神经病学(神经肿瘤免疫)
山东大学
2017(学位年度)
摘要:本文分为以下两个部分进行探讨:
第一部分 脂多糖激活的Toll样受体4信号通路在胶质瘤CD133+肿瘤干细胞的发生发展及免疫逃逸中的作用及机制研究
目的:
胶质瘤恶性肿瘤组织内存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)。胶质瘤CSCs的肿瘤源性活性极强,并具有多种干细胞的特性,如多向分化、无限增殖及自我更新能力等。目前,大部分研究将CD133作为胶质瘤CSCs的常用标记。文献报道,胶质瘤CSCs在胶质瘤的生长、入侵、血管形成、放化疗耐药及免疫逃逸过程中发挥重要作用。Toll-样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)是目前研究最多的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)。最近研究发现,多种肿瘤组织异常高表达TLR4,而且TLR4在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。但是,胶质瘤CD133+ CSCs是否表达TLR4及TLR4的具体功能如何?目前还不清楚。因此,该部分使用人胶质瘤细胞株及从患者肿瘤病理组织中分离得到的原代细胞,诱导生成胶质瘤CSCs,分离并获得胶质瘤CD133+ CSCs,以胶质瘤CD133+ CSCs作为研究对象。使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活TLR4信号传导通路,并建立胶质瘤CD133+ CSCs反应性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),研究TLR4信号传导通路在胶质瘤CD133+CSCs发生发展及免疫逃逸过程中的作用及可能机制。
方法:
使用人胶质瘤细胞株SF295、U251及从4例胶质瘤患者肿瘤组织中分离得到的肿瘤原代细胞(pT1-4),诱导生成胶质瘤CSCs。通过流式细胞学方法,检测胶质瘤CSCs常见分子标记的表达水平。通过CD133磁珠分选方法,从胶质瘤CSCs中分离并获得6种胶质瘤CD133+ CSCs。使用流式细胞学及Western Blot方法,检测胶质瘤CD133+ CSCs中TLR4的表达水平;通过免疫组织化学染色方法(immunohistochemistry, IHC),检测胶质瘤患者肿瘤病理组织标本中TLR4的表达水平。使用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、实时定量聚合酶链反应(real time quantity polymerase chain reaction,qRT-PCR)、流式细胞学、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)及Western Blot方法,检测LPS刺激后,胶质瘤CD133+ CSCs的增殖、分子标记表达、细胞因子分泌及相关信号传导通路分子表达情况。从健康供者外周血中分离获得的单个核细胞,使用磁珠分选方法,获得CD3+T细胞。胶质瘤CD133+ CSCs经过辐照,与CD3+T细胞共培养,建立胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL。通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验,检测胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL对其靶细胞的细胞毒性杀伤作用,并通过流式细胞学鉴定胶质瘤CD133+CSCs反应性CTL的表型。
结果:
胶质瘤CSCs表达CD133、Nanog、SSEA-1、Msil及Nestin。胶质瘤CD133+CSCs及患者组织标本表达TLR4蛋白。LPS促进胶质瘤CD133+ CSCs的增殖并保护其免遭阿霉素诱导的凋亡。LPS在基因及蛋白质水平上调胶质瘤CD133+CSCs标记CD133、Nanog及Nestin的表达。LPS促进胶质瘤CD133+ CSCs分泌细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、巨噬炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-仅)、白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6及IL-10。LPS激活TLR4信号传导通路,诱导胶质瘤CD133+ CSC表达细胞周期蛋白酶4(cyclin-dependent kinase,CDK)、CDK6、Cyclin E、B细胞淋巴瘤-2(B-celllymphoma-2,bcl-2)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、p-p38、p-Jun氨基末端激酶(Jun amino-terminal kinase,JNK)、p-细胞外信号相关激酶(extracellularsignal related kinases,ERK)及p-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)。TLR4的表达抑制胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL的细胞毒性杀伤功能,而这种抑制作用在敲低TLR4表达的胶质瘤CD133+ CSCs中不明显。而且,记忆性效应T细胞在TLR4信号传导通路介导的胶质瘤CD133+CSCs免疫逃逸过程中发挥重要的作用。
结论:
胶质瘤CD133+ CSCs表达TLR4,LPS激活的TLR4信号传导通路促进胶质瘤CD133+ CSCs的增殖、化疗耐药、分子标记表达及细胞因子分泌,并保护其免遭胶质瘤CD133+ CSCs反应性CTL的细胞毒性杀伤作用。因此,TLR4信号传导通路是胶质瘤CD133+ CSCs发生发展及免疫逃逸的重要因素,阻断TLR4信号传导通路可能为胶质瘤患者提供治疗新策略。
第二部分:B7-H6在胶质瘤发生发展中的作用及机制研究
目的:
近年来,尽管治疗策略方面的研究有了很大的进展,胶质瘤仍然是一种不可治愈的疾病,患者5年生存率较低。靶向一些调控肿瘤发生发展及免疫应答反应等分子方面的研究,可能为胶质瘤的治疗提供新的理论依据及策略。据报道,与正常组织不同,肿瘤组织及细胞特异性表达B7-H6。而且,B7-H6在肿瘤的发生发展及免疫应答反应过程中发挥重要的作用。但是,B7-H6在胶质瘤方面的研究较少。因此,本部分以胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代细胞为研究对象,采用分子生物学及免疫学的研究方法,研究胶质瘤B7-H6的表达水平;研究细胞因子及炎症介质刺激后胶质瘤细胞B7-H6表达水平的变化,探索胶质瘤B7-H6表达的具体调控机制。研究胶质瘤患者肿瘤病理组织标本中B7-H6的表达水平。阐述B7-H6在胶质瘤发生发展过程中的作用及可能机制。旨在为胶质瘤的有效治疗方案的建立提供新的理论依据。
方法:
通过PCR方法,检测人胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代肿瘤细胞B7-H6的表达水平。通过IHC方法,检测胶质瘤患者肿瘤病理组织标本中B7-H6的表达水平。使用LPS刺激人胶质瘤肿瘤细胞,通过qRT-PCR及Western Blot方法,检测不同时间的LPS作用后,人胶质瘤肿瘤细胞株B7-H6表达水平的变化。通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)方法敲低胶质瘤细胞B7-H6的表达水平。通过CCK-8、克隆形成实验及细胞计数等方法,检测人胶质瘤肿瘤细胞的增殖能力。通过划痕愈合实验、transwell迁移和侵袭实验,检测人胶质瘤肿瘤细胞的转移和侵袭能力。通过Western Blot方法,检测人胶质瘤肿瘤细胞相关蛋白分子的表达水平,分析B7-H6导致的胶质瘤发生发展过程中涉及到的信号传导通路及相关蛋白分子。
结果:
PCR方法检测显示,人胶质瘤肿瘤细胞株及从患者肿瘤病理组织中分离得到的原代细胞表达B7-H6。IHC方法检测显示,胶质瘤患者肿瘤病理组织标本表达B7-H6。使用LPS,在不同的时间点刺激人胶质瘤肿瘤细胞株后,胶质瘤细胞B7-H6的mRNA和蛋白水平表达增加。使用siRNA方法,敲低人胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代细胞中B7-H6的表达水平。敲低肿瘤细胞B7-H6的表达水平后,人胶质瘤肿瘤细胞株及患者原代细胞的增殖、迁移及侵袭能力降低,其可能的机制是通过降低vimentin、N-cadherin、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9及survivin的表达水平,并增加E-cadherin和bcl-2相关x蛋白(bcl-2 associated x Protein,Bax)的表达水平来介导。
结论:
人胶质瘤肿瘤细胞株、患者原代细胞及肿瘤病理组织标本中均可检测到B7-H6的表达。LPS诱导人胶质瘤肿瘤细胞株B7-H6的表达。B7-H6在人胶质瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,通过调控相关蛋白分子的表达促进肿瘤的增殖、侵袭及转移的发生。因此,该研究将为靶向B7-H6的胶质瘤治疗方案的研究提供新的理论依据和靶点。