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[博士论文] 孔琳
眼科学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)是一种多发于热带及亚热带地区的感染性角膜病变,发病率极高,且有极高的致盲率。尤其是在发展中国家,FK为最常见的致盲性眼病之一,其发病率在各种严重感染性角膜病变中甚至可以居于首位。
  FK的病因多种多样,在发达国家,该病最常见的诱因为佩戴角膜接触镜;而在发展中国家,该病的主要诱因则是角膜外伤,尤其是植物性角膜外伤。在世界范围内,FK的致病真菌有七十余种,其中最常见的是镰刀菌属真菌和曲霉菌属真菌。临床数据表明,与其它真菌引起的角膜炎相比,曲霉菌性角膜炎具有诊断率低、药物治疗效果差、手术治疗需求率高、预后不良和复发率高等特点,已成为目前临床上最为棘手的FK之一。因此,本研究选用烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus, A.fumigatus)构建FK的动物模型并进行相关研究,这具有重要的理论价值和临床意义。
  FK病情进展迅速且预后相对不良,因此必须进行及时的诊断和有效的治疗,否则就有可能出现前房积脓、角膜穿孔、恶性青光眼或真菌性眼内炎等症状,甚至导致失明乃至眼球摘除的后果。目前的相关研究已经表明,在FK的过程中,机体的免疫功能是抵抗真菌感染的重要因素。因此,想要研究FK,就需要深入探究疾病发生发展过程中角膜的免疫防御体系。
  角膜由外向内依次分五层结构,角膜上皮细胞(cornal epithelial cell,CEC)因为居于角膜的最表面,因而成为了角膜抵挡病原微生物入侵的第一重生物学防线。病原微生物侵犯角膜组织时,CEC可以通过其上的Toll样受体(Toll likereceptors, TLRs)和NOD样受体(NOD like receptors,NLRs)等重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原微生物表面的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs),从而启动下游的免疫反应,发挥抵抗病原微生物入侵的作用。我们的前期研究已经表明,在A.fumigatus性角膜炎发生发展的过程中,CEC表面上的TLR2和TLR4受体可以接受A.fumigatus的刺激并对它们进行识别,激活核转录因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)并启动NF-κB下游的信号通路,释放白细胞介素(interleukin,IL)-6,IL-8,IL-10,IL-1β和TNF-α等细胞因子以及hBD2和LL37等抗菌肽,并通过与NOD1和NOD2的交互作用参与免疫反应。
  本研究的结果表明,在角膜A.fumigatus感染的过程中,TSLP促进DCs聚集、活化、成熟和迁移;成熟的DCs分泌Th2细胞趋化因子,促进促炎因子和Th2细胞因子的分泌,诱导Th2型炎症反应。这有助于我们深入了解FK过程中获得性免疫反应的机理,为防治FK提供了新的理论基础和思考方向,具有重要的理论意义和临床价值。
  本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 烟曲霉菌角膜感染介导DCs诱导Th2型炎症反应的实验研究
  目的:
  研究A.fumigatus角膜炎中,树突状细胞(dendritic cells,DCs)参与免疫反应并诱导Th2型炎症反应的过程。
  方法:
  1.用针头在野生型C57BL/6(B6)小鼠的角膜中央划出三道长度为1mm的划痕,用A.fumigatus菌液感染小鼠,将封口膜修剪成适合的角膜接触镜,置于小鼠角膜表面,并缝合小鼠眼睑,24小时后取出接触镜。在感染后0.5d,1d,3d,5d和7d于裂隙灯下观察感染情况,并进行临床评分,PBS处理的小鼠作为阴性对照组,未经处理的小鼠作为空白对照组;
  2.PCR检测感染不同时期小鼠角膜DCs的表达,PCR和Western blot检测感染不同时期小鼠角膜CD11c+DCs的成熟情况,免疫荧光检测感染不同时期小鼠角膜DCs的聚集、迁移和成熟,以及成熟DCs的迁移;
  3.PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测感染不同时期小鼠角膜DCs分泌的Th2细胞趋化因子TARC和MDC的表达情况,PCR和ELISA检测感染不同时期小鼠角膜促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达情况,并进行统计学分析。
  结果:
  随着感染的进行,角膜溃疡逐渐加重,而后逐渐减轻并形成瘢痕愈合。在感染的过程中,DCs聚集、成熟,由基底膜向角膜上皮层迁移,同时由角膜缘向角膜中心迁移,并于感染早期分泌TARC和MDC,于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达。
  结论:
  在A.fumigatus角膜炎的过程中,角膜中的DCs聚集,逐渐成熟并迁移,表达OX40L激活CD4+T细胞,分泌TARC和MDC发挥Th2趋化作用,并于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达,诱导Th2型炎症反应。
  第二部分 烟曲霉菌角膜感染介导TSLP活化DCs诱导Th2型炎症反应的实验研究
  目的:
  研究A.fumigatus角膜炎中,TSLP对DCs参与的免疫反应及其诱导的Th2型炎症反应的影响。
  方法:
  1.野生型C57BL/6(B6)小鼠结膜下注射TSLP小干扰RNA(TSLP siRNA),乱序小干扰RNA,人重组TSLP蛋白(rTSLP)和IgG预处理。用针头在小鼠的角膜中央划出三道长度为1mm的划痕,用A.fumigatus菌液感染小鼠,将封口膜修剪成适合的角膜接触镜,置于小鼠角膜表面,缝合小鼠眼睑,并于感染后1d拆除缝线,于裂隙灯下观察感染情况,并进行临床评分,普通感染的小鼠作为对照组;
  2.PCR和Western blot检测不同处理组中小鼠角膜成熟DCs的表达情况,免疫荧光检测不同处理组中小鼠角膜成熟DCs水平迁移和垂直迁移情况;
  3.PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜DCs分泌的Th2细胞趋化因子TARC和MDC的表达情况,PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达情况,PCR和ELISA检测不同处理组中小鼠角膜Th1细胞因子IFN-γ和Th17细胞因子IL-17的表达情况,并进行统计学分析。
  结果:
  与普通感染组小鼠相比,TSLP siRNA组中TSLP的表达显著下降,rTSLP组中TSLP的表达显著增加。TSLP siRNA组中小鼠角膜炎症情况显著减轻,rTSLP组中小鼠角膜炎症情况显著加重。
  TSLP siRNA组中TSLPR和OX40L的表达显著下降,rTSLP组中TSLPR和OX40L的表达显著增加。TSLP siRNA组中,成熟DCs的数量减少,迁移速率减慢,在角膜缘、角膜中间区和角膜中央区的数量均减少;rTSLP组中,成熟DCs的数量增加,迁移速率加快,在角膜缘、角膜中间区和角膜中央区的数量均增加。
  TSLP siRNA组中TARC和MDC的表达显著下降,rTSLP组中TARC和MDC的表达显著增加。TSLP siRNA组中TNF-α,IL-4,IL-5和IL-13的表达显著下降,rTSLP组中TNF-α,IL-4,IL-5和IL-13的表达显著增加。TSLP的变化对IFN-γ和IL-17表达没有显著影响。
  结论:
  在A.fumigatus角膜炎的过程中,TSLP促进角膜中的DCs聚集,促进DCs表达OX40L成熟并迁移,促进DCs分泌TARC和MDC发挥Th2趋化作用,并于感染中晚期诱导促炎因子TNF-α和Th2细胞因子IL-4,IL-5和IL-13的表达,诱导Th2型炎症反应。
[博士论文] 郭颖卓
眼科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:适当控制角膜上皮的伤口愈合对角膜健康至关重要,涉及到细胞增殖、迁移、锚定和分化。透明质酸钠(SH)已被证实对角膜伤口愈合具有积极的药理学作用,但具体机制尚未阐明。在此基础上,我们拟采用体外细胞实验来探讨miRNA在SH刺激角膜上皮伤口愈合中的作用和机制。
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 参与调节透明质酸钠促进角膜上皮伤口愈合的miRNA表达谱测定
  目的:
  分析SH处理后人角膜上皮细胞(HCECs)中miRNA的差异表达。
  方法:
  细胞分两组:对照组常规培养在KGM-2中,实验组培养基加入0.6mg/ml SH。提取RNA,微阵列分析miRNA差异表达,定义log2FC≥1.5或≤-1.5,adjP<0.05。RT-qPCR验证差异表达最明显的miRNA。
  结果:
  SH组miR-18a、 miR-92表达显著下调,miR-210、miR-26b和miR-378表达上调,miR-18a差异表达最明显。RT-qPCR示miR-18a下调最显著,miR-92紧随其后。
  结论:
  miR-18a在SH处理的HCECs中显著下调,可能为关键miRNA。
  第二部分 miR-18a表达失调对HCECs生物学特性的影响
  目的:
  分析miR-18a上调或下调对HCECs生物学特性的影响。
  方法:
  脂质体转染HCECs,分三组:miR-18a mimics、miR-18a antagomir组和Scrambled对照组。转染后24h、48h、72h,RT-qPCR检测miR-18a的表达。MTT法检测波长570nm的吸光度值。
  结果:
  RT-qPCR示,与Scrambled组相比,miR-18a在mimics组显著上调,在antagomir组显著下调,表达差异随时间推移逐渐缩小。MTT法示antagomir组HCECs细胞活力高于Scrambled对照组,mimics组细胞活力显著低于Scrambled组,表达差异随时间推移逐渐减小。
  结论:
  miR-18a失表达影响HCECs生物学特性,可确定为SH促进HCECs增殖的效应器。
  第三部分 miR-18a靶向CTGF调节透明质酸钠促进角膜上皮伤口愈合
  目的:
  预测miR-18a的可能靶基因并进行验证;分析靶基因是否对SH处理HCECs进行调控。
  方法:
  TargetScan与通路富集分析预测miR-18的靶基因。细胞转染分四组:miR-18amimics、antagomir、Scrambled Control和SH+Scrambled组,Western blot、RT-qPCR检测miR-18a失表达对靶基因的影响。双荧光素酶报告分析miR-18a对靶基因的转录水平影响。脂质体转染技术沉默SH处理HCECs中的靶基因,RT-qPCR、Western blot检测沉默效率,MTT法检测靶基因沉默对SH处理HCECs增殖的影响。Transwell migration和划痕实验检测靶基因沉默对SH处理HCECs迁移的影响。
  结果:
  miR-18a预测靶基因富集于Arf6下游通路,预测为CTGF。mRNA和蛋白质水平上,miR-18a高表达/低表达分别抑制/增强HCECs中CTGF的表达,SH+Scrambled组CTGF表达显著高于Scrambled组。双荧光素酶报告证明miR-18a与CTGF3'UTR结合。与Scrambled组相比, SH处理HCECs在CTGF沉默后24h、48h、72h细胞生长速率显著降低,24h划痕愈合程度、细胞迁移距离显著低下。
  结论:
  CTGF是miR-18a的靶基因。miR-18a对CTGF具有抑制作用。miR-18a靶向CTGF,在SH促进角膜上皮伤口愈合中发挥始动作用。
[博士论文] 孙鹏
眼科学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:角膜疾病是全球主要的致盲性眼病,其中角膜内皮功能障碍会导致严重的不可逆的视力损害。目前唯一的解决方法是角膜移植。然而,由于世界范围内的供体角膜缺乏,很多角膜盲患者不能得到及时有效的治疗。在我国,每年有超过30万的患者等待角膜移植,但是因为角膜供体远远不能满足需要,仅有约1%的患者能够得到手术治疗。
  近几十年来,再生医学(regenerative medicine)和组织工程学(tissueengineering)有了长足发展和深入研究。将培养的角膜细胞接种于生物支架材料上从而构建与天然角膜具有相似结构和功能的角膜替代物已经不再是构想。传统的依赖于供体的角膜移植将被创新而有效的方法取代。但无论是全层角膜移植或者角膜内皮移植,作为构建组织工程角膜的关键成分之一,足够数量的功能性种子细胞是必不可少的。人角膜内皮细胞(Human corneal endothelial cells,HCEC)是目前最理想的种子细胞,但其来源极其有限,体内不能再生,损伤后只能靠邻近细胞扩大和延伸来修复损伤,原代培养的人角膜内皮细胞增殖能力弱,体外经数次传代后不能维持其正常的细胞形态和功能,从而限制了其临床应用。近年来,将其他组织来源的干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞成为研究的热点,通过不懈的努力和探索,我们已经创建了体外角膜内皮样细胞分化的诱导方法,其中包括神经嵴细胞、胚胎干细胞等。但这些诱导的角膜内皮样细胞从形态到功能都与人角膜内皮细胞有不同程度的差距。因此,我们把焦点重新回归到促进人角膜内皮细胞的增殖等能力上。
  眼眶脂肪干细胞(Orbital adipose-derived stem cell,OASCs)来源于神经外胚层的神经嵴细胞,与许多其他干细胞一样,具有强大的增殖能力和多谱系分化潜能。OASCs在保持干细胞特性的同时可以被数次传代培养,另外,角膜内皮细胞同样来源于神经嵴细胞。我们假设眼眶脂肪干细胞能够在保持角膜内皮细胞表型的同时促进其增殖和功能。并且,眼眶脂肪组织相对容易获得,可以提供足够数量的干细胞。本课题组分离并培养人眼眶脂肪干细胞(hOASCs),制备眼眶脂肪干细胞条件培养基,利用该条件培养基培养并扩增人角膜内皮细胞。体外实验结果表明,本研究培养的人角膜内皮细胞具有类似于体内的多边形状,显示较强的增殖能力,多次传代后依然表达角膜内皮细胞相关标志物。动物体内实验结果表明,人角膜内皮细胞能够在短期内使角膜内皮失代偿的动物角膜恢复透明及正常厚度,具有细胞替代治疗及干细胞治疗的潜力。
  研究目的:
  1.培养并利用人的眼眶脂肪干细胞制备条件培养基;
  2.探讨应用眼眶脂肪干细胞条件培养基能否促进人角膜内皮细胞的增殖和修复能力;
  3.进一步检测培养的人角膜内皮细胞体内的细胞治疗能力,利用动物实验评估其用于治疗角膜内皮失代偿的效果。
  研究方法:
  第一部分 制备人眼眶脂肪干细胞源性条件培养基
  1.提取、培养人眼眶脂肪干细胞:
  用PBS反复冲洗眼眶脂肪组织,剪碎,37℃下将脂肪组织置于胶原酶消化,分散的组织重新悬浮于DMEM,室温下5分钟,再经70μm滤网过滤。经洗涤、离心后,将细胞重悬,均匀接种在培养瓶内,置于37℃、5%CO2条件下培养。应用流式细胞术以及免疫荧光染色检测细胞的相关标记物。
  2.制备条件培养基:
  培养人眼眶脂肪干细胞,吸除原培养基,无菌PBS轻轻漂洗1-2次,将刚刚配制并过滤的脂肪干细胞培养基加入到细胞中继续培养,吸出并收集培养细胞的上层液体,0.22um滤器过滤,-80℃保存备用。
  第二部分 条件培养基促进人角膜内皮细胞增殖和功能的体外实验研究
  1.分离、培养人角膜内皮细胞:
  M199冲洗角膜,剥离后弹力层(含HCECs),然后使用胶原酶消化、离心,重悬细胞,将细胞悬液接种于12孔板的1孔中(预先包被FNC)。用提前制备好的条件培养基培养细胞。基础培养基由opti-MEM-I,8%胎牛血清,5 ng/mL人表皮生长因子(hEGF),20μg/mL维生素C、200 mg/L氯化钙、0.08%硫酸软骨素和青霉素-链霉素等组成。
  2.检测人角膜内皮细胞的增殖及细胞修复能力:
  聚合酶链式反应、蛋白质印迹、免疫荧光等检测培养的人角膜内皮细胞相关标志物。应用细胞增殖检测试剂盒、划痕实验等检测人角膜内皮细胞的增殖及修复能力。
  第三部分 人角膜内皮细胞修复能力的体内检测
  1.建立动物(新西兰大白兔、恒河猴)角膜内皮失代偿模型:
  动物行全身麻醉,眼局部表面麻醉,仰卧于手术台,开睑器开眼睑,做角巩膜缘隧道切口,粘弹剂注入前房,用改良后的冲洗针头仔细将角膜内皮细胞自后弹力层面刮除,然后进行充分的前房冲洗,使角膜内皮细胞全部脱离前房。
  2.将培养的人角膜内皮细胞进行体内移植:
  提前用CFSE标记人角膜内皮细胞。将角膜内皮细胞从实验动物的角膜后弹力层刮除,制作角膜内皮失代偿模型,抽取适量房水,然后用胰岛素针将标记的人角膜内皮细胞注射入前房内,结膜下及球周注射激素类药物,在全身麻醉下保持术眼向下的体位5小时。
  3.术后观察:
  术后应用裂隙灯、前节OCT、共聚焦角膜显微镜等评估角膜、前房等情况,并对角膜行组织学等检查。其中,恒河猴实验组进行了长期(大于一年)的术后观察,并进行前房角镜、眼底照相及B超等检查房角、眼底及眼球等情况。
  研究结果:
  第一部分 制备人眼眶脂肪干细胞源性条件培养基
  本研究中培养的人眼眶脂肪干细胞为贴壁细胞,形状为梭形、成纤维细胞样。流式细胞术检测显示,OASCs高度表达CD29、CD105、CD49e、CD166,提示其内皮细胞和干细胞的起源。免疫荧光染色显示,人眼眶脂肪干细胞高度表达波形蛋白。培养的人眼眶脂肪干细胞在10代之前形态及表型相似。
  第二部分 条件培养基促进人角膜内皮细胞增殖和功能的体外实验研究
  本研究体外培养的人角膜内皮细胞表达N-Cadherin、Na+/K+ ATPase、Zo-1、 Co18a2和SLC4A4等相关内皮细胞标志物,可传10代以上并保持较强的增殖能力,体外实验结果显示其具有较强的细胞修复能力。在条件培养基的影响下,人角膜内皮细胞被赋予了类似于干细胞样的特性。
  第三部分 人角膜内皮细胞修复能力的体内检测
  1.新西兰大白兔动物细胞移植实验及组织学检查:
  细胞移植术后裂隙灯及前节OCT等检查显示,人角膜内皮细胞在7天左右成功使角膜恢复透明,中央角膜厚度也较对照组明显变薄,同时也可见前房内渗出等反应。共聚焦角膜显微镜和茜素红染色证实在后弹力层上覆盖着多边形细胞。组织学检查:荧光显微镜检查可见CFSE标记的HCECs;角膜组织HE染色显示,细胞呈单层排列并紧密贴附在后弹力层之上。
  2.恒河猴细胞移植实验及组织学检查:
  裂隙灯显微镜和前节OCT显示,在细胞注射后7天左右角膜恢复透明,中央角膜厚度也明显变薄,排斥反应如角膜后沉着物(KP)和前房渗出在细胞注射后第10至14天出现,但经过术后处理可基本恢复正常。至术后一个月,细胞移植实验组的角膜变得更透明、厚度更薄,类似于正常天然猴角膜。术后眼压(IOP)与正常对照之间无差异。共聚焦角膜显微镜和茜素红染色证实在后弹力层上覆盖着多边形细胞。术后2个月组织学检查:荧光显微镜检查可见CFSE阳性的HCECs。免疫荧光染色检查结果显示,后弹力层上的细胞表达Na+/K+ATP酶和ZO-1。角膜组织HE染色显示,细胞呈单层紧密贴附在后弹力层之上。
  3.恒河猴长期观察(一年以上):
  细胞移植实验组的角膜始终保持透明,厚度正常,使用前房角镜、眼底照相及B超等进行检查,与正常眼比较均未见异常改变。
  研究结论:
  1.体外培养的人眼眶脂肪干细胞增殖能强,表达神经嵴细胞、干细胞等相关标志物。
  2.人眼眶脂肪干细胞源性条件培养基能够有效的体外扩增人角膜内皮细胞,并使其维持较强的细胞修复能力。
  3.在动物实验中,通过体内移植的方式,培养的人角膜内皮细胞可以修复内皮细胞受损的角膜,使角膜重新恢复透明。本研究课题发现眼眶脂肪干细胞源性条件培养基不仅能提高人角膜内皮细胞的增殖能力,而且对维持其功能特性也有明显效果,可以为进一步探索人角膜内皮细胞生物学特性、细胞及干细胞治疗提供来源和基础。
[博士论文] 黄国强
眼科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:紫外线辐射(ultraviolet radiation,UVR)可引起急性损伤如日晒伤和慢性累积性损伤如光老化及皮肤癌,对人类健康存在潜在威胁,越来越引起人们的关注。角膜对高强度UVB(ultraviolet radiation B)所致损伤异常敏感,并可产生多种角膜病变,如翼状胬肉、气候性滴状角膜营养变性、急性电光性角膜炎(雪盲)、角膜上皮内瘤形成等其他眼病。富组蛋白1(Histatin1,Hst1)在唾液中普遍存在,主要作用为抗菌及抗真菌。已有研究提示该蛋白对某些非口腔细胞如人表皮细胞、人成纤维细胞等同样具有活化功能。本研究拟探讨Hst1对紫外线致人角膜上皮细胞光损伤的保护作用研究并初步分析其可能的作用机制。
  方法:通过不同辐射时间的UVB对人角膜上皮细胞(HCEC)进行光化学损伤,建立紫外线致HCEC光损伤细胞模型,并经不同浓度Hst1处理(10μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)。通过阿尔玛蓝测定不同浓度Hst1处理下HCEC的增殖情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HCEC细胞SOD及MDA含量,MTT法检测HCEC存活率情况,通过流式细胞仪检测HCEC凋亡情况。荧光定量PCR技术检测HCEC中IGF-1、Bcl-2和Bax相对表达量,免疫印迹分析(Western Blot)检测HCEC中IGF-1、Bcl-2和Bax的表达水平。
  结果:研究发现紫外线辐射显著诱导HCEC凋亡,且紫外线处理2小时后细胞凋亡的百分率为31%,显著高于对照组细胞。紫外线辐射显著抑制HCEC存活率,紫外线辐射2小时后HCEC的存活率约为70%,显著低于对照组。选取紫外线辐射时间2小时,辐射量为0.144J/cm2,作为紫外线诱导的光损伤细胞模型的最佳剂量。采用三种浓度的(10μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)Hst1处理HCEC,发现Hst1蛋白显著抑制HCEC凋亡并提高HCEC增殖能力,降低SOD表达水平,提高MDA含量,且50μg/ml Hst1为最佳作用浓度。Hst1处理提高HCEC中IGF-1及Bcl-2相对表达量,而Bax基因表达水平明显下降。同时,Hst1处理引起HCEC中IGF-1,Bcl-2和Bax蛋白水平发生相应改变。
  结论:结果表明Hst1对紫外线诱导的HCEC光损伤具有一定的保护作用,作用机制可能是通过改善角膜上皮创伤愈合进程,是治疗紫外线光损伤的潜在的治疗因子。本研究首次发现Hst1可保护HCEC经紫外线诱导的光损伤作用,对角膜紫外线损伤防护的药物开发提供一定的参考价值。
[硕士论文] 王君喆
眼科学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着近视患者的增多,临床对屈光手术的需求也越来越大,其中LASIK(Laser in situ keratomileusis),即准分子激光原位角膜磨镶术,由于具有预测性强、精确度高及安全有效等优点而被广泛地应用于屈光不正的矫正中,并且由于其主要操作是在角膜层间进行、完整保留了角膜表层组织,从而减少了角膜上皮增生等原因可能引起的角膜浑浊,具有术后角膜透明度好及恢复快等优势。但同时,目前也有不少文献对LASIK相关并发症做了报道,其中,术后角膜膨隆是严重影响患者视功能的术后并发症之一,主要表现为角膜中央向前锥形突起、角膜曲率进行性增大和框架眼镜难以完全矫正的进行性视力减退等,是威胁患者术后视觉质量的巨大忧患,目前尚缺乏安全有效的针对性治疗。本文应用角膜交联术(corneal collagen crosslinking CXL)与准分子激光治疗性角膜切削术(phototherapeutic keratectomy PTK)、准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy PRK)联合对LASIK术后角膜膨隆进行治疗,分析评价该联合疗法的有效性和安全性,旨在延缓术后角膜膨隆病情进展的同时对患眼进行屈光重建,从而最大程度地改善患者的视觉质量。
  目的:
  将角膜交联技术与PTK、PRK等屈光技术联合应用于LASIK术后角膜膨隆的治疗中,评价该方法的临床治疗效果及安全性。
  方法:
  本研究为前瞻性自身对照研究。研究对象包括14名LASIK术后角膜膨隆患者(16只眼),对全部患眼行PTK+PRK+CXL联合治疗,记录术前及术后1、3、6个月的裸眼视力(uncorrected visual acuity UCVA)、最佳矫正视力(bestcorrected visual acuity BCVA)、角膜前表面最大曲率(Kmax)值、中央角膜厚度(central corneal thickness CCT)和角膜内皮细胞计数(endothelial cell density ECD)。
  术前与术后各检测值用Wilcoxon符号秩和检验进行统计分析。采用的统计软件为SPSS20.0统计软件。
  结果:
  1.术后1、3、6个月的UCVA分别较术前均有明显的提高(P<0.01):16只患眼术前的UCVA(logMAR)为0.61±0.25,术后1、3、6个月的UCVA(logMAR)分别为0.10±0.12、0.09±0.16和0.04±0.15;
  2.术后3个月和术后6个月Kmax值与术前相比均显著降低(P<0.05):术前角膜Kmax值为49.14±4.86D,术后1、3、6个月分别为47.89±5.31D、44.08±4.88D和43.41±4.37D;
  3.术后3、6个月的角膜厚度与术前相比均有显著差异(P<0.01):具体数值分别为401.25±32.44、394.00±28.12。
  4.术后1、3、6个月的内皮细胞计数与BCVA和术前相比,差异无统计学意义。
  结论:
  PTK+PRK+CXL治疗LASIK术后角膜膨隆后UCVA显著提高、Kmax显著降低,角膜内皮计数变化无统计学意义,说明此联合疗法安全有效。
[硕士论文] 杨筱斐
眼科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨光学区大小对准分子激光原位磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)治疗近视后早期角膜高阶像差的影响。
  方法:前瞻性病例研究。将接受LASIK治疗的近视患者181例(343眼)分为高、中、低度近视组,每组根据激光切削光学区直径不同(6.00mm、6.25mm、6.50mm)分为Ⅰ~Ⅲ亚组。术前、术后1月利用Pentacam眼前节分析系统测量角膜的高阶像差。用spss22.0统计系统分析手术前后各组内不同亚组的总高阶像差、水平彗差、垂直彗差、球差的差异性。
  结果:术前在所有近视组中,各个亚组之间角膜高阶像差的差异性无统计学意义(P>0.05)。术后1月,在低度近视组中,所有亚组间角膜的总高阶像差、水平彗差、垂直彗差、球差的差异性无统计学意义(P>0.05)。中度近视组内各亚组间角膜总高阶像差、球差有统计学意义(P<0.05)。高度近视组中,所有亚组间角膜的总高阶像差、水平彗差、垂直彗差、球差的差异性均有统计学意义(P<0.05),其中较大光学区组低于较小光学区组。
  结论:光学区大小的选择对于LASIK治疗近视后角膜高阶像差是存在干扰的。对于较大的光学区来说,能够降低术后角膜总高阶像差、球差,尤其在治疗高度近视时效果明显,这种影响随矫正近视度数的增加而更明显。
[硕士论文] 杨欣
眼科学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过制备中重度真菌性角膜炎动物模型,探讨结膜瓣角膜全覆盖对治疗中重度真菌性角膜炎的疗效。
  方法:选用2-3kg不限雌雄的成年日本大耳白兔37只,按照完全随机设计分为模型组a组(n=35只),模型对照组b组(n=2只);均将右眼作为实验眼;用麦氏浊度仪调整黄曲霉菌浓度至108集落形成单位(colony forming unit,CUF),一个麦氏浊度单位(1号管)等于3*108CUF/ml。预实验接种方法采用层间注射法,正式实验选用角膜层间注射法联合角膜划痕法进行造模;将一个麦氏浊度单位再稀释3倍,用BD一次性使用无菌胰岛素注射器在右眼10点钟方位瞳孔旁中心基质层给予1U浓度为1*108CUF/ml的黄曲霉菌(1U=0.01ml)菌液。再用15°侧切刀片刮除右眼角膜中央直径约3-4mm范围的上皮组织,针头在角膜表面做井字划痕,深度约至浅基质层,将含黄曲霉菌菌丝液滴在角膜表面,术毕球结膜下注射1万单位庆大霉素注射液(0.5ml),对照组b组(n=2只)右眼作为对照眼除层间注射等量生理盐水及不涂抹真菌菌落外,其余过程同实验组。48小时后裂隙灯检查,随访观察待模型建造成功后行10%KOH涂片并乳酸酚棉蓝染色、真菌培养进一步进行实验确认。制备浓度为2.0%的伏立康唑液(瑞辉制药有限公司)[1],选用符合标准的动物模型,均等分为A、B、C三组各11只并加以标记以及实验对照组D组(n=2只)。A组给予2.0%结膜下注射伏立康唑0.5ml,B组给予结膜瓣角膜全覆盖,C组给予结膜瓣角膜全覆盖联合结膜下注射2.0%伏立康唑0.5ml的干预,实验对照D组(2只)给予等量生理盐水进行干预。给药频率:7天前1次/天,7天后1次/2天,14天后1次/3天。干预后在裂隙灯显微镜下观察角膜溃疡的愈合情况,连续观察3个月了解愈合及有无复发情况。采用spss17.0统计软件进行统计学分析,定量数据采用均数±标准差分析,定量资料采用单样本t检验及方差分析(ANOVA)进行组间分析,定量资料组间两两比较用SNK法分析,定性资料组间比较采用卡方检验,P<0.05差异有统计学意义。
  结果:预实验结膜瓣角膜全覆盖最终结果均为结膜瓣对合处缝线松脱,结膜瓣对合不良且分离,角膜上皮光滑,角膜水肿。正式实验使用层间注射联合角膜划痕法能成功建立模拟真菌性角膜炎结果,模型a组:其中2只为轻度真菌性角膜炎,其中15只为中度真菌性角膜溃疡以及18只属于重度真菌性角膜溃疡。模型对照b组:无感染。排除不适合本实验入选标准的2只兔子,造模成功率为94.29%。经过对真菌性角膜炎三种不同的干预方式后得出:经过比较A组(伏立康唑)、B组(结膜瓣覆盖术)以及C组(伏立康唑+结膜瓣覆盖术)后得出,C组愈合时间最短与A、B组比较有统计学意义(p<0.05),A组效率高于B组差异具有统计学意义。
  结论:结膜瓣角膜覆盖法并不适用于无浅层角膜损伤的真菌性角膜炎。使用层间注射联合角膜划痕法能成功建立模拟真菌性角膜炎的动物模型,成功率较高。三种不同的干预方法中,伏立康唑联合结膜瓣角膜全覆盖治疗真菌性角膜炎的总有效率最高,达到治愈时间最短;单纯伏立康唑的有效率明显优于单纯结膜瓣角膜全覆盖。
[硕士论文] 程璞
眼科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:建立大鼠棘阿米巴角膜炎动物模型,研究抗阿米巴药物联合多西环素对棘阿米巴角膜炎中基质金属蛋白酶-8(MMP-8)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。
  方法:1.将60只健康SD大鼠随机分为3组,每组20只。空白对照组不予任何处理;条件对照组刮除大鼠右眼角膜中央上皮层,取制备好的无菌接触镜覆盖术眼角膜,将PBS液注入镜片与角膜层间;实验组刮除大鼠右眼角膜中央上皮层,取黏附有棘阿米巴的接触镜覆盖术眼角膜,并将棘阿米巴悬液注入镜片与角膜层间,无菌睑裂缝合24小时后拆线并移除接触镜,分别于术后第1、3、5、7、10天各时间点,角膜刮片镜检、棘阿米巴原虫培养及取材行病理切片检查。2.将64只健康SD大鼠随机分为4组,每组16只。刮除大鼠右眼角膜中央上皮层,手术对照组取制备好的无菌接触镜覆盖术眼角膜,将PBS液注入镜片与角膜层间;模型组、洗必泰组和治疗组取黏附有棘阿米巴的接触镜覆盖术眼角膜,并将棘阿米巴悬液注入镜片与角膜层间,无菌睑裂缝合24小时后拆线并移除接触镜。洗必泰组予0.02%醋酸洗必泰点眼,治疗组予0.02%醋酸洗必泰联合0.02%多西环素眼液点眼,手术对照组、模型组大鼠均予以眼液溶媒点眼。分别于术后第3、5、7、10天,裂隙灯下观察大鼠角膜溃疡的情况,计算炎症指数;角膜取材行病理切片检查及炎症细胞计数;荧光定量PCR法检测角膜组织中MMP-8及MCP-1的表达。
  结果:1.经角膜病灶处刮片镜检、培养及病理切片检查证实了实验组大鼠右眼均感染上棘阿米巴角膜炎;角膜病理切片HE染色显示,感染眼第1天即出现炎症细胞的浸润,于第3天、5天呈上升趋势,随时间的推移,第7天、10天逐渐下降。2.大鼠棘阿米巴角膜炎模型建立后,模型组第3天炎症指数为2.33±0.27,第5天为2.92±0.17,第7天为2.75±0.17,第10天为2.33±0.27;洗必泰组第3天炎症指数为1.92±0.17,第5天为2.59±0.17,第7天为2.50±0.20,第10天为2.17±0.19;治疗组第3天炎症指数为1.42±0.17,第5天为2.25±0.17,第7天为2.08±0.17,第10天为1.84±0.19;术后第3天、5天、7天时,治疗组与洗必泰组的炎症指数相比显著降低(均为P<0.05),差异有统计学意义。模型组术后第3天炎症细胞计数为158.00±6.60;第5天为177.75±6.85,第7天为139.50±8.96,第10天为42.00±4.97;洗必泰组术后第3天炎症细胞计数为138.25±7.97;第5天为151.25±5.80,第7天为108.25±11.09,第10天为39.50±3.42;治疗组术后第3天炎症细胞计数为120.25±6.55;第5天为127.75±7.63,第7天为86.25±5.38,第10天为29.50±8.96;术后第3天、5天、7天时,治疗组炎症细胞计数少于洗必泰组(均为P<0.05),差异有统计学意义。荧光定量PCR法检测模型组术后第3天MMP-8基因mRNA的相对表达量为2.10±0.31,第5天为3.39±0.34,第7天为1.76±0.44,第10天为0.43±0.10;洗必泰组术后第3天MMP-8基因mRNA的相对表达量为1.03±0.29;第5天为2.35±0.49,第7天为1.49±0.34,第10天为0.21±0.04;治疗组术后第3天MMP-8基因mRNA的相对表达量为0.29±0.16;第5天为0.83±0.23,第7天为0.79±0.16,第10天为0.19±0.03;术后第3天、5天、7天时,治疗组MMP-8基因与洗必泰组相比表达量显著下降(均为P<0.05),差异有统计学意义,第10天与洗必泰组比较MMP-8的mRNA相对表达量无明显下降趋势(P>0.05)。荧光定量PCR法检测模型组术后第3天MCP-1基因mRNA的相对表达量为1.43±0.37,第5天为1.87±0.09,第7天为0.48±0.05,第10天为0.22±0.01;洗必泰组术后第3天MCP-1基因mRNA的相对表达量为1.02±0.20;第5天为1.29±0.37,第7天为0.26±0.05,第10天为0.06±0.01;治疗组术后第3天MCP-1基因mRNA的相对表达量为0.35±0.07;第5天为0.29±0.12,第7天为0.11±0.05,第10天为0.05±0.02;术后第3天、5天、7天时,治疗组MCP-1基因与洗必泰组相比表达量显著下降(均为P<0.05),差异有统计学意义,第10天与洗必泰组比较MCP-1的mRNA相对表达量无明显下降趋势(P>0.05)。
  结论:1.在上皮缺损的角膜上覆盖黏附有棘阿米巴的角膜接触镜,并滴加阿米巴悬液的方法,可以成功建立稳定的大鼠棘阿米巴角膜炎动物模型。2.抗阿米巴药物治疗的同时局部应用多西环素,可以抑制大鼠棘阿米巴角膜炎的炎症细胞浸润,降低MMP-8及MCP-1的表达,起到减轻炎症损害的作用。
[硕士论文] 刘婷婷
眼科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过建立真菌性角膜炎大鼠模型,观察真菌性角膜炎自然病程的特点,并在不同时间点行组织病理学检查,观察真菌性角膜炎发病过程中组织破坏情况;研究多西环素对真菌性角膜炎发病过程中性粒细胞以及MCP-1、MMP-8表达的影响。
  方法:1.取健康SD大鼠32只,随机分为手术模型组和空白损伤组,每组16只,利用角膜接触镜法建立烟曲霉菌性角膜炎大鼠模型,其中手术模型组角膜接触镜镜片与角膜层间注入20μl孢子混悬液,对照组注入20μl的PBS缓冲液。分别于术后第3、5、7、10天每组取4只大鼠,裂隙灯下观察角膜炎特点,并角膜刮片行10%KOH湿片法以及细菌、真菌培养,角膜取材行组织病理学检查,观察角膜组织的病理学变化。
  2.取健康SD大鼠32只,随机分为多西环素组和对照组,每组16只。利用角膜接触镜法建立烟曲霉菌性角膜炎大鼠模型,多西环素组给予0.3g/L多西环素眼液点术眼,对照组给予眼液溶媒点术眼。其中眼液溶媒除不含多西环素外,其余成分与0.3g/L多西环素眼液相同。分别于术后第3、第5、第7、第10天取4只裂隙灯显微镜下观察角膜炎特点并进行角膜炎症评分;处死并角膜取材,用于组织病理学检查观察角膜组织的病理变化,并记录各时间点中性粒细胞数量变化。
  3.取健康SD大鼠64只,随机分为多西环素组和对照组,每组32只。利用角膜接触镜法建立烟曲霉菌性角膜炎大鼠模型,多西环素组给予0.3g/L多西环素眼液点术眼,对照组给予眼液溶媒点术眼。其中眼液溶媒除不含多西环素外,其余成分与0.3g/L多西环素眼液相同。分别于术后第3、第5、第7、第10天裂隙灯显微镜下观察角膜炎特点并进行角膜炎症评分;空气栓塞法处死大鼠并角膜取材,置于液氮备用。采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测角膜MCP-1、MMP-8的mRNA基因的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测MCP-1蛋白表达水平。
  结果:1.角膜刮片显微镜下可见真菌菌丝及孢子存在,真菌培养表现为典型的菌落特点。角膜病变特点:术后第1天可见结膜轻度充血,角膜水肿,接种部位出现白色混浊;第3天,结膜充血加重,角膜表面菌丝苔被覆盖;第5天,角膜水肿减轻,角膜溃疡灶开始缩小,中央白色致密溃疡灶,部分可出现前房出血或角膜后弹力膜膨出;第7天角膜溃疡灶进一步缩小,第10天逐渐形成角膜白斑或有新生血管爬入角膜缘。组织病理学检查:术后9h可见部分角膜上皮层缺失,角膜基质全层可见炎症细胞浸润;术后第3天角膜胶原纤维肿胀,浸润的炎症细胞明显增多,坏死组织脱落,溃疡形成;术后第5天可见角膜胶原纤维肿胀、变形断裂,覆盖的坏死组织周围可见浸润的中性粒细胞;术后第7天角膜上皮组织逐渐增生,胶原纤维排列紊乱,炎细胞逐渐减少;在病程的后期可见增厚的角膜上皮,角膜组织可见大量新生血管长入。
  2.正常大鼠角膜组织中存在极少量的中性粒细胞,大鼠感染烟曲霉菌后中性粒细胞数量明显增多,于第5天达到高峰,随后逐渐减少。与对照组相比,多西环素组的炎症评分明显低于对照组(P<0.05),多西环素组术后各时间点中性粒细胞计数显著减少(P<0.05)。
  3.正常大鼠角膜组织中MCP-1、MMP-8的表达量极少或基本不表达;大鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型中存在MCP-1、MMP-8的明显表达,早期表达量增多,病程后期逐渐减少,但表达量但仍维持在一个较高的水平。大鼠烟曲霉菌感染后第3、第5、第7天多西环素组MCP-1mRNA和蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);与对照组相比,第3、第5天MMP-8mRNA相对表达量减少(P<0.05)。
  结论:1.本研究使用的角膜接触镜法能成功建立烟曲霉菌性角膜炎大鼠模型;
  2.多西环素可减少大鼠烟曲霉菌性角膜炎中性粒细胞的浸润,从而减轻炎症反应;
  3.多西环素能下调大鼠烟曲霉菌性角膜炎MCP-1、MMP-8的表达,可能是多西环素抑制大鼠烟曲霉菌性角膜炎炎症反应的机制之一。
[硕士论文] 李鹤
病原生物学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:真菌性角膜炎(Fungal keratitis,FK)是一类由真菌感染而引发机体角膜组织发生炎症反应性疾病。本病是由Leber于1878年首次报道,是一类常见的、较顽固的真菌感染。由于本病早期诊断及治疗困难,常导致患者角膜溃疡或穿孔,进展为眼内炎,引发视力障碍或失明。近年来,由于在临床上大量使用抗生素、皮质类激素、免疫抑制剂等药物,我国真菌性角膜炎在人群中发病率呈逐年增高趋势,以男性及农村居民感染为主,继白内障之后成为首要致盲性眼病[1],给人们家庭及社会发展造成巨大的经济负担。镰刀菌和曲霉毒是引起眼部真菌感染的主要菌种,而曲霉菌引起的眼感染症中主要是由感染烟曲霉菌和黄曲霉菌所致。在一些地区真菌角膜感染已经成为主要的致病原[2]。目前,临床上真菌感染的患者很多,然而治疗真菌性角膜炎的有效药物却很少,并且治疗比较困难。因此,深入研究本病的病原学、病理学、免疫学、诊断学和流行病学,对本病的早期诊断和防治有着重要的意义。
  角膜呈球冠型,中央薄,边缘厚,自外向内由5层角膜细胞和结缔组织所构成,其机械屏障可以抵御真菌的感染。角膜上皮细胞及基质细胞也可以通过表达一些模式识别受体(PRRs),通过病原相关分子模式(PAMPs)激活人体的固有免疫,诱导特异的适应性免疫应答,以清除病原体[3],修复病原对人体的损害。
  Ariizumi等人于2000年首次发现树突状细胞相关C型凝集素-l(Dentritk cell associated C Type lectin-1,Dectin-1)[4],后者是树突状细胞表面特异性表达的受体,并且广泛分布于树突状细胞、单核细胞、B细胞以及部分T细胞亚群等。同时,在鼠神经胶质细胞上亦有表达[5]。最近有研究表明,Dectin-1能够识别真菌、细菌表面的β-1、3/β-1、6-葡聚糖和碳水化合物。在真菌感染过程中,Dectin-1参与Th17细胞的产生,后者能够分泌产生IL-6、IL-17A、TNF-α和IL-17F等细胞因子,这些细胞因子可以动员、募集及活化中性粒细胞,对抗细胞外真菌及细菌感染的免疫反应。Th17细胞产生的IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程,从而有效地诱导组织的炎症反应。由于Tyr238X突变使得Dectin-1不能在细胞膜上表达,减少了IL-17的产生,增加了真菌感染的易感性[6][7][8]。而IL-12和TNF-α因子在抗真菌感染反应中也发挥重要的作用。
  Dectin-1受体是一类跨膜结构,属于C型凝集素受体家族中的一员,其能够识别外源性病原菌,例如真菌和分歧杆菌等,也能够识别T细胞表达的内源性配体。由于这一受体能够识别真菌,因此在真菌性角膜炎患者体内能够被发现。而在对患者实施临床诊断和治疗时,也可通过干预Dectin-1受体作用而达到良好的效果。但需注意的是,当前我国在对真菌性角膜炎患者的临床诊治研究中,对Dectin-1受体已有一些研究,但需要更深入的探讨,正是据此本文开展这方面的研究。
  目的:
  本文拟探讨真菌性角膜炎动物模型建立后大鼠角膜的病理变化,Dectin-1受体的表达水平,以及Dectin-1受体与IL-17、IL-12和TNF-α等多种细胞因子之间的关系,以期揭示Dectin-1受体在抗真菌性角膜炎免疫应答中的作用和机制,为临床上诊治真菌性角膜炎,寻找新的治疗靶点提供进一步的实验依据。
  方法:
  一、动物模型建立
  1.实验动物与分组
  选取由大连医科大学实验动物中心提供的60只Wistar清洁级、健康大鼠,雌雄不限、8周龄,体重在200g-250g之间,经裂隙灯显微镜检测后眼部角膜组织均没有结构和功能病变。将这些大鼠分为三组:实验组1、实验组2和对照组,每组分别为25只、25只和10只。
  2.模型建立
  (1)采用中国普通微生物菌种保藏管理中心提供的烟曲霉菌菌株(编号为3.0772),制备成浓度为1×108个菌丝/毫升的菌悬液。
  (2)分别测定实验大鼠的眼部角膜曲率半径,计算平均值作为最终值,将封口膜制备成相应曲率半径的角膜接触镜,并使用浓度为75%的乙醇进行浸泡消毒。
  (3)实验组1的25只大鼠眼部给予Dectin-1特异性抑制剂昆布多糖(Laminarin)处理;实验组2的25只大鼠眼部给予生理盐水处理,不使用昆布多糖(Laminarin)。
  (4)实验组1和实验组2的50只大鼠,均在角膜中部区域钻大约2mm的圆形印痕。
  (5)将菌悬液滴在实验组1和实验组2大鼠的角膜上,用制备好的角膜接触镜进行覆盖,缝合眼睑,保证大鼠感染目标菌株,建立真菌性角膜炎大鼠动物模型。
  二、实验方法
  在建立真菌性角膜炎动物模型后,在第1天、第2天、第3天和第5天,分别取对照组、实验组1、实验组2的大鼠角膜上皮组织。
  1.HE染色后进行病理学观察;
  2.采用免疫组化法检测各组大鼠角膜组织中Dectin-1的表达量;
  3.提取和收集RNA,采用QRT-PCR技术分别测定并比较各组大鼠Dectin-1、TNF-α、IL-17、IL-12的mRNA表达水平。
  结果:
  1.病理学结果
  对照组大鼠的角膜完整、没有水肿和炎症细胞浸润现象;实验组1和实验组2大鼠角膜可见水肿增厚、溃疡处上皮缺失前弹力层、前房及基质中有较多中性粒细胞浸润。
  2.免疫组化结果
  对照组和实验组1的大鼠角膜组织中dectin-1受体的表达始终呈弱阳性;真菌感染1天后,实验组2的大鼠角膜组织中dectin-1受体的表达就开始呈现强阳性,一直持续到第5天。
  3.QRT-PCR检测结果
  (1)对照组、实验组1和实验组2大鼠角膜组织中都有Dectin-1、TNF-α、IL-12的表达。
  (2)在对照组和实验组1大鼠角膜组织中均没有IL-17的表达。
  (3)实验1天后,实验组2大鼠角膜组织细胞中Dectin-1的表达量比对照组和实验组1明显增加(P<0.05),实验组1大鼠角膜组织中Dectin-1的表达量与对照组之间无统计学差异(P>0.05)。
  (4)实验组1大鼠角膜组织中IL-12、TNF-α的表达量比对照组明显增加(P<0.05)。
  (5)实验组2大鼠角膜组织中IL-12的表达量在第1天到第3天持续增加,而TNF-α的表达量在第1天到第5天持续增加。
  结论:
  1.在真菌感染后,大鼠角膜组织中的Dectin-1表达量增加,Dectin-1的表达量可能和炎症反应的应答程度密切相关。
  2.IL-17的合成可能依赖于Dectin-1受体介导的细胞内信号通路。
  3.IL-12可能在真菌感染的早期发挥作用,Dectin-1受体参与炎症因子IL-12的表达,IL-12还受其他类型的细胞受体所诱导。
  4.TNF-α因子参与真菌性角膜炎角膜组织炎症反应,且该因子的表达水平和Dectin-1受体没有显著的关系,其可能经细胞上的其他受体诱导的信号转导途径所调控。
[博士论文] 杨丽霞
眼科学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察蚕蚀性角膜溃疡病人及复发性蚕蚀性角膜溃疡病人的临床特点,探寻影响蚕蚀性角膜溃疡复发及多次复发的相关危险因素,为临床医生进一步了解本病特点、选择合适的治疗方式、降低复发率、提高治愈率提供资料。
  方法:
  1、回顾性分析了2006年6月至2016年10月在山东省眼科医院诊断为蚕蚀性角膜溃疡并保存有完整资料的所有病例。按其随访期内有无复发分为复发组和未复发组,总结临床特点,采用单因素分析两组患者间性别、年龄、职业(农村、城市)、单/双眼、眼别、既往角膜手术史、既往角膜感染史、既往角膜外伤史、治疗前合并角膜穿孔、治疗前合并角膜新生血管、免疫学指标、溃疡范围、溃疡位置、第一次住院治疗方式等指标的差异,P<O.05时认为具有统计学意义。
  2、按照上述结果得出的具有统计学意义的指标(职业、治疗前合并角膜穿孔)对所有患者再次分组,采用Kaplan-Meier生存分析的方法比较组间复发时间的差异。
  3、按照复发1次、复发2次、复发≥3次对复发性患者进行分组,总结临床特征,探寻影响疾病多次复发的危险因素。
  结果:
  1、纳入本研究共95例患者107只眼。年龄平均为49±14岁(18~81岁),随访时间4月~124月。46人(54只眼)发生复发,其中男性30人,女性16人。66人来自农村,37人复发,复发比例是56.1%。29人来自城市,9人复发,复发比例是31.1%。双眼发病者12人,8人复发。单眼发病者83人,38人复发。合并既往角膜手术史的患眼12只,5只发生了复发;合并既往角膜外伤病史的患眼3只,2只发生复发;合并既往角膜感染病史者共4只,1只发生复发。免疫指标异常的患眼共52只,28只复发;治疗前合并角膜穿孔的患眼14只,11只复发,复发比例是78.6%;治疗前合并角膜新生血管的患眼57只,27只复发;单因素分析结果显示:职业(P=0.025)、治疗前合并角膜穿孔(P=0.024)可能与蚕蚀性角膜溃疡的复发有关系,而性别(P=0.420)、年龄(P=0.366)、单/双眼(P=0.062)、眼别(P=0.634)、既往角膜手术史(P=0.518)、既往角膜感染史(P=0.299)、既往角膜外伤史(P=0.569)、治疗前合并角膜新生血管(P=0.494)、免疫学指标(P=0.497)、溃疡范围(P=0.395)、溃疡位置(P=0.256)、第一次住院手术方式(P=0.672)等指标可能与蚕蚀性角膜溃疡的复发没有关联。
  2、Kaplan-Meier生存分析方法显示农村患者复发的时间是治疗后5个月,城市患者复发的时间是治疗后7个月。治疗前合并穿孔患者复发的时间是治疗后4个月,治疗前未合并穿孔患者复发的时间是治疗后6个月。
  3、复发性蚕蚀性角膜溃疡患者中,高于35岁的患者更常见。男性患者所占比例高。农民患者所占比例较城市患者高。单眼发病较双眼发病常见。复发患者的治疗方式以板层角膜移植为主,尤其是部分LKP。溃疡位置多见于患眼的鼻侧和颞侧。溃疡原位复发的患者所占比例较高。治疗前合并角膜穿孔病史的患者更容易发生多次复发。
  结论:
  1、患者职业(P=0.025)、治疗前是否合并角膜穿孔(P=0.024)与蚕蚀性角膜溃疡的复发可能有一定的关联;农村患者、治疗前合并角膜穿孔患者更容易发生复发。
  2、农村患者比城市患者治疗后复发时间早,治疗前合并穿孔患者比未合并穿孔患者的复发时间要早。应该对农村患者、治疗前合并角膜穿孔的患者在治疗的早期予以充分的关注,叮嘱其按时随访,减缓或避免复发。对所有患者加强宣教随访的重要性,以减少复发。
  3、对于复发性蚕蚀性角膜溃疡患者,治疗前合并角膜穿孔史患者更容易发生多次复发,对这部分患者更应高度关注,减轻或避免其日后的多次复发。
[硕士论文] 邵岩
眼科学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨真菌性角膜炎患者的致病原因、致病菌属种类,分析不同真菌种类与相应感染疾病预后的相关性。
  方法:回顾性分析2015年6月至2016年6月我院眼科诊治的真菌性角膜炎患者115例,采用角膜刮片镜检、真菌培养明确诊断,行药物治疗,评估所选病例的致病原因、致病菌属、患者就诊时间、病情严重程度及患者预后,并分析相关指标与患者预后相关性。
  结果:调查115例真菌性角膜炎患者,致病原因包括眼部外伤史76例,占66.0%;抗生素或激素等药物长期滥用22例,占19.1%;角膜接触镜影响6例,占5.2%;既往眼表疾病8例,占7.0;其他3例,占26%;可见真菌性角膜炎的主要致病原因是眼部外伤史。随访6个月后,患者预后情况主要为93例(80.9%)预后好,12例(10.4%)预后中等,10例(8.7%)预后差。致病菌属分布显示镰刀菌属占比最大为50.4%,其次为曲霉菌属占比22.6%,发现致病菌属种类与真菌性角膜炎的预后成显著相关性;不同就诊时间之间比较,Ⅰ级就诊时间的药物治愈率最高,且药物治愈率随就诊时间延长而延长;不同病情严重程度之间比较,病情轻度患者预后较好,且预后情况随病情加重而变差。
  结论:眼部外伤史是我国真菌性角膜炎患者常见的致病原因,镰刀菌、曲霉菌是常见真菌性角膜炎的主要致病菌。镰刀菌和曲霉菌相关性角膜炎的药物治疗效果差,预后较差,手术率高;其他菌属如暗色菌属致病力相对较弱,其所致角膜炎预后相对较好;且患者就诊时间、病情严重程度与其预后呈现明显相关性。
[博士论文] 杜少博
生物学·动物学 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:紫外线B(UVB)辐照损伤的敏感部位之一为动物的眼睛,角膜上皮作为眼对外界刺激的第一道屏障能吸收大部分到达眼的 UVB,而过量UVB会诱导角膜上皮细胞发生凋亡且该凋亡与UVB呈剂量依赖性。但少有研究报道UVB辐照诱导角膜上皮细胞凋亡的动态变化及其时序。研究表明枸杞多糖(LBPs)可以通过抑制多种损伤源诱导的细胞凋亡来保护晶状体上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、感光细胞等多种眼细胞。但LBPs是否能抑制 UVB辐照诱导的凋亡来保护角膜上皮细胞及其机理尚无研究报道。本文首先从成年标准体重 Wistar品系雌鼠提取原代角膜上皮细胞并进行体外培养,使用角膜上皮特异性标记蛋白——细胞角蛋白3和12(cytokeratins3+12),利用免疫荧光技术鉴定原代细胞纯度后将该细胞用于后续实验。实验通过检测144 mJ/cm2 UVB辐照大鼠角膜上皮(RCE)细胞24 h内不同时间点上细胞形态、细胞活力、细胞凋亡率、线粒体膜电位(MMP)及凋亡相关基因(Bax、caspase-8、caspase-3)表达水平的变化研究了UVB辐照诱导RCE细胞凋亡的动态变化及其时序。使用LBPs保护和没有使用LBPs保护的RCE细胞经UVB辐照后,通过检测细胞活力、细胞形态、细胞核形态、细胞凋亡率的变化阐明了LBPs是否能抑制UVB辐照诱导的凋亡来保护角膜上皮细胞的问题;通过检测 MMP、凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、caspase-3)表达水平、JNK磷酸化水平及活性氧(ROS)水平的变化揭示了LBPs抑制凋亡的机理;通过转录组测序后差异表达基因的分析进一步探究了UVB辐照对RCE细胞的损伤与LBPs的保护作用。
  实验结果显示:成功提取并培养了原代RCE细胞,细胞呈单层成纤维样贴壁生长,传代后细胞界限明显、胞体圆润,细胞随着增殖逐渐融合,当融合至80?90%时进行传代处理;统计细胞角蛋白3和12的免疫荧光染色结果得到,经原代培养所得的RCE细胞的纯度约为80%。144 mJ/cm2 UVB辐照RCE细胞后的24 h内,caspase-8和Bax在辐照后0 h时表达量最高;MMP在辐照后0 h时下降且在6 h内保持不变;辐照后6 h时,caspase-3被激活且此时细胞活力最低而凋亡率最高;caspase-3在辐照后12?24 h表达量下降,细胞凋亡率随之下降且晚期凋亡细胞比例下降。不同浓度LBPs对RCE细胞活力的影响为0?1 mg/mL无影响、5 mg/mL增加细胞活力、10 mg/mL降低细胞活力。0.05–1 mg/mL LBPs阻止UVB辐照诱导的RCE细胞活力的下降且该作用的最佳浓度为1 mg/mL;1 mg/mL LBPs显著抑制了UVB辐照诱导的RCE细胞凋亡形态与凋亡核形态的发生,将凋亡核比率从UVB辐照后的38.06%±7.02%降低到了18.51%±0.94%,并将UVB辐照诱导的RCE细胞的凋亡率从47.06%±1.83%降低到了13.93%±1.76%。1 mg/mL LBPs显著抑制UVB辐照诱导的RCE细胞MMP的下降,将RCE细胞Bax/Bcl-2比值从UVB辐照后上升8.26±0.79倍抑制到了2.91±0.08倍;1 mg/mL LBPs分别在mRNA水平和蛋白水平显著抑制了UVB辐照诱导RCE细胞caspase-3的上调,显著减弱了UVB辐照诱导的JNK磷酸化;1 mg/mL LBPs使ROS水平从UVB辐照后上升2.41±0.15倍回落到了1.44±0.17倍。转录组测序结果显示,UVB辐照使RCE细胞产生4373个差异基因,其中1433个上调、2940个下调,经1 mg/mL LBPs处理后,差异基因数减少到了1941个,其中1326个上调、615个下调;将差异基因进行GO(gene ontology)功能富集,发现UVB发挥损伤作用与LBPs发挥保护作用主要涉及的生物进程为细胞通讯与信号转导,细胞响应刺激与对伤害的响应,细胞组分与亚细胞组分迁移,DNA转录、RNA与生物大分子的合成与代谢,免疫反应、细胞防卫响应与细胞因子的产生,炎症反应,细胞运动与移行等;差异基因的KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析再一次表明凋亡通路中的线粒体途径和JNK通路参与到UVB辐照诱导RCE细胞凋亡与LBPs抑制该凋亡的过程中。
  综合以上研究结果,过量UVB辐照可诱导RCE细胞活力下降和发生细胞凋亡且该凋亡是一个快速而有序的过程。LBPs可以通过抑制UVB辐照诱导的细胞凋亡来保护RCE细胞,其机理为抑制Bcl-2的下调、Bax的上调、MMP的下降以及caspase-3的上调,即削减凋亡的线粒体途径,抑制JNK磷酸化水平以及抑制细胞ROS水平的升高。LBPs在转录组水平减少了UVB辐照诱导的差异表达基因的个数。本论文的工作完善了UVB辐照诱导角膜上皮损伤的相关研究,填补了LBPs在对抗UVB辐照诱导的凋亡与损伤和对角膜细胞保护研究上的空白,使用转录组测序探究LBPs的作用也尚属首次。
[硕士论文] 任钰萍
眼科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过回顾病例和相关文献,总结和分析超声乳化术后角膜后弹力层脱离的病因、临床特征和诊治原则,探讨其诊断标准、新的治疗策略和预防思路,以了解白内障手术并发角膜后弹力层脱离的相关因素,为其早期诊断、及时干预和个性化治疗提供参考依据。
  方法:
  采集2015年9月至2016年8月在浙江大学医学院附属第二医院眼科中心行角膜后弹力层脱离复位术患者的病历资料,运用前节光学相干断层扫描仪进行术后随访,评价其手术疗效。通过数据库进行文献数据检索,深入分析白内障超声乳化术后并发角膜后弹力层脱离的相关研究进展。
  结果:
  2015年9月至2016年8月期间在浙江大学医学院附属第二医院眼科中心住院患者中诊断为角膜后弹力层脱离的患者共1例(1只眼),左眼在当地医院行超声乳化联合人工晶体植入术。术后第一天发现角膜后弹力层脱离,予以前房注入空气复位。复位术后第一天,发现角膜后弹力层仍然脱离,后弹力层复位失败。故转入本中心后运用一项替代技术——穿刺放液联合前房注气术进行治疗,成功复位,角膜恢复透明。
  结论:
  1.角膜后弹力层脱离是超声乳化术后可能会导致角膜失代偿的一种严重并发症。
  2.小范围脱离可自行复位,轻中度脱离可采用气体或黏弹剂复位,较大范围脱离则采取角膜缝合,对于常规治疗再次发生后弹力层脱离的特殊情况可采用穿刺放液联合前房注气术,该项替代技术为我们以后遇到复杂且严重的角膜后弹力层脱离提供了一种新的有效的复位方法。
  3.对于角膜后弹力层脱离,进行早期诊断,积极治疗,对恢复角膜透明,改善术后视力有积极的作用。
[博士论文] 张翠英
临床医学(眼科学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分 兔真菌性角膜炎动物模型制作
  目的:建立兔浅层真菌性角膜炎动物模型,探讨模型制作过程中的注意事项,观察感染前后角膜及其他眼部变化,并通过角膜刮片培养及共聚焦显微镜检查明确真菌感染及感染菌种。
  方法:健康成年新西兰大白兔48只,体重2.5~3.0kg,雌雄均用,排除眼前段活动性疾病,预饲养两周。实验兔随机分为三组,分别为:360组,440组和空白对照组。48只实验兔均采用右眼为模型眼,A型超声角膜测厚仪测定兔眼角膜中央厚度。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg),右眼用盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)表面麻醉3次,固定头部;在眼科手术显微镜下,开睑器开睑后,生理盐水冲洗结膜囊,并将提前制备好的浓度为106CFU/ml(Colony-Forming Units,CFU,单位体积中的活菌个数)标准白色念珠菌菌液0.1ml注入角膜中央部浅层基质内,形成直径4mm圆形灰白色区域。制作兔角膜白色念珠菌感染的模型后,通过裂隙灯检查、角膜溃疡刮片培养鉴定菌种、共聚焦显微镜观察真菌。
  结果:A型超声角膜测厚仪测定兔眼角膜中央厚度,各组间角膜中央厚度无显著性差异。裂隙灯检查角膜真菌感染:白色念珠菌感染后1天,角膜溃疡形成,角膜轻度水肿,能透见虹膜文理,前房无积浓;感染后3天,角膜溃疡灶面积增大,周边可见卫星灶,角膜水肿弥漫性加重,不能透见虹膜;感染后5天,溃疡灶面积进一步扩大,溃疡灶和卫星灶融合,并有苔垢样坏死组织附着,溃疡边缘稍隆起毛糙不齐,角膜弥漫性雾状水肿加重,前房可见积脓。角膜刮片培养:菌落为圆形,较大,表面中间粗糙起皱,假菌丝浸入培养基内,为类酵母菌型菌落典型表现。革兰染色阳性,着色不均匀,可见菌细胞呈圆形或卵圆形,并可见假菌丝。无染色高倍镜可见真菌细胞出芽生成假菌丝,假菌丝不分枝,长短不一;使用YST卡进行菌株鉴定菌种鉴定为白色念珠菌。共聚焦显微镜检查:模型制作后第3~5天,角膜溃疡形成,多次共聚焦显微镜检查,所有模型兔均查见菌丝或孢子,共聚焦显微镜检查可见大量真菌菌丝和炎细胞,菌丝细长弯曲成团索样,高折光。
  结论:1.兔眼与人眼形态及解剖相近,眼球较大,是感染性角膜炎理想的动物选择。2.在本实验动物模型制作中采用角膜浅基质层注射真菌的方法,成功制作了兔角膜白色念珠菌性角膜炎动物模型,其操作简单、成功率高、角膜刮片容易,并且明显减少了角膜穿孔的风险。
  第二部分 360nmUVA或440nm蓝光联合核黄素角膜胶原交联对兔真菌性角膜炎的疗效观察
  背景:真菌性角膜炎是一种致盲率高的严重角膜感染性疾病,近40年来发病率明显增加。目前主要的治疗方式仍然是抗真菌药物局部或联合全身应用,由于大多数抗真菌药物眼组织穿透力小且毒性较大,药物治疗相对棘手。另外角膜溃疡刮除联合碘烧灼也有应用,但效果有限。胶原的高机械强度与胶原结构有密切的关系。角膜胶原交联疗法的基本原理是根据光敏剂核黄素的独特的吸收光谱,在紫外线或可见光的照射下,吸收光子能量,诱导胶原纤维和内部化学基团之间,形成更多的共价键交联,从而增加了胶原生物力学特性,提高了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力,增加胶原对酶降解的抵抗力。紫外线A(Ultraviolet Radiation A,UVA)设备使用发光二极管产生的紫外线A波长在360~380nm,此设备包含聚焦系统、焦点距离、光线直径和束均匀度等参数,操作者能根据情况调节参数的大小。角膜胶原交联在眼科应用广泛,特别是对于圆锥角膜和角膜扩张等疗效肯定。核黄素是一种具有3个环状结构的极性分子,具有吸附核酸的特点,能够插入DNA或者RNA碱基内。0.1%核黄素能产生最大的吸收作用,90%紫外线辐射能在角膜基质中被吸收,最大限度保护了角膜内皮,晶状体和视网膜。核黄素在角膜胶原交联过程中具有双重作用,它不但是诱导交联的光敏剂;作为选择性滤波器,核黄素还能够保护下面的组织免受UVA的损伤。另外,足量的核黄素使体内酸性物质减少,不利于真菌生长,因此患者抵御真菌感染的能力增强。360nmUVA联合核黄素角膜交联治疗(corneal cross-lingking,CXL)对真菌性角膜炎的疗效,在动物实验及临床上都得到了证实。我们知道核黄素的吸收波峰包括360nm和440nm,目前核黄素联合360nm UVACXL治疗对真菌性角膜炎的治疗作用已经得到确认,但是核黄素联合440nm蓝光CXL治疗对真菌性角膜炎的疗效尚无人观察。
  目的:本实验采用兔真菌性角膜炎为动物模型实验的方法,观察分析360nmUVA或440nm蓝光联合核黄素CXL治疗对兔真菌性角膜炎的疗效。
  方法:兔真菌性角膜炎动物模型48只,已随机分为空白对照组,360组,440组。空白对照组不做任何处理,360组和440组分别行角膜CXL治疗。实验兔用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg),右眼用盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)表面麻醉3次,固定头部,开睑器开睑,用圆钝刀片刮除直径9.0mm的中央角膜上皮层和表层溃疡组织。0.1%核黄素溶液冲洗角膜,2分钟1次,连续半小时;裂隙灯可观察到前房黄染,确定核黄素充分渗透角膜进入前房。360组采用0.1%核黄素点眼30分钟后,360nmUVA照射30分钟;440组采用0.1%核黄素点眼30分钟后,440nm蓝光照射30分钟;总能量设定均为3mW/cm2,照射距离均为5cm。治疗后1、3、7、15天分别对各组兔进行裂隙灯观察、角膜照相并行溃疡面积计算分析、共聚焦显微镜检查比较。CXL治疗后1、7,15天天各组分别耳缘动脉注气处死4只实验兔,立即剪取其角膜并甲醛固定,切片染色后进行病理观察分析。
  结果:治疗前各组间溃疡面积比较无统计学意义,治疗后1天各组间比较无统计学意义(P>0.05);治疗后3天,空白对照组较治疗前增大6.94%,360组角膜溃疡面积减小35.65%,P=0.012;440组角膜溃疡面积减小37.94,P=0.015,数据分析均有显著性差异;360组和440组间比较P=0.88,数据分析没有显著性差异。360组和440组分别与空白对照组比较p<0.05,数据分析具有显著性差异。治疗后7天,空白对照组较治疗前减小13.14%,360组角膜溃疡面积减小73.82%,P=0.00;440组角膜溃疡面积减小70.00%,P=0.000,数据分析均有显著性差异;360组和440组间比较P=0.75,数据分析没有显著性差异,360组和440组分别与空白对照组比较p<0.01,数据分析具有显著性差异。治疗后15天,空白对照组溃疡面积减小83.16%;360组核和440组角膜溃疡消失。共聚焦显微镜检查:治疗后1天各组间无明显差异;治疗后3,7天360组和440组较空白对照组真菌菌丝减少,真菌菌丝变短棒样,继而消失,角膜中的炎症细胞较空白对照组减少。治疗后15天,空白对照组可见角膜基质细胞增大增多,炎症细胞和少量真菌菌丝呈短棒状高反光;360组和440组未见菌丝及孢子,可见增大的基质细胞。病理检查结果:CXL治疗后1天:各组均可见角膜炎症反应重,局部角膜上皮缺失,可见溃疡形成,局部可见脓肿灶,周围较多淋巴细胞、中性粒细胞浸润及嗜酸性粒细胞。治疗后7天:空白对照组:角膜坏死严重,溃疡形成,局部角膜穿孔,炎症反应重;360组角膜炎症反应相对较轻,角膜水肿,散在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞浸润,纤维细胞母细胞及小血管增生,未见明显坏死及溃疡形成;440组角膜炎症反应相对较轻,角膜水肿,散在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞浸润,纤维细胞母细胞及小血管增生,未见明显坏死及溃疡形成。治疗后15天:空白对照组角膜溃疡不明显,局部角膜上皮缺失,角膜轻水肿,散在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞浸润,纤维细胞母细胞及小血管增生。360和440组未见角膜溃疡,角膜上皮完整,可见纤维母细胞增生。
  结论:360nmUVA和440nm蓝光联合核黄素CXL对兔真菌性角膜炎的治疗均有效,治疗效果无明显差异。
[博士论文] 魏淑芳
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:细菌性角膜炎是由细菌感染导致的角膜炎症,可引起角膜上皮缺损和基质坏死,是一种严重危害视力的眼部疾病。其中尤以金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌感染最常见、最严重。其治疗目前主要依靠局部滴用抗生素滴眼液,但是因受到多种外界因素以及滥用抗生素的影响,部分细菌发生变异而产生一定的耐药性,导致治疗效果不佳,Chang VS回顾分析了20年里葡萄球菌感染的角膜炎,发现耐药率达30.7%。对于迁延不愈的角膜溃疡,有人尝试结膜瓣或羊膜覆盖,但这会降低滴眼液的渗透性,必须在感染控制后才能做此手术。感染严重致角膜溶解时,只能行角膜移植手术治疗,但是角膜材料有限,且术后常会出现排斥反应或炎症复发,以至于相当一部分患者最终不得不进行眼球摘除术来根治。
  角膜交联术(CXL)是通过合适的光源照射激发核黄素产生活性氧族,诱导角膜胶原纤维的氨基之间发生光化学交联反应,从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力,已广泛应用于角膜扩张病变,疗效肯定。2000年,Scnitzler E首次报道了CXL用于治疗角膜溃疡有效,之后大量的临床报道证实CXL是一种新的、有效的治疗感染性角膜炎的方法。相对于大多数抗生素只能从杀灭病原体一方面治疗角膜炎,CXL可以从消除病原体、增加角膜的抗酶活性以及减轻相关炎症反应三方面来治疗角膜溃疡,给角膜溃疡的治疗带来了新的曙光。波长270nm左右的紫外光B、370nm左右的紫外光A、445nm左右的蓝光同为核黄索的吸收峰,均可以激发核黄素产生交联反应。光线的穿透能力与其波长呈正比,波长越长,穿透力越强,370nm紫外光A仅能穿透300um的角膜,440nm蓝光介导的交联深度应该较370nm紫外光更深,而细菌性角膜炎时角膜均会水肿变厚,溃疡深度往往会超过300um,据此,设想440nm蓝光介导的交联治疗严重角膜溃疡的效果应该优于370nm紫外光A。1998年,Spoerl E等人报道了465nm蓝光联合核黄素诱导的CXL可以起到加固离体猪角膜的作用,2008年Iseli报道蓝光CXL可以增加巩膜胶原纤维的机械强度。但440nm蓝光联合核黄素诱导角膜交联治疗角膜溃疡尚未见报道。本文第一部分应用440nm蓝光联合核黄素对金黄色葡萄球菌感染的兔角膜溃疡进行了交联治疗,旨在观察验证其对细菌性角膜溃疡的治疗效果,并与370nm紫外光A进行比较,观察其疗效是否优于后者。第二部分初步观察了440nm蓝光核黄素交联治疗金葡菌角膜溃疡,是否对角膜内皮、视网膜、脉络膜等眼部组织有损害。
  第一部分 440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜炎的疗效研究
  目的:
  通过动物实验观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗金黄色葡萄球菌角膜溃疡的疗效,与空白对照组对比,观察其治疗是否有效;与370nm紫外光A联合核黄素角膜交联治疗组对比,观察其治疗效果是否优于后者。
  方法:
  1.实验设计:选取60只健康新西兰大白兔,右眼为实验眼,全麻后中央角膜浅基质层内注入0.1ml浓度为5×107cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液,制作金黄色葡萄球菌感染的较严重的角膜溃疡模型,将造模成功的54只纳入研究,随机分为三组,每组18只。其中18眼行440nm波长蓝光核黄素角膜交联,18眼行370nm紫外光A核黄素角膜交联,另外18眼作为空白对照组,仅在另外两组行交联治疗的同时,给予一次刮除溃疡表面疏松坏死组织治疗。于交联后第1天、3天、7天、14天分别观察比较各组疗效。
  2.角膜交联方法:10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,角膜测厚,确保最薄点大于400um。去除角膜中央直径9mm疏松溃疡组织及残存上皮,1g·L-1核黄素溶液滴角膜每4-5min1次,共30min。440nm蓝光和370nm紫外光A照射能量均为3mw·cm-2,照射直径均为9mm,工作距离50mm,照射角膜时间均为30分钟。
  3.观察指标:交联后1天、3天、7天、14天,观察眼部分泌物、结膜充血、前房积脓及角膜浸润情况,给予炎症评分并行统计学分析;分别给予角膜照相并利用Image J软件对溃疡面积进行比较分析;同时蘸取所有实验眼溃疡表面坏死组织或分泌物进行细菌培养。交联后1天、7天、14天共焦显微镜观察炎症细胞变化,各组分别摘取两实验眼角膜,制作切片,HE染色,光学显微镜下观察其病理组织学改变。
  结果:
  1.三组实验眼眼部炎症评分比较:CXL治疗前,三组实验眼眼部炎症评分无统计学差异(P=0.814,P>0.05)。CXL治疗后第1天、3天、7天、14天,三组眼部炎症评分的差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.001、0.000、0.000、0.000,P<0.05),370组与对照组比较,差异均有统计学意义(P=0.000、0.000、0.000、0.000,P<0.05),440组和370组比较均无统计学差异(P=0.557、0.567、0.488、0.537,P>0.05)。至观察结束,对照组所有实验眼均角膜穿孔。
  2.每组眼部炎症评分变化:440组五个时间点评分有统计学差异(P=0.000,P<0.05),呈下降趋势。370组四个时间点评分有统计学差异(P=0.002,P<0.05),也呈下降趋势。对照组四个时间点眼部炎症评分有统计学差异(P=0.000,P<0.05),呈上升趋势。
  3.三组实验眼角膜溃疡面积比较:角膜交联治疗前及治疗后第1天、第3天,三组角膜溃疡面积均无统计学差异(P>0.05,P=0.881、0.845、0.066);治疗后第7天、第14天,对照组角膜溃疡面积显著大于440组和370组(P<0.05,q=5.895、5.571),而440组和370组角膜溃疡面积无统计学差异(P>0.05,q=0.323、0.582)。
  4.三组实验眼细菌培养结果:CXL前三组兔眼细菌培养均为阳性。CXL后第1天、3天、7天、14天,440组和370组细菌培养均转为阴性,而对照组均为阳性。
  5.三组实验眼病理结果:CXL后第1天,病理切片三组均可见角膜上皮缺失,大量炎性细胞聚集达深基质;第7天,对照组形成角膜全层脓肿,但后弹力膜尚完整,370组和440组可见角膜上皮多层愈合,溃疡组织内见新生血管、大量炎细胞及少量纤维母细胞增生;第14天,对照组溃疡加重,形成全角膜脓肿,后弹力膜仅部分可见,几近穿孔,370组和440组角膜上皮多层愈合,基质内新生血管、瘢痕组织及纤维母细胞增生,炎性细胞较前减少。
  6.三组实验眼共焦显微镜结果:CXL后第1天,三组实验眼溃疡处基质层内均见大量炎性细胞,CXL后第7天,440组和370组实验眼基质层内仍见大量炎性细胞,但少于对照组实验眼。CXL后第14天,440组和370组实验眼基质层内炎性细胞较前减少,对照组仍见大量炎性细胞。
  结论:
  1.440nm蓝光核黄素角膜交联能有效控制金黄色葡萄球菌感染的角膜溃疡。
  2.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡疗效与370nm紫外光A比较无显著差异。
  3.440nm蓝光核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡的安全性、远期疗效有待进一步研究。
  4.440nm蓝光核黄素角膜交联有望成为难治性角膜溃疡的治疗方法。
  第二部分 440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎的安全性研究
  目的:
  观察440nm蓝光核黄素角膜交联治疗兔细菌性角膜炎,对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜及视神经的影响,初步探讨其治疗细菌性角膜炎的毒副作用。
  方法:
  选取8只健康新西兰大白兔,浅基质法制作金黄色葡萄球菌角膜溃疡模型,每眼注射菌液0.08ml,余步骤同第一部分。24小时后造模成功,全麻下进行440nm蓝光核黄素角膜交联,步骤同第一部分。于交联治疗后第1天、第7天分别气栓处死4只兔子,摘取实验眼眼球,其中各两只放入4%多聚甲醛溶液中固定做病理切片,另四只眼球分别立即取下整个角膜,用锥兰一茜素红联合染色法对角膜内皮进行染色观察。
  结果:
  角膜交联后第1天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。角膜交联后第7天,角膜内皮染色未见异常,视网膜、脉络膜、巩膜及视神经病理组织切片未见异常。
  结论:
  440nm蓝光联合核黄素角膜交联治疗细菌性角膜溃疡安全性较好,未发现对角膜内皮、视网膜、脉络膜、巩膜、视神经造成组织学危害。
[博士论文] 田明霞
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  圆锥角膜是最常见的角膜扩张性疾病,常发生于青少年,表现为进行性的角膜前突并变薄,视力下降,散光增大,最终导致角膜瘢痕以及视力丧失。现在有很多研究证实核黄素/紫外线角膜胶原交联(Corneal collagen crosslinking,CXL)可以阻止圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆的发展。CXL是目前唯一可以从根本上改变圆锥角膜的生物力学和基质结构的不稳定性的方法。核黄素吸收365nm的紫外线后可以作为一种光敏剂,并产生氧自由基或单线态氧激活自然的赖氨酰氧化酶通路,从而使角膜胶原发生物理性交联。角膜胶原交联产生的光氧化反应使角膜内的胶原纤维共价结合,增加角膜的生物力学强度,并且增加角膜基质对酶降解作用的抵抗力,减少角膜胶原降解,从而阻止圆锥角膜的进展。由于圆锥角膜根据不同的标准可以分为不同的类型,假设圆锥角膜的类型不同可能对CXL治疗的效果产生影响。本研究对CXL治疗不同类型圆锥角膜的效果进行对比研究,并分析影响CXL治疗效果的因素。
  方法:
  研究对象2012年7月至2014年6月进行CXL治疗的进行性圆锥角膜患者60例(88眼)纳入本研究,纳入标准为在过去的1年中至少满足以下条件之一者:(1)角膜地形图最大曲率值增加1D及以上,(2)验光散光增加1D及以上,或等效球镜度增加0.5D及以上,(3)随访时间2年及以上,(4)排除其他急、慢性眼病史,角膜移植手术史,角膜厚度小于350μm,或者随访观察期间怀孕、哺乳者。根据圆锥角膜的分类方法共分为2个亚组:(1)中央型圆锥角膜组(以下简称中央组)和周边型圆锥角膜组(以下简称周边组),(2)原发性圆锥角膜组(以下简称原发组)和准分子激光术后角膜膨隆组(以下简称膨隆组)。
  核黄素/紫外线角膜胶原交联使用去角膜上皮的标准CXL方法。
  观察指标分别对各组患者CXL术前和术后2年的裸眼视力(Uncorrected distant visual acuity,UDVA)、最佳矫正视力(Best-corrected distant visual acuity,BDVA)、裂隙灯检查、验光、眼压、pentacam角膜地形图中角膜最大曲率(Maximum keratometry,Kmax)、平均角膜曲率(mean keratometry,Km)、角膜散光等的变化情况进行对比分析。
  统计分析所有数据采用IBM SPSS19.0统计软件进行统计学分析。两组样本之间采用独立样本t检验进行分析;性别比例采用卡方分析进行比较;同组术前术后的变化采用配对样本t检验进行分析;相关性分析采用偏相关分析方法,计算偏相关系数r。对取得显著性相关的变量进一步进行回归分析,获得与CXL术后效果独立相关的因素。所有结果均以P<0.05为具有统计学意义。
  结果:
  1.术前情况
  60例88眼圆锥角膜患者,术前平均年龄为22.1±5.1岁,男女比例为39∶21,平均发病时间为23.4±22.4个月,Kmax距角膜中心的平均距离为2.7±1.5mm,平均角膜厚度为439.7±61.0μm。
  中央组共44例64眼,周边组共16例24眼;术前两组年龄、性别、发病时间及角膜厚度相比均无明显统计学差异(P>0.05),而Kmax距角膜中心的距离却有明显差异(P<0.01)。
  原发组共45例67眼,膨隆组共15例21眼;术前两组年龄、性别、发病时间及角膜厚度相比均无明显统计学差异(P>0.05),而Kmax距角膜中心的距离亦有明显差异(P<0.01)。
  在44例中央型圆锥角膜组中,含5例角膜膨隆患者,占11.4%;在16例周边型圆锥角膜组中,含6例原发性圆锥角膜患者,占37.5%。
  2.CXL术后2年总体情况
  术前UDVA,BDVA分别是0.9±0.5和0.4±0.4logMAR,CXL术后2年提高至0.7±0.4和0.3±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  术前Kmax和角膜散光分别是61.5±14.7D和4.0±2.9D,CXL术后2年,Kmax和散光分别降低至57.0±10.4D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  3.CXL术后2年中央组与周边组疗效比较
  3.1两组UDVA与BDVA的比较
  中央组术前U DVA,BDVA分别是0.9±0.4和0.5±0.4logMAR,术后2年提高至0.8±0.4和0.4±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  周边组术前UDVA,BDVA分别是0.8±0.7和0.2±0.4logMAR,术后2年U DVA提高至0.4±0.4logMAR,与术前相比,差异具有统计学意义(P<0.01);BDVA提高至0.2±0.3logMAR,与术前相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
  中央组与周边组UDVA的变化值(术后-术前)分别是-0.1±0.2和-0.4±0.5logMAR,两者相比具有统计学差异(P<0.01)。而两组BDVA的变化值分别是-0.1±0.3和-0.04±0.2logMAR,两者相比无统计学差异(P=0.25)。
  3.2两组Kmax与角膜散光的比较
  中央组术前Kmax和散光分别是65.6±15.0D和4.6±3.0D,术后2年,Kmax和散光分别降低至60.1±10.3D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  周边组术前Kmax和散光分别是50.3±5.3D和2.4±1.7D,术后2年,Kmax下降至48.8±4.6D,与术前相比差异具有统计学意义(P<0.01),而散光值为2.2±1.8D,与术前相比差异无统计学意义(P>0.05)。
  中央组与周边组Kmax的变化值(术后-术前)分别是-5.6±8.3D和-1.6±2.1D,两者相比具有统计学差异(P=0.01);同样,散光的变化值分别是-1.3±2.2D和-0.3±0.8D,两者相比具有统计学差异(P=0.04)。
  4.CXL术后2年圆锥组与膨隆组疗效比较
  4.1两组UDVA与BDVA的比较
  圆锥组术前UDVA,BDVA分别是0.8±0.5和0.4±0.4logMAR,术后2年,UDVA,BDVA分别提高至0.7±0.4和0.3±0.3logMAR,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  膨隆组术前UDVA,BDVA分别是0.9±0.6和0.3±0.4logMAR,术后2年,UDVA,BDVA分别提高至0.6±0.4logMAR(P<0.01)和0.2±0.3logMAR(P>0.05)。
  圆锥组和膨隆组的UD VA的变化值(术后-术前)分别是-0.1±0.2和-0.2±0.3logMAR,BDVA的变化值分别是-0.1±0.2和-0.03±0.2logMAR,两组之间UDVA,BDVA的变化值相比均无明显统计学差异(P>0.05)。
  4.2两组Kmax与角膜散光的比较
  圆锥组术前Kmax,角膜散光分别是63.3±15.6D和4.5±3.0D,术后2年,Kmax,角膜散光分别降低至58.3±10.4D和3.3±2.2D,与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。
  5.相关性分析
  5.1患者年龄,发病时间与UDVA,BDVA,Kmax,角膜散光的变化值均无相关关系(P>0.05)。
  5.2术前角膜地形图中Kmax距角膜中心的距离与UDVA的变化值(术后-术前)呈负相关(r=-0.295,P<0.01),与Kmax和角膜散光的变化值呈正相关(r=0.239,0.265,P<0.05)。
  5.4术前角膜厚度与Kmax的变化值呈正相关(r=0.266,P=0.012)。
  6.回归分析
  6.1CXL术后2年U DVA的变化值(ΔUDVA)与Kmax距角膜中心的距离的回归方程式为:ΔUDVA=-0.024-0.066×Kmax距角膜中心的距离。
  6.2CXL术后2年Kmax的变化(ΔKmax)与角膜厚度的回归方程式为:ΔKmax=-18.606+0.032×角膜厚度。
  6.3CXL术后2年角膜散光的变化值(Δ角膜散光)与Kmax距角膜中心的距离的回归方程式为:Δ角膜散光=-1.957+0.34×Kmax距角膜中心的距离。
  结论:
  1.CXL治疗2年后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆可以得到明显控制;
  2.CXL对中央型圆锥角膜的控制效果优于周边型圆锥角膜;
  3.CXL对原发性圆锥角膜的控制效果优于准分子激光术后的角膜膨隆;更长期的效果还需进一步的观察和研究。
  4.CXL治疗2年后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆视力的提高与角膜曲率的降低与术前Kmax距角膜中心的距离、圆锥角膜的病变程度以及角膜厚度有关。
  5.回归分析表明,CXL术后圆锥角膜或屈光术后角膜膨隆的视力提高及角膜散光的降低与Kmax距角膜中心的距离相关,而Kmax的降低与角膜厚度相关。
[硕士论文] 赵玉婷
力学 太原理工大学 2017(学位年度)
摘要:角膜为生物软组织材料,在眼的屈光系统中占有重要的地位,其生物力学性能是维持角膜形态的基础,角膜的生物力学性能一旦发生变化,将会影响到眼球整体的屈光能力。同时,角膜的生物力学性能对角膜疾病如圆锥角膜、角膜外伤等的诊断与治疗及对屈光手术的设计、角膜接触镜的设计等都具有重要的参考价值。由于角膜的生物力学性能对角膜的特殊意义,研究人员需更加准确地测量角膜的生物力学性质及建立精准的角膜仿真计算模型。
  本文以猪角膜为研究对象,通过膨胀试验及有限元模拟的方法研究猪角膜的生物力学性能。
  1、主要研究工作如下:
  (1)搭建离体角膜膨胀试验系统,完善猪眼球整体膨胀试验方法,消除试验过程中巩膜位移对角膜位移的影响。采用眼球整体膨胀试验和角膜膨胀试验对猪角膜的力学性质进行离体测量,获得每种试验中角膜顶点位移—眼内压之间的关系。采用板壳理论,根据角膜顶点位移—眼内压之间的关系分别计算出两组试验中角膜的弹性模量及角膜的应变,并得到角膜的应力-应变曲线,将两组试验中得到的角膜弹性阶段的力学性质进行对比分析。
  (2)基于角膜微观结构,建立了考虑角膜胶原纤维分布的猪眼球整体膨胀试验的有限元计算模型。通过扫描电镜对猪角膜的板层结构进行观察并对角膜中的主要元素进行分析,通过透射电子显微镜观测不同眼内压作用下胶原纤维的形态。选用ABAQUS软件中与其结构相适用的 Holzapfel本构模型,对已有的 Holzapfel本构模型参数进行了合理调整,模拟了整体眼球试验中测得的角膜顶点位移-眼内压关系。得到眼内压在15.28-30.17mmHg时,与本文猪眼球整体膨胀试验更为匹配的 Holzapfel本构模型参数。以此为基础建立有限元模型,分析了猪角膜受到不同眼内压作用时所表现出来的力学性能,并讨论了 Holzapfel本构模型中三个主要参数其对角膜力学性能的影响。
  2、主要结论如下:
  (1)通过两组膨胀实验得出:在15.28-30.17mmHg时,猪眼球整体膨胀试验获得的弹性模量比角膜膨胀试验获得的数值小;猪眼球整体膨胀试验获得的应变比角膜膨胀试验获得的数值大;
  (2)通过扫描电子显微镜观测到角膜平行与角膜表面的板层之间为平行排列;通过透射电子扫描电镜观测:在0mmHg时,纤维呈弯曲形态;在30mmHg时,纤维被拉伸且局部有断裂。
  (3)在15.28-30.17mmHg时,模拟角膜受到不同眼内压时角膜的应力及位移状态。眼内压越高,角膜的应力及位移越大,但对应力及位移的分布影响较小。
  (4)计算 Holzapfel本构模型中三个主要参数其对角膜力学性能的影响,重点分析了沿纤维主方向,纤维的分散程度不同时对角膜的应力分布及位移的影响。胶原纤维沿角膜主方向的分散程度,影响角膜中应力的分布方向,但并不影响角膜位移分布的方向。当角膜眼内压相同时,纤维分散程度越大,角膜的应力分布越均匀,角膜顶点位移越小。
  以上通过猪整体眼球膨胀试验方法得到了角膜弹性阶段的力学性能、对角膜结构和主要化学元素的观测以及建立考虑角膜微观结构的有限元模型,为临床上角膜疾病的治疗及手术提供理论依据和技术指导。
[硕士论文] 欧阳慧玲
动物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:角膜病是当前致盲的主要眼病之一,在我国是继白内障疾病之后的第二大致盲眼病,约占15.4%。目前绝大多数严重威胁人类健康的疾病如糖尿病、高血压、冠状动脉疾病和精神分裂症,还包括儿童先天性缺陷如唇裂、鄂裂及许多先天性心脏病也都受到多基因的调控。本实验室采用ENU化学诱变的方法获得一种角膜混浊表型的小鼠模型,将其主基因鉴定为RAX并将该小鼠命名为RAX突变小鼠。本文是对RAX突变小鼠角膜特点及其修饰基因进行研究,主要分为以下三个方面:
  1、RAX无义突变小鼠角膜特点的研究
  本文以RAX无义突变小鼠为研究对象,将该小鼠与正常B6小鼠繁殖,筛选具有角膜混浊表型的杂合子小鼠。对角膜混浊小鼠眼球进行组织学分析发现,突变小鼠角膜基质层及角膜层明显变薄,且角膜表层细胞呈水泡样。再采用免疫组织化学的方法对该8W以上小鼠进行蛋白分子分析,结果显示突变小鼠角膜蛋白Cytokeratin12(K12)、Cytokeratin14(K14)、Cytokeratin13(K13)及PAX6均发生了变化。
  2、角膜混浊修饰基因的定位
  采用将B6背景角膜混浊杂合子小鼠与D2小鼠配种获得F1代小鼠,F1代小鼠继续回交B6获得[(B6×D2) B6]N2代的方案获得角膜混浊杂合子。筛选突变杂合子N2代小鼠1782只,其中180只小鼠表现有角膜混浊表型,通过基因连锁分析结果修饰基因与微卫星D1Mit145连锁(LOD值5.97),初步将该基因定位于小鼠第1号染色体上。为对该修饰基因进行精确定位,在1号染色体上增加微卫星密度,最终将该修饰基因定位于1号染色体68.38cM-74.68cM之内。
  3、角膜混浊修饰基因的鉴定
  根据定位结果,通过MGI数据库查询该小鼠修饰基因定位区域附近相关基因,并对相关基因进行基因功能分析,最终初步将候选基因确定为:Pou2f1。继而对候选目的基因设计引物,分别PCR扩增候选目的基因,切胶回收后测序,将以上测序结果与本实验中心野生型B6小鼠、D2小鼠基因序列进行对比,筛查突变位点。Pou2f1启动子部分三段引物分别为Pou2f1717、Pou2f1736、Pou2f1703;Pou2f1编码区部分三段引物分别为Pou2f1910、Pou2f11029、Pou2f1556。双向测序结果显示突变小鼠Pou2f1在基因编码区未发现重叠峰而在启动子区域发现多个单核苷酸多态性。
[硕士论文] 兰伟伟
生物医学工程 太原理工大学 2017(学位年度)
摘要:圆锥角膜是临床常见的眼科疾病。针对圆锥角膜的治疗方法有多种,其中角膜胶原交联术(corneal collagen cross-linking, CXL)能够有效阻止圆锥角膜进展,倍受青睐。CXL术后角膜基质的胶原纤维结构发生变化,应力状态重新分布,基质细胞生存的力学微环境发生了改变,细胞如何适应这种变化、并与之相互作用,是我们亟待解答的问题。
  非酶糖基化交联,在实现基质交联环境的同时可与细胞共凝,因此为体外研究 CXL术后角膜基质细胞与基质相互作用提供了良好的载体。本文通过添加核糖对胶原水凝胶实现非酶糖基化交联,探讨了胶原交联后圆锥角膜成纤维细胞形态、铺展、增殖以及细胞骨架的重排,为研究CXL术后角膜微环境改变对角膜基质细胞生物学行为的影响提供参考。论文主要工作如下:
  1.采用不同核糖浓度(0、50、100、150、200 mM)对鼠尾 I型胶原进行非酶糖基化交联,通过自行搭建的胶原薄膜力学特性检测系统检测了胶原水凝胶薄膜的弹性模量,采用共聚焦显微镜和扫描电镜观测了胶原微观结构。研究表明:随着核糖浓度的增加,胶原力学性能得到了一定改善,从180 Pa提高到470 Pa;胶原纤维的直径变粗。胶原水凝胶薄膜的力学性能和胶原纤维直径变化之间呈正相关性。
  2.原代提取培养圆锥角膜成纤维细胞,将其接种于胶原水凝胶的表面,采用 FDA-PI双色荧光法观测细胞活性;通过浮雕显微镜观察细胞形态变化;通过Image plus5.1软件对细胞铺展面积进行测量;采用WST-1检测对细胞增殖情况;通过对细胞核与细胞骨架的共染观察细胞骨架的重排情况,并测量了细胞核面积的变化。研究表明:随着核糖浓度的增加,细胞形态发生明显改变,细胞铺展面积以及细胞核面积变小;细胞活性未受到明显的影响,细胞的增殖随着核糖浓度的增加而降低;生长于低核糖浓度交联的水凝胶基底上的细胞肌动蛋白应力纤维更加明显。
  我们的研究表明非酶糖基化交联后的胶原水凝胶力学微环境发生明显变化,这种改变对圆锥角膜成纤维细胞的铺展、增殖及骨架重排等细胞行为均产生了一定的影响,适度的交联在提高胶原水凝胶力学性能的同时亦适合细胞的生长。这将为探索CXL术后角膜基质细胞与基质相互作用提供有价值的参考。
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