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[硕士论文] 张沛
水利工程 重庆交通大学 2018(学位年度)
摘要:呼伦贝尔地区是全球/区域变化的典型敏感地区,以温度增加和降水波动为特征的全球气候变化对呼伦贝尔地区的影响是显著的,近年来呼伦贝尔地区植被退化、沙漠化加速发展,草原生态系统遭到严重破坏。为了揭示呼伦贝尔地区水热条件时空变化特征及其生态效应影响,本文结合6期1990-2015年呼伦贝尔地区更新水体数据后的土地利用分类数据,利用土地利用转移矩阵和景观格局指数分析方法对1990-2015年呼伦贝尔地区土地利用/覆被和地表水体(含地表水体二级类)的面积动态变化特征、转移规律和景观格局特征进行了研究。然后利用呼伦贝尔地区内9个气象站1990~2015年逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温、平均气温距平、日照时数等热量资料,通过在ArcGIS中采用Kriging空间插值法得到区域的热量资料,以探求热量在时间序列上的年际变化特征,并按照年代将数据空间化,求取前后期热量在空间上的变化特征。最后选择植被覆盖指数作为呼伦贝尔草地生态系统的指示因子,分析水热条件时空动态变化与植被覆盖指数的联系,以探求水热条件时空动态变化的生态效应。研究发现:
  (1)由1990-2015年呼伦贝尔地区各土地利用/覆被类型的面积变化特征可知,呼伦贝尔地区的土地利用/覆被变化存在以耕地和居民地等人类活动为主的人为景观增多,以林地和草地等自然覆被为主的自然景观减少的客观形状。在呼伦贝尔地区土地利用/覆被变化的影响下,1990-2015年呼伦贝尔地区的地表水体面积呈现先增后减再增的整体趋势,在1995年达到最大值46759km2,25年间面积从1990年的3377km2增加到2015年的3451km2,共增加74km2。在各地表水体二级分类中,河渠、湖泊和滩地面积在25年内都呈先增后减再趋于稳定的变化趋势,而水库面积在1990-2005年保持稳定状态,从2005年以后呈增加趋势。
  (2)从1990-2015年呼伦贝尔地区地表水体的时空转移分析,与地表水体转移的一级土地利用类型主要为草地、林地、沼泽和未利用地,25年间,地表水体在与其他土地利用/覆被类型的转移上共净增加74km2,从局部变化期来看,1990-2000年,地表水体与其他土地类型发生转移较频繁,2000-2015年地表水体与其他土地类型发生转移较少。对1990-2015年呼伦贝尔地区地表二级类水体的时空转移分析,研究区各地表二级类水体转移趋势与总地表水体的转移趋势较为一致,同样是与草地、林地、沼泽和未利用地的转化较多,与耕地的转化相对较少,与居民地的转化最少。另外,地表二级类水体中各类之间的转化以河渠和滩地与其它地表水体二级类的转化较为剧烈。
  (3)1990-2015年呼伦贝尔地区的景观格局呈现出简单到复杂的变化过程。研究区的景观格局有微弱的倾向于复杂和不连续的斑块镶嵌体的变化趋势,研究区的优势景观占景观的比例趋于减小,且景观有被分割成不连续斑块的倾向,研究区的各土地利用/覆被类型越来越趋于均衡,弱势土地利用/覆被类型的占比有所增加。其中地表水体25年间呼伦贝尔地区地表水体破碎度数值较小,并保持稳定趋势,说明整体水体景观保存较好,连通性高,湖泊、水库等水体景观趋向于成为一个完整的整体,河渠则被分割成不连接斑块的程度越大。
  (4)由1990-2015年呼伦贝尔地区逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温年际变化特征可知,25年间,年均温、年平均最低气温和年平均最高气温变化趋势较为一致,均呈先增加后减小再增加的波动变化趋势。25年间日照时数整体趋势呈较小的减少趋向。1990-2015年间,呼伦贝尔地区平均温度距平只有2010年、2012年、2013年小于零,其它22年均大于零,说明呼伦贝尔地区在近25年内年平均气温高于多年平均气温,气温上升趋势明显。由1990-2015年呼伦贝尔地区年均温空间变化特征可见,呼伦贝尔大部分地区处于增温趋势,但增温趋势较小,处于0-1℃,这与之前得出的呼伦贝尔地区气温进入变暖趋缓的阶段的结论一致。
  (5)利用呼伦贝尔地区9个气象站点的气温和降水资料分别从年际、季候、生长季月变化角度分析该地区植被指数对水热条件时空变化的响应,研究发现降水变化是促使草地植被年际变化的主要因子,从季候水平来看,草地植被指数在不同季节对水热条件变化的敏感性不同,春季植被生长与气温关系密切,夏季草地植被生长受降水强度影响较大;从生长季月变化来看,5月份植被指数变化受气温变化影响较大,6月和7月植被指数变化受降水影响显著,植被生长对7月和8月降水变化具有一定的滞后性。
[博士论文] 辛英豪
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:中和抗体能够与病毒表面的抗原结合,从而阻止病毒吸附靶细胞受体,防止病毒侵入细胞,在抗病毒感染中发挥重要作用。因此,中和抗体是一种具有很好应用前景的抗病毒治疗制剂。但是,采用小鼠单克隆抗体技术制备的抗病毒中和抗体对于人或畜禽等动物存在异源性等特性,导致其临床应用受到限制。近年来,随着抗体制备技术的发展,制备人源或动物源的中和抗体成为研究热点。目前,针对人类免疫缺陷病毒、流感病毒、埃博拉病毒、登革热病毒等多种病毒的全人源中和抗体开发取得了显著进展,而且还发现人体内可能存在具有抗病毒中和作用的天然中和抗体。相对于人源中和抗体研究,猪等动物源中和抗体的开发尚处于起步阶段。
  猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的妊娠母猪繁殖障碍、仔猪严重呼吸系统症状和生长迟缓等临床表现的病毒性传染病。PRRSV感染或免疫能诱发很强的体液免疫反应,一般于感染后7~9d可检测到特异性抗体,但这些抗体对体内、外的病毒都没有中和能力甚至会增强感染,而有效的中和抗体一般出现于28d以后。由于中和抗体产生的时间晚、水平低,使该病的防治十分困难。为深入研究猪对PRRSV的抗体反应,本研究利用噬菌体展示技术构建了猪源抗体库,并从中筛选到具有中和能力的抗体。进一步研究发现筛选到的中和抗体为多反应性抗体,主要结合细胞蛋白KRT8(Keratin8)和MYH9(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A)。具体研究内容如下:
  1.猪源天然抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选
  分离PRRSV抗原、抗体阴性猪的PBMCs(Peripheral BloodMononuclear Cells),提取mRNA,利用RT-PCR技术扩增得到抗体重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因,通过overlap PCR将VH、VL用一条柔性多肽基因组装成scFv(single-chain antibody)片段。噬粒pComb3XSS与scFv片段经SfiⅠ酶切、回收、连接、电转化感受态细胞,获得库容为1.5×108的初级库,经鉴定插入片段大小的正确率为80%。通过测序发现VH序列的相似度介于63.3%~92.5%,未发现相同序列,说明抗体库的多样性好。与IMGT数据库比对发现天然库VH基因家族的分布符合文献报道的最多的3个基因家族占比>40%,最多的6个基因家族占比>70%的规律,而且天然库的VH基因分布于13个不同的基因家族,进一步证实构建的天然库具有很好的多样性。加入辅助噬菌体超感染获得重组噬菌体抗体库,用纯化的PRRSV病毒粒子进行筛选,获得4株噬菌体抗体N-28、N-36、N-48、N-67。将获得的抗体基因连接至pET-22b表达载体,经鉴定重组蛋白主要以包涵体的形式表达。对包涵体进行变性、复性后,测定了4株抗体中和PRRSV的能力,发现其中N-28、N-67具有一定的中和PRRSV的能力。
  2.猪源PRRSV免疫抗体库的构建与抗PRRSV抗体的筛选
  为筛选具有广谱抗PRRSV的中和抗体,首先用PRRSV商品化弱毒活疫苗免疫30日龄仔猪,然后用高致病性PRRSV毒株(WUH3株)、两种美国流行毒株(VR2385、VR2549)、国内分离的流行毒株(NADC30L)对仔猪进行感染。经过8次免疫/感染后,实验猪体内产生了针对PRRSV WUH3株、VR2385株、VR2549株和NADC30L株的高滴度中和抗体,中和效价介于1∶63.5~1∶858.7之间。分离高免疫猪的PBMCs,扩增抗体基因,经过多次电转获得库容为2×107的初级库,经鉴定插入片段大小的正确率为89.4%。通过测序发现VH序列的相似度介于70.3%~93.5%,未发现相同序列,说明免疫抗体库的多样性好;VH基因家族则由天然库的13个下降为6个,说明经过多次免疫/感染后试验猪的抗体基因使用率发生了明显的变化。用纯化的PRRSV病毒粒子对构建的抗体库进行富集、筛选,最终获得3株噬菌体抗体Ⅰ-2154、Ⅰ-1320、Ⅰ-141。将抗体基因连接至原核表达载体pET-22b中,表达纯化后测定了3株抗体对PRRSV WUH3株、VR2549株、NADC30L株的中和能力,结果表明3株抗体对3株病毒均有一定的中和作用,其中Ⅰ-141的中和效果最好。3株病毒对抗体的敏感度也不相同,其中NADC30L对Ⅰ-141最为敏感。进一步分析了Ⅰ-141对NADC30L的抑制机制,发现Ⅰ-141并不影响病毒的吸附而是抑制了病毒的侵入。
  3.scFv结合蛋白的质谱鉴定与功能研究
  首先用生物素标记的N-28、Ⅰ-141分别与感染或不感染PRRSV的MARC-145细胞裂解液孵育,用链霉亲和素偶联的磁珠分离与scFv结合的蛋白,然后对分离的蛋白进行了质谱鉴定。根据质谱结果检索PRRSV WUH3编码蛋白,在2个接毒组中均未能鉴定到病毒蛋白;对4个实验组鉴定到的蛋白分析发现有30种蛋白在4个实验组均能被鉴定到,提示N-28、Ⅰ-141可能为多反应性抗体。为了确认这两株scFv的多反应性,选择了KRT8、MYH9这两种已知在病毒感染细胞过程中发挥重要作用的蛋白作为研究对象,通过免疫共沉淀实验发现N-28、Ⅰ-141能与KRT8、MYH9发生互作,确认了这两种scFv的多反应性。然后在PK-15CD163细胞中干扰或超表达这两种蛋白,证实这两种蛋白参与了PRRSV的感染,并且在PRRSV侵入细胞过程中这两种蛋白的表达量上调。
[硕士论文] 吕梦婷
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种病毒性肠道传染病。自2010年底,由PEDV变异毒株引起的PED大规模暴发,给全球养猪业带来了严重的经济损失。目前尚无有效的药物用于该病的治疗,因此抗PED药物的开发成为研究热点。PEDV3C样蛋白酶(3CLpro)在PEDV增殖及致病过程中发挥关键作用,且在PEDV不同变异毒株中具有较好的保守性,因此,PEDV3CLpro可以作为开发抗病毒药物的重要靶标。而PEDV3CLpro和底物间相互作用机制的阐明将为靶向PEDV3CLpro特异性药物的研制提供理论依据。
  本实验室前期的分子生物学实验研究发现,PEDV3CLpro可以识别天然免疫信号通路中关键分子-NEMO的第231位(P1)谷氨酰胺并对其进行切割,当NEMO切割位点邻近的第229位(P3)谷氨酰胺突变为精氨酸(Q-P3-R)、赖氨酸(Q-P3-K)或丙氨酸(Q-P3-A)后,发现Q-P3-A突变体完全不能被PEDV3CLpro切割,而Q-P3-K和Q-P3-R突变体被PEDV3CLpro切割的程度减弱,表明P3位点的突变会影响NEMO被PEDV3CLpro识别和切割,提示NEMO P3位在PEDV3CLpro识别底物自身底物过程中可能具有某些特殊作用。但是,P3位氨基酸是如何影响底物被PEDV3CLpro识别的机制尚不清楚,因此,本论文利用分子动力学模拟针对PEDV3CLpro与NEMO之间的相互作用开展了以下研究:
  1.Western blot实验分析PEDV3CLpro识别NEMO P3位的特征
  有文献报道冠状病毒3CLpro底物P3位偏爱正电荷氨基酸和长侧链氨基酸,我们在分析PEDV3CLpro底物P3位偏爱性时,发现P3位偏爱性最高的氨基酸为天冬酰胺(N)。基于此,我们构建了NEMO229(QP3)位突变的2个突变体:Q-P3-E和Q-P3-N,将这两个突变体的真核表达质粒和实验室之前构建的NEMO野生型(WT)及3个突变体(Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R)的真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,通过Western blot实验检测不同转染体系中PEDV3CLpro对NEMO的切割程度。发现WT(无电荷、长侧链)、Q-P3-K(正电荷、长侧链)、Q-P3-R(正电荷、长侧链)可以被PEDV3CLpro切割,而Q-P3-A(无电荷、短侧链)不能被PEDV3CLpro切割,与本实验室前期实验结果相符;此外,Q-P3-E(负电荷、长侧链)及Q-P3-N(无电荷、长侧链)也可以被PEDV3CLpro切割,说明PEDV3CLpro底物NEMO P3位也可以是负电荷氨基酸。进一步分析发现在可以发生切割反应的体系的中,底物NEMO P3位均具有长侧链的特征,提示PEDV3CLpro底物NEMO P3位可能偏爱长侧链氨基酸。
  2.NEMO P3位点不同突变体与PEDV3CLpro间的自由能分析
  分子生物学实验是进行分子动力学研究的基石,而分子动力学研究可以从微观角度上观察到模拟体系原子尺度上的运动变化。为探究NEMO P3位点不同突变对PEDV3CLpro识别底物的影响,我们借助分子动力学模拟分析了NEMO野生型(WT)及5个突变体(Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E和Q-P3-N)与PEDV3CLpro间的自由能。发现Q-P3-A与PEDV3CLpro间的自由能值最大,说明Q-P3-A体系中酶与底物的亲和力最低,发生切割反应的可能性最小,与生物学实验证实Q-P3-A是唯一不能被切割的结果是一致的。
  3.NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割
  有文献报道:冠状病毒3CLpro底物P3位偏爱可以形成β-sheet结构的氨基酸,而PEDV也属于冠状病毒,因此,我们利用分子动力学模拟分析了不同突变体P3位点及其邻近氨基酸的二级结构变化,发现在可以发生切割反应体系中的NEMO(WT、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E、Q-P3-N)均存在由P3、P2形成的β-sheet结构;但是,在无切割反应发生的体系中的NEMO(Q-P3-A)则不存在由P3、P2形成的β-sheet结构,表明NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割。进一步利用分子动力学模拟分析了6个体系中底物P3、P2位β-sheet结构存在的时间,发现在WT、Q-P3-N、Q-P3-K中,P3、P2位的二级结构始终为β-sheet,在Q-P3-R中,P3、P2位的二级结构由β-sheet逐渐转变为loop,在Q-P3-E中,P3、P2位的二级结构由loop逐渐转变为β-sheet,而在Q-P3-A中,P3、P2位的二级结构由β-sheet很快转变为loop,表明NEMO P3位的突变会影响P3、P2位β-sheet结构的形成和维持。
  4.NEMO P3位点的突变影响PEDV3CLpro酶活位点H41和C144间的距离
  在证实NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割后,利用分子动力学模拟对其作用的具体机制进行了分析。发现当底物P3、P2位二级结构由β-sheet转变为loop时,底物P2位氧原子构象由溶剂化表面翻转至PEDV3CLpro酶活口袋方向,底物P2位氧原子构象的变化又导致PEDV3CLpro上S2口袋氨基酸中H41的构象发生了改变,而H41构象的改变,则导致了其与另一个酶活位点C144间的相对定位发生了改变。而PEDV3CLpro酶促反应的第一步是H41上的N夺取C144上-SH的H,暗示H41和C144间的距离对酶促反应的发生至关重要。因此,进一步分析了PEDV3CLpro H41和C144间参与酶促反应的重原子间距,发现在不同体系中,H41和C144间的距离波动差异明显,表明NEMO P3位的突变会影响PEDV3CLpro酶活位点H41和C144间的距离。此外,我们分析了酶活位点间距和NEMO的切割程度间的相关性,发现二者的相关性系数为0.846,表明二者之间具有强相关作用,说明PEDV3CLpro中H41和C144间的合适距离是影响其对NEMO切割的重要因素。
[博士论文] 黄海波
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸腺是T细胞发育的场所,其稳态的维持对免疫系统的正常发育具有重要意义。由于血-胸腺屏障的存在,胸腺曾经被视为免疫豁免器官,在感染性疾病的研究和防治工作中被忽视。近来大量的证据表明胸腺是多种病原物的靶器官。鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)是一类具有严重危害性的人畜禽共患病原微生物,该菌感染可导致雏禽多个器官损伤,甚至个体死亡。然而有关该菌感染对雏鸡胸腺的影响及其机理的研究极为匮乏。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是该菌的主要毒力因子,常用于该菌致病机制的研究。LncRNAs是近来发现的一类不编码蛋白质的长链RNA,可直接以RNA形式调控生命活动。转录组研究可以全面地反映所有RNA的表达规律和功能属性,在家禽疾病研究中发挥着越来越重要的作用。因此,本研究的目的是首先从器官、组织和细胞层面检测S Typhimurium及其LPS刺激对雏鸡胸腺的影响,然后进一步从mRNAs和lncRNAs转录组层面系统地研究LPS刺激诱导雏鸡胸腺损伤的机制,进而为家禽细菌性疾病的防控提供理论基础。本研究取得的主要结果如下:
  (1)S.Typhimurium感染导致雏鸡胸腺损伤,表现为细胞大量死亡和器官萎缩。与生理盐水组相比,雏鸡胸腺皮质区细胞死亡数目在5×104CFU S Typhimurium感染后36h达到最大值,显著增加到3.81倍(P<0.05)。胸腺重量和胸腺指数在细菌感染后72h达到最小值,分别显著下降了43%(P<0.01)和26%(P<0.05)。HE染色结果显示,雏鸡胸腺组织皮质和髓质分界清晰,结构完整。
  (2)Salmonella LPS刺激比沙门氏菌刺激更快地诱导雏鸡胸腺损伤。与生理盐水组相比,雏鸡胸腺皮质区细胞死亡数目在50mg/kg Salmonella LPS刺激后12h达到最大值,Forrnamide-MAb和TUNEL方法检测到细胞死亡数目分别显著增加到2.95倍和5.23倍(P<0.001)。雏鸡胸腺质量和胸腺指数在LPS刺激后36h达到最小值,分别显著下降了35%(P<0.01)和20%(P<0.05)。胸腺组织结构在LPS刺激后同样未受到破坏。此外,脾脏中chT1+细胞亚群的比例,以及脾脏和胸腺中的CD4+/CD8+细胞亚群的比例在LPS刺激后36h均未发生显著变化。雏鸡胸腺髓质区和皮髓质交界处的肥大细胞数量以及皮质区的巨噬细胞标记物LEP100的表达在LPS刺激后12h达到最大值,分别显著增加到1.90和3.69倍(P<0.05)。
  (3)1767个雏鸡胸腺mRNAs在Salmonella LPS刺激后显著差异表达(P<0.001,|log2(fold change)|≥0.585)。Poly(A)+RNA-seq获得158978794个高质量的长50bp的单端有效读段(clean reads),其中约77.05%的读段可以匹配到鸡的基因组。873、536和856个mRNAs的表达量在12h vs.0h、36hvs.0h和72h vs.0h的比较中存在显著差异。在12hvs.0h比较中上调mRNAs被注释到炎症反应、免疫反应等过程,以及急性时相反应信号等通路;下调mRNAs被注释到细胞分裂、染色体分离等过程,以及Polo样激酶介导的有丝分裂等通路。在36hvs.0h比较中上调mRNAs被注释到抗菌应答、抗革兰氏阴性菌应答等过程,以及急性时相反应信号等通路;下调mRNAs被注释到着丝粒组装和染色体分离等过程。在72h vs.0h比较中上调mRNAs主要与代谢活动相关;下调mRNAs主要与细胞死亡、代谢和免疫活动相关。因此,在雏鸡胸腺损伤最严重的时期(12h和36h),差异表达的胸腺mRNAs主要涉及免疫反应和细胞分裂活动。整合通路分析结果进一步显示LPS可能通过TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路诱导雏鸡胸腺的炎症反应,进而促使DNA损伤和细胞周期阻碍。
  (4)鉴定了5520个雏鸡胸腺lncRNAs。rRNA-depleted RNA-seq获得385393591对高质量的长150bp的双末端有效读段,其中约79.66%的读段可以匹配到鸡的基因组。通过读段的组装和转录本的筛选,最终鉴定了2283个基因间型lncRNAs、2810个内含子型lncRNAs和427个反义链型lncRNAs。88.59%的lncRNAs是最新发现。与鸡mRNAs相比,鸡lncRNAs的外显子较长,外显子数目较少。
  (5)111个雏鸡胸腺lncRNAs在Salmonella LPS刺激后显著差异表达(Q-value<0.05,|log2(fold change)|≥1)。在12h vs.0h比较中有47个lncRNAs差异表达,它们分别对应了1260个邻近mRNAs(cis-mRNAs)和2811个共表达mRNAs(co-mRNAs)。在36hvs.0h比较中有81个lncRNAs差异表达,分别对应了1766个cis-mRNAs和3203个co-mRNAs。在12h vs.0h比较中差异表达lncRNAs的cis-mRNAs注释于染色质沉默和蛋白激酶的负调节等过程,以及贾纳斯激酶-信号传导及转录活化因子和丝裂原活化蛋白激酶信号等通路;差异表达lncRNAs的co-mRNAs注释于细胞分裂和LPS应答等过程,以及细胞周期等通路。在36hvs.0h比较中差异表达lneRNAs的cis-mRNAs注释于免疫反应和细胞分裂等过程,以及卵母细胞减数分裂和贾纳斯激酶,信号传导及转录活化因子等通路;差异表达lncRNAs的co-mRNAs注释于炎症反应和细胞分裂等过程,以及细胞周期、细胞因子和细胞因子受体互作等通路。因此,在雏鸡胸腺损伤最严重的时期,差异表达的胸腺lncRNAs也主要涉及炎症反应和细胞分裂活动。通路可视化分析结果进一步显示在TLR-MAPKs-Cytokines和细胞周期通路中的大部分mRNAs均有与之共表达或者邻近的lncRNAs,因而lncRNAs也可能通过以上这些通路参与Salmonella LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程。
  (6)实时荧光定量PCR试验检测了22个mRNAs和6个lncRNAs的表达。为验证RNA-seq结果,将10个差异mRNAs的实时荧光定量PCR结果与Poly(A)+RNA-seq结果进行比较,二者表达趋势一致,具有显著强相关性(P=1.65e-8,r=0.828)。6个差异lncRNAs的表达模式也与rRNA-depleted RNA-seq结果基本一致,且二者同样具有显著强相关性(P=2.28e-4,r=0.871)。因而Poly(A)+RNA-seq和rRNA-depleted RNA-seq可以分别真实地反应雏鸡胸腺mRNAs和lncRNAs的表达模式。在LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程中,基因转录变化很迅速,6个mRNAs的表达量早在刺激后2~6h显著上调。S.Typhimurium感染诱导确实可以使如上10个mRNAs的表达呈现类似的趋势,但是其峰值相对LPS刺激滞后。因此,STyphimurium可能主要通过LPS来影响雏鸡胸腺基因表达。除了以上10个mRNAs以外,Poly(A)+RNA-seq和实时荧光定量PCR试验均显示LPS刺激可以上调雏鸡胸腺TLR4通路和氧化应激通路中的6个mRNAs的表达,下调细胞周期6个mRNAs的表达。
  综上所述,本研究证明了S Typhimurium感染及其LPS刺激均可导致雏鸡胸腺损伤。TLR4-MAPKs-FOS/JUN通路在这个过程中可能起着重要的调节作用,lncRNAs也可能通过如上通路参与了LPS诱导的雏鸡胸腺损伤过程。
[博士论文] 方谱县
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:冠状病毒(Coronavirus,CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae),其感染宿主范围十分广泛,包括鸟类、人以及其他哺乳动物。根据国际病毒分类委员会第九次报告,冠状病毒可分为α、β、γ、δ4个属。在冠状病毒编码的蛋白中,除了传统的结构蛋白和非结构蛋白,还存在数量不等、零散分布在结构蛋白之间或内部的辅助蛋白(accessory protein)。这些辅助蛋白具有种属特异性,与其他已知蛋白没有同源性或者同源性非常低。根据目前关于SARS-CoV等冠状病毒辅助蛋白的研究结果,证实冠状病毒辅助蛋白是病毒复制非必需的,但参与了免疫调控,并且与病毒的毒力相关。
  2014年美国首次报道猪场爆发猪δ冠状病毒(PDCoV),引起新生仔猪的腹泻、呕吐、死亡。随后,多个国家报道了该病的发生与流行,引起养猪业的高度关注。根据基因组序列预测PDCoV可编码两个辅助蛋白NS6和NS7,但没有得到实验验证,其功能也有待分析。另外,除了NS6和NS7外,PDCoV是否还编码其它的辅助蛋白也不清楚。因此,本研究以PDCoV CHN-HN-2014毒株为代表,对其假定编码的辅助蛋白进行鉴定,同时探究它们与宿主天然免疫反应之间的关系。具体研究内容如下:
  1.PDCoV辅助蛋白NS6的鉴定
  参照PDCoV CHN-HN-2014全基因组序列,设计两条特异性引物(Leader-F,NS6r),分别位于基因组5'端前导序列以及NS6基因3'末端。提取病毒感染的细胞总RNA,进行RT-PCR和测序分析,结果显示NS6是一个独立的亚基因组(subgenomic RNA,sgmRNA),采用了非经典的调控序列(transcription regulating sequences,TRS),且位于预测的TRS上游。随后,通过单克隆抗体的制备成功获得两株稳定分泌NS6特异性抗体的杂交瘤细胞。间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析表明:两株单抗(2G3和4B9)可特异性识别过表达的NS6蛋白或PDCoV感染的LLC-PK1细胞,证实NS6蛋白在病毒感染早期表达,而且定位于细胞质中。进一步分析发现,NS6蛋白主要定位于内质网和内质网高尔基体室,部分定位于高尔基体。这些结果首次证实了NS6蛋白在PDCoV感染细胞中的表达,而且NS6是一个独立的亚基因组,采用了非经典的TRS(ACACCT)。
  2.PDCoV辅助蛋白NS7的鉴定及NS7a的发现
  根据预测的PDCoV NS7的序列,设计引物将预测的NS7基因克隆至pGEX-KG原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-KG-NS7。随后,经IPTG诱导表达获得GST-NS7融合蛋白,进一步通过单克隆抗体制备成功获得4株稳定分泌NS7蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞。IFA证实4株单克隆抗体都能特异性识别PDCoV感染的或过表达NS7的LLC-PK1细胞。Western blot分析发现,4株单克隆抗体与PDCoV感染的细胞反应时,除了能检测到NS7蛋白条带外,还出现了一条大小约12kDa的特异性蛋白条带。但是,这个小蛋白条带在过表达NS7的细胞中并没有出现。随后,通过分析PDCoV感染细胞后病毒的亚基因组RNA,发现存在一条采用非经典TRS的新的亚基因组RNA,其ORF的3'末端与NS73'末端完全相同,可编码大小为100个氨基酸的多肽,说明可能存在一个新的辅助蛋白,将其命名为NS7a。进一步研究发现,过表达的NS7a蛋白能被4株针对NS7的单克隆抗体特异性识别,并且与病毒感染条件下检测到的较小的蛋白大小一致。这些结果表明PDCoV确实编码了一个新的辅助蛋白NS7a,是一个独立的亚基因组,而且采用了非经典的TRS(ACCCCA)。
  3.PDCoV辅助蛋白NS6拮抗IFN-β产生的机制
  先前的研究已经证实PDCoV编码了3个辅助蛋白(NS6、NS7、NS7a),但是这些辅助蛋白是否也具有免疫调节功能尚不清楚。因此,我们以NS6为代表对PDCoV辅助蛋白调控天然免疫的特性进行了进一步研究。将NS6克隆至pCAGGS-HA载体中获得真核表达质粒pCAGGS-HA-NS6,转染细胞进行超表达,发现NS6蛋白能显著抑制仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β蛋白表达,而且抑制SeV诱导的关键转录因子IRF3和NF-κB的磷酸化以及入核,表明NS6蛋白能够拮抗IFN-β产生。但令人惊奇的是,NS6蛋白对RLRs(RIG-I-like receptors)信号通路关键分子(RIG-I/RIG-IN、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3)介导的IFN-β启动子活性并没有抑制作用,提示NS6蛋白可能靶向RIG-I/MDA5或其上游。同时,通过免疫共沉淀实验(Co-IP)和IFA分析发现,NS6与RIG-I/MDA5存在相互作用,而且这种相互作用并不依赖于RNA;进一步分析表明,NS6蛋白与RIG-I的CTD区域以及MDA5的Hel和CTD区域发生相互作用,RNA pull-down分析证实NS6不是一个RNA结合蛋白。随后的Co-IP竞争性试验结果也证实NS6蛋白能显著减弱RIG-I/MDA5与dsRNA的结合。上述结果表明NS6采用了一种新的免疫抑制策略,抑制RLRs介导的IFN-β产生。
[博士论文] 郝兴杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)和基因组选择(Genomic Selection,GS)已经成为研究人类和动植物复杂性状遗传基础和表型预测的重要手段。随着测序技术的发展,人类和动植物基因组的功能注释不断完善,在GWAS和GS中整合SNP的生物学注释信息将有利于复杂性状遗传基础的挖掘和表型预测准确性的提高。因此,本研究基于混合线性模型分别在GWAS和GS中提出整合功能注释信息的策略和模型,建立了整合先验生物学信息的全基因组最佳线性无偏预测(incorporate Prior biological information in Genomic Best Linear Unbiased Predictor,pGBLUP),整合多种注释信息鉴定性状相关组织(Scalable Multiple Annotation integration for trait-Relevant Tissue identification and usage,SMART)两种遗传学分析方法。本研究的主要研究结果如下:
  (1)建立了pGBLUP模型和方法,通过模拟比较pGBLUP和常见基因组选择方法(GBLUP和BayesR),发现pGBLUP使用生物学注释信息可以提高基因组选择功效,但对注释信息的功能也存在依耐性;
  (2)pGBLUP模型可以被拓展后用于遗传力富集分析,可以准确估计不同功能注释信息的遗传力富集程度,作为衡量不同功能注释对性状性状影响的指标;
  (3)pGBLUP应用于奶水牛基因组选择,奶牛产奶性状QTL区域对奶水牛产奶性状具有中等较弱的遗传力富集(fe<5),在奶水牛样本量有限(412头)的情况下,整合奶牛产奶性状QTL信息以提高奶水牛产奶性状基因组选择的效果不明显,但pGBLUP为将来在小群体中整合先验生物学功能信息进行基因组选择提供了策略;
  (4)pGBLUP应用于仔猪八字腿功能注释信息遗传力富集分析,鉴定出了在仔猪八字腿遗传力上高度富集(fe>100)的7条KEGG信号通路,其中信号通路KEGG_MTOR_SIGNALING_PATHWAY控制肌肉发育,值得进一步深入研究;
  (5)建立了SMART模型和方法,通过模拟测试以及真实数据应用,发现SMART整合多种注释信息有利于准确鉴定性状相关组织(细胞),且利用SMART鉴定的性状相关组织构建的SNP权重,可以提高SNP-set检验功效,在GWAS中鉴定出更多的位点;
  (6)SMART应用于人类复杂性状和基因组功能注释公共数据:根据性状与组织相关性,将43个性状分层聚为5大类,从整合多组学功能注释信息角度发现性状之间的相关关系;同时对不同组蛋白注释信息效应的估计,发现组蛋白H3K4me1和H3K4me3具有较大效应,适合进行基因组功能预测。
  总之,本研究建立了整合功能注释信息的基因组选择方法pGBLUP和全基因组关联分析方法SMART,通过整合功能注释信息提高基因组选择和全基因组关联分析的功效,将为复杂性状遗传基础的研究和表型预测提供新的思路和工具,有助于通过整合和利用动物多组学功能注释信息加快动物的遗传选育。
[博士论文] 杨新
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文对湖北省山羊主要寄生蠕虫开展分子流行病学调查方面的研究。论文主要包括文献综述,描述已取得成果的八个章节以及讨论。文献综述发现了一些需要解决的问题(第一章),这些问题主要包括山羊寄生虫分子流行病学调查、山羊寄生虫的分子鉴定与诊断以及山羊线虫的抗药性。
  本研究的目的是针对这些需要解决的问题开展相关方面的研究,包括:(1)通过对湖北省山羊寄生蠕虫的调查明确其流行情况;(2)对调查中发现的重要前后盘吸虫开展线粒体基因组的研究,为今后的分子流行病学、种群遗传结构以及遗传进化分析的研究提供更多的分子标记;(3)针对优势虫种捻转血矛线虫建立环介导等温扩增检测方法用于捻转血矛线虫病的特异性诊断;(4)同时,对湖北省山羊消化道线虫的抗药性进行调查,为该地区山羊寄生蠕虫病的防控提供参考。
  结合形态学检测技术及基于PCR的DNA测序方法对张港镇(第二章)及罗田县(第三章)放牧山羊寄生蠕虫感染情况进行调查,结果表明山羊寄生蠕虫,尤其是消化道线虫,全年都维持在较高的感染水平,线虫在2月份、5月份、9月份和12月份会出现感染的小高峰;吸虫感染主要出现在3-8月份,这可能与中间宿主螺蛳的活动相关;绦虫感染没有明显的季节动态。山羊寄生蠕虫主要包括捻转血矛线虫、蛇形毛圆线虫、奥斯特线虫、鞭虫、粗纹食道口线虫、前后盘吸虫、矛形双腔吸虫、肝片吸虫、胰阔盘吸虫、细颈囊尾蚴和扩展莫尼茨绦虫,优势虫种为捻转血矛线虫、前后盘吸虫及细颈囊尾蚴。
  针对重要前后盘吸虫长菲策吸虫(第四章)、荷包腹带吸虫(第五章)及野牛平腹吸虫(第六章)开展线粒体基因组的测序与分析,为后续的分子流行病学、种群遗传结构以及遗传进化分析的研究提供有用的分子标记。结果表明长菲策吸虫、荷包腹袋吸虫及野牛平腹吸虫线粒体基因组具有相同的基因排序,并且,基于线粒体全基因组的遗传进化分析表明三种前后盘吸虫与鹿前后盘吸虫的亲缘关系最近,这与它们在分类学上的关系相一致(第四至六章)。
  针对优势虫种捻转血矛线虫核糖体第二内转录间隔(ITS-2)建立了环介导等温扩增检测方法,并将该方法用于生产实践中捻转血矛线虫病的诊断,结果表明该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强及省时的优点(第七章)。
  在山羊寄生蠕虫调查过程中,发现驱虫药的超剂量使用在山羊驱虫过程中十分普遍,尤其是伊维菌素。为了验证是否存在抗药性,结合粪便虫卵计数减少实验(FECRT)及死后剖检在湖北省张港镇及罗田县放牧山羊中开展抗药性的调查,结果首次证明张港镇(第八章)和罗田县(第九章)山羊消化道线虫存在苯并咪唑、左旋咪唑及伊维菌素抗药性。
  本研究对于湖北地区山羊寄生蠕虫流行病学调查、重要吸虫分子生物学特性及抗药性检测等方面的研究具有重要的意义。本研究的结果为湖北省山羊寄生蠕虫的后续研究及其防控提供参考(第十章)。虽然本研究主要关注山羊优势寄生蠕虫,但本研究的结果对于我国其它家畜寄生蠕虫的系统研究具有借鉴意义。
[博士论文] 李中华
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起的新型猪流行性腹泻在世界范围内暴发,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。然而,当前防控手段的匮乏无法应对PED带来的威胁。因此,研究PEDV的致病机理以及开发抗PEDV药物对PED的防控和治疗具有深远的意义。
  本研究基于iTRAQ技术,开展了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠组织的比较蛋白质组学分析,为揭示PEDV的致病机理和宿主的免疫应答提供参考。根据蛋白质组学的分析结果,研究了hnRNP A1和PEDVN蛋白的互作关系,为揭示PEDV的复制过程提供参考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并阐明了其抗病毒机理,为PEDV的治疗和相关药物的开发提供了参考。主要研究内容如下:
  1.PEDV强毒株及其致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学分析
  本研究使用iTRAQ定量蛋白质技术结合液相二级质谱技术(LC-MS/MS),研究了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学变化。在强毒株YN13株感染组和弱毒YN144感染组分别鉴定到269和301个差异表达蛋白。生物信息学分析发现,差异蛋白主要涉及应激反应,信号转导和免疫反应等过程。进一步分析发现,PEDV感染可以导致多种干扰素刺激基因的上调表达,表明PEDV感染会诱导宿主的先天性免疫过程。通过对比分析两感染组的蛋白,发现许多热激蛋白家族成员和一些转录翻译相关因子在两组中呈现不同的表达情况,提示这可能是造成两毒株致病性差异的因素。
  2.核不均一蛋白A1(hnRNP A1)参与PEDV的复制过程
  根据蛋白质组学结果,发现hnRNP A1在两病毒感染组表现为不同的表达情况,提示该蛋白的变化可能会造成病毒致病力的变化。首先研究了该蛋白在细胞中定位情况,通过共聚焦试验发现该蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位,表明两者之间存在互作关系。使用免疫共沉淀技术,进一步确认了两者之间的互作关系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位区主要位于核周,而核周是冠状病毒复制转录复合体存在的位置,提示hnRNP A1可能参与了该复合体的组成,进而参与了PEDV的复制过程。为了验证hnRNP A1是否参与了PEDV的复制过程,通过siRNA沉默hnRNP A1的表达,而后使用不同PEDV毒株感染。通过间接免疫荧光试验、荧光定量RT-PCR和Western blot试验发现hnRNP A1沉默后,PEDV的基因组、PEDV感染的细胞数量以及PEDV N蛋白的表达量都显著减少,说明hnRNP A1参与了PEDV的复制过程。结合蛋白质组学结果,推测hnRNP A1在YN144感染组的下调表达是造成两病毒毒力差异的原因之一。
  3.槲皮素抗PEDV研究
  通过间接免疫荧光和Western blot试验,发现槲皮素可以有效抑制PEDV的感染过程。首先研究了槲皮素对PEDV吸附和入侵过程的影响,发现其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero细胞,表明槲皮素抗PEDV的作用发生在病毒入侵宿主细胞之后。由于槲皮素是一种很好的HSPA1抑制剂,其可能通过抑制HSPA1发挥抗PEDV效果。为验证此设想,使用siRNA沉默HSPA1的表达,然后再感染PEDV,通过荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot试验发现PEDV的感染过程并未受到影响。表明槲皮素的抗病毒效果并不依赖其HSPA1抑制剂的活性。通过Docking分析,发现槲皮素可以结合于PEDV3C样蛋白酶的活性位点,表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表达纯化了PEDV的3C样蛋白酶,通过表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)验证了两者可以发生互作。为验证槲皮素是否可以抑制PEDV3C样蛋白酶的活性,建立了一种荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法,通过该方法发现纯化的蛋白具有很好的酶活性,在酶反应体系中加入槲皮素,发现PEDV3C样蛋白酶的活性受到显著抑制,而且抑制效果呈剂量依赖性。因此,认为槲皮素可以通过抑制PEDV3C样蛋白酶的活性而发挥抗PEDV效果。
[硕士论文] 李赞
特种经济动物饲养 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:抗苗勒氏管激素(AMH)是转化生长因子β超家族(TGF-β)成员之一,由雌性动物的卵巢分泌,并通过2型受体(AMHR2)发挥其生物学效应。AMH主要通过抑制原始卵泡的募集、降低有腔卵泡对FSH的敏感性而参与调控卵泡生长发育,AMH还可作为评估卵巢储备能力、预测超排反应的有效标志物。然而,有关AMH基因功能的研究多集中于对类固醇激素的调控上,AMH对卵母细胞体外成熟尤其是卵丘扩展的研究报道较少。因此,本实验以昆明鼠的卵母细胞为研究对象,采用体外培养、RT-PCR、Western Blot、ELISA等方法,分别研究AMH对裸卵和卵丘卵母细胞复合体体外成熟的影响,分析AMH对卵丘扩展的调控作用,为提高卵母细胞的利用率奠定基础。主要研究结果如下:
  (1)AMH及其受体在小鼠卵巢中的表达。通过检测不同日龄小鼠卵巢中AMH及AMHR2的表达,发现AMH和AMHR2在14日龄时表达量最高;还发现AMH仅在卵丘颗粒细胞中表达,而AMHR2在卵丘颗粒细胞与卵母细胞中均有表达,并且AMHR2的表达量随着卵母细胞的发育呈现逐渐下降的趋势,GV期卵母细胞中AMHR2的表达显著高于MI期卵母细胞(P<0.05)。
  (2)AMH对体外培养裸卵成熟率的影响。在裸卵培养液中分别添加不同浓度的rh-AMH(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL),体外培养14h后,发现裸卵的成熟率与AMH浓度呈剂量依赖关系,其中100ng/mL添加组成熟率最高,且均显著高于对照组和低剂量添加组(P<0.05);随着AMH浓度的升高,MPF的含量逐渐增加,BMP15的表达量逐渐升高;此外,AMH添加组能极显著降低胞质中cAMP含量(P<0.01)。可见,AMH可能是通过上调BMP15表达、促进MPF分泌与降低cAMP的途径来促进裸卵的体外成熟。
  (3)AMH对卵丘卵母细胞复合体(COC)体外成熟的影响。将100ng/mL AMH与100ng/mL FSH单独或联合添加于卵丘卵母细胞复合体(COC)体外培养体系,分析AMH对COC体外成熟的影响。结果发现,与对照组相比,添加100ng/mL AMH对COC的体外成熟无显著性影响(P>0.05);与FSH单独添加组相比,AMH与FSH联合添加组中COC的成熟率显著降低(P<0.05),提示AMH能抑制FSH对卵母细胞体外成熟的促进作用;此外,还发现AMH能显著抑制FSH促卵母细胞MPF分泌的作用。
  (4)AMH对体外卵丘扩展的调控作用。将100ng/mL AMH与100ng/mL FSH单独或联合添加于卵丘卵母细胞复合体(COC)体外培养体系,分析AMH对卵丘颗粒细胞扩展的调控作用。结果显示,AMH单独处理组对卵丘扩展没有影响,而FSH添加组能显著促进卵丘颗粒细胞的扩展(P<0.05);与FSH单独处理组相比,AMH与FSH联合处理组能显著降低卵丘扩展指数(P<0.05),提示AMH能抑制FSH对卵丘扩展的促进作用。采用RT-PCR法检测各处理中与卵丘扩展相关基因的表达,发现AMH能显著上调卵丘颗粒细胞中Ptgs2mRNA的表达(P<0.05),而Has2、PTX3和Tnfaip6基因的表达无显著性差异;FSH处理组中Has2、PTX3和Tnfaip6的表达显著升高(P<0.05),而AMH能抑制FSH对Has2、PTX3和Tnfaip6基因表达的上调作用。
  综上所述,高浓度AMH能显著促进裸卵的体外成熟,但对COC的成熟及卵丘扩展无影响,且AMH能抑制FSH促COC体外成熟及促卵丘扩展的作用。
[博士论文] 刘会敬
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪是肉类蛋白的主要来源,同时,也可作为研究人类健康问题的重要医学模型。骨骼肌是动物体内最丰富的组织,因此研究猪骨骼肌的生长发育对肉质生产科学和人类医学都具有重大意义。本研究以生长速度和肉质性状存在显著差异的约克夏猪和通城猪作为研究对象,采用RNA-seq技术,探索了妊娠期40,55,63,70和90天两猪种胚胎背最长肌差异表达基因不同的时序性表达规律,推测了两猪种间肌纤维发育差异的时间拐点,在此基础上探究中外猪种在妊娠时期胚胎骨骼肌发育的分子调控机理;使用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术,检测了妊娠期55天两猪种胚胎背最长肌的差异甲基化图谱,分析了两猪种差异DNA甲基化对肌纤维发育的调控;并对转录组测序数据和全基因组重亚硫酸盐测序数据进行了联合分析,分析了DNA甲基化对两猪种肌纤维发育过程中差异表达基因的调控作用,主要研究内容和结果如下;
  1.利用RNA-seq技术获得了通城猪和约克夏猪妊娠5个时期的胚胎背最长肌的转录组表达谱,并利用荧光定量PCR验证了测序结果的可靠性。在通城猪和约克夏猪分别筛选到1317个和691个差异表达基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分别对上述通城猪和约克夏猪的发育依赖的DEGs进行时序性分析,发现了在两个猪种中都显著富集到的表达模式0,39,20和21,表达模式10,11,13和25只在通城猪中显著富集,表达模式14和15只在约克夏猪中显著富集。分别对通城猪和约克夏猪的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,结果发现两猪种共同表达模式39显著富集的GO条目中均发现了多个与肌肉生长发育相关的GO条目;共同表达模式0显著富集的GO条目中均发现了多个与细胞周期相关的GO条目。通路富集分析结果显示,通城猪和约克夏猪差异表达基因富集的前10条通路中有8条是两猪种共同富集到的,但富集程度不同。这些结果说明妊娠时期胚胎的背最长肌的发育机制在两猪种中有相似之处,又存在一定的差异。
  2.对两个猪种分别在5个时期的基因表达进行差异比较分析,总共获得了1677个差异表达基因。5个比较组中,妊娠55天的差异表达基因最多。对两个猪种间的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,发现黏着斑(Focal adhesion),细胞外基质受体互作(ECM-receptor interaction),氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8条显著富集的通路。然后,对两猪种间差异表达基因进行蛋白互作网络分析,发现PTEN,EP300,MYO9A,CDK14,IRS1,PPP1CC和一些核糖体蛋白基因可能对揭示两猪种胚胎肌肉发育差异有重要作用。
  3.通过ASprofile软件分析,发现第一个外显子可变剪切(TSS)和最后一个外显子可变剪切(TTS)事件是两猪种中最主要的可变剪切类型。
  4.本研究通过WGBS技术构建了通城猪和约克夏猪在妊娠55天时胚胎背最长肌全基因组DNA甲基化图谱,并揭示了其DNA甲基化特征;CG双核苷酸甲基化是两猪种基因组DNA甲基化的主要方式,只有极少部分DNA甲基化发生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中,CG位点甲基化水平在内含子和3,UTR中的DNA甲基化水平较高,而非CG位点甲基化水平在CGI区域最高。
  5.通过WGBS技术,通城猪和约克夏猪之间获得了211822个差异甲基化区域(DMR),涉及到了12261个差异甲基化基因(DMG),其中在通城猪中差异高甲基化的有36582个DMR,涉及到DMG个数为5301;在约克夏猪中差异高甲基化的DMR为175240个,涉及到DMG为11746个。对两猪种的DMGs进行GO和KEGG通路功能注释和富集分析,发现在CG、CHG、GHH三种不同序列环境下的DMGs都显著富集到多个GO条目;KEGG通路富集分析发现非CG序列环境下的DMGs均显著富集到多条通路,而CG序列环境下的DMGs只显著富集到磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidyhnositol signaling system)。通过WGBS技术,鉴定到启动子区域的DMR为5946个,涉及到DMG为4578个。对启动子区DMGs进行GO和KEGG通路富集分析,发现只有CHH序列背景下的DMGs显著富集到了GO条目,但是在三种序列背景下的DMGs主要富集到的GO条目中有一些与肌肉发育相关GO条目;在三种序列背景下的DMGs都没有显著富集到通路,但主要富集的通路中都有核糖体(Ribosome),这表明核糖体通路中基因启动子甲基化可能会调控肌肉的发育。
  6.对转录组测序数据与全基因组甲基化测序数据进行联合分析,通过在整体水平上分析DNA甲基化水平与基因表达水平的相关性,发现两猪种在基因转录起始位点上游2kb及基因本体靠近转录起始位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈负相关;基因本体靠近转录终止位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈正相关。检测到同时是DMG又是DEG的基因个数616个,对其进行通路富集分析发现,主要富集的通路中黏着斑,Wnt信号通路(Wnt signahng pathway),凋亡(Apoptosis-multiple species),细胞外基质受体相互作用和TGF-beta信号通路(TGF-beta signahng pathway)在肌肉生长发育中发挥着重要作用。
  7.构建候选基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并筛选到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫荧光技术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,肌管形态的变化,发现两个干涉组的肌管数目都明显低于对照组,且RPL6干涉组的肌管明显变粗。使用流式细胞术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,对C2C12细胞周期进程的影响,发现RPL6基因参与了细胞周期的调节,干涉RPL6后会使滞留于G1期的细胞比例显著高于对照组,滞留于S期和G2期的细胞比例显著低于对照组;发现干涉TPPP3后,细胞周期各阶段的细胞比例与对照组相比皆无明显差异。通过免疫荧光技术鉴定到超表达基因RPL6可以增加细胞中增殖细胞核抗原(PCNA:增殖标志基因)蛋白的表达。
[硕士论文] 赵席功
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种能够引起临床上以急性出血和坏死性、慢性纤维素性胸膜肺炎为主要特征的高度接触传染性疾病猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumoniae,PCP)的病原菌,一旦发病,将给国内外养猪业带来很大的经济损失。毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统是一种在细菌和古生菌中广泛分布的小型基因组件。大多TA模型在许多细菌中已经被研究,并被证实在细菌生理机能和毒力方面起着重要作用。然而,在放线菌属中还没有被研究。因此,本研究主要研究猪胸膜肺炎放线杆菌中TA系统的分布存在情况,深化我们对APP生物学特性的认识;对APP中TA系统进行预测鉴定并对鉴定为TA系统的作进一步功能研究,希望可以筛选出与毒力相关的TA系统,为临床上弱毒疫苗及药物靶标的研究提供参考。
  主要研究内容如下:
  1、APP中Ⅱ型TA系统的鉴定
  在APP中,通过Ⅱ型TA系统预测软件RASTA-Bacteria和TADB2.0预测胸膜肺炎放线杆菌JL03菌株中TA系统,并选择两软件预测相同的7对作进一步的研究。通过RT-PCR实验验证TA基因共转录;超表达毒素使细菌生长受到抑制,但这种抑制可被其同源抗毒素中和;pull-down实验表明毒素与其同源抗毒素在体内发生相互作用;启动子活性实验表明抗毒素能够促进或者抑制自动调节TA操纵子的转录活性;此外,APJL_0660/0659TA系统在被检测的部分APP血清型中存在,而其它3对TA系统在所检血清型中都存在。最终,我们在APP中确定了4对TA系统,为进一步的功能研究奠定基础。
  2、APP中4对TA系统的功能研究
  首先,通过自杀性质粒pEMOC2构建重组质粒pE△TA,将测序正确的pE△TA转化到β2155感受态中,将pE△TA/β2155与亲本菌株APP5进行结合转移,挑出单交换菌株,进一步通过单交换传代挑取到基因缺失株△TA。其次,通过E.coli-APP穿梭质粒pJFF224-XN构建重组质粒pJFTA,将重组质粒电转化到△TA感受态中,挑菌鉴定氯霉素抗性菌株即可得到互补菌株C△TA。最后,研究缺失株及互补菌株的生长特性、遗传稳定性和对小鼠的毒力。结果显示:C△TA3和△TA3生长特性与APP5略有差异,而其它3对TA系统生长特性与亲本菌没有明显差异;4对TA系统对APP5的毒力没有影响。
[硕士论文] 张帅
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:氧化应激能够导致动物机体发生系统性和代谢性疾病,肠道的抗氧化酶系统在氧化应激中起重要作用。大量研究表明,魔芋甘露低聚糖可以促进肠道有益菌、抑制有害菌的生长,并且具有清除活性氧自由基的能力。枯草芽孢杆菌对动物机体有多种益生功能,在加强机体免疫功能、减小机体氧化应激程度、阻止致病菌的生长定殖等方面具有重要作用。本实验室前期研究发现,魔芋甘露低聚糖对枯草芽孢杆菌的生长有着显著的促进作用,两者联合添加对肠上皮细胞活性、炎性损伤等方面具有明显的修复效果。在前期研究的基础上,本研究利用LPS刺激结肠癌上皮Caco-2细胞,建立细胞氧化损伤模型,探讨魔芋甘露低聚糖和枯草芽孢杆菌对肠上皮细胞氧化损伤的修复作用,并建立LPS诱导的小鼠急性损伤模型,进一步探讨两者联合添加对动物机体的协同修复以及防护作用。主要研究内容如下:
  1.肠上皮细胞氧化损伤模型的构建。利用不同浓度LPS刺激Caco-2细胞不同时间,检测细胞的氧化和抗氧化指标,研究结果发现,LPS可引起氧化标志物MDA的表达升高,抗氧化酶SOD酶活性降低,最终确定LPS诱导Caco-2细胞氧化损伤的最佳作用浓度是2μg/mL,作用时间为8h。并通过Q-PCR进一步检测氧化酶NADPH的NOX2亚型、抗氧化反应元件Nrf2/Keap1以及下游抗氧化基因SOD1、GPx1的表达,western blot检测Nrf2的表达变化。与对照组相比,LPS能引起NOX2的表达上调,使细胞中产生更多的活性氧;Nrf2表达上调,Keap1表达下调,下游的抗氧化基因SOD1、GPx1和HO-1表达也被上调,说明细胞的Nrf2/Keap1抗氧化酶系统被激活。
  2.魔芋甘露低聚糖和枯草芽孢杆菌对Caco-2细胞抗氧化功能的影响。研究结果表明:与LPS损伤组相比,魔芋甘露低聚糖处理组细胞培养上清中抗氧化酶SOD酶活性和GSH含量显著提高,但在细胞裂解液中两种抗氧化酶无显著变化。Q-PCR检测表明,魔芋甘露低聚糖对抗氧化基因的表达也无显著影响,这提示魔芋甘露低聚糖在细胞培养中发挥抗氧化作用可能更多的是通过自身的理化性质与细胞中的自由基等反应,并没有介入到细胞的抗氧化系统中。与LPS损伤组相比,在枯草芽孢杆菌处理组细胞上清和裂解液中,SOD酶活性和GSH含量均显著增加。与对照组相比,枯草芽孢杆菌阳性对照组Nrf2和下游抗氧化基因SOD1、GPx1的表达显著上调;与LPS损伤组相比,枯草芽孢杆菌处理也能够使Nrf2和下游抗氧化基因,SOD1、GPx1的表达显著上调。这提示枯草芽孢杆菌可能通过影响细胞的Nrf2信号通路上调抗氧化基因的表达,提高细胞的抗氧化功能。与LPS损伤组相比,寡糖和益生菌联合处理组中MDA的表达下调,SOD酶活性和GSH含量增加;与益生菌单独处理组相比,寡糖和益生菌联合添加能够下调MDA的表达和上调SOD酶活性,对GSH的含量则无显著影响。
  3.魔芋甘露低聚糖和枯草芽孢杆菌对小鼠肠道抗氧化功能的影响。①与LPS损伤组相比,添加寡糖对小鼠肝脏中T-AOC、SOD、GSH三种抗氧化物活性均有显著地提升,添加益生菌能显著提升超氧化物歧化酶和总抗氧化酶的活力,而对肝脏中GSH的含量无显著影响。寡糖和益生菌联合处理能显著提高肝脏中三种抗氧化酶活性,且比单独添加益生菌的组别效果更显著。②相比LPS损伤组,寡糖和枯草芽孢杆菌灌胃均能显著降低小鼠血清中MDA的含量,且两者联合灌胃效果更显著。小鼠回肠HE染色显示,LPS诱导后,小鼠回肠组织产生了明显的损伤,肠绒毛断裂,组织固缩;加入寡糖和枯草芽孢杆菌均能不同程度地修复小鼠回肠组织的损伤。③添加枯草芽孢杆菌和魔芋甘露低聚糖均可明显抑制小鼠回肠中炎性因子TNF-αIL-6的表达,且寡糖和益生菌联合处理效果更显著。④与LPS损伤组相比,小鼠灌胃处理组(三组)中GSH含量和SOD酶活性均有显著提升。灌胃处理组均能显著抑制由LPS引起的小鼠肠道氧化基因NOX2的上调,并且两者联合灌胃组比单独灌胃寡糖或者益生菌下调更明显。灌胃处理组对LPS抑制机体抗氧化酶系统的表达也具有良好的防护效果。⑤通过western blot检测Claudin-1蛋白的表达,发现:相比LPS损伤组,预灌胃寡糖和枯草芽孢杆菌能显著上调Claudin-1蛋白的表达,说明枯草芽孢杆菌和魔芋甘露低聚糖对LPS引起的肠道紧密连接损伤具有良好的防护作用。
  综上所述,LPS可引起结肠癌上皮Caco-2细胞氧化应激损伤;枯草芽孢杆菌、魔芋甘露低聚糖及其联合使用均能提升细胞的抗氧化功能;枯草芽孢杆菌与魔芋甘露低聚糖联合添加比单独使用益生菌、魔芋甘露低聚糖效果更明显。灌胃枯草芽孢杆菌和魔芋甘露低聚糖对LPS急性损伤小鼠模型具有良好的防护效果。
[硕士论文] 屈文萍
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:骨骼肌卫星细胞是一类位于肌纤维膜表面与基底膜之间的细胞,在肌肉的发育和再生过程中发挥着重要的作用。长非编码RNA(Long non coding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt,具有低蛋白编码潜力的RNA分子。lncRNA能够调控基因表达、参与表观遗传修饰,影响细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动的进程。本研究以体外分离的猪骨骼肌卫星细胞为材料,研究一个新的lncRNA-AK394747在细胞增殖和分化过程发挥的功能及可能存在的机制。主要研究结果如下:
  1.利用两步酶消化法成功分离出活性较高、有一定增殖能力的猪原代骨髂肌卫星细胞,经差速贴壁纯化后,用Pax7基因对分离的细胞进行鉴定,免疫荧光结果显示细胞阳性率高达95%。同时,对分离的细胞进行分化诱导培养,能形成肌管,且稳定表达MyoD、MyoG和MyHc这三个成肌标志基因。
  2.通过RACE和测序验证了猪AK394747全长为1586bp,生物信息学分析发现该lncRNA不具有编码蛋白的能力,主要存在于细胞质中,时空表达谱分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉组织中高表达,且随着猪骨骼肌细胞的分化表达量上升。
  3.在猪骨骼肌细胞中利用干扰和超表达实验研究了AK394747对细胞增殖和分化的影响,EdU、RTCA以及细胞周期检测等实验结果发现该lncRNA对骨骼肌细胞的增殖过程无显著影响,并且增殖相关基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表达变化不显著;而干扰AK394747后,利用Q-PCR、Westren Blotting以及免疫荧光技术检测发现肌细胞分化标志基因MyoD、myoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表达显著下降,表明AK394747促进了猪骨骼肌细胞分化。
  4通过生物信息学筛选了4个潜在的与AK394747结合的miRNA—ssc-miR-32,ssc-miR-218,ssc-miR-218-3p,ssc-miR-301。在干扰AK394747后,其中ssc-miR-32及其pri-RNA表达降低。通过在线软件预测发现AK394747基因与NICD蛋白可能相互结合,同时利用Q-PCR技术检测发现干扰AK394747后NICD(Notch1胞内片段)基因的表达显著升高。
  本实验研究了猪lncRNA-AK394747的基本性质,验证了其促进骨骼肌细胞分化的基因功能,初步预测了其可能发挥作用的方式,为研究AK394747在骨骼肌细胞发育过程中的作用机制奠定了基础,同时也为研究猪骨骼肌生长发育调控机制提供了新的思路。
[硕士论文] 李明杨
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:母猪的繁殖力很大程度上决定了猪场的经济效益,而繁殖性状是由微效多基因控制的数量形状,遗传力较低,采用常规育种手段很难在较短时间内得到明显进展。目前国内外育种研究者将分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)与常规育种方法相结合来进行选育,能够促进猪繁殖性状的遗传改良进程。因此鉴定影响繁殖性状的候选基因或分子标记可为猪育种工作提供重要的理论依据。本实验在大白猪群体中,基于GWAS以及基因功能研究结果鉴定了HBEGF、KPNA7、FOXA2和PTGS2等四个候选基因,利用PCR-RFLP和Sequenom质谱等方法进行了SNP检测,并研究了SNP与繁殖性状之间的关联。主要研究结果如下:
  (1)在法系大白猪HBEGF基因第一、三内含子上共发现并验证了三个新SNP,分别为rs81218760、rs81218761和rs333992579。在法系大白经产母猪中,rs81218760位点AC基因型个体的初生窝重显著高于AA型个体(P<0.05),CC基因型个体的弱仔数显著低于AC基因型和AA基因型个体(P<0.05);在法系大白猪初产和经产母猪中,rs81218761位点CC基因型个体的弱仔数均显著低于TT基因型个体(P<0.05);在法系大白初产和经产母猪中,rs333992579位点TC基因型个体的初生窝重均显著高于TT型个体,另外在经产母猪中,TC基因型个体的健仔数显著高于TT基因型个体(P<0.05),而其弱仔数显著低于TT基因型个体(P<0.05)。
  (2)在法系大白猪KPNA7基因第一、三外显子区域,第一、三内含子区域以及5'UTR区域中发现并验证了六个新SNP,分别为rs81308652、rs321312903、rs327848277、rs334590006、rs336259402和rs339249916。在法系大白初产母猪中,rs81308652位点CT基因型个体的总产仔数显著高于TT基因型个体(P<0.05),而在经产母猪中TT基因型个体的弱仔数显著低于CC基因型个体;在法系大白初产母猪中,rs327848277位点GG基因型个体的初生窝重和健仔数均显著高于GT基因型个体(P<0.05),在经产母猪中,GG基因型个体的弱仔数要显著低于GT基因型个体;另外四个位点的多态性与法系大白猪繁殖性状之间的关联性均没有达到显著水平。
  (3)在法系大白猪FOXA2基因3'UTR区域检测到一个新SNP(rs328630446),该位点的GG和CG基因型个体的弱仔数均显著低于CC基因型个体(P<0.05)。
  (4)在美系和法系大白猪PTGS2基因第九外显子上检测到一个新SNP(rs322152513),在美系大白初产母猪中,该位点AA基因型个体显著低于AG基因型个体,而在经产母猪中,AA基因型个体的初生窝重显著高于AG基因型个体(P<0.05);在法系大自初产和经产母猪中,rs322152513位点多态性与繁殖性状之间的关联性并不显著。
  综上所述,本研究发现了HBEGF、KP NA7、FOXA2以及PTGS2基因内部的SNP与猪繁殖性状之间存在关联,为猪繁殖性状的遗传改良提供了理论基础。
[硕士论文] 蔡安乐
动物营养与饲料科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在哺乳动物妊娠期,胎盘是调节宫内环境和保障胎儿发育的重要媒介,其中胎盘的血管网发挥了关键作用。有研究发现提高妊娠期日粮中蛋氨酸水平能够提高仔猪初生窝重和仔猪初生个体重,然而蛋氨酸调控胎盘血管发育的作用及其调控机理尚不清楚。本研究以猪血管内皮细胞为研究对象,构建了猪胎盘滋养层细胞与血管内皮细胞共培养模型,研究了蛋氨酸对猪血管内皮细胞血管生成的调控规律:并进一步从关键基因表达调控角度,研究蛋氨酸调控内皮细胞血管生成关键基因的关键机制。主要研究内容和结果如下:
  1.提高蛋氨酸水平对猪血管内皮细胞血管生成的影响。通过建立猪血管内皮细胞与猪滋养层细胞体外共培养模型,研究在猪血管内皮细胞单独培养和与猪胎盘滋养层细胞共培养条件下,将蛋氨酸从生理浓度(0.05mmol/L)提高到0.2和0.5mmol/L对猪血管内皮细胞血管生成的影响。结果显示,在单独培养或者共培养条件下,提高蛋氨酸的水平都显著促进了内皮细胞的成管(P<0.05),但是蛋氨酸与培养条件不存在交互作用,说明了蛋氨酸促进内皮细胞血管生成不依赖于滋养层细胞。
  2.提高蛋氨酸水平影响猪血管内皮细胞血管生成的主要事件。提高蛋氨酸水平后内皮细胞形成管腔数、总的分支长度和总的节点数显著增加(P<0.05)。通过MTT法和流式细胞术,检测不同浓度蛋氨酸处理对细胞增殖的影响,结果表明,随着蛋氨酸浓度的增加,细胞活力显著增加(P<0.05),但是对细胞周期没有影响。细胞划痕和Transwell小室迁移法检测提高蛋氨酸水平对细胞迁移能力的影响,结果发现随着蛋氨酸浓度增加,细胞的迁移能力显著增加(P<0.05),说明了提高蛋氨酸水平主要影响了内皮细胞血管生成中的细胞迁移事件。
  3.蛋氨酸对内皮细胞血管生成关键基因的调控。对细胞迁移基因和血管生成相关基因mRNA表达变化检测发现,增加蛋氨酸水平(0.05mmol/L Vs0.5mmol/L)对MM2的mRNA表达没有影响,但是显著增加了MMP9、VEGF-A、VEGF120、VEGF164.、VEGFR-1的mRNA水平(P<0.05),血管生成负调节基因sVEGFR-1的表达量也显著增加(P<0.05)。在0.5mmol/L蛋氨酸处理条件下,检测蛋氨酸不同处理时间对猪血管内皮细胞细胞VEGF-A的mRNA表达的变化,结果表明随着蛋氨酸处理时间的增加,VEG F-A的mRNA表达水平逐渐增加,当处理时间达到24h时,显著促进了VEGF-A mRNA的表达(P<0.05)。此外,蛋氨酸不同处理时间或不同浓度蛋氨酸对猪胎盘滋养层细胞VEGF-A的mRNA表达没有影响。
  4.VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。本试验利用VEGF-A抑制剂Bevacizumab对细胞进行处理,研究了VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。结果表明,与高浓度蛋氨酸处理组相比,添加Bevacizumab处理后的细胞迁移能力显著降低(P<0.05),而与生理浓度蛋氨酸相比没有显著性差异。在血管生成试验中,添加Bevacizumab处理后形成管腔数、总的分支长度和总的节点数与高浓度蛋氨酸处理组相比显著降低(P<0.05);与生理浓度蛋氨酸相比,总的分支长度仍显著增加(P<0.05),总的节点数无显著差异。说明了在猪血管内皮细胞中,VEGF-A在介导蛋氨酸促进内皮细胞的血管生成中发挥了关键作用。
  5.蛋氨酸调控VEGF-A基因表达机制的研究。VEGF-A的mRNA水平增加涉及到转录水平和转录后水平的调控。本试验通过染色质免疫共沉淀技术来探究蛋氨酸对RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因CDS区的结合能力的影响。结果表明,在高蛋氨酸水平下,RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因启动子结合没有显著变化。利用放线菌素D进行处理,当处理时间增加到30和60min时,高蛋氨酸处理组VEGF-A的mRNA稳定性显著高于低蛋氨酸处理组(P<0.05)。说明了,提高蛋氨酸不影响VEGF-A转录水平,而是通过提高VEGF-A mRNA转录后的稳定性来调节的。
  综上所述,本研究的结论是:
  1.提高蛋氨酸水平促进了猪血管内皮细胞的迁移和血管生成,但该作用不依赖于滋养层细胞。
  2.蛋氨酸促进猪血管内皮细胞迁移和血管生成是通过提高VEGF-A基因表达来实现的。
  3.蛋氨酸通过影响了VEGF-A mRNA转录后的稳定性提高了VEGF-A的mRNA水平。
[博士论文] MUJAHID IQBAL
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)是发生在快速生长禽类中的一种病因不明的疾病。TD的典型病变可见于胫骨近骺端,其主要特征是无血管化和无钙化。患TD的家禽表现为身体状况差,胫骨骨骼变形,行走困难。这种疾病在全世界不仅造成巨大的经济损失,而且也带来了严重的动物福利问题。
  中草药一直被用于治疗各种疾病,相比化学合成药物,它具有副作用较小、生产成本低廉等特性,适合长期的服用。
  1.姜黄素修复福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良中的生长板发育异常
  姜黄素是一种鲜黄色的香料,黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种姜黄多酚,被称为姜黄。姜黄素被认为可通过抑制破骨细胞的生成来抑制骨吸收。它是调控和参与骨重塑的重要分子靶点。然而,目前尚无采用姜黄素治疗肉鸡TD的研究报道。本试验旨在研究姜黄素对TD损伤、禽类的生长性能、胫骨参数及对血管内皮生长因子(VEGF)和Dlx5基因表达的影响;同时分析了不同处理条件下肉鸡肝脏中的相关酶类(ALT、ALP、AST)和抗氧化(SOD、MDA、GSH-Px)水平。本试验将400只AA肉鸡平均分为4组:对照组、TD组、TDR(自然恢复组)和CUR(姜黄素给药组)。对照组从第1天至第18天喂食标准日粮。TD组从第1天至第3天喂食标准饲料,并且从第4天至第18天喂食含福美双(50mg/kg)的日粮。TDR组从第1天至第3天饲喂标准日粮,第4天至第7天饲喂含有福美双(50mg/kg)的日粮以诱发该疾病,然后从第8天至第18天继续饲喂标准日粮以观察肉鸡TD的恢复能力。CUR组从第1天至第3天饲喂标准日粮,第4天至第7天喂含福美双的日粮,从第8天至第18天喂食标准日粮的同时应用姜黄素(200mg/kg)。分别于第7、10、14和18天从各组随机挑选肉鸡,屠宰,评估相关指标。通过RT-qPCR、免疫组织化学和蛋白质印迹试验发现:患TD的肉鸡GP中VEGF的表达量显著上调,而Dlx5的表大量显著下调(P<0.05)。给予姜黄素后,VEGF的表达量显著下调,而Dlx5的表大量显著上调。胫骨的H&E病理切片显示患TD的肉鸡软骨细胞分布紊乱、细胞核溶解;姜黄素处理后,细胞恢复了正常的形态结构。生化结果显示:患TD的肉鸡生化指标ALT、AST和MDA升高,ALP、SOD和GSH-Px降低。姜黄素治疗组后,相关生化、抗氧化指标和胫骨参数接近于对照组。同时,TDR组中的肉鸡身体状况优于TD组,除极少数参数外,其他结果差异不大。
  2.大黄素对福美双诱导的肉鸡胫骨软骨发育不良中ALP、PPARγ和Ⅰ型胶原基因表达的影响
  大黄素是一种蒽醌衍生物,广泛存在于各种天然药材中。数千年来它被用于治疗包括骨疾病在内的各种疾病。本试验将系统的研究大黄素对TD的治疗效果(本试验设计、检测参数和技术见试验1)。通过RT-qPCR、免疫组织化学和蛋白质印迹试验发现:TD组肉鸡中的ALP表达显著下调(P<0.05),血清中ALP水平也下降。给予大黄素可显著上调GP中ALP水平,增加血清中ALP的含量。TD组PPARγ基因的表达上调,PPARγ的活化增加了骨吸收,然而大黄素治疗后发现其表达被显著下调。同时,研究发现对照组和TD组中Ⅰ型胶原蛋白表达水平非常接近,大黄素治疗后可以上调Ⅰ型胶原蛋白的表达量。大黄素治疗组中肉鸡的死亡率、GP的宽度、重量、长度等胫骨参数均接近于对照组。大黄素能够通过提高饲料转化率(FCR)和恢复GP形态功能而达到治疗肉鸡TD的效果,而且不会引起因摄入治疗药物而带来的肉鸡药物残留威胁。
[博士论文] 宋彤星
动物营养与饲料科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:脂肪组织既是一个储能器官,也是一个重要的内分泌器官。脂肪组织的形成主要包括脂肪生成和脂肪蓄积两个事件。脂肪过厚不仅影响猪的生长速度、饲料效率和胴体品质,而且影响猪的繁殖性能并对全身性代谢产生影响。因此,从脂肪细胞生成和脂质代谢两个角度去阐明脂肪组织形成的机制,并探索体脂沉积的营养调控技术是目前研究的热点问题之一。本实验室前期研究发现,妊娠期母猪过肥时,显著增加了弱仔的比率。因此,解析妊娠期母猪过肥时弱仔发生的具体机制及妊娠期母体的脂肪发育与代谢的调节机制具有重要意义。
  过去二十多年的研究发现,脂肪细胞生成受到了高度复杂且精密的转录级联网络调控,核受体过氧化物酶增殖子激活受体γ(Peroxisome Proliferator ActivatedReceptorγ,PPARγ)是调控成脂分化的关键转录因子,能响应长链多不饱和脂肪酸,发挥促进成脂分化、胎盘形成和血管生成等重要的生物学功能。近年来的研究发现,细胞膜上的G蛋白偶联受体120(G protein coupled receptor120,GPR120)也具有响应LCPUFA促进成脂分化的作用,但其调控机制不明。那么,细胞膜上GPR120被激活后,是通过什么信号传导途径传入细胞核中的?这些信号是怎样激活PPARγ从而促进成脂分化的?另外,妊娠期母体肥胖条件下,GPR120和PPARγ的表达是否受到影响,并引发胎盘功能异常,这些重要的问题都值得深入研究。
  因此,本研究以妊娠期不同背膘母猪为研究对象,探讨妊娠期母体过肥影响低初生重(Low Birth Weight,LBW)仔猪(下称弱仔)发生的机制,揭示GPR120等关键基因的正常表达对于胎盘功能的影响;并阐明GPR120通过PPARγ调控脂肪分化的机制。
  第一部分 母猪妊娠肥胖对胎盘发育的影响及其机制研究
  1、选择1090头胎次为1-4胎的长大二元杂母猪在妊娠109天度量了P2背膘厚。按照背膘厚分为3组,即≤17mm(第1组),18-20mm(第2组),≥21mm(第3组),统计并分析了三组间弱仔发生率的情况,结果发现:三组背膘不同的母猪中,第3组中仔猪初生重≤0.9kg和≤1.0kg的发生率分别是7.1%和11.51%,显著高于其他两组(P<0.01)。
  2、采集了21头母猪的150份胎盘组织样品(三组分别是8头,56份胎盘;5头,38份胎盘;8头,56份胎盘),保证胎盘与胎儿一一对应。通过分析胎盘组织中甘油三酯发现,第3组显著高于第二组(P<0.05),相比于第1组有升高的趋势。胎盘的血管发育和血管发育关键基因PPARγ和血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达并没有显著差异。值得注意的是:我们进一步分析发现,三组背膘下,LBW仔猪的胎盘及血管发育的关键基因PPARγ和VE FA表达均显著低于其他2组;相对于其他两组,胎盘组织中PPARγ和VEGFA蛋白表达水平也显著下调。通过建立了高效液相色谱-质谱联用方法检测胎盘组织的6-甲基腺嘌呤(m6A)水平,结果发现:LBW仔猪胎盘中m6A水平显著高于其他各组(P<0.01); m6A去甲基化酶FTO的蛋白水平显著低于其他各组(P<0.01),而m6A甲基转移酶METTL3表达没有发生相应的变化;对应的FTO和METTL3的基因表达却没有受到影响。通过建立了MeRIP-QPCR方法,结果表明:第3组LBW仔猪胎盘中PPARγ和VEGFA mRNA上m6A甲基化水平显著升高(P<0.01)。这些结果表明:在不同母体背膘下,背膘过厚的母猪LBW仔猪的形成,可能增加PPARγ和VEGFA mRNA上高m6A修饰水平,从而抑制其基因和蛋白的表达,引发弱仔胎盘血管发育障碍。这暗示肥胖母体和正常母体下,LBW仔猪发生原因可能并不相同。
  3、把第3组母猪(背膘≥21mm)的仔猪,按照初生重分为4组,即<1.0kg,1.0-1.4kg,1.4-1.6kg,>1.6kg。结果发现:仔猪初生重<1.0kg的胎盘血管密度显著低于正常体重组;胎盘组织胎盘脂质代谢相关的GPR120、ABHD5以及胎盘发育与血管生成相关的PPARγ、VEGFA的基因和蛋白的表达显著低于其他组(P<0.01),但对应这些基因的mRNA m6A水平显著高于其他各组(P<0.01),且胎盘组织中m6A水平与仔猪体重呈现显著的负相关;而m6A去甲基化酶FTO的蛋白水平显著低于其他各组(P<0.01)。这些结果表明:在母猪妊娠期体脂过度沉积时,母猪胎盘脂质代谢以及胎盘发育相关基因mRNA上的m6A修饰程度增加,降低了这些基因在胎盘组织中的表达,最终影响了胎盘血管生成。
  因此,如何调节母猪妊娠期脂肪沉积尤为关键,以下两部分内容基于GPR120探讨调控母猪脂肪分化的作用机制。
  第二部分 猪GPR120不同转录本的鉴定及受体信号研究
  本研究通过克隆猪GPR120基因(pigGPR120,pGPR120),首次鉴定出pGPR120存在3种转录本,其中pGPR120的野生型(pGPR120 wild type,pGPR120-WT)是主要表达的亚型,在肠道、脾脏和成熟脂肪组织中高表达,并在母猪胎盘和血管内皮细胞中表达。接着,通过构建GPR120下游经典信号胞内钙离子信号([Ca2+]i)报告基因系统和胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,ERK1/2)报告系统,利用双荧光素酶报告系统,鉴定出pGPR120-WT可以很好的响应n-3 PUFA,如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、α-亚麻酸(ALA)以及GPR120特异性激动剂TUG-891的刺激,而其他转录本受体不能被激活。n-3 PUFA也可以通过pGPR120-WT激活ERK1/2信号,上调ERK1/2的磷酸化水平。另外,利用上述两个报告基因系统开展受体显性抑制实验,结果表明,其他突变亚型并不能抑制pGPR120-WT的活性。
  第三部分 GPR120调控脂肪分化的功能及机制研究
  1、采用成脂诱导培养基MDI对小鼠3T3L1前脂肪细胞进行分化诱导,收集0、0.5、1、2、4、6和8天的样品,QPCR检测了成脂关键基因的表达模式。结果发现:随着诱导的时间延长,GPR120、PPARγ和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4(FABP4,也称为aP2)的表达显著上调。猪脂肪组织血管基质细胞经MDI诱导后也呈现相似的结果。特别是在诱导两天之后,GPR120的表达显著上调。随后,在3T3L1细胞中,通过慢病毒干扰GPR120,油红O染色显著抑制脂肪分化;相应的,成脂相关基因PPARγ和aP2的表达也显著下调。
  2、用α-亚麻酸ALA和GPR120的特异性激动剂TUG-891分别处理MDI诱导2天的3T3L1细胞后,均显著增强PPARγ蛋白的表达,从而促进了成脂分化。当慢病毒干扰GPR120的表达后,ALA和TUG-891的处理并不能提高PPARγ的表达,也不影响脂肪分化的表型。利用PPARγ结合元件报告基因(PPARγ Response Element,PPRE)研究发现,ALA和TUG-891激活PPARγ是依赖于GPR120的。
  3、作为GPR120的另一种内源性激动剂,DHA也可以激活PPRE的活性,却抑制PPARγ的表达,从而抑制成脂分化的发生。
  4、为排除ALA脂肪酸本身对其他事件的影响,我们利用TUG-891研究下游信号通路,结果发现TUG-891可以很好的激活下游的[Ca2+]i-ERK1/2信号;当慢病毒干扰GPR120之后,TUG-891对上述信号的激活作用消失。
  5、进一步研究[Ca2+]i-ERK1/2信号在脂肪分化中的作用,TUG-891的处理可以上调成脂关键基因PPARγ和aP2的表达,并上调PPARγ蛋白的表达,从而促进脂肪分化。当添加[Ca2+]i-ERK1/2信号相应的抑制剂,BAPTA-AM和U0126处理时候,可以显著抑制TU-891对脂肪分化事件的激活作用。在不表达GPR120的HEK293T细胞,利用PPRE活性研究也证实了TUG-891通过[Ca2+]i-ERK1/2信号激活PPARγ,这一过程依赖于GPR120。
  综上所述,本研究的主要结论是:
  (1)母猪妊娠期肥胖显著增加仔猪弱仔发生率,其机制是:母体过度沉积体脂时,胎盘脂质沉积增加,导致胎盘组织中去甲基化酶FTO表达水平下调,胎盘RNAm6A修饰水平显著升高,从而抑制了血管生成关键基因GPR120、ABHD5、PPARγ和VEGF-A的表达,造成胎盘血管发育障碍,胎儿发育受阻。
  (2)猪GPR120参与了脂肪细胞生成的调控,其机制是:膜受体pGPR120被配基激活后,通过[Ca2+]i-ERK1/2信号通路,上调了细胞核中核受体PPARγ的表达,从而促进了脂肪分化。
[硕士论文] 敖冬玲
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:安全有效地处理病死猪尸体是中国养殖场和个体养殖户共同面临的实际问题。堆肥作为一种无害化处理畜禽尸体的方法在世界各地被广泛应用。然而堆肥过程中存在效率低和氮损失严重等问题。为了探究猪尸体堆肥中理化参数和参与氮循环微生物功能基因的变化规律,本研究对猪尸体进行好氧静态堆肥,测定堆肥过程中理化参数,利用荧光定量PCR检测堆肥中参与氮循环相关功能基因的丰度变化,并分析理化参数对功能基因的影响。研究结果如下:
  1.对猪尸体进行好氧静态堆肥试验,发现添加耐高温复合菌剂(实验组)和自然堆(对照组)均在第2d升到50℃,在第4d达到最高温68.3℃。实验组和对照组堆体温度高于50℃的天数分别为34d和27d。堆体pH值的变化均呈现出先升高后下降的整体趋势,pH值的变化范围为7.75~8.71,两者差异不显著。铵态氮和亚硝态氮含量也都呈现出升高的趋势。结合其他理化参数可知堆肥达到完全腐熟,并达到堆肥无害化要求。
  2.利用荧光定量PCR检测,发现堆肥过程中均能检测细菌16S rDNA、amoA、narG、nirK、nosZ和nifH基因。narG、nirK、nosZ和nifH这四个基因丰度均在堆肥升温期到高温期中期一周的时间较高,在堆肥高温后期及腐熟期基因丰度较低。实验组中amoA基因在高温期后期有所降低,到腐熟期又升高到与升温期相当的水平。相对于堆肥中16S rDNA的水平,amoA<narG,nirK,nosZ<nifH。
  3.利用SPSS软件进行相关性分析发现,参与硝化作用的amoA基因丰度变化会随着含水率的降低而下降。参与反硝化作用的narG基因丰度会随着含水率的降低而下降外,nirK和nosZ基因丰度除了会随着含水率的降低而下降外,还会随着铵态氮含量升高而降低。参与固氮作用中的nifH基因丰度会随着含水率的降低而降低外,还会随着铵态氮含量升高而降低。
[硕士论文] 牛红丹
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:应激反应导致机体内应激激素大量分泌,其中以皮质醇为主,它是影响肉质的一个较为重要的因素。课题组前期研究表明,在动物日粮饲喂过程中添加皮质醇会导致仔猪背最长肌肌肉组织受损严重,肌纤维间隙增大,凋亡细胞数增多。但目前关于应激激素是如何影响肉质以及通过何种方式导致肉质发生变化的机制并不完全清楚。现今研究表明糖皮质激素(glucocorticoid,GC)主要通过细胞膜与体内糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)结合发挥一系列调控作用。在这些基础上,本课题以GRα为主要研究对象,探究GRα对猪原代骨骼肌细胞(pig skeletal muscle cells,PSC)生长的影响以及在猪劣质肉产生过程中的作用,并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:
  1.地塞米松引起猪肌细胞氧化应激
  地塞米松(dexamethasone,DEX)处理PSC细胞后发现其对肌细胞有明显的毒性,且与对照组相比DEX组细胞内的活性氧自由基大量上升,造成细胞氧化应激;等浓度米非司酮(mifepristone,RU486)处理后细胞内的活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)明显下降。通过MTT法检测DEX对PSC细胞增殖的影响,实验结果表明:DEX抑制PSC细胞增殖。通过qPCR和Western blot检测DEX对细胞应激的影响,结果表明:DEX能促进PSC细胞中HSP90的表达;等浓度RU486处理后能抑制PSC细胞中HSP90的表达。
  2.GRa对PSC细胞功能的影响
  通过构建GRα超表达载体和合成siRNA来超表达和抑制GRα的表达。通过流式细胞仪和MTT法检测GRα对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达GRα可以促进PSC细胞凋亡,抑制PSC细胞增殖。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR检测GRα对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达GRa能促进PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和GPX2的表达;同样,干扰GRα能抑制HSP90、CAST和GPX2的表达。超表达GRα和干扰GRα后检测谷胱甘肽过氧化物酶活性,实验结果表明:超表达GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高,干扰GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。可能是机体应激水平过高,并通过提高谷胱甘肽过氧化物酶活性以维持机体稳定。
  3.GRα靶基因的筛选
  干扰GRα后根据表达差异筛选GRα的靶基因,定量结果显示,干扰GRa后极显著下调Tβ10的表达,下调HSP90和HSP7的表达;且超表达GRα后Tβ10的表达显著升高,上调HSP90和HSP27的表达,且在网站上预测出GRα与Tβ10的结合位点。因此推测Tβ10可能是GRα的靶基因,双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀等试验初步验证,结果表明Tβ10可能是GRα潜在的靶基因。构建Tβ10超表达载体后通过流式细胞仪检测Tβ10对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达Tβ10可以促进PSC细胞凋亡。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR实验检测Tβ10对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达Tβ10能促进PSC细胞中BAX、HSP90、HSP27和CAST的表达。
  4.APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激
  与GRα组相比添加不同浓度的(0.1mg/mL,1mg/mL,10mg/mL和100mg/mL)黄芪多糖(astragalus Polysacharin,APS)后可缓解细胞应激,并通过检测ROS含量找出最适浓度为10mg/mL。添加10mg/mL APS后机体的ROS水平显著降低,且与对照组趋于一致。通过MTT法检测APS对PSC细胞增殖的影响,结果表明:APS可显著缓解超表达GRα后抑制PSC细胞增殖的作用。且添加APS后与GRα组相比谷胱甘肽过氧化物酶活显著降低,从而维持机体稳定。通过QPCR和Western blot检测APS对PSC细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果显示:与GRα组相比添加APS可抑制PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和Tβ10的表达。表明APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激。
[博士论文] 阿里阿克巴布延
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胃肠道线虫(GINs)是影响小型反刍动物经济的重要寄生虫之一,也是世界上许多地区动物健康问题的主要来源。该寄生虫感染的抗性或易感性与遗传因素有关,且在品种与品种之间、个体与个体之间有差异。了解抗GINs感染的遗传机制对于有效和可持续地控制胃肠道线虫感染是十分重要的。然而,宿主对GINs感染的反应的分子机制目前尚不十分清楚。本研究对山羊GINs感染的候选基因、通路、特异性抗体反应及可能的机制进行了研究。
  (1)通过粪便虫卵计数法筛选鉴定了宜昌白山羊(YWGs)品种内的抗性和易感个体。对选择的山羊检测寄生虫学参数和血液学参数,并由感染试验和转录组分析来对抗性组和易感组的的GINs感染情况进行分析。同时评估局部mIgA和系统性sIgE对GINs感染过程中的特异性抗原的保护机制和调节活性。本研究中共有来自不同地点的384只山羊用于鉴定ATP2A3基因中的单核苷酸多态性和它们与GINs感染性状的相关性。现场试验结果表明,抗性组较易感组的虫卵量及虫卵产生均有降低。与抗性山羊相比,易感山羊的血液学参数在观察期间的,血红蛋白(Hgb)有显著降低(p<0.01),填充细胞容积(PCV)百分比较低(p<0.05),同时发现易感的山羊血红蛋白低于正常血红蛋白值(90-150g/L)。线虫感染试验后,抗性组山羊捻转血矛线虫数量显著低于易感组山羊(p<0.05)。在本研究的三个性状中,粪便虫卵计数(FEC)与血红蛋白呈负相关(r=-0.94),粪便虫卵计数(FEC)与填充细胞容积呈负相关(r=-0.90),其中血红蛋白与填充细胞容积呈正相关(r=0.94)。
  (2)在GINs感染抗性组和易感组中各选择四个极端个体,进行血液转录组分析以比较其mRNA表达谱。转录组分析显示,两组共有显著差异(p<0.001)表达的基因2369个,其中上调基因1407个,下调基因962个。在抗性组中高表达的298个基因的功能注释产生了46个显著的(p<0.05)功能注释簇,包括涉及免疫生物合成过程以及一些与免疫系统相关的途径的31个基因(先天免疫9个,获得性13个,先天免疫9个),如转化生长因子(TGF)-β,促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞粘附分子(CAMs)。这些发现提供了与改善宿主对GINs感染的抗性相关的认识,并为进一步了解山羊对GINs感染抗性机制打下了基础。
  (3)从转录组分析得到的差异表达基因中选择12个上调和下调的基因,通过qRT-PCR来进行验证。在选择的基因中,与抗性组山羊相比,6个上调基因(ITGA4,C3,BCL2,ATP7A,ERAP1和ST6GAP1)在易感山羊中高表达,另外6个下调基因(LST1,IFI44L,IL1R2,F12,CCL27和IFI6)在易感山羊中低表达。ITGA4,C3,BCL2,ST6GAL1,LST1,IFI44L,IL1R2和IFI6基因在p<0.01水平显著差异表达,ATP7A,ERAP1,F12和CCL27在p<0.05水平显著差异表达,同转录组分析结果相一致。将qRT-PCR log2表达(倍数变化)数据和mRNA序列log2表达(倍数变化)数据拟合在线图和表达模式中,相关系数为0.912,线性回归模型为Y=0.839X-2.252,与测序表达结果呈显著的相关性。
  (4)局部粘膜免疫球蛋白-A(mIgA)和全身性血清免疫球蛋白-E(sIgE)是针对GINs感染的最重要的应答抗体。本研究调查了局部mIgA和系统性sIgE,监测了局部mIgA和系统sIgE针对特定抗原的反应,发现两者与GINs感染的成年期、生殖力和虫体长度呈负相关,表明其调节抗寄生虫感染方面的作用。
  (5)应用qRT-PCR在山羊中检测了5个感染相关基因的相对情况,结果表明,在易感山羊中C3,LTBP2,ABCB1和SMAD3基因的表达水平较高,但IL1R2基因在抗性山羊中高表达。皱胃组织(胃底和幽门组织),淋巴结(胃肠和肠系膜)和小肠组织中的C3和IL1R2基因的mRNA相对表达谱显示出显著差异,而基因LTBP2,ABCB1和SMAD3在易感山羊和抗性山的淋巴结和小肠组织中没有显示出差异。总体来说,抗原特异性局部mIgA和全身sIgE以及组织特异性应答,特别是C3和IL1R2应答,在山羊GINs感染的遗传抗性机制中具有重要效应。
  (6)检测了ATP2A3基因的多态性,并研究了其与三个中国山羊群体中GINs感染的关系。在山羊ATP2A3基因中发现了7个新的变异,其中5个位于3'UTR区域,2个位于外显子区且为同义突变。7个变异的基因型和等位基因频率与Hardy-Weinberg平衡及群体遗传学参数相一致,如多态性信息量(PIC)在恩施黑山羊、南江黄羊及宜昌白山羊中分别为0.26,0.32和1.54,杂合度(He)在恩施黑山羊、南江黄羊及宜昌白山羊中分别为0.28,0.35和1.60,有效等位基因数(Ne)在恩施黑山羊、南江黄羊及宜昌白山羊中分别为0.28,0.34和1.55。
  (7)关联分析显示,在7个多态性位点中有4个多态性位点对山羊GINs感染有显著影响。从7个单核苷酸多态性的单倍型和LD结构来看,3'非编码区C24361893T和C24379974T以及3'UTR区的C24358400A和G24358441C两对变异体之间存在显著的连锁不平衡,及较高的连锁不平衡系数(D'),并分别跨越了18.081kb(~18kb)和0.041kb(~0kb)的两个区域。从ATP2A3基因的4个多态性位点及其单倍型组合中,从这4个突变构建了8个以前未发现的单倍型,其中AG和CC单倍型频率最高,分别为65.0%和53.3%,其次是其他单倍型。通过qRT-PCR分析,ATP2A3基因的mRNA的相对表达量在易感山羊中高于抗性山羊,并且在p<0.05水平上与转录组测序数据的相对倍数变化有显著不同。这些结果表明,ATP2A3基因在山羊抗GIN感染过程中是一个关键候选基因。
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