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[硕士论文] 赵志峰
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:近年来,干细胞治疗在相关疾病中已经进入临床试验阶段,但免疫排斥现象如影随从,是干细胞治疗技术的绊脚石。半乳糖凝集素1(Galectin-1,GAL-1)在大多数间充质干细胞、多数肿瘤及鹿茸干细胞中被发现高表达,而相应的这些细胞中均出现免疫抑制现象。GAL-1作为免疫调控因子,推测其很可能参与了干细胞的免疫调控。
  鹿茸是唯一能够在失去后还能完全再生的哺乳动物器官。研究表明,鹿茸再生是一个基于干细胞的过程,鹿茸干细胞中高表达GAL-1基因,推测其是鹿茸再生中的一个重要调控因子。为研究GAL-1在鹿茸干细胞中的表达及可能的生物学功能,本论文以东北梅花鹿鹿茸的干细胞组织,即生茸区骨膜和角柄骨膜(致敏角柄骨膜与休眠角柄骨膜)以及对照组织面部骨膜为研究材料,克隆了梅花鹿的GAL-1基因CDS区序列,利用软件或网站,对GAL-1蛋白进行生物信息学分析;利于Western-blot及Q-PCR技术检测了GAL-1在鹿茸干细胞中的相对表达量。结果显示:梅花鹿GAL-1ORF全长为408bp,编码134个氨基酸;相对分子质量为14.69KDa,氨基酸序列与牛羊高度接近(95%>);主要定位于细胞外,无跨膜区,无糖基化位点,可能有两个磷酸化位点,二级结构主要为β-折叠与无规卷曲;三级结构与牛的结构相似;GAL-1在面部骨膜中表达量更高。本研究预测了梅花鹿GAL-1蛋白的结构特点,检测了GAL-1蛋白在鹿茸干细胞中的表达情况,为进一步研究鹿茸再生提供数据支持。
  鹿茸生茸区骨膜干细胞被归类为一种间充质干细胞,是鹿茸发生的基础。GAL-1蛋白在生茸区骨膜干细胞中发生异常表达。为探究GAL-1基因在干细胞中的具体功能,本实验采取了RNAi技术,经Q-PCR,Western-blot测定干扰效率约为62%。通过PI法与CCK8法分别检查细胞周期和增殖;Q-PCR检测IL-6和CMYC的表达量;与CFSE染色的外周血淋巴细胞共培养4d后,显微镜下观察并用流式细胞仪检测。结果干扰后的细胞S期占比上升,G1期占比下降;细胞增殖速度加快;IL-6被上调约1倍,CMYC被上调约5倍;淋巴细胞分裂速度加快。这表明干扰后,细胞中GAL-1含量降低,导致大部分细胞进入分裂期,分裂速度加快。IL-6和CMYC等免疫相关因子被上调,刺激免疫细胞活化增殖。推测GAL-1是鹿茸再生过程中细胞增殖与免疫调控的关键抑制因子。
[硕士论文] 罗阳
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本研究采用体外发酵法比较不同组和比例的桑树叶和羊草的组合效应,在此基础上,再利用桑树叶与羊草的混合作为粗饲料饲喂绵羊,通过比较其在绵羊体内消化与瘤胃发酵特征、生产性能、脂肪代谢与沉积性能、肉品质等指标,确定桑树叶在绵羊饲粮中的最佳添加量,为桑树叶在绵羊饲养中的合理使用提供参考。研究内容主要包括以下三部分:
  试验一、本试验旨在利用体外瘤胃发酵法研究不同比例的桑树叶与羊草之间的组合效应,从而筛选出两者之间的最佳组合比例。将桑树叶和羊草分别以0∶100(T0组)、20∶80(T20组)、40∶60(T40组)、60∶40(T60组)、80∶20(T80组)、100∶0(T100组)的比例混合后作为底物,进行连续72h的体外产气培养和体外批次培养试验。结果表明:1)随着底物中桑树叶比例的提高,理论产气量、累积产气量、培养液微生物蛋白(MCP)浓度和体外有机物消化率(IVDOM)都有提高的趋势;2)在72h时,T100组的理论最大产气量、累积产气量和IVDOM都显著高于其他各组(P<0.05),T60和T100组的培养液MCP浓度显著高于其他各组(P<0.05);3)在48和72h时,T60、T80和T100组培养液pH显著低于其他各组(P<0.05);4)在72h时,T60、T80和T100组培养液的总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度都显著高于其他各组(P<0.05);5)在6、12和72h时,T60、T80和T100组的培养液氨氮(NH3-N)浓度显著高于其他各组(P<0.05);6)T60组的多项组合效应(MFAEI)要高于其他各组。综上所述,桑树叶与羊草的组合能够改善体外瘤胃发酵特性,即存在正组合效应,其中桑树叶与羊草的最佳比例为60∶40。
  试验二、本试验研究了不同比例的桑树叶对绵羊瘤胃发酵、消化代谢、血液生化和生长性能的影响。试验选用32只小尾寒羊公羊(25.15±1.03kg),随机分成4组,分别为对照组(Con组)、T20组、T60组和T80组,每组8只重复。试验饲粮的组成和营养水平参照NRC(2007)建议的肉绵羊饲养标准,预期日增重200g/d,干物质采食量0.83kg,ME为10MJ/kg。对照组饲粮中以羊草为单一粗饲料,T20组、T60组和T80组为添加桑树叶组,粗料中桑树叶和羊草的比例分别为20∶80,60∶40和80∶20,即各组饲粮中桑树叶的比例分别为0、8%、24%、32%。试验预饲期10天,正试期55天。结果表明:1)添加桑树叶组的终末体重和平均日采食量在数值上要高于对照组。2)添加桑树叶组的DM和OM表观消化率均显著高于对照组(P<0.05)。T20和T60组的CP表观消化率显著高于对照组和T80组(P<0.05)。T60组的NDF和ADF表观消化率显著高于其他各组(P<0.05)。T60和T80组的EE表观消化率均显著高于对照组和T20组(P<0.05)。3)对照组血清中尿酸的含量要显著高于其他各组(P<0.05),其他血清指标均没有显著差异。4)各组瘤胃液的pH、氨氮浓度、TVFA、乙酸、丙酸的浓度和乙酸/丙酸的值都没有显著差异(P>0.05)。T60组和T80组的MCP浓度显著高于对照组和T20组(P<0.05)。T60组丁酸的浓度显著高于对照组和T20组(P<0.05)。
  试验三、本试验研究了不同比例的桑树叶对绵羊屠宰性能、肉品质和脂肪沉积的影响。在正饲期结束后每组随机挑选4只小尾寒羊进行屠宰试验。结果表明:1)各组试验羊的屠宰性能指标均没有显著差异(P>0.05)。T60组的胴体重、屠宰率、净肉重和肉骨比在数值上要高于其他各组。2)添加桑树叶组背最长肌的肉色L和臀中肌的剪切力、蒸煮损失都显著低于对照组(P<0.05)。T60组背最长肌和股外侧肌的肉色a都显著高于对照组(P<0.05)。T60组背最长肌的pH24h和股外侧肌的pH24h都显著高于其他各组(P<0.05)。T60组和T80组背最长肌的滴水损失显著低于对照组和T20组(P<0.05)。T60组股外侧肌的滴水损失显著低于其他各组(P<0.05)。3)T60组和T80组的背膘厚显著高于对照组和T20组(P<0.05)。各组之问的胴体脂肪总重、腹脂重、内脏脂肪重、皮下脂肪重、尾脂重和肌内脂肪重没有显著差异(P>0.05),T60组的内脏脂肪重、皮下脂肪重和肌肉脂肪重在数值上要高于其他各组。T60组和T80组肌内脂肪的含量显著高于对照组和T20组(P<0.05)。4)T60组C15∶1、C18∶3n3、MUFA的含量和PUFA/SFA均显著高于其他几组(P<0.05),而SFA的含量要显著低于其他几组(P<0.05),C17∶1的含量显著高于对照组(P<0.05)。T80组C18∶1n9c的含量显著高于其他几组(P<0.05)。T60组和T80组C16∶1的含量显著高于其他两组(P<0.05),C16∶0的含量要显著低于其他两组(P<0.05)。5)T60和T20组背最长肌中ACC mRNA的表达量显著高于对照组和T80组(P<0.05),T60组和对照组AGPAT1mRNA的表达量显著高于T20组和T80组(P<0.05),T60组GPAT1和DGAT2mRNA的表达量显著高于其他各组(P<0.05),T20组ATGL mRNA的表达量显著高于T80组(P<0.05)。
[硕士论文] 赵盼
养殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鹅脂肪肝(俗称肥肝)是一种营养丰富的高档食材。不同品种的鹅产肝性能存在明显差异,这表明鹅肥肝生产性能可通过遗传育种途径加以改良。目前中国用于肥肝生产的鹅品种是从国外引进的朗德鹅,由于引种费用昂贵,许多肥肝生产企业为了有利可图,常常购买引进后已多次传代、种质退化了的群体,严重影响了企业的生产效率和收益。解决这一问题的有效途径之一是对中国引进的朗德鹅群体进行选种,然而目前采用的表型选择,其选种效果并不明显。相对于表型选择,遗传标记辅助选择的优势明显。本研究旨在评估GRP78和MC5R两个基因与脂肪肝形成的关系及其多态性位点与肥肝鹅相关生产性状的关联,从而为肥肝鹅的标记辅助选择奠定基础。本研究的主要结果如下:
  1、利用荧光定量PCR检测GRP78基因在填饲第7天、14天和19天对照组(常规饲养组)和填饲朗德鹅不同组织(肝脏、腹脂和胸肌)中的表达情况。结果显示:在填饲第7天、14天和19天,填饲组朗德鹅肝脏中GRP78基因的mRNA表达量均低于对照组朗德鹅,但未达到统计显著性(P>0.05);相反,填饲组朗德鹅腹脂中GRP78基因的mRNA表达量均高于对照组朗德鹅,且在填饲第14天达到统计显著性(P<0.05)。然而,胸肉中GRP78基因的mRNA表达量在两组间没有明显差异。再者,在饲料中添加蔗糖导致肥肝中的GRP78表达量进一步被抑制,同时伴有肥肝重和腹脂重的增加,该结果表明GRP7参与鹅肥肝的形成,其表达抑制或有助于肥肝的形成。因此,GRP78是鹅肥肝辅助选择标记的良好候选基因。为探讨GRP78基因用作辅助选择标记的可行性,本研究通过PCR扩增出GRP78基因及其上游序列(<2.5kb)并测序以筛查该基因存在的SNP位点。结果发现仅在上游序列较远的位置(-1904bp~-2484bp)上存在6个SNP位点,且这些位点与测定的生产性能指标不存在显著关联,而在其他序列中并未找到SNP位点。GRP78基因编码区没有找到多态性位点反映出GRP78基因因具有重要的生物学功能而承受了较大的选择压力。
  2、利用荧光定量PCR检测MC5R基因在填饲第7天、14天和19天对照组和填饲组朗德鹅不同组织(肝脏、腹脂和胸肌)中的表达情况。结果显示:在填饲第7天、14天和19天MC5R基因在填饲组朗德鹅肝脏中的表达均显著低于对照组,且随着肝中脂肪沉积量的增加,MC5R的表达抑制变得更加明显。类似地,填饲组腹脂中MC5R基因的表达量均显著低于对照组。对于胸肌而言,在填饲第7天,填饲组与对照组间没有明显差别;在填饲第14天,填饲组低于对照组,但不显著;而在填饲第19天,填饲组显著低于对照组,且表达的抑制程度加剧。此外,与常规填饲组相比,加糖日粮的填饲进一步抑制肥肝中的MC5R表达,且这种抑制与肝重增重相关。这些结果提示,MC5R基因的表达抑制可能促进组织中的脂肪沉积,因此MC5R基因是鹅肥肝辅助选择标记的良好候选基因。
  3、为了更好地理解MC5R与鹅肥肝形成的关系,本项目检测了脂肪肝形成相关因子(高剂量葡萄糖、胰岛素和脂肪酸)对鹅原代肝细胞中MC5R基因表达的影响。结果显示:在高剂量葡萄糖、胰岛素、棕榈酸、油酸和亚油酸分别处理鹅原代肝细胞14小时后,葡萄糖和胰岛素都不同程度地诱导了MC5R的表达,而脂肪酸对MC5R表达没有显著的调节作用。这些结果与鹅肥肝组织的表达情形不一致,推测在鹅肥肝形成过程中,还存在其他因子或机制影响鹅肥肝中MC5R基因的表达。
  4、为探讨MC5R用作肥肝鹅辅助选择标记的可能性,本研究通过对PCR产物进行测序分析,查找MC5R编码区内的SNP位点,并对SNP位点与生产性能相关指标(肝重、腹脂重和胴体重)进行关联分析。数据显示:在MC5R基因编码区找到一个C/T多态性位点(起始密码子下游编码区序列的807bp处),该SNP位点并未引起MC5R氨基酸序列的改变。该SNP位点与肥肝鹅的腹脂重存在关联。CT基因型的平均腹脂重显著大于CC基因型的平均腹脂重(P<0.05),两者相差52.67g;而TT基因型与CC、CT基因型在平均腹脂重的差异未达到显著水平。SNP位点与肥肝鹅的胴体重也存在关联,CC基因型的平均胴体重显著大于TT基因型的平均胴体重(P<0.05),两者相差630g;而CT基因型与CC、TT基因型在平均胴体重上的差异未达到显著水平。然而,SNP位点与肥肝鹅的平均肝重不存在明显关联。这些结果从关联分析的角度表明,MC5R或可用于肥肝鹅的辅助选择,在保持肝重不受显著影响的情况下,对填肥后的腹脂重和胴体重进行选择。
  综上所述,通过明晰朗德鹅不同组织中GRP78和MC5R基因表达水平随填饲时间的变化规律、饲料加糖试验和脂肪肝形成相关因子对基因表达的影响,以及基因的SNP位点与肥肝鹅生产性能相关指标间的关联情况,本研究揭示了GRP78与MC5R基因在肝脏中的表达抑制有助于鹅肥肝的形成,因此两者均为肥肝鹅辅助标记的良好候选基因;在MC5R编码区筛选到的SNP或可作为辅助选择标记用于肥肝鹅腹脂重和胴体重的选择。
[硕士论文] 姚颖
养殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鹅产蛋性能低下是阻碍鹅产业发展的关键原因之一。研究已发现,鸡的产蛋就巢行为与产蛋量密切相关,但鹅的产蛋与就巢行为是否影响其产蛋性能至今尚未见有系统研究报道。基于此,本研究以产蛋量明显不同的四川白鹅、浙东白鹅、卡洛斯鹅为研究对象,采用视频自动采集系统,观察鹅只产蛋与就巢行为,并研究鹅就巢过程中卵巢形态学和激素分泌变化,分析就巢行为与产蛋量之间的关系。研究旨在了解不同鹅品种产蛋与就巢规律差异,不仅可为针对就巢性状采用有效措施提供参考依据,也为今后开展高产鹅选育提供基础数据。主要研究结果如下:
  1、为了解不同鹅品种产蛋行为特性差异,经观察发现不同品种母鹅产前均具有寻巢、巢位选择和筑巢行为。整个产程包括产前趴窝、努责产蛋、产后休息三个阶段。不同鹅品种具有不同的产蛋时间偏好性,浙东白鹅和四川白鹅产蛋时间偏好性较强,而卡洛斯鹅产蛋时间较分散。不同鹅品种连产长度和产蛋间歇长度也存在较大差异,卡洛斯鹅的平均连产长度(19.15天)显著高于浙东白鹅(14.07天)和四川白鹅(12.14天),产蛋间歇长度(4.73天)显著低于浙东白鹅(80.97天)(P<0.05),总的来说,产蛋量与连产性关系密切,因此连产性状可用于肉鹅产蛋辅助选育指标。
  2、为了解不同鹅品种就巢行为特性差异,经观察,不同鹅品种就巢行为表现相似,但就巢各时期表现差异明显。就巢中期采食饮水频次减少,体重体温降到最低点。四川白鹅母鹅就巢持续时间约49天,显著高于其他两鹅种(P<0.05)。同时对试验期内就巢鹅和非就巢鹅产蛋量进行统计分析,结果显示,卡洛斯就巢鹅平均产蛋量(13.86)显著低于非就巢鹅平均产蛋量(26.92)(P<0.05),而就巢性对四川白鹅产蛋量影响不显著(P>0.05)。浙东白鹅随着就巢次数增加,产蛋量反而上升。上述结果表明,并非所有鹅品种可通过剔除就巢鹅来提高鹅群产蛋量。
  3、为探明就巢期内鹅卵巢形态学变化,以产蛋和就巢各时期的浙东白鹅为研究对象,观察卵巢形态变化。结果显示,从产蛋期到就巢期卵巢体积逐渐变小,直径由9.38cm降低至3.61cm,皱缩程度加深。由石蜡切片和透射电镜结果可知,随着就巢的进行,卵巢萎缩退化程度加剧,闭锁卵泡数目增多。
  4、为阐明鹅就巢过程中相关基因表达变化规律,利用实时荧光定量技术检测PRL、AMH、DβH、P450scc基因在浙东白鹅不同繁殖周期不同组织中的表达情况,结果显示,PRL、AMH和Dβ何就巢期表达量显著高于产蛋期(P<0.05)。其中,PRL和DβH在下丘脑,垂体,卵巢中均表达,PRL在垂体中高表达,AMH只在卵巢中表达。相反地,产蛋期P450scc在卵巢和垂体中高表达,表达量显著高于就巢各时期(P<0.05)。同时采用ELISA试剂盒测定不同鹅品种就巢期血清中相关生殖激素的含量,测定结果显示,就巢期PRL和AMH激素含量显著高于产蛋期(P<0.05)。相反地,就巢期鹅血清中FSH、PROG和LH激素含量很低。上述结果表明,PRL和AMH对鹅就巢行为的调控起主要作用,该结果提示在生产中可通过内、外环境的改变,影响机体内分泌系统,降低就巢的发生。
  综上所述,不同鹅品种产蛋和就巢行为表现出不同的规律性,随着连产时间延长,鹅产蛋量随之增加,但是随着就巢时间延长,并非所有鹅产蛋量随之降低。在就巢过程中PRL和AMH激素对鹅就巢行为的调控起主要作用。
[硕士论文] 戴振清
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:内源性反转录病毒(Endogenous retrovirus,ERV)据称源于进化中感染生物体的反转录病毒,是生物体基因组组成的一部分,如人内源性反转录病毒约占基因组序列的5~8%,大部分不表达。传统观点认为内源性反转录病毒属于垃圾DNA(Junk DNA)序列,或具有感染性。内源性反转录病毒对早期胚胎发育和胚胎干细胞具有重要作用。本研究选择内源性反转录病毒—鸡内源性白血病病毒(Avian leukosis virus subgroupE,ALVE)作为研究对象,基于目前已经鉴定出鸡内源性白血病病毒能产生反义长非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA),并发现反义lncRNA lnc-ALVE1-AS1与细胞天然免疫有关联。本论文主要围绕长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1在鸡个体发育早期的表达规律、多态性分析及与鸡抗病表型关联性进行展开,初步阐明长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与鸡抗病表型的关联。
  1、禽内源性反转录病毒ALVE1在鸡基因组完整序列鉴定
  已知鸡基因组中含有禽内源性反转录病毒ALVE1序列,而ALVE1在鸡基因组中的上游和下游区域位置在参考基因组中并未成功鉴定。本研究成功鉴定出ALVE1所在鸡基因组中的上、下游序列,并通过提取CEF细胞和DF-1细胞基因组反向验证ALVE1的位置信息。与参考基因组不同的是,我们发现ALVE1序列包含3'LTR序列,在鸡1号染色体上的插入位置为chr1:65,995,534~65,993,540。本研究不仅提供了ALVE1在鸡基因组中的完整信息,也为进一步研究ALVE1的功能奠定了基础。
  2、长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1在CEF细胞和鸡个体发育早期表达规律的研究
  鉴于长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1可能与先天性免疫及以及抗病毒有关,本研究通过检测长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1在CEF细胞和鸡个体发育早期表达规律,发现禽白血病病毒抗性品系鸡G1中长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的表达量要高于禽白血病病毒易感品系鸡G3,并且早期表达量较高,这初步验证了长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1可能与先天性免疫及个体抗病毒能力相关。
  3、长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1多态性分析及与鸡抗病表型关联性研究
  通过比对禽白血病病毒抗性品系鸡G1和禽白血病病毒易感品系鸡G3的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1序列,我们发现禽白血病病毒抗性品系鸡G1的序列相比易感品系鸡G3的序列,含有一个3碱基GCG插入突变,推测可能与禽白血病抗性有关。本研究选取如皋黄鸡、海南文昌鸡和河北麻城蛋鸡等3个地方鸡种,扩增其长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1序列,并与抗性品系鸡G1和易感品系鸡G3进行比对,发现如皋黄鸡和海南文昌鸡的测序序列与抗性品系鸡G1相一致,同样含有一个3碱基GCG插入突变,而河北麻城蛋鸡的序列则与易感品系鸡G3相一致。因此推测,如皋黄鸡和海南文昌鸡可能同样具有对禽白血病具有抗性。进一步通过制备3个地方鸡种CEF细胞进行细胞攻毒实验进行验证,发现结果与预期相一致,所以易感品系鸡G1所含有的3碱基GCG插入突变可能与禽白血病抗性相关。
  综上所述,长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1可能与禽白血病病毒抗性有关,在个体发育早期免疫器官中表达量高,感染病毒后显著下调。抗性品系鸡G1中含有一个3碱基GCG插入突变,可能与禽白血病抗性相关。
[硕士论文] 陈洋宙
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  1.抗鸡马立克氏病病毒Meq蛋白特异性单克隆抗体研制
  本研究根据NCBI中已发表的MDV-RB1B-Meq序列,设计合成一条特异性引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出特异性的Meq片段。利用EcoRⅠ和XbaⅠ两种限制性内切酶对Meq基因和Pcold-TF空载体进行酶切,将两者酶切产物进行连接,转化至BL21大肠杆菌,筛出阳性表达菌,获得重组质粒Pcold-TF-Meq。酶切分析、SDS-PAGE和Westernblotting鉴定的结果表明:构建的Pcold-TF原核表达载体正确,基因序列分析结果与预期完全一致。转染BL21原核表达细菌通过大量诱导,并裂解细菌,结果在上清中获得大量表达的MDV-RB1B-Meq重组蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳和Wenstern Blot鉴定,结果在77 Kda分子量有一特异性条带。切取该特异性蛋白条带作为免疫原,对Balb/cc小鼠进行4次免疫,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行细胞融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光(IFA)检测杂交瘤细胞上清,结果成功获得了一株对Meq蛋白具有特异性的杂交瘤细胞,命名为MDV-5F4。经2次亚克隆,杂交瘤细胞达到100%分泌抗MDV-Meq蛋白特异性抗体。酶联免疫吸附实验(ELISA)对MDV-5F4进行亚类鉴定,结果表明该单抗亚类为IgM。该单抗的成功研制,为MDV性肿瘤鉴别诊断提供了条件。
  2.抗MDV-Meq蛋白单克隆抗体的初步应用
  家禽肿瘤病主要有马立克病,禽白血病,网状内皮细胞增生症以及不明原因的其他肿瘤性疾病。为了在临床上快速鉴别肿瘤的病原,本研究利用自行研制的抗MDV-Meq的特异性单克隆抗体MDV-5F4、实验室保存的抗MDV gB蛋白的单克隆抗体MDV-BD8、抗禽白血病病毒特异性单克隆抗体ALV-5D3和抗网状内皮细胞增生症病毒的单克隆抗体REV-6C12,建立了快速检测MDV、ALV和REV等三种病原性肿瘤快速鉴别的免疫组织化学检测方法和间接免疫荧光法(IFA)。研究结果表明,该方法可以用于临床马立克氏病病毒(MDV)和禽白血病病毒(ALSV)强毒感染鸡的肿瘤组织快速的检测,对于3种肿瘤疾病的鉴定具有较好的应用前景。
[硕士论文] 王美青
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:在养鸭业中,鸭雌雄个体间因生理、行为等特性的不同导致在生产性能、饲养管理与经济用途及价值等方面存在巨大差异。在胚胎早期进行性别鉴定或者通过性别控制,提前预知甚至决定动物性别,这将会为养鸭业带来一次巨大的飞跃。本实验以凤头鸭胚为研究对象,通过比较与优化鸭胚胎期全血和尿囊液直接PCR性别鉴定方法,旨在获得一种方便、快捷、无损的早期鸭胚性别鉴定的方法。同时,通过在鸭胚中注射芳香化酶抑制剂(AI)和17β-雌二醇(E2),在性别分化关键时期观察其性腺组织学和形态学变化,成功建立鸭胚性反转模型;采用RT-qPCR方法分析AI和E2诱导的性反转鸭胚中DMRT1、SOX9、AMH、P450arom、FOXL2、SF-1等6个性别决定候选基因在性腺分化发育过程中的表达,探讨鸭性别决定相关基因的作用机制。进一步通过构建SOX9和FOXL2的干扰和过表达载体,检测性别决定关键基因的表达水平变化,为探明SOX9和FOXL2基因在鸭性别分化中功能提供理论依据。主要研究结果如下:
  1.以鸭胚全血为模板,用常规PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶直接进行PCR扩增,成功鉴定鸭胚性别,该方法同样适用于雏鸭及成年鸭血,但不适用于胚胎尿囊液性别鉴定;以鸭胚E10~E20的尿囊液为模板,应用高保真酶MightyAmp DNA Polymerase直接PCR,E17~E20的尿囊液鉴定出了鸭胚性别。两种方法均可进行直接PCR,无需提取DNA,具有简便、快速、准确特点,但胚胎期全血采样对鸭胚伤害过大,死亡率较高,难以应用于实际生产;而尿囊液属于微创采样,对孵化率影响较小,可在实际生产中推广应用。
  2.通过性腺组织形态学以及组织切片观察发现:与对照组相比,注射芳香化酶抑制剂能够使鸭雌性个体性别反转成雄性,其影响性别分化的关键时期是在8.5-10.5胚龄,并且能促进公鸭胚性腺的早熟;注射雌二醇组可使胚胎表现性别由雄性反转为雌性,其影响性别分化的关键时期也在8.5-10.5胚龄,并且能促进母鸭胚性腺的早熟。
  3.鸭胚在外源注入AI后,呈现性别反转,其中,DMRT1、SOX9、AMH在遗传雌性(ZW)胚胎性腺中表达量均出现上调趋势,表明DMRT1、AMH和SOX9等雄性决定基因与睾丸的形成紧密相关;同时P450arom、FOXL2、SF-1等雌性决定基因的表达量显著降低,与表型一致,表明AI确实能使雌性鸭胚雄性化,且能调控鸭性别决定基因表达。注入E2后发现胚胎表现性别由雄性反转为雌性,DMRT1、SOX9、AMH在遗传雄性(ZZ)胚胎性腺中表达量都明显降低,P450arom、FOXL2、SF-1的表达量均显著升高。进一步表明DMRT1、SOX9、AMH、P450arom、FOXL2、SF-1有性别决定效应,可能是通过参与性激素的合成,在性别分化后的生殖腺生长和发育过程中产生影响。
  4.在成功构建鸭SOX9基因和FOXL2基因干扰和过表达载体基础上,发现SOX9基因和OXL基因均可以调控性别决定关键基因DMRT1,还可以通过调节SF-1、AMH以及P450arom基因发挥调控性别作用,另外,SOX9和FOXL2也存在反向调控作用,进一步表明SOX9和FOXL2是决定鸭性别的关键基因。
[硕士论文] 赵凤至
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本试验旨在研究饲粮中果胶对仔鹅生产性能、养分利用率及肠道微生物区系的影响,为今后富含果胶的非常规饲料在鹅生产上的应用提供理论基础及参考依据。选用180只体重相近且健康的28日龄扬州鹅公鹅,随机分为3个组(试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组),每组6个重复,每个重复10只。试验Ⅰ组(对照组)饲喂基础饲粮,试验Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂添加1.5%和3%果胶的试验饲粮,试验期为42天。通过饲养试验、代谢试验及16sDNA测序试验分析饲粮中果胶对仔鹅生长性能、屠宰性能、养分利用率及肠道微生物区系等方面的影响。结果显示:
  (1)1.5%和3%果胶处理组显著降低了42、56、70日龄仔鹅的体重和28~70日龄平均日增重(P<0.05),提高了料重比(P<0.05);3%果胶处理组显著降低了70日龄仔鹅的胸深和胸宽(P<0.05);1.5%果胶果胶处理组显著降低了70日龄仔鹅的胸肌率(P<0.05),3%果胶处理组显著降低了70日龄仔鹅的胸肌率和腹脂率(P<0.05);3%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅的脾脏指数和腺胃指数(P<0.05),显著降低了法氏囊指数和胸腺指数(P<0.05)。
  (2)3%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅血清中谷丙转氨酶、尿酸、高密度脂蛋白的含量(P<0.05),降低了低密度脂蛋白的含量(P<0.05);1.5%和3%果胶处理组显著提高了谷草转氨酶、尿素氮和甘油三酯的含量(P<0.05);3%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅肌肉水分含量(P<0.05),降低了胸肌粗蛋白质含量和腿肌粗蛋白质、粗脂肪含量(P<0.05)。
  (3)1.5%果胶处理组显著提高了70日龄仔鹅胸腹部的羽毛评分值(P<0.05),3%果胶处理组显著提高了背部、左翅、胸腹部及尾部的羽毛评分值(P<0.05),显示果胶含量越高羽毛越脏。
  (4)1.5%和3%果胶处理组能够显著降低仔鹅对饲粮中粗蛋白质和粗脂肪的利用率(P<0.05)。
  (5)3%果胶处理组显著提高了42日龄回肠肌层厚度、56日龄日龄空肠隐窝深度、70日龄回肠重量(P<0.05),降低了42日龄十二指肠绒毛高度、56日龄十二指肠肌层厚度、回肠绒毛高度及隐窝深度、70日龄盲肠重量(P<0.05)。
  (6)肠道微生物结果显示,饲粮中较高的果胶含量:降低了仔鹅十二指肠物种丰度及物种多样性,提高了变形菌门(Proteobacteria)和螺杆菌属(Helicobacter)的相对丰度;降低了仔鹅空肠物种丰度及物种多样性,提高了厚壁菌门(Firmicutes)、螺杆菌属(Helicobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、链球菌属(Streptococcus)和巨单胞菌属(Megamonas)的相对丰度;提高了仔鹅回肠物种丰度及物种多样性,提高了厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺杆菌属(Helicobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和链球菌属(Streptococcus)的相对丰度,降低了厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度;提高了仔鹅盲肠物种丰度及物种多样性,提高了拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和梭菌属(Clostridium)的相对丰度,但降低了盲肠中拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺杆菌属(Helicobacter)、拟杆菌属(Batcteroides)的相对丰度。
  综上所述,饲粮中较高的果胶含量对仔鹅生长性能、屠宰性能、养分利用率等具有不良影响,推测果胶可通过改变肠道微生物区系对其生长性能、屠宰性能、养分利用率等产生不利影响,在生产实践中,对于一些富含果胶的饲料原料,应当注意其使用量。
[硕士论文] 吴诗樵
动物营养与饲料科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本论文利用单胃动物仿生消化系统模拟鸡胃肠道的消化,探究外源蛋白酶对饲料原料总能和氨基酸的消解规律,首先分析外源蛋白酶添加剂量和上样量对饲料原料养分消化率的影响,确定外源蛋白酶的最适添加量,继而研究不同仿生参数条件下外源蛋白酶对饲料原料体外养分消化率的影响,并分析外源蛋白酶对常用饲料原料养分消化率提升作用,为快速评价饲用酶制剂有效性提供方法参考。
  1、外源蛋白酶添加剂量和上样量对豆粕饲料原料体外养分消化率的影响。不同添加剂量的外源蛋白酶对豆粕体外干物质、能量消化率和酶水解物能值均有显著提高作用(P<0.01),并能够显著提高氨基酸消化率(P<0.05)。上样量为1g的豆粕的体外养分消化率显著高于上样量为2g时的测值(P<0.01)。外源酶的添加剂量与豆粕上样量对酶水解物能值存在互作效应(P<0.01)。外源蛋白酶添加量为2500mg/kg,豆粕剂量为1g时,豆粕的体外养分消化率最高。
  2、不同仿生参数条件下外源蛋白酶对豆粕饲料原料体外养分消化率的影响。试验共分为五个部分,分别研究在不同模拟胃液接触时间、pH值、体积、蛋白酶浓度条件下外源蛋白酶的作用以及外源蛋白酶的作用部位。试验一结果表明随着胃液接触时间的延长,外源蛋白酶的消化作用越显著,豆粕的养分消化率越高,在240min时,豆粕样品中养分的消化率达到最大值。试验二结果表明豆粕的养分消化率随着pH值增加而减少,添加外源蛋白酶的豆粕在pH值为2.0时,样品的养分消化率可达到最大值(P<0.01)。试验三表明豆粕饲料的养分体外消化率随着胃液体积的减少而增加(P<0.01),但外源蛋白酶降低了豆粕干物质和能量消化率(P<0.01)。试验四结果表明豆粕消化率随着胃液蛋白酶浓度的增加而增大,胃液蛋白酶浓度为3100U/mL时达最大(P<0.01)。不添加外源蛋白酶的豆粕消化率在胃蛋白酶浓度为3100U/mL时模拟胃消化中达最大(P<0.01)。试验五试验结果表明,外源蛋白酶在胃消化阶段和小肠消化阶段均能显著提高豆粕样品的体外养分消化率(P<0.01),且有小肠段豆粕养分消化率高于胃段消化率的趋势。
  3、外源蛋白酶对鸡常用饲料原料体外养分消化率的影响。添加外源蛋白酶的鸡常用饲料原料的干物质和能量消化率与对照组差异不显著;外源蛋白酶提高了棉粕、玉米和酒糟的表观和标准化蛋氨酸消化率(P<0.05),提高了甜菜粕的组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸的标准化氨基酸消化率(P<0.05)。
[硕士论文] 甘丽娜
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:肠道不仅是猪体内重要的消化吸收器官,同时也是机体抵抗病原菌侵袭的第一道防线。肠道屏障能够防止肠内的细菌和病毒产生的有害物质穿过肠粘膜进入机体血液循环中,肠道屏障的受损与众多疾病具有密切的相关性。猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)导致的一种高度接触性肠道传染病,尤其在仔猪中具有很高的发病率和死亡率,研究发现肠道屏障的受损是导致在仔猪中发病率较高的腹泻和肠道炎症等疾病的重要内因之一。PEDV毒株的基因变异导致变异株毒力增强以及现有疫苗难以有效免疫,从遗传本质上增强仔猪对PEDV的抗性,从长远来看可能是抵抗PEDV侵害的有效方法。因此,从分子遗传学角度出发筛选与仔猪肠道屏障相关的关键候选基因,对于猪抗PEDV育种工作具有重要的科学价值和应用前景。
  本研究以43头“杜×长×大”8日龄三元杂交猪为研究对象,其中腹泻仔猪个体28头,正常仔猪个体15头。首先进行PEDV经典毒株RT-PCR检测,然后利用血清D-乳酸和DAO的ELISA含量检测初步鉴定腹泻和正常仔猪个体的肠道通透性,同时屠宰仔猪采集各肠道组织并利用扫描和透射电镜直观观察结合石蜡切片的系列检测进一步验证仔猪肠道屏障完整性,以获得确证的肠道屏障完整和受损仔猪个体表型。对肠道屏障完整和受损仔猪个体肠道粘膜使用RNA-seq测序技术筛选重要调控通路及差异表达基因,并对重要候选基因进行个体和细胞水平的初步功能验证,主要试验结果如下:
  1、基于M基因的序列使用邻接法建立进化树发现腹泻病猪肠道内的毒株与目前国内外的PEDV流行株具有较高的同源性,由此确认本研究中的腹泻病猪均为PEDV病毒感染。然后采用血清D-乳酸和DAO含量检测从腹泻和正常个体中共剔除仔猪15头,初步将仔猪鉴定为肠道屏障完整组和受损组。扫描和透射电镜以及石蜡切片染色的结果显示,典型的肠道屏障完整仔猪肠黏膜结构完整,层次分明,绒毛长度和宽度均显著高于受损个体(P<0.05),黏膜上皮细胞的轮廓清晰,排列规则,杯状细胞数量较多。典型的肠道屏障受损仔猪肠道发生明显病变,肠道绒毛脱落,破损,固有层暴露,肠腺萎缩,杯状细胞数量较少。最终成功获得确证的肠道屏障受损仔猪10头,肠道屏障完整仔猪12头。本研究使用血清D-乳酸和DAO的ELISA含量检测、肠道组织扫描和透射电镜直观观察、石蜡切片检测等一系列实验建立了仔猪肠道粘膜屏障完整性的评价体系,最终成功获得了确证的肠道屏障受损和完整仔猪个体,为下一步仔猪抗腹泻病等肠道疾病的研究工作提供了宝贵的素材,同时为今后猪肠道屏障研究素材的获得提供了一个有效可行的方法和途径。
  2、使用RNA-seq技术对肠道屏障完整和受损仔猪空肠粘膜组织进行转录组测序,分别获得110.62、101.07、129.27、100.18和113.57、108.03、99.84、111.55百万个raw reads,采用HISAT2对过滤后的reads进行参考基因组的比对分析后发现Total mapped在90.75%~95.41%之间,超过70%的预期结果。3.11%~6.78%的reads在参考基因组序列上具有多处比对位置,85.43%~91.76%的reads比对位置唯一。根据p-adjust<0.05的原则,在肠道屏障完整组和受损组之间共筛选出差异表达基因(differentially expression genes,DEGs)3721个,其中受损组上调基因具有2151个,下调基因1570个。根据GO富集分析的结果筛选得到57条显著富集的GO分类(22条BP,11条CC,24条MF),CC主要包括细胞内部分(intracellular part)、细胞内细胞器(intracellular organelle)和细胞器(organelle)等,MF主要包括核苷酸结合域(nucleotide binding)、核苷磷酸结合(nucleoside phosphate binding)和小分子结合(small molecule binding)等。KEGG分析显示DEGs主要被富集到甘油酯代谢(Glycerolipid metabolism)、磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositol signaling system)和肌醇磷酸盐代谢(Inositol phosphate metabolism)等通路中。
  3.基于基因的高表达差异倍数和生物学功能筛选了SELE、LRRK1、1TPR2、EDA、KIAA1429、PRAP1、ALPI、SDR16C5、CLDN10、ASAH、AGPAT3和KCNJ12等12个重要的候选基因,并利用实时荧光定量PCR验证转录组测序的分析结果,发现实时荧光定量的结果与转录组测序结果一致,表明转录组测序的结果准确度较高。进一步在细胞水平上通过PEDV感染IPEC-J2细胞检测这12个候选基因的表达变化,结果发现在感染PEDV病毒后这些候选基因没有发生显著的差异表达,进一步证实这些候选基因可能并不直接参与仔猪抗PEDV感染的免疫应答,而是通过维持或提高仔猪肠道屏障的完整性来抵抗PEDV感染。
[硕士论文] 李士洋
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:美洛昔康(meloxicam)为烯醇酰胺类的新型非甾体抗炎药(NSAIDS),为COX-2选择性抑制剂,具有良好的镇痛、抗炎作用。因该药不良反应少,许多国家已用之代替其他非甾体抗炎药,广泛应用于镇痛、抗关节炎(OA)和类风湿性关节炎(RA)及其他急慢性炎症。美洛昔康也是目前众多获批的用于犬临床的非甾体抗炎药(NSAIDs)中的一种。在欧洲批准的犬用美洛昔康制剂有注射剂、片剂和口服混悬液,可用于缓解犬急性和慢性肌肉骨骼疾病引起的炎症和疼痛。本研究在建立犬血浆中美洛昔康含量测定的高效液相色谱法基础上,以美洛昔康原研药为参比品进行国产仿制品生物等效性试验,以确定国产美洛昔康咀嚼片和原研药是否具有临床可替代性,为国产美洛昔康咀嚼片的临床合理用药提供依据。
  1.建立犬血浆中美洛昔康含量高效液相色谱法测定方法
  犬血浆中美洛昔康采用液液萃取法提取,采用Agilent HC-C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱和等度洗脱对待测样品中的各成分进行分离,采用Agilent1260色谱系统进行定量分析,外标法定量。流动相:乙腈∶0.1%磷酸水溶液(pH2.5)=65∶35(V/V),流速:1mL/min,柱温:35℃,进样量为20μL,紫外检测波长λ=355nm。在本试验条件下,美洛昔康在0.05~5μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数达到0.999。检测限(LOD)为0.02μg/mL,定量限(LOQ)为0.05μg/mL。美洛昔康三个空白血浆添加浓度样品(0.05、1、5μg/mL)的回收率均在82%~108%之间,变异系数均小于8%。稳定性试验结果表明,美洛昔康储备液在冻存条件下、待测样品在冻存和室温下放置,以及反复冻融下待测物均具有良好的稳定性。本试验建立的犬血浆中美洛昔康含量的HPLC测定方法可用于犬血浆中美洛昔康含量的测定。
  2.美洛昔康咀嚼片在犬体内药动学及生物等效性研究
  18只体重较为一致的雄性健康比格犬,随机分为2组,采用交叉实验设计。第一阶段1-9号犬单剂量(0.25mg/kg bw)口服给药受试美洛昔康咀嚼片,10-18号犬单剂量(0.25mg/kg bw)口服给药参比美洛昔康咀嚼片;第二阶段1-9号犬单剂量(0.25mg/kg bw)口服给药参比美洛昔康咀嚼片,10-18号犬单剂量(0.25mg/kg bw)口服给药受试美洛昔康咀嚼片。两阶段药物清洗期为2周。给药后按预定时间点采集血样。采用经验证的HPLC法测定血浆样品中的美洛昔康浓度。实测血浆药物浓度-时间数据采用Winnonlin6.4药动学软件拟合药代动力学参数。
  犬单剂量口服美洛昔康咀嚼片受试品和参比品后,平均消除半衰期(t1/2)分别为(19.0±5.4)h和(21.3±3.4)h,达峰时间(Tmax)分别为(4.1±2.1)h和(4.9±1.6)h,达峰浓度(Cmax)分别为(0.896±0.159)μg/mL和(0.816±0.203)μg/mL,平均滞留时间(MRT)分别为(20.6±3.1)h和(22.5±2.7)h,平均药时曲线下面积(AUC0~t)分别为(22.121±3.512)μg·h mL-1和(19.807±3.963)μg h·mL-1。以美洛昔康原研产品为参比,受试品的相对生物利用度(F)为111.81%。药动学研究结果显示,美洛昔康咀嚼片口服给药在犬体内消除较慢,且受试品与参比品在犬体内具有相似的药动学特征。统计学分析表明,美洛昔康咀嚼片受试品和参比品的主要药代动力学参数间均无显著性差异(p>0.05)。
  采用WINNONLIN6.4版药代参数计算软件分别对美洛昔康受试品与参比品的Cmax(经对数转换)、AUC0-t(经对数转换)和AUC0-∞(经对数转换)进行生物等效性检验,美洛昔康受试品与参比品Cmax的对数均值之比为109.93%,90%置信区间分别为96.63%~125.06%,美洛昔康受试品Cmax的90%置信区间介于参比品70%~143%范围之间;美洛昔康受试品与参比品AUC0-t的对数均值之比为111.81%,90%置信区间为103.56%~120.72%;美洛昔康受试品与参比品AUC0-∞的对数均值之比为112.68%,90%置信区间为104.38%~121.63%。美洛昔康受试品AUC的90%置信区间介于参比品80%~125%范围之间。依据制剂生物等效性评价标准,国产美洛昔康咀嚼片与进口同类药物生物等效,表明国产美洛昔康咀嚼片与进口同类产品在临床上可相互替代。
[硕士论文] 穆琳
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(Solute carrier family7member11,Slc7a11)属于溶质转运第7家族的第11个成员,编码胱氨酸/谷氨酸xCT运载体,控制褐黑色素合成从而影响真黑色素与总黑色素的比例,改变动物的毛色和肤色。课题组前期研究中,发现Slc7a11基因在不同毛色獭兔皮肤中表达存在显著差异,推测其可能参与到獭兔皮毛色素沉积过程。为了进一步探究Slc7a11在色素沉积中的分子调控机制,本研究分离并鉴定了兔黑色素细胞,利用荧光定量及Wes全自动蛋白质印迹定量分析等技术手段分析了Slc7a11在獭兔不同毛色皮肤中的表达规律,并通过双荧光素酶和EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assays)实验验证了转录因子POU2F1又名Oct-1(Octamer Transcription factor-1)对Slc7a11基因启动子的转录激活有重要的调控作用。该研究结果为拓展Slc7a11在獭兔皮毛黑色素沉积中的功能,深入解析被毛色素沉积机理提供研究基础。
  主要研究结果如下:
  1、首次分离并鉴定了兔黑色素细胞,为本研究的开展提供实验素材。采集黑色獭兔背部皮肤,利用两步酶消化法分离兔黑色素细胞,发现其呈现特有的两极树突状,且具有特殊的生长晕、折光性强。Real-time-PCR检测黑色素细胞标志基因MITF、TYR、TYRP1,发现其均有表达。利用左旋多巴(L-DOPA)染色方法对分离的黑色素细胞进行染色,发现细胞中呈现棕色或者黑色颗粒。进行S-100、TYR、TYRP1的免疫细胞化学染色,发现3种标记物在黑色素细胞内均有表达,与阴性对照相比,S-100染色显示胞质及树突呈棕色阳性着色,TYR染色细胞核内为棕黄色,TYRP1呈现浅棕着色,均为阳性,说明成功分离和鉴定了兔黑色素细胞。
  2、利用RACE和克隆技术获得Slc7a11cDNA序列,包括31bp5'UTR、1509bp的开放阅读框(ORF)和132bp3'UTRs(含poly[A]tail),提交GenBank(登录号为KY971639.1)。通过免疫组织化学法分析Slc7a11蛋白在獭兔皮肤组织中的定位,结果显示Slc7a11在表皮、毛囊毛球部、毛根鞘均有蓝色阳性反应,着色深浅不等,表达部位较广泛。利用Real-time qPCR检测Slc7a11基因在不同毛色獭兔皮毛中的mRNA表达水平,发现其在蛋白黄色被毛皮肤中的表达量最高,是白色皮肤的3.7倍;利用Wes系统检测Slc7a11蛋白在各毛色皮肤组织中均有表达,但蛋白青色与蛋白黄色皮肤组织中的表达量高于其他毛色,提示Slc7a11与獭兔毛色形成相关。
  3、为进一步分析Slc7a11基因在黑色素生成过程中的作用机理,通过siRNA干扰与过表达技术,转染兔黑色素细胞,利用荧光定量PCR及Wes检测MITF、TYR等毛色相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现Slc7a11过表达或抑制时,色素生成密切相关的基因的mRNA和蛋白表达量也显著变化,mRNA和蛋白表达量呈显著正相关(P<0.05),与Slc7a11表达变化情况一致。通过酶标仪检测转染之后的黑色素细胞黑色素含量,发现Slc7a11过表达/抑制时,与对照组相比,黑色素含量增加/降低。由此得出,Slc7a11可影响TYR、MITF等色素沉积相关基因的表达,进而影响黑色素生成。
  4、为了进一步揭示Slc7a11基因的调控机制,克隆了Slc7a11起始密码子前2499bp的启动子序列,首先通过预测分析Slc7a11启动子区域内潜在的转录因子,并据此构建了10个系列缺失载体,转染RAB-9细胞,利用双荧光素酶报告系统检测发现Slc7a11启动子的核心区域为-769~-619bp,经预测发现该区域存在转录因子POU2F1结合位点。利用定点突变技术,将该结合位点进行有效突变,发现突变后Slc7a11启动子活性极显著上升(P<0.01),说明POU2F1对Slc7a11启动子活性有抑制作用。进一步利用竞争性EMSA实验,确认POU2F1蛋白可结合于Slc7a11启动子-713~-703bp区域调控Slc7a11启动子活性。
[博士论文] 李婷婷
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:畜禽的产肉潜力与其肌纤维数量密切相关,而动物胚胎发育后期和动物出生后,肌纤维数量基本已固定。胚胎肌肉发生主要依赖于成肌细胞的增殖和分化,其增殖和分化的能力很大程度上能够决定动物出生后的肌纤维数量。为了探讨家禽骨骼肌发育的受调控情况,特别是由成肌细胞向肌管分化的过程,本研究以鸡为研究对象,以鸡原代成肌细胞为工具,利用RNA-seq技术对鸡原代成肌细胞分化过程中的mRNA、lncRNA和miRNA进行鉴定和分析,主要结果如下:
  研究一:分离培养鸡原代成肌细胞并诱导分化,利用RNA-seq技术分析成肌分化第0、1、3和5天的lncRNAs和mRNAs表达情况,结合生物信息学分析方法,鉴定在成肌分化过程中表达的lncRNAs,预测其可能的生物学功能。同时筛选成肌分化过程中的差异表达lncRNAs和mRNAs,进行K-means表达聚类分析。
  1、共鉴定出2,484条lncRNAs,其中包括2,285条基因间区长链非编码RNAs和199条反义长链非编码RNAs。这些lncRNAs在染色体上的分布具有明显的偏好性,1号染色体上分布最多(367)。与鸡已知的蛋白编码基因相比,lncRNAs具有更短的转录本、ORF长度以及更少的外显子数。
  2、选取lncRNA上下游10kb范围内的蛋白编码基因为其cis作用的靶基因,结果在1,530个lncRNAs附近共发现2,041个蛋白编码基因。功能富集分析显示,鸡原代成肌细胞分化过程中的lncRNAs在多条骨骼肌发育相关的通路中显着富集,如肌动蛋白细胞骨架调节、胰岛素信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路以及黏着斑。
  3、以皮尔森相关系数为筛选依据(r>0.95或r<-0.95,p<0.05),选择与lncRNAs显着相关的蛋白编码基因为其trans作用的靶基因,结果发现990个lncRNAs与7,436个蛋白编码基因显着相关,78,202对为正相关关系,27,724对为负相关关系。功能富集分析显示,鸡原代成肌细胞分化过程中的lncRNAs主要被富集在细胞周期、黏着斑、p53信号通路以及细胞外基质受体互作等生物学通路,参与成肌细胞增殖、分化和融合过程。
  4、在鸡原代成肌细胞分化过程中共筛选到906个差异表达lncRNAs和4,422差异表达mRNAs。功能富集分析显示,差异表达基因主要富集在骨骼肌分化、有丝分裂、细胞迁移和粘附等相关的生物学进程,同时发现多个成肌分化相关通路,如ECM受体互作、黏着斑、DNA复制、细胞粘附分子、细胞周期、肌动蛋白细胞骨架调控、PPAR信号通路等。
  5、对差异表达基因表达数据进行K-means聚类分析,最终将4,422个差异表达基因聚为4个类别(命名为K1、K2、K3和K4)。功能富集分析表明,K1可能在成肌细胞增殖或由增殖过渡到分化过程发挥重要作用;K4可能与成肌细胞分化启动或初始分化密切相关;K2和K3则可能与成肌细胞迁移、粘附以及融合有关。
  研究二:基于cis靶基因预测,联合差异表达基因数据,构建lncRNA-mRNA互作调控网络,筛选参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子;以鸡原代成肌细胞分化过程中的差异表达lncRNAs和差异表达mRNAs为数据源进行WGCNA分析,鉴定成肌分化过程中的功能模块,筛选调控鸡骨骼肌分化的重要候选因子。
  1、构建差异表达lncRNAs及其共表达cis作用靶基因间的互作网络。该网络中lncRNAs主要被富集在肌动蛋白细胞骨架调节、ErbB信号通路和胰岛素信号通路,参与骨骼肌分化、有丝分裂、细胞迁移和粘附等相关的生物学进程。SIX2、PAK3、HA CD1、SULF1、SOCS1、MFN2、SIK1、CFL2、ACTC1、TNNI2等以及与它们关联的lncRNAs可被视为参与调控鸡骨骼肌发育的重要候选分子。
  2、WGCNA分析鉴定到6个与有丝分裂、肌细胞分化、肌动蛋白细胞骨架动态调节、能量代谢、细胞迁移和粘附等GO分类密切相关的基因模块。模块中高连通性枢纽基因可能对骨骼肌发育具有潜在的重要作用,包括TRIM55、DES、FAM65B、ACTC1、TNNI2、FEN1、AIF1L、ALDBGALT0000002581、NEK6、FAR-1等。
  研究三:利用RNA-seq技术获得成肌分化过程中miRNA的表达谱。结合生物信息学分析方法,鉴定在成肌分化过程中表达的miRNAs,预测其可能的生物学功能。同时,整合差异表达miRNAs和mRNAs表达数据,辅以多种功能性分析和互作网络构建软件进行miRNA-mRNA联合分析,筛选参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子。
  1、共鉴定出712个miRNAs成熟体,对应584个miRNA前体,属于123个miRNAs家族,此外还鉴定到224个新miRNAs。
  2、鸡原代成肌细胞中miRNA的表达量普遍较低,其中TPM在1-10的miRNAs数目占总miRNAs数量的85.32%以上,大于10,000的miRNAs仅占1.4%左右。
  3、每个文库表达丰度前15共19个miRNAs的靶标通路分析表明,介导靶向抑制参与鸡原代成肌细胞分化调控的功能性miRNAome可能很小且趋于高表达。
  4、对成肌细胞不同分化阶段的miRNA表达进行差异表达分析,共鉴定出298个DEMs。相邻阶段DEMs功能富集分析显示,DEMs在骨骼肌发育、有丝分裂、细胞迁移和粘附相关的通路显着富集。
  5、构建差异表达miRNAs及其差异表达靶基因间的互作调控网络,筛选到多个参与鸡骨骼肌发育调控的潜在候选因子,如miR-206、miR-133b、miR-204、miR-214、miR-7、miR-7b、miR-146b-5p、miR-222b-5p、miR-10a-5p、miR-203a、miR-10b-5p、miR-34a-5p、miR-218-5p、CDK6、AOX1、FS TL1、SESN1、TIMP2等。
[硕士论文] 曹正锋
养殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:随着人民生活水平的不断提高,风味独特、肉质鲜美的肉产品越来越受到消费者欢迎。一般认为,肉品质除受品种、饲养环境与方式、饲料营养水平等因素影响外,上市日龄对肉品质的影响也非常大。研究已发现,随着日龄的增加,体内的呈味物质(氨基酸等)也随之变化,从而使肉品质发生改变。但由于在肉鸭上缺乏相关的研究,导致其上市日龄不统一,产品参差不齐。本研究以樱桃谷鸭和白改鸭为研究对象,分别探讨不同日龄对肉鸭肌肉发育及营养物质含量的影响,以期为快大型肉鸭和优质小型肉鸭确定合理的上市日龄与产品分级提供参考依据。试验主要结果如下:
  1.不同日龄对樱桃谷鸭肌肉生长发育的影响:对28日龄、38日龄、42日龄、45日龄等不同日龄樱桃谷鸭肌肉生长和肌纤维发育进行测定,结果显示,樱桃谷鸭38日龄后增重速度明显减缓,胸、腿肌重也表现为类似的趋势;肌纤维面积测定结果显示,早期胸肌和腿肌的肌纤维面积增粗明显,38日龄胸肌、腿肌的肌纤维面积分别达791.48μm2,3180.76μm2,而后随日龄增加,腿肌肌纤维发育开始滞缓,42日龄后,胸肌肌纤维发育也出现减慢。不同日龄肌肉发育相关基因表达量检测结果表明,胸肌PPAR-α和MyoD表达量在38日龄时达到峰值,腿肌在42日龄时达到峰值,而胸肌MSTN的表达量在45日龄时达到最高,腿肌MSTN在42日龄时达到最高。由上可以看出,樱桃谷鸭38-42日龄肌肉生长和肌纤维发育达到最佳,而45日龄时出现明显的滞缓。
  2.不同日龄对樱桃谷鸭肌肉营养物质沉积的影响:对28日龄、38日龄、42日龄、45日龄等不同日龄樱桃谷鸭肌肉常规营养成分、金属元素含量、氨基酸含量和脂肪酸含量进行测定,结果显示,38日龄时胸肌蛋白含量达22.62%,显著高于其他3个时期(P<0.05),而42日龄时脂肪含量达到最低水平;胸肌中Fe、Mg、P、K含量均在38日龄时最高,Cu含量在42日龄时最高;肌肉氨基酸含量测定结果显示,除蛋氨酸外,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等6种人体必需氨基酸和丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸等呈味氨基酸均在38日龄时达到峰值,其中38日龄时肌肉谷氨酸含量达到了33.72g/kg;肌肉脂肪酸含量测定结果表明,38日龄胸肌中花生四烯酸、DHA、多不饱和脂肪酸含量达到峰值,而硬脂酸、饱和脂肪酸含量在42日龄表现最高。由上可以看出,从绝大多数指标来看,38-42日龄肌肉营养物质沉积达到峰值。
  3.不同日龄对小型肉鸭肌肉生长发育的影响:对42日龄、49日龄、56日龄的白改鸭和莆田黑鸭肌肉生长和肌纤维发育进行测定,结果显示:白改鸭早期生长发育明显快于莆田黑鸭,且两者在49-56日龄阶段体重及胸、腿肌的增重速度均有所减缓;肌纤维面积测定结果显示,白改鸭与莆田黑鸭肌纤维生长发育趋势相似,49-56日龄阶段胸、腿肌肌纤维面积增大的趋势逐渐减小,56日龄时胸肌分别达到719.74μm2、611.45μm2,腿肌分别达到2608.32μm2、2360.56μm2;不同日龄肌肉发育相关基因表达量检测结果表明,白改鸭胸、腿肌的PPAR-α、MSTN基因均在56日龄时表达量最高,而腿肌MyoD基因在56日龄时达到峰值。由此看出,白改鸭早期生长和肌纤维发育较快,但49日龄后增幅明显减缓。
  4.不同日龄对小型肉鸭肌肉营养物质沉积的影响:以白改鸭和莆田黑鸭为实验材料,对42日龄、49日龄、56日龄的肌肉常规营养成分、金属元素含量、氨基酸含量和脂肪酸含量进行了测定。结果显示,白改鸭与莆田黑鸭肌肉蛋白沉积和金属元素沉积表现出相似的趋势,胸肌蛋白含量均在56日龄时最高(p<0.05),胸肌中Ca、Mg、P、K等金属元素均在56日龄达到峰值,但两者脂肪沉积表现出相反的趋势,随日龄增加,白改鸭肌肉脂肪随之升高,莆田黑鸭变化不明显。肌肉氨基酸含量测定结果显示,除莆田黑鸭肌肉中苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸外,两个品种肌肉的苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等人体必需氨基酸随日龄增加变化不明显;除莆田黑鸭肌肉甘氨酸和脯氨酸外,两个品种的谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸等呈味氨基酸也随日龄增长而变化不明显。脂肪酸含量测定结果表明,不同鸭品种表现出一定的差异性,白改鸭的胸肌中多种不饱和脂肪酸在49或56日龄处有较高含量的富集,莆田黑鸭的胸肌中多种不饱和脂肪酸的含量在42或56日龄处有较高的富集。由上可以看出,对于小型鸭而言,肌肉中蛋白含量,Ca、Mg、P、K等金属元素含量以及不饱和脂肪酸含量随着日龄增加而增加;但肌肉氨基酸含量随日龄增加沉积不明显。这一结果也澄清了并非所有肌肉营养物质都是随着日龄增加而逐渐转化和积累的观点。
  综上,对于大型肉鸭(樱桃谷鸭)而言,38-42日龄时肌肉生长和肌纤维发育达到最佳,且在该时期内,肌肉蛋白含量,Fe、Mg、P、K等金属元素含量,丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸等呈味氨基酸含量以及花生四烯酸、DHA、多不饱和脂肪酸含量达到峰值,因此建议生产中,大型肉鸭以38-42日龄上市为宜。对于白改鸭而言,早期生长和肌纤维发育较快,49日龄后增幅明显减缓;且随着日龄增加,肌肉中蛋白含量,Ca、Mg、P、K等金属元素含量,不饱和脂肪酸含量而增加,56日龄达到最大值,建议生产中以56日龄上市为宜;鉴于莆田黑鸭56日龄体重较小,可适当延长上市时间。
[博士论文] 刘颖
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:肠道微生物菌群变化和免疫应答在动物机体生长、发育过程中发挥重要的作用,为了系统地揭示猪从初生到成年阶段肠道微生物变化以及免疫调控的遗传基础和分子机制,本研究以中国地方代表性品种—梅山猪为试验对象,一方面利用16S rDNA测序技术,并结合OTU分析、物种分类和丰度分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析等一系列生物信息学技术分析了梅山猪在8个不同发育阶段(初生1日龄、7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、35日龄、120日龄和180日龄)肠道6个区段(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)肠道微生物的分布情况;另一方面,利用长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)测序分析了以上不同日龄脾脏组织中lncRNA和mRNA表达水平,并通过加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)筛选重要的lncRNA、免疫调控通路以及功能基因,在此基础上利用qPCR分析免疫调控通路中相关基因在不同生长发育阶段梅山猪免疫和肠道组织中的表达水平,其次结合cis和trans机制预测其lncRNA靶基因,并结合RNA immunoprecipitation(RIP)-PCR验证lncRNA与靶基因的相互作用关系,确定lncRNA调控的重要靶基因,进而利用焦磷酸测序技术分析了关键靶基因启动子甲基化修饰对其发育性表达水平的调控作用。主要结果如下:
  1.梅山猪不同发育时期肠道微生物变化分析
  (1)8个不同发育阶段肠道6个区段240个肠道消化物样本共检测到4465个OTU,肠道6个区段按照微生物组成结构和丰度可分为3个部分,分别为十二指肠和空肠组成一类,回肠单独一类,盲肠、结肠和直肠为一类。在十二指肠—空肠段乳酸杆菌(Lactobacillus)和拟杆菌(Bacteroides)为主要优势菌;在回肠中梭菌属(Fusobacterium)和埃希氏杆菌属(Escherichia)为优势菌;在盲肠—结肠段普氏菌属(Prevotella)含量最多。
  (2)仔猪出生第1天时,6个肠段中微生物组成十分相似,之后随着时间各自演变,肠道菌群在不同肠段表现出明显的时间和空间特异性,但是总体来说大肠(盲肠、结肠和直肠)肠道微生物的变化规律比小肠(十二指肠、空肠和回肠)更为明显。
  (3)追踪一些和采食以及免疫相关的菌种发现,在不同肠段中它们随时间变化巨大,表明日粮结构改变和免疫调节是影响肠道微生物菌群自出生开始变化最重要的两个因素。此外,不同肠段微生物组成不同,也暗示着不同肠段的消化功能不同。
  2.梅山猪不同发育时期免疫调控分子机制分析
  (1)8个不同发育阶段脾脏组织lncRNA测序总共获得251.8Gb clean reads,基于CNCI分析、CPC分析、PFAM分析和PLEK分析,筛选获得3200个候选lncRNAs;不同日龄间脾脏组织中差异表达lncRNA和mRNA分析显示,以1日龄为参照,7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、35日龄、120日龄、180日龄分别与其存在123、53、146、35、129、310、276个差异lncRNA,存在2726、1067、2360、1015、2108、4860、4598个差异mRNA;WGCNA分析显示,lncRNA和mRNA转录本被划分成为13个模块,其中purple和grey模板与时间点存在显著的相关性。模块中基因参与KEGG通路富集分析显示,purple模块中免疫通路NF-kappa B signaling pathway高度富集,其中包括TLR4、IL-1β、IFN-α等免疫调控基因,以及TCONS_00112081、TCONS_00028679等2个关键lncRNA。靶基因预测发现TCONS_00028679下游10kb内存在一个免疫相关靶基因TNF-α,RIP-PCR验证发现,TCONS_00028679与TNF-α存在相互作用。
  (2)不同发育时期组织表达检测显示,TLR4、TNF-α、IL-1β和IFN-α基因在不同发育阶段梅山猪的免疫组织(脾、胸腺、淋巴)和肠道组织(十二指肠、空肠和回肠)中均有表达,其中TLR4基因在脾脏组织中表达水平较高,在其他组织中的表达水平较低,在7和35日龄阶段脾脏和淋巴组织TLR4表达水平明显低于其他不同日龄,在21和35日龄阶段肠道组织TLR4表达水平明显低于其他不同日龄。IFN-α、IL-1β和TNF-α基因在免疫和肠道组织中的表达水平变化随发育阶段的变化较大,IFN-α基因在21、120和180日龄的表达水平明显高于其他阶段,IL-1β在120和180日龄的肠道组织中的表达水平明显高于其他阶段,TNF-α在21和180日龄表达水平明显高于其他阶段;聚类分析发现,免疫组织(脾、胸腺、淋巴)中TLR4、TNF-α、IL-1β和IFN-α基因表达水平比较接近,肠道组织(十二指肠、空肠和回肠)中4种基因表达水平比较接近;表达水平相关性分析显示,TLR4、TNF-α、IL-1β和IFN-α在免疫和肠道组织中表达水平间均存在显著的相关性,表明TLR4、TNF-α、IL-1β和IFN-α在免疫调控中发挥了协同作用。
  (3)猪TNF-α基因启动子区存在1个CpG区域(417bp),甲基化检测发现,随着不同日龄增长,TNF-α基因启动子区甲基化水平表现为上升,其中35日龄梅山猪脾脏组织甲基化水平极显著高于其它不同日龄,其次21日龄和28日龄甲基化水平也较高;平均甲基化水平和mRNA表达的相关系数为-0.775,P值为4.87E-07,结合双荧光素酶验证,表明TNF-α基因启动子甲基化水平与mRNA表达水平表现为极显著负相关,其中4个CpG位点(CpG-6、CpG-8、CpG-11和CpG-15)均与mRNA表达水平呈显著负相关,并位于ELK4、Sp1、TFAP2B等转录因子结合域内。
  本研究利用16S rDNA和lncRNA测序揭示了梅山猪从初生到成年阶段肠道微生物变化以及免疫调控的遗传基础和分子机制,不仅构建了一个完整的梅山猪肠道微生物数据库,而且筛选出TLR4、IL-1β、IFN-α等功能基因,非编码RNA—TCONS_00028679及其靶基因TNF-α在梅山猪生长发育过程中发挥重要的免疫调控作用,为今后从肠道微生物和免疫调控层面来科学合理设计猪抗病育种策略奠定基础和提供理论依据。
[博士论文] 王莎莎
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鸭脂肪细胞的形成与脂肪沉积属于复杂性状,一方面脂肪组织在维持机体稳态具有重要作用,另一方面脂肪异位过度沉积与饲料转化率、机体疾病密切相关。另外,肌肉与皮下、腹部组织中对脂肪含量的需求也截然不同,这些都是行业亟待解决的关键问题。本研究以脂肪沉积存在显著差异的樱桃谷鸭、凤头鸭及其F2资源群体为对象,从群体表型、全基因组、转录组水平等筛选出影响鸭脂肪细胞形成与脂肪沉积的候选功能基因,并整合全基因组关联分析(GWAS)与RNA组学数据,利用联合荟萃分析的方法,进一步鉴定出与脂肪生成与沉积相关的关键功能基因,旨在筛选出一批影响鸭脂肪生成与沉积的候选功能基因,为全面揭示不同鸭品种、不同部位脂肪生成与沉积的分子调控机制以及降低脂肪异位沉积造成的危害提供参考依据。
  主要研究结果如下:
  1.鸭原代前脂肪细胞诱导体系建立与成脂能力研究
  以20胚龄(E20)樱桃谷鸭脂肪组织为材料,胶原酶消化分离培养鸭原代前脂肪细胞。由于家禽的脂肪细胞自身不能合成脂肪酸,因此需要添加外源脂肪酸刺激成脂,本研究选用油酸作为鸭原代前脂肪细胞诱导剂,在10μg/μL胰岛素,1μm/L DEX,0.5mmol/L IBMX,1μM罗格列酮组成的基础配方中添加不同浓度油酸(100μM,300μM,600μM),来探究油酸在鸭前脂肪细胞成脂过程中的作用。通过表型的定性观察和定量测定,发现在诱导2天后,视野中发现形似亮斑的小脂滴,油红O染色为红色的亮斑,诱导4-6天后,小脂滴逐渐累积,体积从小到大,梭形的前脂肪细胞开始回缩,诱导8天后,前脂肪细胞分化为圆形的脂肪细胞,细胞质被大量的脂滴填充,细胞核位于一侧,视野中的前脂肪细胞发育成椭圆形或圆形成熟脂肪细胞,所有细胞几乎都染成红色,而作为脂滴主要成分的甘油三酯含量随着诱导时间的增加逐渐升高。同时,发现在油酸添加量为300μM时,前脂肪细胞的成脂量最高,且在一定范围内,随着油酸浓度的增加,成脂量逐渐增加,增加到600μM时,油酸对成脂存在一定程度的抑制作用。根据诱导效率和表型检测,最终建立了最佳诱导体系:10μg/uL胰岛素,1μm/L DEX,0.5mmol/L IBMX,1μM罗格列酮以及300μM油酸,成功将鸭前脂肪细胞诱导为脂肪细胞。
  生产中发现大体型肉鸭品种—樱桃谷鸭与小体型鸭品种—凤头鸭相比,无论是在肌内脂肪、腹脂含量或者皮下脂肪含量上均存在显著差异,推断其前脂肪细胞的成脂能力可能存在差异。通过分离樱桃谷鸭与凤头鸭胚胎20天(E20)脂肪组织的前脂肪细胞,经过3天体外诱导后,通过CCK-8检测发现樱桃谷鸭在前脂肪细胞的增殖能力以及脂肪细胞中TG含量均显著高于凤头鸭,表明了大体型的樱桃谷鸭具有较强的脂肪生成能力。
  2.全转录组测序筛选鸭脂肪细胞成脂关键功能基因
  为筛选鸭脂肪细胞成脂关键功能基因,以20胚龄(E20)樱桃谷鸭原代脂肪前体细胞为素材,在上述前脂肪细胞的体外分离与诱导模型的基础上,对前脂肪细胞与诱导72h后的脂肪细胞进行全转录组测序,分析mRNA,miRNA,lncRNA与circRNA的差异。结果表明,与前脂肪细胞相比,诱导72h后的脂肪细胞中共筛选到4702个差异表达的mRNA(2606个基因显著上调,2096个基因显著下调),839个差异表达的lncRNA(58个lncRNA显著上调,781个lncRNA显著下调),141个差异表达的circRNA(66个circRNA显著上调,75个circRNA显著下调),59个差异表达的miRNA(32个miRNA显著上调,27个miRNA显著下调)。通过GO与KEGG功能注释发现,差异基因大量地富集在与脂肪有关的不饱和脂肪酸、脂肪酸的生物合成以及细胞代谢等过程中,通路分析的结果显示,差异表达基因显著富集在脂肪酸代谢通路,类固醇的生物合成,PPARγ信号通路等。采用RT-qPCR对9个mRNA,7个lncRNA,7个circRNA,15个miRNA在樱桃谷鸭样本上进行验证,发现表达趋势、差异显著性与转录组测序结果均一致,证实了转录组测序结果的可靠性。通过生物信息学预测了差异表达lncRNA与circRNA的靶向miRNA,构建了lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA的竞争内源调控机制,其中,起关键的作用包括XLOC_014103-miR-181b-5p-MMP13,XLOC_001895-miR-122-5P-KLF2,circ_0003172-miR-15c-5p-LYZ,circ_0009143-miR-206-FAS和circ_0003172-miR-219b-KLF2等,为进一步研究鸭脂肪细胞中的成脂机制奠定了基础,筛选出与成脂过程中的关键RNA。
  在上述初步筛选的基础上,我们将鸭脂肪细胞成脂关键功能基因,包括DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL进行细胞水平的功能验证,发现随着前脂肪细胞的分化与脂肪形成的过程中,DLK1作为前脂肪细胞因子在前脂肪细胞中表达量最高,伴随着诱导过程其表达量逐渐下降,到诱导10天后,DLK1的表达量最低,几乎不表达。FABP4和LPL基因的表达量最高峰出现在诱导10天后,而在诱导8天后,C/EBPα和FAS的表达量达到最高点。随着诱导分化时间的延长,PPARγ的表达逐渐增加,最高峰在诱导后的第6天。以上表明DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL等基因在脂肪形成中均发挥重要作用。
  为了进一步研究PPARγ这一影响家禽脂肪性状的明星基因,同时以上测序数据与细胞水平验证结果,也发现PPARγ在鸭脂肪形成中发挥着关键作用。因此,我们筛选出对PPARγ特异性干扰作用的siRNA进行了敲低实验。干扰PPARγ48h后,发现原代脂肪细胞TG含量下降,同时相关成脂基因的mRNA表达水平也表现为下降,其中,转录因子C/EBPα与FABP4基因的表达水平均下降但差异不显著,而LPL的表达水平显著下降(P<0.05)。表明PPARγ确实能够影响鸭脂肪形成,并发挥关键作用,是重要的候选基因之一。
  在上述试验中已经发现樱桃谷鸭与凤头鸭的成脂能力存在差异,为探明不同品种的成脂差异的分子机制,我们对樱桃谷鸭与凤头鸭的的差异miRNA和关键mRNA进行了比较分析。首先从诱导72h后的凤头鸭脂肪细胞与前脂肪细胞比较中筛选出影响凤头鸭成脂的关键miRNA,结果发现差异显著的miRNA有105个(50个miRNA显著上调,55个miRNA显著下调)。选择其中7个miRNA在凤头鸭原代细胞中进行表达水平验证,结果与测序结果一致。在樱桃谷鸭与风头鸭中,共有37个miRNA是樱桃谷鸭与风头鸭所共有的,且在这37个交集miRNA中,有31个在2个品种中的表达趋势是一致的,推测这些miRNA可能在脂肪的生成过程中发挥不可缺少的作用;同时发现有22个miRNA在樱桃谷鸭成脂过程特异表达,68个miRNA在凤头鸭的成脂过程特异性的发挥作用,通过靶基因预测后,我们发现了419个特异性在樱桃谷鸭成脂过程表达的基因,显著富集到了包括脂肪酸的延伸,生成和代谢等过程。进一步对其中的成脂关键基因:PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL等在2个品种上进行验证,发现除LPL外,诱导72h后樱桃谷鸭的脂肪细胞的4个基因表达量均显著高于凤头鸭,再次在分子水平上验证了大体型的樱桃谷鸭脂肪形成沉积能力高于凤头鸭。
  3.全基因组关联分析鉴定肌内脂肪与腹脂沉积候选基因
  为了进一步鉴定出鸭脂肪形成的关键基因,在细胞水平研究的基础上,我们从个体水平通过全基因组关联分析影响鸭脂肪形成沉积的关键基因或标记,以期进行生产应用。构建了樱桃谷鸭(♂)×风头鸭(♀)杂交F2资源群体共304只并进行样品采集,采血并测定腹脂重与胸肌肌内脂肪含量,提取DNA通过10×全基因组重测序,结合表型值进行全基因组关联分析。结果显示,肌内脂肪范围为1.260%~1.503%,均值为1.387%,腹脂重范围为4g~51g,均值为27.622g,性状表型值符合正态分布,通过Bonferroni多重检验校正法确定P value的显著性阈值为5(-log10P)时,对胸肌肌内脂肪含量性状共定位到14个极显著的SNPs,根据NCBI,Ensembl,KEGG,Uniprot,GeneCards等数据库信息,利用生物信息学和比较基因组的方法,对显著位点的SNP周围1个LD(20kb)距离的基因进行功能注释,发现了包括BARHL2,SLC22A16,THBD,OGDH,CD93,Ctgf等共25个基因,这些基因功能主要涉及DNA结合转录因子活性,转运蛋白家族,神经元迁移,磷酸肌醇酯酶等,具有激酶活性,参与信号转导等多个方面。腹脂重性状定位到12个极显著SNPs,注释后共包含MI CALL1,GALR3,SOX10,EIF3L,POLR2F等48个基因,将所有筛选的脂肪相关基因进行功能注释后,发现包括PGDFB和ATF4等显著富集到了MAPK以及激素代谢等信号通路。MAPK信号通路同时在肌内脂肪与腹脂重性状中发挥调控作用,同时,由LAMA4参与的PI3K-AKT通路通过糖酵解和糖质新生等过程调控肌内脂肪的生成与代谢,而由PDGFB与ATF4通过SOS信号通路与Erk1/2作用,对PPARγ通路的抑制作用调控脂肪沉积。
  4.GWAS与转录组联合分析鉴定鸭脂肪形成沉积基因
  整合转录组测序与全基因关联分析的结果发现,全基因组关联分析的26个SNPs中的73个基因,与转录组筛选的4702个差异基因进行联合分析后发现,共存在18个交集基因(LAMA4,SYNJ1,CD164,CDK19,SLC22A16,RPF2,GTF3C6,AMD1,SSTR4,CARD11,SH3BP1,GCAT,MICALL1,POLR2F,JOSD1,RPL3,PDGFB,MGAT3),通过功能注释与通路分析,筛选到影响鸭脂肪形成与沉积的关键基因PDGFB,MGAT3,LAMA4,SLC22A16,AMD1,CD164等,将筛选出的基因进行通路分析后,发现PDGFB与mTOR信号通路密切相关,因此提出以下假说,PDGFB可能通过启动PI3K/Akt信号通路对mTOR信号通路产生抑制作用,进一步与PPARγ信号通路的发生作用,与mRNA,miRNA,lncRNA和circRNA等共同调控脂肪的生成。
  综上所述,鸭脂肪形成沉积的过程是复杂的,PDGFB,MGAT3,LAMA4,SLC22A16,AMD1,CD164在全基因组SNP水平和转录水平对鸭脂肪形成沉积具有较大效应,同时表明ARHL2,ATF4在全基因组SNP水平,MMP13,KLF2等基因在转录水平可能是影响脂肪的形成与沉积关键候选基因。
[硕士论文] 高雯
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:湖羊是我国著名的多羔绵羊品种兼羔皮用绵羊品种。近年来,由于人们对湖羊肉用性能的重视,以及产区外部分外来品种的引入,导致湖羊羔皮品质逐渐下降。毛囊是由20多种细胞构成的皮肤附属器官,其中毛乳头细胞在毛囊生长发育过程中起着关键作用。microRNAs(miRNAs)是一类长约18-24nt,在转录后水平介导基因沉默的短单链非编码RNA。研究表明,大量miRNAs参与毛囊的发生发育和周期性生长。本研究以湖羊为研究对象,通过机械分离法和酶消化法成功培养了湖羊羔皮毛囊毛乳头细胞,并在课题组前期基因芯片和高通量测序结果的基础上,以在湖羊不同花纹羔皮毛囊中呈现差异表达的BMP7基因为研究线索,利用生物信息学软件预测并筛选出靶向BMP7的miRNAs,并与本课题组前期进行的湖羊不同花纹羔皮毛囊的miRNA测序数据取交集得到miR-148a和miR-10a,通过双荧光素酶报告基因检测、Western Blot和RT-qPCR技术验证其靶向关系,最后利用CCK-8和RT-qPCR检测miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞增殖以及与毛囊相关信号通路(TGF-β/Smads通路)中部分基因(Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、TGF-β1)的影响,以初步探讨miR-148a和miR-10a在毛囊发育中的调控作用。主要研究结果如下:
  1.体外分离并培养湖羊羔皮毛囊的毛乳头细胞,发现该细胞具备典型的凝集生长特征,经细胞组织化学染色发现细胞对PAS、AB-PAS以及甲苯胺蓝染色均呈阳性,且对甲苯胺蓝具有异染反应,经间接免疫荧光检测发现毛乳头细胞的特异性标记物α-SMA呈阳性表达,表明成功分离并获得湖羊毛乳头细胞,为后续在细胞水平进行基因功能验证奠定基础。
  2.双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-148a和miR-10a可显著降低BMP7荧光素酶报告基因(WT)活性,初步证明BMP7为miR-148a和miR-10a的靶基因;为进一步验证miR-148a和miR-10a与BMP7的靶作用关系,利用Western Blot和RT-qPCR技术分别在蛋白水平和mRNA水平进行验证,发现miR-148a和miR-10a均通过促进BMP7mRNA的降解,进而降低BMP7蛋白表达水平,证实BMP7为miR-148a和miR-10a的靶基因。
  3.利用CCK-8检测过表达及抑制细胞内源性miR-148a和miR-10a后毛乳头细胞的增殖情况,结果显示miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞的增殖起抑制作用。
  4.在湖羊毛乳头细胞中过表达miR-148a后,Smad1至Smad6基因表达上调,其中Smad3和Smad6的表达量显著高于对照组(P<0.05),Smad4和Smad5的表达量极显著高于对照组(P<0.01),然而TGF-β1的表达量却低于对照组,但差异不显著;抑制细胞内源性miR-148a后,Smad1至Smad6以及TGF-β1基因的表达量均低于对照组,其中Smad3和Smad4基因的表达水平显著低于对照组(P<0.05),而TGF-β1的的表达水平低于对照组水平(P<0.01)。过表达miR-10a后,Smad1至Smad6基因的表达量低于对照组,其中Smad2基因的表达量显著低于对照组(P<0.05),Smad1、Smad4及Smad5基因的表达水平极显著低于对照组水平(P<0.01),而TGF-β1的表达量显著上调(P<0.05);抑制细胞内源性miR-10a后,Smad1至Smad6,以及TGF-β1的表达水平低于对照组水平,其中Sm ad1表达显著下调(P<0.05),Smad2表达极显著下调(P<0.01)。以上结果表明,在湖羊毛乳头细胞中过表达或抑制miR-148a和miR-10a能够影响与毛囊生长发育相关的TGF-β/Smads通路中基因的表达。
[硕士论文] 绪欣
畜产品安全生产与加工工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:随着人们生活水平的日益提高,牛奶早已成为一种非常重要的营养食品,而人们对牛奶品质的要求也越来越高。奶牛乳腺炎则是限制牛奶品质的一个重要的瓶颈。奶牛乳腺炎通常指的是由于病原微生物的感染而使奶牛乳腺组织产生的炎症的统称。乳腺炎的发生会导致奶牛产奶量和乳品质的显著下降,给奶牛养殖业造成严重的经济损失。本研究采用对金黄色葡萄球菌攻毒乳腺组织及攻PBS组织进行miRNA表达谱及转录组测序,筛选出其表达下调的miRNA和表达上调的目的基因,验证候选miRNA与免疫基因的靶向关系及其在乳腺上皮细胞系中的相关功能。
  1、miR-145在牛乳腺上皮细胞系(Mac-T)中的功能研究
  为探究miR-145在Mac-T中的功能,我们在Mac-T中过表达和干扰miR-145,并检测其过表达和干扰效果。效果显著后应用Elisa和EdU检测Mac-T几种细胞因子的分泌水平变化及细胞增殖能力变化。结果显示:miR-145在牛乳腺上皮细胞系中过表达情况下可以显著降低白细胞介素12的分泌量和肿瘤坏死因子α的分泌量,显著增加干扰素γ的分泌量。与此同时,过表达miR-145后牛乳腺上皮细胞的增殖能力被抑制。
  2、miR-145靶基因的预测及靶基因FSCN1的识别
  由金黄色葡萄球菌攻毒的乳腺组织转录组数据结果,结合TargetScan、miRanda以及PicTar三个microRNA靶基因预测软件预测出数个候选靶基因。并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹检测(Western Blot)和双荧光素酶报告基因系统(Luciferase)多重验证筛选出miR-145的靶基因。结果显示:miR-145过表达或抑制表达后,FSCN1的mRNA表达均发生显著变化,并且miR-145过表达可以引起FSCN1蛋白表达的显著下调。FSCN1基因mRNA3'UTR存在确实的miR-145的靶向结合位点,并且下调FSCN1的活性。故miR-145可靶向调控FSCN1。
  3、FSCN1在Mac-T细胞中的功能研究
  采用RNA干扰法来对Mac-T细胞系中FSCN1的表达进行干扰,荧光定量PCR技术验证设计的siRNA敲降效果显著后,用Elisa检测Mac-T细胞系细胞因子的分泌情况以及EdU增殖实验检测细胞增殖状况。从而阐明FSCN1对Mac-T细胞系这两项功能的影响。结果显示:FSCN1的敲降可以使白细胞介素12的分泌量发生显著上调,而肿瘤坏死因子α的分泌量却显著下调。
  4、全文结论
  金黄色葡萄球菌感染的乳腺组织,机体开启自我防护产生炎症,Bta-miR-145表达下调,从而释放了其对FSCN1基因的干扰作用,FSCN1表达上调促进乳腺上皮细胞增殖力图恢复细菌侵袭后损坏的乳腺细胞组织。
[硕士论文] 连俊伟
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:养殖业在中国经济构成中占有重要一环,也是提高人们生活水平的重要构成。其中在养猪产业上,中国也占有绝对地位,在2012至2016年的猪肉消费量,中国明显领先其他各国,总消费量达到世界的50%以上。养猪产业方兴未艾,大量问题也凸显出来,其中人们最为关注的便是耐药性问题。
  生猪养殖中疫病的发生不可避免,虽然经由改善养猪环境,加大管理力度能够降低猪群发病率,起到疾病预防作用,不过因为部分致病微生物在外界环境长期存在,疾病一旦发生,使用药物治疗同样是必要的,即便是饲养管理体系高度健全的欧美发达国家亦是如此。在生猪存栏量上中国是最大的国家,中大规模养殖企业的占比不可忽视,在今后较长的一个时期内,我们仍然面临着疫病防控的重压,解决的主要手段便是借助兽药。
  而大肠杆菌和葡萄球菌作为环境中大量栖居的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌代表,虽然它们是常在条件致病菌,但由于大量广泛的存在,与其他细菌和生物体接触十分密切,通常作为环境指示菌加以使用。正是由于其独特的存在方式,本文将大肠杆菌和葡萄球菌作为研究对象,对它们进行耐药性分析及耐药基因进行检测,从而了解猪场的抗菌药耐药选择压力和耐药现状。
  本次研究从江苏某猪场采集鼻拭子、肛拭子、粪便、空气、土壤和水,共六类不同环境的样品,共计67份。从中一共分离到200株大肠杆菌、93株葡萄球菌,采用琼脂平板稀释法进行了7类15种抗菌药的药敏试验。对筛选获得的耐药菌株采用PCR进行了质粒介导的耐药基因检测,其中包括:多粘菌素mcr-1,磷霉素fosA、fosA3、fosC2,和碳青霉烯类blaNDM-1、blaKPC-2、blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP-1、blaIMP-2、blaOXA-48,共11种耐药基因。并从中选取mcr-1阳性菌株进行接合子试验,以及针对mcr-1阳性菌株进行七对管家基因的MLST分型。
  结果表明,猪场分离到的大肠杆菌及葡萄球菌广泛耐药,且存在水平传播的风险。在六类不同的环境样品中分离到的大肠杆菌和葡萄球菌对13种抗菌药都有着不同程度的耐药性,其中全部菌株均对阿米卡星和美罗培南表现为敏感,而对氟苯尼考、氯霉素耐药率均在90%以上;大肠杆菌对7种抗菌药耐药率高于50%,且集中在6-8重耐药;葡萄球菌对12种抗菌药耐药率低于25%,仅对土霉素、氯霉素、氟苯尼考耐药率高于90%,且多重耐药集中在0-2重。在采用PCR方法对31株耐磷霉素、35株耐粘杆菌素、2株耐美罗培南的菌株进行耐药基因检测中,发现19株携带mcr-1基因的大肠杆菌,12株携带fosA3基因的大肠杆菌,无不暗示质粒介导的耐药基因积重难返。在对19株mcr-1基因阳性大肠杆菌进行接合转移试验中,接合率为36.8%,且接合前后MIC也发生了改变。对mcr-1耐药基因的接合子试验表明,mcr-1耐药基因能够发生水平传播,且对耐药性的传播影响甚大。MLST分型则显示mcr-1阳性菌株可分为16个ST型,9个为已知,7个为未知,且19株菌中有14株具有独特的ST性,3株为ST88,2株为ST542,表明当前猪场大肠杆菌具有丰富的多态性,需加强对微生物变异性的检测与流行病学调查。
[硕士论文] 李静雯
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:沙门菌是世界范围内主要的人兽共患肠道病原菌之一,在全球范围内的猪肉生产链中广泛分布,生猪因此成为沙门菌的主要载体。然而多种沙门菌在健康猪体内呈潜伏感染,因此沙门菌更加容易流向人们的餐桌从而危害人类健康甚至危及生命。我国是猪肉生产和食用的大国,更应重视猪肉生产链中沙门菌的防控。猪养殖场作为猪肉生产链中的源头,对猪场沙门菌的防控更是我国食品安全控制的重要环节。
  本研究对上海某家规模化猪场进行了为期两年的沙门菌流行病学调查,以期阐明规模化猪场沙门菌流行规律,并提出针对性的防控措施。
  2016年4月至2018年3月期间,共采集粪便样品587份,分离获得沙门菌158株,总分离率为26.9%;采集饲料样品201份,分离得到10株沙门菌,检出率为5.0%;采集环境拭子样品72份,分离得到15株沙门菌,分离率为20.8%。血清型分布结果显示鼠伤寒沙门菌为猪场优势血清型(39.0%),伦敦沙门菌(24.0%)和肯塔基沙门菌(17.0%)也占据较大比重;饲料样品中分离到的菌株主要为鼠伤寒沙门菌(30.0%)和罗森沙门菌(40.0%)。研究期间,猪场沙门菌分离率呈现2次主要变化,将沙门菌分离情况分为3个阶段。2016年4月至12月,猪群沙门菌感染率为46.2%;第二个阶段为2017年3月至9月,沙门菌分离率为8.8%;第三阶段为2017年10月至2018年3月,沙门菌分离率为32.6%。沿着猪场生产线,对猪场12头母猪跟踪调查发现,1头猪在产房环节感染肯塔基沙门菌,2头猪在保育环节分别感染肯塔基沙门菌和罗森沙门菌,说明产房和保育舍是沙门菌感染的风险环节。对猪场154株沙门菌分离株进行20种抗生素的耐药性试验,结果表明70%以上的菌株对林可霉素、四环素、土霉素、氨苄西林和萘啶酸有耐药性,其中林可霉素、四环素和土霉素为猪场内常用药物。多重耐药方面,多数菌株表现7重耐药,部分鼠伤寒沙门菌和肯塔基沙门菌对18种抗生素有耐药性。
  为了探明饲料、环境与猪源沙门菌的关系,对58株鼠伤寒沙门菌和20株罗森沙门菌进行脉冲场凝胶电泳试验。结果表明,猪场优势的鼠伤寒沙门菌可以分为4个主要的PFGE型(T1、T2、T3、T4),其中37株分离株为主体部分T1型,表明2016年10月至2017年11月该型沙门菌为优势PFGE型,长期在猪群和猪场环境中流行;2016年5月至2016年7月于饲料原料和猪粪便中分离到的7株鼠伤寒沙门菌系T2型,表明饲料中的沙门菌感染了猪群;2017年10月出现了新的PFGE型T3;2017年11月则从新引进的种猪粪便中分离到T4型鼠伤寒沙门菌,表明种猪携带外源沙门菌。对罗森沙门菌的PFGE试验表明,除个别分离株的PFGE型不同以外,其余沙门菌可以分为2种PFGE型(R1、R2),尤其是R2型菌株中包括饲料和粪便中分离到的沙门菌,进一步表明被污染的饲料极有可能是场内沙门菌的污染源。结合沙门菌分离率的变化,2017年9月从饲料中分离到罗森沙门菌之后,猪场粪便样品中罗森沙门菌的分离率大幅升高,并且饲料源与粪便源分离株属于同一种PFGE型,表明被污染的饲料是导致猪场沙门菌感染率发生变化,由第二阶段进入第三阶段的重要原因。
  选取23株鼠伤寒沙门菌和7株罗森沙门菌进行了全基因组测序分析,结果表明,罗森沙门菌中除SH086以外,其余菌株之间相似性为99.0%~99.6%,其中SH134(饲料来源)与SH136(粪便来源)相似性达到99.6%;鼠伤寒沙门菌菌株之间相似性为99.8%~100.0%,其中SH035(饲料来源)与SH034(粪便来源)相似性高达99.95%,直接表明被污染的饲料是猪场沙门菌的来源。鼠伤寒沙门菌SH073来源于猪舍工人双手擦拭样,与从粪便样品中分离得到的SH071和SH081系同一克隆,表明工作人员是猪舍沙门菌传播的重要载体。
  2016年11月对猪场沙门菌防控措施进行了优化,主要包括三个部分。一是加强对饲料中细菌的监测;二是改进猪场管理模式,提高对工作人员消毒的要求,对相关措施强制执行;三是优化猪场消毒程序,将消毒时间设置在猪群较活跃的时间点,喷雾消毒时间延长30s。结果显示,优化消毒后,猪对沙门菌的感染率由43.0%降至8.8%,表明对防控措施的改进是导致猪场沙门菌的流行率由第一阶段进入第二阶段的主要原因。对环境中沙门菌的定量测定结果显示,在围栏中,沙门菌覆盖量在优化消毒前为6.1MPN/g,优化后降为小于3MPN/g;优化后水嘴的沙门菌载量比优化前亦有所下降。结果表明,加强对工作人员的管理,合理优化消毒程序可以显著降低猪场沙门菌的分离率。
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