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[博士论文] 朱昊俊
特种经济动物饲养 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:转Bt基因作物的种植可以使Bt蛋白经由根系分泌物、花粉、以及作物残体、雨水径流等途径进入其周围的水环境中,实现从陆地生态系统到水生生态系统的转移。因而,评估Bt蛋白对水生生态系统的潜在风险显得十分重要,但是目前有关转Bt基因作物对水生生物的研究很缺乏。本研究以转cry1Ab/1Ac基因水稻(华恢1号,HH1)作为转基因水稻材料,以代表水生生物——爪蟾(Xenopus laevis)作为研究对象,研究转Bt基因水稻对不同发育历期爪蟾(胚胎期,变态期以及成年期)生长发育的影响。主要研究内容和结果如下:
  (1)基于爪蟾胚胎致畸(Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus,FETAX)试验,在培养液内分别添加Cry1Ab和Cry1Ac纯蛋白,设置10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L三个浓度,同时设立毒死蜱阳性对照组(480μg/L、240μg/L)和空白对照组,每24h观察并且记录胚胎发育状况和畸形情况,并且更换一次培养液,待试验结束后对蝌蚪体内酶活性进行检测。结果显示:经过96h试验,未观察到Bt蛋白的暴露对爪蟾胚胎产生不利影响,其存活率、畸形率、体重、体长以及酶活力均和对照组一致,差异不显著。
  (2)在蝌蚪饲养水体内添加Cry1Ab和CryAc纯蛋白,以及水稻秸秆浸出液对爪蟾蝌蚪(孵出后7d)进行长期暴露,每天投喂两次并且观察蝌蚪存活情况和日常行为,试验期间每48h更换一次饲养用水,完成变态后立即对幼蛙进行麻醉处理,然后称重解剖,记录下各脏器重量。试验共设置7个处理:(1)100μg/L Cry1Ab纯蛋白组;(2)100μg/L Cry1Ac纯蛋白组;(3)50μg/LCry1Ab+50μg/L Cry1Ac纯蛋白组;(4) HH1水稻秸秆浸出液组;(5) HH1亲本对照(明恢63,MH63)水稻秸秆浸出液组,(6)空白对照组;(7)阳性对照组:100μg/L毒死蜱。通过检测蝌蚪完全变态时间、发育情况、体内酶活力等指标,研究转Bt基因水稻对爪蟾蝌蚪变态期发育的影响。结果显示:Bt蛋白的暴露不会对爪蟾变态期完成变态时间、变态完结时的体重体长、各脏器重量等生长发育指标产生影响,组织切片观察各脏器组织未见明显差异;同时,对肝功能、肾功能以及脂肪代谢进行检测,也未发现显著差异。由此,我们认为Cry1Ab和CryAc纯蛋白的暴露不会影响爪蟾蝌蚪变态期的正常生长发育。
  (3)对变态完成后爪蟾肠道内微生物进行16S rDNA V4区测序,探究其肠道微生物组成,发现爪蟾肠道具有丰富的微生物多样性,总共获得56个门496个属的微生物信息,其中仍有大量未被鉴定微生物。从多样性分析可以看出,不同的肠道分段,微生物种类和组成差异显著;而在同一个分段内,不同的处理(Bt蛋白、秸秆浸出液、毒死蜱)对肠道微生物影响较小。由此,我们推断Cry1Ab和CryAc纯蛋白的暴露未对不同处理组爪蟾肠道微生物产生明显影响。
  (4)根据爪蟾营养需求,使用HH1和MH63稻谷粉(稻谷粉添加比例30%)制作试验用颗粒饲料,通过90d饲喂试验对爪蟾成蛙进行Bt蛋白暴露。每隔15d测量一次体重和体长,在试验结束后,进行一系列生理生化、组织病理学检测。结果显示:取食HH1稻谷粉的爪蟾和对照组相比,其体重、体长、动物行为、各器官重量、肝功能、肾功能等均没有显著差异。这表明,取食含有Bt蛋白的饲料并未对爪蟾幼体产生可观察的影响。
  由以上各结论,我们认为种植转cry1Ab/Ac基因水稻(华恢1号,HH1)不会影响蛙类的生长发育。
[硕士论文] 赵永峰
预防兽医学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:H9N2亚型流感病毒可引起人以及各种动物低致病性呼吸道疾病。水貂对其易感,由于我国水貂养殖特点为狐狸、貉子与其混合饲养,从而加大了狐狸、貉子感染H9N2亚型流感病毒的机会。
  为研究H9N2流感病毒在水貂群中的流行及进化情况,以及是否在狐狸和貉子种群中造成感染。2015年本实验室从山东省中东部地区收集到105份水貂、32份狐狸和20份貉子的肺组织,并从水貂肺组织中分离到六株 H9N2亚型流感病毒,A/Mink/Shandong/Z1/2015,A/Mink/Shandong/Z2/2015,A/Mink/Shandong/Z3/2015,A/Mink/Shandong/Z4/2015,A/Mink/Shandong/Z5/2015和A/Mink/Shandong/Z6/2015。而在狐狸和貉子的肺组织中没有分离到流感病毒。
  将六株分离毒株的核苷酸序列与GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列进行比对发现,该六株分离毒株的八个基因片段同源性为99.2%~100%;其PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因与A/mink/Shangdong/F10/2013(H9N2)(Mk/SD/F10/13)毒株的相应片段同源性最高,都在97.0%以上,而PB2基因与A/environment/Suzhou/14/2013(H7N9)同源性最高,为99.4%。
  为进一步揭示六株分离毒株的分子特征,用DNASTAR软件分别推导其各基因片段的氨基酸序列,并与参考毒株进行比较分析。分析结果表明,该六株分离毒株八段氨基酸序列的同源性为98.2-100%。六株分离毒株的HA蛋白第226位氨基酸均为亮氨酸(Leu),具有SAα-2,6-Gal的受体结合特性;其裂解位点处氨基酸序列为RSSR,表明六株病毒均是低致病性的毒株;HA蛋白有8个潜在糖基化位点,与参考毒株相比,在218位氨基酸处丢失了一个潜在的糖基化位点,在313位氨基酸处增加了一个潜在的糖基化位点;六株分离毒株PB2蛋白的氨基酸序列在627位编码谷氨酸Glu,第701位编码天冬酰胺 Asn,第627位符合禽源流感的特点,但第701位的天冬酰胺 Asn可以补偿第627位突变产生的影响,增强其在哺乳动物体内的复制能力。
  为了进一步分析六株分离毒株的基因片段的起源,用GeneBank中的H9N2亚型流感病毒的序列作为参考序列,进行系统发生分析。HA基因的系统发生树分析得出:六株分离毒株属于欧亚Ⅲ系的Y280亚系分支, NA基因与内部基因PB1、PA、NP、NS的系统发生树分析表明:六株分离毒株属于欧亚Ⅱ系的Shanghai/F/98亚系分支,M基因的系统发生树表明:六株分离毒株属欧亚Ⅱ系的Hong Kong/G1/97亚系分支。且以上7个片段与Mk/SD/F10/13毒株具有最近的亲缘关系;PB2基因的系统发生树分析表明:六株分离毒株属于欧亚Ⅰ系的Korea/38349-p96323/96亚系分支,且与A/environment/Suzhou/14/2013(H7N9)有很近的亲缘关系。
  为研究貂源H9N2亚型流感病毒能否在水貂种群中水平传播,是否可以跨种传播给狐狸、貉子。本研究用实验室保存的Mk/SD/F10/13毒株进行动物实验。动物实验结果,发现在接种后的第4-8天,哨兵水貂出现了精神沉郁、食欲减退、流清亮鼻涕、流眼泪、轻微的咳嗽等症状,最后攻毒水貂和哨兵水貂都恢复健康,没有造成死亡。排毒检测发现哨兵水貂在第4~6天内能够通过鼻腔向外界排毒。剖检能发现肺脏出血、气管环出血、脾脏肿大出血等病理学变化。组织病理学观察发现肺脏表现出血性间质性肺炎,且肺泡壁充血增厚。第14天采集水貂血液样本分离血清进行HI抗体检测发现HI抗体均为阳性。哨兵狐狸和貉子没有表现临床症状,也没检测到排毒,但第14天采集狐狸和貉子血清检测发现HI抗体均为阳性。同时进行了狐狸和貉子的致病性实验,攻毒狐狸和貉子没有表现临床症状,也没检测到排毒,而第14天采集狐狸和貉子血清检测发现HI抗体也为阳性。这些结果表明:在实验条件下,貂源H9N2亚型流感病毒可以在水貂种群中水平传播,并可以跨种传播给狐狸、貉子。此外,为进一步研究H9N2亚型流感病毒在水貂、狐狸和貉子种群中的流行情况,进行了血清学调查。调查结果:水貂血清中抗H9N2亚型流感病毒的抗体阳性率达为31%(97/313),高于2013年的20%。狐狸血清中抗H9N2亚型流感病毒的抗体阳性率为59.4%(76/128),貉子血清中抗H9N2亚型流感病毒的抗体阳性率为41.4%(106/256)。该结果表明H9N2亚型流感病毒在水貂群中的流行越来越广泛,并在狐狸和貉子群中流行。
  本研究证实了貂源H9N2亚型流感病毒可以在水貂种群中水平传播,并可以跨种传播给狐狸、貉子。而且在毛皮动物种群中广泛流行。此外,貂源H9N2亚型流感病毒在水貂体内持续进化。这可能会对毛皮动物养殖业造成危害,而且毛皮动物也可能作为H9N2流感病毒的中间宿主而感染其他动物,甚至可能感染人类。本研究对做好H9N2流感病毒的防制和监测工作提供了重要的分子流行病学资料,因而具有重要的公共卫生学意义。
[硕士论文] 陈嫦青
动物营养与饲料科学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1,mammalian target of rapamycincomplex1)的激活不仅能促进蛋白质的合成,还能抑制自噬等蛋白质的降解途径的发生。氨基酸尤其是亮氨酸不仅是蛋白质合成的原料,也能作为信号分子参与mTORC1的激活过程。近年来,越来越多的蛋白被发现参与氨基酸激活mTORC1的过程。然而,关于氨基酸在细胞内的感应机制尚不明确,细胞中还可能存在其它未知的蛋白质分子参与氨基酸激活mTORC1的过程。
  本研究通过构建用于研究mTORC1信号通路的无细胞体系(Cell-freesystem),结合同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(isobaric tags for relative andabsolute quantification)技术及生物信息学分析,初步筛选参与亮氨酸调节mTORC1信号通路的关键差异候选蛋白质。本研究的无细胞体系由溶酶体粗提物(包括P20(+)和P20(-))、胞浆蛋白(包括S100(+)和S100(-))、纯化的标签蛋白HA-raptor(mTORC1的组分之一)组成。无细胞体系结果表明,在由胞浆蛋白S100(-)和溶酶体粗提物P20(-)组成的无细胞体系中,亮氨酸能促进Raptor与溶酶体P20(-)的结合。无细胞体系反应完成后,我们将对照组的上清和沉淀(S1,P1)与亮氨酸组的上清和沉淀(S2,P2)进行iTRAQ试验。本次iTRAQ试验共鉴定到6292个蛋白,以变化倍数(Fold change)>1.2或<0.83和Q值(Q-value)<0.05两个条件进行差异蛋白的筛选。在P2-VS-P1组中,上调差异蛋白数(Up-regulated proteins)为208个,下调差异蛋白数(Down-regulatedproteins)为190个;在S2-VS-S1组中,上调差异蛋白数(Up-regulated proteins)为12个,下调差异蛋白数(Down-regulated proteins)为3个。对上述差异蛋白进行生物信息学分析(包括GO、COG注释、Pathway注释分析)后发现,差异蛋白主要为细胞器上参与代谢过程的蛋白,且参与脂质代谢和与神经退行性疾病相关的蛋白也可能参与亮氨酸对mTORC1的激活过程。
  参与亮氨酸激活mTORC1信号通路的关键差异候选蛋白需要综合考虑上清和沉淀中的差异蛋白。其中,在上清中下调且在沉淀中上调的蛋白数为0,而在上清中上调且在沉淀中下调的蛋白有6个,因而我们初步将这6个蛋白(APOA1、CFH、FGA、ERH、CANX、F2)定义为参与亮氨酸激活mTORC1信号通路的关键差异候选蛋白。对CANX进行初步验证后发现,无细胞体系样品中该蛋白的分布规律与iTRAQ数据一致,且CANX与溶酶体上的标志性蛋白Lamp2的共定位结果也说明亮氨酸能促进CANX向细胞质中迁移。
  综上所述,(1)本研究首次成功构建了用于研究亮氨酸调节mTORC1信号通路的无细胞体系,且该体系有效性好,稳定性高。(2) iTRAQ数据与生物信息学分析结果表明,APOA1、CFH、FGA、ERH、CANX、F2可能参与亮氨酸对于mTORC1信号通路的调节。
[硕士论文] 于新生
临床兽医学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:蓝狐作为一种新型的经济动物被广泛的养殖在我国黑龙江省大兴安岭市,并已成为该地区继木材减产后的重要支柱产业。微孢子虫病是以肾脏肿大为特征,表现为分窝后生长受阻,机体逐渐消瘦死亡,多伴随着腹泻的一种急性传染病,即使耐过,幼兽生长也会受到严重影响,并导致蓝狐的毛皮质量降低,给蓝狐养殖业带来严重的经济损失。现已确认引起蓝狐发生微孢子虫病的主要病原是兔脑炎原虫,并且大多伴随隐性感染。因此,进行微孢子虫病分子流行病学调查对预防及治疗该病具有重要意义。同时,对患微孢子虫病狐肠道内微生物菌群的研究也为寻找新型治疗药物奠定基础。
  本研究通过对2014-2015年间大兴安岭地区10个规模化养殖场共12143只蓝狐血清样本进行微孢子虫病胶体金试纸条法检测,并进行流行病学分析。在群体中随机抽选30只健康蓝狐和30只患病明显的病狐,以Real-time PCR检测技术分别对两组动物肠道内的乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、肠球菌(Enterococcus)、梭菌(Clostridium)、韦荣球菌(Veillonella)进行检测和差异性显著分析。在2015-2016年间,应用阿苯达唑抗虫剂联合乳酸菌调节法对以上10所养殖场开展微孢子虫病治疗试验。
  流行病学调查结果显示,共检测出阳性感染病例705只,感染率为5.80%;其中带有腹泻症状533例,腹泻率为75.6%;阳性感染病例中死亡病例211个,死亡率为30.0%;剖检典型肾部症状的189个,比率为89.5%。real-time PCR检测结果显示,对照组蓝狐的肠道菌群中,乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)的菌群浓度与患病组菌群浓度相比差异性显著(P<0.05),而健康组的拟杆菌(Bacteroides)、肠球菌(Enterococcus)、梭菌(Clostridium)、韦荣球菌(Veillonella)菌群数量与患病组菌群浓度相比差异不显著(P>0.05)。自2015年起,对大兴安岭地区10个养殖场采用阿苯达唑抗虫药联合乳酸菌调肠道菌群的方法对微孢子虫病进行控制,实验数据统计分析表明,检测感染病例111只,其中有腹泻32例,阳性感染病例中死亡病例24个,剖检典型肾部症状的17例,感染病例由种群规模的5.8%下降到0.9%,此方法效果显著。
  研究表明微孢子虫病已成为我国大兴安岭地区致蓝狐死亡的主要传染病之一,且患病动物的死亡率较高,微孢子虫病除了具有泌尿系的病变之外,还主要引起动物肠道菌群的改变,进而使蓝狐出现消化道症状。联合应用阿苯达唑抗虫药与乳酸菌,可显著降低该病的发病率和死亡率,本研究明确了影响大兴安岭地区蓝狐大肾病的病因及致病机制,为深入开展机理研究提供了依据。
[博士论文] 谭静
动物营养与饲料科学 河南农业大学 2017(学位年度)
摘要:DDK综合症是一种以小鼠早期胚胎死亡为表型的繁殖现象,其主要表现为:当DDK品系雌鼠与同亚种内其他品系雄鼠杂交时,胚胎因形成胚泡障碍不能着床而死亡;而DDK雄鼠与其他品系雌鼠杂交时胚胎则均能正常发育。小鼠卵子突变基因(Ovum mutant,Om)被认为是导致该综合症的突变基因,然而该基因序列及作用机制目前仍不清楚。本研究旨在通过在小鼠日粮中添加不同浓度的精氨酸观察其对DDK综合症胚胎的影响,以及精氨酸代谢与DDK综合症间的关系;同时研究中通过寻找DDK综合症的修饰基因,以揭示Om基因位点杂合雌鼠与C57BL/6(B6)回交后胚胎死亡率偏离半数致死的原因。本研究通过营养和基因两个方面共同探讨对DDK综合症胚胎的影响,为最终解释DDK综合症的机理奠定基础。本研究共分三部分进行:
  第一部分研究小鼠日粮中添加不同浓度精氨酸对DDK综合症的影响。实验采用单因素完全随机设计,选用120只F1(B6♀×DDK♂)代雌鼠,随机分为3组,分别饲喂精氨酸含量为1.10%、1.34%和1.59%的日粮。妊娠12天解剖,观察存活胎子数和着床数,检测子宫胎盘内一氧化氮含量。实验结果表明,饲喂1.34%的精氨酸组其着床数显著高于1.10%和1.59%组(P<0.05)。同时,1.34%组的存活胎子数最高,但与其他两组相比,均未达到显著性差异(P>0.05)。子宫胎盘内一氧化氮检测结果显示,小鼠日粮中添加1.34%和1.59%的精氨酸其一氧化氮含量均显著高于1.10%组(P<0.05)。该实验结果表明,小鼠日粮中添加1.34%精氨酸对提高DDK综合症胚胎的成活率有一定帮助,但差异不显著;子宫胎盘内一氧化氮的检出,表明DDK综合症胚胎死亡和精氨酸缺乏及一氧化氮代谢障碍间无直接关系。
  第二部分初步定位DDK综合症的修饰基因。实验利用与Om基因紧密连锁的D11Mit36、D11Mit66和D11Mit247三个微卫星分子标记,筛选杂合型N2雌鼠构建修饰基因定位群体。同时,采用凝胶电泳法筛选在DDK和B6品系间具有多态性的微卫星分子标记,利用筛选到的分子标记对作图全体进行全基因扫描。收集杂合型N2雌鼠妊娠12天的存活胎仔数和胚胎着床数作为表型数据。最后采用WinQTLCart2.5软件中的复合区间作图法结合全基因扫描结果和表型数据进行QTL定位分析,初步寻找加重DDK综合症的修饰基因。实验结果显示,本研究共筛选到289只N2杂合型雌鼠构建作图群体,其筛选比例为23.94%。筛选到67条具有多态性的微卫星引物,筛选比例为25.97%,平均每条染色体上有3.53个标记,标记间平均距离为18.56cM。收集到的表型数据显示存活胎子数平均为2.57只,而着床数平均为3.59只,且均符合正态分布。结合19363个全基因扫描结果和表型数据进行QTL分析后发现,存活胎子数在第几号染色体上有一个明显高峰,其最大LOD值为3.5,超过了2.9的显著性LOD值,因此认为该位点是一个主效修饰基因位点,并将其命名为Amom1,该位点位于小鼠第几号染色体上的38.9-51.9cM区间。而着床数虽然也在第九号染色体上也有一个高峰,但其最大LOD值为2.3,未达到显著性LOD值2.5的水平,因此,认为该位点不是一个显著性修饰基因位点。该实验结果表明,在B6品系遗传背景中定位到一个主效修饰基因位点,该位点可以加重DDK综合症,使得胚胎成活率进一步降低。该实验结果解释了Om位点杂合雌鼠与B6品系回交胚胎死亡偏离半数致死的原因。
  第三部分对Amom1修饰基因位点进行精细定位。本研究在初步定位的基础上通过扩大定位群体,增加高密度分子标记等方法,以进一步精细定位Amom1位点。在精细定位后,结合小鼠资源库及生物信息学方法,寻找Amom1位点内的候选基因,为最终克隆DDK综合症修饰基因奠定基础。实验结果显示,本研究在小鼠第九号染色体上筛选到高密度分子标记28个,筛选率为21.88%,Amom1位点内分子标记间距为0.93cM。增加了56个有效样本,使作图群体达到了345只。利用作图群体的存活胎子数表型数据进行QTL分析,并采用1.5LOD-drop的方法进行置信区间估测。QTL分析结果表明,Amom1位点置信区间为47.7-49.1cM间,大约1.4cM。该位点的贡献率为10.56%,加性效应为-1.46,显性效应为12.72。通过NCBI和MGI数据库分析该区间对应90700-94500Mb,包含有效基因19个,其中12个为未知基因,4个为Plscr家族基因,2个为Zic家族基因和1个Plod家族基因。下一步的研究需要对19个基因进行更进一步的筛选,并对筛选出来的候选基因进行功能性验证。
  综合以上研究结果,小鼠日粮中添加1.34%的精氨酸对DDK综合症略有缓解,DDK综合症胚胎死亡与日粮中精氨酸代谢无直接关系,而与B6品系遗传背景中的修饰基因位点Amom1有直接关系。该修饰基因位点通过对Om基因的调节,可促进DDK胚胎死亡的进一步增加,即加重DDK综合症。该研究揭示了日粮中精氨酸与DDK综合症胚胎死亡间的关系,同时定位到的加重DDK综合症的修饰基因为全面解释DDK综合症的机理奠定了基础。
[硕士论文] 许冠
药用动物资源开发 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:林麝(Moschus berezovskii)是我国重要的经济动物,因其所产麝香有极高的经济价值而被大量捕杀,导致种群数量锐减,2002年被列为我国Ⅰ级重点保护的珍稀濒危野生动物。目前,开展人工养麝是保护林麝野生资源的重要手段之一,但圈养林麝又带来了新的问题,遗传相关问题尤为突出。因林麝保护级别高,分布区域有限,样品获取较难,目前有关林麝的研究报道较少。为丰富林麝遗传学有关数据,同时为麝场的养殖管理提供资料,本文开展了以下研究:运用磁珠富集法构建林麝微卫星富集文库,从文库中筛选多态微卫星位点;用8个林麝多态微卫星位点分析陕西某麝场圈养林麝群体的遗传多样性,并对所采40个林麝样进行UPGMA聚类分析。所得主要结果如下:
  1.采用磁珠富集法构建林麝(AC)n微卫星文库,获得16个微卫星位点,其中完全型微卫星8个,占50%,不完全型微卫星7个,占43.75%,复合型微卫星1个,占6.25%。
  2.设计14个林麝微卫星位点引物,经筛选发现3个多态的林麝微卫星位点,可用于林麝群体遗传多样性分析;1个林麝和马麝的种间鉴别位点。
  3.圈养林麝种群的遗传多样性分析结果显示,8个林麝微卫星位点的多态信息含量在0.679~0.870之间,平均多态信息含量为0.798;共检测到68个等位基因,平均等位基因数为8.5,平均有效等位基因数为5.8770;圈养林麝种群的平均观测杂合度为0.5428,平均期望杂合度为0.8337,平均Shannon's信息指数为1.8971。卡方检验结果显示,除Mber76C位点外,其余7个微卫星位点偏离Hardy-Weinberg平衡,其中2个位点杂合子过剩,5个位点杂合子缺失。8个微卫星位点共检测到14个稀有等位基因,占等位基因总数的20.59%。
  4.40个圈养林麝样品的聚类分析结果表明,群体的相似系数在0.72~0.97之间,整个群体可分为9类,同一类群个体数最多为22个,最少为1个。
  本研究丰富了林麝微卫星标记数据,分析发现陕西麝场圈养林麝群体的遗传多样水平较高,但为了麝场长远的发展,仍需不断提高麝场的养殖管理水平,建立完善的群体遗传谱系,实时进行群体遗传监测,避免种群退化的风险。
[博士论文] 陶大勇
临床兽医学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:鹿茸是一种名贵的中药材,具有温肾壮阳、生精益血、强筋补髓的功效。它是鹿科动物特有的组织,具有很强的再生能力,在自然生长情况下每年都要经历发生、生长、骨化、脱落等过程。塔里木马鹿是单位体重产茸量晟高的鹿科亚种,在生茸期鹿茸生长迅速,鹿茸角的生长的本质就是在软骨骨架上的成骨过程,期间大量的矿物质元素尤其是钙将沉积在鹿茸角中。钙离子的沉积需要多种因素调控,关系比较密切的因素有钙敏感受体(CaSR)、甲状旁腺素(PTH)、雄激素(ADG)、降钙素(CT)、骨特异性碱性磷酸酶(BALP)、骨唾液酸糖蛋白(BSP)、骨钙素(BGP)等激素。为了明确钙离子在鹿茸中的沉积规律、以及鹿茸骨化与调控因素之间的关系,本试验通过测定生茸期鹿茸钙、血钙、骨钙、血液中ADG、PTH、CT、BALP、BGP及BSP等激素的含量和变化规律,对塔里木马鹿鹿茸间充质细胞、前成软骨细胞、软骨细胞、骨膜细胞进行体外培养,采用激光共聚焦显微技术观察细胞外钙离子向胞内流动以及测定胞内钙离子浓度,采用Real-time PCR、WesternBlot等方法,分析CaSR、BSP、Runx2、GAPDH等基因表达情况,分析研究鹿茸角骨化机制。通过试验研究,取得如下成果:
  1、塔里木马鹿鹿茸生长状况,及鹿茸钙、血钙、骨钙变化规律。
  青年组塔里木马鹿鹿茸角的生长速度在鹿茸角开始生长的第84天达到最大值,血Ca2+含量在鹿茸角开始生长的第70天出现下降趋势,而后升高,于鹿茸角开始生长的第84天达到最高值。中年组、老年组马鹿在鹿茸角开始生长的第70天鹿茸角生长速度达到最大值,血液中Ca2+含量子鹿茸角开始生长的第57天达到最高值,在鹿茸角开始生长的第70天出现降低态势,此后Ca2+含量又缓慢攀升。塔里木马鹿鹿茸生长期约有100天(从春分至夏至),年龄大的鹿只其鹿茸角先开始生长、先进入骨化阶段。鹿茸钙含量是不断增加的,鹿茸骨化过程是分阶段进行的,在生长期表现为钙在软骨内沉积,在骨化期则是软骨组织迅速钙化。马鹿主要骨骼均存在脱钙现象,鹿茸角中的钙主要来源于肋骨,其次是骨盆骨,而小腿骨与肩胛骨脱钙程度最轻。
  2、鹿茸骨化与血液中相关激素之间的关系。
  在鹿茸角的不同生长阶段,塔里木马鹿外周血中血清ADG、PTH、CT、BALP、 BGP及BSP的含量存在着不断的变化,尤其是骨化阶段变化最为明显。血清ADG水平的变化最明显的是在锯茸后,在此之前都一直处于低水平状态,然后迅速升高,达到显著性差异(P<0.01)。血清PTH在鹿茸角生长阶段变化一直不明显,骨化期之前一直处于低水平状态,但在进入骨化后期,各组马鹿血清PTH含量显著增高(P<0.01)。各组马鹿血清BALP含量在生茸初期至快速生长期均有下降趋势,快速生长期至骨化后期,各组马鹿血清BALP含量均增加,在鹿茸收获以后,明显下降。血清BGP、BSP均是随着鹿茸角的生长而在升高,进入骨化期后开始下降,鹿茸角收获后就一直在下调,与鹿茸角的生长速度呈正相关。各组血清CT的浓度变化趋势与鹿茸角生长率相同,但滞后于鹿茸角生长速度的变化,在生茸初期、茸快速生长期均缓慢升高,到骨化后期达到最高,然后开始下降。说明血液中ADG、BALP、BGP、BSP等激素与鹿茸角快速骨化有着密切关系。血液中PTH、CT等激素与脱钙的骨骼重建有着密切关系。
  3、鹿茸细胞培养及与钙调节相关基因的关系。
  采集处于生长期鹿茸顶端部分进行细胞培养,实验结果表明:前软骨细胞(ACC)、间充质细胞(MSC)易培养,而软骨细胞(CC)生长较慢。用激光共聚焦方法检测[Ca2+]i的变化,结果发现MSC的[Ca2+]i高于ACC、CC,补充外源性钙时,胞外Ca2+流入胞内,MSC、ACC细胞需要的时间较短,而CC细胞则需要的时间较长。说明越临近骨化期,鹿茸角中软骨细胞的数量越多,需要的钙量也越来越多。用实时荧光定量PCR扩增CaSR、BSP、Runx2等基因,前软骨细胞的BSP、CaSR、Runx2等基因mRNA表达水平明显高于间充质细胞,而软骨细胞中只有Runx2基因的mRNA表达水平高于间充质细胞、前软骨细胞。Western Blot检测得到了相同的结果。说明鹿茸的生长与MSC、ACC的分化能力有关,鹿茸的钙化与CC的数量、胞外钙的浓度有关。在鹿茸生长期内,BSP调节Ca2+进入到软骨细胞形成骨小梁的过程中起到重要作用;Ca2+将通过CaSR介导在软骨细胞中沉积;Runx2在软骨成熟中可以起到一定的作用。
[硕士论文] 焦钰
动物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:转基因小鼠(Mus musculus)的制备方法多种多样,包括原核显微注射、精子介导转基因、体细胞核移植和使用慢病毒载体等。但目前为止,生产转基因小鼠最为有效的方法仍然是原核注射技术。单从效果来看,原核注射技术是最为理想的。但此项技术也存在着不足:很多研究人员在实验室中得到的转基因效率并不一致,并且转基因效率低。为此,本文从注射针直径、外源基因浓度、单/双核注射等原核注射环节入手,对原核注射技术进行优化,并采用优化后的技术制备转基因小鼠。试验结果,注射针的直径大约为0.5μm时是最合适的,相比直径1μm的阳性率(12.5%),其阳性率(47.7%)要高出35%(P<0.01)。外源性基因的浓度,是影响转基因小鼠阳性率的重要因素。外源基因浓度为1.00μg/mL、2.50μg/mL、3.00μg/mL和4.0μg/mL时,转基因小鼠阳性率分别0.67%、14.9%、30.6%和21.4%。当外源性基因浓度为3.00μg/mL时,阳性率远高于其他组(P<0.01)。使用浓度为3.00μg/mL的外源基因浓度,分别统计并比较单原核注射与双原核注射的阳性率,结果表明双原核注射组的阳性率(24.3%)比单原核注射组(18.3%)明显要高(P<0.01)。在显微技术辅助作用下,将2-细胞时期胚胎分别移入到0.5d、1.5d、2.5d假孕母鼠输卵管内,19.5d后代孕母鼠产仔,产仔率分别为68.6%、67.6%和40.1%,经检测,转基因阳性率为17.4%、22.5%和10.1%。组间对比结果表明,在产仔率指标方面,0.5d和1.5d组间对比差异不具有统计学意义,不过在转基因阳性率方面,1.5d代孕组(22.5%)显著高于其他两组。使用注射针直径小(≈0.5μm);DNA载体浓度为3μg/mL;采用双原核注射;1.5d代孕母鼠孕母鼠;可以高效获得转基因转基因小鼠。本实验经过对原核注射过程中主要关键步骤的优化组合,形成了一套高效的转基因小鼠标准化操作流程。
[博士论文] 石全华
野生动植物保护和利用 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:猎物不足是威胁中国野生东北虎生存和恢复的主要限制因素之一。鉴于在中国东北的野生东北虎分布区内,其主要猎物梅花鹿密度极低,不足0.1只/km2,该项目采用猎物重引入的方式帮助梅花鹿在野外建立稳定的基础种群。2012-2013年,作者在吉林省汪清国家级自然保护区,重引入人工饲养梅花鹿63只,置于建立在野外的过渡场内驯化1个月,而后就地释放。2012年6月到8月,以及2013年6月到8月,项目通过对重引入梅花鹿种群的监测,进行了其在重引入初期的适应性研究,以对未来在东北虎栖息地开展猎物重引入计划,及其它鹿类的重引入计划提供基础信息和技术指导。其研究主要结论如下:
  1、利用粪便分析法,对重引入梅花鹿在过渡场期间的食物组成变化进行研究,发现其采食的主要植物12科31属,其中柳属、杨属、栎属、桦木属和蒿属为其主要食物,占总采食量的46.48%。而重引入梅花鹿在过渡场的最初5天,食物组成与野外植物的可获得相关性高,而后经过一段时间的波动,最终在10天后,形成稳定的食物选择。将其稳定期的食物组成与当地同期野生梅花鹿的食物组成相比较,结果显示总体差异不显著。
  2、提取测定重引入梅花鹿粪便中皮质醇激素的含量,结果显示重引入梅花鹿种群到达过渡场的最初10天,其粪便中皮质醇含量较高且不稳定(588.3±93.4)ng/g,表明其应激反应强烈。然而,其含量整体呈下降趋势,10天后其含量逐渐平稳在约355.10±63.1 ng/g。将其与当地同期野生梅花鹿比较,同期粪便中的皮质醇含量相似。本研究没有发现10日内因应激反应而产生的梅花鹿由于健康问题或死亡,因此认为,种群在非捕食动物刺激的情况下,在10日之内将重引入梅花鹿的应激反应消除是可靠的。
  3、从行为学角度,利用瞬间扫描法来研究重引入梅花鹿在过渡场期间的行为变化,结果显示在其到达过渡场最初10日内,其行为时间分配波动较大,存在一定的日活动节律,但并不稳定。而在到达过渡场10天后,逐步形成稳定的时间分配和日活动节律。其稳定后,日活动节律基本与野生梅花鹿相似。值得注意的是,重引入梅花鹿到达过渡场前10天,采食行为所占比例很低,而观望行为的比例很高,这也是高应激反应的一个表现。而后,即使在采食逐渐增多的第5天左右,其观望行为的比例仍然很高,而反刍行为所占比例却较低,这个阶段对于鹿群的适应是一个关键时间,在应激反应的影响下,反刍受到波动而采食开始逐渐增多,如果没有及时消除应激反应,很有可能对梅花鹿的代谢产生影响,甚至出现健康问题。
  4、在过渡场驯化1个月后,重引入梅花鹿就地释放。项目利用无线电项圈对其跟踪监测,并对其释放后的生境选择进行研究。同时,辅助利用自动相机对当地野生梅花鹿的生境选择进行研究。结果显示释放后的重引入梅花鹿偏爱选择位于坡度小于25°,灌木密度小而乔木密度适中的区域,同时其对水源依赖,会倾向选择距离水源较近(<500m)的生境。其与同域分布的梅花鹿存在一定的一致性,如两者均倾向于选择坡度较小的区域,均倾向于选择乔木密度较适中的区域。然而,野生梅花鹿在生境选择上更注重回避捕食,如倾向于选择上坡位,距离隐蔽较近的地方活动,以及远离人为干扰区域。此外,主成分分析的结果显示对于重引入梅花鹿,其绝对值较大的权系数出现在坡度、坡位、距水源距离和郁闭度上,说明在重引入地的选择上,以上生境因子应优先考虑。
  5、总的来讲,重引入的梅花鹿在采食、应激和行为上的适应,都会在最初的10天完成,表现为初期的波动和逐渐稳定、适应的规律。因此,在管理方面,更严格的监测和可能需要的人工干预都会出现在这个阶段,应安排相应的人力和做好准备工作。而对于释放后的梅花鹿群,其与野生梅花鹿群仍存在一定的差异,特别是在回避捕食上,释放后管理人员应该尽可能地促进重引入的梅花鹿与野生梅花鹿尽早合群,以使其更快完成生境选择上的适应过程。
[硕士论文] 徐天琦
特种经济动物饲养 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:本研究于2014年4月至8月,采用扫描取样法(Scan sampling)和目标取样法(Focal sampling)以及行为取样法(Behavior Sampling)对沈阳森林动物园丹顶鹤的自然繁育行为进行观察记录,研究了人工环境下丹顶鹤求偶期、孵化期和育雏期的行为时间分配和活动规律。
  研究结果显示:
  丹顶鹤繁殖期总体时间分配为:繁殖24%、游走24%、理羽17%,觅食15%,警戒14%,静栖6%。雄性的警戒时间显著多于雌性(P<0.01)。
  交尾期时间分配为:游走28%、理羽27%、繁殖16%、警戒14%、觅食10%、静栖5%。昼间交尾行为多发生在上午4:00-5:00。
  孵化期时间分配为:孵化36%、游走25%、理羽14%、觅食11%、警戒10%、静栖4%。孵化期内孵化行为时间分配逐渐升高,游走、理羽、觅食、警戒、静栖行为时间分配都有所下降。
  育雏期时间分配为:觅食25%、育雏21%、游走19%、警戒18%、理羽10%、静栖7%。随着雏鹤日龄的增长,雏鹤印随行为和静栖行为大幅减少,理羽、游走、警戒行为逐渐增加。成鹤的育雏行为明显减少,理羽、游走、警戒、觅食行为均有所增加。雄性的警戒时间显著多于雌性(P<0.05),雌性的育雏行为始终多于雄性。
  人工环境下丹顶鹤自然繁育行为呈现一定的昼间活动规律,本实验旨在研究人工环境下丹顶鹤的自然繁育行为,为今后丹顶鹤的保护、野化放归收集资料,为再引入工程打下基础。
[博士论文] 胡贺娇
野生动植物保护与利用 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:目前,西藏马鹿(Cervus wallichii)是我国特有、濒危、珍贵鹿类动物,主要分布于西藏山南地区桑日县境内。该物种曾一度被国际组织认定为已经灭绝的物种,上个世纪90年代被中外科学家在野外调查时重新发现。本研究于2013年和2014年(8月初~9月末)连续两年秋季,采用非损伤取样法——粪便样品,对西藏马鹿的遗传多样性、种群性比及数量、食物组成、食物选择、营养成分测定以及生理健康评价等内容进行了研究,获得如下主要成果:
  1、从野外采集的199份西藏马鹿粪便样品中,利用非损伤取样法成功提取出了87份DNA分子片段。对12个多态性高,无紧密连锁关系的微卫星位点进行了PCR分析,并进行了个体识别,最终识别出的87份粪便样品分属于50只西藏马鹿个体。对这50只个体性别鉴定结果为:雌∶雄≈1∶0.79,表明西藏马鹿种群的性别比例雌性个体数量多于雄性个体数量,有利于西藏马鹿种群的发展。
  2、运用R软件Capwire包中的TIRM和ECM两种模型进行模拟得到的结果分别别为:TIRM模块得到西藏马鹿数量为87只,97.5%的判别率下的置信区间为87~90只;ECM模块得到的西藏马鹿数量为65只,97.5%的判别率下的置信区间为65~67只。利用该软件包的似然比测试得到的P值不显著偏离0,说明调查区域内的不同的个体的捕捉率不同,因此以模块TIRM结果为种群数量估计值。本次粪便采样覆盖面积(即调查抽样面积)为264.5km2,在97.5%的判别率下马鹿种群数量置信区间为87~90只,密度为0.329~0.340只/km2。本次实地调查确认:西藏马鹿目前仅分布于面积2680.6 km2的西藏桑日马鹿自然保护区内。西藏马鹿实际适栖面积为650.4 km2,其余2030.2km2为白唇鹿(C.albirostris)的主要分布区。故2013~2014年秋季西藏马鹿种群总数量约为214~221只。
  3、通过50只个体基因型数据统计指出,西藏马鹿种群平均等位基因数为7.58±0.18个,有效等位基因数平均为4.91±0.16个,单个微卫星座位的PIC在0.39~0.90之间,平均值为0.67±0.013,12个座位中只有位点T123为中度多态性位点,其他11个位点均为高度多态性位点。期望杂合度变化范围为0.45~0.91,平均为0.72±0.01;平均表现杂合度为0.52±0.11。遗传分析数据显示,目前西藏马鹿的遗传多样性较高,种群不会由于自身遗传因素而导致衰退。
  4、通过粪便显微切片技术分析得出西藏马鹿秋季采食的植物共有37种,隶属于18个科,26属,采食比率较高的依次为菊科(21.62%)、豆科(13.51%)、禾本科(13.51%)、蔷薇科(8.11%);对西藏马鹿所食植物中的水分(W)、粗蛋白(CP)、粗脂肪EE)、能量(E),纤维素(C)和单宁(T)等物质含量测定结果:水分(62.13%)、粗蛋白(11.06%)、粗脂肪(8.88%)、能量(17812.53J/g)、纤维素(22.86%)、单宁(0.14%)。
  5、选择食物组成、能量、纤维素和蛋白质4个主要营养成分为因变量,建立响应曲面模型,分析结果显示西藏马鹿偏向蛋白质和能量高的食物,对蛋白质高纤维素含量低,能量高纤维素含量低的植物有一定的选择性,但是并未出现明显的回避,分析认为西藏马鹿秋季取食策略为食物营养均衡型策略。此外,还通过对西藏马鹿粪便样品中氮含量与秋季主要采食的20种植物的平均蛋白含量的测定结果,初步探讨了鹿粪氮含量与可食植物蛋白质含量之间的关系。
  6、采用沉淀法和漂浮法对西藏马鹿粪便样品中寄生虫含量进行了测定;利用酶联免疫法对粪便样品中的免疫球蛋白进行了测定。结果显示西藏马鹿粪便中寄生虫感染率低,免疫球蛋白较圈养梅花鹿含量低,说明西藏马鹿生理健康状态良好。
  综上所述,尽管我国西藏马鹿种群遗传多样性较高,营养状态良好,但鉴于目前分布面积狭窄,种群数量稀少,当地有关部门应尽快加大该物种目前的唯一分布地——西藏桑日马鹿自然保护区的建设投资和保护管理力度,以利于这一特有、濒危、珍贵鹿科动物种群数量的迅速恢复。
[博士论文] 金光耀
野生动植物保护和利用 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:2013年~2015年冬季,作者在黑龙江省长白山地的张广才岭地区和大兴安岭地区对紫貂(Marteszibellina)进行了调查研究,基于野外收集的冬季紫貂生境数据,运用Kolmogorov-Smirnov Test的检验方法、资源选择函数模型及最大熵生境评价模型等数据处理方法对我国长白山地和大兴安岭的紫貂冬季生境选择和生境适宜性进行比较研究,获得如下主要结果:
  1、通过长白山地和大兴安岭紫貂冬季对海拔、坡度、坡向、距水源距离、距道路距离、距针叶林距离、距阔叶林距离、距混交林距离、距灌木距离、距沼泽距离、距居民点距离、隐蔽级、郁闭度、雪深、植被类型、优势乔木等16种生境因子的选择差异比较,结果显示:海拔、距水源距离和距道路距离均为影响两地紫貂生境选择的主要因子;而距阔叶林距离、隐蔽级仅为影响长白山地紫貂生境选择的主要因子;距混交林距离、距居民点距离和郁闭度仅为影响大兴安岭紫貂生境选泽的主要因子。
  2、通过对生境因子进行逻辑斯蒂回归筛选,建立紫貂生境选择的资源选择函数模型为:长白山地大海林林区:P=ez/(1+ez),其中z=1.041+1.313×海拔+0.907×距道路距离-1.003×距水源距离-2.040×距阔叶林距离+0.553×隐蔽级;大兴安岭新林林区:P=ez/(1+ez),其中z=2.041+1.040×海拔+1.907×距道路距离-1.303×距水源距离;大兴安岭双河国家级自然保护区:P=ez/(1+ez),其中z=0.265-1.305×距水源距离+0.927×距混交林距离+1.060×距沼泽距离-0.061×雪深。在资源选择函数的变量选取上,只有距水源距离是3个研究地点共有的生境因子,其余被筛选进资源选择函数模型的生境因子均不相同。
  3、运用最大熵(MAXENT)模型对影响紫貂分布的海拔、坡度、坡向、距河流距离、距道路距离、距居民点距离、距针叶林距离、距针阔混交林距离、距阔叶林距离,距灌丛距离及距沼泽距离11个生境变量的重要性进行分析:长白山地大海林林区距阔叶林距离(46.62%)、海拔(18.16%)、距河流距离(12.82%)、坡向(11.94%)这4个环境变量的累积贡献率达90.0%。大兴安岭新林林区距道路距离(46.87%)、距河流距离(13.27%)、距针叶林距离(11.13%)、坡度(5.48%)这5个生境变量的累积贡献率达76.8%。大兴安岭双河自然保护区距河流的距离(20.46%)、距沼泽的距离(16.73%)、距道路的距离(15.85%)、距针阔混交林的距离(13.01%)、距针叶林距离(10.01%)这5个生境变量的累积贡献率达82%。
  4、运用MAXENT模型评价长白山地和大兴安岭紫貂的生境适宜性;概率切断点的概率值由模型敏感性(Sensitivity)和特异性(Specificity)值的和最大时确定。长白山地大海林林区的适宜生境呈现连续性分布,主要分布在中部和西南部,适宜生境的面积为107.1km2,约占林区总面积的33.7%;不适宜生境面积为210.9km2,约占林区面积的66.3%。大兴安岭新林林区的适宜生境呈现聚集分布,并有一定的连续性,适宜生境面积为326.8km2,约占林区总面积的25.6%;不适宜生境面积为950.5km2,约占林区域总面积的74.4%。大兴安岭双河国家级保护区的适宜生境呈现斑块分布,并有一定的连续性,适宜生境的面积为227.8km2,约占保护区总面积的26.2%;不适宜生境面积为641.7 km2,约占保护区面积的73.8%。
  5、长白山地和大兴安岭地区紫貂的生境适宜性均呈现出随着距阔叶林距离的增加,或随着距针叶林距离和距水源距离的减少而增加趋势。这表明紫貂回避阔叶林并偏爱在针叶林中和距水源较近的地区生活。此外,由于长白山地张广才岭林区海拔起伏相对较大,海拔因子成为该地紫貂生境适宜性评价特有的因子;因大兴安岭部分地区山地崎岖陡峭,坡度为紫貂生境适宜性评价特有的因子。这两个特有因子分别对长白山地和大兴安岭的紫貂的生境适宜性产生较大影响。
[硕士论文] 韩铠怿
预防兽医学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:近年来,受市场需求的刺激,水貂养殖业迅猛发展。山东也成为了我国水貂的养殖大省。但是,随着水貂养殖规模的不断扩大,一些疫病也成为了制约水貂养殖业发展的重要因素。水貂阿留申病(AD),作为毛皮动物三大疫病之一,会造成水貂的毛皮质量的下降,对养殖业造成巨大经济损失。但是,目前,还没有专门的药物或者疫苗来防治此病,只能通过检疫淘汰病貂达到对貂群的净化。因此,研究水貂阿留申病毒(ADV)在山东地区的分子生物学特点,建立一种特异性的检测方法具有重要意义。
  本研究对检测到的患水貂阿留申病的水貂脏器进行研磨,将研磨液接种到猫肾细胞(CRFK)中分离培养。当细胞出现稳定的病变后,提取细胞DNA进行PCR检测,结果呈现阿留申阳性。将扩增的序列进行测序,与参考序列ADV-G比对后,核苷酸同源性达到92.6%。但是,随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐消失,PCR检测呈现阴性。说明该病毒不能在猫肾细胞中稳定传代。时,我们对从山东省诸城某水貂养殖场采集的134份水貂实质器官进行检测,发现有37株呈现水貂阿留申病阳性,阳性率达到27.6%。对37株水貂阿留申病毒进行VP2基因的扩增并进行序列测定。用生物软件分析后发现,37株测序株间VP2基因核苷酸相似性为88%-99.8%,与GenBank中参考序列的相似性为88.0%-100%。并且,我们观察到:山东地区水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突变位点。将测序株与参考株经进化树分析后,分成5个分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。VP2基因进化树显示89%的国内毒株处在进化树的第Ⅰ和第Ⅴ分支,而这两个分支不包含国外毒株。其中,有78.4%的毒株处在第Ⅰ分支。余下的11%的国内毒株则与其他国外毒株有较近的亲缘关系。这说明我国水貂阿留申病毒已经有别于国外毒株,形成了自己的独立进化支。由于大多数分离到的毒株处于第Ⅰ分支,我们暂且认为可能山东地区的毒株在向第Ⅰ分支进化的趋势。这对找出本地区流行的水貂阿留申病毒的标准毒株,以便进行对该病的检测提供科学依据。为了进一步研究分离到的37株病毒VP2基因的分子特征,用DNASTAR软件分别推导出各基因片段的氨基酸序列,并与参考毒株进行比较分析。结果发现:测序株间氨基酸的相似性为89.2%-99.7%,与参考序列间的相似性87.7%-100%。纵观VP2的整个氨基酸序列中,突变较多,有超过100多个氨基酸的突变。突变较集中的区域有三个,其中包括免疫反应区VP2:429-524。有14个突变位点只存在于中国毒株。其中,位点204:V-I、305:K-T、308:T-S、419:L-I、436:I-M的突变,突变毒株超过10个。419:L-I、436:N-D两个突变存在于VP2:428-446区域,而该区域可能影响水貂阿留申病毒的宿主范围的选择(McKenna et al.,1999)。对于其它几个频率较高的突变,我们目前还没有确切的研究来表明它突变的意义。其次,本实验室针对VP2序列的高免疫反应区(430-525)进行原核表达,并建立了间接ELISA检测方法。将扩增出的序列与pET-32a原核表达载体连接,在大肠杆菌BL21中进行表达。当诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L,在37℃诱导4h的表达量最高。表达蛋白经Western blot检测后具有良好的反应原性。将纯化蛋白包被酶标板,通过优化条件,建立了间接ELISA检测方法。用建立好的方法对84份送检的血清样本进行检测,检出率为26.2%。
[硕士论文] 姜常青
兽医 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:近年来,随着经济的发展,山东省的毛皮动物养殖业发展非常迅速。目前山东省已成为我国毛皮动物养殖第一大省,现在毛皮动物饲养量约占全国的二分之一左右。但是随着我省毛皮动物养殖业集约化程度的逐渐提高,毛皮动物的发病率也持续上升已成为制约我国毛皮动物产业发展的重要因素,给毛皮动物养殖业造成了很大的经济损失。水貂出血性肺炎是严重妨碍水貂养殖业的重要疫病之一,疫情日趋严重。研究表明,犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、流行性感冒(Influenza)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P. aeruginosa)、水貂克雷伯氏菌(1Klebsiella peneumoniae1)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌(Escherichia Coli)是引起水貂出血性肺炎的常见病原。本研究采用常规细菌分离鉴定技术,对109份患出血性肺炎的水貂的肺组织进行了细菌的分离鉴定。其中未能纯培养的有10株,可纯培养的有99株,纯培养的99株细菌在普通营养琼脂培养基上表现各种不同的生长形态。
  提取细菌基因组DNA后,釆用PCR方法利用细菌16SrRNA序列通用的引物16S-1492R和16S-27F进行扩增后测序获得菌株16SrRNA基因序列。用NCBI-BLAST软件,将测序序列在GenBank数据库中进行同源性检索分析,初步确定细菌的种属,再根据细菌在生化反应中表现的特性确定细菌种属。
  经过实验鉴定的结果表明,99株细菌中,其中31株克雷伯氏菌,该菌的检出率为28.4%(31/109);13株绿脓杆菌,该菌的检出率为11.9%(13/109);34株大肠杆菌,该菌的检出率为31.2%(34/109);8株葡萄球菌,该菌的检出率为7.3%(8/109);2株变形杆菌,3株粪肠球菌,2株奇异变形杆菌,2株芽孢杆菌,1株枸橼酸杆菌,1株弗氏柠檬酸杆菌,1株蜡样芽孢杆菌,1株橙黄微小杆菌。16SrRNA序列同源性分析结果表明,13株绿脓杆菌分离菌间的核苷酸序列同源性为84.2%-100%,其中,除SD P.a-9与其他12株间的同源性较低,在84.2%-87.3%之间,其他12株间的同源性相对较高。遗传演化分析结果显示SD P.A-9与其他12株同源性较低,处于第一分支。SD P.a-4和SD P.a-12亲缘关系较近,SD P.a-1和参考株DM5、s7ps5与同一小分支上亲缘关系较近。分离的31株克雷伯氏菌分离菌间的核苷酸序列同源性为75.2%-100%,SD Kp8与其他30株同源性较低,为75.2%-76.6%。其余30株同源性均较高。遗传演化分析结果显示SD Kp8与其余30株亲缘关系较远,处于第一分支。分离的34株大肠杆菌分离菌间的核苷酸序列同源性为96.3%-100%,同源性很高。遗传演化分析结果显示在进化关系上SD Eco-4与其他33株亲缘关系较远,处于第一分支,其他33株处于第二分支,亲缘关系均较近。分离的8株葡萄球菌分离菌间的核苷酸序列同源性为97.3%-100%,SD Sau-5与SD Sau-6间的同源性较高,处于一个小分支。但sau5、sau6与其他六株的同源性较低。SD sau1、SD sau2、SD sau3、SD sau4、SD sau7、sau8六株之间的同源性较高,均在98%以上。遗传演化分析结果显示在进化关系上SD sau5与SD sau6亲缘关系较近,处于第一分支。SD sau2和SD sau3亲缘关系较近,和SD sau4亲缘关系较近,SD sau7与SD sau8亲缘关系较近。SD sau1、SD sau2、SD sau3、SD sau4、SD sau7、sau8六株处于进化树的第二分支。
  通过对检测菌株克雷伯氏菌进行药敏试验,发现该细菌对氟苯尼考,阿米卡星,头孢他啶,氧氟沙星等药敏感;通过对检测菌株绿脓杆菌进行药敏试验,发现该菌对头孢哌酮,链霉素,阿米卡星,头孢他啶,氧氟沙星等药敏感;通过对检测菌株大肠杆菌进行药敏试验,发现该细菌对头孢曲松,头孢噻肟,头孢他啶,阿米卡星,氟苯尼考等药敏感;通过对检测菌株葡萄球菌进行药敏试验,发现该细菌对阿莫西林,头孢噻肟,头孢哌酮,氨苄西林,氟苯尼考等药敏感。
  对病料进行解剖,发现主要以肺脏出血为主。对送检病料进行分子生物学检测,对水貂肺炎主要病原菌分析,表明克雷伯氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和葡萄球菌的感染率比较高,大多数对阿米卡星、头孢类的药物敏感,可根据病情进行对症治疗。
  本试验初步了解山东省各地区水貂出血性肺炎的病原菌的感染率,了解水貂出血性肺炎主要细菌病的病原及耐药性,为进一步防治水貂出血性肺炎提供依据。
[硕士论文] 赵姬臣
动物遗传育种与繁育 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:狍(Capreolus pygargus)是我国重要的经济动物,具有广泛的市场应用前景。本研究通过Illumina/Solexa测序平台进行狍茸顶端组织转录组测序,使用自体组装软件Trinity对测序短序列reads进行从头组装,建立狍茸顶端组织转录组数据库。并与蛋白数据库Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG进行序列比对、功能注释及代谢通路分析;与已有的梅花鹿鹿茸顶端组织转录组数据库进行简单比较分析;在此基础上,我们选出癌症通路中ANXA-2和PTN功能基因进行克隆测序,获得了包含这两个基因全部编码区的cDNA序列,并与转录组测序数据库中拼接组装得到的这两个Unigene的cDNA序列进行比对,以佐证转录组测序数据库的准确性。从转录组水平开展对狍茸的研究,更有利于揭示狍茸的生长机制,为提高狍茸产量和质量提供理论依据。
  1、狍茸顶端组织转录组测序共得到的5千多万个高质量短序列reads,采用组装拼接后共获得两端不能再延长的Unigenes36865个,平均长度932nt,N50值为1579m,接近98%的序列测序质量值均在Q20(碱基测序错误率为1%)。
  2、在数据库比对及功能基因的注释过程中,发现与Nr数据库比对上的Unigenes共22983条,可以直接确定其CDS区及序列方向。其余序列用ESTscan软件进行编码区预测,结果表明有510条可能为新的蛋白编码序列;在COG功能分类,共有8668条Unigenes被归类到25个功能类别中;通过GO功能分类,共有18273条Unigenes被归类到61个功能类别中;通过KEGG代谢通路分析,共有17284条基因注释到258个信号通路中。
  3、对狍茸转录组数据进行整体筛选分析,按照FPKM值从高到低的顺序排序发现,表达量较高的一类蛋白是胶原蛋白,在胶原蛋白中表达量最高的是COL1A1、COL1 A2,COL16A1、COL9A1、COL27A1。并且发现至少141种与生长相关的基因及受体,生长相关高表达基因中高表达的有TGFB3、IGF、TGFBP、IGF4、CTGFP、PDGFR等;挑选出至少259种转录因子,这一类与转录相关高表达的基因中,表达量最高的为ATF4、TFAP1、GTFIIF、SNAI2、JunB、TFp65等;挑选出至少384种细胞外基质,大部分的细胞外基质主要集中在胶原类成分。
  4、克隆包含ANXA-2与PTN基因全部编码区的cDNA序列,分别编码339和168个氨基酸。与转录组数据库所测得序列进行比对,相似性分别为99.7%和99.0%,进一步佐证了本转录组测序结果的准确性。
[硕士论文] 梁宇祥
特种经济动物饲养 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:我国的水貂养殖起源于上个世纪五十年代,目前我国已经成为全球水貂养殖数量最多的国家。虽然我国是水貂养殖大国,但还不是水貂养殖强国。相比于欧美等养殖发达国家,我国水貂养殖无论是从繁殖育种、饲料营养、饲养管理,还是疾病防治等方面都还很落后。养殖方式多样化,机械化程度低,大量依靠人力。相对于国外发达国家的标准化养殖,庭院式养殖数量较多仍然是我国水貂养殖的一大特点。
  山东是我国毛皮动物养殖量最大的省份,其中水貂养殖量更是占全国的60%以上,庭院式养殖也占有较大的比例。水貂皮市场行情具有一定的周期性,2012年价格达到高峰之后,近年来价格逐年下降。行情不好的同时,养殖中出现的问题也越来越多。2014年初,山东某水貂庭院养殖密集区有许多养殖者反映水貂养殖中出现生长阻滞、脱毛、毛皮质量差的现象。为探究导致其生长阻滞、脱毛等现象的原因,于2014年至2015年期间多次对该地区进行走访调研。调研采用实际走访的方式,对养殖中水貂的繁殖、饲料、疾病、饲养管理等多方面进行了解。针对当地养殖户反映生长阻滞、脱毛等情况,在当地具有代表性的庭院式养殖场对水貂饲料、血液、肝脏等进行取样。带回实验室后对饲料营养,肝脏中重金属含量、水貂阿留申病、附红细胞体病等可能造成生长阻滞的疾病进行检测。
  根据走访与实验室检测结果综合分析得出,造成该地区养殖水貂生长阻滞、脱毛现象的主要原因是饲料中营养水平偏低、水貂阿留申病和附红细胞体病高发。此外,养殖场的环境卫生、饲养管理不规范也给疾病的发生提供了一定的条件。根据所出现的问题并结合当地实际情况,提出一些解决问题的方法和水貂养殖的一些建议供广大水貂养殖者参考。
  本论文从生产中出现的实际问题入手,与生产实践紧密相连,旨在解决水貂养殖中出现的一些问题,也是首次主要针对我国存在的庭院式养殖方式出现的问题进行分析。未来我国水貂养殖的发展也要和国际发达国家接轨,向着集约化、科学化、标准化方向发展。早日实现我国由水貂养殖大国变为水貂养殖强国。
[博士论文] 高玉花
野生动植物保护和利用 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:胎盘是哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官,具有物质交换、防御、合成和免疫等功能。随着东北虎基因组数据的公布,东北虎表观遗传学成为一个可开拓的前沿领域。MicroRNA是一类由内源基因编码的长度约为18~25个核苷酸(nt)的非编码单链RNA分子,其主要参与基因转录后的表达调控。本研究应用高通量测序技术对东北虎胎盘组织进行microRNA表达谱及转录组分析,并对胎盘组织特异microRNA进行功能验证,得到以下结论:
  1、利用RNA-seq技术对东北虎胎盘组织进行small RNA测序,去除接头和低质量序列后,将 clean reads与东北虎基因组(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/term=tiger)进行比对、注释及表达分析。获得东北虎胎盘组织microRNA表达谱,其中包括465个microRNA,经聚类分析分为41个簇(cluster)和35个家族(family),其中胎盘组织特异性的microRNA有microRNA-424,microRNA-450,microRNA-495,microRNA-376a,microRNA-184,microRNA-369和microRNA-503,利用TAM tools(http://www.cuilab.cn/tam)进行功能分析,其功能主要包括胎儿生长发育、血管生成、骨再生、肌肉发育、凋亡与抗凋亡、细胞增殖与分化、粒细胞生成、免疫反应应答和激素分泌调节等。
  2、对东北虎胎盘组织转录组进行生物学分析,包括其表达基因的GeneOntology(GO)和Clusters of Orthologous Groups of proteins(COG)分析。其中21103条东北虎基因在GO分析中被注释到45个GO terms,有8462条基因在COG中被注释、分类。利用靶基因预测工具TargetScan和miRanda对靶基因在东北虎胎盘组织转录组上进行预测,获得东北虎胎盘组织microRNA调控靶基因,描述了microRNA靶基因在胎盘组织中生物学功能,同时绘制了microRNA调控靶基因实现胎盘组织功能的分子网络图。
  3、选取胎盘组织中特异的microRNA,利用Real time PCR、组织原位杂交和Westen blotting分析microRNA-424及其靶基因MAP2K1在东北虎和家猫胎盘组织中的表达,结果显示东北虎胎盘组织中microRNA-424的表达显著低于家猫胎盘组织(**p<0.01),而其靶基因MAP2K1的表达在东北虎胎盘组织中显著高于家猫胎盘组织(**p<0.01)。
  4、通过靶位点突变及双荧光素酶分析得出MAP2K13'UTR区域microRNA-424靶位点突变后,荧光素酶活性无显著差异,而未突变组荧光素酶活性显著下调(**p<0.01),证实microRNA-424可直接靶向结合MAP2K13'UTR区域,并在东北虎成纤维细胞中过表达microRNA-424后,Westen blotting证实microRNA-424可显著下调MAP2K1的蛋白表达量(**p<0.01)。为验证microRNA-424在东北虎成纤维细胞中的生物学功能,Westen blotting评估侵染microRNA-424病毒颗粒后的东北虎成纤维细胞MAP2K1基因下游ERK1/2的磷酸化及蛋白表达量,MTT法评定东北虎成纤维细胞增值能力,结果证实,microRNA-424不但直接调节MAP2K1的转录表达,同时影响下游ERK1/2的表达,从而起到抑制细胞增殖分化的作用。
  综上所述,microRNA-424及其靶基因MAP2K1在东北虎与家猫胎盘组织中的表达差异可能与猫科动物体型大小有关,该实验结果初步证明东北虎、家猫间的体型大小与microRNA-424的转录后调控相关,但具体调控机制仍需要在动物内体进行基因敲除或突变实验来证实。
[硕士论文] 吴娟
林业 华南农业大学 2016(学位年度)
摘要:城市化浪潮给城市人居环境和城市居民的健康带来了相当大的压力。为破解这些难题,生态城市建设为城市发展提供了基础方案和思路。而制定生态城市野生动物保护效果评价标准与指标,是规范野生动物保护的基础,是实现野生动物在生态系统中的服务功能的必要保证。
  目前,受地域环境、野生动物物种等影响,野生动物保护评价标准和指标体系仅限于在野生动物保护计划制定中需要考虑的方面,并提供逻辑框架,但相关标准指标的可操作性仍然有待商榷,尤其是现阶段在建设生态城市中,如何进一步制定野生动物保护评估标准,既有利于野生动物资源的保护,又能充分发挥其在生态系统中的功能性作用。
  研究通过文献综述、专家咨询、实地调查等方法,以海珠生态城建设——海珠湿地生态恢复为对象,从保护野生动物、野生动物在生态城市生态系统中的服务功能及其保护效果评价等方面,选取16项指标,建立了海珠生态城野生动物保护效果评价体系,并通过层次分析和模糊数学方法进行了评价。
  结果显示:
  (1)共记录到两栖动物7种,爬行动物9种,哺乳动物5种,鸟类64种;
  (2)2015年不同季节鸟类物种数和个体数均大于2014年的,2013年启动的海珠湿地恢复项目实施后,海珠湿地鸟类多样性呈现增加的趋势;
  (3)海珠生态城建设过程中,野生动物保护成效综合评估值为63.32,处于中等偏上水平。
  海珠湿地内植物种类单一、城市建设过程中的噪音、水体等污染,制约了野生动物的生存,而适当控制周边建筑密度及容积率、控制游客量,科学合理进行生境改造,将有利于野生动物种群数量的进一步恢复。
[硕士论文] 邬丹
野生动植物保护与利用 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:黑熊(Selenarctos thibetanus)的研究领域广泛,涉及野外黑熊资源的调查、种群分布、种群数量、生境选择、食性分析、遗传基因、遗传多样性研究。行为方面多为单一行为或者繁殖期行为的研究,目前还未发现对圈养条件下取胆与非取胆黑熊行为规律的差异性分析的研究。
  本文作者对24头成年圈养黑熊(12取胆、12非取胆)进行了为期3个季度的行为观察,先利用Excel2003统计了取胆与非取胆黑熊昼间行为的时间分配和行为节律,再利用SPSS18.0检验不同季节、不同年龄段、不同性别两者昼间行为的差异性。主要研究结果如下:
  1.通过预观察构建的圈养黑熊行为谱如下:休息、食粪、饮水、排粪、排尿、走动、咂舌、攀爬、舔舐、搔痒、啃趾甲、张望、嗅闻、玩耍、示警、打斗、戏水、刻板动作、探究、育幼、繁殖和其他,对相关行为进行归类,即休息、饮水、排遗、运动、警戒、体表护理、社群、繁殖、刻板和其他行为。
  2.圈养取胆黑熊冬季、春季、夏季昼间绝大部分时间都用于休息行为((55.88±9.64)%、(46.14±9.61)%、(38.19±8.40)%)、刻板行为((20.36±6.01)%、(30.21±6.83)%、(34.96±5.29)%)、运动行为((8.31±2.12)%、(8.50±1.47)%、(8.74±1.82)%)和警戒行为((8.11±1.77)%、(8.34±1.95)%、(10.32±2.56)%);圈养非取胆黑熊冬季、春季、夏季昼间绝大部分时间也都用于休息行为((44.98±8.63)%、(43.94±12.36)%、(39.20±10.82)%)、刻板行为((30.35±5.21)%、(32.99±7.06)%、(34.39±5.92)%)、运动行为((8.96±1.39)%、(8.38±1.32)%、(8.18±0.77)%)和警戒行为((8.73±1.41)%、(7.66±2.21)%、(949±3.66)%)。
  3.4-6岁取胆黑熊的主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(43.87±7.59)%、(26.55±5.10)%、(9.93±2.23)%和(9.98±2.74)%;4-6岁非取胆黑熊的主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(39.37±8.03)%、(36.60±5.91)%、(8.65±0.95)%和(8.62±1.77)%。7-9岁取胆黑熊的主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(49.60±7.88)%、(30.47±5.35)%、(7.09±1.47)%和(7.86±1.58)%;7-9岁非取胆黑熊的主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(46.05±14.35)%、(28.55±7.65)%、(8.36±1.20)%和(8.64±2.87)%。
  4.雌性取胆黑熊的主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(60.41±9.07)%、(17.81±5.89)%、(6.81±1.63)%和(10.13±2.27)%;雌性非取胆黑熊的主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(53.70±7.81)%、(21.47±4.30)%、(8.04±0.84)%和(10.75±2.87)%。雄性取胆黑熊的
  5.主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(33.06±8.12)%、(39.20±4.96)%、(10.22±1.11)%和(7.71±1.76)%;雄性非取胆黑熊的主要行为(休息、刻板、运动、警戒)所占时间比例分别为(31.71±13.50)%、(43.68±7.60)%、(8.97±1.69)%和(6.51±1.75)%。
  6.冬季取胆与非取胆黑熊昼间刻板行为(F=11.037,P=0.006<0.01)差异极显著,休息行为(F=4.958,P=0.046<0.05)、体表护理行为(F=5.518,P=0.037<0.05)和其他行为(F=6.879,P=0.022<0.05)差异显著;春季取胆与非取胆黑熊昼间繁殖行为(F=9.720,P=0.009<0.01)差异极显著;夏季取胆与非取胆黑熊昼间所有行为均差异不显著。
  7.4-6岁取胆与非取胆黑熊昼间排遗行为(F=66.372,P=0.000<0.01)、体表护理行为(F=43.645,P=0.000<0.01)和刻板行为(F=11.598,P=0.005<0.01)差异极显著,社群行为(F=8.037,P=0.015<0.05)差异显著;7-9岁取胆与非取胆黑熊昼间排遗行为(F=22.420,P=0.000<0.01)和体表护理行为(F=23.815,P=0.000<0.01)差异极显著。
  8.雌性取胆与非取胆黑熊昼间社群行为(F=43.878,P=0.000<0.01)差异极显著;雄性取胆与非取胆黑熊昼间排遗行为(F=6.580,P=0.025<0.05)差异显著。
  对结果进行讨论分析表明,圈养条件下黑熊的行为规律与野外条件下不同,除休息行为占很大比例外,刻板行为也很强烈,运动行为相对较少,这与其他圈养动物类似;行为节律表现出一定的规律性,并受到季节、年龄、性别、是否取胆等因素的影响。
[硕士论文] 安天怡
特种经济动物饲养 东北林业大学 2016(学位年度)
摘要:本文采用非损伤取样法,对圈养条件下的泌乳期母梅花鹿和仔鹿的免疫状态进行了研究,以10d为间隔测定了双阳鹿场12只泌乳期母鹿分娩后10~90d及12只仔鹿出生后10~130d粪便中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)的含量;测定了左家鹿场人工哺育的3只仔鹿20~50d粪便中三种免疫球蛋白的含量;测定了太阳岛鹿苑泌乳期1只母鹿10~90d和1只仔鹿30~90d粪便中三种免疫球蛋白和皮质醇激素的含量。结果如下:
  1.自然哺育的母鹿分娩后40d内IgG、IgM和IgA含量呈上升趋势,分娩后50~90dIgG和IgA含量显著下降(p<0.01),IgM含量下降后又略有回升趋于稳定。
  2.自然哺育的仔鹿粪便中IgG、IgM和IgA含量在出生后40d内呈上升趋势,出生后50~80d内IgG波动后呈下降趋势,IgM含量较稳定,IgA第50d开始骤然下降(P<0.01),波动后趋于平稳。与断乳前比,断乳后IgG和IgM的含量极显著下降(P<0.01),IgA断乳后未出现显著下降。
  3.自然哺育的母鹿粪便中IgM与IgA、IgG呈极显著正相关(P<0.01),皮质醇与IgM、IgA间呈极显著的正相关(P<0.01);自然哺育的仔鹿粪便中IgG与IgM、IgA呈显著的正相关关系(P<0.05),皮质醇与IgG、IgA、IgM间呈显著的正相关关系(P<0.05)。
  4.20~50d人工哺育仔鹿粪便中IgG、IgM和IgA含量显著低于同期自然哺育的仔鹿(P<0.01)。
  5.梅花鹿是群居动物,单独饲养的母、仔鹿粪便中皮质醇含量显著高于群养母、仔鹿(P<0.01),单独饲养的母、仔鹿较群养母、仔鹿承受较大压力。
  通过测定粪便中三种免疫球蛋白的含量来评估泌乳期母梅花鹿及仔鹿的免疫健康状况,探讨母仔鹿之间免疫球蛋白的关系,同时为科学饲养梅花鹿提供基础。
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