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[硕士论文] 张沛
水利工程 重庆交通大学 2018(学位年度)
摘要:呼伦贝尔地区是全球/区域变化的典型敏感地区,以温度增加和降水波动为特征的全球气候变化对呼伦贝尔地区的影响是显著的,近年来呼伦贝尔地区植被退化、沙漠化加速发展,草原生态系统遭到严重破坏。为了揭示呼伦贝尔地区水热条件时空变化特征及其生态效应影响,本文结合6期1990-2015年呼伦贝尔地区更新水体数据后的土地利用分类数据,利用土地利用转移矩阵和景观格局指数分析方法对1990-2015年呼伦贝尔地区土地利用/覆被和地表水体(含地表水体二级类)的面积动态变化特征、转移规律和景观格局特征进行了研究。然后利用呼伦贝尔地区内9个气象站1990~2015年逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温、平均气温距平、日照时数等热量资料,通过在ArcGIS中采用Kriging空间插值法得到区域的热量资料,以探求热量在时间序列上的年际变化特征,并按照年代将数据空间化,求取前后期热量在空间上的变化特征。最后选择植被覆盖指数作为呼伦贝尔草地生态系统的指示因子,分析水热条件时空动态变化与植被覆盖指数的联系,以探求水热条件时空动态变化的生态效应。研究发现:
  (1)由1990-2015年呼伦贝尔地区各土地利用/覆被类型的面积变化特征可知,呼伦贝尔地区的土地利用/覆被变化存在以耕地和居民地等人类活动为主的人为景观增多,以林地和草地等自然覆被为主的自然景观减少的客观形状。在呼伦贝尔地区土地利用/覆被变化的影响下,1990-2015年呼伦贝尔地区的地表水体面积呈现先增后减再增的整体趋势,在1995年达到最大值46759km2,25年间面积从1990年的3377km2增加到2015年的3451km2,共增加74km2。在各地表水体二级分类中,河渠、湖泊和滩地面积在25年内都呈先增后减再趋于稳定的变化趋势,而水库面积在1990-2005年保持稳定状态,从2005年以后呈增加趋势。
  (2)从1990-2015年呼伦贝尔地区地表水体的时空转移分析,与地表水体转移的一级土地利用类型主要为草地、林地、沼泽和未利用地,25年间,地表水体在与其他土地利用/覆被类型的转移上共净增加74km2,从局部变化期来看,1990-2000年,地表水体与其他土地类型发生转移较频繁,2000-2015年地表水体与其他土地类型发生转移较少。对1990-2015年呼伦贝尔地区地表二级类水体的时空转移分析,研究区各地表二级类水体转移趋势与总地表水体的转移趋势较为一致,同样是与草地、林地、沼泽和未利用地的转化较多,与耕地的转化相对较少,与居民地的转化最少。另外,地表二级类水体中各类之间的转化以河渠和滩地与其它地表水体二级类的转化较为剧烈。
  (3)1990-2015年呼伦贝尔地区的景观格局呈现出简单到复杂的变化过程。研究区的景观格局有微弱的倾向于复杂和不连续的斑块镶嵌体的变化趋势,研究区的优势景观占景观的比例趋于减小,且景观有被分割成不连续斑块的倾向,研究区的各土地利用/覆被类型越来越趋于均衡,弱势土地利用/覆被类型的占比有所增加。其中地表水体25年间呼伦贝尔地区地表水体破碎度数值较小,并保持稳定趋势,说明整体水体景观保存较好,连通性高,湖泊、水库等水体景观趋向于成为一个完整的整体,河渠则被分割成不连接斑块的程度越大。
  (4)由1990-2015年呼伦贝尔地区逐年平均气温、平均最低气温、平均最高气温年际变化特征可知,25年间,年均温、年平均最低气温和年平均最高气温变化趋势较为一致,均呈先增加后减小再增加的波动变化趋势。25年间日照时数整体趋势呈较小的减少趋向。1990-2015年间,呼伦贝尔地区平均温度距平只有2010年、2012年、2013年小于零,其它22年均大于零,说明呼伦贝尔地区在近25年内年平均气温高于多年平均气温,气温上升趋势明显。由1990-2015年呼伦贝尔地区年均温空间变化特征可见,呼伦贝尔大部分地区处于增温趋势,但增温趋势较小,处于0-1℃,这与之前得出的呼伦贝尔地区气温进入变暖趋缓的阶段的结论一致。
  (5)利用呼伦贝尔地区9个气象站点的气温和降水资料分别从年际、季候、生长季月变化角度分析该地区植被指数对水热条件时空变化的响应,研究发现降水变化是促使草地植被年际变化的主要因子,从季候水平来看,草地植被指数在不同季节对水热条件变化的敏感性不同,春季植被生长与气温关系密切,夏季草地植被生长受降水强度影响较大;从生长季月变化来看,5月份植被指数变化受气温变化影响较大,6月和7月植被指数变化受降水影响显著,植被生长对7月和8月降水变化具有一定的滞后性。
[硕士论文] 常沛玺
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的猪病原体,它能够引起猪的多种疾病包括脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎,甚至导致死亡。在猪链球菌33个血清型中,猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)是临床分离最多的、毒力最强的病原菌,在给世界的养猪业带来了巨大的经济损失的同时,也能通过患病的动物或者污染的生猪肉副产品感染人类,威胁人类健康,严重的可引起人死亡。双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)广泛存在于细菌中,调节各种重要的细菌生理和代谢过程,在细菌的毒力和致病性方面发挥重要作用,但是对于猪链球菌中参与逃避天然免疫反应的双组分调控系统尚不清楚。
  本实验室已有△TCS2(△bceRS)、△TCS3(△nisKR)、△TCS4(△salKR)、△TCS5(△ciaRH)、△TCS6(△vicK)、△TCS8(△ihk/rr)、△TCS11(△1910KR)等双组分基因缺失株。本课题利用同源重组构建了△TCS1(△vraSR)、△TCS7(△SC84_1438hk/1439rr)、△TCS9(△SC84_1523hk/1522rr)、△TCS10(△covR)、△TCS12(△SC84_1840rr)、△TCS13(△revS)、△TCS14(△SC84_1925rr)、△TCS15(△virSR)等双组分基因缺失株,并用PCR内外部引物验证成功获得15个双组分基因缺失突变株。通过猪链球菌2型野生株SC19与天然免疫细胞互作以及猪链球菌2型15个双组分基因缺失突变株在人全血中的存活能力比较,筛选出了1个重要的双组分调控系统VraSR,并探究了其在帮助猪链球菌2型逃避宿主免疫过程中发挥的作用以及毒力功能的作用。主要结果如下:
  1.15个双组分系统基因缺失突变株在人全血中存活能力的比较
  将猪链球菌和人血互作,并在1h、2h、3h分别收集样品计数,与初始菌量比较计算存活率。结果表明,野生株和15个突变株均在人全血中呈现不断增殖的趋势。但是与野生株相比较,其中△vraSR和△ihk/rr增殖能力明显下降。
  2.猪链球菌2型感染人中性粒细胞后双组分调控蛋白的表达变化
  将猪链球菌2型野生株与人中性粒细胞互作3h,收集样品提取细菌总RNA,检测15个反应调控蛋白表达水平。结果表明,与未经中性粒细胞刺激的对照组相比,vraR(SC84_0373),ciaR,SC84_1224,SC84_1439和SC84_1522基因上调明显。
  3.VraSR在天然免疫反应中的作用
  筛选出了双组分调控系统VraSR,进一步通过中性粒细胞杀菌验证野生株SC19、△vraSR、C△vraSR对免疫细胞的抵抗能力。结果证实了缺失了VraSR后,猪链球菌在中性粒细胞中存活能力明显下降。随后采用流式细胞术检测中性粒细胞对野生株SC19、△vraSR、C△vraSR的吞噬,体外模拟吞噬后的杀菌途径:氧化杀伤(H2O2)和非氧化杀伤(溶菌酶),均表明了缺失VraSR后,猪链球菌抵抗能力明显减弱。
  4.VraSR参与调控猪链球菌荚合成和细胞黏附
  荚膜的厚度影响着中性粒细胞对猪链球菌的吞噬,我们通过透射电镜检测了SC19、△vraSR、C△vraSR的荚膜变化,并比较了唾液酸水平的差异和荚膜合成相关基因的表达差异。结果表明,缺失VraSR后,猪链球菌荚膜变薄。此结果与△vraSR黏附HBMEC细胞能力下降相悖,进一步通过qPCR发现缺失株体内与细胞黏附相关基因下调明显,表明双组分调控系统VraSR调控细胞黏附相关基因表达作用大于调控荚膜合成相关基因作用。
  5.VraSR基因缺失株对致病性和炎症反应的影响
  以BALB/c小鼠为模型,存活曲线和组织载菌量表明,双组分调控基因VraSR缺失后小鼠死亡率明显降低,猪链球菌更容易被机体清除。在感染初期,突变株和野生株引起的炎症因子表达水平无差异;在感染后期,突变株所引起的炎症反应明显低于野生株。
[硕士论文] 余庆
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:沙门氏菌的各种血清型可对人、畜、禽和野生动物引起疾病,沙门氏菌引发的疾病遍布世界各地,许多血清型的沙门氏菌可使人感染并发生食物中毒。近年来,禽沙门氏菌病的发生日趋严重,鸡白痢是其中的一种,而且此病在流行、发生、临床表现及剖检变化、药物敏感性等许多方面都发生了一些新的特点,目前在鸡白痢病方面还没有一种有效的疫苗防治。本研究对收集的禽源沙门氏菌进行鉴定,耐药性和毒力基因的分析,并筛选了其中两株鸡白痢沙门氏菌,运用病理组织学和免疫组织化学方法进行致病性研究。
  1、禽源沙门氏菌的鉴定及血清型分析
  本试验对收集的10株背景清晰的禽源沙门氏菌,进行培养,革兰氏染色、PCR鉴定、血清型测序分析及生化实验,并以肠炎沙门氏菌参考标准株作为对照。结果表明鸡源沙门氏菌中有2株为鸡白痢沙门氏菌,1株为猪霍乱沙门氏菌;鸭源沙门氏菌中有1株为肠炎沙门氏菌,6株为鼠伤寒沙门氏菌。
  2、禽源沙门氏菌的耐药基因检测及耐药性分析
  通过K-B(Kirby-Bauer)法对收集的10株沙门氏菌进行14种药物敏感试验及11种对应的耐药基因PCR检测,并以大肠杆菌ATCC25922作为对照。检测结果表明对链霉素的耐药率最高,达到了70%;对氨苄西林的耐药率为30%;对阿莫西林,诺氟沙星,四环素,复方新诺明的耐药率均为20%;对头孢西林,卡那霉素,庆大霉素,氯霉素的耐药率均为10%;对头孢哌酮,新霉素,氧氟沙星,诺氟沙星均表现出敏感性,有四株菌表现为多重耐药;耐药基因检测结果表明耐药基因catA1在的检出率为100%;aadA1,aadA2,sulⅠ的检出率在50%以上,qnrB,tetB,blaTEM,tetA,sulⅡ的检出率低于35%;blaPSE,qnrA,tetG检出率为0。分析沙门氏菌耐药性的结果与耐药基因的结果表明,药物的耐药表型与耐药基因的检出率基本一致,细菌所携带的耐药基因与其对药物耐药性呈正相关,沙门氏菌DNA上携带的耐药基因能很大程度的决定其耐药性。
  3、禽源沙门氏菌的毒力基因检测
  采用PCR技术检测了10株沙门氏菌15个毒力基因,它们已知参与沙门氏菌的粘附,侵袭和存活。检测结果表明大多数沙门氏菌对选择的大多数毒力基因都是阳性的,携带率均在80%以上,其中1号菌株携带检测的全部毒力基因;pipD,fimA,misL,sopA,invA,stn,spvC,spiC,sifA和orf319的检出率均为100%;virK的携带率为90%;sipA的携带率为80%;spvB的携带率为60%;fliC的携带率为40%。
  4、鸡白痢沙门氏菌的致病性研究
  根据10株菌的感染宿主的临床症状,毒力基因检测,筛选两株鸡白痢进行动物致死性感染试验,筛选出致病性较强的一株测定半数致死量试验,以此为依据进行动物感染试验,同期根据药敏试验结果选用临床兽用药进行抗生素治疗试验。经腹腔注射,分别在感染第1d、3d、5d、7d、10d、15d取SPF鸡的心、肝、脾、肺、盲肠、法氏囊进行HE染色,选取肝脏和盲肠测定载菌量;选取损伤最为严重的肝进行毒力蛋白SpiC的定位及相关肝损伤指标的免疫组织化学染色。
  在感染第3d到第7d是死亡高峰期,也是各器官损伤最严重的时期。同期肝脏Spic的表达范围最广,表达量最高,与肝脏坏死灶的分布一致,说明毒力蛋白与肝损伤有关。Caspase-1和Caspase-3也在此期间高表达,说明了在此期间肝脏受到损伤,即细菌感染导致动物的器官损伤,因此使宿主发病。
[博士论文] 王晓艳
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:干扰素-τ(Interferon-τ,IFN-τ)是反刍动物在妊娠早期由胚胎滋养层细胞分泌的一类Ⅰ型干扰素,被视作妊娠识别信号,具有抗黄体溶解、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能。其在调节胚胎着床时期子宫容受态和子宫免疫环境等方面的作用对于胚胎的顺利着床尤为重要。IFN-τ在奶牛妊娠早期,即胚胎植入窗口期,通过对牛白细胞Ⅰ类抗原(Bovine leukocyte antigen,BoLA-Ⅰ)及其他妊娠相关分子的调节,提高母体对胎儿的容受性,增加胚胎植入的成功率。BoLA-Ⅰ,是牛的主要组织相容性Ⅰ类(Major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)蛋白,在牛的胚胎滋养层和子宫内膜上皮细胞中均有表达,与妊娠早期母体对胎儿免疫耐受密切相关。IFN-τ也可以调节分离培养的奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达miRNAs。miRNAs普遍存在于真核生物,通过对靶基因的调节,参与机体各种生理和病理过程,在妊娠免疫和重塑子宫内环境等方面也有重要作用。
  本实验室前期的研究表明,IFN-τ在奶牛妊娠早期可上调BoLA-Ⅰ的表达,并可调节奶牛子宫内膜上皮细胞中miRNAs的表达谱。通过高通量测序和分析,发现一些差异表达显著的miRNAs可能与IFN-τ调节奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达BoLA-Ⅰ类蛋白有关。为进一步验证其相关性,也为进一步研究奶牛妊娠免疫和子宫容受性的调节机制提供实验依据,探索IFN-τ在奶牛妊娠早期协助胚胎免疫逃逸,为胚胎植入提供可能的潜在机制,本研究从验证miRNAs/miRNAs靶基因入手,展开了深入的研究,主要研究内容和结果如下:
  (1)从高通量测序的结果中筛选到bta-miR-145和bta-miR-204在IFN-τ作用下的奶牛子宫内膜上皮细胞中的表达明显降低。选取空怀和妊娠早期奶牛子宫内膜组织进行在体验证。RT-qPCR和Western blot检测结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织相较于空怀奶牛而言,其bta-miR-145和bta-miR-204的mRNA水平显著降低,MHC-Ⅰ类相关链(MHC classⅠ-relatedchain,MIC1)基因和Ⅰ类MHC重链(Major histocompatibility complex,classⅠ-A,BoLA)基因的mRNA水平却显著上调,且BoLA-Ⅰ蛋白水平也明显升高。
  (2)分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)进行体外验证,结果显示,在IFN-τ(200ng/mL)作用下,和对照组相比,bEECs中bta-miR-145与bta-miR-204的mRNA水平同样下降明显,MIC1和BoLA的转录水平上升明显,BoLA--Ⅰ蛋白表达水平升高显著。
  (3)利用生物信息学技术对bta-miR-145与MIC13'UTR,bta-miR-204与BoLA3'UTR靶序列的碱基配对情况,结合形成RNA双链的二级结构和自由能等主要生物信息学指标进行了归纳分析,初步确定MIC1为bta-miR-145的靶基因,BoLA为bta-miR-204的靶基因。通过双荧光素酶报告检测分析,发现,bta-miR-145显著抑制MIC13'UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性,而bta-miR-204也能显著抑制BoLA YUTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性。确证MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (4)bta-miR-145、bta-miR-204的过表达和抑制实验表明,在bEECs中转染bta-miR-145模拟物能显著抑制MIC1基因mRNA的表达;而转染bta-miR-145抑制剂后,MIC1基因mRNA的表达则显著上调。而在bEECs中转染bta-miR-204模拟物则能显著抑制BoLA基因mRNA的表达;而转染bta-miR-204抑制剂后,BoLA基因rnRNA的表达则显著上升。在IFN-τ的作用下,bEECs中MIC1和BoLA的mRNA水平显著增加,BoLA-Ⅰ的蛋白表达水平也明显上调。进一步证实了MIC1是bta-miR-145的直接靶基因,而BoLA是bta-miR-204的直接靶基因。结果证明,IFN-τ可以通过对bta-miR-145和bta-miR-204的负调节作用,提高MIC1和BoLA的表达。
  (5)为了验证IFN-τ在胚胎植入期对细胞外基质和免疫微环境的影响,采用RT-qPCR分析了未孕和妊娠早期奶牛子宫内膜组织中崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白10(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10,ADAM10),崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白17(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein17,ADAM17),程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death-ligand1,PD-L1)和程序性细胞死亡配体2(Progammed cell death-ligand2,PD-L2)的mRNA水平。结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织中的ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的mRNA水平都有不同程度的升高。而在IFN-τ的作用下,bEECs中ADAM10,ADAM17,PD-L1与PD-L2的mRNA水平都有明显的增加。
  (6)为了验证IFN-τ是否通过对MIC1和BoLA的调节来影响ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的表达,采用siRNA干扰技术在bEECs中进行体外验证。结果表明,siRNA干扰MIC1的表达后,ADAM10和ADAM17mRNA水平明显下降;在bEECs中转染BoLA siRNA后,PD-L1与PD-L2的mRNA水平也显著下调。结果提示,IFN-τ通过bta-miR-145对MIC1的调节影响ADAM10和ADAM17的表达;同时可通过bta-miR-204对BoLA的调节作用,来调节PD-L1与PD-L2的表达,从而对细胞外基质和免疫耐受等多方面的调节来影响胚胎植入。
  (7)进一步验证IFN-τ对胚胎植入的影响,建立了LPS诱导的小鼠胚胎植入障碍模型,进行在体验证。实验结果表明,IFN-τ能提高LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量,同时FN-τ也能抑制LPS诱导的炎性因子IL-1β和TNF-α的表达,并上调抗炎因子IL-10的表达。
  结论:
  (1)MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (2)IFN-τ通过抑制bta-miR-145上调MIC1的表达来增加ADAM10和ADAM17的表达,以影响细胞外基质,促进胚胎黏着、侵袭等过程。
  (3)IFN-τ通过抑制bta-miR-204上调BoLA的表达来提高PD-L1与PD-L2的表达,以此影响母胎界面的免疫微环境,促进胎儿免疫逃逸。
  (4)IFN-τ通过下调bta-miR-145/204的表达来调节BoLA-Ⅰ类相关分子的表达和功能,以增加胚胎植入的成功率。
  (5)IFN-τ通过对免疫平衡的调节来增加LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量。
[博士论文] MUJEEB UR REHMAN
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.cold是一种常见的食源性、条件性致病菌,一般人畜呈无症状感染,但在一定的条件下能够产生威胁人畜生命安全的并发症。反刍动物是致病性E.coli最重要的宿主之一。牦牛(Bos grunniens或Yak)是生活在青藏高原上特有的反刍动物,也是当地牧民主要肉食品来源。目前,由于药物的滥用,导致大肠杆菌耐药性不断产生,耐药基因不断被发现。因此,越来越多的专家指出研究和评估食用性动物(如牦牛)的抗菌耐药性(Antimicrobial resistance,AMR)和致病因子(Virulence factors)对于公共卫生安全非常重要。现在临床上关于细菌耐药性的监测还不够全面,对动物耐药研究还没形成完整的理论系统,并且关于青藏高原地区牦牛大肠杆菌耐药性报道也较少。因此,本研究开展对青藏高原地区牦牛大肠杆菌中致病基因、遗传谱系、血清型和抗生素抗性模式的研究,以期为青藏高原地区牦牛肉食品安全性评估提供理论依据。研究内容如下:
  1.青藏高原地区散养牦牛大肠埃希氏菌耐药性研究
  在我国散养牦牛中关于抗生素耐药性、血清型、遗传谱系和相关毒力特征的研究还未见详细的报道,为系统的研究青藏高原地区大肠杆菌耐药机制,本研究开展了青海地区腹泻牦牛中分离出来的大肠杆菌菌株的表型、基因型、毒力因子、遗传谱系和血清型的可能关联和分布,以及对未接触过抗生素的西藏地区半山区放牧的健康牦牛进行系统的研究。结果显示,在青海省腹泻的牦牛分离出的大肠杆菌菌株中,大多数菌株是多重耐药(97%),并且具有至少有一个毒力基因。而在西藏健康牦牛分离的488个大肠杆菌株中,其中大约31.1%的菌株具有多重耐药性。我们观察到10个毒力基因中,其中sfa在腹泻牦牛中最为常见(96.9%)。而且,OmpA(30.2%)和etrA(23.1%),blaCTX-M(27.6%)和blaTEM(14.4%)分别是西藏健康牦牛中主要流行的毒力基因和耐药基因。相关性分析显示在两个区域中一些抗性表型和毒力基因之间呈现显著的正相关(P<0.05,OR>1)。分离出来的大肠杆菌菌株主要属于遗传谱系A(Phylogroup A,接近70-80%)和血清型(Serogroups)O91和O145。重要的是,我们注意到阳性选择的印迹在青藏高原牦牛上通过各种最大似然模型推测广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamase,ESBL)产生的CTX-M基因中含有单核苷酸多肽(SNPs)基因型。研究结果表明,牦牛作为致病性E.coli拘宿主,携带多种致病基因和抗性表型。因此,临床医生和相关部门必须确保抗菌药物的规范使用,以避免这些微生物通过粪便传播给农场工人和食品加工者。
  2.食用型动物体内耐抗生素大肠杆菌整合子和相关基因盒的特性
  为进一步调查在散养健康动物群体中耐药性和毒力特性的分布情况,我们分别从中国散养的牦牛、仔猪和鸡体内分离出大肠杆菌耐药菌株,并研究了耐药菌株中整合子和ST131基因的出现频率,同时识别出隐藏在整合子基因中的基因盒。我们一共检测了432株至少表现出一种抗生素耐药性的大肠杆菌菌株,利用PCR分析、限制性片段长度多态性(Restriction fragment-length polymorphism)、DNA测序、接合实验、质粒分析和多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)等实验手段识别整合子基因及其相关基因盒。在432株耐药菌株中有29株(6.7%)扩增出了整合子基因。其中,含有1级整合子的有26株(6%),含有2级的有3株(0.7%)。同时,在6个可变区(Variable regions,VRs)内检测到6种不同的基因盒,分别是drfA1,drfA12,aadA1,aadA2,sat1和orfF。其中drfA1+aadA1组合是最常见的,在26个中有12个1级整合子(46.1%)发现了该类组合。另外,只有1个2级整合子包含1个基因盒,其余2个则还未确定VRs。值得注意的是,从散养健康动物群体内发现了17种序列类型(Sequence types,ST),其中6种可能是新型ST。最后的接合实验也证实有4种不同类型的1级整合子转移入受体菌株,其质粒大小在20kb到30kb之间。我们在超过6%的耐药大肠杆菌菌株中检测到了整合子和ST131基因。因此,需要采取一定预防措施来防止食用型动物群体中移动性耐药基因决定簇的扩散,并对其实施监控。
  3.牦牛源大肠杆菌菌株对小鼠致死性试验
  为了解从健康牦牛粪便中分离的大肠杆菌的致病性,采用皮下注射感染小鼠模型来观察具有不同血清型和遗传谱系的大肠杆菌分离株毒力及致病性。这些菌株分离自西藏地区较少使用抗生素的健康牦牛,检测菌株至少含有一种毒力基因(与ExPEC或InPEC致病型相关,属于不同的遗传谱系:A、B1、B2和D)。结果发现,23%的感染大肠杆菌分离株的小鼠引起致死性感染。此外,大多数致死菌株属于遗传谱系A(65%)和血清型O60或O101(35%)。遗传谱系B1、血清组O60和O101与致死性状态存在统计学上关联(P<0.05)。而且,致死性大肠杆菌分离株和所有其他细菌毒性特征之间存在正相关(OR>1)。本研究首次报道了西藏散养健康牦牛粪便中分离到的大肠杆菌具有潜在的毒力,表明健康牦牛源大肠杆菌的致病性也能带来严重的公共卫生问题,要引起重视。
  4.鱼腥草提取物对多重耐药性大肠杆菌的抑菌效果和耐药调节
  为了研究鱼腥草提取物(Houttuynia cordata water extract,HCWE)对携带有AcrA基因(大肠杆菌的多药外排系统)的多重耐药(Multi-drug resistant,MDR)大肠杆菌菌株的抑菌活性,我们对至少抗三种不同种类的抗生素的耐药菌株进行HCWE抑菌活性试验。并采用琼脂扩散技术、试管稀释法和实时PCR分析方法,对AcrA基因的抑菌效果、最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)和AcrA基因转录水平进行了HCWE抑菌活性评价。试验结果显示:具有抗菌活性的HCWE在500mg/mL和50mg/mL浓度下,对多重耐药的E.coli的抑菌区域直径(Zone diameter of inhibition,ZDI)最大是29mm和最小是13mm。HCWE针对具有多重耐药大肠杆菌分离株的MIC和MBC分别为400mg/mL和500mg/mL。此外,当采用25mg/mL、50mg/mL和100mg/mL浓度的HCWE培养E.coli时,AcrA基因的表达水平以一种剂量依赖的方式递减(分别是0.39倍、0.29倍和0.16倍)。这些结果表明,鱼腥草水提取物对多重耐药性大肠杆菌具有非常大的潜在应用价值。它能作为一种抗多重耐药病原体的抗菌药物替代品,并且对该药物的进一步开发是非常必要和值得的。
  综上研究,青藏高原地区散养牦牛大肠杆菌耐药检出率较高,并且牦牛在危险的病原菌及多抗药基因的携带和传播中起重要作用。与之相关的原因有许多,可能包括抗性基因的正向选择,联合选择,频繁使用自然资源以及在治疗中无限制地使用抗菌药物等。而且,散养健康牦牛源大肠杆菌遗传谱系A和血清型O60或O101菌株具有致病性,对人畜的生命健康构成一定的威胁。在研究中尝试使用中草药(鱼腥草水提取物)作为一种合成抗生素的替代品,它对抗多重耐药大肠杆菌具有很大的潜在应用价值。
[硕士论文] 宋娇阳
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:高致病性禽流感H5N1和低致病性禽流感H9N2在全球范围内的广泛传播,加速了新型流感的发生和流感大流行的风险。H9N2和H5N1亚型禽流感病毒常与其他亚型发生广泛的基因重组形成致病力较高的新型病毒,如H7N9、H10N8,并且可以跨越物种障碍直接感染人类,威胁人类健康。因此,对H9N2和H5N1禽流感的预防尤为重要。禽流感病毒主要通过呼吸道、消化道等黏膜部位感染机体。通过鼻腔免疫亚单位疫苗可以引起局部的黏膜免疫反应,从而阻断禽流感病毒原发部位的感染。将抗原完整的跨越黏膜屏障转运是成功诱导黏膜免疫的关键。但是由于黏膜免疫系统的复杂性,抗原的有效转运受到制约。鸡卵黄抗体IgY Fc受体(FcRy)是鸡IgY的转运受体。在本实验室前期研究中,已经证实了FcRy可以将IgY Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障进行转运。在本研究中,将禽流感病毒H9N2和H5N1的主要保护性抗原HA1与鸡IgY Fc片段融合,在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中表达,并辅以佐剂CpG-ODN2007,制备二价亚单位疫苗。通过滴鼻免疫鸡,显示融合蛋白可以借助呼吸道黏膜上皮细胞表达的FcRy进行转运跨越黏膜屏障,诱导机体产生了针对H9N2、H5N1禽流感病毒HA1的有效特异性黏膜免疫和全身性免疫应答。主要结果如下:
  1.H9N2禽流感病毒HA1的表达及鼠抗H9N2HA1多克隆抗体的制备
  成功构建pGEX-KG-HA19原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中诱导表达GST-HA19融合蛋白,将该融合蛋白纯化后辅以佐剂免疫小鼠,成功制备了鼠抗H9N2HA1的高免血清,利用间接ELISA检测抗体效价高达1∶256000,经Western Blot鉴定该多克隆抗体具有良好的特异性。
  2.构建pFastBac HTb-sHA19-HA15-Fc、pFastBac HTb-sHA19-Fc重组质粒及融合蛋白的表达与鉴定
  将禽流感病毒H9N2含有信号肽的HA1(sHA1)及H5N1HA1与鸡IgY Fc片段融合,构建pFastB ac HTb-sHA19-HA15-Fc真核表达载体;将禽流感病毒H9N2sHA1与鸡IgY Fc片段融合,构建pFastBac HTb-sHA19-Fc真核表达载体。然后,利用Bac-to-Bac表达系统分别表达sHA19-HA15-Fc和sHA19-Fc融合蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,其蛋白大小约为140KDa、105KDa,比预测蛋白略大。应用Western Blot分别对该融合蛋白的HA19、HA15和Fc片段进行检测,结果显示各蛋白均成功表达。在非还原条件下检测蛋白大小约为280KDa、210KDa,说明该融合蛋白以二聚体的形式存在,具有类似IgY的分子结构。
  3.sHA19-HA15-Fc融合蛋白二价亚单位疫苗对鸡的免疫效果评价
  将sHA19-HA15-Fc融合蛋白辅以佐剂CpG-ODN2007滴鼻免疫鸡,可以同时诱导有效的局部黏膜免疫和全身性免疫应答。(1)二免后第10d,气管和肺脏冲洗液检测中,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组抗H9N2HA1和抗H5N1HA1特异性sIgA和IgY抗体效价均最高,除了sHA19-Fc和sHA15-Fc滴鼻免疫组外,与其他免疫组相比差异极显著(P<0.01)。(2)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组血清中IFN-γ、IL-2均极显著高于sHA19-HA15滴鼻免疫组和灭活苗组(P<0.01),与sHA19-Fc或sHA15-Fc滴鼻免疫组无显著性差异。(3)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组脾淋巴细胞增殖指数显著高于sHA19-HA15-Fc皮下免疫组和sHA19-HA15滴鼻免疫组。(4)二免后第14d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组血清中抗H9N2HA1和抗H5N1HA1特异性IgY的ELISA抗体和HI抗体水平均为最高,与sHA19-HA15滴鼻免疫组差异极显著(P<0.01)。(5)H9N2病毒攻毒后第5天,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫组、sHA19-Fc滴鼻免疫组的咽拭子和泄殖腔拭子均未检测到H9N2病毒的血凝活性,其保护率均为100%,sHA19-HA15-Fc皮下免疫组、灭活苗组攻毒保护率分别为75%、87.5%,而sHA19-HA15滴鼻免疫组保护率仅为25%。
  该研究结果表明,将sHA19-HA15-Fc融合蛋白辅以黏膜佐剂,滴鼻免疫鸡,可以利用鼻腔黏膜上皮细胞表达的FcRy胞转将鸡IgY Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障进入血液循环,诱导机体产生抗H9N2、H5N1禽流感病毒的有效局部黏膜免疫和全身性免疫应答,完全保护免疫鸡抵抗H9N2禽流感病毒的感染。
[博士论文] 曾哲
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:冠状病毒对人类和动物健康造成了严重的危害。2010年以来,猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)对我国经济造成了巨大的损失,随后PEDV变异株引起的猪流行性腹泻在我国持续发生,然而截止目前我国湖北地区的PEDV变异情况和流行病学尚未完全阐明,同时新出现的猪δ冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)与PEDV共同感染的情况时常发生。深入研究冠状病毒的复制机制对疫病的防控具有重要的指导意义。冠状病毒非结构蛋白9(nsp9)是病毒复制复合体的重要组成部分,参与病毒RNA的结合,对病毒复制起到重要作用,是抗病毒药物的潜在靶点。本文首先对2016年湖北省PEDV的流行病学情况进行了研究,然后以PDCoV为模型,对nsp9的结构和功能进行了深入研究,具体内容如下:
  1.通过对省内34家猪场收集的172份各类样品,系统分析了PEDV S基因的遗传演变规律,阐明了2016年湖北省PEDV的分子流行病学情况。首先针对PEDV nucleocapsid(N)基因进行了检测,74份样品确定为PEDV阳性,随后对所有阳性样品的spike(S)基因全长进行了测序,通过序列分析获得了21种有不同氨基酸序列的S基因。据此分析得到湖北省内的PEDV基因型具有多样性,除了经典的Ⅰ型和Ⅱ型,同时还存在INDEL型。此外,在本研究中的所有S基因序列上还发现了58个氨基酸突变位点,其中44个位于S1基因,14个位于S2基因。结果表明多种基因型PEDV毒株共存和病毒快速变异的情况是导致我省猪流行性腹泻疫情发生的重要原因之一。我省复杂的PEDV分子流行病学情况是对评估传统PEDV疫苗保护力的挑战,迫切需要研发新的疫苗来应对不断出现的新变异毒株,并制定系统的防控措施,才能更有效的预防和控制地方性的PEDV引发的疫情。
  2.解析了PDCoV nsp9的晶体结构和进行了PDCoV nsp9的生化功能研究,阐明了冠状病毒nsp9二聚体形成和核酸结合的分子机制。在表达纯化了PDCoVnsp9蛋白后,筛选获得高分辨率的蛋白晶体,并解析了其三维结构。PDCoVnsp9单体由1个α-helix和7个β-strand组成。发现PDCoVnsp9氨基端的电子云密度比其它冠状病毒nsp9的更清晰,并参与了二聚体形成,我们将氨基端这个区域命名为N-finger。通过对二聚体界面的分析发现,N-finger上的Leu4和Arg7分别与Arg70和Ser103形成了两个氢键,同时在α-helix的疏水性相互作用下共同形成二聚体。通过分子体积排除色谱法(Size-exclusion chromatography,SEC)和分析型超速离心(Analytical Ultracentrifuge,AUC)实验证实了当PDCoV nsp9缺失N-finger时,其突变蛋白在溶液中完全成为单体。如果同时对N-finger上的Leu4、Leu6、Arg7和Asn8同时突变,突变蛋白在溶液中的单体形式含量上升。在与核酸结合的分子机制上,首先验证了α-helix上的Gly对核酸的亲和力也有很大的影响,这一特点与其它冠状病毒nsp9是一致的。在针对N-finger的进一步研究中,通过凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和微量热泳动(Microscale thermophoresis,MST)实验揭示了当PDCoVnsp9缺少N-finger时,结合核酸的能力下降。并进一步发现当对N-finger上Arg7突变后,核酸的亲和力也会减小。结合以上研究,我们首次发现N-finger在PDCoVnsp9的二聚体形成过程中起到了重要作用,并且N-finger也影响PDCoVnsp9的核酸结合能力。冠状病毒nsp9二聚体与核酸的亲和力高于单体更有利于发挥其生物学功能并帮助病毒复制。
  综上所述,系统分析了2016年湖北省的PEDV的分子流行病学情况,揭示了PEDV S基因的遗传演变规律,为流行性腹泻疫苗的防控提供了指导;解析了PDCoV nsp9的晶体结构,阐明了冠状病毒nsp9的二聚体形成机制和核酸结合特性,揭示冠状病毒的复制机理和为抗病毒药物的研究提供了理论基础。
[硕士论文] 闫科技
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病毒是一种致死性的神经嗜性病原微生物,由于其很高的致死率以及目前缺乏很好的防治方法,对人类和相关宿主动物的健康造成了巨大的威胁,也因此成为了病原学中一个很重要的研究对象。另一方面因其具有对神经元的特殊嗜性以及在神经元内生存和复制的能力,狂犬病毒被开发成为了一种用来神经环路示踪和标记的有力工具,相对于传统的神经环路示踪工具有着天然优势,在神经科学的研究中具有巨大的应用价值和开发潜力。单细胞测序技术作为近几年发展起来的新型技术,凭借其独有的优势为现代生物学的发展起到了巨大的推动作用,通过对单个细胞组学相关信息的分析实现在细胞和分子层析探索相关生物学过程以及复杂组织的结构和功能的解析,在发育、癌症以及神经科学等研究领域具有不可替代的应用潜力。
  大脑,作为目前动物体中结构和功能最复杂的器官,已成为现在生命科学和医学研究领域最热门也最有挑战性的领域,对其深入的研究和探索对理解大脑运行机制以及对相关脑疾病的防治提供理论意义和指导作用。而对于大脑奥秘的揭示,最重要的一步是对其中数量庞大而又错综复杂神经环路结构和功能的解析。
  于是,基于以上相关技术和科学背景,本课题主要的目的是利用狂犬病毒对特异神经环路进行示踪和标记,描绘对应神经环路的结构基础,同时结合单细胞测序技术对标记的特异神经环路上的神经元进行单细胞水平上的转录组分析,分析对应神经环路的功能基础。从而实现对特定神经环路结构和功能的解析,为进一步深入探索神经环路的调节机制以及在受到外界病原入侵时如何变化提供科学基础和研究思路。本课题的研究内容主要分为以下几个方面:
  1.片段化酶Tn5的纯化和应用
  Tn5是来源于大肠杆菌中一种转座酶,由于其在体外可以转座以及对DNA片段进行切割和连接接头的能力被开发为二代测序文库构建时用于片段化和接头化的工具酶,并在单细胞测序文库构建中具有很广泛的应用价值。在该课题中,我们首先对其进行了表达、纯化和组装。其次对其进行了活性检测,验证了Tn5具有DNA片段化和加接头的能力。最后我们经过不断优化反应条件将其成功应用到单细胞转录组测序Smart-seq2建库方法中,节省建库成本的同时又可以进行特殊功能应用的扩展。
  2.Smart-seq2技术在培养细胞和特异神经环路神经元上的应用
  Smart-seq2技术是目前最常用的单细胞RNA-seq技术,我们首先通过不断地尝试和摸索将其应用到培养的细胞上,做到了个位数细胞起始量的转录组扩增。然后结合狂犬病毒对特异神经环路神经元的标记和分离技术,将其应用到特异神经环路神经元上,完成了对神经环路单个神经元转录组的建库测序和数据分析,从而实现对感兴趣的特定神经环路结构的解析和功能的探索。
  3.PVN-LHA神经环路的标记和初步探索
  PVN是下丘脑中具有调节机体相关自主性的生理功能作用的神经核团,PVN-LHA神经环路对于机体饮食的调节起着直接的影响,对其深入的研究可以理解大脑对饮食行为的调节机制以及在受到病原入侵时的响应。本课题中,我们首先利用GFP重组的狂犬病毒对PVN-LHA环路进行了标记,然后对在PVN处标记的神经元进行了单细胞转录组测序实验。我们分析了这些神经元的基因表达谱,并对神经元类型和功能相关的基因表达情况做了免疫组化方面的验证,为进一步深入研究提供了数据基础。
  总体而言,本课题结合狂犬病毒对特异神经环路的示踪标记技术和单细胞RNA-seq技术,实现了在特定神经环路上神经元单细胞转录组分析技术的建立,并将其应用到PVN-LHA神经环路,初步鉴定了该环路PVN处神经元的类型和功能,为进一步研究此环路提供了一定的技术,而且这两种技术的结合为神经科学相关问题的研究提供了一定的技术基础和研究思路。
[硕士论文] 谢梦利
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:禽流感作为重要的人畜共患病,一直以来对养殖业和公共卫生健康造成重大影响。H9N2禽流感病毒感染家禽后虽不会造成很高的死亡率,但被感染的鸡抵抗力降低,导致鸡对其他病原易感而引发二次感染,对家禽养殖业造成重大经济损失。当禽流感病毒感染哺乳动物时其体内的RIG-Ⅰ和MDA5受体能识别病毒RNA产生天然免疫反应,天然免疫系统的激活会引起下游的信号通路产生级联反应,并释放干扰素(IFN)和多种炎性因子发挥抗病毒效应。有研究表明在鸡的体内缺乏RIG-Ⅰ受体,但当鸡被禽流感病毒感染时鸡体内同样可产生抗病毒作用的IFN-Ⅰ。在哺乳动物MDA5的研究中,发现MDA5在抗流感病毒感染过程中可发挥识别病毒RNA并诱导IFN应答的作用,虽鸡的体内存在MDA5受体,但其在抗流感病毒中的功能并不清楚。因此本研究拟通过CRISPR/Cas9技术构建DF1细胞mda5功能失活的细胞系,评价mda5对H9N2禽流感病毒诱导IFN-β及对病毒增殖的影响,为阐释禽流感诱导IFN信号通路及开发适合H9N2流感病毒疫苗株增殖细胞系奠定基础。
  本研究首先拟通过将既可表达Cas9蛋白又可直接转录sgRNA的质粒转染到细胞完成基因突变,但结果显示在抗生素筛选下细胞均无存活,即该方法未能成功。接着在优化的慢病毒构建体系基础上,通过lenti-CRISPR-v2慢病毒系统构建突变细胞系,但同样构建失败。因此又选择运用两个小骨架慢病毒系统进行构建,首先通过lentiCas9-Blast慢病毒系统构建稳定表达Cas9蛋白的DF1细胞系,经检测可知DF1-Cas9细胞系构建成功;其次通过lenti-Guide-puro慢病毒系统将sgRNA整合入该细胞中,并通过T7E1试验及基因测序验证细胞系功能,结果表明在构建的DF1-Cas9细胞系中可发挥对mda5基因靶向切割的功能。利用对IFN敏感的VSV-GFP荧光病毒进一步筛选mda5基因功能失活的细胞系,结果显示成功实现DF1-Δchmda5细胞系的构建。
  为探究mda5对H9N2诱导的IFN-β及H9N2增殖的影响,因此分别测定了DF1-Δchmda5和DF1-Cas9细胞感染H9N2后诱导IFN-β和PKR转录水平。结果显示,DF1-Cas9感染H9N2后,细胞中IFN-β和PKR的转录水平随感染时间的延长呈现上升趋势,表明在H9N2刺激下DF1-Cas9细胞可诱导IFN的应答;在DF1-Δchmda5细胞系中也可检测到IFN-β的转录,但其转录水平显著低于DF1野生细胞,表明鸡mda5虽不是禽流感诱导IFN-β和PKR转录的唯一受体,但仍在IFN诱导中发挥主导作用。进一步测定细胞上清病毒的血凝价,结果显示mda5功能失活后可在24h内快速提高H9N2病毒血凝素含量。
  通过CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定表达Cas9蛋白的DF1细胞系;在该细胞系的基础上成功构建mda5功能失活的DF1细胞系;DF1细胞中mda5功能的失活可显著下调H9N2诱导IFN-β的转录,并在短时间内提高H9N2病毒血凝素含量。
[硕士论文] 姜晓娜
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎附植期是猪早期妊娠胚胎丢失最敏感时期之一,受很多因子调控,但目前对猪胚胎附植的相关因子研究较少。在本实验室先前的转录组和蛋白的测序数据分析发现ANXA8基因在猪的胚胎附植期差异表达。ANXA8基因是膜联蛋白家族的成员之一,编码抗凝血蛋白参与凝血级联并作为一种间接性的凝血酶特异性复合物。然而,目前在猪的胚胎附植以及猪的子宫内膜细胞中ANXA8基因的功能均未见报道。为了了解ANXA8基因在猪的子宫内膜中以及可能对猪胚胎附植产生的作用,本研究先检测了猪妊娠早期的子宫内膜组织中ANXA8基因的相对表达;然后将构建的真核超表达载体pcDNA3.1(+)-ANXA8和ANXA8基因的干涉片段转染到猪子宫内膜细胞中,通过免疫荧光、实时荧光定量PCR、流式细胞术和western blot等技术研究ANXA8基因在猪子宫内膜细胞中的调控作用;通过小鼠子宫角注射方法确定ANXA8基因对胚胎附植的影响。主要研究结果:
  1.实时荧光定量PCR技术检测猪妊娠9-15d和18d的子宫内膜组织中ANXA8基因的表达情况,发现该基因在妊娠12d的相对表达量最高。通过免疫荧光方法确定了ANXA8蛋白在猪子宫内膜细胞中的表达位置,发现ANXA8蛋白在细胞质中有表达。
  2.实时荧光定量PCR测定表明ANXA8基因显著上调LIF和EGF基因在猪子宫内膜细胞的表达量。
  3.流式细胞术确定ANXA8基因促进猪的子宫内膜细胞的细胞周期的S期细胞增加。免疫荧光技术和western blot技术确定超表达ANXA8基因可以通过促进细胞中增殖标志蛋白PCNA的表达来促进猪子宫内膜细胞的增殖。
  4.Western blot技术确定超表达ANXA8基因在不影响猪子宫内膜细胞中AKT总蛋白的情况下促进细胞中p-AKT蛋白的表达,进而调控细胞中AKT信号通路。免疫荧光技术和western blot检测证实ANXA8基因通过AKT信号通路来调控猪子宫内膜细胞的增殖,其中免疫荧光技术结果发现超表达ANXA8并添加AKT磷酸化抑制剂(Perifosine)后,细胞中PCNA蛋白含量与对照组无显著差别,且其含量低于只超表达ANXA8组中细胞内PCNA蛋白的含量,其次western blot结果发现AKT磷酸化抑制剂对细胞内ANXA8蛋白含量无影响。实时荧光定量PCR技术确定超表达ANXA8可以上调AKT下游mTOR基因在猪子宫内膜细胞中的表达。
  5.在小鼠子宫角注射实验发现注射干涉片段ANXA8的小鼠的胚胎附植数明显少于对照组。
  6.实时荧光定量PCR技术结果发现干涉ANXA8基因可以降低同家族ANXA4基因在子宫内膜细胞中的表达。
  以上主要结果表明ANXA8基因可以通过AKT信号通路促进猪子宫内膜细胞的增殖。此外还发现ANXA8基因也影响猪子宫内膜细胞中胚胎附植标志LIF和EGF基因的表达;ANXA8基因也会影响小鼠的胚胎附植数目。
[硕士论文] 邹丹阳
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪腹股沟/阴囊疝是一种常见的影响养猪业经济效益的发育异常疾病,主要发生在鞘状突和腹股沟管的薄弱部位。该病是由遗传和环境因素共同作用产生的,但目前对影响猪腹股沟/阴囊疝的遗传机制却知之甚少。本研究利用实验室前期对120头猪只个体(59头患病个体和61头健康个体)进行特异性位点扩增片段测序(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing,SLAF-seq)的结果进行全基因组关联分析,并对猪腹股沟/阴囊疝的易感基因进行筛选和功能验证。主要研究结果如下:
  1.将120个样本分成三个群体(group1:患病个体与健康个体;group2:患病大约克猪,健康大约克猪,患病长白猪,健康长白猪患病杂交猪和健康杂交猪;group3:患病法系猪,健康法系猪,患病美系猪与健康美系猪),利用FarmCPU(fixed and random model Circulating Probability Unification)模型进行全基因组关联分析,选择两种不同的阈值对关联结果进行筛选。当筛选阈值为系统默认值p.threshold=0.01/标记数时,共鉴定到21个与腹股沟/阴囊疝显著关联的SNPs(P<0.01),定位了9个易感基因(AUH,TMPRSS3,UBASH3A,PTPN20B,VWA3B,NOL10,TENM3,PLCG2和NUAK1);当筛选阈值为推荐值p.threshold=1E-05时,共鉴定到6个新的与腹股沟/阴囊疝显著关联的SNPs(P<0.01),定位了3个新的易感基因(DEGS1,MEPE和PRKCE)。上述结果均经过QQ图检验假阳性程度,发现统计结果与预测值拟合良好,关联结果可靠。
  2.针对筛选出的5个与细胞凋亡相关基因(DEGS1,PLCG2,PRKCE,NUAK1和TENM3)进行扩大群体验证。结果发现,在总群体和法系大约克猪中,PRKCE基因多态位点的基因型和等位基因频率在患病、正常两组中的分布差异显著(P<0.05);在所有群体中,DEGS1基因多态位点的等位基因频率以及基因型频率的分布与阴囊疝的发生并没有显著的关联(P>0.05);在法系群体和法系长白群体中,NUAK1基因多态位点的基因型的分布差异显著(P<0.05);在总群体中,PLCG2基因多态位点的基因型的分布差异显著(P<0.05);在法系群体、法系长白群体和多元杂交群体中,TENM3基因多态位点的基因型分布差异显著(P<0.05),而且在总群体和美系群体中,该基因多态位点的基因型分布差异极显著(P<0.01)。
  3.根据转录因子预测结果,选择TENM3基因作为腹股沟/阴囊疝候选基因进行初步功能研究。利用NNPP网站在线预测TENM3基因可能的核心启动子区域,与pGL3-Basic构建重组载体,通过双荧光活性检测发现TENM3-2片段的荧光活性最高(P<0.01),将其定义为TENM3基因的核心启动子区域。构建包含核心启动子TENM3-2和不同基因型(G/T)内含子片段的重组pGL3-Basic载体,双荧光素酶活性检测发现pGL3-P2-G的荧光活性显著高于pGL3-P2-T(P<0.05)。干扰预测的可能与目标SNP位点结合的转录因子RUNX2后,细胞晚期凋亡数量未发生显著变化(P>0.05),但TENM3的蛋白和mRNA水平均显著降低(P<0.05)。结果说明TENM3基因该SNP位点可以影响转录因子RUNX2的结合,且该转录因子可能具有抑制TENM3基因转录激活的作用。
[博士论文] 哈西卜哈利克
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  1.硼对脾的影响
  在研究中检测了硼对脾发育变化之间的关系和硼(以硼酸的形式)对Hsp40/70表达水平的影响。将30羽健康雏鸵鸟随机分为6组:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组,分别饲喂添加0,40,80,160,320,640mg/L硼的基础日粮。通过HE染色对脾组织进行病理学检查;采用IHC和Western blot检测技术分析Hsp40/70的表达水平;并通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测Hsp40/70的mRNA表达水平。为了研究细胞凋亡,分析了所有处理组的TUNEL反应。该部分研究工作的内容和结果如下:
  1.1硼对鸵鸟脾组织结构的影响
  与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组没有显著性差异。与Ⅰ组比较,Ⅲ组和Ⅳ组白髓的数量和体积增多,边缘区细胞密集增厚,边界清晰。试验组Ⅴ和Ⅵ组织病理学变化明显;白髓的数量和体积减少,边界不清晰。
  1.2硼对Hsp40/70在雏鸵鸟脾中分布的影响
  Hsp70主要在脾脏组织中呈弥漫分布。与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组的Hsp70的分布无显著性差异,但Ⅲ组,特别是饲喂添加160mg/L硼的Ⅳ组的Hsp70分布差异显著。然而,高硼处理组的Hsp70阳性信号的分布开始下降,其在Ⅵ下降得犹为明显。此外,与Ⅰ组相比,Ⅱ组中阳性信号IOD略有增加,但无显著性差异;Ⅲ组和Ⅳ组中Hsp70阳性信号的IOD显著性升高。然而,Ⅴ组阳性信号的IOD却略有降低,但无显著性差异,Ⅵ组阳性信号的IOD显著性降低。通过蛋白免疫印迹分析,Hsp70表达量水平与免疫组化结果的趋势相似。随着硼含量的增加,Hsp70s表达量也增加并在Ⅳ组中达到峰值。Hsp40的表达量的趋势与Hsp70的相似;然而,与Hsp70相比,相同组中Hsp40的表达量较少。这表明Hsp40是Hsp70的辅因子,有助于Hsp70的活性。
  1.3硼对鸵鸟脾Hsp40/70mRNA表达量的影响
  Ⅱ组(40mg/L硼)中Hsp40/70的mRNA表达量水平高于Ⅰ组;Ⅲ组mRNA表达量水平显著升高;Ⅳ组mRNA表达量水平达到峰值,之后Hsp40/70的mRNA表达量水平开始下降;Ⅵ组的mRNA表达量水平最低,与Ⅰ组(对照组)相近。mRNA表达量下降,表明Hsp40/70mRNA表达量是呈现剂量依赖性的,最初在较低剂量下诱导表达,然后在较高量的硼处理组中被抑制。
  1.4硼对鸵鸟脾细胞凋亡的影响
  为了检测硼对雏鸵鸟脾细胞凋亡的影响,采用TUNEL法评估细胞凋亡。TUNEL细胞主要是棕色颗粒的细胞。在Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组中,TUNEL阳性信号弱于Ⅰ组;但在第Ⅴ组,特别是Ⅵ组(640mg/L硼)TUNEL阳性信号增强。IOD分析显示Ⅱ-Ⅳ组水平较低,Ⅳ组最低;而与Ⅰ组相比,Ⅴ组和Ⅵ组的IOD水平显著升高。
  2.硼在肾脏组织发育中的作用
  在本试验中,研究了硼对雏鸵鸟肾的作用,特别是抗氧化能力。将48羽雏鸵鸟随机分为6组,在饮用水中补充不同浓度的硼。测定相对氧化/抗氧化酶(T-AOC,MDA,GSH-Px,CAT,GR,SOD)和肾细胞凋亡各项指标。通过qPCR测量该通路(Nrf2,HO-1和GCLC)中3个重要基因的表达,并通过免疫组化分析关键调节因子Nrf2的定位。研究的相应内容和结果如下:
  2.1硼对雏鸵鸟肾组织凋亡的影响
  凋亡的细胞分布在肾的各个部位,这些细胞基本上是棕色颗粒的细胞。与对照组相比,Ⅱ组和Ⅲ组凋亡细胞数量较少。饲喂添加160mg/L硼基础日粮处理组凋亡细胞数量略有增加,当添加剂量达到320mg/L时凋亡细胞数明显增加,在640mg/L剂量时达到峰值。此外,IOD分析显示Ⅱ组和Ⅲ组的水平较低,Ⅲ组水平最低,而与对照组相比,Ⅴ组和Ⅵ组IOD水平显著升高。
  2.2硼对雏鸵鸟肾组织抗氧化活性的影响
  与对照组相比,添加40mg/L和80mg/L硼组MDA含量分别显著降低了26.02%和48.12%,然而添加160-320mg/L硼时增加,640mg/L硼组增加了一倍。添加40mg/L硼组雏鸵鸟肾组织T-AOC活性与对照组相比没有差异,添加80mg/L硼组则明显升高。相反,添加640mg/L硼组T-AOC活性显著下降,与同组MDA含量变化相反。雏鸵鸟肾组织的GSH-PX活性在添加40和80mg/L硼组略有增加,但差异不显著。然而,GSH-PX在添加160,320mg/L硼组显著增加了约50%,添加640mg/L硼组增加了一倍。
  2.3硼对雏鸵鸟肾组织Nrf2抗氧化通路的影响
  研究结果表明,在低剂量硼组,Nrf2阳性产物主要分布在肾近端小管,而高剂量组Nrf2阳性产物分布主要位于上皮细胞中。IOD分析显示,低剂量组Nrf2阳性产物的分布较高,而与Ⅰ组相比,高剂量组的Nrf2阳性产物分布较少。抗氧化通路(Nrf2,HO-1,GCLc)中3个重要基因的qPCR分析显示不同组之间相似而强烈的差异。与对照组相比,当添加硼达到160mg/L剂量时能显著提高了雏鸵鸟肾组织中Nrf2的表达水平,添加80mg/L硼组达到峰值。除了添加40mg/L硼组外,其他添加硼组抗氧化通路GCLc表达量水平均显著升高,添加80mg/L硼组达到最大值。此外,与其他抗氧化因子相比,硼对雏鸵鸟肾组织中HO-1表达量水平的影响是最大的。
  3.硼对肝脏功能的影响
  在非洲鸵鸟饮用水中添加硼酸(0mg,40mg,80mg,160mg,320mg和640mg),观察并检测雏鸵鸟肝中由不同剂量硼引起的组织学,细胞凋亡,组织化学和血清生化参数的变化。通过HE染色和PAS染色评估不同组的组织结构变化;通过TUNEL检测细胞凋亡情况;通过分光光度法检测血清生化指标。得到的结果如下:
  3.1硼对肝组织结构的影响
  90羽鸵鸟肝显示出良好的结构,具有丰富的细胞数量和不同形状的肝门管区。在低剂量硼组,进一步发现肝细胞发育良好,肝门管区清晰可见。在高剂量组中观察到肝组织结构发生改变。与硼中毒有关的主要病变包括:肝门管区炎症和肝细胞病变。肝门管区炎症在Ⅵ组最严重。在肝组织的一些肝细胞中观察到轻度症状,添加640mg/L硼剂量组中较多。此外,一些肝细胞还观察到核疱化。同时,还观察到的部分的核固缩和坏死。
  3.2硼对糖原含量的影响
  Ⅱ组糖原含量高于Ⅰ组,Ⅲ组糖原含量最高,有显著性差异。Ⅳ组可能是最佳剂量,之后糖原量开始下降。与Ⅰ组比较,在Ⅴ组和Ⅵ组中糖原含量最少。经IOD分析证实了以上所述各组糖原水平。
  3.3硼对雏鸵鸟肝细胞凋亡的影响
  低剂量组显示较少的细胞凋亡,Ⅱ组中细胞死亡最少。与Ⅰ组相比,高剂量组,特别是添加640mg/L硼组中肝细胞凋亡量较多。IOD的统计学分析与本研究的TUNEL结果相似,表明硼对细胞凋亡具有剂量依赖性作用,并且添加超过160mg的硼剂量会使更多的细胞凋亡。
  3.4硼对血清生化指标的影响
  血清生化指标受硼剂量的影响显著。高剂量组(添加320mg/L,特别是640mg/L硼组)酶活性参数与空白组相比差异显著。同时,参与代谢的血清生化指标在低剂量组(至Ⅳ组)中显示出硼有利的作用。总体结果表明硼在低剂量(80-160mg/L硼酸)对肝酶活性和代谢有正面的影响,高剂量(主要是640mg硼酸/L)则具有相反的作用。
  简言之,总体结果表明适当的膳食硼摄入量(约160mg)可以使雏鸵鸟各组织发育良好,提高抗氧化的能力,减少细胞的凋亡和正向调节各项血清生化指标。然后,高剂量的硼能引起中毒反应并表现出明显的组织学结构病变。此外,长期超量添加硼会导致HSP表达量下降,糖原消耗过多,细胞凋亡增多和酶活性增加,这些都与硼的作用密切相关。
[硕士论文] 孙灵灵
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甲氧苄啶类药物是一类二氢叶酸还原酶抑制剂,常与磺胺类联用增加药物的抗菌活性,所以在临床上广泛应用。由于该类药物较好的抗菌增效作用,实际生产中滥用现象时常发生,影响了药物协同作用的防治效果以及导致细菌耐药性的产生,并且关于甲氧苄啶类药物的残留消除研究较少,因此为了该类药物在临床上的安全有效使用,有必要建立它的残留预测研究。仅仅依靠制定的最大残留限量和休药期,并不能对标签外用药残留量进行较好预测,由此可能会导致兽药在动物中残留。若是对上市的动物进行抽检,不但工作量大,而且一旦抽检不合格也会造成很大的经济损失。生理药动学(PBPK)模型作为一种新的残留预测方法,可以弥补现存残留预测方法的不足。本研究开展了二甲氧苄啶(DVD)在猪体内的生理模型研究,并通过化合物外推得到同类药物甲氧苄啶(TMP)、艾地普林(ADP)在猪体内以及种属外推得到DVD在鸡和鱼体内的PBPK模型。通过这些研究,建立甲氧苄啶类药物的残留预测方法,促进甲氧苄啶类药物残留监控体系的完善,加大PBPK模型在兽药领域的应用范畴。
  1.DVD在猪体内PBPK模型构建
  生理参数如猪的心输出量和组织器官容积都可以通过文献查阅得到。化合物特异性参数:吸收速率常数通过计算初值为0.061h-1,肾清除率为0.075L/h/kg,组织/血浆分配系数是利用血浆与组织中的药时曲线下面积比值得到,在肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中分别为0.7、1.31、0.38和0.53,肝脏、胆汁和肠道代谢速率常数是采用后3个点消除相斜率得到,分别为0.008h-1、0.017h-1和0.009h-1,这些参数值作为模型运行的初值。
  根据查找到关于DVD的药动学以及残留消除数据,建立一个血流限速型PBPK模型。采用一级速率方程描述DVD在肝脏中的代谢,模型包含肝脏、肾脏、肌肉、脂肪、血浆和其他组织房室,肝肠循环过程也包含在结构中。利用查找到的实验数据对模型中的化合物动力学参数进行有针对性的调试和逐步优化,灵敏性分析确定对模型影响较大的参数,分别为吸收速率常数、生物利用度、肝脏代谢速率常数、肠道代谢速率常数、肾清除率和各组织/血浆分配系数,以灵敏性参数为研究对象进行蒙特卡罗模拟,考量参数的变化对于预测结果产生的影响,并且实验数据也都包含在蒙特卡罗模拟的结果中。同时用非拟合数据对模型进行验证,验证采用直观对比分析、残差分析、线性回归分析和2倍因子分析进行评价,结果表明,模型能较好地对大多数时间点药物浓度进行残留预测,表明了模型建立的成功。本课题是采用acslXtreme软件((advanced continuous simulation language,acslX,Version3.0.2.1,Aegis Technologies Group,Inc.,Huntsville,AL,USA)以代码的形式建立PBPK模型。
  2.TMP在猪体内残留消除研究
  本研究建立了TMP在猪的可食性组织肝脏、肾脏、肌肉、脂肪以及血浆中的HPLC检测方法,样品经乙酸乙酯和氨水提取,MCX小柱净化,0.5%高氯酸和甲醇(67∶33,V/V)复溶,HPLC检测。色谱柱:Zorbax SB-C18,流动相:0.5%高氯酸∶甲醇=67∶33,紫外检测波长:230nm,进样量:20μL,柱温:30℃。该方法在猪血浆以及各组织中的定量限为40μg/kg,在40、80和160μg/kg浓度下回收率均在82%以上,且日间相对标准偏差低于10%,该方法满足相关方法学要求。
  20头28kg左右的杜长大三元杂交猪,按照6mg/kg b.w连续7d灌胃给药,最后一次给药后在1、3、5、7和14d宰杀动物,取肝脏、肾脏、肌肉和脂肪组织及采集血浆。HPLC分析结果显示,停药1d后肾脏中TMP含量最高,达到693.8μg/kg,停药3d和5d时各组织中药物浓度均高于定量限,第7d时仅在肝脏、肾脏和血浆中检测到药物残留,肌肉和脂肪中的药物含量低于定量限,第14d时在组织和血浆中都检测不到药物残留。
  3.PBPK模型外推
  以DVD在猪体内的PBPK模型为基础,化合物外推到同类药物TMP和ADP,种属外推到DVD在鸡、鱼体内。化合物外推所需要的生理参数与DVD在猪体内的生理参数一致,化合物动力学参数的初值通过文献查找,没有查找到的假设与DVD拟合后的结果一致,通过药动学和残留消除结果对模型进行拟合。TMP在猪体内的PBPK模型能较好地拟合连续7d给药后肝脏、肾脏、肌肉、脂肪和血浆中药物浓度,但在最后一次给药后第7d肾脏中药物残留预测值略高于实验值,这可能是因为肾脏中血流量较少,但预测值仍在实验值的2倍因子范围内,因此模型能较好地对TMP在猪体内的药物残留进行监控。ADP在猪体内的PBPK模型能很好地对肝脏、肾脏、肌肉、脂肪和血浆中药物浓度进行预测,但是模型高估了最后一次给药后肝脏中第3d和肾脏中第3d和5d中的药物浓度,这可能是由于肝脏和肾脏器官容积、血浆分配系数较大的原因。种属外推需要的鸡、鱼生理参数通过文献查找得到,假设化合物动力学参数在种属间是不变的,通过组织和血浆中DVD浓度对模型进行拟合以及验证。DVD在鸡体内的PBPK模型预测值和实验值在一些时间点存在差异,这可能是由于鸡的生理结构与哺乳动物差异较大,但是模型还是能对DVD在鸡体内的残留趋势进行预测。DVD在鱼体内的PBPK模型能较好地拟合连续7d给药后1d、3d和7d中肝脏和肌肉中药物浓度,以及14d时肝脏和肾脏中的药物残留,但高估了最后一次给药后肾脏中第3d的药物浓度,这可能与肾脏中组织血流量有关,但2倍因子分析结果表明,模型预测值均在实验值2倍因子范围内,符合模型评价标准,也证明了模型外推的成功。
  综上所述,本课题建立了能够预测不同给药方案下DVD在猪体内残留的PBPK模型,并通过化合物外推和种属外推建立了ADP和TMP在猪体内及DVD在鸡、鱼体内的PBPK模型。该研究结果为甲氧苄啶类残留监控提供了新型预测手段,促进了甲氧苄啶类药物残留监控体系的完善,对于保障动物源性食品安全以及养殖行业的健康发展具有重要的意义。
[硕士论文] 张瑶
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多动物共患病,猪是伪狂犬病毒的天然宿主。2011年底,我国多省份经gE基因缺失株Bartha-K61弱毒疫苗免疫的猪突发伪狂犬疫病,对猪场造成巨大经济损失。病毒分离等实验证明疫病爆发根源是该毒株发生变异。对感染PRV变异株和疫苗免疫的猪区别诊断,是国际上控制伪狂犬病的策略之一。为有效防控并清除猪伪狂犬病,亟需建立针对PRV变异株gE蛋白抗体的检测方法。
  本实验用原核系统表达了PRV新流行株河南博爱株的gE蛋白,建立了一系列检测gE蛋白抗体的方法。建立了间接ELISA方法,包被抗原浓度0.32μg/mL,待检血清1∶400稀释,1%牛血清白蛋白(BSA)封闭,羊抗猪IgG5000倍稀释,以5倍信噪比为阴阳性判定标准。本方法与阻断法ELISA试剂盒相比符合率为91.36%,灵敏性为76.92%,特异性为94.12%。
  为建立更快速的检测方法,基于间接ELISA实验,我们将gE蛋白与猪IgG分别作为检测线和质控线,以胶体金颗粒标记羊抗猪IgG制备免疫胶体金,组装成胶体金免疫层析试纸条。试纸条的质控线(C线)包被2mg/mL的猪IgG,检测线(T线)包被2mg/mL的gE蛋白。胶体金标羊抗猪IgG的pH9.0~9.2,浓度0.07mg/mL。敏感性实验发现,血清稀释640倍时检测线和质控线最清晰,但特异性实验发现试纸条特异性较差。
  为更快速准确地检测gE蛋白抗体,我们建立了基于磁珠的检测方法。优化反应条件后,本方法检测限达到阳性血清稀释51200倍,线性范围为血清稀释50~25600倍,灵敏度比ELISA方法有较大提高。并且,本方法可在30m in内完成gE蛋白抗体检测。
  综上所述,本实验建立了三种检测PRV gE蛋白抗体的方法:间接ELISA方法、免疫层析试纸条方法以及基于磁珠的快速检测方法。基于磁珠的快速检测具有灵敏度高、操作简便等优点,有望开发成新型PRV gE蛋白抗体快速检测商品化试剂盒。
[博士论文] 杨新
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文对湖北省山羊主要寄生蠕虫开展分子流行病学调查方面的研究。论文主要包括文献综述,描述已取得成果的八个章节以及讨论。文献综述发现了一些需要解决的问题(第一章),这些问题主要包括山羊寄生虫分子流行病学调查、山羊寄生虫的分子鉴定与诊断以及山羊线虫的抗药性。
  本研究的目的是针对这些需要解决的问题开展相关方面的研究,包括:(1)通过对湖北省山羊寄生蠕虫的调查明确其流行情况;(2)对调查中发现的重要前后盘吸虫开展线粒体基因组的研究,为今后的分子流行病学、种群遗传结构以及遗传进化分析的研究提供更多的分子标记;(3)针对优势虫种捻转血矛线虫建立环介导等温扩增检测方法用于捻转血矛线虫病的特异性诊断;(4)同时,对湖北省山羊消化道线虫的抗药性进行调查,为该地区山羊寄生蠕虫病的防控提供参考。
  结合形态学检测技术及基于PCR的DNA测序方法对张港镇(第二章)及罗田县(第三章)放牧山羊寄生蠕虫感染情况进行调查,结果表明山羊寄生蠕虫,尤其是消化道线虫,全年都维持在较高的感染水平,线虫在2月份、5月份、9月份和12月份会出现感染的小高峰;吸虫感染主要出现在3-8月份,这可能与中间宿主螺蛳的活动相关;绦虫感染没有明显的季节动态。山羊寄生蠕虫主要包括捻转血矛线虫、蛇形毛圆线虫、奥斯特线虫、鞭虫、粗纹食道口线虫、前后盘吸虫、矛形双腔吸虫、肝片吸虫、胰阔盘吸虫、细颈囊尾蚴和扩展莫尼茨绦虫,优势虫种为捻转血矛线虫、前后盘吸虫及细颈囊尾蚴。
  针对重要前后盘吸虫长菲策吸虫(第四章)、荷包腹带吸虫(第五章)及野牛平腹吸虫(第六章)开展线粒体基因组的测序与分析,为后续的分子流行病学、种群遗传结构以及遗传进化分析的研究提供有用的分子标记。结果表明长菲策吸虫、荷包腹袋吸虫及野牛平腹吸虫线粒体基因组具有相同的基因排序,并且,基于线粒体全基因组的遗传进化分析表明三种前后盘吸虫与鹿前后盘吸虫的亲缘关系最近,这与它们在分类学上的关系相一致(第四至六章)。
  针对优势虫种捻转血矛线虫核糖体第二内转录间隔(ITS-2)建立了环介导等温扩增检测方法,并将该方法用于生产实践中捻转血矛线虫病的诊断,结果表明该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强及省时的优点(第七章)。
  在山羊寄生蠕虫调查过程中,发现驱虫药的超剂量使用在山羊驱虫过程中十分普遍,尤其是伊维菌素。为了验证是否存在抗药性,结合粪便虫卵计数减少实验(FECRT)及死后剖检在湖北省张港镇及罗田县放牧山羊中开展抗药性的调查,结果首次证明张港镇(第八章)和罗田县(第九章)山羊消化道线虫存在苯并咪唑、左旋咪唑及伊维菌素抗药性。
  本研究对于湖北地区山羊寄生蠕虫流行病学调查、重要吸虫分子生物学特性及抗药性检测等方面的研究具有重要的意义。本研究的结果为湖北省山羊寄生蠕虫的后续研究及其防控提供参考(第十章)。虽然本研究主要关注山羊优势寄生蠕虫,但本研究的结果对于我国其它家畜寄生蠕虫的系统研究具有借鉴意义。
[博士论文] 郝兴杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)和基因组选择(Genomic Selection,GS)已经成为研究人类和动植物复杂性状遗传基础和表型预测的重要手段。随着测序技术的发展,人类和动植物基因组的功能注释不断完善,在GWAS和GS中整合SNP的生物学注释信息将有利于复杂性状遗传基础的挖掘和表型预测准确性的提高。因此,本研究基于混合线性模型分别在GWAS和GS中提出整合功能注释信息的策略和模型,建立了整合先验生物学信息的全基因组最佳线性无偏预测(incorporate Prior biological information in Genomic Best Linear Unbiased Predictor,pGBLUP),整合多种注释信息鉴定性状相关组织(Scalable Multiple Annotation integration for trait-Relevant Tissue identification and usage,SMART)两种遗传学分析方法。本研究的主要研究结果如下:
  (1)建立了pGBLUP模型和方法,通过模拟比较pGBLUP和常见基因组选择方法(GBLUP和BayesR),发现pGBLUP使用生物学注释信息可以提高基因组选择功效,但对注释信息的功能也存在依耐性;
  (2)pGBLUP模型可以被拓展后用于遗传力富集分析,可以准确估计不同功能注释信息的遗传力富集程度,作为衡量不同功能注释对性状性状影响的指标;
  (3)pGBLUP应用于奶水牛基因组选择,奶牛产奶性状QTL区域对奶水牛产奶性状具有中等较弱的遗传力富集(fe<5),在奶水牛样本量有限(412头)的情况下,整合奶牛产奶性状QTL信息以提高奶水牛产奶性状基因组选择的效果不明显,但pGBLUP为将来在小群体中整合先验生物学功能信息进行基因组选择提供了策略;
  (4)pGBLUP应用于仔猪八字腿功能注释信息遗传力富集分析,鉴定出了在仔猪八字腿遗传力上高度富集(fe>100)的7条KEGG信号通路,其中信号通路KEGG_MTOR_SIGNALING_PATHWAY控制肌肉发育,值得进一步深入研究;
  (5)建立了SMART模型和方法,通过模拟测试以及真实数据应用,发现SMART整合多种注释信息有利于准确鉴定性状相关组织(细胞),且利用SMART鉴定的性状相关组织构建的SNP权重,可以提高SNP-set检验功效,在GWAS中鉴定出更多的位点;
  (6)SMART应用于人类复杂性状和基因组功能注释公共数据:根据性状与组织相关性,将43个性状分层聚为5大类,从整合多组学功能注释信息角度发现性状之间的相关关系;同时对不同组蛋白注释信息效应的估计,发现组蛋白H3K4me1和H3K4me3具有较大效应,适合进行基因组功能预测。
  总之,本研究建立了整合功能注释信息的基因组选择方法pGBLUP和全基因组关联分析方法SMART,通过整合功能注释信息提高基因组选择和全基因组关联分析的功效,将为复杂性状遗传基础的研究和表型预测提供新的思路和工具,有助于通过整合和利用动物多组学功能注释信息加快动物的遗传选育。
[硕士论文] 屈文萍
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:骨骼肌卫星细胞是一类位于肌纤维膜表面与基底膜之间的细胞,在肌肉的发育和再生过程中发挥着重要的作用。长非编码RNA(Long non coding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt,具有低蛋白编码潜力的RNA分子。lncRNA能够调控基因表达、参与表观遗传修饰,影响细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动的进程。本研究以体外分离的猪骨骼肌卫星细胞为材料,研究一个新的lncRNA-AK394747在细胞增殖和分化过程发挥的功能及可能存在的机制。主要研究结果如下:
  1.利用两步酶消化法成功分离出活性较高、有一定增殖能力的猪原代骨髂肌卫星细胞,经差速贴壁纯化后,用Pax7基因对分离的细胞进行鉴定,免疫荧光结果显示细胞阳性率高达95%。同时,对分离的细胞进行分化诱导培养,能形成肌管,且稳定表达MyoD、MyoG和MyHc这三个成肌标志基因。
  2.通过RACE和测序验证了猪AK394747全长为1586bp,生物信息学分析发现该lncRNA不具有编码蛋白的能力,主要存在于细胞质中,时空表达谱分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉组织中高表达,且随着猪骨骼肌细胞的分化表达量上升。
  3.在猪骨骼肌细胞中利用干扰和超表达实验研究了AK394747对细胞增殖和分化的影响,EdU、RTCA以及细胞周期检测等实验结果发现该lncRNA对骨骼肌细胞的增殖过程无显著影响,并且增殖相关基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表达变化不显著;而干扰AK394747后,利用Q-PCR、Westren Blotting以及免疫荧光技术检测发现肌细胞分化标志基因MyoD、myoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表达显著下降,表明AK394747促进了猪骨骼肌细胞分化。
  4通过生物信息学筛选了4个潜在的与AK394747结合的miRNA—ssc-miR-32,ssc-miR-218,ssc-miR-218-3p,ssc-miR-301。在干扰AK394747后,其中ssc-miR-32及其pri-RNA表达降低。通过在线软件预测发现AK394747基因与NICD蛋白可能相互结合,同时利用Q-PCR技术检测发现干扰AK394747后NICD(Notch1胞内片段)基因的表达显著升高。
  本实验研究了猪lncRNA-AK394747的基本性质,验证了其促进骨骼肌细胞分化的基因功能,初步预测了其可能发挥作用的方式,为研究AK394747在骨骼肌细胞发育过程中的作用机制奠定了基础,同时也为研究猪骨骼肌生长发育调控机制提供了新的思路。
[硕士论文] 吕梦婷
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种病毒性肠道传染病。自2010年底,由PEDV变异毒株引起的PED大规模暴发,给全球养猪业带来了严重的经济损失。目前尚无有效的药物用于该病的治疗,因此抗PED药物的开发成为研究热点。PEDV3C样蛋白酶(3CLpro)在PEDV增殖及致病过程中发挥关键作用,且在PEDV不同变异毒株中具有较好的保守性,因此,PEDV3CLpro可以作为开发抗病毒药物的重要靶标。而PEDV3CLpro和底物间相互作用机制的阐明将为靶向PEDV3CLpro特异性药物的研制提供理论依据。
  本实验室前期的分子生物学实验研究发现,PEDV3CLpro可以识别天然免疫信号通路中关键分子-NEMO的第231位(P1)谷氨酰胺并对其进行切割,当NEMO切割位点邻近的第229位(P3)谷氨酰胺突变为精氨酸(Q-P3-R)、赖氨酸(Q-P3-K)或丙氨酸(Q-P3-A)后,发现Q-P3-A突变体完全不能被PEDV3CLpro切割,而Q-P3-K和Q-P3-R突变体被PEDV3CLpro切割的程度减弱,表明P3位点的突变会影响NEMO被PEDV3CLpro识别和切割,提示NEMO P3位在PEDV3CLpro识别底物自身底物过程中可能具有某些特殊作用。但是,P3位氨基酸是如何影响底物被PEDV3CLpro识别的机制尚不清楚,因此,本论文利用分子动力学模拟针对PEDV3CLpro与NEMO之间的相互作用开展了以下研究:
  1.Western blot实验分析PEDV3CLpro识别NEMO P3位的特征
  有文献报道冠状病毒3CLpro底物P3位偏爱正电荷氨基酸和长侧链氨基酸,我们在分析PEDV3CLpro底物P3位偏爱性时,发现P3位偏爱性最高的氨基酸为天冬酰胺(N)。基于此,我们构建了NEMO229(QP3)位突变的2个突变体:Q-P3-E和Q-P3-N,将这两个突变体的真核表达质粒和实验室之前构建的NEMO野生型(WT)及3个突变体(Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R)的真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,通过Western blot实验检测不同转染体系中PEDV3CLpro对NEMO的切割程度。发现WT(无电荷、长侧链)、Q-P3-K(正电荷、长侧链)、Q-P3-R(正电荷、长侧链)可以被PEDV3CLpro切割,而Q-P3-A(无电荷、短侧链)不能被PEDV3CLpro切割,与本实验室前期实验结果相符;此外,Q-P3-E(负电荷、长侧链)及Q-P3-N(无电荷、长侧链)也可以被PEDV3CLpro切割,说明PEDV3CLpro底物NEMO P3位也可以是负电荷氨基酸。进一步分析发现在可以发生切割反应的体系的中,底物NEMO P3位均具有长侧链的特征,提示PEDV3CLpro底物NEMO P3位可能偏爱长侧链氨基酸。
  2.NEMO P3位点不同突变体与PEDV3CLpro间的自由能分析
  分子生物学实验是进行分子动力学研究的基石,而分子动力学研究可以从微观角度上观察到模拟体系原子尺度上的运动变化。为探究NEMO P3位点不同突变对PEDV3CLpro识别底物的影响,我们借助分子动力学模拟分析了NEMO野生型(WT)及5个突变体(Q-P3-A、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E和Q-P3-N)与PEDV3CLpro间的自由能。发现Q-P3-A与PEDV3CLpro间的自由能值最大,说明Q-P3-A体系中酶与底物的亲和力最低,发生切割反应的可能性最小,与生物学实验证实Q-P3-A是唯一不能被切割的结果是一致的。
  3.NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割
  有文献报道:冠状病毒3CLpro底物P3位偏爱可以形成β-sheet结构的氨基酸,而PEDV也属于冠状病毒,因此,我们利用分子动力学模拟分析了不同突变体P3位点及其邻近氨基酸的二级结构变化,发现在可以发生切割反应体系中的NEMO(WT、Q-P3-K、Q-P3-R、Q-P3-E、Q-P3-N)均存在由P3、P2形成的β-sheet结构;但是,在无切割反应发生的体系中的NEMO(Q-P3-A)则不存在由P3、P2形成的β-sheet结构,表明NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割。进一步利用分子动力学模拟分析了6个体系中底物P3、P2位β-sheet结构存在的时间,发现在WT、Q-P3-N、Q-P3-K中,P3、P2位的二级结构始终为β-sheet,在Q-P3-R中,P3、P2位的二级结构由β-sheet逐渐转变为loop,在Q-P3-E中,P3、P2位的二级结构由loop逐渐转变为β-sheet,而在Q-P3-A中,P3、P2位的二级结构由β-sheet很快转变为loop,表明NEMO P3位的突变会影响P3、P2位β-sheet结构的形成和维持。
  4.NEMO P3位点的突变影响PEDV3CLpro酶活位点H41和C144间的距离
  在证实NEMO P3、P2位β-sheet结构的存在有利于PEDV3CLpro的切割后,利用分子动力学模拟对其作用的具体机制进行了分析。发现当底物P3、P2位二级结构由β-sheet转变为loop时,底物P2位氧原子构象由溶剂化表面翻转至PEDV3CLpro酶活口袋方向,底物P2位氧原子构象的变化又导致PEDV3CLpro上S2口袋氨基酸中H41的构象发生了改变,而H41构象的改变,则导致了其与另一个酶活位点C144间的相对定位发生了改变。而PEDV3CLpro酶促反应的第一步是H41上的N夺取C144上-SH的H,暗示H41和C144间的距离对酶促反应的发生至关重要。因此,进一步分析了PEDV3CLpro H41和C144间参与酶促反应的重原子间距,发现在不同体系中,H41和C144间的距离波动差异明显,表明NEMO P3位的突变会影响PEDV3CLpro酶活位点H41和C144间的距离。此外,我们分析了酶活位点间距和NEMO的切割程度间的相关性,发现二者的相关性系数为0.846,表明二者之间具有强相关作用,说明PEDV3CLpro中H41和C144间的合适距离是影响其对NEMO切割的重要因素。
[硕士论文] 牛红丹
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:应激反应导致机体内应激激素大量分泌,其中以皮质醇为主,它是影响肉质的一个较为重要的因素。课题组前期研究表明,在动物日粮饲喂过程中添加皮质醇会导致仔猪背最长肌肌肉组织受损严重,肌纤维间隙增大,凋亡细胞数增多。但目前关于应激激素是如何影响肉质以及通过何种方式导致肉质发生变化的机制并不完全清楚。现今研究表明糖皮质激素(glucocorticoid,GC)主要通过细胞膜与体内糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)结合发挥一系列调控作用。在这些基础上,本课题以GRα为主要研究对象,探究GRα对猪原代骨骼肌细胞(pig skeletal muscle cells,PSC)生长的影响以及在猪劣质肉产生过程中的作用,并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:
  1.地塞米松引起猪肌细胞氧化应激
  地塞米松(dexamethasone,DEX)处理PSC细胞后发现其对肌细胞有明显的毒性,且与对照组相比DEX组细胞内的活性氧自由基大量上升,造成细胞氧化应激;等浓度米非司酮(mifepristone,RU486)处理后细胞内的活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)明显下降。通过MTT法检测DEX对PSC细胞增殖的影响,实验结果表明:DEX抑制PSC细胞增殖。通过qPCR和Western blot检测DEX对细胞应激的影响,结果表明:DEX能促进PSC细胞中HSP90的表达;等浓度RU486处理后能抑制PSC细胞中HSP90的表达。
  2.GRa对PSC细胞功能的影响
  通过构建GRα超表达载体和合成siRNA来超表达和抑制GRα的表达。通过流式细胞仪和MTT法检测GRα对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达GRα可以促进PSC细胞凋亡,抑制PSC细胞增殖。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR检测GRα对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达GRa能促进PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和GPX2的表达;同样,干扰GRα能抑制HSP90、CAST和GPX2的表达。超表达GRα和干扰GRα后检测谷胱甘肽过氧化物酶活性,实验结果表明:超表达GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高,干扰GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。可能是机体应激水平过高,并通过提高谷胱甘肽过氧化物酶活性以维持机体稳定。
  3.GRα靶基因的筛选
  干扰GRα后根据表达差异筛选GRα的靶基因,定量结果显示,干扰GRa后极显著下调Tβ10的表达,下调HSP90和HSP7的表达;且超表达GRα后Tβ10的表达显著升高,上调HSP90和HSP27的表达,且在网站上预测出GRα与Tβ10的结合位点。因此推测Tβ10可能是GRα的靶基因,双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀等试验初步验证,结果表明Tβ10可能是GRα潜在的靶基因。构建Tβ10超表达载体后通过流式细胞仪检测Tβ10对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达Tβ10可以促进PSC细胞凋亡。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR实验检测Tβ10对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达Tβ10能促进PSC细胞中BAX、HSP90、HSP27和CAST的表达。
  4.APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激
  与GRα组相比添加不同浓度的(0.1mg/mL,1mg/mL,10mg/mL和100mg/mL)黄芪多糖(astragalus Polysacharin,APS)后可缓解细胞应激,并通过检测ROS含量找出最适浓度为10mg/mL。添加10mg/mL APS后机体的ROS水平显著降低,且与对照组趋于一致。通过MTT法检测APS对PSC细胞增殖的影响,结果表明:APS可显著缓解超表达GRα后抑制PSC细胞增殖的作用。且添加APS后与GRα组相比谷胱甘肽过氧化物酶活显著降低,从而维持机体稳定。通过QPCR和Western blot检测APS对PSC细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果显示:与GRα组相比添加APS可抑制PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和Tβ10的表达。表明APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激。
[博士论文] 李中华
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起的新型猪流行性腹泻在世界范围内暴发,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。然而,当前防控手段的匮乏无法应对PED带来的威胁。因此,研究PEDV的致病机理以及开发抗PEDV药物对PED的防控和治疗具有深远的意义。
  本研究基于iTRAQ技术,开展了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠组织的比较蛋白质组学分析,为揭示PEDV的致病机理和宿主的免疫应答提供参考。根据蛋白质组学的分析结果,研究了hnRNP A1和PEDVN蛋白的互作关系,为揭示PEDV的复制过程提供参考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并阐明了其抗病毒机理,为PEDV的治疗和相关药物的开发提供了参考。主要研究内容如下:
  1.PEDV强毒株及其致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学分析
  本研究使用iTRAQ定量蛋白质技术结合液相二级质谱技术(LC-MS/MS),研究了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学变化。在强毒株YN13株感染组和弱毒YN144感染组分别鉴定到269和301个差异表达蛋白。生物信息学分析发现,差异蛋白主要涉及应激反应,信号转导和免疫反应等过程。进一步分析发现,PEDV感染可以导致多种干扰素刺激基因的上调表达,表明PEDV感染会诱导宿主的先天性免疫过程。通过对比分析两感染组的蛋白,发现许多热激蛋白家族成员和一些转录翻译相关因子在两组中呈现不同的表达情况,提示这可能是造成两毒株致病性差异的因素。
  2.核不均一蛋白A1(hnRNP A1)参与PEDV的复制过程
  根据蛋白质组学结果,发现hnRNP A1在两病毒感染组表现为不同的表达情况,提示该蛋白的变化可能会造成病毒致病力的变化。首先研究了该蛋白在细胞中定位情况,通过共聚焦试验发现该蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位,表明两者之间存在互作关系。使用免疫共沉淀技术,进一步确认了两者之间的互作关系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位区主要位于核周,而核周是冠状病毒复制转录复合体存在的位置,提示hnRNP A1可能参与了该复合体的组成,进而参与了PEDV的复制过程。为了验证hnRNP A1是否参与了PEDV的复制过程,通过siRNA沉默hnRNP A1的表达,而后使用不同PEDV毒株感染。通过间接免疫荧光试验、荧光定量RT-PCR和Western blot试验发现hnRNP A1沉默后,PEDV的基因组、PEDV感染的细胞数量以及PEDV N蛋白的表达量都显著减少,说明hnRNP A1参与了PEDV的复制过程。结合蛋白质组学结果,推测hnRNP A1在YN144感染组的下调表达是造成两病毒毒力差异的原因之一。
  3.槲皮素抗PEDV研究
  通过间接免疫荧光和Western blot试验,发现槲皮素可以有效抑制PEDV的感染过程。首先研究了槲皮素对PEDV吸附和入侵过程的影响,发现其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero细胞,表明槲皮素抗PEDV的作用发生在病毒入侵宿主细胞之后。由于槲皮素是一种很好的HSPA1抑制剂,其可能通过抑制HSPA1发挥抗PEDV效果。为验证此设想,使用siRNA沉默HSPA1的表达,然后再感染PEDV,通过荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot试验发现PEDV的感染过程并未受到影响。表明槲皮素的抗病毒效果并不依赖其HSPA1抑制剂的活性。通过Docking分析,发现槲皮素可以结合于PEDV3C样蛋白酶的活性位点,表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表达纯化了PEDV的3C样蛋白酶,通过表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)验证了两者可以发生互作。为验证槲皮素是否可以抑制PEDV3C样蛋白酶的活性,建立了一种荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法,通过该方法发现纯化的蛋白具有很好的酶活性,在酶反应体系中加入槲皮素,发现PEDV3C样蛋白酶的活性受到显著抑制,而且抑制效果呈剂量依赖性。因此,认为槲皮素可以通过抑制PEDV3C样蛋白酶的活性而发挥抗PEDV效果。
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