.5d小鼠子宫角内移植微量空气,收集7.5d蜕膜组织,通过形态观察、子宫内膜通透性检验、组织切片、蛋白质双向电泳、转录组测序及RT-PCR验证的实验方法对其机理进行研究。结果显示子宫内气泡能够诱导小鼠子宫角发生明显的增粗、增重、体积增大,且发生明显的血管重塑,双核细胞大量出现,各类细胞不规则分布,不能够区分主、次蜕膜区,子宫内胚胎大量死亡。蛋白质双向电泳结果显示在被检测范围内,子宫内气泡诱导蜕膜与正常蜕膜无蛋白差异点。而转录组测序结果显示,两组之间有64个差异表达基因,其中有59个差异表达基因在正常蜕膜中高表达。差异表达基因中表达量最高的前10位基因依次H19,Prl7a1,Prl3d1,Prl4d1,Prl2c3,Krt8,Mmp9,Prl2c2,Plet1,Cts7。对差异表达基因进行GO分析,这些差异基因主要富集在胎盘发育、滋养层巨细胞分化、细胞对白细胞介素因子1的反应、细胞对肿瘤坏死因子的反应、生长激素活性调节、细胞蛋白分解过程中蛋白质水解等生物过程,富集基因都为正常蜕膜高表达基因。使用RT-PCR对转录组测序结果进行验证,结果显示被验证的8个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。结果表明移植进入子宫内的气泡导致子宫内膜多个位点发生异常蜕膜化反应,基因表达模式发生变化,影响胚胎正常发育,最终导致胚胎死亡。这些研究结果不仅有利于提高小鼠胚胎移植成功率,更为重要的是,它为人类以及其他动物胚胎移植研究提供了新思路。
[硕士论文] 李玉凤
生态学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:Ca2+是真核细胞重要的细胞内信使。细胞内Ca2+浓度的变化是许多生理进程所必需的。钙库操纵的钙通道(SOCs)是钙离子流入细胞内的主要的方式,其中最著名最具特色的是钙离子释放激活钙离子(CRAC)通道。CRAC通道调节许多基本的细胞功能,包括基因表达、细胞增殖、细胞分泌等。在近十几年里,作为CRAC通道的Orai蛋白和作为内质网钙离子感受器的STIM蛋白的发现是理解CRAC通道的机制和功能取得极大进步的基础。当内质网钙库释放后,STIM蛋白发生一系列的构象变化与Orai蛋白相互作用,从而开放CRAC通道,允许细胞外的钙离子流入细胞内。但CRAC通道门控的分子机制仍然知之甚少。
  为了进一步揭示CRAC通道门控的分子机制,我们表达并分离纯化了果蝇源的Orai蛋白和STIM蛋白不同片段。在过程中对STIM蛋白不同片段的分离纯化条件进行了优化,对STIM蛋白不同片段进行了功能测试,并最终获得了较稳定并具有功能的STIM蛋白片段,同时对纯化的Orai蛋白和STIM蛋白片段进行了等温滴定测定其相互作用。我们发现Orai蛋白与STIM蛋白片段亲和力较强,这为后续通过单分子荧光能量转移技术和蛋白技术共结晶进一步的研究两蛋白的相互作用的构象变化奠定了基础。
[硕士论文] 刘建
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:对豹猫6种组织进行原代培养建系,最后选择3种组织来源细胞即剑状软骨源细胞、心脏源细胞和肺源细胞。以该3种细胞为实验材料研究豹猫细胞的生物学特性。
  在本研究中,主要进行了如下实验:细胞的原代建系及传代培养的形态观察、细胞贴壁率计算、冻存复苏率对比、3种细胞生长曲线的对比、支原体污染检测、核型分析等。
  在形态学观察方面,3种来源细胞各有显著特征但均属于成纤维样细胞。贴壁率能力分析显示,心脏源细胞最弱;肺源细胞代次P9之前易贴壁,P9之后细胞贴壁增殖及传代比较困难;剑状软骨源细胞最易贴壁。将三种细胞冻存前后存活率进行实验对比发现:解冻后相比于冻存前均有所下降,随着细胞代次的增高,细胞的存活率也有所下降。生长曲线对比发现,曲线均呈“S”型曲线,曲线显示剑状软骨源细胞增殖的最快,肺源细胞次之,心脏源细胞最慢。支原体污染检测细胞污染情况为阴性。在豹猫细胞核型分析研究中发现,染色体数目为2n=38,18对为常染色体,形态类型为7M+11SM;1对为性染色体,其形态类型X为ST。本研究为日后利用豹猫细胞、保存遗传信息及深入研究其生物学特性提供了一个好的依据和实验材料。
[硕士论文] 臧欢
农业电气化与自动化 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:畜牧养殖业迅猛发展,禽流感、口蹄疫等动物传染病随之暴发流行,兽用疫苗的市场需求量大幅度增加,采用传统转瓶培养方式生产疫苗已远远不能满足现代畜牧养殖业的发展。动物细胞悬浮培养技术逐步代替传统转瓶培养方式,并成为当前工业生产生物疫苗的主流技术,所以,如何应用动物细胞悬浮培养技术实现疫苗的快速高效生产成为当前以及未来生物制药领域的焦点和竞争核心。
  动物细胞悬浮培养过程具有高度的非线性、时变性等特性,过程中由于受到传统物理仪表测量方法的限制(易染菌、成本高等),一些关键状态变量(如葡萄糖浓度、乳酸浓度、细胞密度等)的实时监测严重制约了产物合成从而影响了生物制品的产量和质量。而离线测量又具有一定的滞后性,严重影响了整个过程的优化控制。软测量技术的出现为解决上述问题提供了一种有效途径。
  本文针对BHK-21(乳仓鼠肾细胞)悬浮培养过程关键状态变量难以实时测量的问题,提出一种基于直角三角形角度值动态加权的软测量建模方法。首先结合培养过程工艺机理,确定模型的主导变量,然后基于现场采集数据,应用相关系数法确定模型的辅助变量,最后建立软测量模型。在深入了解支持向量机、最小二乘支持向量机和关联向量机的基础上,将其与基于直角三角形角度值动态加权的关联向量机建模方法进行对比。结果表明,相比支持向量机与最小二乘支持向量机,关联向量机的解具有较好的稀疏性和更高的鲁棒性,且模型预测精度较高;动态关联向量机不仅具有关联向量机的优点,而且能将工业过程的动态特性引进模型中,使得预测效果更加精确、更能体现工业过程的本质。
  为了实现BHK-21细胞悬浮培养过程实时监测及优化控制,充分利用MATLAB强大的计算能力和WinCC强大的脚本编程能力,建立基于MATLAB和WinCC混合编程平台的BHK-21悬浮培养过程关键状态变量的在线预测及实时监控系统,为培养过程的优化控制奠定了基础。实验结果表明,所建监控系统能够实时准确的进行关键状态变量的显示,为进一步的优化控制提供了充分的工况信息,降低了系统故障概率,从而实现经济高效的工业生产。
[硕士论文] 杜盼
药学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:自2006年 Yamanaka首次利用“四因子”组合(pSOX2、pOCT4、pC-MYC、pKLF4)成功诱导生成iPSCs后,细胞重编程技术始终是研究热点之一。由于iPSCs来源于患者自身体细胞,并具有自我更新和多向分化能力,因此,将 iPSCs作为一种替代胚胎干细胞(ESCs)的细胞应用于临床中,能够有效避免很多伦理及法律问题,且 iPSCs源于患者,能够实现个体化治疗。
  原位肝移植是目前唯一能有效治疗肝癌的方法。然而,由于器官短缺,近年来因为肝癌死亡的人数不断增加;此外,世界范围内的肝癌发病率也在不断上升。肝细胞移植的临床试验带来振奋人心的成果。但作为替代肝脏移植的肝细胞移植仍然需要解决肝细胞来源的问题。目前,很多研究都致力于寻找一种能够产生稳定的功能性肝细胞的可行性方法。其中,可能会成为肝细胞不竭来源的细胞就是人源诱导多能干细胞(hiPSCs)。hiPSCs具有自我更新和多向分化能力,与人源胚胎干细胞(hESCs)相比,hiPSCs涉及到的伦理问题较少,且完全不受来源限制。因此,hiPSCs来源肝细胞(hiPSC-HEPs)在药物筛选、细胞治疗以及体外疾病模型等方面具有重要的意义。本研究课题是以磷酸钙纳米粒作为基因载体,通过携带两种不同因子组合将人脐带间充质干细胞(hUMSCs)重编程为hiPSCs,继而进行肝细胞定向诱导分化,并筛选优化出最佳诱导分化培养基,采用最佳诱导方案对其进行培养,使其分化为肝细胞,为肝细胞移植提供理论基础,从而更好地解决肝细胞短缺问题。
  第一章重编程法制备人源肝脏细胞及其应用研究进展
  通过查阅大量资料,对人源肝细胞重编程方法进行了综述,总结并分析人源肝细胞重编程的影响因素;阐述了人源肝细胞重编程技术的研究现状及其在再生医学、药物筛选及体外疾病模型等方面的应用,并指出人源肝细胞应用于临床实践的局限性。为本论文实验工作的顺利开展和进行提供了理论依据。
  第二章非病毒纳米基因传递系统的 hiPSCs重编程研究
  采用磷酸钙纳米粒作为基因载体,对比两种不同的因子组合,即 pSOCK(pSOX2、pOCT4、pC-MYC、pKLF4)与 pOS+miR(pOCT4、pSOX2、miR302b-367),制备得到磷酸钙纳米粒 C-pSOCK与 C-pOS+miR,通过琼脂糖凝胶电泳、透射电镜观察、毒性评价、粒径以及 Zeta电位测定等一系列检测进行表征;以人脐带间充质干细胞(hUMSCs)为源细胞,进行重编程研究。结果显示:两种因子组合所制备得到的纳米粒均呈现形态规整、分散均匀、表面带正电荷的球形或者椭球型;细胞毒性实验表明两种不同因子组合制备得到的磷酸钙纳米粒无毒或低毒;通过碱性磷酸酶染色,统计阳性克隆数,从而考察两种纳米粒的重编程效率;免疫荧光、Western blot均说明纳米粒 C-pOS+miR诱导生成的 hiPSCs能够表达多能性标记蛋白,且能进行体内分化(内、中、外)。
  第三章 hiPSCs的肝细胞定向诱导分化研究
  设置4种不同肝细胞诱导分化培养基(MediumⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),对重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化,采用酶联免疫检测法(ELISA)分别在诱导分化第0,3,7,11,15,19,23,27,32天检测 AFP和 ALB表达情况,从而筛选出最佳诱导方案;光学显微镜下观察细胞形态变化;用免疫荧光法、Western blot检测肝脏特征性蛋白(AFP、ALB、CK8、CK18、SOX17)的表达。结果显示:诱导培养基 MediumⅡ、诱导方案“三步法”的肝细胞诱导效果较好;显微镜下观察细胞形态发生明显变化,从“克隆团”形态逐渐变化为“铺路石”样形态,诱导分化结束后,细胞形态基本一致,为多角多边形或者类圆形,且细胞核较明显,部分细胞表现出典型肝细胞形态:出现双核甚至多核现象,且诱导分化的肝细胞能够表达肝脏肝脏特征性蛋白(AFP、ALB、CK8、CK18、SOX17)。
  第四章二维培养体系中肝细胞药物代谢酶表达及细胞活性研究
  在二维培养体系下,选择Ⅰ相代谢酶细胞色素 P450(CYP450)、Ⅱ相代谢酶葡萄糖醛酸转移酶(UGT)与谷胱甘肽硫转移酶(GST),用 Western blot测定诱导后细胞蛋白表达,以人胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)为阳性对照;考察在诱导分化不同时间药物代谢酶的动态变化,同时比较 hiPSCs诱导形成的肝细胞与胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)药物代谢酶的表达差异;不同时间取样,检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)的质量浓度;检测白蛋白分泌、尿素合成及葡萄糖消耗含量,分别采用溴甲酚绿法、二乙酰-肟法及葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法。结果显示:hiPSCs诱导形成的肝细胞(hiPSCs-HEPs)能够较好表达 CYP450、UGT与 GST,且与hESCs-HEPs表达无明显差异;而诱导前 hiPSCs很少表达甚至不表达CYP450、UGT与 GST;hiPSCs的肝细胞诱导分化过程中ALT、AST、LDH变化趋势与 hESCs基本一致;hiPSCs-HEPs与 hESCs-HEPs测定的白蛋白分泌水平、尿素合成浓度以及葡萄糖消耗量基本一致。
  第五章三维培养体系中hiPSCs定向肝细胞诱导分化
  在三维培养体系下,对重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化。以Ⅰ型胶原和壳聚糖作为支架材料,采用冷冻干燥-热固化法制备胶原/壳聚糖三维支架,考察不同质量比与不同固化时间对支架性能的影响,优化三维支架制备工艺,通过形态观察、吸水率与保水率测定等对制备得到的支架进行表征;将纳米粒 C-pOS+miR与空白胶原/壳聚糖支架相结合,得到三维载基因纳米粒-胶原/壳聚糖支架;人脐带间充质干细胞(hUMSCs)在三维载基因纳米粒-胶原/壳聚糖支架中进行重编程后,形成边界清晰、形态规整的克隆团;对三维支架上重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化,用 ELISA法对比二维与三维培养体系中肝细胞功能;分别用溴甲酚绿法、二乙酰-肟显色法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法比较二维与三维培养体系中肝细胞代谢活性。结果显示:在三维培养体系诱导21天后,细胞形态呈现明显的肝细胞样细胞形态;在三维培养体系下,诱导形成的肝细胞功能没有“损伤”,仍处于正常肝功能状态。
[硕士论文] 姚文光
兽医 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:细胞体外培养是使细胞在人工模拟的生理环境中生长繁殖的一种体外培养方式,是进行生物工程研究的一项重要技术。培养的细胞可以用来分离纯化病毒、生产疫苗和药物。离体细胞培养的成功为细胞结构与功能的研究创造了条件,包括各种细胞株的建立。这些培养的细胞已成为细胞生物学、免疫学等学科研究的重要途径。
  细胞体外培养需要满足一些基本条件:1.无菌无毒的培养环境;2.适宜的培养温度;3.合适的气体环境和pH;4.充足的营养,包括多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、生长因子。
  猪睾丸细胞(ST细胞)在猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等的繁殖和猪瘟疫苗的生产中广泛应用,是病毒繁殖、疫苗生产的重要细胞系之一。本研究对ST细胞的规模化培养工艺进行了研究,通过比较不同血清浓度(5%、10%、15%)、不同培养温度(35℃、36℃、37℃)和不同pH值(7.2、7.3、7.4)对ST细胞体外规模化培养的影响,并通过细胞计数法,分别绘制了ST细胞在不同血清浓度、不同培养温度、不同pH值条件下培养的生长曲线图,从而筛选出一个最适合ST细胞规模化体外培养的工艺。
  结果表明,培养液中含10%的血清浓度在三种血清浓度中为最适合、最经济的浓度;三种不同温度、pH值培养环境对ST细胞体外培养影响不大。
  合适的血清浓度既可以满足细胞生长的需求,又能避免较高血清浓度所导致的营养过剩,从而对细胞产生毒害作用。本研究的结果为ST细胞规模化体外培养所需的血清浓度、温度、pH值提供了一个适宜的参考值,对提高利用猪睾丸细胞生产猪瘟弱毒疫苗的生产工艺具有积极的意义。
[硕士论文] 孙明慧
微生物 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:本文通过化学诱变的方法即用亚硝基胍(NTG)处理疣孢漆斑菌孢子,使其产生随机突变。通过96孔板高通量筛选的方法,筛选出了两株产耐热性能好的漆酶的菌株,命名为MF-01和MF-02,并对其及其产生的漆酶进行了生理指标检测,结果显示,两株突变株与未突变株比较发酵液中的酶活性,pH以及菌体生长量并没有突出变化,发酵液pH均为下降后上升,菌体生长量为线上升后下降。对两个菌株和未突变株的漆酶进行纯化,得到单一纯蛋白。MF-01的反应最适pH值为3.0,pH稳定性最好的时候在pH3.0-3.5。MF-02的反应最适pH值为4.0,pH稳定性最好时候在3.5-4.0,而未突变株的两值分别在pH4.5和pH4-5之间。说明两个突变株更耐酸性,稳定性更好。在热稳定性和最适温度的实验中,突变株MF-01在30-50℃时有相对较高的酶活,但MF-02与未突变株最适温度的差异不是十分明显。当温度上升至70-90℃,酶活均下降至50%以下,但MF-01的酶活性仍然高于MF-02和未突变菌株。同样在50%的相对酶活条件下,突变株漆酶放置的时间更长。经过分析,两株菌株产生的漆酶均有较好的稳定性,但其中一株MF-01的性能更加突出,并且能够稳定遗传,分析是突变剂使其产漆酶的基因序列发生了变化。
  为了验证这一猜想,实验用RACE的方法对未突变菌株的产漆酶基因进行了克隆,得到了产漆酶基因的编码区全部序列,并以此基因设计引物,对突变菌株的产漆酶基因编码区进行克隆,对两段基因对比发现,在编码区的第1522bp左右的位置,有碱基发生了变,由GCT变成了GAT,致使其编码的氨基酸由丙氨酸变成了天冬氨酸,突变并没有对漆酶的铜中心造成结构变化。铜中心是一个相对保守的区域,活性中心的铜离子位点就位于这个由1个半胱氨酸和10个组氨酸残基构成的配体结构中。丙氨酸为中性氨基酸,而转变为天冬氨酸后,变成了带负电荷的酸性氨基酸,组氨酸属于带正电荷碱性氨基酸;分析这两种氨基酸可能产生了分子间作用力,使漆酶蛋白分子更加稳定,但漆酶不仅由氨基酸组成,还有糖基的参与,分析稳定性的变化还有可能是诱变使糖基化过程发生了某些变化,本文仅在漆酶基因水平上做了基础性研究。
[硕士论文] 孔畅畅
发育生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:随着克隆技术的不断发展,克隆技术面临的一些如个体成活率低、成活个体存在不同程度表型异常等问题日益得到重视,这一类表型异常和缺陷与基因组异常的甲基化所导致的症状相类似。DNA甲基化修饰与基因表达抑制相关,DNA羟甲基化功能虽研究较少,但它参与DNA去甲基化过程,极可能与促进基因表达相关。本实验从表观遗传学角度出发,选取DNA甲基化和羟甲基化这对紧密相连的表观遗传修饰作为研究对象,利用HPLC、LC-MS等技术探讨它们在整个基因组及特殊位点的修饰差异,探究造成这些差异的可能原因,最终目标将揭示DNA5mC与5hmC对克隆动物成活和发育的重要影响,为提高克隆效率提供理论指导。
  本研究通过HPLC技术,建立了组织和细胞总DNA甲基化(5mC)含量检测方法,检测了不同供体核(胎儿成纤维细胞系FFB和输卵管上皮细胞系FOV)存活克隆牛基因组DNA甲基化水平,对于死亡克隆牛我们检测的组织包括:耳组织,还有肌肉、肺脏、心脏、脾脏和肝脏组织样。利用LC-MS技术,我们建立了组织和细胞总DNA羟甲基化(5hmC)含量检测方法。对于不同供体核克隆牛单基因位点的甲基化和羟甲基化检测我们采用氧化亚硫酸氢盐(oxBS-seq)法,完成了对印记基因H19和Xist的5mC和5hmC检测。通过检测发现无论存活还是死亡克隆动物(牛、猪)DNA5mC和5hmC均有异常,DNA5mC重编程不完全,表现在5mC含量比正常繁殖动物高;存活克隆动物也存在DNA甲基化重编程不完全现象,但不完全程度要低,主要表现在DNA甲基化水平虽高于正常繁殖动物,但是低于死亡克隆动物。对于5hmC研究发现,存活克隆动物5hmC含量高于死亡克隆动物,但低于正常繁殖动物,这说明克隆动物5hmC重编程也异常。通过对于单基因位点的检测发现H19 DNA5mC重编程异常对克隆牛存活和死亡贡献更大,存活克隆牛H195mC含量一般均低于50%,而死亡克隆牛5mC含量一般在70%附近,而Xist基因DNA5mC差别不大。
[硕士论文] 魏思
发育生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:基因组编辑技术的快速发展,使得人们能够按照意愿对基因组位点进行编辑修饰,实现基因的敲入和敲除。基因组编辑技术能够利用分子生物学手段实现对基因的改造,从而帮助人们深层次地理解基因的内部结构、基因功能与生物表型之间的关系,是进行基因功能研究、转基因动物制备和基因治疗的重要手段。特别是新兴的CRISPR/Cas9技术,以其编辑效率高,制作简单和成本低的特点,已经被广泛应用于斑马鱼,果蝇,小鼠等模式生物和人类细胞中。该技术的快速发展必将给人类疾病治疗和动植物新品种的培育带来革新性的改变。在细胞中,基因组发生双链断裂,细胞启动自身同源重组修复的效率是极低的,而这种低效率的修复不能满足人们对靶位点精确修复的要求。同源重组修复效率的高低跟位点自身以及同源重组片段的大小都有密切的关系。在之前的研究中人们发现:随着同源臂的增大,位点的同源重组效率也是逐渐增加的。本实验以人293T细胞为平台,利用CRISPR/Cas9技术造成基因双链断裂,用不同大小的同源重组片段(250 bp,500 bp,750 bp,1 kb,1.5 kb,2 kb)去重组修复,验证同源片段大小对同源重组效率的影响。结果显示随着同源片段不断增大,同源重组效率也是不断提高的,但是效率增加的幅度并不是均匀的。在一些位点的检测中,我们还发现了同源重组效率随着同源片段大小的增加呈现先减小后增加的趋势。
  本研究建立了一种能够用分子手段检测同源重组效率的方法-AFDA(amplification fragment digestion analysis),相较于eLIFE上的方法—用200bp的同源片段重组修复,AFDA可以进行任何长度的同源片段的检测,而且我们的实验结果显示小片段的检测结果不具有均一性。对于不同的位点而言,短片段的重组效率不如长片段的重组效率更具可靠性,不能代表该位点的真实重组效率。在HR效率结果检测方法上,本实验采用了三种不同的方法,琼脂糖凝胶电泳检测,聚丙烯酰胺凝胶检测和Agilent生物芯片技术。三种方法都能采用,只是对于效率差别较小的位点,琼脂糖凝胶的分辨率不高。聚丙烯酰胺凝胶的分辨率可以达到要求,但是整个实验耗时较长。相比较之下,Agilent生物芯片有着明显的优势,能够在较短的时间内完成样品分析,具有高效率,高稳定性,高精确性等特点。除此之外,本实验还以自行构建的Cas9稳转细胞系为平台,通过不同类型小分子物质的添加,验证小分子物质对打靶位点的同源重组效率的影响。结果证实两种类型的小分子物质确实能够促进细胞的同源重组修复。总之,本实验提供一种检测HR效率的方法,为高效率靶位点的选取提供了技术支持,为转基因动物制备,基因治疗提供了理论基础。
[硕士论文] 梅冬意
发育生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:基因组编辑技术是利用人工核酸内切酶对特定的目的基因进行修饰和改造,引入DNA片段或造成目的基因缺失的一种技术。目前应用最广泛的是CRISPR/Cas9系统,该系统能够对目的基因进行高效快捷地改造,实现目的基因的敲入或者敲除,从而定向改变物种的遗传信息。该技术主要应用到探究物种基因的功能及作用机理、构建模式动物、基因治疗等方面。CRISPR/Cas9系统作用到靶位点上会导致DNA双链断裂,导致细胞启动同源重组修复(HDR)或者非同源末端连接修复(NHEJ)。非同源末端连接修复可以引起碱基移码突变,实现基因沉默;而同源重组修复可以实现基因的定向改造。大多数情况下,为了提高实验成功率,在使用CRISPR/Cas9技术对基因定向改造前,需要筛选出高效的靶位点。如今,基因组编辑效率的检测手段有很多种,主要是检测NHEJ效率,而很少有检测HDR效率,但是在很多研究中,对基因组进行修饰主要用的是同源重组修复途径。
  本研究致力于HDR效率的检测。选取小鼠母源印记Meg3基因作为研究对象,确定该基因位置的10个gRNA位点,用两种细胞系作为受体细胞来检测10个位点同源重组效率。一种是容易培养和转染的293T细胞系,首先将小鼠Meg3基因的3'和5'大小约3kb左右DNA序列扩增出来,然后导入293T细胞的基因组中,以该细胞系作为平台,利用改良后的扩增片段酶切分析(AFDA)检测方法检测10个位点同源重组效率;另一种是小鼠ES细胞,由于ES细胞转染难度大,本课题通过摸索优化ES细胞转染条件,最终确定利用电转染法,电转程序为 A-013,转染细胞数量满足2-4×106个,转染效率能都达到10%-20%,由于该效率还不能达到后续检测要求,我们在Cas9质粒中引入一段绿色荧光蛋白基因,能随Cas9蛋白一起表达而不影响Cas9蛋白作用,然后利用流式细胞仪分选出带绿色荧光的细胞,剔除未转染成功的细胞,间接提高转染效率,最终ES细胞样品转染效率相当于达到90%,同样利用扩增片段酶切分析检测方法检测10个位点的同源重组效率。利用容易培养和转染的293T细胞为受体细胞检测出小鼠Meg3基因10个位点的同源重组效率,筛选出3'-1和5'-4高效率位点,但是293T细胞中的基因环境与小鼠细胞中的基因环境有所不同,可能导致每个靶位点的同源重组效率也会不同,我们又用 ES细胞为受体细胞同样检测这10个位点的同源重组效率,得到结果也是3'-1和5'-4两个位点效率最高,而且两批结果其他靶位点效率高低也基本一致,说明293T细胞基础上检测的结果是可靠的。本实验创造性建立了一种利用易培养易转染细胞系检测难转染少量细胞基因组编辑效率的方法,并证明了该方法的可行性。最终成功筛选得到效率高的靶位点,给以后目的基因的改造、模式生物的构建以及基因治疗提供很好的技术手段。
[硕士论文] 李猛
内科学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:引言:研究表明自怀孕第6周至妊娠结束,胎盘中均含有HSC(HSC),且具有细胞数量大,获取便捷,使用过程中不存在伦理问题等优点。目前针对脐血(UCB)来源造血干/祖细胞(HSPC)的体外扩增临床研究已经取得成功,采用扩增后UCB来源HSPC进行移植可以有效解决HSC数量不足造成的造血恢复延迟等问题,数据表明移植后干细胞较未扩增UCB来源HSPC具有相同植入率。胎盘来源HSC与UCB来源HSC同属于围产期干细胞,研究表明其较UCB来源HSC更为原始,目前国内外尚无针对胎盘来源HSC体外扩增的文献报道。
  目的:本研究旨在通过比较机械处理联合化学酶消化法及AMD3100循环灌注法提取人胎盘来源HSC的效果,构建适用于未来临床应用的胎盘来源HSC分离提取方法,得到来源清楚组份确定的HSC;基于模拟造血微环境的体外扩增理论,探讨UCB中CD34+细胞在间充质干细胞(MSC)共培养体系、UM171联合细胞因子扩增体系以及 UM171联合细胞因子与MSC共培养体系三种不同扩增体系下体外扩增效果;依据优化的胎盘来源HSC提取方法,对胎盘来源 HSC进行分离提取,并基于模拟造血微环境理论构建的扩增体系对提取得到的CD34+细胞行体外扩增,评价扩增效果及扩增后HSPC功能,为拓展临床HSC来源做出尝试。
  方法:
  1、健康足月顺产胎盘依照处理方法不同分为两组进行胎盘来源 HSPC体外提取:A组(机械处理联合化学酶消化组)、B组(AMD3100循环灌注组),每组处理胎盘5个。A组将胎盘经预处理后解剖成小组织块,采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后收集清洗液(命名为A1),采用胶原酶、透明质酸酶、DNA酶对清洗后的胎盘组织块进行消化,并置于100目及200目滤网研磨,收集消化液(命名为A2)。B组采用智能蠕动泵连接脐动静脉,采用生理盐水(NS)NS及含AMD3100的NS分步对胎盘脉管系统行循环灌注,分别收集两次灌洗液(命名为B1及B2)。比较两种方法收集得到各类细胞总数,并分别测定两种方法不同阶段收集得到细胞数量及其流式表型情况。
  2、采集到的UCB进行磁珠分选后得到纯净的CD34+细胞,脐带剪至小块后采用含有0.2%Ⅱ型胶原酶的 DMEM/F12培养基进行消化后,进行贴壁传代培养。UCB来源 CD34+细胞及脐带来源 MSC分为以下四组进行体外扩增培养10天:A组(对照组)、B组(UM171培养组)、C组(MSC共培养组)、D组(UM171联合MSC共培养组)。四组细胞均采用 StemSpan培养基,并添加100 ng/ml干细胞因子(SCF),100 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3),50 ng/ml促血小板生成素(TPO),CD34+按照1×105/孔密度接种于六孔板中,其中 B组在培养基中额外添加100 ng/ml UM171,C组采用分离得到的第三代脐血同源脐带MSC作为基质细胞,待贴壁90%融合采用60Co照射,剂量为10Gy,D组在C组实验条件基础上同时添加100 ng/ml UM171,细胞培养10天后比较不同组别间细胞扩增倍数及流式表型和集落培养情况。
  3、分别将AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液经免疫磁珠纯化,采用UM171联合MSC共培养方法分别对纯化后的胎盘来源CD34+细胞进行体外扩增培养,验证其扩增效果及流式表型和集落培养情况。
  结果:
  1、A组与 B组收集得到的 TNC分别为(45.19±9.41)×107和(42.69±11.19)×107,二者无统计学差异;收集得到的 CD34+细胞数(12.98±3.62)×107和(1.87±0.87)×107,二者比较,p=0.00,具有显著统计学差异;收集得到的CD133+细胞数分别为(1.16±0.61)×107和(1.15±0.63)×107,二者无统计学差异;A组收获的细胞液 A1中含有 TNC为(6.76±2.13)×107,其中CD34+CD38-比例为(1.14±0.56)%。收获的细胞液 A2中含有 TNC为(38.44±7.33)×107,其中 CD34+CD38-比例为(30.31±10.75)%;B组收获的细胞液 B1中含有 TNC为(15.11±6.03)×107,其中 CD34+CD38-比例为(0.72±0.34)%。收获的细胞液 B2中含有 TNC为(27.58±11.14)×107,其中CD34+CD38-比例为(5.56±1.78)%。
  2、分离得到的脐带MSC传代培养后细胞状态良好,流式检测发现其高表达 CD105, CD73, CD90,不表达 CD14, CD34,CD19,CD45, HLA-DR,SSEA-4含量约在1%,经过诱导培养后可以分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。CD34+细胞在不同条件下体外培养10天后发现,对照组细胞总数扩增3.7倍,CD34+细胞扩增3.5倍,组别间无明显差异。UM171培养组总有核细胞数扩增14倍,CD34+细胞扩增13.5倍;MSCs共培养组总有核细胞数扩增11倍,CD34+细胞扩增10倍;联合培养组总有核细胞数扩增达22倍,CD34+细胞扩增21倍。UM171联合 MSCs组得到CD34+CD38-细胞比例为91.49±2.67%,较MSCs及UM171组(分别为(78.11±2.34)%,(87.66±1.48)%)均在显著差异,含UM171培养体系CD133细胞比例较单独MSCs培养组存在差异,扩增后细胞集落培养14天后,各系集落形成良好, UM171扩增组细胞较MSCs扩增组在红系及粒系形成能力方面存在优势。
  3、胎盘NS灌洗液中CD34+细胞经10d培养后细胞总数扩增17倍, CD34+细胞扩增14倍;胎盘AMD3100灌洗液中CD34+细胞经10天培养后几乎全部死亡。脐血对照组与胎盘NS灌洗组扩增后细胞在TNC、CD34+细胞总数、CD133+细胞总数均存在统计学差异,其中胎盘 NS灌洗组CD34+CD38-比例为(82.70±6.89)%;扩增后脐血来源及胎盘 NS灌洗液中CD34+各谱系集落形成能力良好,胎盘NS灌洗液中CD34+细胞在粒系形成能力方面较未扩增脐血CD34+细胞存在差异。
  结论:
  1、机械处理联合化学酶消化法以及AMD3100循环灌注法均可以对胎盘来源CD34+细胞进行有效收集,其中AMD3100循环灌注法在保证细胞收集数量的同时可以有效降低细菌污染风险,并可降低母体组织对胎盘来源HSC的影响,收集得到的CD34+细胞经免疫磁珠分选后纯度较高,较机械处理联合化学酶消化法在收集胎盘来源HSC上具有更大的优势。
  2、脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可提高CD34+细胞体外扩增效果,UM171在扩增过程中可较好的保持细胞干性,二者联合应用扩增效果最佳,建立的脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34+细胞的扩增方法可用于CD34+细胞体外扩增培养。
  3、经AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液中CD34+细胞在脐带MSC联合细胞因子及UM171培养体系中扩增效果存在明显差异,其中NS灌洗液中CD34+细胞扩增效果可达17倍,其中较为原始的CD34+CD38—细胞比例达82%,扩增后细胞集落培养实验表明其具有与脐血来源扩增后 CD34+细胞同样的谱系重建能力。AMD3100灌洗液中CD34+细胞在该体系中不能进行有效扩增,其细胞来源及功能尚需进一步研究。
[硕士论文] 蔚梦怡
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:随着小鼠胚胎干细胞诱导的研究越来越受到关注,各实验室利用不同培养基建立了不同多能性状态的干细胞系,包括由本实验室利用四种细胞因子ABCL(ActivinA、BMP4、CHIR99021和mLif)诱导类胚层干细胞系(AFSCs)获得的新型胚胎干细胞系ASCs(Advanced Stem Cells)。在本文中,我们利用分别缺少ABCL中单个细胞因子的培养基[A(-)组、B(-)组、C(-)组及L(-)组]培养GOF-GFP标记的AFSCs,同时以添加ABCL培养基为对照组,研究ABCL四种细胞因子在诱导和维持ASCs多能性中的作用。
  本研究主要内容包括:⑴ABCL组的GOF-GFP阳性克隆出现的最早,数量也最多,并能稳定传代,即新型胚胎干细胞系ASCs。⑵除A(-)组没有出现GOF-GFP阳性克隆以外,其余三组均有GOF-GFP阳性克隆出现:B(-)组在培养后第5天、L(-)组在第6天、C(-)组在第10天依次出现GOF-GFP阳性克隆。但是否可获得稳定的干细胞系还有待进一步研究。⑶实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果表明,ABCL组细胞的多能性基因表达水平随着培养天数的增加明显高于其它四个单个细胞因子缺少组,如Nanog的表达。结果还显示,ActivinA的主要作用为促进多能性基因的表达,并抑制AFSCs向表皮方向的分化;BMP4的作用为抑制神经相关基因,同时促进部分多能性基因表达;mLif的作用主要为抑制原始内胚层(PrE)相关基因的表达,并促进多能性基因表达;而CHIR的作用并不明显,可能与表观遗传调控和生殖特化等基因的表达相关。⑷核型分析结果显示,ASCs在不同培养液ABCL、AF和FH的培养和诱导过程中,均未见明显异常。
[硕士论文] 史文姝
动物遗传育种与繁殖 延边大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精过程中,多精入卵被视为最普遍的异常受精,而近年来的许多研究表明,透明带(ZP)的泛素化异常是造成多精入卵的主要原因之一。泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)是一种主要的去泛素化酶,研究显示UCHL1与透明带蛋白的泛素化水平相关。本试验的丰要目的是探究抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响。试验主要分三部分进行:(1)UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用DAPI染色观察极体排放情况,从而验证抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟率的影响;(2) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用SDS-PAGE和Western blot等方法检测猪卵母细胞透明带泛素化水平的影响;(3) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用Hoechst染色观察精卵粘附及多精入卵情况。试验得到以下结果:
  1.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,对照组成熟率为66.22%,而30μM组的成熟率为5.30%,且各处理组成熟率差异性显著(P<0.05),结果表明抑制UCHL1对猪卵母细胞的体外成熟有影响。
  2.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,经Western blot检测结果显示各处理组的ZP在约65kDa,85kDa,120kDa处均发生不同程度的泛素标记,通过灰度值分析差异显著(P<0.05),结果表明随UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。
  3.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,进行体外受精,经Hoechst染色显示对照组ZP精子粘附数最多,精子入卵数最少;随着UCHL1抑制剂浓度逐渐增大,ZP精子粘附数逐渐减少,精子入卵数逐渐增多;添加30μM UCHL1抑制剂组的ZP精子粘附数少,没有精子入卵。结果表明UCHL1调节ZP精子粘附及多精入卵。
  结果显示,UCHL1抑制剂对猪卵母细胞的体外成熟有影响。随着UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。UCHL1调节ZP精子粘附以及多精入卵。
[硕士论文] 黄佳琪
机械工程 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:随着现代生物医学技术研究的不断深入,对于细胞个体的生物显微操作过程越来越复杂和精密。其操作精度已经逼近亚微米甚至纳米水平,这对生物显微操作技术提出了更高的要求。因此研制面向复杂细胞“手术”的高精密和微损伤细胞显微注射装置成为了现代生物医学发展的迫切需求。
  本课题以细胞显微注射的微创化为总体目标,借助压电陶瓷超声振动技术实现了微损伤细胞破膜。新型细胞注射仪具有三大优势:(1)新型轻量化压电陶瓷封装结构传导速率高,散热快,寿命长;(2)优化的微针夹持头兼容普通商用弯头平口针,使得注射仪通用性大大提升;(3)集成细胞弹性模量检测与细胞压电破膜功能于一体的陶瓷封装设计,初步实现了细胞弹性模量实时检测与细胞注射于一体的流程构想。总体上,新型微创化压电超声细胞显微注射仪的操作效果相比传统装置有了较大进步。主要研究内容如下:
  一,阐述了细胞注射技术的概念,并对与其紧密相关的辅助技术进行了介绍,对细胞注射仪的研究现状进行了概括,总结出“机器视觉代替人眼视觉”,“机械手代替人手”的显微注射技术发展趋势。
  二,研究了压电技术与超声技术,并对微针的振动进行了数学分析,对微针的受迫振动微分方程进行了推导。在破膜机理上,通过对比分析提出了新的破膜理论。文中将微针针尖振动进行了分解,分别研究各振动在三个破膜阶段中的作用机理,发现侧向振动在破膜第二阶段能够明显减小微针阻力,对破膜具有一定的辅助作用。细胞弹性模量检测功能方面,在对已有技术总结掌握的基础上,阐述了本文所用技术的技术原理。
  三,进行了注射装置结构的设计与优化。新压电封装使用6061铝合金开放式外壳,减轻质量并提高了散热性;同时使用弓形弹变结构传导振动,传导速率与稳定性更高。微针夹持头优化后结构更小,质量更轻仅有1g,适合未来实验室快速3D打印。折弯设计使得传统20μm弯头微针适用于压电注射,大大提升了装置的通用性。最后对整体进行了模态与谐响应仿真,仿真结果显示装置低阶模态频率最高2KHz,对装置超声振动无影响,且在超声频段22KHz处侧向位移最小仅有18.5μm,初步满足破膜操作要求。
  四,为了检验装置的破膜效果,研究装置的破膜性能,对破膜装置进行了测试与实验。首先搭建了实验平台,平台使用微机械手与机器视觉辅助操作。在空气与培养液中测试后发现,针尖侧向在20KHz附近达到最低振幅,在培养液的削弱作用下,残影宽度最低可达20.5μm。按照操作过程,对装置的弹性模量检测功能进行了检验,测试表明装置能够初步分辨不同弹性模量的硅胶块。最后,使用猪卵母细胞进行了多组破膜实验,并对新旧装置造成的细胞损伤状况进行了对比评估,结果表明新装置对细胞损伤更低。后续对三组共60枚细胞破膜培养,结果显示24小时成活率能达到98.3%。
[硕士论文] 高静
内科学 内蒙古医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:建立一种方法简单、快速适用、重复性好的Oddi括约肌平滑肌细胞的体外培养模型。
  方法:麻醉豚鼠,取豚鼠Oddi括约肌(the sphincter of oddi,SO)并用苏木素伊红(He matoxylin Eosin,HE)染色法的实验步骤对组织进行HE染色,显微镜下观察SO的镜下结构。无菌条件下解剖显微镜下分离豚鼠SO并纵形切开,刮去粘膜组织及表面结缔组织,将肌条切成1mm3~2mm3大小的组织块,用0.1%的II型胶原蛋白酶溶液消化大约4h,每30min观察一次,见组织块变小,边缘模糊,原来澄清液变为混悬液,获得大量梭形Oddi括约肌细胞后终止消化,收集消化液,经500um滤网过滤后,离心,弃上清液,加入适量含20%胎牛血清的DMEM培养基,吹打均匀后,移入25ml培养瓶,置于二氧化碳培养箱内静置培养。显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法进行a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定,测原代细胞生长曲线。
  结果:HE染色结果为细胞核和胞质内的嗜碱性物质被苏木素染成紫蓝色,细胞质和嗜酸性物质被伊红染成深浅不同的粉红色,细胞呈梭形,包浆丰富,细胞核呈椭圆形。倒置显微镜下观察原代Oddi括约肌平滑肌细胞(Sphincter of oddi Smooth Muscle Cells,SOSMCs)呈梭形或带状,细胞核呈卵圆形,位于中央。当细胞相互融合,约长满培养瓶80%时,可传代,呈典型的“峰-谷”样生长,依据细胞活性,细胞可传至第6代。经形态学观察、免疫细胞化学法鉴定均表明培养的细胞为SOSMCs。细胞增值曲线示豚鼠SOSMCs在第3天达到对数生长期,生长最为迅速,3天后细胞生长逐渐减缓,细胞增值活性逐渐降低。
  结论:应用胶原蛋白酶消化法成功建立了豚鼠SOSMCs体外培养模型,此培养方法可作为研究SOSMCs生物学行为的有效模型。
[博士论文] 马腾
外科学(骨外) 中国人民解放军空军军医大学;第四军医大学 2017(学位年度)
摘要:长节段周围神经损伤的治疗仍是一个世界性难题。目前,应用组织工程神经支架结合细胞修复神经缺损,被认为是替代自体神经移植治疗和克服自体神经移植缺陷的最有效方法。然而,由于神经损伤周围组织血管损伤造成的缺血、缺氧,植入组织工程支架内的细胞大量死亡,很大程度限制了细胞的功能,从而影响了其修复神经缺损效能的发挥。因此,在新生血管长入前,建立一种氧供系统为植入体内的细胞供氧有望成为修复长节段神经缺损的有效方法。本研究以全氟三丁胺为基础,构建了结合有雪旺细胞的氧供修复系统,在明确PFTBA对缺氧状态下雪旺细胞活性及功能有促进作用的基础上,我们提出了两种可用于长节段神经损伤的修复方案。(1)应用 PFTBA纤维蛋白水凝胶保护早期缺氧状态下的雪旺细胞,并用其填充于可降解胶原-壳聚糖神经导管,构建雪旺细胞-PFTBA凝胶修复系统,修复大鼠长节段神经缺损,促进其神经再生。(2)构建基于同轴静电纺丝技术的壳-核结构,封装PFTBA,构建具有氧缓释功能的神经修复系统,桥接神经缺损,促进神经的再生和功能恢复。该研究提示:基于PFTBA构建的氧供修复系统极大的丰富了利用“氧”作为神经损伤修复的理论,为神经损伤修复开拓了新的领域。整个研究可分为以下三部分:
  第一部分、PFTBA纤维蛋白水凝胶氧供系统的构建及其对缺氧雪旺细胞的保护性研究
  背景:雪旺细胞作为一种经典的组织工程细胞,已经被越来越多的学者应用于周围神经损伤修复。然而,由于组织损伤后局部血管损伤造成的缺血,使得植入的雪旺细胞因缺氧而活性降低,影响了修复效果。因此,构建一种能为雪旺细胞早期供氧材料,保护其活性就显得即为重要。
  目的:构建PFTBA纤维蛋白水凝胶氧供系统,研究其对缺氧状态下雪旺细胞活性和功能的保护。
  方法:制备一种富含PFTBA的纤维蛋白水凝胶,使其作用于培养于缺氧环境中的雪旺细胞,从而观察检测其对雪旺细胞活性和功能的影响。首先,我们应用血气分析仪定量检测制备的PFTBA纤维蛋白水凝胶在培养基中的释氧能力。其次,我们将培养的雪旺细胞种植在含有这种水凝胶的培养基中,并将其置于正常氧或者缺氧环境中。再次,我们应用流式细胞仪对SCs对缺氧的耐受进行检测,同时应用CCK-8对细胞的增殖分化进行评估。进一步通过SCs的迁徙实验以及RT-PCR的检测对细胞功能进行研究。最后,我们应用PFTBA纤维蛋白水凝胶作为载体,对雪旺细胞的进行3D细胞培养,并采用活-死细胞染色评估细胞短期活性,采用RT-PCR检测评估细胞功能。
  结果:血气分析表明:PFTBA凝胶能够明显升高其周围培养基的氧浓度;PFTBA能够明显升高缺氧培养的雪旺细胞的CCK-8值,降低其凋亡率;PFTBA可以促进3D培养状态下雪旺细胞的活性,上调细胞NGF、BDNF、GDNF、VEGF、N-cam的mRNA表达水平。
  结论:PFTBA纤维蛋白水凝胶氧供系统对缺氧的雪旺细胞的活性和功能具有保护作用。
  第二部分、PFTBA纤维蛋白水凝胶氧供系统修复神经缺损的有效性研究
  背景:应用组织工程神经导管结合雪旺细胞来修复周围神经缺损,被认为是替代自体神经移植治疗和克服自体神经移植缺陷的最有效方法。然而,由于组织损伤后局部血管损伤造成的缺血、缺氧,神经导管内部的低氧环境很大程度上限制了雪旺细胞的活性,从而影响了其修复神经缺损效能的发挥。因此,应用含有携氧剂PFTBA的水凝胶作为雪旺细胞的载体,使其与神经导管复合,可能是一种更加有效和方便的解决方案,有望明显改善支架内部早期的缺氧环境,促进雪旺细胞的存活以及功能的发挥,从而促进外周受损神经的再生和功能恢复。
  目的:探讨PFTBA对植入体内的雪旺细胞活性的保护作用,研究PFTBA纤维蛋白水凝胶氧供系统修复神经缺损的有效性。
  方法:应用PFTBA水凝胶作为雪旺细胞的载体,与胶原-壳聚糖神经导管有机结合,构建PFTBA神经修复系统,修复大鼠15mm坐骨神经缺损,通过行为学分析、神经电生理检测、荧光金逆行示踪、靶器官及再生神经远端的形态学分析(Masson染色、甲苯胺蓝染色、免疫荧光染色、透射电镜等)等方法评价神经再生和功能恢复情况。
  结果:应用PFTBA水凝胶氧供系统修复长节段大鼠坐骨神经缺损时,复合雪旺细胞的PFTBA水凝胶的神经支架与不含有PFTBA水凝胶的神经导管相比,其雪旺细胞的存活率明显提升,其促进轴突顺利贯穿神经支架并支配远端靶器官。
  结论:PFTBA水凝胶可以明显改善神经导管内部早期的缺氧环境,促进雪旺细胞的存活以及功能的发挥,促进周围神经的再生和功能恢复。
  第三部分、基于同轴静电纺丝技术的PFTBA缓释修复系统的研究
  背景:周围神经损伤时,损伤的血管可以导致局部缺血、缺氧,而这一状态一直会持续至局部组织再血管化。因此,神经组织工程支架中心部位的细胞处于缺氧环境,严重限制着神经再生的修复。鉴于此,寻找可以解决局部供氧的材料有望改善局部再生微环境,保护植入雪旺细胞活性,从而促进神经缺损的修复效果。
  目的:探讨基于同轴静电纺丝技术的PFTBA缓释修复系统修复神经缺损的效能。
  方法:基于同轴静电纺丝技术,利用聚已内脂和壳聚糖,构建一种具有壳-核结构的封装有PFTBA的静电纺丝材料,并对其释氧特性进行评估。将雪旺细胞接种于该材料膜上,应用血气分析,CCK-8以及流式周期检测,评估缺氧环境或者正常氧环境中该壳-核结构对雪旺细胞的影响。其次,我们将最佳参数的PFTBA壳-核结构与PFTBA水凝胶作为雪旺细胞的载体,构建神经支架修复系统,修复大鼠17mm坐骨神经缺损,通过行为学分析、神经电生理检测、荧光金逆行示踪、靶器官及再生神经远端的形态学分析(HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫荧光染色、透射电镜等)等方法评价神经再生和功能恢复情况。
  结果:PFTBA壳-核结构能够形成氧缓释状态,维持周围培养基一定的氧浓度至144h;该PFTBA壳-核结构纺丝对雪旺细胞无明显毒性,同时能够保护缺氧状态下雪旺细胞的活性;当应用该结构结合PFTBA水凝胶修复坐骨神经缺损时,其促进轴突顺利贯穿神经支架并支配远端靶器官。
  结论:基于 PFTBA构建了结合有雪旺细胞的壳-核结构神经支架修复系统可显著加快神经再生,促进其功能的恢复。
[硕士论文] 刘治威
外科学 内蒙古医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨小分子化合物诱导小鼠成纤维细胞在体外重编程为多能性干细胞的研究。
  方法:体外分离培养胎鼠成纤维细胞经小分子化合物诱导为多能干细胞。利用碱性磷酸酶监测、细胞核型分析、免疫组化、RT-PCR等技术确定其具有干细胞性质。
  结果:采用七种小分子化合物VPA,CHIR99021,616452,Tranylcypromine,Forskolin,AM580,EPZ004777诱导成纤维细胞形成多潜能干细胞的过程中,细胞诱导前期经历了一个类胚外内胚层(XEN,Extraembryonic endoderm cells)的中间阶段。该细胞系在诱导过程首先形成上皮样细胞克隆,这些上皮细胞样细胞表达胚外内胚层细胞标志性蛋白如SALL4,GATA4,SOX17并在进一步诱导过程中形成胚胎干细胞样克隆,并表达SOX2,OCT4,NANOG等胚胎干细胞标志性蛋白。该细胞系碱性磷酸酶阳性,证明细胞处于未分化状态,具有干细胞性质。
  结论:
  1、小分子VPA,CHIR99021,Forskolin,EPZ004777,AM580,Tranylcy,Promine可将小鼠成纤维细胞诱导形成多潜能干细胞。
  2、在化学诱导成纤维细胞重编程的过程中细胞首先经历一个XEN的中间态,随后又形成多能干细胞。
  3、全化学诱导小鼠成纤维细胞重编过程,没有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子参与,克服转录因子诱导iPS的安全问题,使得诱导效率提高了近1000倍。
[硕士论文] 赵一桐
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:透明带(zona pellucida,zP)是包裹在卵母细胞外的一层由糖蛋白组成的外被结构,在初级卵泡早期阶段由卵母细胞和颗粒细胞共同分泌形成。在受精过程和早期胚胎发育中起着重要作用。然而,透明带的厚化和硬化不利于胚胎的孵化。因此,我们尝试利用辅助孵化(assisted hatching,AH)技术提高囊胚的孵化率,从而提高胚胎的着床率以及子代的出生率。辅助孵化是通过人为的方法对透明带进行处理,使胚胎从透明带释放出的技术。目前,辅助孵化技术有许多种,我们组早期的实验发现,不同的辅助孵化技术对不同时期的胚胎进行操作会有不同的效果。Piezo介导的各种辅助孵化技术中,在桑椹胚期进行透明带打小孔处理后(打孔尺寸约为10μm),可获得最高的囊胚孵化率。而该种方法是否能够提高胚胎的着床率以及子代的出生率仍有待考究。本实验利用该种辅助孵化方法处理胚胎,再进行胚胎移植(embryo transfer,ET),统计其胚胎着床率、母鼠妊娠率、子代出生率以及子代生长曲线等数据,以探明piezo介导的辅助孵化对小鼠胚胎着床和发育的影响。
  本研究对以下三种不同来源的胚胎进行分析,包括:(1)自然交配组(mating组),用作非辅助孵化、非胚胎移植操作的对照组;(2)体内受精获得的胚胎,仅进行胚胎移植,而不进行辅助孵化处理,用于观察胚胎移植对妊娠效率及后代发育的影响(embryo transfer,ET组);(3)体内受精获得的胚胎,进行辅助孵化处理后,再进行胚胎移植,用于观察辅助孵化和胚胎移植对妊娠效率及后代发育的影响(small hole,SH组)。
  我们的研究结果表明,与Mating组相比,ET组中的胚胎移植操作会降低胚胎着床数,着床后的胚胎发育迟缓,孕天延迟,子代出生数降低,并影响子代生长曲线;但对胚移后妊娠率、活胎率、性别都没有影响。胚移后得到的子代小鼠再进行自然交配,其孕天以及生育能力没有受到影响。
  与ET组相比,SH组虽然能够提高胚胎的体外孵化效率,但着床后胚胎发育迟缓,并影响子代生长曲线。打孔之后的胚胎在胚移之后,母鼠存活率、着床数、着床率、妊娠率、孕天、子代小鼠出生数、出生率、活胎率、性别、孕天以及子代小鼠生育能力等都没有影响。
  SH组与Mating组相比较,会降低胚胎着床数,着床后的胚胎发育更加迟缓,孕天延迟,子代出生数降低,并影响子代生长曲线;但对胚移后妊娠率、活胎率、性别都没有影响。胚移后得到的子代小鼠再进行自然交配,其孕天以及生育能力没有受到影响。
  综上所述,piezo介导的透明带打小孔的辅助孵化方式并不能够提高胚胎的着床率、母鼠的妊娠率和子代的出生率。相反,经过辅助孵化和胚胎移植操作后,会导致胚胎发育紊乱,对着床后胚胎的发育和子代生长曲线都有影响,但并不影响子代小鼠的性别和生殖能力。因此,我们认为,依赖于打孔方式的辅助孵化技术,在临床上应该被谨慎使用。
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