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[硕士论文] 刘越
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是世界范围内广泛种植的重要园艺作物,在早春露地栽培以及反季节设施栽培中常常遭遇低温胁迫。研究西瓜在低温胁迫下的基因表达模式,鉴定差异表达基因的功能,有助于进一步了解西瓜低温响应及调控机制,为西瓜耐低温遗传改良提供理论支撑和基因资源。WRKY转录因子家族成员数量多且具有重要功能,不仅影响植物生长发育过程,还能够对植物面临的各种胁迫产生响应并发挥调控作用。低温胁迫下的西瓜转录组数据分析结果显示,多个WRKY家族基因的表达模式发生了显著改变,表明WRKY能够响应低温胁迫,但这些基因是否具有调控西瓜耐低温的功能,目前尚不清楚。针对这一问题,本研究在分析西瓜WRKY基因家族特征的基础上,鉴定了2个受低温胁迫诱导显著上调表达的WRKY基因Cla018059和Cla021170的功能,获得了以下研究结果:
  1.西瓜WRKY转录因子家族鉴定和特征分析。利用隐马尔可夫模型,在西瓜基因组上鉴定出57个WRKY转录因子家族成员,根据家族成员在染色体上的位置,依次命名为ClWRKY1~ClWRKY57。蛋白序列比对及系统发生分析表明,57个ClWRKY转录因子中,55个具有保守的7肽WRKYGQK DNA结合结构域,另外2个的WRKY结构域分别为WRKYGKK和KSRKRQV;所有ClWRKY转录因子的锌指结构为C2H2或C2HC类型。根据结构域的数量和锌指结构的类型,ClWRKY家族被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ族,各有11、39和7个成员。根据蛋白序列的保守性和进化关系,Ⅱ族可进一步分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe族。基因结构分析表明,ClWRKY基因序列长度在0.7kb~7kb之间,主要集中在1kb~3kb。ClWRKY家族成员的外显子含量为2~6个。共线性分析表明,ClWRKY转录因子家族基因中发生了18组复制事件,其中3组是转座复制,15组是片段复制,片段复制是ClWRKY家族基因扩增的主要模式。复制基因的Ka/Ks值均小于1,发生复制的ClWRKY家族基因在进化过程中受到纯化选择。
  2.西瓜ClWRKY转录因子家族基因的表达谱分析。西瓜果实发育转录组数据分析表明,除ClWRKY1外,其余56个ClWRKY基因在果实中均有表达,其中50个在果肉中表达,52个在果皮中表达,54个在种子中表达。低温胁迫处理的西瓜转录组数据分析表明,19个ClWRKY基因受低温胁迫诱导呈现显著差异表达,其中7个下调表达,12个上调表达。显著上调表达的基因中,Cla018059(ClWRKY55)和Cla021170(ClWRKY20)的log2FC值最大,表明其对低温胁迫更敏感。因此本课题对这2个基因进行了进一步的研究。
  3.低温相关西瓜ClWRKY基因的功能鉴定。构建了亚细胞定位表达载体pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY20和pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY55并注射到烟草表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜发现ClWRKY20和ClWRKY55均定位于细胞核。构建了ClWRKY20和ClWRKY55的T1代超表达烟草植株OE20和OE55。对转基因植株进行4℃低温处理,通过对表型、冷害指数、相对电导率及丙二醛含量等指标的分析发现,超表达ClWRKY20基因提高了烟草植株的低温耐受性,而超表达ClWRKY55基因增强了烟草植株对低温的敏感性。抗氧化酶系统活性的检测表明,低温胁迫处理后的OE20植株具有更高的SOD、POD和CAT活性,表明ClWRKY20可能是通过提高植株的抗氧化能力来提高低温耐受性。OE55植株的SOD、POD和CAT活性均低于野生型植株,表明ClWRKY55可能通过削弱抗氧化能力来降低植株的低温耐受性。
[硕士论文] 高菲
环境科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:硒是人体的必需营养元素,农产品硒含量的增加对于人体健康水平的提高以及特定疾病的预防具有重要意义。本项目采用大田区组试验,分别研究外源硒肥对西瓜、罗汉果和砂糖桔果实硒和镉含量以及其它品质指标的影响,旨在为开展优质高效富硒降镉瓜果的生产提供参考和理论依据。主要研究结果如下:
  1.研究了基施不同剂量硒肥(0.26、0.51、1.03kg/hm2)和不同时期(花期、坐果期)叶面喷施硒肥处理对西瓜硒含量和品质及抗氧化系统的影响,以探讨适宜的西瓜硒肥施用方式。结果表明,所有处理西瓜果肉硒含量为0.014~0.106mg/kg,均达到了湖北省果蔬富硒标准(硒含量>0.01mg/kg)。基施和花期喷施硒肥均提高了果肉中硒的含量,其中基施硒肥处理较对照组提高了63%~282%、花期喷施提高了9%,所有处理中基施0.26kg/hm2硒肥处理果肉硒含量最高。施用硒肥还显著提高了西瓜果肉可溶性糖的含量(P<0.05),且坐果期喷施显著高于基施和花期喷施处理。基施低剂量(0.26kg/hm2、0.51kg/hm2)的硒肥、以及叶面喷施硒肥均可以提高西瓜抗氧化的能力,显著降低叶片丙二醛含量。综合考虑,西瓜硒肥适用方式为基施亚硒酸钠0.26kg/hm2。
  2.研究了基施(G)、基施与叶面喷施混施(G+Y20)以及不同浓度叶面喷施(Y40+40、Y20+20、Y40)硒肥处理对罗汉果果实中硒、镉及其它营养元素的含量和分布,以及果肉维生素C含量的影响。结果表明,罗汉果中的硒主要分布在果肉和籽粒中,在果皮中分布较少。施用硒肥显著提高了罗汉果中硒的含量(P<0.05)、其含量是对照组的1.6~21.6倍,其中G、G+Y20、Y40三个处理罗汉果硒含量满足湖北省干果类富硒标准(硒含量在0.1~0.5mg/kg范围内)。所有处理罗汉果中的镉含量均满足湖北省水果及其制品的镉污染限量要求(镉含量<0.05mg/kg),且G、G+Y20、Y40处理进一步降低了罗汉果中镉的含量(P<0.05)。但是,外源硒肥的施加也显著降低了罗汉果中铁的含量、以及果肉中维生素C和可溶性糖的含量。
  3.研究了基施(G)和叶面喷施一次(Y40)和两次(Y20+20)砂糖桔果肉硒、镉、铁、锌含量及营养品质的影响。结果表明,施用硒肥有增加砂糖桔果肉中硒含量的趋势,但与对照组相比差异未达到显著水平(P>0.05)。施用硒肥降低了果肉中镉的含量,较对照组降低了29.6%~50.3%。施用硒肥对果肉中可溶性糖和可溶性固形物的含量无显著影响(P>0.05),但基施处理显著提高了果肉中铁、维生素C及可滴定酸度的含量(P<0.05)。
[硕士论文] SABA HAMEED
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai]是一种重要的经济作物。果实是西瓜的产品器官,决定着西瓜的经济价值。揭示西瓜果实发育过程中调控机制可以为西瓜遗传改良提供有价值的信息。热激转录因子(Hsfs)在植物发育过程中发挥着重要的调控作用。Hsfs是否参与西瓜果实发育的调控尚不清楚。针对这一问题,本课题在对西瓜Hsf家族基因进行全基因组鉴定的基础上,进一步分析了基因结构、系统发育关系、进化历史,以及在果实发育过程中的表达谱,获得了如下结果:
  1.在西瓜基因组中鉴定出24个ClHsfs基因,编码蛋白序列长度为192到782个氨基酸,其DNA结合结构域在西瓜、黄瓜和拟南芥等物种中具有高度的保守性。在寡聚化结构域中,Hsfs存在可变的连接子和HR-A/B区域。基于DNA结合结构域和寡聚化结构域之间的接头长度和插入HR-A/B区域的氨基酸残基数目不同,将ClHsfs分为3类,即A类(54.17%),B类(37.50%)和C类(8.33%)。
  2.ClHsfs基因在11个西瓜染色体上分布不均匀。4个ClHsf位于chr5和chr1上,3个位于chr10上,2个位于chr3、chr8、chr7、chr9和chr11上,1个分别位于chr2、chr4和chr6上。在西瓜中,有58.33%的Hsfs经历过复制事件。复制模型分析显示ClHsfs包含9个片段复制基因对和3转座复制基因对。ClHsfs中小规模的片断和转座复制在这个基因家族的适度扩张中发挥了关键的作用。选择压力分析表明,所有重复的ClHsfs基因主要受纯化选择的影响。ClHsfs基因复制的时间可以追溯到179-312百万年前。推测B类Hsfs是古代群体,发展为陆地植物后扩展到A类和C类群成员。
  3.利用转录组数据分析了ClHsf基因在西瓜果皮、果肉和种子中的表达。在果皮中,ClHsf-17(A2)在授粉后10天表达量最高。在白色-粉红色及红色肉果期,ClHsf-02(B1)和ClHsf-23(C1)在果肉中具有中丰度表达。ClHsf-24(A9)在种子成熟阶段表达量高。在ClHsf启动子序列中,Skn-1基序,GCN4基序和CAT-box出现的频率相对较高。
[硕士论文] 张祺恺
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是世界范围内重要的园艺作物,枯萎病和根腐病等土传病害是限制西瓜产业发展的瓶颈,采用嫁接可提高西瓜对土传病害的抗性。南瓜是适合西瓜嫁接的砧木材料,但目前对砧用南瓜的资源评价和利用研究尚不够深入。本课题对南瓜资源的耐旱性和根腐病抗性进行鉴定,以期筛选出优异的种质资源,为进一步砧木选育奠定基础。针对部分南瓜作为砧木嫁接后导致西瓜果实品质下降的问题,本课题选用对嫁接西瓜果实品质影响较小和较大的南瓜砧木材料,以西瓜自交系97103为接穗,以自嫁为对照,通过对果实膨大停止期和商品成熟期的果肉样品的转录组和代谢组进行分析,来研究不同砧木对嫁接西瓜果实品质形成的影响,获得的主要结果如下:
  1.对不同南瓜种质一叶一心时期的性状进行评价。以126份南瓜种质为材料,包括33份中国南瓜(C.moschata),93份印度南瓜(C.maxima)。以2份商业砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’作为对照,进行南瓜种质资源嫁接适宜时期(一叶一心时期)的性状调查与评价,发现27份材料下胚轴长度较商业砧木等同或更短;大部分南瓜种质资源材料都具有与商业砧木同等茎粗或大于商业砧木,仅有13份材料下胚轴茎粗较细;31份材料具有比对照商业砧木更大的子叶展开角度;9份材料具有与商业砧木相似的子叶叶绿素相对含量;18份材料具有与商业砧木类似大小的子叶长宽积。
  2.对不同南瓜种质资源的耐旱性进行评价。选用94份南瓜种质为材料,包括29份中国南瓜(C.moschata),63份印度南瓜(C.maxima),以及2份商业砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’,对材料进行耐旱性鉴定。幼苗3叶1心期时进行干旱处理,计算干旱胁迫指数、株高胁迫指数、茎粗胁迫指数和干物质胁迫指数,使用UPMGA法(非加权算数平均法)对所得结果进行聚类分析,将南瓜种质资源按耐旱等级分为6类。18份材料属于最耐旱材料;14份材料为次耐旱类材料;13份材料为较耐旱类材料;7份材料为最不耐旱材料;24份材料为次不耐旱类材料;18份材料为较不耐旱材料。
  3.对不同南瓜种质资源的根腐病抗性进行评价。选用45份南瓜种质资源为材料,包括25份中国南瓜(C.moschata),18份印度南瓜(C.maxima)和2份商业砧木‘青研1号’(C.maxima×C.moschata)和‘京欣砧4号’(C.maxima×C.moschata)。使用孢子悬浮液蘸根法对南瓜种质材料进行根腐病抗性鉴定,经过对病害的分级统计及病情指数计算,筛选出R7S11-4、R7S20、R7S82等19份高抗根腐病材料和R7S21-1、R7S28-2、R7S06等26份中抗根腐病材料。
  4.研究不同南瓜砧木对嫁接西瓜果实的影响。以10份南瓜材料为砧木与97103嫁接,筛选出2份对西瓜果实品质影响具有差异的材料。发现L12为砧木嫁接后对西瓜果实品质无显著影响,L9嫁接后显著降低西瓜果实可溶性固形物含量,嫁接组合L12/97103的西瓜果实中的果糖含量和葡萄糖含量显著高于嫁接组合L9/97103的西瓜果实,而苹果酸含量显著低于后者。
  5.研究L9和L12砧木在转录水平对西瓜果实品质的影响。南瓜砧木L9在转录水平影响了嫁接西瓜果实的柠檬酸代谢、果糖与甘露糖代谢和蔗糖与淀粉代谢途径,导致西瓜果实品质变差,而L12并未在以上途径对西瓜果实产生影响,所以对西瓜果实品质无影响。
  6.研究L9和L12砧木在代谢水平对西瓜果实品质的影响。南瓜砧木L9影响了西瓜果实果糖与甘露糖代谢与柠檬酸循环,导致西瓜果实品质变差,而L12在代谢水平仅在柠檬酸代谢上对西瓜果实产生影响,所以对西瓜果实品质无显著影响。
[硕士论文] 陈晨
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:以钾低效基因型西瓜早佳(ZJ),钾高效基因型西瓜勇士(YS)为材料,通过构建不同嫁接组合以及外源施用生长素类似物(NAA)、生长素极性运输抑制剂(NPA和TIBA),以正常钾(3mM)为对照,对低钾(0.01mM)条件下三方面进行了研究:(a)ZJ和YS根系构型差异及生长素相关转运基因的表达特点;(b)不同西瓜接穗对砧木根系钾吸收和生长素含量的影响;(c)外源生长素及抑制剂对ZJ和YS钾吸收的影响。研究结果如下:
  1.研究了低钾对西瓜根系构型特点、以及钾吸收和生长素转运基因的影响,结果表明,在受到低钾处理12d后,ZJ和YS幼苗均受到抑制,但YS受到的抑制程度相对较轻。ZJ和YS在低钾下根系和叶片的钾含量比对照均下降,ZJ根系及叶片的钾含量下降幅度大于YS,高亲和钾吸收基因Cla012760(HAK5)在YS中的表达量相对于对照上调幅度更大,生长素转运基因Cla017975(AUX1)、Cla018455(PIN1)等在YS植株根系内的相对表达量更高,暗示了生长素可能在西瓜钾吸收中发挥作用。
  2.研究了不同接穗对西瓜幼苗生长、钾吸收和生长素含量及转运基因表达量的影响,结果表明,耐低钾西瓜YS作为接穗提高了低钾敏感西瓜ZJ在低钾下的适应能力,与Z/Z自嫁相比,Y/Z西瓜幼苗的根系总长、根系体积、根系表面积以及根尖数量均有所增加,叶片和根系的组织钾含量也显著提高,低钾下根系和叶片生长素的含量均显著增加,相关基因Cla012760(HAK5),Cla017975(AUX1),Cla018455(PIN1),Cla01887(PIN2)的相对表达量显著提高,表明植株对低钾的耐受型与其地上部分通过生长素调控钾的吸收存在联系。
  3.研究了外源生长素类似物NAA、生长素运输抑制剂NPA和TIBA对ZJ、YS根系生长及钾吸收能力的影响,结果表明,正常钾条件下,NAA能够提高ZJ和YS根系及叶片钾含量,但在低钾条件下对ZJ和YS的影响存在差异,从根系构型和基因表达的结果看,YS对外源NAA更为敏感,可能与本身内部已经具有较高的生长素含量有关。抑制剂NPA、TIBA对正常和低钾下ZJ和YS生长存在抑制作用,NPA和TIBA处理同时提高了低钾下ZJ和YS的根系钾含量,降低了叶片钾含量。
  本研究结果表明,嫁接西瓜接穗能通过生长素调控砧木根系生长和钾吸收,但是详细的作用机制还需要进一步研究。
[硕士论文] 鲍牧兰
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:ERF(ethylene responsive factor)与乙烯信号转导相关,是一类位于信号途径下游的转录因子,可参与逆境应答、植物生长发育和果实的成熟。ERF转录因子属于AP2/EREBP家族中的EREBP亚族,包含一个AP2/ERF结合域。在甜瓜(Cucumis meloL.)中已经克隆得到若干ERF转录因子基因,但与甜瓜果实成熟相关研究报道较少。甜瓜属于葫芦科甜瓜属,果实具有丰富的营养,因此,深入研究与甜瓜果实成熟相关的ERF转录因子功能已经成为必要。本研究根据甜瓜数据库序列分别克隆得到三个ERF转录因子CmERFⅢ-12、CmERFⅢ-14、CmERFⅤ-2基因,分别编码275、148、391个氨基酸,利用生物信息学软件进行蛋白理化性质、磷酸化位点、信号肽结构、跨膜结构等相关性质预测。结果表明三个转录因子都具有亲水性,有不同的磷酸化位点,不属于分泌型蛋白,不具有跨膜结构,也不属于膜蛋白;亚细胞定位预测显示CmERFⅤ-2和CmERFⅢ-14很可能定位于细胞核,CmERFⅢ-12在细胞质内分布较多,因此三个转录因子可能分别在细胞核和细胞质内发挥着调控作用。为研究其初步功能,构建CmERFⅢ-12、CmERFⅢ-14、CmERFⅤ-2基因超表达载体和RNAi干扰载体,利用农杆菌注射法在甜瓜果实中进行瞬时表达,通过实时定量PCR分别检测转化部位三个基因的表达特性和果实成熟相关基因的相对表达量。结果显示,注射CmERFⅢ-14基因超表达载体部位果皮颜色出现提前变黄表型,注射干扰载体部位仍保持绿色;注射CmERFⅤ-2基因超表达部位果皮颜色保持绿色,注射干扰载体部位出现变黄表型;分别注射CmERFⅢ-12基因超表达与干扰载体部位的果皮颜色表型不明显。注射组织实时定量PCR检测结果显示:CmERFⅢ-14基因的过表达和干扰处理分别会激活和抑制果实成熟相关ACS4、EXP1、PSY1基因的表达。CmERFⅤ-2基因的过表达能抑制EXP1基因的表达。结合表型结果,CmERFⅤ-2基因可能推迟果实的成熟而CmERFⅢ-14基因会促进果实的成熟,CmERFⅢ-12基因则对果实成熟的影响不大。构建携带有果实特异表达E8基因启动子的报告载体pPZP-E8-GUS,以分别携带目的基因超表达载体为效应载体,通过叶片注射法共转化本氏烟草(Nicotiana benthamiana),根据GUS活性变化,CmERFⅢ-12、CmERFⅢ-14转录因子基因能够激活果实特异性E8启动子促进基因的表达而增加GUS酶的相对活性,而CmERFⅤ-2则倾向于抑制E8启动子降低GUS基因的表达而影响酶的相对活性。
[硕士论文] 金乌云
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:甜瓜(Cucumis melo L.)属于葫芦科,是全世界广泛栽培的水果作物,具有重要的经济价值。甜瓜丰富的种质资源以及2012年甜瓜全基因组测序的完成,使得甜瓜成为除番茄之外的另一种研究果实发育成熟的模式植物。乙烯对呼吸跃变型果实的成熟起到重要的调控作用,ACC氧化酶(ACO)是乙烯生物合成途径中的最后一个限速酶。本研究对甜瓜ACO基因家族进行了全基因组分析,根据甜瓜转录组测序数据结果选择候选基因,进行克隆并构建基因的超表达和CRISPR/Cas9编辑载体,通过子房注射法转化甜瓜。主要研究结果如下:
  1)本研究从甜瓜全基因组鉴定得到了9个ACO基因,分别命名为CmACO1-CmACO9,其中CmACO2基因存在可变剪接现象,可编码3种mRNA。甜瓜ACO基因家族分为2个亚家族,9个ACO蛋白序列同源性为19.95%-75.54%,同组蛋白氨基酸序列同源性均在40%以上,组间蛋白的同源性仅为20%左右。甜瓜ACO基因家族与其他物种ACO基因的系统发育分析结果显示,CmACO1与CsACO3、CmACO3与CsACO2、CmACO6与CsACO1同源性最高。
  2)根据两个不同时期甜瓜中果肉样品转录组测序数据,选取2个上调的差异表达基因进行qPCR检测,qPCR检测结果与转录组测序结果基本一致,均在成熟期表达量上升,选定CmACO7、CmACO8作为候选基因。
  3)从甜瓜中克隆得到了CmACO7、CmACO8基因cDNA,长度分别为1191bp、1131bp,分别编码396、376个氨基酸,对两个蛋白进行生物信息学分析,结果表明两个蛋白的结构域包括DIOX_N和20G-Fe_ⅡOxy,均为亲水蛋白;无信号肽,均为非分泌蛋白;无跨膜结构,均不属于跨膜蛋白。
  4)成功构建了CmACO7、CmACO8基因的超表达载体pPZP221-CmACO7、pPZP221-CmACO8和编辑载体pCRI-CmACO7、pCRI-CmACO8并通过子房注射法转化甜瓜,对T1代植株胚根进行PCR检测,阳性率分别为21.5%、20.8%、10.5%、12.3%。
[硕士论文] 李星岩
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:甜瓜是一种在世界广泛种植的经济作物,研究甜瓜果实发育过程的生物学机制与相关基因,对于人们加强对甜瓜以及其他作物果实发育的理解具有重要意义,进一步为果实的贮藏保鲜、品质改良等提供了思路与理论依据。
  本研究利用转录组测序与生物信息学技术,针对果实发育前后的两个时期,对转反义ACO基因的M9品系河套蜜瓜(Cucumis meloL.cv Hetao)与原种河套蜜瓜进行了转录组测序和较全面的比较,以找出转反义ACO基因与乙烯对甜瓜果实发育的影响。本研究对甜瓜乙烯合成转录调控与信号通路中的5个关键基因家族CmCTR、CmEIN2、CmHB、CmETR、CmRIN进行了全基因组范围的生物信息学鉴定,分别鉴定出了20、6、17、3、21个家族成员。分析其与CmEIN3/EILs共6个基因家族在M9与原种河套蜜瓜转录组中的表达情况,结果显示多数基因家族在此过程中的表达情况复杂,CmEIN3/EILs家族在两个品系的样本中整体受到上调,CmETR则相反。本研究统计了M9与原种河套蜜瓜转录组的GO富集情况,绘制了相应的GO有向无循环图,使用AmiGO1.8对以上GO富集信息进行分析,发现M9品系在有机酸及羧酸代谢、细胞器及组分的组织与合成代谢、光合系统、与其他有机体的互作、脱羧反应的氧化还原酶活性、核苷酸三磷酸酶活性方面的GO富集比例明显大于原种,而原种在蛋白质位置信息相关GO的富集比例和绝对数量都明显大于M9品系。最后基于转录组Log2Foldchange值,利用R语言等工具筛选基因,进一步选取了9个基因,为后续的研究提供了资料与依据。
[硕士论文] 李青梅
土壤学 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:巨大芽孢杆菌作为农用微生物菌剂的主要有效菌,能够调节土壤中的养分元素,促进作物生长,提高作物产量,改善产品品质;生根粉作为植物生长调节物质,能够促进细胞分裂,提高植株根系活力。关于巨大芽孢杆菌菌剂、生根粉对农作物的应用效果虽然有相关报道,但是两者对土壤的施用效果、对甜瓜生长及生理代谢的报道尚缺少系统研究。本试验以巨大芽孢杆菌菌剂和生根粉为材料,研究二者单施或混施对甜瓜生长、产量和品质及土壤养分、土壤酶活性及土壤微生物数量的综合效应,得到如下结果:
  1.添加50~100mg/L生根粉后,保存180d巨大芽孢杆菌存活率与不加生根粉相比提高0.4~7.0倍。
  2.生根粉处理以及巨大芽孢杆菌和生根粉混合处理后甜瓜种子发芽势、发芽率、发芽指数分别比对照高36.17%、18.18%、43.33%和25.53%、9.09%、6.89%。巨大芽孢杆菌菌剂处理甜瓜幼苗地上部干重高于对照25.96%,生根粉处理甜瓜植株地下部干重高于对照12.57%。
  3.单独使用巨大芽孢杆菌菌剂、生根粉以及二者混合应用后,大棚甜瓜苗期株高和叶片数分别高于对照25.86%、10.14%、14.55%和4.55%、10.64%、6.09%;植株叶片净光合速率、叶片气孔导度和蒸腾速率分别高于59.88%、39.92%、45.29%,39.39%、60.61%、57.58%和42.71%、46.18%、39.76%;植株全磷、全钾及全氮含量分别高于对照12.27%、16.61%、4.33%,6.68%、11.38%、17.91%和8.33%、7.81%、15.10%;果实可溶性蛋白质和维生素C含量分别高于对照21.09%、25.00%、35.94%和24.86%、3.78%、70.27%,巨大芽孢杆菌菌剂处理甜瓜果实可溶性糖含量高于对照13.96%;产量分别高于对照31.53%、6.96%、11.12%,效益提高0.32~1.79万元/hm2。
  4.单独使用巨大芽孢杆菌菌剂、生根粉以及二者混合应用后,土壤中速效磷和速效钾含量分别高于对照24.09%、15.88%、25.21%和27.43%、5.18%、2.13%,土壤pH值分别比对照低0.24、0.30、0.21。
  5.单独使用巨大芽孢杆菌菌剂、生根粉以及二者混合应用后,土壤中碱性磷酸酶活性分别高于对照42.86%、34.29%、36.19%,过氧化氢酶活性分别高于对照20.18%、19.30%、17.54%,脲酶活性分别高于对照42.86%、33.33%、50.00%。单独使用巨大芽孢杆菌菌剂、生根粉后,土壤巾细菌数量增加,巨大芽孢杆菌菌剂和生根粉混合使用后土壤中放线菌数量增加,各处理真菌数量减少。
  综上,在6个月内添加生根粉浓度为50~100mg/L时巨大芽孢杆菌存活率提高0.4~7.0倍。巨大芽孢杆菌菌剂用量为37.5L/hm2,生根粉用量300g/hm2,二者单独使用或混合使用后,减缓了由于长期过量施肥造成的土壤pH过高现象,土壤中碱性磷酸酶、过氧化氢酶、脲酶活性提高,土壤中有益微生物数量增加,真菌数量减少,减少了甜瓜各生育期植株的发病率,在酶和有益微生物的作用下,土壤中速效磷、速效钾含量有所增加,从而增加了植株中磷、钾的含量,提高植株的生理代谢,从而促进植株的生长发育,改善果实品质,提高果实产量,提高甜瓜效益。
[硕士论文] 矫士琦
园艺学;蔬菜学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科作物,其果实相关性状一直受到育种工作者们的关注。近年来,越来越多的人致力于提高果实产量和改良果实品质。种子性状决定甜瓜的初期的萌芽和生长生硬能力,是保证甜瓜良好生长密不可分的一部分。为了探讨甜瓜果实和种子性状的遗传规律并进行QTL分析,本研究利用具有显著农艺性状差异的美国厚皮甜瓜品系ms-5和中国薄皮甜瓜品系HM-1为亲本构建F2∶3群体,采用基于高通量测序开发的全基因组多态性CAPS分子标记构建甜瓜遗传连锁图谱,结合田间表型数据对甜瓜果实、种子等相关性状进行遗传分析和QTL定位,并对相关QTL位点进行候选基因预测,结果如下:
  甜瓜果实相关性状包括单果重、果实长度、果实宽度、果形指数及果肉厚度,均符合正态分布,表明为数量性状,同时果实长度、果实宽度、果形指数三者之间均为极显著相关。甜瓜种子相关性状种子百粒重、长度和宽度,三者两两之间均呈极显著相关,且田间性状调查符合正态分布,为数量性状。
  本研究以高通量测序技术开发CAPS分子标记,在甜瓜12条染色体上均匀选取酶切位点设计引物,共设计523对引物,对所设计的引物进行多态性验证,结果表明,有170对引物具有多态性,多态率为32.5%。利用F2群体植株个体DNA,构建一张包含159个CAPS标记、12个连锁群(分别对应于甜瓜12条染色体)的甜瓜遗传连锁图谱,覆盖基因组长度1771.53 cM,标记间平均遗传距离11.35 cM,其中第9号染色体标记数量最多,共29个。各个标记在遗传连锁图谱上的分布与理论上开发CAPS标记的位置基本一致。
  共检测到与果实性状相关QTL位点18个,LOD值介于2.82-18.78,可解释2.68%-79.40%表型变异率。与单果重相关的QTL位点4个,分别位于第2、6、8号染色体上;果实长度有关QTL位点1个,位于第2号染色体上;果实宽度有关位点3个,位于第6、7号染色体上;果形指数相关QTL位点7个,分别位于2、6、7号染色体上;果肉厚度有关QTL位点3个,位于第2、7号染色体上。共检测到与种子相关性状有关QTL位点7个,LOD值介于3.60-8.66,可解释8.07%-19.53%的表型变异。与种子百粒重相关QTL位点2个,均位于第6号染色体上;与果实长度有关QTL位点4个,位于第5、9、11号染色体上。与果实宽度有关QTL位点1个,位于第11号QTL位点。
  果形指数QTL位点FS6.1位于B0610和E0623两个标记之间,两标记间遗传距离为0.27 cM,LOD值为6.14,解释5.72%表型变异率,通过基因序列比对QTL FS6.1位于甜瓜基因组scaffold00027上,基因注释结果发现,该区域有26个候选基因。
[硕士论文] 叶伟震
园艺学;蔬菜学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:甜瓜(Cucumis melo L.2n=24)作为葫芦科作物之一,是人们日常生活常用的水果之一,甜瓜果肉含有很多营养物质且药用价值很高。种子是植物繁殖后代,延续遗传物质的载体,是物种延续不可或缺的组成部分,种子的大小关系到营养物质的储存以及种子的萌发,因此,研究及定位控制甜瓜种子相关性状的基因,对甜瓜遗传育种及其种子相关生物学研究具有重要意义。染色体片段置换系具有遗传背景纯合、能够稳定遗传、QTL分析及定位准确等优点,是作物QTL及品种选育的理想材料。
  本研究的内容主要分为两个部分,一方面结合分子标记辅助选择,利用回交群体进行染色体片段置换系的初步构建,主要内容为:以厚皮抗病甜瓜品种MR-1为母本材料,以普通栽培薄皮甜瓜品种M1-15为父本材料,通过杂交获得F1代单株,以MR-1为轮回亲本,进行了两代回交分别获得了BC1P1和BC2P1代群体,结合MAS技术,利用对父母本全基因组重测序的数据设计开发CAPS分子标记然后对每代回交群体进行分子标记辅助选择,构建染色体片段置换系。另一方面,利用BC1P1代群体的基因组和种子的相关性状构建遗传连锁图谱并对甜瓜种子长度、宽度、百粒重以及种腔宽度等性状进行了QTL分析。从而为培育甜瓜优良品种及分子辅助育种提供更理想的育种材料。主要研究结果如下:
  以高通量测序技术为基础,在两亲本间共开发出600对CAPS引物,经引物筛选后共获得具有多态性的CAPS标记240对,多态率为40%,利用240对分子标记,以及三个群体(包含两个BC1P1群体和一个BC2P1群体)构建了3张不同的图谱,分别包含197,209和180对分子标记覆盖基因组长度分别为2231.09cM、1829.55cM和1264.70cM。
  通过对两个回交世代染色体片段置换系初步构建的结果统计观察与分析,得出BC1P1群体和BC2P1群体中母本条带和杂合条带的数量基本符合1∶1和3∶1的比例,并计算出两个回交世代中各单株的导入率,分别为接近于25%和12.5%。对GGT2.0软件计算结果进行统计,得到在两个回交世代中均有初步建成的单片段置换系,数量分别为54和190。
  对BC1P1群体的种子长度、宽度、百粒重及种腔宽度进行QTL分析,共获得6个QTL位点,分布于1、2、5、8号染色体上,其中1号染色体M1-14和M1-16两个标记之间同时存在分别和种子长度及种子百粒重相关的两个QTL位点;与种子宽度、种子长度相关的两个QTL位点均位于5号染色体上M5-16与M5-17两标记之间;种腔宽度共获得两个QTL位点位于2号以及8号染色体上。四个性状的定位距离分别为1.19cM、1.12cM、1.12cM、2.39cM、4.20cM、2.59cM,贡献率均在9.86%-13.52%之间。
[硕士论文] 曹蕾
蔬菜学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是重要的葫芦科作物,具有较高的经济价值。西瓜是典型的喜温作物,在早春和反季节设施栽培过程中,常受到低温胁迫而影响产量和经济效益。低温已成为西瓜生产中主要的非生物限制因子,严重制约西瓜的周年供应和种植效益提高。MYB转录因子在植物应答外界胁迫环境中起着重要作用,参与调控下游多个基因的表达。本课题前期研究中,通过挖掘低温胁迫下西瓜转录组数据发现多个基因参与低温逆境响应。进一步分析得出,Cla005622的表达量显著上调,且属于MYB-related型转录因子,但其耐低温功能及相关调控作用尚未明确。为回答上述问题,本研究拟采用如下方法解决:对MYB-related家族成员鉴定、分析Cla005622的结构特征、qRT-PCR鉴定Cla005622对西瓜低温胁迫的应答、亚细胞定位和转录活性鉴定Cla005622的特征、超量表达与烟草遗传转化后鉴定耐低温性功能验证、酵母双杂交探究蛋白互作及功能分析,旨在明确Cla005622对西瓜低温逆境的耐低温功能鉴定及调控作用,结果不仅可以解析西瓜的低温耐受性机制,同时还可为后续从分子育种角度改善西瓜低温抗性、提高西瓜产量与质量提供丰富的基因资源。本文的主要研究结果如下:
  1.Cla005622基因结构分析及西瓜MYB-related家族基因成员鉴定。使用NCBI预测Cla005622蛋白保守结构域得知,其属于典型的MYB-related基因。为进一步探索其在MYB-related家族基因中的特征,通过HMM算法在西瓜全基因组上共鉴定出50个MYB-related家族基因,编码序列长度240bp-4986bp,等电点4.8-9.97,分子量5890.67-181178.4。据基因在染色体上的分布顺序命名为ClMYB1-ClMYB50。Cla005622对应基因为ClMYB46,编码序列全长1040bp,编码334个氨基酸,等电点为6.70,分子量为35890.61,位于第10号染色体。
  2.ClMYB46对西瓜低温逆境的应答。以西瓜97103为实验材料,用qRT-PCR技术检测10℃低温处理西瓜叶片后6h、12h、24h、48h的基因表达量变化,变化趋势呈现先升高后降低再升高的过程。其中,6h点的表达量达到最高。因此,ClMYB46受低温胁迫诱导显著上调表达。
  3.ClMYB46的特征分析。亚细胞定位以本氏烟草为实验材料,构建载体GV3101[pH7LIC5.0-N-eGFP-ClMYB46]后瞬时表达,观测荧光信号位于细胞核。转录活性鉴定通过构建Y2HGold[pGBKT7-ClMYB46],激活HIS3、ADE2报告基因表达,具有转录活性。因此,ClMYB46表达部位在细胞核,且具有转录活性。
  4.ClMYB46的耐低温性功能鉴定。以野生栽培烟草为实验材料,构建载体LBA4404[pHellsgate8-ClMYB46]后进行烟草遗传转化,qRT-PCR检测ClMYB46表达量,筛选OE1、OE2株系进行后续实验。以野生型烟草WT、转基因株系OE1和OE2各75株为实验材料,4℃低温处理(光周期16h/8 h,光强100μmol m-2s-1)0h、6h、12h、24h、48h时间点观察并取样。表型观察、冷害指数测定均得出不同时间点下野生型株系萎蔫程度均高于转基因株系,过表达ClMYB46能提高烟草对低温逆境的抗性。使用试剂盒测定不同时间点下电导率和丙二醛含量变化得知野生型细胞膜受损伤更严重,过表达ClMYB46能提高烟草对低温逆境的抗性。
  以低温处理不同时间点下野生型烟草WT、转基因株系OE1和OE2为材料,qRT-PCR检测ABA信号转导途径相关基因(rab18、ABI1、ABI2)与冷胁迫相关基因(DREB转录因子DREB2A、脯氨酸合成促进基因P5CS)的表达量变化。ClMYB46上调引起rab18上调表达、ABH、ABI2下调表达、DREB2A、P5CS上调表达。
  5.ClMYB46互作蛋白筛选及点对点验证。重组构建无毒性的诱饵载体Y2HGold[pGBKT7-ClMYB46],AbA抑制其自激活后Mating法筛库鉴定并测序。初步筛选出10个有功能的互作蛋白,包含:维持细胞内环境离子平衡、盐胁迫响应、维持离子通道平衡、响应ABA信号转导途径、参与茉莉酸胁迫响应。其中,ClMYB46的互作蛋白Cla014285(AtCPK28)参与蛋白磷酸化途径、ABA信号转导途径、Ca2+信号转导途径从而引起植株对逆境胁迫的响应。
[硕士论文] 王鹏飞
园艺 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:西瓜是一种葫芦科,双子叶植物,原产地为非洲。西瓜是人们在夏季最常见的水果之一,味甜多汁,富含糖类、矿物盐、多种维生素、有益于心脑血管的氨基酸(瓜氨酸、精氨酸和谷胱甘肽)等营养成分外,还富含对人体有益的番茄红素。番茄红素可以预防肿瘤的发生、具有美颜护肤等多种保健功能。番茄红素β-环化酶基因(LCYB)可以将番茄红素环化为β-胡萝卜素;西瓜果肉颜色的形成受多个基因的共同调控,LCYB基因与西瓜果肉颜色形成的联系是一个值得探讨的课题。
  本试验拟对决定西瓜果肉颜色的LCYB基因开展功能研究,分析7个不同果肉颜色西瓜品种(红色、黄色、粉色、白色)中LCYB基因结构的差异,利用高效液相色谱法检测LCYB基因蛋白表达并测定这7个品种从坐果到成熟期间5个阶段的果肉组织中番茄红素的含量及运用荧光定量PCR技术(qPCR)检测LCYB基因的表达量,分别从基因水平、转录水平及蛋白水平上阐述LCYB基因与西瓜果肉颜色形成的关系。经过试验研究得到以下结论:
  7个不同果肉颜色西瓜材料LCYB基因序列间3个差异位点,分别是基因序列的第11、675和1305位碱基。在蛋白序列比对结果中发现2个SNP位点,分别位于第225及435位氨基酸。第225位SNP位点能明显区分出富含番茄红素的西瓜材料(红色果肉、粉色果肉)与其它果肉颜色西瓜材料的差异。
  7个西瓜试验材料在果实发育不同时期的色谱结果:白色果肉西瓜材料ZXG0000在HPLC结果中几乎检测不到色素;红色果肉西瓜ZXG55、ZXG79、ZXG1549和粉色果肉西瓜ZXG1452、ZXG1594中检测大量的番茄红素和微量β-胡萝卜素;而在黄色果肉西瓜ZXG77中检测出大量β-胡萝卜素。
  红色果肉西瓜材料ZXG55、ZXG79、ZXG1549,粉色果肉西瓜ZXG1452、ZXG1594中LCYB基因相对表达量差异不大,白色果肉西瓜ZXG0000中LCYB基因相对表达量差异较为显著;黄色果肉西瓜ZXG77在果实成熟LCYB基因相对表达量差异显著。LCYB基因在转录水平的调控可以影响番茄红素的积累,从而影响西瓜果肉颜色的形成。
  从酶活检测结果中白色果肉西瓜材料ZXG0000,红色果肉西瓜材料ZXG55、ZXG79、ZXG1549,粉色果肉西瓜ZXG1452、ZXG1594和黄色果肉西瓜材料ZXG77间LCYB基因蛋白表达水平上差异不显著。
[硕士论文] 侯艳
园艺学;蔬菜学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:甜瓜(Cucumis melo L.)是一种草本植物,隶属于葫芦科黄瓜属甜瓜亚属。甜瓜果实具有独特的香甜味,深受人民喜爱,现在育种专家们越加的关注甜瓜品质性状并对其进行深入研究。通过开发新的标记,将其用于甜瓜果实品质性状的基因定位,再进一步加密找到与其紧密相连的标记使其应用于甜瓜分子育种,这有助于甜瓜育种进程的加快。因此本试验以厚皮甜瓜MR-1和薄皮甜瓜M1-15为亲本得到170株BC1P1群体,利用基于双亲材料的基因组重测序数据开发的SNP-CAPS标记进行分子图谱的构建和对甜瓜主要果实性状的QTL分析,并根据分析结果,将其相关的标记进行有效性分析。结果如下:
  基于双亲基因组重测序数据设计578个SNP-CAPS标记,利用双亲及F1代DNA筛选出240个具有多态性的SNP-CAPS标记,多态率41.5%。以含有170株的BC1P1群体为作图群体,利用240个SNP-CAPS标记以及QTLIciMappingV3.3软件绘制了一张甜瓜分子遗传连锁图谱,其包括12个连锁群(分别对应甜瓜的12条染色体),200个SNP-CAPS标记。其覆盖甜瓜全基因组长度为1710.4cM,平均图距为8.6cM,这12个连锁群长度在111.66cM~183.53cM之间,其中10号连锁群长度是最小(111.66cM);则2号连锁群长度和平均距离是最大的,分别为183.53cM和10.80 cM;8号连锁群平均距离最小(6.63 cM);含标记数目最多的是6号连锁群(20个);10号连锁群则最少(11个)。
  对甜瓜主要果实性状采取QTL分析,共获得15个QTL位点,分布在1、2、4、5、6、7、8、9和11号连锁群上。其中,与果实长度相关的QTL4个,其加性效应均为正值,分别位于在第1、5、6和8号连锁群上,总贡献率为46.82%。与果实宽度相关的QTL1个,在8号连锁群上,贡献率为10.56%,加性效应显示为正值。与果型指数相关的QTL4个,其加性效应均为正值,在8号连锁群上存在1个主效QTL,贡献率为38.62%,且果实长度、果实宽度和果形指数定位的区域在第8连锁群上是相连的。与单果重相关的QTL5个,其贡献率均大于15%且加性效应均为负值;与可溶性固形物相关QTL1个,贡献率大于15%,为主效QTL,加性效应为负值。
  利用60份甜瓜材料对5个与单果重、果实长度、果实宽度和果型指数相连的标记进行有效性分析,标记M4-2和M11-18对单果重进行分子标记检测,分子数据与田间数据的符合率分别为67%和30%;利用标记M9-9-1对果形指数采取分子检测,分子鉴定和与田间数据的吻合率为48%;标记M8-14和M6-2对果实宽度和果实长度进行分子检测,其结果与田间表型鉴定的符合率分别为62%和63%。
[硕士论文] 焦妍妍
蔬菜学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:钾是植物生长发育必需的大量元素之一,占植物干重的2%-10%。世界农业生产中普遍存在土壤缺钾的问题。提高农作物本身对钾的吸收能力,是缓解钾素不足对作物生长发育带来不利影响的重要途径之一。西瓜是一种重要的园艺作物,在世界各地广为种植,生长发育和果实产量品质形成对钾需求量大,利用嫁接提高抗逆性是瓜类园艺作物的一个重要特点。本研究以课题组前期筛选出的钾高效基因型西瓜“勇士”和钾低效基因型西瓜“早佳8424”为实验材料,通过正常钾(6mM,对照)和低钾(0.01mM,胁迫)处理,旨在研究嫁接西瓜接穗对砧木钾吸收的反馈调控、响应低钾的microRNA和长距离运输的microRNA;低钾胁迫下钾高效吸收基因HAK5在西瓜根系表达量显著升高,所以对该基因进行功能鉴定。主要研究内容和结果如下:
  1.不同钾水平下接穗对砧木根系生长和生理的影响。通过对不同钾浓度下接穗对砧木根系生长、钾吸收能力、ABA和IAA内源激素的影响,发现嫁接西瓜接穗对砧木钾吸收存在反馈调控现象。钾高效基因型西瓜“勇士”作为接穗可以促进钾低效基因型西瓜“早佳8424”根系的生长、钾吸收能力、ABA和IAA内源激素水平;反之,以钾低效基因型西瓜“早佳8424”作为接穗降低钾高效基因型西瓜“勇士”根系的生长、钾吸收能力、ABA和IAA内源激素水平,这种反馈在低钾胁迫下表现得更明显。
  2.西瓜响应低钾的microRNA及可能长距离移动的microRNA筛选。通过RNA-Seq分析了钾高效基因型西瓜“勇士”和钾低效基因型西瓜“早佳8424”自根苗的根系和叶片中响应低钾的miRNA发现,钾高效基因型西瓜“勇士”叶片响应低钾的miRNA有miR156a、miR395a、miR395b;根系响应低钾的miRNA: miR396b、novel_24。钾低效基因型西瓜“早佳8424”叶片响应低钾的miRNA: miR162、miR172a、miR172d、miR172f、 miR395a、miR395b;根系响应低钾的miRNA: miR156a、miR167a、miR167c、miR167d、miR319c、miR396b、miR395b、miR395a。这些差异miRNA很可能是西瓜响应低钾的重要miRNA。与钾高效基因型西瓜“勇士”相比,钾低效基因型西瓜“早佳8424”在低钾胁迫下有更多的miRNA调控植物体的生长发育,其对低钾胁迫环境更敏感。在钾高效基因型西瓜“勇士”和钾低效基因型西瓜“早佳8424”响应低钾的miRNA基因及其对应的靶基因表达量分析中发现,miRNA156a和miRNA395b可能是嫁接西瓜接穗对砧木钾吸收长距离运输的microRNA。
  3.西瓜钾吸收重要基因HAK5的克隆及功能验证。本实验成功的将钾高效基因型西瓜“勇士”基因组中HAK5(Cla012760)钾吸收重要基因克隆出来,并转化到拟南芥T-DNA插入突变体Salk_130604中,通过转基因拟南芥恢复了突变体拟南芥植株表型及钾含量,证明了Cla012760是西瓜钾吸收重要基因。
  以上实验结果表明:嫁接西瓜接穗对砧木钾吸收存在反馈调控现象,钾高效基因型西瓜“勇士”作为接穗对西瓜嫁接苗的根系形态及生理参数具有促进作用;反之,钾低效基因型西瓜“早佳8424”作为接穗对西瓜嫁接苗的根系形态及生理参数具有抑制作用,这种促进作用和抑制作用在低钾胁迫下表现的更明显。西瓜受到低钾胁迫后miR156a、miR162、miR167a、miR167c、miR167d、miR172a、miR172d、miR172f、 miR319c、miR395a、miR395b、miR396b、novel_24发生变化,说明这些microRNA很可能参与了西瓜响应低钾的调控;从冠-根角度分析响应低钾的microRNA基因,从中筛选出了miRNA156a和miRNA395b可能是嫁接西瓜接穗对砧木钾吸收长距离运输的microRNA。低钾胁迫后西瓜钾吸收重要基因HAK5(Cla012760)在根系中表达量显著升高,并通过转基因手段验证了该基因是西瓜钾吸收的重要基因。
[硕士论文] 周冬奇
蔬菜学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是我国重要的经济作物之一,但随着栽培面积的扩大,连作障碍日益成为西瓜产业的突出问题,而嫁接是克服连作障碍的重要手段。在生产上南瓜是西瓜的常用砧木,中国南瓜(Cucurbita moschata)和印度南瓜(Cucurbitamaxima)的种间、种内杂交种是砧木选育的主要方向,我国南瓜种质资源丰富,但目前选育的砧木品种相对较少,也存在嫁接不亲和、对西瓜品质有负面影响及适应栽培环境范围窄等问题。因而本课题充分利用课题组前期引进的南瓜种质资源,对其自交系进行嫁接西瓜适应性评价,再配制杂交组合,对杂交组合进行嫁接适应性评价,以期获得嫁接亲和性好、西瓜果实品质高的南瓜砧木杂交组合,为西瓜优良砧木新品种选育作出贡献。同时,还对课题组繁多的砧用南瓜资源进行耐盐、耐旱性进行鉴定,以期筛选到耐盐性强和耐旱性强的南瓜种质,为耐盐和耐盐的砧木选育奠定基础。本课题获得主要的结果如下:
  1.以19份南瓜种质资源包括16份自交系(9份中国南瓜(Cucurbita moschata)、7份印度南瓜(Cucurbita maxima))和3份杂交组合(2份中国南瓜种内杂交组合(C.moschata×C.moschata)、1份印度南瓜中国南瓜种间杂交组合(C.maxima×C.moschata))为砧木,并且以2份商业砧木品种‘青研1号’(C.maxima×C.moschata)和‘京欣砧4号’(C.moschata×C.moschata)作为对照南瓜砧木,将这些材料与西瓜‘早佳8424’嫁接,‘早佳8424’自根苗作为对照。通过测定南瓜砧木下胚轴长度直径和子叶长宽等苗期性状,比较嫁接成活率、田间存活率、植株生长势和叶绿素含量等指标,结合西瓜成熟果实的果型指数、果皮厚硬度、可溶性固形物含量和口感等指标,综合评价了不同南瓜自交系嫁接西瓜的适应性,从中选出中国南瓜Y8、Y13、L9、L22、L24、L25、L28、L29和印度南瓜Y20、Y26,这10份自交系可以作为配制杂交组合的亲本。
  2.对课题组前期选出的16份南瓜自交系,按照印度南瓜做母本、中国南瓜做父本和中国南瓜互为父母本的杂交原则,共得到101份杂交组合。其中在自交系嫁接试验中表现优秀的10份自交系作为亲本得到的杂交组合有47份,包括36份中国南瓜种内杂交组合和11份印度南瓜中国南瓜种间杂交组合。以47份南瓜杂交组合和5份南瓜自交系作为西瓜‘早佳8424’的砧木,商业砧木‘青研1号’‘京欣砧4号’作为对照砧木,‘早佳8424’自根苗作为对照。综合评价了52份南瓜材料的苗期性状、嫁接亲和性,及其对西瓜植株长势、果实品质和口感等的影响,从中选出了Y20×L25、L23×L6、L24×Y13、L24×L254个嫁接适应性好的杂交组合。
  3.以课题组前期扩繁杂交的94份砧用南瓜,包括11份中国南瓜、56份印度南瓜和27份中国南瓜种内杂交种作为试验材料,以商业南瓜砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’作为对照。在南瓜幼苗三叶一心时,50ml200 mM NaCl处理,14天后观察植株状况,根据盐害症状分级表,统计植株盐害级别和对应株数,计算盐害指数。以盐害指数35%、65%为节点,可以将94份南瓜砧木划分3类,第1类包括Y3、Y16-9、L1×L3等22份耐盐材料,第2类包括Y4、Y7-1、L1×L17等52份较耐盐材料,第3类包括Y15-1、Y20-1、L17×L6等20份不耐盐材料。
  4.以课题组前期扩繁杂交的74份砧用南瓜,包括14份中国南瓜、4份印度南瓜、11份印度南瓜中国南瓜种间杂交种和45份中国南瓜种内杂交种作为试验材料,以商业南瓜砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’作为对照。在植株三叶一心时干旱处理,7天后观察植株状况,根据旱害症状分级表,统计植株旱害级别和对应株数,计算干旱胁迫指数。再进行复水处理和干旱处理,7天后测量处理组和对照组植株株高、茎粗和干重,计算株高胁迫指数、茎粗胁迫指数、干物质胁迫指数。对所得数据用非加权算数平均法(UPMGA)聚类分析,结果表明可以将材料分为3类,第1类是耐旱的2份砧用南瓜;第2类是较耐旱的18份砧用南瓜;第3类是不耐旱的54份砧用南瓜。
[硕士论文] 孙小粉
园艺 河南农业大学 2017(学位年度)
摘要:甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科甜瓜属一年生蔓生作物,具有丰富的遗传多样性和表型多样性。中国甜瓜栽培面积是世界上最大且产量最高的国家,也是世界上栽培甜瓜历史最长的国家之一。表皮毛是由表皮细胞分化而来的表皮衍生结构,表皮细胞是研究植物细胞分化最好的模型,因此研究甜瓜表皮毛形成机制可以使植物细胞分化理论更加丰富。随着新一代高通量测序技术的发展和完善,以及分子生物学和生物信息学的不断交叉和深入发展,极大地加快了重要性状的图位克隆和功能分析研究进程。本文构建了厚皮甜瓜无毛材料M68和正常有毛材料M465的F2群体,利用分离群体分析法(BSA)初步定位了控制无毛性状的基因,并在亲本重测序的基础上进一步精细定位,然后对候选区段的基因预测和序列比较,最终克隆到控制甜瓜无毛性状的候选基因gl。同时通过RNA-seq转录组测序研究该基因的调控网络,为更进一步的研究gl基因的功能与作用机理打下了坚实的基础。具体结果如下:
  1、构建了1536单株M68×M465的F2群体,对苗期表皮毛的表型调查显示,有毛单株1156株,无毛单株380株,卡方检验后符合孟德尔遗传规律的分离比例(3∶1)(x2=0.5556<x2005=3.84),说明甜瓜无毛性状是由一对隐性单基因控制的,将其命名为gl。
  2、在F2群体中选择有毛植株和无毛植株各10株构建基因混池,然后选用480对SSR标记利用BSA法对两个亲本和混池进行筛选,共得到8个具有多态性的标记,并进一步选择256个F2单株作为初步作图群体,将基因初步定位在第8号染色体上,位于标记CmSSR19480与CmSSR19495之间,分别与gl基因相距0.93cM和0.01cM。
  3、对亲本M465和M68重测序,通过比较两亲本在候选区段的序列差异,寻找差异位点并开发了6个Indel标记和1个dCAPS标记,其中4个Indel标记在两个亲本和混池中具有多态性。随机选择438株F2单株,将gl基因定位在Indel1和Indel6之间,遗传距离分别与其相距0.3cM与0.1cM。进一步扩大F2群体至1536株进行精细定位,最终将gl基因定位在Indel2和Indel5之间11.58kb的范围内,对该区段进行ORF预测发现只有一候选基因,该基因DNA全长5367bp,CDS全长2166bp,编码一个含有721个氨基酸的蛋白,经BLAST比对显示它与黄瓜上已经克隆的无毛基因Csa6M514870同源性高达99%,均编码HD-ZIPⅣ蛋白。
  4、根据两个亲本的重测序在候选基因的序列对比显示,与正常材料序列相比,该基因在无毛材料中发生10个SNP位点突变,其中有4个位于外显子上,6个位于内含子上,且位于第4个外显子上发生SNP导致gl基因在突变体中转录翻译提前终止。
  5、根据20个F2有毛单株幼叶的混池(T01)和20个F2无毛单株幼叶的混池(T02)RNA-seq测序结果显示,共找到差异表达基因2368个,上调基因1195个,下调基因1173个。对发现的DGE进行GO、KEGG功能分析,结果表明,共富集8个通路,其中涉及新陈代谢通路中苯基丙氨酸,芳香族酪氨酸和色氨酸的数量最多,富集因子最高。GO功能分析,生物过程功能得到312个功能注释,比例最高,占63.3%。其中,相关新陈代谢过程注释基因数最多。
  6、根据两个BSR-seq混池之间的SNP差异进行的ED关联结果显示,该候选基因的定位区域位于1.98Mb到3.72Mb范围内,而通过图位克隆的方法将gl基因定位于甜瓜第8染色体上2.45Mb左右的位置,两种定位方法结果一致。
[硕士论文] 赵世豪
园艺 河南农业大学 2017(学位年度)
摘要:西瓜是世界上重要的水果型蔬菜之一,尤其在夏日水果中的地位不可替代。长期的人工驯化和杂交使西瓜育种材料日趋单调,育种材料亲缘关系太单一,造成育种工作很难取得突破。为了有效地利用西瓜种质资源,突破西瓜育种的资源瓶颈,需持续而深入地对西瓜种质资源进行收集和研究,特别是要对现有种质资源进行系统鉴定和评价。本研究以来自世界各地的167份西瓜种质资源为材料,利用形态学标记和SSR分子标记,结合多样性分析、聚类分析、主坐标分析和相关性分析等方法,对其遗传多样性进行了较全面的研究。主要结果如下:
  1.利用29个形态学性状来说明167份西瓜种质的遗传多样性:Shannon多样性指数的变化范围是0.54-2.03,平均值为1.50,其中质量性状平均值为1.16,数量性状为1.71,其中多样性指数最大的是种子长度(2.03),多样性指数最小的是表面光滑度(0.54);变异系数的变化范围是16.43%-90.73%,变异系数平均值为34.12%,其中边糖含量的变异系数最大(90.73%),最小的是子叶宽度(16.43%)。
  2.利用形态学标记所有种质划分为五个组群,亚洲材料主要集中于组群Ⅰ和Ⅴ,非洲材料主要集中于组群Ⅱ,北美洲材料主要集中于组群Ⅲ,组群Ⅳ是一个混合群,材料来源分散;主坐标分析的结果为,前三个主坐标的方差贡献率分别为16.24%、10.04%和8.29%,所有的种质材料分为4个区域,与聚类分析结果基本一致。
  3.利用22对SSR分子标记检测167份西瓜种质材料的基因型,获得107个多态性位点,单个引物检测到2-8个等位基因,平均每对引物扩增出4.86个等位基因,多样性指数变幅是0.54-1.61,平均值为0.94;期望杂合度(He)在0.27和0.77之间,平均0.52。多态性信息含量(PIC)在0.25和0.73之间,平均值为0.45。
  4.在SSR分子标记群体结构分析中,将167份西瓜种质材料分为4个群体,P1类群含有13份种质(7.78%);P2类群包含64份种质(38.32%),P3类群含有73份种质(43.71%),P4类群包含17份种质(10.18%)。对所有材料的Q值进行分析,127份(76.05%)材料的Q值大于0.80,40份材料的Q值介于0.49和0.80之间。
  5.利用分子标记对167份西瓜种质材料进行聚类分析,结果分为4个类群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),其中,种质1和55分别聚为一类,第Ⅱ类群共148份材料,第Ⅳ类群共17份材料。主坐标分析发现所有材料可以分为2个大区域,对应聚类的2大类。第一个区域的材料可以分为3个小区域,加上第2大区域,共4个区域,和Structure群落结果高度一致。与聚类结果基本一致。
  6.Mantel检验两种标记的聚类分析结果,形态学标记与SSR分子标记的相关系数r为0.43,即在本实验中两种标记聚类结果的一致性相对较低。
[博士论文] 杨永超
蔬菜学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:干旱是影响作物产量和品质的重要环境因子之一。我国干旱和半干旱区域约占国土面积的50%。而在湿润的地区也会遭受到季节性和周期性的干旱。在解决干旱问题的方法中,培育抗旱耐旱新品种是重要的手段之一。而抗旱耐旱新品种的培育就要求我们了解作物对干旱胁迫的响应和调控机制。根系在植物吸收水分、营养物质及感受水胁迫信号中发挥重要作用,同时也是受干旱影响最大的器官,故了解根系对干旱胁迫的响应和应对具有重要意义。西瓜[Citrullus lanatus(Thumb.) Matsum.& Nakai.]是一种重要的水果型经济园艺作物,其栽培面积占世界蔬菜栽培面积的7%。西瓜整个生长期需要大量水分,季节性干旱及频繁发生的自然干旱严重影响了西瓜的产量、品质,甚至整个西瓜产业的发展。M08是一个经鉴定较为抗旱的西瓜自交系。本研究以M08根系为材料,用20% PEG模拟干旱胁迫,采用Illumina Hiseq2500平台对胁迫后的根系进行转录组、miRNA及降解组测序和分析,其结果为了解西瓜根系响应、应对渗透胁迫机制和西瓜抗旱耐旱遗传改良提供了基础信息。同时对脯氨酸合成相关酶的活性及编码基因表达模式进行了研究,明确了脯氨酸的长距离运输方式,并将脯氨酸合成限速酶P5CS转拟南芥进行了功能验证。本研究主要结果如下:
  (1)采用Illumina Hiseq2500平台对20% PEG胁迫6h的根系及对照进行转录组测序,共得到了32.99 Gb数据,超过40M条长125bp的pair-end reads。有5246个差异表达基因,其中2753上调表达,2493下调表达。在差异表达基因中有5175个基因获得注释。GO分析结果显示这些差异表达基因涉及到了信号传递、渗透调节、活性氧清除、转录因子、植物激素、蛋白合成和细胞分裂等过程。在KEGG分析中,825个差异表达基因可分到108个不同的通路中。核糖体、植物激素信号、植物-病原体互作、嘌呤代谢及淀粉和糖代谢等通路中包含了大部分差异表达基因,其中核糖体途径被显著改变。
  (2)采用Illumina Hiseq2500测序平台对西瓜根系PEG胁迫后其miRNA水平上的响应进行了研究,同时利用生物信息学预测和降解组测序的方法对测序得到的miRNA的靶基因进行了预测。在对照文库S01、S02、S03和胁迫处理文库S04、S05 S06文库中分别得到了14,662,351、14,263,084、15,767,557、16,743,057、16,615,676、13,354,601和27,618,848个clean reads,通过质量控制,每文库的Clean Data均大于13.35M,且Q30值均大于91%。在6个样品中总共预测到了1060个新miRNA,其长度以24 nt为主。对这1060个miRNA的靶基因进行预测,其中174个miRNA预测到了456个靶基因。在这预测到的456个靶基因中,有241个基因获得了注释信息。差异表达的miRNA有42,其中上调表达的为20个,下调为22个。在差异表达表达miRNA的75个靶基因中,只有14个基因得到了注释。在降解组文库中,共检测到了66个靶基因降解位点和66个靶基因发生了降解。与miRNA测序预测的靶基因取交集,得到了28个共有靶基因,这28个共有靶基因涉及了SPL、HD-Zip转录因子及植物激素信号传递。
  (3)西瓜植株在PEG胁迫下,其茎和叶中脯氨酸含量逐渐增加,后在12h下降;而在根中,在第3h达到最大,后开始下降。脯氨酸合成相关酶的酶活性及其编码基因的相对表达量结果表明,PEG胁迫下脯氨酸合成以谷氨酸途径为主,在2个P5CS编码基因中,以Cla006553为主,Cla017928表达被抑制。P5CS活性变化与Cla006553相对表达量变化相似。OAT酶活性较小,而其编码基因的表达在根、茎叶中均被抑制。截断地上部和地下部分并进行干旱胁迫,其试验结果表明叶是脯氨酸合成的主要场所,在胁迫下根中脯氨酸依靠叶中脯氨酸长距离运输到根部。对Cla006553和Cla017928的启动子驱动GUS的转基因拟南芥胁迫后染色发现,在拟南芥叶中Cla006553启动子活性最高,在根中活性低。而Cla017928的启动子在胁迫后,根、叶中的活性均较低。这更进一步表明,PEG胁迫下西瓜主要以Cla006553编码P5CS酶,脯氨酸以叶为主要合成器官。
  (4)克隆了西瓜自交系M08的P5CS酶两个编码基因:Cla006553和Cla017928。Cla006553的编码序列长2166 bp,编码721个氨基酸;Cla017928的编码序列长2145bp,编码714个氨基酸。二者核酸和氨基酸序列之间相似性为分别为74.19%和77.12%。其蛋白含有谷氨酸激酶功能域、ATP结合区、NAD(P)H结合区、亮氨酸拉链、谷氨酰脱氢酶功能区(G5PR)等结构域和脯氨酸反馈抑制位点。转Cla006553和Cla017928基因的拟南芥植株可显著增加脯氨酸含量,具有较高的耐旱和耐盐能力。
[硕士论文] 赵玉龙
甜瓜育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:甜瓜(Cucumis melo L.,2n=24)是葫芦科黄瓜属一种非常重要的经济作物,其品质优劣与产量高低决定着甜瓜的经济效益。就目前来看,一方面,我国甜瓜病害非常严重,枯萎病、白粉病作为甜瓜世界性病害,是影响甜瓜品质与产量的重要因素之一,是限制甜瓜产业发展的一大因素;另一方面,丰富多姿的甜瓜直接影响人们的消费水平,市场上单一颜色的甜瓜不能满足人们的需求,降低甜瓜经济效益。随着我国甜瓜种植面积的不断扩大与甜瓜种质资源的商品化,越来越亟需含有抗病优质等多基因聚合的甜瓜品种。分子标记技术的出现与发展,解决了传统育种方式的一系列问题,如育种时间长、效率低下、优质基因难以准确检测等,加快了育种进程。
  本试验以橙色果肉品种MR-1与绿色果肉品种X191为试验材料,设计开发橙色果肉分子标记,结果表明本实验室自主设计开发的分子标记能很好地区分橙色果肉与非橙色果肉,可以应用于生产实践。
  本实验中,以MR-1与WI998为亲本的F2群体中由于亲本均为橙色果肉且F1严格自交,因此,F2果肉颜色均为橙色,酶切结果均为两个条带与实际完全一致。自然群体数量为355株,其中分子标记结果与实际调查一致的有340个,符合率为95.8%;其中实际调查中具有橙色果肉性状的有83个,酶切电泳结果中明确具有两个条带的有68个,符合率为81.9%。
  本试验以MR-1与WI998为亲本材料,设计开发抗枯萎病分子标记,并在自然群体与F2群体中验证。F2群体数量为76株,抗枯萎病植株为56株,感病植株20株,抗病与感病之比近似为3∶1,经x2检测,符合3∶1孟德尔经典单基因控制性状遗传的规律。本试验355个自然群体中,分子标记抗病与感病株数与实际调查情况一致的有335株,符合率达到94.8%;76株双亲群体中分子标记抗病与感病株数与实际调查情况完全一致,符合率达到100%。
  本试验以抗白粉病分子标记在自然群体与双亲群体中进行验证,在自然群体中158株抗病单株,抗病植株所占比例为44.5%%,分子标记与实际调查情况一致的有342株,符合率达到96.3%;F2群体中76株抗病单株,抗病植株所占比例为100%,符合率达到100%。
  本试验以雄全同株抗枯萎病抗白粉病橙色果肉品种MR-1与全雌感枯萎病感白粉病橙色果肉品种严格WI998为亲本严格杂交获得F1代,F1代严格自交获得F2代,试验中F2群体76株,以已知的自主开发的抗白粉病分子标记、性别分化分子标记和本实验室自主开发的果肉颜色分子标记、抗枯萎病分子标记进行筛选,获得12株具有纯合基因型橙色果肉基因、枯萎病抗性基因、全雌基因、白粉病抗性基因的株系。
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