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[硕士论文] 任重阳
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:失眠是常见的睡眠障碍,不仅影响免疫功能,且能造成认知功能的损害。腺苷在人体脑内及外周广泛分布,通过调节神经细胞功能及神经递质的释放,发挥促眠作用。腺苷信号包括腺苷产生、代谢过程关键酶及腺苷受体,它们也与睡眠调节相关。研究显示,睡眠紊乱会诱导免疫炎症因子的异常表达,而一些炎症因子在也具有促眠作用。在腺苷的主要分泌场所星形胶质细胞中,腺苷与免疫炎症因子共同作用,调节睡眠觉醒过程。失眠会造成认知功能的损害,特别是工作记忆及空间识别能力的降低。以往的研究主要针对睡眠剥夺的健康人群,对于符合慢性失眠诊断标准患者的外周腺苷相关指标及免疫功能的研究较少,同时也缺乏这些指标与患者记忆功能联系的研究。
  目的:探索慢性失眠障碍(CID)和失眠共病抑郁(ICD)患者外周血腺苷水平与免疫炎症因子水平的变化,探索相关指标的的变化是否与失眠患者记忆能力的损害存在联系。
  方法:募集首诊于睡眠及神经内科门诊,主诉失眠的患者共69例。根据ICSD-3诊断标准分为CID病例37例(男13例,女24例)和ICD病例32例(男6例,女26例)。来源于体检中心的对照组47例(男13例,女34例)。进行患者基本资料如年龄、性别及教育程度的采集。由专业医师完成匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)评估患者的睡眠质量,汉密尔顿抑郁量表17项(HAMD-17)评估患者抑郁情绪及蒙特利尔认知量表(MoCA)评估患者总体认知功能。指导患者完成九盒迷宫实验,评估相关记忆能力。抽取受试者静脉血,部分进行淋巴细胞分离,部分离心获取血浆置于-80℃冰箱冻存。应用液相色谱串联质谱法测血浆腺苷水平,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ADA水平,应用PHA刺激淋巴细胞转化实验检测淋巴细胞转化率,应用Luminex液相芯片技术检测外周血IL-1β、TNF-α及IL-4水平。
  结果:CID组、ICD组和对照组的基本资料,包括年龄、性别及教育程度无统计学差异;CID组和ICD组PSQI评分高于对照组(P<0.05),但其两组组间无统计学差异,CID组和ICD组的HMAD-17评分均高于正常对照组(P<0.05),且ICD组的评分高于CID组(P<0.05);三组间物体及空间参考记忆、物体及空间工作记忆和物体再认记忆均有统计学差异(P<0.05),两两比较CID组物体工作、空间工作及物体再认记忆的错误数高于对照组(P<0.05),ICD组的所有类型记忆错误数均高于对照组(P<0.05);三组间的腺苷水平有统计学差异(P<0.05),CID组及ICD组的腺苷水平低于对照组(P<0.05);三组间比较ADA水平之间有统计学差异(P<0.05),ICD组的ADA水平高于对照组(P<0.05),CID与对照组及CID与ICD两组间ADA水平无统计学差异;三组间比较淋巴细胞转化率之间有统计学差异(P<0.05),ICD组的淋巴细胞转化率高于对照组(P<0.05),ICD与CID两组间无统计学差异;三组间比较TNF-α水平之间有统计学差异(P<0.05),CID组和ICD组的TNF-α均高于对照组(P<0.05),且ICD组TNF-α水平低于CID组(P<0.05);三组间的IL-1β水平均有统计学差异(P<0.05),CID组及ICD组的IL-1β水平高于对照组(P<0.05),且ICD组的IL-1β水平高于CID组(P<0.05);三组间的IL-4水平无统计学差异,CID组的IL-4水平高于对照组(P<0.05)。
  结论:失眠患者(慢性失眠组和失眠共病抑郁组)外周血腺苷水平降低,影响了促进睡眠和抑制觉醒的能力。失眠共病抑郁组的淋巴细胞转化率及ADA水平升高;失眠患者体内具有促眠作用的TNF-α和IL-1β升高,慢性失眠组患者体内对TNF-α和IL-1β负调控的IL-4同时升高。提示失眠影响了机体的免疫功能,且机体会对失眠造成的免疫状态改变进行自我调整。因腺苷具有免疫抑制作用,外周血腺苷水平降低伴随免疫细胞因子表达的上调是合理的,但其中的通路及机制需进一步探索。失眠患者的记忆功能损害程度与TNF-α、IL-1β、腺苷水平的变化有相关性,记忆功能损害来自于它们的影响。
[硕士论文] 程柯
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:本研究旨在探讨Calsyntenin-1(CLSTN1),钙粘蛋白超家族Ⅰ型跨膜蛋白在脆性X综合症(Fragile X Syndrome,FXS)神经元成熟过程中的作用,以及它是否通过介导细胞内细胞间粘附分子5(Intercellular adhesion molecule5,ICAM5)的转运来调节树突棘的发育。
  方法:Fmr1基因敲除小鼠(FVB.129P2-Pde6b+Tyrc-ch Fmr1tmlCgr/J)(Fmr1KO)和野生对照小鼠(FVB.129P2-Pde6b+Tyrc-ch/AntJ)(WT)用作FXS的动物模型,采用免疫印迹,高尔基染色,观察CLSTN1和ICAM5蛋白的表达在WT和KO小鼠随天数依赖性的变化,以及树突棘发育随天数依赖性的变化。原代小鼠神经元培养由WT或Fmr1KO的小鼠前额叶大脑皮层分离,运用免疫细胞化学共定位,免疫共沉淀,活细胞延时成像分析,来鉴定CLSTN1和ICAM5之间的相互作用。采用多种神经元转染,利用Dil染色观察CLSTN1蛋白的变化对培养的神经元的树突棘的发育的影响。
  结果:1)发现在Fmr1KO小鼠前额叶皮质神经元中存在大量未成熟的丝状伪足样的棘;2)Fmr1KO小鼠突触发育关键期脑皮质神经元上CLSTN1表达不足,而同时ICAM5过表达;3)CLSTN1和ICAM5在小鼠皮质神经元上存在着相互作用现象,转染的过表达蛋白也存在着共运输现象;4)在WT小鼠前额叶皮质神经元中干扰CLSTN1表达,ICAM5与PSD95的共定位明显增加,ICAM5在树突棘膜表面堆积,影响棘的发育;6)Fmr1KO小鼠中过表达CLSTN1可以改善树突棘发育的异常。
  结论:CLSTN1通过调节神经元中的ICAM5重新分布在树突棘形成和成熟中起关键作用,在Fmr1KO小鼠中,CLSTN1失调导致神经元树突ICAM5分布的异常,进而引起树突棘发育的异常。因此,CLSTN1可能成为FXS的潜在生物标志物和治疗靶点。
[硕士论文] 裴亚平
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是因脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein,FMRP,由FMR1基因编码)缺乏引起的一种遗传性智力发育迟滞疾病,是最常见的遗传性智力障碍,也是自闭症谱系障碍(ASD)的主要单基因突变致病因素。FXS特征性神经病理改变是树突棘和突触发育异常,导致其认知功能障碍,但其树突棘发育畸形的机制尚不清楚。单次跨膜蛋白细胞间粘附分子5(Intercellular adhesion molecule5,ICAM5,也叫端脑素Telencephalin)是免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)超家族成员之一,与神经元和树突棘发育以及树突状丝状伪足的形成和维持有关。本研究旨在利用FXS动物模型,Fmr1基因敲除(Fmr1KO)小鼠,探讨ICAM5是否参与FXS特征性神经病理改变是树突棘发育异常,并进一步研究RNA结合蛋白FMRP和ICAM5mRNA的直接相互作用。
  方法:1)FXS动物模型Fmr1KO(FVB.129P2-Pde6b+Tyrc-chFmr1tm1Cgr/J)小鼠,同龄野生型(wild-type,WT)小鼠(FVB.129P2-Pde6b+Tyrc-ch/AntJ)作为在体动物模型,以及取自WT或Fmr1KO胚胎(E17-E18)前额叶大脑皮层的原代神经元培养作为离体细胞模型;2)高尔基染色检测小鼠出生后树突棘发育改变;3)免疫印迹检测出生天数依赖的ICAM5表达谱;4)RNA免疫沉淀、实时荧光定量PCR和DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定FMRP和ICAM5mRNA之间的相互作用;5)Dil染色检测神经元树突棘的变化;6)系列行为学实验检测小鼠行为学改变。
  结果:1)ICAM5蛋白在Fmr1KO小鼠的出生后大脑中上调,但在Fmr1KO小鼠的出生后大脑中ICAM5mRNA第30天下降;2)ICAM5蛋白的发育变化平行于Fmr1KO小鼠树突棘高密度的时间;3)在WT神经元中,干扰FMR1表达后ICAM5蛋白过度表达,ICAM5mRNA水平不变,幼稚丝状树突棘增多;4)过表达FMR1表达后ICAM5蛋白表达下降,ICAM5mRNA水平不变,成熟的蘑菇状树突棘增多;5)FMRP的过度表达使ICAM5表达正常化,并进一步改善Fmr1KO神经元中的树突棘形态;6)FMRP直接与ICAM5mRNA结合,并通过与ICAM5mRNA的编码序列相互作用调控ICAM5的表达来影响树突棘成熟。7)ICAM5蛋白的过度表达与Fmr1KO小鼠的行为异常有关,包括空间记忆和恐惧记忆;减少ICAM5的表达可以改善Fmr1KO小鼠的行为异常。
  结论:FMRP通过与ICAM5mRNA的直接相互作用来调节ICAM5的合成,并且Fmr1KO小鼠中FMRP的缺乏引起ICAM5的过度表达,导致树突棘形态异常和行为的损伤。据我们所知,这是第一个为ICAM5提供功能性连接的研究,这种功能连接在神经元形态和FXS认知损害方面存在缺陷,并且提示FMRP在树突棘形态中起重要作用。
[博士论文] 廖少华
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:为了描述和分析肿瘤神经抗体相关疾病(Onconeural Antibody-Associated Disorders,OAAD)的临床特征及结局,同时鉴别疾病预后不良的预测因素。
  方法:文章回顾性分析了本院2009.9至2017.7所有符合诊断标准的OAAD病例共70例。我们收集了全面的信息,把所有OAAD病人按诊断标准分为三类:副肿瘤综合征(paraneoplastic neurological disorders,PNDs)、自身免疫性脑炎(autoimmune encephalitis,AE)和可能OAAD。同时,我们依据临床结局mRS(modified Rankin Scale)评分,把所有病例分类为预后良好组(mRS=0-2)和预后不良组(mRS=3-6)。依据两种不同分类方法,我们总结了各组病例的临床特征和结局,同时应用单因素分析和多因素回归分析方法,比较各组间特征的差异,并鉴别疾病预后不良的预测因素。
  结果:(1)一般资料:(以下计数资料均表示为n+%,计量资料均表示为中位数+范围)①共有70名病人纳入研究,其中44名男性(62.9%),中位年龄55岁(14-78)。处于免疫抑制状态的有17人(24.3%);住院前时间是74(7-1090)天;住院时间是37(3-116)天。②分组来看,PNDs组有38人(38/70,54.3%),包括男性21人(21/38,55.3%)。AE组有14人(14/70,20%),包括男性8人(8/14,57.1%)。可能OAAD组有18人(18/70,25.7%),包括男性15人(15/18,83.3%)。处于免疫抑制状态人数,PNDs组、AE组、可能OAAD组分别有9人(9/38,23.7%)、3人(3/14,21.4%)、5人(5/18,27.8%);住院前时间各组分别为120(15-1090)天、22.5(8-365)天、60(7-365)天。住院时间各组分别为10(3-79)天、36(4-90)天、10.5(3-116)天。(2)临床表现:①所有病人中(均以70人为整体),急性起病16人(22.9%),亚急性起病17人(24.3%),慢性起病37人(52.9%)。有54人(77.1%)无明显前驱症状。起始症状主要包括:肢体无力29人(41.4%),肢体麻木9人(12.9%)。入院时体温大于37℃的有8人(11.4%)。主要临床症状包括:认知功能损害的有17人(24.3%),精神行为异常表现的有17人(24.3%),意识障碍的有7人(10%),癫痫发作的有13人(18.6%),新发的局灶性神经功能损害的有30人(42.9%),尿失禁/潴留表现的有12人(17.1%)。②分组来看,PNDs常见慢性起病,为26人(26/38,68.4%);AE常见急性起病,为9人(9/14,64.3%);可能OAAD组常见慢性起病,为8人(8/18,44.4%)。主要临床症状,PNDs组常见新发局灶性神经功能损害(21/38,55.3%),尿失禁/潴留(6/38,15.8%);AE组常见认知功能损害和精神行为异常(10/14,71.4%);可能OAAD组常见新发局灶性神经功能损害(8/18,44.4%),癫痫发作(4/18,22.2%)。(3)检查结果:①整体来看,共有60个病人(60/70,85.7%)接受了神经系统MRI检查,18人(18/60,30%)发现FLAIR/T2异常。有53人(53/70,75.7%)接受了CT筛查,13人(13/53,24.5%)发现肿瘤。有27人(27/70,38.6%)接受了脑电图检查,21人(21/27,77.8%)发现了异常慢波。有38人,38/70,58.6%)接受了肌电图检查,34人(34/38,89.5%)有异常发现,以周围神经病变为主。有43人(43/70,61.4%)接受了腰椎穿刺并脑脊液化验,白细胞数目为8.0(0-96.0)×106/L;蛋白含量为0.5(0.2-3.9)g/L。有56人(56/70,81.4%)检测了血清肿瘤标记物,26人(26/56,46.4%)为阳性,NSE阳性为16人(16/47,34.0%),CEA阳性为9人(9/56,16.1%)。有67人(67/70,95.7%)检测了血清肿瘤神经抗体,38人(38/67,56.7%)为阳性,主要的抗体包括13例(13/38,34.2%)Hu抗体,11例(11/38,28.9%)Yo抗体,13例(13/38,34.2%)NMDAR抗体。有37人(37/70,54.3%)检测了血清共存自身抗体,19人(19/37,51.4%)为阳性,包括TGAb13人(13/37,35.1%),TPOAb5人(5/37,13.5%),ANA5人(5/37,13.5%)等。重要脏器功能指标结果均在正常范围。②分组来看,PNDs组有28人(28/38,73.7%)接受了CT筛查系统性肿瘤,其中发现肿瘤有10人(10/38,26.3%),阳性率高于其它各组。PNDs脑脊液IgG含量为58.6(17.5-169.0),IgG指数为593.3(231.1-791.9)/1000,均高于其它组。AE组NSE为11.7(8.6-30.1)ug/L,AFP为1.3(0.6-8.5)ng/ml,为三组较低。可能OAAD组CY211为2.9(1.8-3.9)ug/L,高于其它组。PNDs组有13例(13/38,34.2%)Hu抗体,10例(10/38,26.3%)Yo抗体为阳性,AE组有13例(13/14,92.9%)NMDAR抗体为阳性。可能OAAD组TGAb为1.5(0.1-36.0)IU/ml,TPO为1.7(0.2-1087.0)IU/ml,均高于其它组。(4)诊断和治疗:①所有病人(均以70人为整体)主要诊断包括抗NMDAR抗体脑炎13例(18.6%),周围神经病12例(17.1%),亚急性小脑变性12例(17.1%),Lambert-Eaton肌无力综合征8例(11.4%)。有35人(50.0%)有既往或新发肿瘤,包括19例(27.1%)肺癌,其中10例(14.2%)小细胞肺癌,其次是乳腺癌4例(5.7%)。治疗方面,共有35人(50.0%)接受了免疫治疗,22人(31.4%)应用了激素,26人(37.1%)应用了IVIg,13人(18.6%)应用了激素+IVIg,4人(5.7%)接受了肿瘤手术治疗,2人(2.9%)行化疗。6人(8.6%)需要ICU监护,其中5人(7.1%)接受了机械通气治疗。②分组来看,PNDs组主要诊断是周围神经病(10/38,26.3%),亚急性小脑变性(8/38,21.1%),AE组主要诊断是抗NMDAR抗体脑炎(13/14,92。9%),可能OAAD组主要诊断是边缘叶脑炎(4/18,22.2%),亚急性小脑变性(4/18,22.2%)。AE组共有13人(13/14,92.9%)接受了免疫治疗,6人(6/14,42.9%)应用了激素,12人(12/14,85.7%)应用了IVIg,4人(4/14,28.6%)需要ICU监护且接受了机械通气治疗,以上指标比例均高于其它两组。(5)结局:①最后共有35人(50%)预后良好。其中男性25人(25/35,71.4%);年龄为54(14-77)岁,大于65岁以上有8人(8/35,22.9%);共有11人(15.7%)死亡,其中男性6人(8.6%),5人(7.1%)大于65岁。②分组来看,PNDs组有14人(14/38,36.8%)、AE组有9人,(9/14,64.3%)、可能OAAD组有12人(12/18,66.7%)预后良好。最后死亡人数各组分别为6人(6/38,15.8%),2人(2/14,14.3%),3人(3/18,16.7%)。(6)结局预测因素:应用单因素分析方法,结果表明,住院前时间(P=0.0224)和尿失禁/潴留(P=0.0043)对不同预后的影响有统计学显著差异。免疫抑制状态(P=0.0944)、脑脊液IgG(P=0.0773)、所有肿瘤数量(P=0.0542)对不同预后可能存在显著影响。应用多因素回归分析,结果表明,尿失禁/潴留(P=0.0388)和免疫抑制状态(P=0.0247)对不同预后的影响有统计学显著差异,其OR值分别为27.22和34.6,表明为预后不良的危险因素。
  结论:1.OAAD临床特征。OAAD以中老年人为主,男性多于女性,病程时间整体较长。OAAD以慢性起病多见,多无明显前驱症状,起始症状以肢体无力最多见,主要症状以新发局灶神经功能损害多见。OAAD神经系统MRI异常及CT肿瘤筛查阳性率在30%左右;脑脊液白细胞数量、蛋白含量均高于正常人群;肿瘤标记物以NSE、CEA阳性较多见;肿瘤神经抗体以Hu、Yo、NMDAR抗体多见;共存自身抗体以TGAB、TPO、ANA较为多见。OAAD主要诊断是抗NMDAR抗体脑炎、周围神经病、亚急性小脑变性;所有肿瘤病人占总数50%左右,最常见的是肺癌,其次是乳腺癌。有50%病人接受了免疫治疗,以激素、免疫球蛋白为主,肿瘤治疗较少。病人预后良好者占50%,男性比例较高;死亡率为15.7%,男女比例相当。
  2.OAAD各组临床特征。(1)一般资料和临床表现:各组年龄以可能OAAD组最大,AE组年龄较小;男性比例也是可能OAAD组最高;住院前时间以PNDs组最大;住院时间则以AE组最大。PNDs组以慢性起病为主,AE组以急性起病为主。AE组多见认知损害、精神行为异常;新发局灶性神经功能损害以PNDs组最多。(2)辅助检查:CT发现肿瘤阳性率以PNDs组最高。脑脊液分析中,IgG含量、IgG指数以PNDs组较高。肿瘤标记物中,NSE、AFP以AE组较低,CY211以可能OAAD组较高。肿瘤神经抗体PNDs组以Hu、Yo抗体多见,AE组以NMDAR抗体为主。TGAB、TPO均以可能OAAD组较高。(3)诊疗及结局:PNDs诊断以周围神经病、亚急性小脑变性较多见,AE组主要是抗NMDAR抗体脑炎,可能OAAD组以边缘叶脑炎、亚急性小脑变性为主。AE组接受免疫治疗、ICU监护及机械通气治疗最多。预后良好病人比例以PNDs组较低,死亡人数比例以AE组较低。
  3.OAAD结局的预测因素。
  应用单因素分析方法进行统计学分析,住院前时间、尿失禁/潴留对不同预后的影响存在显著差异(P<0.05)。进一步应用多因素回归分析,尿失禁/潴留和免疫抑制状态对不同预后的影响存在统计学显著差异(P<0.05),为预后不良的危险因素。
[硕士论文] 苏东安
精神病与精神卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:抑郁症是一种常见的情感障碍,主要临床表现为情绪低落、兴趣减低,甚至可出现极端消极观念和自杀行为,致残及致死率非常高,预计到2020年,抑郁症将成为全球第二大常见疾病[1];先前研究发现抑郁症的发病机制可能与相应脑区神经营养因子水平下调及促炎性因子的异常激活有关[2-4]。大量研究指出氯胺酮作为一类临床常用的全身麻醉药,其可发挥快速起效的抗抑郁作用,且对伴有自杀倾向的难治性抑郁患者亦有改善作用[5,6],本研究旨在通过构建抑郁动物模型和临床实验进一步证实氯胺酮对抑郁症的治疗作用,并试图阐明氯胺酮抗抑郁机制,从而为临床治疗抑郁症提供理论基础。
  一、氯胺酮对抑郁大鼠白介素-1β和白介素-6表达的影响
  目的:观察氯胺酮对抑郁大鼠前额皮层及海马区组织内白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)表达的变化。
  方法:Wistar大鼠雄性20只,2月龄,体重180~220g。按随机方式分为2组(n=10),分别给予生理盐水(对照组,C组)、给予氯胺酮药物治疗组为K组。应用行强迫游泳实验15min的方法建立大鼠抑郁模型,建模后第2天腹腔注射氯胺酮10mg/kg或等体积生理盐水。注射30min后再次进行强迫游泳试验5min,记录大鼠不动时间。然后立即处死大鼠,剥前额皮层及海马组织测定IL-1β和IL-6的表达。
  结果:与对照组相比,氯胺酮干预后大鼠强迫游泳不动时间明显减少(p<0.01),大鼠前额皮层及海马区的IL-1β和IL-6表达均明显下调(p<0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与前额皮层及海马IL-1β和IL-6的表达下调有关。
  二、氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子及5-羟色胺水平的影响
  目的:探索单次小剂量静脉注射氯胺酮对抑郁症患者血清脑源性神经营养因子(BDNF)及5-羟色胺(5-HT)水平的影响。
  方法:39名抑郁症患者随机分为两组:对照组(n=20),氯胺酮组(n=19)。氯胺酮组静脉持续推注0.5mg/kg盐酸氯胺酮溶液50ml,推注时间40min,对照组推注等容量生理盐水50ml。在治疗前及治疗后第1、3、7天完成汉密尔顿(HAMD)量表评分及测定外周静脉血BDNF及5-HT的含量。
  结果:与对照组相比,氯胺酮组患者在干预后第1、3、7天HAMD评分均明显降低(p<0.05),治疗后第1天BDNF水平明显上升(p<0.01),尽管第3天有所回落但仍显著高于对照组(p<0.05),第7天无明显差异(p>0.05),5-HT水平各时间节点与对照组无明显差异(p>0.05)。
  结论:氯胺酮的抗抑郁作用可能与上调血清BDNF的表达有关,与5-HT的关系尚需进一步研究证实。
[博士论文] 郭洪伟
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目前在侧支循环的研究中,多集中在急性缺血方面,而对慢性缺血侧支循环的研究却较少。将两者进行对比研究未见有报道。随着近年来基因技术、分子生物学和基因测序技术的进步,发现长链非编码RNA在细胞的增殖、分化、代谢凋亡等方面有着重要的调控作用,人类疾病的发生、发展也和它有密切关系。特别在血管内皮细胞和血管平滑肌的研究中发现lncRNA在许多方面对其有调控作用。侧支循环建立形成的基因调控目前仍未完全清楚,并且大部分研究集中于mRNA。lncRNA调控侧支循环的研究却鲜有报道。因此我们构建了大鼠急性和慢性缺血模型,进一步观察大鼠急性或者慢性缺血状态下颅内各个血管变化进一步寻找可能的影响因素。同时对大鼠脑缺血区的脑血管做了二代的RNA-seq高通量测序。我们试图在大鼠脑急性缺血模型和慢性缺血模型中寻找在血管生成和侧支循环形成的异同,为可能的基因调控靶点提供一些证据。
  第一部分 大鼠急性、慢性缺血模型及侧支循环的建立
  试验方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型,选成年雄性Wistar健康大鼠,随机分成三组:A组(假手术组),B组(MCAO模型组),C组(慢性缺血组)。所有大鼠造模后均行激光散斑成像观察,分别于苏醒后2小时、12小时、24小时、48小时、72小时和1周每个时间段行神经功能评分,后4个阶段每组处死3只大鼠取脑,行HE和CD105染色,观察脑侧支循环建立和血管生成。
  结果:
  TTC染色示:B组梗死面积百分比达到20.30±4.62%,C组梗死面积百分比为3.02±1.26%。激光散斑血流图示:在A组造模后,脑血流无明显变化。B组在MCAO侧脑灌注明显减少,降幅达60%以上,在梗死后软膜动脉既开放向缺血区供血。C组全脑灌注明显减低达50%以上,早期大脑中、大脑前仍有血流,较前明显减少。HE染色B组脑组织水肿,病变区血管充血扩张大量神经细胞死亡,C组在部分可见有少量血管充血,大脑皮层及海马区可见部分神经细胞变性皱缩坏死,结构稀疏。CD105染色示在B组梗死核心区和梗死灶周边均有新生血管生成,梗死灶周边明显,随着梗死时间延长新生血管逐渐增多,7天时最多。C组也有新生血管生成,相对B组较少。
  第二部分 缺血后大鼠脑血管差异表达RNA研究
  试验方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型,选成年雄性Wistar健康大鼠,随机分成三组:A组(假手术组),B组(MCA0模型组),C组(慢性缺血组)。模型建立后48小时处死大鼠,立刻取右侧缺血区脑血管,提取RNA,行二代高通量RNA-seq测序。利用Ballgown对两组转录本进行比较,寻找差异基因,应用KEGG数据库进行GO分析、pathway分析,构建信号传导网络(signal-net)分析和lncRNA与mRNA共表达网络(lncRNA-mRNA-net)分析。qRT-PCR验证RNA-seq测序结果。
  结果:
  1、急性缺血组与对照组lncRNA与mRNA的分析:较筛选出差异lncRNA71个差异基因,其中34个上调,37个下调。mRNA有1963个,其中上调的有1142个,下调821个。在mRNA相互作用网络中,与血管生成相关的mRNA中,基因Tek、Kdr、Plcb4和Plcg1在整个调控网络起到了非常重要作用。Tek、Kdr能够通过激活Plcb4对Prkce、Prkcb、Prkca、Itpr1、Pla2g4a、Mapk13和Mapk11组成的网络进行调控。Kdr也能够通过Plcg1对上述网络进行调控。Itgb2能够通过调控Fgf2来影响Adcy5继而影响上述调控网络。ENSRNOT00000036680、ENSRNOT00000084727同时对Plcg1调控,前者为正向调控,后者为负向调控。Tek未发现有lncRNA调控,对Kdr调控的lncRNA有三个,其中ENSRNOT00000077132调节能力最强为负向调控,ENSRNOT00000092096为正向调控。ENSRNOT00000073655对Plcb4进行负向调控。ENSRNOT00000087051对Adcy5进行正向调控。
  2、慢性缺血组与对照组lncRNA与mRNA的分析:筛选出差异lncRNA276个差异基因,其中66个上调,160个下调。mRNA有3289个,其中上调的有1776个,下调1513个。在mRNA的相互作用网络中,与血管生成有关的mRNA中,Mapk1、Prkca同Nras和Kras构成了主要的相互作用网络。Nras、Kras与Mapk1将作用更密切并能调控Mapk8、Mapk9。我们推测在慢性缺血的过程中血管的生成主要是通过对Mapks调控。通过lncRNA与mRNA共表达网络分析发现ENSRNOT00000092872对Kras进行负向调控,ENSRNOT00000076004对Nras调控。对Mapk1调控的lncRNA中作用最强的是ENSRNOT00000090397和ENSRNOT00000076495,前者为负向调控。ENSRNOT00000092832对Prkca进行调控。
  3、慢性缺血组与急性缺血组lncRNA与mRNA的分析
  对比急性和慢性缺血组的RNA数据分析:在有血管生成有关的mRNA中,在两组中均有表达的有330个。差异表达在4倍以上的有21个。Kcnab2、Atp6v1g2、Stmn4、Stim1、Cyp1b1、Fgf2等差异基因两组之间是反向调节,而Kng2在两组之间均为上调但B组差异倍数更显著。B组与C组之间GO分析和pathway分析对比发现,Kcnab2、Stmn4仅在C组中有显著性差异。Stim1、Cyp1b1仅在C组中有显著性差异。Atp6v1g2在离子跨膜运输功能上B组为下调,C组上调,代谢通路上B组为下调,C组上调。从上数据我们可以看出,Kng2、Fgf2和Atp6v1g2在B、C两组中具有相同的功能,相同的调控通路。ENSRNOT00000087079在调控Stmn4的lncRNA中调控能力最强。ENSRNOT00000002990对Serpine1负向调控,但在C组中ENSRNOT00000076446的调控能力较ENSRNOT00000002990强,正向调控。对Kng2的调控两组没有相同的lncRNA。在两组中ENSRNOT00000079300对lgf1调控均为负向调控。ENSRNOT00000092605对Ap6v1g2在两组中均为正向调控,但在C组中ENSRNOT00000089288的调控能力较ENSRNOT00000092605强,负向调控。
  结论:
  1、急性梗死超早期的侧支循环建立以固有动脉为主,如Willis动脉环,软膜动脉。梗死后血管新生发生在24h内出现,随着梗死时间延长,血管新生越明显,7天时仍有明显血管新生。血管新生在梗死灶核心和周边均有,周边明显增多。慢性血管狭窄颅内侧支循环的建立主要以固有动脉为主,也存在部分血管新生但较急性脑梗死少。
  2、急性缺血模型中Tek、Kdr、Plcb4、Plcg1对血管生成有重要调控作用,可能是通过VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等通路调控进行调控,其中Mapks信号通路作用可能更明显。ENSRNOT00000077132、ENSRNOT00000092096和ENSRNOT00000073655对上述mRNA起到了调节作用。
  3、慢性缺血模型中Mapk1、Prkca、Nras和Kras等基因在其中起到了重要作用调控作用,其PI3K-Akt信号通路和Mapk信号通路在其中贡献较大。ENSRNOT00000092872、ENSRNOT00000076004和ENSRNOT00000092832等lncRNA对上述mRNA的调控作用强。
  4、Kng2、Fgf2和Atp6v1g2在B、C两组中具有相同的功能,相同的调控通路。在两组中ENSRNOT00000079300对lgf1调控均为负向调控。ENSRNOT00000092605对Atp6v1g2在两组中均为正向调控,但在C组中ENSRNOT00000089288的调控能力较ENSRNOT00000092605强,负向调控。
[博士论文] 王馨蕊
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分 基于高分辨率磁共振管壁成像探讨颅内动脉瘤壁强化与动脉瘤破裂相关性的系统综述和Meta分析
  目的:高分辨率磁共振管壁成像(magnetic resonance vessel wall imaging,MR-VWI)中,颅内动脉瘤(intracranial aneurysm,IA)瘤壁的强化反映瘤壁中存在活跃的炎症反应,间接提示动脉瘤的不稳定性。本研究通过系统回顾和Meta分析方法,探讨IA瘤壁强化与动脉瘤破裂的相关性。
  方法:综合检索MEDLINE、Embase文摘数据库、Cochrane图书馆,以及中国知网(CNKI)、万方和维普数据库公开发表的以IA瘤壁强化与动脉瘤破裂相关性为主要研究内容的中、英文文献。由2名高年资神经影像诊断医师独立筛选文献,对纳入文献进行质量评价和资料提取。采用Revman5.3软件对提取的原始数据进行分析:通过Cochrane Q检验和I2检验评价纳入研究是否存在异质性,根据异质性检验结果选择固定效应模型或随机效应模型进行效应量加权合并。采用Z检验评价合并效应量是否具有统计学意义。当纳入研究的异质性显著时,进一步做亚组分析以寻找异质性来源。采用STATA13软件和Begg-Mazumdar检验评价纳入研究是否存在发表偏倚。
  结果:本研究最终纳入8篇文献,包括5篇英文文献和3篇中文文献。共纳入700例动脉瘤,其中破裂动脉瘤160例(22.9%)。Meta分析结果显示,IA瘤壁强化与动脉瘤破裂整体存在显著相关性(OR=35.09,95% CI15.32~80.38,p<0.01),纳入研究不存在统计学异质性(p=0.25;I2=0)和显著发表偏倚(p=1.000)。对IA完全强化与动脉瘤破裂相关性的亚组分析结果显示,IA完全强化与<7mm小动脉瘤破裂具有显著相关性(OR=25.99,95% CI6.54~111.79,p<0.01),而与≥7mm大动脉瘤破裂不具有相关性(p=0.78)。
  结论:IA瘤壁强化与动脉瘤破裂具有显著相关性,IA完全强化有助于鉴别具有高危破裂风险的<7mm小动脉瘤。基于MR-VWI技术判断IA瘤壁是否强化有望成为评估动脉瘤破裂风险的影像学新方法。
  第二部分 症状性未破裂颅内动脉瘤的瘤壁强化特征研究
  目的:本研究运用高分辨率磁共振管壁成像(magnetic resonance vessel wallimaging,MR-VWI)技术,以症状性未破裂颅内动脉瘤(unruptured intracranialaneurysm,UIA)作为研究对象,对症状性UIA的瘤壁强化特征进行定性、分级分析,探索症状性UIA的高危管壁影像特征。
  方法:在2014年7月至2017年12月间,连续收集我院神经外科收治的症状性UIA患者纳入症状组。在同期就诊的无症状UIA患者中,根据患者年龄、性别以及动脉瘤大小、部位与症状组进行1∶1配比,选择合适病例纳入对照组。所有患者行3T MR-VWI和DSA检查。记录患者的临床资料,测量动脉瘤形态参数,对动脉瘤壁强化方式进行定性、分级评价。比较症状组和对照组患者临床资料、动脉瘤形态以及瘤壁强化方式是否存在统计学差异。
  结果:症状组和对照组共纳入78例UIA患者,平均年龄57.4±10.1岁,包括26位男性(33.3%)和52位女性(66.7%)。配比后症状组与对照组患者的临床基本资料和动脉瘤形态均无显著差异(p>0.05)。症状组UIA的瘤壁强化率高达74.3%,显著高于对照组(46.1%),差异具有统计学意义(p<0.05)。在强化程度方面,症状组与对照组UIA瘤壁轻度强化和明显强化的发生率无明显统计学差异(p>0.05)。但在强化范围方面,症状组UIA瘤壁弥漫强化与完全强化的发生率显著高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.01)。
  结论:症状性UIA的瘤壁强化率显著高于无症状UIA,二者强化方式存在一定差异。通过MR-VWI技术对UIA瘤壁进行显像,利用瘤壁“弥漫强化”和“完全强化”这一管壁影像特征,有助于对症状性UIA进行快速甄别。
  第三部分 未破裂颅内动脉瘤壁强化与动脉瘤破裂危险因素及破裂风险的相关性研究
  目的:本研究利用高分辨率磁共振管壁成像(magnetic resonance vessel wallimaging,MR-VWI)技术,对未破裂颅内动脉瘤(unruptured intracranial aneurysm,UIA)的瘤壁强化方式进行定性、分级分析,并基于动脉瘤破裂风险计算模型评估UIA破裂风险,探讨UIA瘤壁强化与动脉瘤破裂危险因素和计算破裂风险的相关性。
  方法:在2014年7月至2017年12月间,连续收集我院神经外科收治的无症状UIA患者纳入本研究。所有患者行3T MR-VWI和DSA检查。记录患者的临床资料,测量动脉瘤形态学参数,对动脉瘤壁强化进行定性、分级分析,并根据UCAS和PAHSES动脉瘤破裂风险计算模型评估UIA的1年和5年破裂风险。以动脉瘤壁是否强化作为因变量,以患者临床资料、动脉瘤一般情况及形态特征作为自变量进行单因素和多因素Logistic回归分析。采用Spearman相关系数检验分析动脉瘤壁强化等级与动脉瘤形态以及计算破裂风险的相关性。
  结果:研究共纳入77名患者(平均年龄58.4±10.8岁,男性39位,女性38位)和88例UIA。多因素Logistic回归分析结果显示,颈内动脉以外动脉瘤部位(OR=3.4,95% CI1.6~7.1)以及动脉瘤大小(OR=1.9,95% CI1.3~2.7)是与动脉瘤壁强化相关的独立危险因素(p<0.05)。伴有瘤壁强化的UIA1年和5年破裂风险显著升高(p<0.001)。动脉瘤壁强化等级与动脉瘤大小、瘤体与载瘤动脉直径比以及计算破裂风险存在中度相关性(Spearman R2≥0.30,p<0.05)。
  结论: UIA瘤壁强化与动脉瘤破裂危险因素具有显著相关性,伴有瘤壁强化的UIA在短至中期内破裂风险显著升高。瘤壁强化等级与动脉瘤大小和破裂风险存在正相关性。利用MR-VWI可实现颅内动脉瘤壁结构的无创性成像,有助于在常规风险评估方法的基础上进一步鉴别具有潜在破裂风险的高危动脉瘤。
  第四部分 颅内夹层动脉瘤的磁共振管壁成像研究
  目的:颅内夹层动脉瘤(intracranial dissecting aneurysm,IDA)是引起青年卒中的重要原因。本研究利用高分辨率磁共振管壁成像(magnetic resonance vessel wallimaing,MR-VWI)技术,对IDA形态进行定性和定量分析,探讨不同类型IDA的影像学特征差异。
  方法:在2016年1月至2017年9月间,连续收集我院神经外科收治的IDA患者纳入本研究,所有患者行3T MR-VWI检查。定性评价IDA管腔和管壁形态,定量测量IDA形态参数。结合IDA管腔形态和管壁特征,将纳入对象分为经典型、节段扩张型、延长扩张型和局部巨大占位型四组。比较四组IDA患者临床资料、动脉瘤管腔和管壁形态的定性分析和定量测量结果有无差异。
  结果:研究共纳入49例IDA患者,平均年龄52.7±11.8岁,包括35位男性(71.4%)和14位女性(28.6%)。各组分别纳入:经典型27例(55.1%),节段扩张型7例(14.3%),延长扩张型12例(24.5%),局部巨大占位型3例(6.1%)。IDA形态的组间比较结果显示,经典型以非扩张性病变为主(p<0.001),管壁常见内膜瓣及双腔征(p<0.05);节段扩张型多见管腔扩张(p<0.001),少见内膜瓣和双腔征(p<0.05),常见附壁血栓形成(p=0.019);延长扩张型和局部巨大占位型以瘤体外部扩张为主要表现(p<0.01),瘤体外管径、瘤体长度、管壁厚度指数及管腔重构指数显著高于经典型和节段扩张型(p<0.001)。此外,IDA瘤壁强化率高达98.0%,强化程度随时间推移逐渐减弱(p<0.01),节段扩张型多见瘤壁局部强化,经典型、延长扩张型和局部巨大占位型多见瘤壁弥漫强化,差异具有统计学意义(p=0.047)。
  结论:不同类型IDA存在显著形态学差异,反映了疾病进程中的病理变化。MR-VWI有助于明确颅内夹层动脉瘤的诊断及分类,并可作为一种无创影像学检查方法对夹层动脉瘤患者进行长期随访。
[博士论文] 李力
神经外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 介入治疗囊性未破裂颅内动脉瘤的神经系统并发症危险因素分析
  目的:
  探索介入治疗囊性未破裂颅内动脉瘤发生神经系统并发症的发生风险,分析影响神经系统并发症的危险因素,为临床医生决策提供参考依据。
  方法:
  回顾性收集2010年1月至2017年1月间在第二军医大学长海医院接受介入治疗的囊性未破裂颅内动脉瘤患者,应用单因素和多因素分析其临床及影像学特点,分析可能的神经系统并发症危险因素。
  结果:
  1232例患者中有60例(4.87%)发生神经系统并发症。单因素分析结果显示高血压病(P=0.022)、吸烟史(P=0.043)、既往短暂性脑缺血发作或脑梗死病史(P=0.000)、心血管合并症(P=0.001)、动脉瘤最大径>10mm(P=0.000)、不规则形态或有子囊(P=0.010)、血流导向装置(P=0.000)与术后神经系统并发症的发生相关,多因素分析结果显示既往短暂性脑缺血发作或脑梗死病史(P=0.000,OR=3.503)、心血管合并症(P=0.002,OR=3.290)、动脉瘤最大径>10mm(P=0.000,OR=3.571)和不规则形态或有子囊(P=0.019,OR=2.191)是术后神经系统并发症发生的独立危险因素。
  结论:
  既往脑梗死病史或短暂性脑缺血发作史、心血管合并症、动脉瘤直径>10mm和不规则形态或有子囊是囊性未破裂颅内动脉瘤介入术后发生神经系统并发症的独立危险因素。
  第二部分 介入治疗囊性未破裂颅内动脉瘤术中破裂的危险因素及临床特点分析
  目的:
  探讨囊性未破裂颅内动脉瘤介入治疗过程中发生术中破裂的危险因素及术中破裂的临床特点,为临床降低术中破裂的发生率提供对策。
  方法:
  回顾性收集2010年1月至2017年2月间在第二军医大学长海医院接受介入治疗的囊性未破裂颅内动脉瘤患者,分析其临床及影像学特点,并对术中破裂可能的危险因素行单因素和多因素分析。
  结果:
  共1232例患者中有11例(0.89%)发生术中破裂。单因素分析结果显示心血管疾病史(P=0.025)、前交通动脉瘤(P=0.009)、不规则形态(P=0.001)、支架应用(P=0.016)与术中破裂相关,多因素分析结果显示心血管疾病史(P=0.008,OR=6.919)、不规则形态(P<0.001,OR=9.758)、前交通动脉瘤(P=0.024,OR=4.648)是颅内未破裂动脉瘤发生IPR的独立危险因素,放置支架是颅内未破裂动脉瘤发生IPR的保护因素(P=0.026,OR=0.238)。
  结论:血管疾病史、不规则形态、前交通动脉瘤时囊性未破裂颅内动脉瘤发生术中破裂的独立危险因素。支架治疗患者术中破裂的发生率低于非支架治疗患者。
  第三部分 介入治疗囊性未破裂颅内动脉瘤缺血并发症的危险因素及临床特点分析
  目的:
  分析囊性未破裂颅内动脉瘤介入治疗过程中发生缺血并发症的危险因素及临床特点,为临床降低缺血并发症的发生率提供依据。
  方法:
  回顾性收集2010年1月至2017年2月间在第二军医大学长海医院接受介入治疗的1232例囊性未破裂颅内动脉瘤患者的临床资料,分析其临床及影像学特点,并对缺血并发症可能的危险因素行单因素和多因素分析。
  结果:1232例患者中有34例(2.76%)发生缺血并发症,其中支架内血栓形成16例、术后症状性脑梗死15例、短暂性脑缺血发作3例。单因素分析结果显示高血压病(P=0.002)、吸烟(P=0.050)、动脉瘤最大径>10mm(P=0.005)与缺血并发症相关,多因素分析结果显示高血压病(OR=3.192,P=0.003)、吸烟(OR=2.956,P=0.022)、动脉瘤最大径>10mm(OR=2.915,P=0.004)为缺血并发症的独立危险因素。缺血并发症的永久致残率和致死率分别为8.8%(3/34)和2.9%(1/34)。
  结论:
  高血压病、吸烟、动脉瘤最大径>10mm是囊性未破裂颅内动脉瘤介入治疗过程中发生缺血性并发症的独立危险因素。
  第四部分 介入治疗囊性未破裂颅内动脉瘤术后复发的危险因素分析
  目的:
  报道囊性未破裂颅内动脉瘤介入治疗术后的临床及影象学随访结果,并探索影响动脉瘤复发的危险因素,为临床降低动脉瘤术后复发提供帮助。
  方法:
  回顾性收集2010年1月至2016年12月间在第二军医大学长海医院接受介入治疗且有完整随访的囊性未破裂颅内动脉瘤患者,收集其临床和影象学特征,行单因素和多因素分析可能与术后复发相关的危险因素。
  结果:共537例连续性数据的患者纳入本研究,其中56例(10.4%)发生术后复发。单因素分析结果显示既往SAH病史(P=0.038)、动脉瘤最大径>10mm(P<0.001)、瘤颈宽度>6mm(P<0.001)、治疗策略(P=0.001)与动脉瘤术后复发相关,多因素分析结果显示既往SAH病史(P=0.004,OR=4.361)、动脉瘤最大径>10mm(P=0.008,OR=3.491)是囊性未破裂颅内动脉瘤术后复发的独立危险因素,与单纯栓塞相比,支架辅助栓塞可降低囊性未破裂颅内动脉瘤的术后复发风险(P<0.001,OR=0.146)。
  结论:
  既往SAH病史、动脉瘤最大径>10mm是囊性未破裂颅内动脉瘤术后复发的独立危险因素。与单纯栓塞相比,支架辅助栓塞可降低囊性未破裂颅内动脉瘤的术后复发风险。
[硕士论文] 张春阳
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  急性缺血性卒中在各类脑血管病的全球发病率中居首位,具有极高致残率和死亡率,严重危害人类健康。正五聚素3(PTX3)在多种疾病中被证实是评估患者病情严重程度及预后的一个有效的指标,但PTX3在脑血管领域价值仍有待进一步探究。本文将探究急性脑梗死患者溶栓前后24小时PTX3变化,并分析PTX3与溶栓治疗效果和长期预后之间的联系。
  方法:
  前瞻性的纳入2016年7月至2017年6月在我院接受静脉溶栓治疗的急性缺血性卒中患者。所有纳入研究的患者在溶栓前均通过多模式影像学评估排除需进一步桥接血管内治疗的手术指征。收集患者溶栓前及溶栓后24小时血浆,采用酶联免疫吸附测定法测定PTX3浓度。对患者溶栓前及溶栓后24小时进行NIHSS评分,记录人口学资料、卒中相关危险因素、溶栓治疗时间窗(3/3-4.5小时)、他汀类药物服用史等信息,在患者发病3个月后回访进行mRS评分。以24小时NIHSS评分较溶栓前NIHSS评分下降≥40%作为溶栓治疗有效的判定标准,采用mRS≤2分作为预后良好的判定标准。通过对比溶栓有效组和无效组的相关因素以及根据溶栓前PTX3浓度的上下三分位数分为三组进行亚组分析评估PTX3在溶栓治疗中的价值,最后通过对溶栓治疗有效和预后良好进行单因素及多因素分析,评估PTX3与溶栓疗效和长期预后的相关性。
  结果:
  本研究中符合入组标准的患者47例,年龄44-83岁,男性30例,女性17例。溶栓治疗有效组22例,无效组25例,其中3小时内溶栓治疗(P=0.03)和24小时NIHSS(P<0.001)评分在两组中存在显著差异,溶栓有效组的溶栓前及24小时PTX3均高于无效组,但两组间无统计学差异(P=0.72,P=0.36)。通过对溶栓前PTX3进行亚组分析,亚组内人口学因素、卒中危险因素及溶栓时间窗等未见显著差异。对溶栓后神经功能改善进行单因素及多因素分析,溶栓前及24小时PTX3未见与溶栓治疗有效相关。对3月后MRS评分进行单因素及多因素分析,仍未见溶栓前PTX3与患者预后良好相关。
  结论:
  在本研究中,接受溶栓治疗的急性缺血性卒中患者的24小时后症状改善与溶栓治疗时间窗相关,尚不能认为溶栓前及溶栓后24小时PTX3浓度与溶栓后24小时症状改善及其长期预后有关。
[硕士论文] 史张
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分 活体颅内动脉粥样硬化斑块形态学及影像组学特征的研究目的:颅内动脉粥样硬化性疾病(ICAD)是导致缺血性脑血管事件的主要原因之一。高分辨率磁共振成像(HR-MRI)是颅内动脉斑块评估的首选方法。本研究旨在基于HR-MRI采用传统形态学及定量影像组学的方法分析颅内动脉粥样硬化斑块,以区分症状性斑块与无症状斑块。
  方法:回顾性分析2013年9月至2016年10月间行HR-MRI检查的158例大脑中动脉和基底动脉狭窄患者。磁共振成像序列采用T1、T2加权成像和Gd对比注射的增强T1成像(CE-T1WI)。测量症状性斑块和无症状斑块的最小管腔面积、斑块负荷、管腔狭窄率、斑块内出血(IPH)、强化率和109个定量影像组学特征。采用多变量Logistic回归和随机森林模型对诊断结果进行评价。
  结果:通过临床特征及形态学分析,吸烟(优势比[OR]=2.724;95%CI,1.200-6.183)、IPH(OR=11.340;5%CI,1.441-89.221)和强化率(OR=6.865;95%CI,1.052-44.802)分别与症状性斑块相关。综合三个因素共同来识别症状性斑块的曲线下面积(AUC)为0.714。而影像组学分析则表明T2WI、T1WI和CE-T1WI图像中提取的22个影像组学特征与症状性斑块有关,其AUC分别为0.801、0.835和0.846。将所有影像组学特征组合起来,其AUC为0.953,准确率可达0.823。所有形态学及影像组学特征组合后AUC可达0.976,准确率为0.874。
  结论:影像组学分析能够准确区分颅内症状性动脉粥样硬化斑块和无症状斑块,且该方法优于传统形态学方法。将影像组学特征与传统临床特征及形态学特征的评估相结合,其准确性最高。
  第二部分 离体颅内动脉粥样硬化斑块影像组学特征的初步研究
  目的:本研究通过应用3.0T磁共振的常规管壁成像序列对离体颅内动脉血管行HR-MRI扫描,以病理分类为标准,以影像组学为手段,评估影像组学对辨别颅内动脉粥样硬化斑块稳定性的能力,并进一步分析不稳定斑块的影像组学特征。
  方法:收集从2013年1月至2015年6月在医院病理科和大学解剖教研室行尸检的14例病例(8男6女,平均年龄79.14±10.34岁)的40根病变颅内血管。对病变血管行3.0T磁共振成像。图像扫描完成后,对血管标本行病理制片处理。依据层面的位置,匹配磁共振图像和病理层面。以病理分型标准为参照,将斑块分为稳定和不稳定两类。采用3D-slice软件对磁共振图像的斑块进行手动勾画,提取影像组学特征。采用随机森林法进行模型的统计学分析。
  结果:40根血管经病理分类后得到稳定斑块49个,不稳定斑块56个。通过建模后,两个序列(T1WI、T2WI)对颅内动脉粥样硬化斑块均有较好的判别能力,其中模型在T1WI、T2WI上判别不稳定斑块的准确率分别为0.832、0.813,AUC分别为0.897、0.920。将全部影像组学特征组合起来共同评判斑块的稳定性时,其准确率为0.861,AUC为0.945。
  结论:基于3.0T高分辨率磁共振管壁成像的影像组学方法能够定量并准确地评估离体颅内斑块的稳定性。不稳定斑块的影像组学特征在T1WI和T2WI两个序列上具有不同的表现;联合所有影像组学特征能够更准确地预测离体斑块的稳定性。
  第三部分 颅内动脉粥样硬化斑块离体与活体影像组学特征的对比研究
  目的:研究基于前期关于离体及活体颅内动脉粥样硬化斑块的影像组学研究,分析颅内动脉离体与活体粥样硬化斑块影像组学特征之间的相关性,以及临床症状分类法和病理分类法在判别斑块上的差异,评估症状性动脉粥样硬化斑块与不稳定斑块的一致性。
  方法:体及活体斑块的影像组学测量见第一部分及第二部分所述。以离体斑块的影像组学特征为参照,找出离体和活体斑块共同扫描序列的相同影像组学特征,并以离体分类标准为依据,用共有的影像组学特征将活体动脉粥样硬化斑块分为稳定斑块和不稳定斑块。Cohen's kappa(κ)值用于判别活体临床症状分类标准与病理分类标准的一致性。
  结果:离体斑块与活体斑块在T2WI和T1WI上的相同影像组学特征各有两个。经过一致性检验发现,四个影像组学特征通过两种分类方法判别斑块稳定性的κ值分别为0.084、0.107、0.076和0.013,且检验均无统计学差异(P>0.05)。症状性斑块为不稳定斑块的漏诊率相对较低而其误诊率相对较高;用四个影像组学特征共同评判时,其平均阳性预测值为0.475,阴性预测值为0.608。
  结论:影像组学分析在离体及活体上均可用于判别颅内粥样硬化斑块的性质,但症状性分类法与病理稳定性分类法一致性欠佳。症状性动脉粥样硬化斑块是不稳定斑块的阳性预测值较低,而无症状斑块是稳定斑块的概率较高。
[博士论文] 吕楠
外科学(神外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 颅内动脉瘤瘤壁强化的危险因素分析
  研究目的:未破裂颅内动脉瘤破裂风险的准确评估是制定其合理治疗策略的重要前提。瘤壁炎症被认为在颅内动脉瘤的发生、发展以及破裂机制中发挥着重要作用。基于高分辨率核磁共振管壁成像技术的瘤壁强化被认为是瘤壁炎症的在体影像指标,但其发生的危险因素及其与动脉瘤破裂风险的关系并不明确。本研究将通过对颅内动脉瘤患者临床及影像资料的回顾性分析,探讨颅内动脉瘤发生瘤壁强化的危险因素,为其在颅内动脉瘤破裂风险评估中的应用提供依据。
  研究方法:回顾性收集2015年1月至2016年12月于上海长海医院神经外科收治的未破裂颅内囊性动脉瘤患者,采集年龄、性别、高血压病病史、糖尿病病史、吸烟史、既往蛛网膜下腔出血史等临床特征资料。对颅内动脉瘤的管壁成像影像进行分析,根据对比剂增强前后T1相瘤壁信号的变化定义为瘤壁非强化、部分强化或环形强化。同时收集颅内动脉瘤相关特征,包括动脉瘤大小、部位、多发性等。按照瘤壁强化程度进行分组,对上述临床特征及动脉瘤特征进行单因素分析后进一步行有序Logistic回归分析,以明确未破裂颅内动脉瘤发生瘤壁强化的危险因素。同时应用PHASES破裂风险评分对未破裂动脉瘤的破裂风险进行评估,从而分析瘤壁强化程度与动脉瘤破裂风险的关系。
  研究结果:根据研究的纳入与排除标准,共入组110例患者,共140枚未破裂颅内动脉瘤,其中男性患者40例,女性患者70例;年龄区间30-80岁,平均年龄57.2±10.7岁。动脉瘤大小区间为1.7-36.0mm,平均大小9.4±6.4mm。其中,69枚(49.3%)瘤壁未见明显强化,39枚(27。9%)表现为瘤壁部分强化,32枚(22.9%)表现为瘤壁环形强化。单因素分析显示,不同瘤壁强化程度组之间动脉瘤大小(P<0.001)、动脉瘤部位(P<0.001)、多发性(P=0.016)及不规则形态(P=0.006)差异无统计学意义。患者年龄、性别、高血压病病史、糖尿病病史、吸烟史、既往蛛网膜下腔出血史等差异无统计学意义(P>0.05)。进一步的有序Logistic回归分析显示,动脉瘤大小(比值比=6.910;95%置信区间=4.175-11.439;P<0.001)与动脉瘤部位(比值比=2.689;95%置信区间=1.642-4.406;P<0.001)是未破裂颅内动脉瘤发生瘤壁强化的独立危险因素。应用PHASES评分对各枚动脉瘤的破裂风险进行计算,结果显示不同破裂风险评分区间中颅内动脉瘤瘤壁强化程度差异有统计学意义,随着动脉瘤破裂风险的增加,瘤壁强化程度显著提高(P<0.001)。
  研究结论:应用管壁成像技术能够有效地对颅内动脉瘤的瘤壁强化进行分析。颅内动脉瘤瘤壁强化程度不仅动脉瘤大小、动脉瘤部位等常规因素密切相关,在不同破裂风险的动脉瘤中也存在显著差异,提示瘤壁强化可能成为颅内动脉瘤破裂风险评估的可行指标,为未破裂颅内动脉瘤临床治疗决策提供依据。
  第二部分 瘤壁强化与血流动力学在颅内动脉瘤破裂危险中的相互作用
  研究目的:由异常血流动力学激活的颅内动脉瘤瘤壁炎症反应进而导致瘤壁的病理性退化是动脉瘤发生、生长以及破裂的关键机制。在第一部分研究中,应用管壁成像技术能够实现对颅内动脉瘤瘤壁强化进行有效地判断。而既往研究证实,应用计算流体力学技术能够对血流动力学进行量化性地分析。本研究拟联合应用管壁成像技术与计算流体力学技术,探讨颅内动脉瘤瘤壁强化与血流动力学的相互关系及其在颅内动脉瘤破裂机制中的作用。
  研究方法:回顾性收集2015年1月至2016年12月于上海长海医院神经外科收治的未破裂颅内囊性动脉瘤患者,采集年龄、性别、高血压病病史、糖尿病病史、吸烟史、既往蛛网膜下腔出血史、动脉瘤部位、多发性等临床资料。对颅内动脉瘤的管壁成像影像进行分析,根据对比剂增强前后T1相瘤壁信号的变化定义为瘤壁非强化、部分强化或环形强化。基于动脉瘤三维旋转造影影像数据进行计算流体力学模拟分析,计算动脉瘤壁面切应力(wall shear stress,WSS)、低壁面切应力面积(percentage of low wall shear stress area,LSA)、剪切震荡指数(oscillatory shear index,OSI)、相对阻滞时间(relative residence time,RRT)、压力(pressure)等血流动力学参数。同时基于三维影像计算颅内动脉瘤的形态学参数,包括动脉瘤大小(Size)、纵横比(aspect ratio,AR)、体积比(size ratio,SR)、体颈比(dome-to-neck ratio,DN)、瓶颈因子(bottleneck factor,BNF)、高宽比(height-to-width ratio,HW)、入射角度等。按照瘤壁强化程度进行分组,对上述临床特征、血流动力学特征及形态学特征进行单因素分析后进一步行有序Logistic回归分析,以明确未破裂颅内动脉瘤发生瘤壁强化与其形态学与血流动力学的相关性。同时应用PHASES评分对未破裂动脉瘤的风险进行评估,并分析动脉瘤形态学、血流动力学与瘤壁强化程度和动脉瘤破裂风险的关系。
  研究结果:根据研究的纳入与排除标准,共入组57例患者,共65枚未破裂颅内动脉瘤,其中男性患者22例,女性患者35例;年龄区间36-80岁,平均年龄58.4岁。动脉瘤大小区间为2.6-19.6mm,平均大小7.1±3.0mm。39枚(60.0%)瘤壁未见明显强化,14枚(21.5%)表现为瘤壁部分强化,12枚(18.5%)表现为瘤壁环形强化。单因素分析显示,不同瘤壁强化程度组之间基线资料差异无统计学意义(P>0.05)。血流动力学参数中,WSS(P=0.001)、LSA(P=0.003)、RRT(P=0.022)在不同瘤壁强化程度组间差异有统计学意义。而OSI(P=0.318)和Pressure(P=0.478)差异无统计学意义。形态学参数中,动脉瘤大小(P<0.001)、AR(P=0.011)、SR(P<0.001)、BNF(P=0.013)、DN(P=0.007)差异有统计学意义,且各参数均符合随着动脉瘤瘤壁强化程度的增加而增大的变化趋势;其余形态学参数,包括HW(P=0.064)和入射角度(P=0.337)差异无统计学意义。进一步的有序Logistic回归分析显示,颅内动脉瘤的SR(比值比=2.575;95%置信区间=1.197-5.540;P=0.016)和WSS(比值比=0.182;95%置信区间=0.035-0.939;P=0.042)是未破裂动脉瘤瘤壁强化的独立危险因素。应用PHASES评分对各枚动脉瘤的破裂风险进行计算,结果显示不同破裂风险评分区间中颅内动脉瘤形态学特征(动脉瘤大小、SR、BNF、DN、入射角度)、血流动力学特征(WSS、LSA、OSI、RRT)以及瘤壁强化程度差异无统计学意义(P<0.05)。
  研究结论:颅内动脉瘤瘤壁强化程度与其血流动力学与形态学密切相关。高破裂风险的未破裂动脉瘤形态学特征表现为体积大而不规则,血流动力学特征表现为低而多变的壁面切应力,而瘤壁特征表现为环形均匀的强化。通过对颅内动脉瘤形态学、血流动力学与瘤壁特征的综合分析可能成为颅内动脉瘤破裂风险提供更准确的依据。
[硕士论文] 黄欣欣
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders,NMOSD)是一种中枢神经系统特发性炎性脱髓鞘疾病,主要侵袭视神经、脊髓与大脑。本文通过总结分析NMOSD患者临床资料,开展横断面研究,比较NMOSD初发组与复发组患者血脂水平,探讨血脂水平与疾病复发的相关性;进一步采用多因素分析研究血清低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平与疾病复发风险的关联,探究胆固醇潜在的炎症作用及其临床意义。
  研究方法:第一部分:回顾性收集2010年1月-2016年6月在长海医院神经内科及仁济医院神经内科住院确诊的96例NMOSD患者的临床与生化资料。根据患者入院时疾病是首次发作还是复发,将患者分为初发组与复发组,并比较两组患者间的临床资料、血生化检验和脑脊液检验指标。按CHO和LDL-C分组比较患者疾病的复发率,并采用校正性别因素的偏相关分析研究胆固醇水平与疾病复发的相关性。
  第二部分:回顾性收集2009年6月-2016年6月在长海医院神经内科及仁济医院神经内科确诊的127例NMOSD患者的临床资料。血清LDL-C水平与疾病复发的相关性采用Spearman秩相关分析和多因素线性Logistic回归分析。采用受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC)来分析能够有效反映疾病初发和复发的最佳LDL-C截断(cut-off)值,确定NMOSD患者血脂水平降低的目标值。
  研究结果:第一部分:疾病初发组与复发组之间女性患者所占比率有统计学差异(48.8%vs.80%,P<0.05),总胆固醇(Cholesterol,CHO)(4.27±0.85vs.5.18±1.26)及LDL-C(4.27±0.85vs.5.18±1.26)比较均有统计学差异(P<0.001);两组间年龄、上呼吸道感染、胃肠道感染、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、尿酸水平、白细胞数及脑脊液蛋白检验比较均无统计学差异(P>0.05);CHO正常组与偏高组患者复发人数百分比为43.55%与82.35%,两组间比较有统计学差异(x2=13.51,P<0.01);LDL-C正常组与偏高组患者复发人数百分比为47.69%与77.42%,两组间比较有统计学差异(x2=7.58,P<0.01)。调整性别因素后进行相关分析,CHO水平与疾病复发呈正相关(r=0.346,P<0.01),LDL-C水平与疾病复发呈正相关(r=0.380,P<0.01)
  第二部分:疾病复发组患者LDL-C水平显著高于初发组(3.05±0.88vs.2.34±0.79,P<0.001);按LDL-C水平正常值将患者分为LDL-C正常组与LDL-C偏高组,LDL-C偏高组疾病复发率显著高于LDL-C正常组(78.00%vs.38.96%,P<0.001);按LDL-C水平由低到高分为T1组、T2组、T3组,其复发率依次为10.24%,18.90%,25.20%,三组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。在调整性别、年龄、胃肠道感染、视觉受损、HDL-C、TG、ALT、BUN、Scr、AQP4抗体和免疫球蛋白等多因素后进行分析,LDL-C水平与复发率的优势比(Crude odds rations,OR)(95%CI)为2.33(1.35,4.04)(P=0.002);调整混杂因素后分析LDL-C水平T1组、T2组、T3组与疾病复发率优势比OR(95%CI)分别为1.0(reference),2.69(1,7.21)(P=0.049)和4.03(1.36,11.93)(P=0.011);按性别、年龄、EDSS评分、视力损伤及AQP4-IgG等因素进行分层分析,统计结果显示在排除上述因素的交互作用后,仍然可以观察到LDL-C水平与疾病复发率的优势比OR值均大于1,p<0.05,进一步论证了偏高水平血LDL-C是NMOSD疾病复发的独立危险因素。通过ROC曲线分析确定降脂目标值,总体应将患者LDL-C控制于2.795mmol/L以内,女性LDL-C控制于2.790mmol/L以内,男性控制于2.360mmol/L以内。ROC曲线下的面积值AUC值均大于0.7,提示确定的降脂目标值对于识别疾病复发有中等强度的准确性。
  研究结论:本研究显示NMOSD复发患者CHO与LDL-C水平高于初发患者,高CHO与高LDL-C血症可能与NMOSD患者疾病复发相关,且女性患者易复发。经过调整混杂的危险因素和分层分析之后,发现偏高水平的LDL-C是疾病复发的独立危险因素,对于临床上NMOSD患者控制胆固醇水平有一定指导意义。
[硕士论文] 孙艳
公共卫生 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过LPS诱导建立小鼠小胶质细胞(BV2细胞)炎症模型,观察了锌对LPS诱导BV2细胞炎症反应的抑制作用以及对海马神经细胞HT-22活性的保护作用,并初步探讨锌抑制炎症反应的机制。研究结果将有助于进一步完善锌对神经炎症抑制作用的机制研究,为抑郁症的炎症假说提供新的实验基础。
  方法:
  1、细胞培养
  BV2细胞,是小鼠小胶质细胞系;HT-22细胞,小鼠海马神经元细胞系,由加拿大的David Schubert博士馈赠。BV2细胞和HT-22细胞均用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素双抗的高糖培养基培养在37℃、5%CO2的细胞培养箱内。
  2、细胞干预
  (1)采用100ng/ml LPS按时间曲线(0h、1h、3h、6h、12h、24h)处理BV2细胞。
  (2)使用浓度梯度的硫酸锌(10μM、15μM、30μM、50μM)处理BV2细胞24h和按时间曲线(0h、1h、3h、6h、12h、24h)分别使用10μM、30μM浓度的硫酸锌处理BV2细胞。
  (3)用10μM和30μM的硫酸锌预处理BV2细胞1h,然后用100ng/ml LPS处理不同时间(1h、3h、6h),将实验分为对照组、LPS组、10Zn+LPS组、30Zn+LPS组、10Zn组、30Zn组。
  3、共培养
  10μM和30μM的硫酸锌预处理1h,之后用100ng/ml LPS干预3h培养BV2细胞,然后取其上清液培养HT-22细胞24h。
  4、细胞转染
  当融合度为80%时,将BV2细胞接种于多孔培养板,用转染试剂与干扰RNA为2∶1的比例进行转染。将A20小干扰RNA以及转染试剂lipofctamine3000用Opti-MEM无血清培养基稀释后混匀,室温下孵育15min。每孔预先加入含10%FBS的培养基,再根据培养板规格加入适量的上述混合液。培养至24h和36h后进行后续实验并收集细胞检测。
  结果:
  1、LPS对BV2细胞CD11b表达的影响
  100ng/ml LPS处理BV2细胞不同时间,Western Blotting结果显示:与对照组比较,1h、3h、6h、12h和24h组CD11b蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。
  2、LPS对BV2细胞活性的影响
  100ng/ml LPS处理BV2细胞不同时间,CCK-8试剂盒检测结果显示:与对照组比较,1h、3h、6h、12h和24h组细胞活性均无明显差异(P>0.05)。
  3、LPS对BV2细胞ROS水平的影响
  100ng/ml LPS处理BV2细胞不同时间,与对照组相比,3h、6h、12h和24h组细胞ROS水平显著升高(P<0.01),1h组无明显变化(P>0.05)。
  4、LPS对BV2细胞炎症因子表达水平的影响
  RT-PCR实验结果表明:与对照组比较,1h和3h组TNF-α和IL-6mRNA表达水平均明显升高(P<0.05),6h组仅IL-6mRNA表达水平显著升高(P<0.01);ELISA结果显示,与对照组比较,3h、6h、12h和24h组TNF-α和IL-6的浓度均显著升高(P<0.01)。
  5、LPS对BV2细胞iNOS和COX2表达水平的影响
  RT-PCR结果发现,与对照组相比较,3h和6h组iNOS和COX2mRNA表达水平均明显上升(P<0.05);1h组仅COX2mRNA表达水平显著升高(P<0.01);蛋白分析结果显示:3h、6h和12h组iNOS和COX2表达水平均明显升高(P<0.05),1h组iNOS表达水平显著上升(P<0.01),24h组COX2表达水平显著上升(P<0.001)。
  6、锌对BV2细胞活性的影响
  不同浓度的硫酸锌分别干预BV2细胞24h,实验结果显示,与对照组相比,10μM、15μM、30μM和50μM组细胞活性无明显变化(P>0.05)。
  7、锌预处理对LPS诱导的BV2细胞中ROS水平的影响
  实验结果显示:与对照组比较,3h LPS组ROS水平显著升高(P<0.001),单独加硫酸锌组则无明显变化;与3h LPS组比较,10Zn+LPS和30Zn+LPS组ROS水平均明显降低(P<0.01)。
  8、锌预处理对LPS诱导BV2细胞中炎症因子表达水平的影响
  RT-PCR和ELISA结果显示:与对照组相比较,3hLPS组、10Zn+LPS组和30Zn+LPS组TNF-α和IL-6mRNA表达水平及浓度均显著升高(P<0.001),10Zn组和30Zn组均无明显变化;与3h LPS组比较,10Zn+LPS组和30Zn+LPS组TNF-α和IL-6mRNA表达水平及浓度均明显下降(P<0.05)。
  9、锌预处理对LPS诱导BV2细胞中iNOS和COX2表达水平的影响
  RT-PCR和Western blotting实验结果显示,与对照组比较,6h LPS组、10Zn+LPS组和30Zn+LPS组iNOS mRNA和蛋白表达水平均显著上升(P<0.05),单独加硫酸锌组无明显变化(P>0.05);与6hLPS组比较,10Zn+LPS组和30Zn+LPS组iNOS mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。与对照组比较,6hLPS组、10Zn+LPS组和30Zn+LPS组COX2mRNA表达水平均显著升高(P<0.001),COX2蛋白表达水平在6h LPS组显著升高(P<0.001);与6h LPS组比较,10Zn+LPS组和30Zn+LPS组COX2mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。
  10、锌对小胶质细胞激活介导的毒性对HT-22细胞活性的影响
  共培养后,CCK-8检测结果显示:与对照组比较,3h LPS组、10Zn+LPS组和30Zn+LPS组HT-22细胞活性明显下降(P<0.05),单独加硫酸锌组(10Zn和30Zn组)无明显变化;与3h LPS组比较,10Zn+LPS组和30Zn+LPS组HT-22细胞活性明显升高(P<0.05)。
  11、锌对BV2细胞中A20表达水平的影响
  10μM和30μM硫酸锌分别干预BV2细胞不同时间,RT-PCR实验结果显示:与对照组比较,3h组、6h组、12h组和24h组A20mRNA表达水平显著升高(P<0.01);在LPS诱导的BV2细胞中,Western blotting检测结果显示:与3h LPS组比较,10Zn+LPS组和30Zn+LPS组A20蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。
  12、锌对LPS诱导的BV2细胞中NF-κB信号通路的影响
  蛋白检测结果显示:1h LPS组的磷酸化IκBα表达水平较对照组显著升高(P<0.01);与1h LPS组比较,10Zn+LPS组和30Zn+LPS组的磷酸化IκBα表达水平明显下降(P<0.05)。与Con组比较,3h LPS组细胞核中磷酸化NF-κp65表达水平显著升高(P<0.01),而细胞质中NF-κB p65表达水平下降(P<0.01);而与3hLPS组比较,10Zn+LPS组和30Zn+LPS组的磷酸化NF-κB p65表达水平显著下降(P<0.01),相反,细胞质中NF-κB p65表达水平显著升高(P<0.001)。
  13、锌对A20干扰后BV2细胞中A20表达的影响
  RT-PCR和Western blotting实验结果显示:与NC组比较,干扰组A20mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.01),而加锌之后(即Si+10Zn组和Si+30Zn组),A20mRNA和蛋白表达水平均较干扰组明显升高(P<0.05)。在LPS刺激下,与Si+LPS组相比,Si+10Zn+LPS组和Si+30Zn+LPS组A20mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。
  14、锌对A20干扰后BV2细胞中NF-κB的影响
  Western blotting结果表明:与Si+LPS组比较,加锌组(Si+10Zn+LPS组和Si+30Zn+LPS组)细胞质中NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P<0.05),而细胞核中磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。
  结论:
  本研究通过LPS诱导BV2细胞产生炎症反应,观察锌预处理对BV2细胞氧化应激和炎症水平等方面的影响,并探讨锌抑制炎症反应的作用机制。根据实验结果初步得到如下结论:
  1、LPS可以诱导BV2细胞引起氧化应激和释放炎症介质。
  2、锌可以抑制LPS诱导的BV2细胞炎症反应,并且可能对BV2细胞激活引起的HT-22细胞损伤具有保护作用。
  3、锌可能通过上调A20而抑制NF-κB的激活,从而抑制小胶质细胞激活介导的炎症反应。
[硕士论文] 赵普远
外科学(神经外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:动脉瘤性蛛网膜下腔出血有着高发病率,高死亡率,高致残率的特点,本研究通过收集长海医院神经外科单中心的所有破裂囊性动脉瘤的数据分析其临床及影像学特征,为临床医生决策提供参考依据,指导临床实践。
  方法:该回顾性研究纳入了长海医院神经外科自2001年1月至2017年12月收治的1945例颅内囊性破裂动脉瘤导致的蛛网膜下腔出血患者,所有患者均接受全脑血管造影且临床及影像学数据资料完整。摘取年龄、性别、入院时Hunt-Hess分级、是否高血压、是否糖尿病、是否高脂血症、是否冠心病、是否合并脑供血动脉狭窄、是否有吸烟史、是否合并脑室内积血、动脉瘤的大小、部位、形态、动脉瘤的最大径、瘤颈、瘤高、横径、是否宽颈动脉瘤、是否多发动脉瘤等因素,应用单因素和多因素分析其临床及影像学特征。
  结果:本研究共1945例颅内囊性破裂动脉瘤患者,男性为859例,女性为1086例,男女比为1∶1.26。患者平均年龄为55.07±12.71岁,女性平均年龄56.83±12.60岁,男性平均年龄52.83±12.52岁。大于60岁或小于40岁的患者男女比例差异明显,分别为1∶1.92、1∶0.77。患者合并高血压960例(49%),糖尿病150例(7.7%),吸烟史96例(4.6%),高脂血症94例(4.8%),冠心病208例(10.7%),合并脑血管粥样硬化狭窄169例(8.7%)。307例患者动脉瘤破裂后合并脑室内积血,前交通动脉瘤合并脑室内积血例数最多。前循环合并脑室内积血共237例,后循环合并积血患者为70例,后循环动脉瘤破裂合并脑室内积血的机会更高。破裂动脉瘤最常见的五个部位分别是后交通动脉(26.17%),颈内动脉(24.42%),前交通动脉(21.85%),大脑中动脉(9.87%),基底动脉(3.75%)。右侧与左侧的比例为1∶1.82,前循环动脉瘤占所有破裂动脉瘤的88.79%。在后循环破裂动脉瘤中,破裂动脉瘤最常见的部位是基底动脉动脉瘤(33.49%),其次为椎动脉动脉瘤和大脑后动脉动脉瘤。破裂动脉瘤最大径的中位数4.8mm,平均大小5.93±4.26mm。小于5mm的动脉瘤为1051例,介于5到10mm之间的动脉瘤为695例,小于等于10mm的动脉瘤占全部动脉瘤的89.77%。基底动脉破裂动脉瘤最大径平均值最大(8.24±6.67mm),大脑前动脉破裂动脉瘤最大径平均值最小(4.20±2.34),后循环动脉瘤的最大径明显大于前循环动脉瘤最大径。本组宽颈动脉瘤共733例,男女比例为1∶1.08,男性患宽颈动脉瘤的机会更大。体颈比<1.5的破裂动脉瘤共1275例,男性(62.51%)与女性(67.96%)的比例之间有显著差异。高血压患者破裂动脉瘤最大径明显大于对照组,≤40岁的患者破裂动脉瘤最大径明显较>40岁患者动脉瘤的最大径更小。多发动脉瘤患者有518例,占总患者人数的26.63%,更常见于女性,平均年龄明显小于单发动脉瘤患者,且动脉瘤直径≤10mm时,多发动脉瘤的发生率更高。多因素分析结果显示,高脂血症(OR=4.786)、Size Ratio值(OR=1.234)是发生高级别aSAH的独立危险因素。
  结论:该单中心大样本研究客观反映了我中心收治的破裂动脉瘤患者的临床及影像学特征情况,基本上同国内外类似的大宗病例的研究结果一致,如发病年龄、性别差异、Hunt-Hess分级、常见部位、动脉瘤的大小分布、多发动脉瘤的比例及动脉瘤的形态等。但也有不同之处,如高血压患者动脉瘤的最大径明显大于非高血压患者,这与国外报道结果相反,其不同结果可能源自于种族差异。总体而言,该研究在我国人口破裂动脉瘤的流行病学及自然病史方面提供了较有价值的信息。
[博士论文] 田春鸥
外科学(神外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究的主要目的有二:1、研究外周血差异表达的lncRNAs作为急性脑梗死生物标志物的诊断价值;2、研究神经细胞中差异表达的lncRNAs调控缺血损伤后凋亡的机制。
  本研究涉及的主要技术方法有:外周全血及贴壁细胞总RNA的抽提,lncRNAs芯片,生物信息学分析技术,定量PCR,贴壁细胞培养、传代与OGD模型建立,贴壁细胞转染siRNAs,CCK8细胞活力检测,TUNEL细胞凋亡检测,流式细胞术,Western blotting(蛋白质免疫印迹实验),医学统计学。
  第一部分 急性脑梗死后循环血lncRNAs的芯片差异表达谱及生物信息学分析
  目的:建立急性脑梗死患者与健康志愿者的外周全血lncRNAs与mRNAs差异表达谱,分析差异表达的lncRNAs涉及的功能、通路及转录因子。
  方法:分别采集6例急性脑梗死患者及3例健康志愿者的外周全血,以PAXgene Blood miRNA Kit提取总RNA,按Agilent Human lncRNA Microarray4*180K V5芯片的标准流程进行质控、标记、杂交、扫描、原始信号提取、数据标准化。将p≤0.05,倍数改变值≥2.0者定义为差异lncRNAs。取倍数改变值排在前400位的lncRNAs与芯片的完整mRNAs数据库进行共表达分析,然后进行功能预测、通路预测及其与转录因子的关联分析。
  结果:1、脑梗死患者与健康志愿者对比共检测出差异mRNAs1990种,其中上调的有1468种,下调的有522种;共检测出差异lncRNAs5686种,其中上调的有4641种,下调的有1045种。2、GO分析显示与急性脑梗死差异lncRNAs相关的mRNAs主要涉及NF-κB转录因子活性的负调控、程序性细胞死亡的正调控等生物功能。3、基于KEGG数据库的Pathway分析显示与急性脑梗死差异lncRNAs相关的mRNAs主要涉及凋亡、神经营养因子信号通路等。4、与急性脑梗死的差异lncRNAs相关的mRNAs主要涉及PBX3、STAT1等转录因子。
  结论:芯片检测可以揭示急性脑梗死的独特全血lncRNAs表达谱,其探针的阈值可以胜任全血lncRNAs的检测。其差异mRNAs和lncRNAs以上调者居多。后续的GO分析显示异常表达的lncRNAs涉及NF-κB转录因子活性的负调控、程序性细胞死亡的正调控等功能,Pathway分析显示他们与凋亡有密切关系。转录因子关联分析的数据可以促进lncRNAs转录调节的研究。
  第二部分 循环血lncRNAs早期诊断急性脑梗死的价值及其与分型、预后的关系
  目的:1、以定量PCR验证芯片全血lncRNAs差异表达谱的可靠性;2、进一步探讨lncRNAs标志物是否是急性脑梗死的独立诊断因子;3、研究lncRNAs标志物对急性脑梗死的诊断准确性;4、研究lncRNAs标志物的表达与脑梗死分型及预后的关系。
  方法:1、选择芯片全血lncRNAs芯片差异表达谱的部分lncRNAs,以另外39名急性脑梗死患者及39名健康志愿者的标本以定量PCR检测其表达差异;2、以二分类logistic回归分析来研究差异lncRNAs与脑梗死状态的相关性;3、使用ROC曲线来判断候选lncRNAs标志物对急性脑梗死的诊断准确性;4、比较候选lncRNAs标志物的表达水平在不同OCSP分型的脑梗死患者与健康志愿者之间的差异,比较候选lncRNAs在3个月随访的MRS高评分组与低评分组之间的差异。
  结果:1、从芯片差异谱中挑选9种lncRNAs以定量PCR验证其差异,其中6种lncRNAs在芯片中是表达增高的;3种在芯片中是表达降低的。定量PCR的结果显示脑梗死患者的这9种lncRNAs的表达全部都是增高的,其中NR_120420和lnc-GCH1-2∶3有统计差异,其余7种lncRNAs无统计差异;2、对所有的临床特征、NR_120420及lnc-GCH1-2∶3的表达水平进行logistic回归分析,NR_120420、年龄及高脂血症进入回归模型,lnc-GCH1-2∶3未进入回归模型,NR_120420有统计学意义;3、NR_120420诊断完全前循环型(TACI)脑梗死的AUC是0.861,灵敏度和特异度分别是85.7%和84.6%,lnc-GCH1-2∶3诊断TACI型脑梗死的AUC是0.802,灵敏度和特异度分别是85.7%和特异度82.1%;4、TACI型脑梗死患者的NR_120420及lnc-GCH1-2∶3表达水平较健康志愿者显著升高,预后不佳组(MRS3-6)的NR_120420及lnc-GCH1-2∶3表达水平较预后良好组(MRS0-2)显著升高。
  结论:定量PCR与芯片的结果总体变化趋势一致,NR_120420和lnc-GCH1-2∶3在脑梗死患者与健康志愿者之间的表达有显著差异。Logistic回归分析显示NR_120420可作为急性脑梗死的独立诊断因子。这两种lncRNAs用于诊断脑梗死都具有较高的灵敏度和特异度,二者在外周全血中的表达与脑梗死患者的OCSP分型及预后有相关性。
  第三部分 lncRNA NR_120420促进神经细胞缺血损伤后凋亡的机制
  目的:1、检测来自第二部分研究的两种lncRNAs在神经细胞的OGD模型中是否发生相应变化,同时选择具体的造模方式及工具siRNAs;2、研究两种目标lncRNAs是否调控本模型的凋亡;3、研究敲低目标lncRNAs后模型中靶因子的变化;4、证实敲低目标lncRNAs后模型凋亡的变化与靶因子的变化是否存在因果关系。
  方法:1、分别以OGD0、4、8、12h及OGD4、8、12h后再灌注24h这7种方式处理SH-SY5Y细胞后,以定量PCR检测目标lncRNAs的变化,分别以设计的6种siRNAs转染细胞后以定量PCR检测相应lncRNAs的变化;2、对细胞转染敲低效率合格的4种siRNAs后,给予OGD8h建立细胞模型,再分别以CCK8法检测细胞活力,以TUNEL法及流式细胞术(AnnexinⅤ-FITC/PI)检测细胞的凋亡;3、敲低本模型中的NR_120420后分别以western检测p-P65、P65、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT在蛋白水平的变化;4、对细胞转染siNR_120420后分别以不加与加PDTC两种方式处理细胞模型后,再分别检测细胞的活力及凋亡。
  结果:1、两种目标lncRNAs在本细胞系中经OGD处理后均会表达升高,二者均是在OGD8h后表达最高,然后随OGD时间延长其表达再逐渐下降。二者在OGD4h及8h后的表达都有统计差异。6种siRNAs中siNR_120420Ⅰ、siNR_120420Ⅲ、siGCH1-2∶3Ⅰ及siGCH1-2∶3Ⅱ的敲低效率达到60%以上,后续选择这四种siRNAs作为敲低目标lncRNAs的工具siRNAs;2、本细胞系造模后细胞活力降低,TUNEL阳性细胞比例增高,流式凋亡细胞比例增高,提示造模在功能层面上是成功的。敲低NR_120420会升高本模型的细胞活力,会降低TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例;敲低lnc-GCH1-2∶3对本模型的细胞活力、TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例无明显影响;3、敲低NR_120420后本模型中的P65、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的蛋白表达无明显变化,p-P65的蛋白表达显著降低;4、转染siNR120420Ⅰ和siNR_120420Ⅲ会升高本模型的细胞活力,会降低TUNEL阳性细胞比例及流式凋亡细胞比例,而PDTC可以取消上述作用。
  结论:本部分研究选择了较合理可靠的研究设计和lncRNAs干预工具,NR_120420与lnc-GCH1-2∶3均会在本模型中发生显著变化,但只有敲低NR_120420对本模型的凋亡有抑制作用。NR_120420对脑梗死模型是起损害作用的。敲低NR_120420后本模型中NF-κB(p-P65)的蛋白水平会发生显著降低,NF-κB抑制剂可以取消NR_120420对本模型中凋亡的调控作用。
  小结:芯片检测可以揭示急性脑梗死的独特全血lncRNAs表达谱,后续的GO分析和Pathway分析显示异常表达的lncRNAs涉及凋亡与NF-κB活性。NR_120420和lnc-GCH1-2∶3在脑梗死患者与健康志愿者之间的表达有显著差异,其中NR_120420可作为急性脑梗死的独立诊断因子。这两种lncRNAs用于诊断脑梗死都具有较高的灵敏度和特异度,二者在外周全血中的表达水平与脑梗死OCSP分型及预后有相关性。NR_120420与lnc-GCH1-2∶3均会在神经细胞OGD模型中发生显著变化,但只有敲低NR_120420对本模型的凋亡有抑制作用。敲低NR_120420后本模型中NF-κB(p-P65)的蛋白水平会发生显著降低,NF-κB抑制剂可以取消NR_120420对本模型中凋亡的调控作用。本研究筛选出了两种具有较高诊断价值的脑梗死潜在lncRNAs生物标志物,初步阐明了NR_120420在神经细胞缺血损伤后促进凋亡的具体机制,有望提高我国急性脑梗死的诊治水平。
[博士论文] 王晓晴
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景与目的:
  脑卒中是全球致死率和致残率最高的三大疾病之一,其中87%是脑梗死。对于急性脑梗死,目前唯一被FDA批准的药物治疗手段是早期溶栓。但溶栓时间窗限制相对严格,95%以上的患者无法在发病时间窗内到达医院进行溶栓治疗。我国已经慢慢步入老龄化社会,脑卒中致死率、致残率逐年升高,并且严重降低了患者的生存质量、平均寿命,给国民经济带来沉重的负担。因此,科研人员探索新的、能够覆盖更多患者的缺血性脑卒中治疗策略具有极其重要的现实意义。近几年,涌现出许多神经干细胞在脑卒中治疗领域的机制研究,这为解决脑卒中这一世界性难题提供了新的思路和方法。在急性脑卒中的研究中,神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)对于微血管内皮细胞的保护作用尚不明确。脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs)不仅是脑微血管腔的内衬细胞,更能分泌活性因子来影响神经元的功能状态。BMECs的损伤是急性脑梗死后缺血再灌注损伤的基本动因。由于缺血再灌注损伤,BMECs发生水肿,暴露皮下胶原。最终,导致白细胞、血小板粘附,微血栓形成;同时BMECs的线粒体受损,被强烈激活进行氧化活动,产生大量氧自由基,加重脑组织损伤。然而,目前在神经干细胞治疗脑梗死的研究中,多数研究聚焦于受损神经组织的修复,而对于脑梗死后缺血再灌注损伤中,NSCs对BMECs的保护作用尚不清楚。为此,本研究就NSCs修复缺血再灌注损伤BMECs的机制进行了一系列实验探索。本研究证实了NSCs可以通过直接接触的方式保护缺血再灌注损伤的内皮细胞。在实验中,我们成功分离和培养了NSCs和BMECs;为了进一步模拟缺血再灌注损伤中脑微血管内皮细胞所处的病理生理条件,我们建立了NSCs和BMECs的共培养模型;并证实了NSCs能与BMECs形成隧道纳米管(Tunneling nanotubes,TNTs),这是一种只在哺乳动物细胞间形成的桥连,是一种细胞间的特殊连接方式,主要由a-微管蛋白和丝状肌动蛋白聚合构成,可进行长距离的线粒体转运。TNT是由表层的细胞膜和内部的细胞骨架构成,其长度和直径可在较大范围内波动,不同类型的细胞和不同的培养条件可能会造成程度上的差异。TNT可以介导了细胞间的物质运输和信号交流,凭借其较宽口径以及相对较长的长度,在转运分子量较大的物质甚至细胞器上拥有得天独厚的优势。
  (1)在该研究中鉴定发现了BMECs和NSCs之间TNT的形成,以及MSEC基因对TNTs形成的促进作用、诺考达唑(Nocodazole,微管蛋白解聚剂)对TNTs的抑制作用。(2)因TNT缺少特异性标记物,将NSCs添加MSEC或Nocodazole预处理来影响TNT形成,对MCAO模型进行预处理干细胞移植治疗。检测主要氧化应激因子SOD、H2O2、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px和MDA表达的变化;分析预处理因素在线粒体凋亡信号通路和对MCAO模型病理学、功能学上的作用差异。本研究主要通过离体实验、在体实验探究NSCs的脑卒中治疗作用新机制,为干细胞疗法进一步造福人类提供一定的理论依据。
  实验方法:
  细胞实验部分
  (1)原代分离培养神经干细胞、脑微血管内皮细胞;
  (2)Nestin抗体鉴定原代培养的神经干细胞、Ⅷ因子抗体鉴定分离出来脑微血管内皮细胞;
  (3)构建了神经干细胞、脑微血管内皮细胞共培养模型;
  (4)对脑微血管内皮细胞进行CFSE标记;
  (5)对神经干细胞进行线粒体mitotracker示踪;
  (6)构建MSEC慢病毒;
  (7)对神经干细胞进行MSEC转染或Nocodazole预处理;
  (8)抽提预处理各组神经干细胞普通RNA,PCR检测ki-67表达水平;
  (9)激光共聚焦显微镜观察TNTs形成;
  动物实验部分
  (1)MCAO模型建立;准备MSEC慢病毒感染、Nocodazole预处理神经干细胞、空病毒转染神经干细胞和PBS预处理神经干细胞作为对照组;
  (2)对MCAO模型进行神经干细胞移植;
  (3)作冰冻切片染色,对移植细胞进行示踪;电镜观察血脑屏障附近结构;
  (4)TTC染色明确脑梗模型建立,并比较脑梗塞面积;
  (5)尼氏体染色,观察神经干细胞移植后脑组织形态学改变,并计数神经元;
  (6)对各组MCAO模型鼠进行mNSS行为功能学评分;
  (7)检测动物模型中氧化应激相关因子表达变化;
  (8)Western Blot检测对MCAO模型干预后,线粒体凋亡通路上的关键分子Bcl-2、Bax和Cyt-c的表达。
  结果:
  (1)原代培养的BMECsⅧ因子抗原阳性,NSCs Nestin抗原阳性。证明细胞分离成功;
  (2)结果证明BMECs、NSCs共培体系中存在有TNTs形成;
  (3)过表达MSEC基因可以促进TNT形成,Nocodazole预处理NSCs抑制细胞间TNT形成;
  (4)MSEC过表达病毒转染和Nocodazole预处理操作不影响NSCs的增殖活性;
  (5)构建小鼠MCAO模型,TTC染色显示单侧脑梗塞病灶形成;
  (6)尼氏体染色、神经功能学mNSS评分结果显示:MSEC过表达促进神经干细胞对MCAO保护作用;Nocodazol预处理削弱神经干细胞对MCAO保护作用;
  (7)western blot检测结果显示:MSEC预处理神经干细胞上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax和通路下游分子Cyt-c的表达;Nocodazole预处理结果则相反;
  (8)总体上,MSEC预处理神经干细胞能促进抗氧化因素的作用,抑制H2O2、ROS、MDA等氧化因素;采用Nocodazole预处理神经干细胞得到相反的结果。
  结论:
  在本研究中,我们成功构建BMECs和NSCs共培养模型,验证发现了BMECs和NSCs之间TNTs的形成。MSEC基因对TNTs形成有促进作用、Nocodazole预处理神经干细胞会阻碍TNTs形成。TNT缺少特异性标记物,在细胞密度高的脑组织内难以直接观察。NSCs添加MSEC或Nocodazole预处理后,对MCAO模型进行移植治疗时,TNT促进因素MSEC预处理神经干细胞更能削弱细胞的线粒体凋亡、减弱氧化应激反应;TNT抑制因素Nocodazole预处理结果则相反。
[硕士论文] 王诺
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 大脑中动脉粥样硬化斑块稳定性高分辨率磁共振管壁成像研究
  目的:应用高分辨率磁共振(HR-MRI)管壁成像技术研究大脑中动脉(MCA)粥样硬化斑块稳定性的影像学特征,探讨HR-MRI在诊断颅内动脉粥样硬化性疾病中的价值。
  方法:收集2015年1月~2016年12月间海军军医大学第一附属长海医院住院期间因MCA粥样硬化狭窄进行HR-MRI管壁成像检查的连续病例,根据MCA支配区域是否发生急性脑缺血症状分为症状组和无症状组。所有患者均行3D-TOF MRA和HR-MRI管壁T1WI、T2WI、STIR和T1WI增强序列扫描,分析管腔狭窄程度和斑块影像学特征。
  结果:116例MCA粥样硬化患者分为症状组80例,无症状组36例,3D TOF MRA显示症状组大脑中动脉重度狭窄和闭塞比例为65%,明显高于无症状组(36.11%,P=0.009)。症状组环形斑块31例(38.75%),弧形斑块49例(61.25%);无症状组环形斑块6例(16.67%),弧形斑块30例(83.33%),症状组患者环形斑块比率明显高于无症状组(P=0.019)。症状组斑块明显强化58例(72.5%),轻度强化15例(18.75%),无强化7例(8.75%);无症状组明显强化1例(2.78%),轻度强化20例(55.56%),无强化15例(41.67%),统计分析显示症状组斑块明显强化比率显著高于无症状组(P<0.001),无症状组斑块无强化或轻度强化比率明显高于症状组(均P<0.001)。但是,症状组和无症状组斑块信号类型在T1WI、T2WI和STIR上差异无统计学意义(均P>0.05)。
  结论:HR-MRI可以清晰显示MCA粥样硬化斑块形态,症状性MCA斑块以环形多见,斑块明显强化,非症状性MCA斑块以弧形为主,斑块多无强化或轻中度强化,两组斑块信号在各序列无明显差异。
  第二部分 脑桥梗死高分辨率磁共振基底动脉管壁成像研究
  目的:应用高分辨率磁共振(HR-MRI)管壁成像技术研究基底动脉粥样硬化在不同类型脑桥梗死中的作用。
  方法:收集2014年6月至2017年6月期间海军军医大学第一附属长海医院收治的急性孤立性脑桥梗死行3.0T HR-MRI基底动脉管壁成像检查患者,脑桥梗死分为脑桥旁中央梗死(PPI)和深部小梗死(SDPI)。所有患者均行3D-TOF MRA和HR-MRI管壁T1WI、T2WI和T1WI增强序列扫描,对比研究PPI和SDPI患者基底动脉是否存在斑块及斑块特征。
  结果:55例急性脑桥梗死患者入组,其中PPI组患者37例,SDPI组患者18例。3D TOFMRA显示PPI组和SDPI组基底动脉狭窄50%以上分别为21例(58.8%)和7例(38.9%),两组无统计学差异(P=0.214)。PPI组16例基底动脉狭窄小于50%,其中14例(87.5%) HR-MRI检测出基底动脉斑块形成,为分支动脉粥样硬化病(BAD),明显高于SDPI组(27.3%),两组差异具有统计学意义(P=0.001),BAD斑块强化分别占PPI组和SDPI组中35.1%和5.6%,两组比较具有统计学意义(P=0.018)。
  结论:HR-MRI基底动脉管壁成像研究显示动脉粥样硬化是PPI和SDPI的常见原因,BAD不稳定斑块常见于PPI,而SDPI中少见。
[硕士论文] 王浩伟
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  疼痛是临床上最常见的症状之一,一般认为疼痛感觉是一种生存机制,可作为正在或即将发生的组织损伤的一种警告信号。但是,慢性疼痛已经超出其作为预警的作用,变得持久和具有毁灭性,现在已经被认为是一种临床病症。目前,遭受疼痛困扰的人数已经超过心脏病、癌症和糖尿病人数的总和,这其中,神经病理性疼痛又是导致慢性疼痛的主要病因。神经病理性疼痛发病机制复杂,目前临床方面也缺乏特异性和有效的治疗药物。因此,深入研究其发生发展机制对于研发新的治疗药物,改善临床治疗效果有重要意义。
  BK通道在多种细胞中广泛表达,分布于上皮细胞、平滑肌、骨骼肌、感觉神经元等部位,参与多种生理过程包括调控腺体分泌、神经元兴奋,神经递质释放等,还参与多种疾病的病理性过程如神经病理性疼痛。BK通道是大电导Ca2+激活的K+通道,BK通道电流在细胞复极化相和细胞兴奋性中起重要作用。通道开放时,钾离子外流,表现为膜电位的超极化;反之、通道活性降低或通道关闭会导致钾离子外流减少,膜电位表现为去极化。因此表达于神经元的BK通道可能通过调控神经元的兴奋性以及调节神经递质的释放在创伤后的急性疼痛向慢性神经病理性疼痛的转化过程中发挥重要的作用。深入研究神经病理性疼痛发生发展过程中BK通道的基因表达变化和通道蛋白功能的变化不仅有助于阐明神经病理性疼痛发生发展的机制,还可能为阻断急性痛向慢性痛的转化以及疼痛相关治疗药物的研究提供新颖、高效的方案。
  本研究拟通过大鼠行为学检测及单细胞测序技术和电生理技术研究脊神经结扎导致神经病理性疼痛发生过程中BK通道的变化,从而深入探索BK通道在神经病理性疼痛中的作用机制。
  方法:
  应用Wistar大鼠,L5-L6脊神经结扎(spinal nerve ligation,SNL)制备神经病理性疼痛的动物模型,利用Von Frey纤维测痛针检测手术后机械性刺激诱发痛的阈值变化。在术后的不同时间点通过手术取出脊神经结扎后的神经节,利用酶解消化的方法的到背根神经节(Dorsal Root Ganglion,DRG)单个神经元。使用micropipette挑取单细胞并转移到配置好的裂解液中,构建单细胞测序文库。通过检测不同时间点DRG神经元基因表达的变化,得到随着时间的进展,参与神经病理性疼痛发生过程的相关基因。由于离子通道在伤害性感受的形成和传导中发挥重要作用,因此进一步分析编码离子通道基因的表达变化。数据分析发现BK通道基因在手术后神经病理性疼痛的进展过程中表达量发生了显著变化。进一步使用离体单细胞电生理记录的方法检测不同时间点上BK通道电流的变化,从而完成对通道功能的验证。本研究通过行为学检测、单细胞测序和电生理实验证明了BK通道参与神经病理性疼痛的发生发展过程并对其作用机制进行了深入具体的研究。
  结果:
  (1)SNL术后大鼠机械性刺激痛阈值在术后1天即有明显降低,术后3-5天基本稳定,并维持到术后21天甚至更久。
  (2)通过对挑取的DRG单细胞直径测量并经统计分析发现,根据细胞直径的不同可将DRG中的细胞分为三大类,分别为小细胞(d<25um)、中细胞(25um<d<35um)和大细胞(>35um),这为下一步开展单细胞测序实验挑取不同种类的单细胞提供依据。
  (3)单细胞测序结果显示,DRG的小细胞中BK通道α亚基编码基因(kcnma1)在术后3天表达值显著降低;β2亚基编码基因(kcnmb2)在术后1天即有明显降低,在术后3天保持较低水平;β4亚基编码基因(kcnmb4)在术后3天表达值上升,在术后5天保持在增高水平。DRG中等大小细胞中α亚基编码基因(kcnma1)在术后3天表达值显著降低,术后5天进一步降低到最低值;β2亚基编码基因(kcnmb2)在术后1天同样有明显降低,在术后3天保持较低水平;β4亚基编码基因(kcnmb4)表达值则在术后3天上升,术后5天上升到最高水平。而大细胞中α亚基和β亚基基因表达的变化则主要体现在手术后的14天和21天。单细胞测序结果显示了BK通道基因变化情况,结果与行为学检测的变化趋势相一致,提示SNL术后BK通道参与了神经病理性疼痛的发生发展过程并在痛觉敏化的形成中发挥了重要作用。
  (4)基因表达变化是否最终能影响到大体行为学还需要进行蛋白功能的检测,因此,利用电生理的方法对BK通道的电流情况进行分析。发现脊神经结扎术后BK通道电流随时间进展发生变化,具体表现为中小神经元中BK通道电流特征和失活模式发生改变。在术后第3天,BK通道的峰值电流显著降低,这一结果表明BK通道的α亚基在病理性疼痛的进展中发生了变化,其表达量降低。通过对失活的时间常数进行分析,发现手术后BK通道电流失活减慢,通道电流失活的慢时相和快时相的时间常数在小细胞和中细胞均增加,表明疼痛进展过程中β调节亚基类型和数目发生了变化。α亚基和β亚基的这些变化可导致细胞内钾离子外流减少,从而表现为一定程度的去极化,这可能参与了神经病理性疼痛中痛觉敏化的形成。
  结论:
  (1)单细胞测序结果表明神经损伤后第3天基因表达量发生显著性变化,是疼痛由急性向慢性转化的关键时间节点。
  (2)神经病理性疼痛进展过程中BK通道基因表达发生变化,α亚基表达降低,β2调节亚基表达降低,β4调节亚基表达增加。
  (3)BK通道电流的峰值和失活常数在神经损伤后发生改变,SNL术后第3天BK通道的峰电流显著降低,这与α亚基基因变化相一致。同时,通道电流失活的慢时相和快时相的时间常数均增加,这与β调节亚基变化相关。电流的改变可导致细胞内钾离子含量增加,可能导致细胞兴奋性提高,从而表现出神经病理性疼痛症状。
[博士论文] 邵柏棕
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:现今,炎症相关疾病的发病率逐年增加,严重危害人类的健康,其中,动脉粥样硬化和多发性硬化尤为显著。动脉粥样硬化已成为现代社会危害人类健康的杀手之一,可以继发心肌缺血、心肌梗死、血栓形成,甚至由于血栓脱落引起急性心血管事件的发生。动脉粥样硬化在病理上大体可分为四期,分别为脂质条纹期、纤维斑块期、粥样斑块期及晚期继发改变期,泡沫细胞的形成是粥样斑块形成的病理基础。现在普遍认为,泡沫细胞主要来源于聚集于动脉内膜下的巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞,其中更多的泡沫细胞来源于巨噬细胞,其形成过程主要为血液中的单核细胞聚集于内膜受损动脉的内膜下转变为巨噬细胞,巨噬细胞吞噬异常聚集于血管壁内膜下层的氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoproteins,oxLDL)及其它修饰的脂蛋白,进而转变成为泡沫细胞。多发性硬化是一种炎症相关的神经退行性变,多发生在青少年,是致畸致残的主要疾病。目前认为,多发性硬化的主要病因是中枢神经系统的慢性炎症,其中,小胶质细胞作为中枢神经系统中的巨噬细胞发挥着重要的作用。因此,抑制小胶质细胞介导的炎症免疫反应在多发性硬化的防治工作中尤为关键。尽管已有很多研究探讨动脉粥样硬化和多发性硬化的防治,然而,两者发生发展的机制尚未阐明,有效的疾病防治手段仍需探索。β-arrestin-1蛋白属于β-arrestins蛋白家族,是一种多功能的胞浆调节蛋白。传统认为,其主要功能是参与G蛋白偶联受体的调节作用,主要使G蛋白偶联受体发生内吞或脱敏;然而,近年来的研究表明,β-arrestin-1可以作为支架蛋白参与多种G蛋白偶联受体依赖或非依赖的信号通路。已有报道指出,β-arrestin-1在多种疾病中发挥重要作用。在动脉粥样硬化中,已有研究表明,血管平滑肌中的β-arrestin-1可以通过抑制内皮下平滑肌的增殖、迁移进而降低斑块的新生内膜增生,从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而,巨噬细胞中的β-arrestin-1在动脉粥样硬化中的作用及其机制尚无文献报道。此外,在多发性硬化中,敲除β-arrestin-1的小鼠其发生多发性硬化(EAE)的疾病严重程度显著降低,说明了β-arrestin-1在多发性硬化中的作用,然而,巨噬细胞(小胶质细胞)中的β-arrestin-1作用及其具体机制尚未明确。本课题对巨噬细胞中的β-arrestin-1在动脉粥样硬化和多发性硬化中的作用及其机制进行研究,主要分为三个部分:第一部分实验中,探究了巨噬细胞β-arrestin-1在动脉粥样硬化中的保护作用,这种保护作用的实现有自噬过程的参与;第二部分实验中,发现巨噬细胞β-arrestin-1参与了α7nAChR介导的抗动脉粥样硬化作用;第三部分实验中,探讨巨噬细胞β-arrestin-1参与调控了α7nAChR的抗多发性硬化作用。
  (一)巨噬细胞β-arrestin-1通过自噬发挥抗动脉粥样硬化作用
  自噬是机体重要的代谢机制,主要降解细胞内的长程蛋白、折叠错误的蛋白和受损细胞器,其功能的实现依赖于溶酶体。已有报道,自噬在多种疾病的发生发展中发挥重要的作用。在动脉粥样硬化中,诱导自噬有利于缓解粥样斑块巨噬细胞的炎症及免疫反应,并通过抗凋亡、增加胆固醇流出发挥抗动脉粥样硬化的作用。对于β-arrestin-1与自噬的关系,教研室的前期研究表明,神经元中β-arrestin-1可以诱导自噬水平的增加,从而保护神经元。然而,在动脉粥样硬化中尚无相关报道。在这一部分中,旨在探讨巨噬细胞β-arrestin-1抗动脉粥样硬化的自噬机制。该部分实验的具体结果简述如下:
  (1)检测发生动脉粥样硬化时斑块巨噬细胞β-arrestin-1的表达
  通过Western blot检测正常小鼠与动脉粥样硬化疾病模型小鼠主动脉中的β-arrestins表达,发现与正常小鼠相比,疾病模型小鼠主动脉中的β-arrestin-1水平显著增高。进一步通过组织免疫荧光技术检测发现斑块巨噬细胞中有β-arrestin-1蛋白的高表达。
  (2)构建髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除的动脉粥样硬化小鼠模型
  通过Cre-LoxP系统构建髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠,并通过骨髓移植的方法构建ApoE-/-背景下的髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠,继以喂以高脂饮食4个月造成动脉粥样硬化小鼠模型。
  (3)巨噬细胞β-arrestin-1的抗动脉粥样硬化作用
  通过油红O染色、免疫组织化学染色、Masson染色及天狼星红染色检测发现,发生动脉粥样硬化时,与野生型小鼠相比,髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的主动脉斑块面积显著增加,主动脉斑块的稳定性下降,进一步检测血脂水平,发现髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的总胆固醇及低密度脂蛋白水平增加,高密度脂蛋白水平下降。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1通过自噬机制的参与发挥抗动脉粥样硬化的作用。
  (二)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用
  α7n型乙酰胆碱能受体(α7nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)是一种n型乙酰胆碱能受体亚型。近年来研究表明,α7nAChR通过胆碱能抗炎通路发挥抗炎作用。α7nAChR在多种疾病中发挥作用,其中在动脉粥样硬化中,广泛认为,激动α7nAChR具有抗动脉粥样硬化的作用,然而,其具体分子机制仍不明确。在这一部分实验中,旨在探讨巨噬细胞β-arrestin-1是否参与介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用。取得的具体结果简述如下:
  (1)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用
  通过油红O染色、免疫组织化学染色、Masson染色及天狼星红染色检测发现,发生动脉粥样硬化时,激动α7nAChR可以显著降低小鼠的主动脉斑块面积,增加主动脉斑块的稳定性,而髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除很大程度上降低这种效果;进一步检测血脂水平,发现激动α7nAChR可以显著降低总胆固醇及低密度脂蛋白水平,而巨噬细胞特异性β-arrestin-1敲除很大程度上抑制这一效果。
  (2)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗泡沫细胞形成作用
  在小鼠巨噬细胞上通过油红O染色及细胞水平胆固醇检测,发现激动α7nAChR可以显著降低泡沫细胞的形成比例,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。进一步通过Real-time PCR检测发现,激动α7nAChR可以显著提高与胆固醇流出呈正相关的ABCA1及ABCG1载体的表达水平,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。
  (3)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抑制巨噬细胞迁移作用
  通过Transwell细胞迁移实验检测巨噬细胞的迁移水平,发现激动α7nAChR显著降低巨噬细胞的迁移水平,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1通过介导α7nAChR的保护作用发挥抗动脉粥样硬化的作用。
  (三)巨噬细胞β-arrestin-1调控α7nAChR的抗多发性硬化作用
  激动α7nAChR在多发性硬化中发挥重要的抑制作用,主要是通过其介导的胆碱能抗炎通路抑制中枢神经系统中小胶质细胞引起的炎症反应。然而,其具体分子机制仍不明确。在这一部分实验中,旨在探讨巨噬细胞(小胶质细胞)β-arrestin-1是否参与调控α7nAChR的抗多发性硬化作用。取得的具体结果简述如下:
  (1)检测发生多发性硬化时脊髓中小胶质细胞β-arrestin-1的表达变化
  通过Real-time PCR技术、Western blot技术和免疫组织荧光技术检测发现,发生EAE时,脊髓和脊髓小胶质细胞中β-arrestin-1蛋白水平显著提高。
  (2)LPS/ATP刺激的BV2细胞中β-arrestin-1蛋白调节激动α7nAChR的抗炎作用
  通过Western blot技术检测发现,在LPS/ATP刺激下的BV2细胞中,应用PNU282987激动α7nAChR显著抑制了NLRP3炎性小体的激活,而过表达β-arrestin-1蛋白极大地抑制了激动α7nAChR的这一作用。
  (3)LPS/ATP刺激的BV2细胞中激动α7nAChR抑制β-arrestin-1蛋白与NLRP3蛋白的结合
  通过细胞免疫荧光技术和免疫共沉淀技术检测发现,在BV2细胞中,LPS/ATP刺激显著增加了β-arrestin-1和NLRP3蛋白的结合,而应用PNU282987激动α7nAChR显著降低了β-arrestin-1和NLRP3蛋白的结合水平。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1负向调控α7nAChR介导的抗多发性硬化作用。
[硕士论文] 梁萌
神经病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着影像技术的快速发展,影像学评估在颅内血管狭窄引起的缺血性卒中诊疗中的应用越来越广泛,其在疾病的鉴别诊断、治疗方式选择、疗效判定及风险评估等方面的作用日益突出,影像技术的每一次革新都必将引起临床诊疗观念的改变与发展。传统的血管成像技术主要是指血管腔成像技术,包括数字减影血管造影(DSA)、计算机断层扫描血管成像(CTA)和磁共振血管成像(MRA)。其中,DSA作为最经典的血管成像技术,能够清晰的显示出血管的狭窄程度及侧支循环状态,被认为是判断血管狭窄的“金标准”。但是由于其潜在的放射性损害、造影剂损伤、感染及血管损伤风险,其临床应用受到了一定的限制。相比于DSA,CTA凭借其扫描快、损伤小、图像失真少的特点在缺血性卒中血管评估中得到了广泛的应用。但是,其仍然存在放射性损害及引起造影剂损伤的风险。与上述两种影像技术不同,MRA具有创伤小且无放射性损害的优势,但其扫描时间较长,对病人的选择性较高且成像结果易受干扰。综上所述,尽管存在着各自的优势及缺点,以上三种影像技术均可提供良好的管腔影像。然而,对病变血管的组织学研究发现,相同程度的狭窄可能源自于完全不同病因或不同程度的管壁病变。因此,除了单纯评价管腔狭窄程度以外,对管壁病变的评估显得更加重要。近年来,利用高分辨磁共振(HR-MRI)“黑血”技术进行的血管壁成像技术,凭借其对管壁的清晰显示,已成为缺血性卒中诊断及风险评估的重要手段。
  本研究旨在对颅内血管病变的一些影像特点及其临床意义进行初步探讨和分析。
  第一部分:新生血管与孤立性大脑中动脉狭窄/闭塞所致青年缺血性卒中预后的相关性研究
  目的:
  新生血管形成是脑血管狭窄/闭塞病变中常见的影像学征象。本研究旨在探讨由孤立性大脑中动脉狭窄/闭塞所致的青年缺血性卒中患者中,新生血管与卒中预后之间的相关性。
  方法:
  我们回顾性分析了2006年1月至2016年6月于我中心住院的93例青年(年龄≤45岁)缺血性卒中患者的数字减影血管造影(DSA)图像、临床及预后资料。所有患者均被诊断为孤立性大脑中动脉(MCA)狭窄/闭塞,新生血管(NVF)被定义为后前位DSA图像上出现于狭窄/闭塞的MCA周围的异常血管。分析影响新生血管形成的因素以及新生血管与卒中功能结局及复发之间的相关性,对新生血管的临床意义进行探讨。
  结果:
  MCA中度狭窄(50%~70%)患者的NVF发生率为0,MCA重度狭窄(70%~99%)患者的NVF为15.8%而MCA闭塞(100%)患者的NVF为53.7%。NVF发生与MCA狭窄的严重程度相关(r=0.467,P<0.001)。与无NVF的患者相比,存在NVF的患者表现出90天的结局不良比例较高的趋势(6.2%比21.4%,p=0.061)。Logistic回归分析显示,NVF与90天不良结局相关[比值比(OR)=4.159,95%置信区间(CI)=(1.072,16.137), P=0.039]。
  结论:
  本研究发现,在诊断为孤立性MCA狭窄/闭塞的青年缺血性卒中患者中,NVF是患者早期结局不良的预测因素。
  第二部分:有症状颅内动脉粥样硬化性狭窄患者斑块增强的临床意义:高分辨率磁共振成像研究
  目的:
  高分辨率磁共振成像(high-resolution magnetic renounce imaging,HRMRI)已被广泛应用于观察和评估颅内动脉粥样硬化病变。本研究旨在利用高分辨磁共振管壁成像技术,探讨有症状颅内动脉粥样硬化性狭窄患者斑块强化的临床意义。
  方法:
  本研究前瞻性纳入了73例于2016年7月至2017年11月期间因急性缺血性卒中/短暂性脑缺血发作在南京总医院神经内科住院治疗的患者,所有患者均存在经血管造影证实的颅内动脉狭窄,对所有患者行HRMR检查。检查序列包括弥散加权成像(DWI)、时间飞跃法磁共振血管造影(TOF-MRA)、平扫和增强的血管横断面四反转恢复序列T1加权成像(qir-T1WI)以及平扫和增强的T1WI Cube序列。73例患者中,37例确诊为动脉粥样硬化病变。根据斑块是否强化将患者分为两组,分析两组间人口学资料、危险因素、实验室检查及斑块的影像学特征,从而发现斑块增强的影响因素。根据DWI结果将患者分为缺血性卒中组和TIA组,分析得出斑块强化与梗塞之间的关系。
  结果:
  与斑块未强化患者相比,斑块强化患者的白细胞水平更高(7.50±2.30 vs5.80±1.00,p=0.018)、血管重度狭窄占比更高[轻度0例、中度3例(13.6%)、重度19例(86.4%) vs轻度3例(23.1%)、中度3例(23.1%)、重度7例(53.8%),p=0.040],而吸烟者占比较少[3例(13.6%) vs6例(46.2%),p=0.050]。与TIA患者相比,斑块强化在缺血性卒中患者中占比较高[15(71.4%) vs7(50%),p=0.288],但两组之间无明显统计学差异。
  结论:
  本研究发现,在症状性颅内动脉粥样硬化患者中,病变血管的狭窄程度及患者的白细胞水平与斑块强化有关。同时,本研究也发现,斑块强化与症状性颅内动脉粥样硬化患者是否发生梗塞无明显相关性。
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