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[硕士论文] 陶蓓蓓
生物工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本研究通过使用标准品结合三重四极杆质谱的针泵模式建立了氨基酸、肉碱、以及一些氨基代谢物的质谱检测方法。并且优化了液相色谱使用的色谱柱、流动相、梯度模式、柱温等参数,建立了最优的液相色谱分离方法。脂质靶向代谢组学使用的是液相色谱联用高分辨质谱平台。代谢物使用了脂质相关数据库并根据二级结构进行定性。并且使用了部分标准品进行验证。最终定性了300多种脂质代谢物。液相分离方法同样进行了优化。
  本研究针对建立的三种靶向组学检测方法,分别选用几种生物基质中不含有的所测代谢物的同位素或是同系物进行了随机的方法学验证。主要从检测限,定量限,线性,稳定性,精密度,回收率等方面验证方法的准确性与可靠性。结果显示,线性相关系数R2均大于0.999,日间日内精密度均小于5%。稳定性、精密度、回收率等也均满足靶向代谢组学实验要求。证明所建方法灵敏度高,准确性好,可以用于靶向组学研究。
  为了验证所建靶向组学方法的应用性,本研究使用建立的方法进行了生物基质的代谢组学分析。选用的生物基质为正常人与代谢综合征病人的血浆。仪器采集的数据使用相关软件进行数据处理与统计学分析。结果显示,代谢物检测结果有很好的稳定性与准确性。正常组与疾病组在氨基酸类、脂质类代谢物中有较大差异。
  综上所述,基于液相色谱-质谱联用平台,本研究建立了不同类型代谢物的靶向分析平台,并对建立的方法进行了实际生物基质的应用性研究。本研究所建立的靶向分析方法覆盖了氨基酸、肉碱、脂质等超过400种代谢物。这些代谢物涉及多条代谢通路,在生物体生长繁殖、保持它们的结构以及对外界环境做出反应等过程中都有重要作用。
[硕士论文] 柴梦亚
食品科学与工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:Kit配体(KITL)和神经氨酸苷酶(NA)均是单跨膜蛋白,前者通过与其受体Kit相互作用介导了细胞增殖、分化和存活等生命活动;后者在流感病毒的各个感染阶段中发挥着不同的作用。而这些功能得以实现的先决条件是形成正确的自组装体。有研究指出KITL通过其跨膜区形成了非共价二聚体,NA利用跨膜区的四聚体构象匹配远端头部的寡聚状态并进一步促进了整个NA分子的成熟。然而,关于KITL和NA跨膜区的潜在自组装机制尚不清楚。
  本论文利用粗粒化(CG)和全原子(AA)两种分子动力学模拟手段对KITL和NA跨膜区的自组装机制进行了研究。
  关于KITL跨膜区的研究,野生型KITL跨膜区在模拟过程中通过保守的SxxxGxxxG基序形成了一个稳定的非共价二聚体;二聚界面上的残基单突变模拟表明S11I,G15I和G19I的二聚能力相对于野生型KITL跨膜区有大幅度地下降,这进一步验证了SxxxGxxxG这一基序对KITL跨膜螺旋二聚体的重要性;比较野生型KITL和突变体Y22I中N-末端和C-末端的空间概率密度分布可发现野生型KITL的C-末端具有最小的空间自由度,磷酸相对于第22位残基的径向分布显示在野生型KITL中距离酪氨酸1nm处磷酸出现的频率最高,而突变体Y22I中未观察到第22位残基附近有磷酸积累,以上结果结合起来表明Tyr22通过对磷酸的锚定作用促进了KITL跨膜区二聚体的形成;Pro7则通过改变局部螺旋结构诱导KITL跨膜区二聚能力的下降。
  关于NA的研究,NA跨膜区的自组装过程是先形成二聚体,再依次形成三聚体和四聚体,并且最终以四聚体形式存在;aN5(禽类的第五个NA亚型)跨膜区四聚体的对角线距离均为12.7±0.2(A),相邻螺旋间的二面交叉角均为-30°,这两者结果结合起来表明NA跨膜区四聚体是一个对称的右手装配;组合突变体S14LN21LH25LS28L和单突变体H25Q的模拟结果揭示了NA跨膜区四聚体的动力学影响因素,即由Ser14、Asn21、His25和Ser28组成的极性界面对NA跨膜区四螺旋束来说是必不可少的,此外,His25残基侧链朝向四螺旋束的极性中心形成了约束环进而促进了四螺旋束的稳定性。
[硕士论文] 吴佳
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:利用CRISPR/Cas9系统敲除L02和L6细胞的TBC1D15基因,从细胞水平上研究TBC1D15与糖代谢的关系,为新型降糖药物设计提供潜在靶标。
  方法:首先针对大鼠Tbc1d15基因的CDS序列设计并构建5个包含sgRNA序列的pX459重组载体。通过MTT实验确定L02和L6细胞的最佳嘌呤霉素筛选浓度,随后用已有的pX462重组质粒转染L02细胞,用pX459重组质粒转染L6细胞,利用T7E1核酸内切酶检测敲除效率,用有限稀释法筛选出单克隆细胞株,然后利用Western Blotting和基因组PCR分别验证TBC1D15在蛋白水平和基因组水平的变化。在功能研究方面,通过2-NBDG葡萄糖荧光类似物培养,经流式细胞仪检测糖吸收情况。利用Western Blotting技术检测了胰岛素刺激下野生型和TBC1D15-/-细胞的GLUT4、Rab7和LC3B的表达变化。筛选能在10~14d杀死全部L02和L6细胞的最低G-418浓度,构建HA-GLUT4-EGFP表达载体,转染野生型和TBC1D15-/-L02细胞,筛选稳转细胞株。利用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察野生型和TBC1D15-/-L02细胞的Rab7的分布以及分别和GLUT4及Lamp1的共定位情况。
  结果:MTT实验获得L02和L6细胞的最佳嘌呤霉素筛选浓度分别为1.5μg/mL和5.0μg/mL。T7E1核酸内切酶检测敲除效率的结果显示,pX459-1、pX459-2、pX459-3和pX459-4的敲除效率依次为56%、28%、45%和28%。Western Blotting未检测到L02和L6单克隆细胞株表达TBC1D15蛋白,且基因测序结果进一步证明细胞株已成功敲除TBC1D15基因。经流式细胞仪检测,TBC1D15-/-L02和L6细胞的荧光信号强度明显降低,证明其糖吸收能力减弱。Western Blotting结果显示TBC1D15-/-L02和L6细胞的GLUT4和LC3II水平下调,Rab7表达没有变化。细胞免疫荧光结果表明TBC1D15-/-L02细胞内Rab7发生聚集,且与GLUT4及Lamp1的共定位增加。
  结论:与HeLa细胞的结果相同,未癌变的细胞中敲除TBC1D15基因也会导致细胞摄取葡萄糖能力下降。TBC1D15通过调节Rab7活性介导GLUT4囊泡从核内体运输到溶酶体。敲除TBC1D15基因后更多GLUT4被分拣至溶酶体降解,从而使细胞糖摄取能力降低。另外,TBC1D15-/-细胞LC3Ⅱ水平下降,意味着TBC1D15基因可能与细胞自噬有关。
[硕士论文] 付涛
临床检验诊断学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  体外原核表达人降钙素原(Procalcitonin,PCT)基因,获取高纯度PCT重组蛋白;优化PCT重组蛋白表达条件;制备鼠源性多克隆抗体;分析临床PCT检测的主要影响因素并探讨PCT重组蛋白最佳储存介质。
  方法:
  根据NCBI上人降钙素原的基因序列,利用Primer Premier5.0设计引物,PCR技术扩增全长序列,经DNA胶回收、质粒提取、基因连接和酶切鉴定等步骤,构建原核表达重组载体PCT/pET-22b(+)。将该重组质粒转化至E.coli BL21并诱导表达,观察诱导剂浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)、诱导时间(4h、8h、12h、16h、20h)、诱导温度(22℃、27℃、32℃、37℃)及转速(80、120、160、200、250 r/min)等对蛋白表达的影响。采用镍柱亲和层析法纯化PCT重组蛋白,并用Western blotting和胶体金法对其鉴定。
  纯化的PCT重组蛋白与等体积佐剂充分研磨乳化后,免疫Balb/c小鼠,第三次免疫7天后采集血液并分离血清,用ELISA法检测血清抗体效价。
  分析血液标本类型、保存时间和温度对PCT检测的影响;以生理盐水、小牛血清和PBS稀释PCT重组蛋白,分别检测保存5d、10d、20d、30d的PCT浓度变化,并进行统计学分析。
  结果:
  琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物约350 bp。同源性比对分析说明PCT基因片段(348 bp)成功插入pTG19-T载体,未出现碱基突变。用BamH I和HindⅢ对重组表达载体PCT/pET-22b(+)酶切,得到约350 bp和5500 bp片段。超声波破碎菌体后,SDS-PAGE电泳显示PCT重组蛋白以可溶性形式存在,Mr约14KD,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。Western blotting和PCT胶体金法结果呈阳性,显示重组蛋白含组氨酸标签(His-tag),并能与PCT抗体反应。对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE电泳,结果显示:诱导时间12~20h、诱导剂终浓度为0.2~1.0 mmol/L、诱导温度为22℃、转速为80~160r/min时,上清液中PCT蛋白表达量较高。
  用PCT重组蛋白免疫Balb/c小鼠,第三次免疫7天后血清抗体效价均>1:512000。
  血液标本在保存过程中,PCT会出现下降。25℃下血浆管放置4h(下降4.1%)和全血管放置2h(下降5.4%),在4℃下血浆管放置4h和全血管放置2h后,PCT检测值之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。在小牛血清中PCT重组蛋白4℃可保存20d,结果不变,显著优于生理盐水和PBS。
  结论:
  成功构建PCT/pTG19-T重组克隆载体和PCT/pET-22b(+)重组表达载体,PCT重组蛋白以可溶性形式存在,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。最佳诱导表达条件:22℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、12h和160 r/min。PCT重组蛋白具有很强的免疫原性,易获得高效价PCT鼠源性多克隆抗体。PCT检测血液标本保存不要超过4h,最好在2h内检测,小牛血清是储存PCT重组蛋白的首选介质。
[硕士论文] 郭小娟
无机化学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:中心蛋白是EF-hand超家族蛋白成员之一,是一种分子量比较小(20kD)的、酸性钙离子结合蛋白。最初,中心蛋白是在单细胞绿藻中作为纤维收缩的组成成分被发现的。后来,中心蛋白在许多真核生物中发现,包括高等植物、酵母、脊椎动物和人类,在不同的细胞过程中,扮演着重要的角色。
  人体中有四类不同的中心蛋白,分别为centrin1,centrin2,centrin3和centrin4(缩写为HsCen1-HsCen4),四种中心蛋白都与视网膜相互连接的鞭毛相关,参与视力的信号转导。但是四种中心蛋白仍有不同的功能,因此可能有不同的生物意义。本文在研究HsCen2的基础上,进一步研究了HsCen1的如下性质:
  首先,研究了HsCen1磷酸化前后与金属Tb3+和Ca2+的相互结合:Ca2+与HsCen1的反应为放热、焓驱动反应;Tb3+与HsCen1的反应为吸热、熵驱动反应;每摩尔HsCen1可以结合4摩尔Tb3+,蛋白与Tb3+结合顺序为Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。HsCen1磷酸化后减弱了与Ca2+和Tb3+的结合,结合常数减小。
  HsCen1结合金属离子后,构象改变。HsCen1磷酸化后引起的构象变化减弱。
  其次,通过共振光散射光谱法研究了HsCen1的聚集及其影响因素。结果表明:金属离子可以诱导HsCen1聚集,而且Tb3+引起的聚集明显强于Ca2+引起的聚集;HsCen1浓度、不同稀土离子、离子强度以及TNS等都可以影响HsCen1的聚集:HsCen1的聚集程度与蛋白本身的浓度呈正相关;随着金属离子的半径增大,金属离子引起蛋白的聚集减弱;随着KCl盐浓度的增大,Tb3+引起的HsCen1聚集减弱;随着TNS与HsCen1比例的增加,Tb3+引起的HsCen1聚集减弱。HsCen1磷酸化后,HsCen1的聚集程度减弱,HsCen1聚集可能是由疏水作用和静电作用共同调控的。
  最后,通过等温滴定量热法和荧光发射光谱法研究了HsCen1磷酸化前后与R18-Sfi1的相互作用。结果表明:二者之间是焓驱动的放热反应;每摩尔HsCen1可以结合1摩尔R18-Sfi1,不依赖Ca2+,但是Ca2+的存在,增强了二者之间的相互作用;HsCen1磷酸化后,必须依赖Ca2+才可以与R18-Sfi1结合,而且磷酸化后,减弱了二者之间的亲和力。
[硕士论文] 王红帅
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:脂肪生成过程中受到众多转录因子调控,过去二三十年大量研究证实,虽有大量转录因子被鉴定出来参与脂肪的发育调控,但机制仍不清晰。课题组前期在SV细胞诱导成脂分化过程中,利用RNA-seq和生物信息学分析,筛选出一个新的转录因子Zfp217可能参与调控脂肪生成。因此,本文以3T3-L1前脂肪细胞为研究材料,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Zfp217基因敲除单克隆细胞系,探讨Zfp217对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响;此外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Zfp217基因敲除小鼠,进一步验证Zfp217与脂肪形成的关系。
  本研究主要内容包括:⑴筛选有剪切活性的sgRNA。首先利用sgRNAcas9_3.0.5软件和http://crispr.mit.edu/网站针对Zfp217基因第一外显子设计4个sgRNA,成功构建了CRISPR/Cas9系统(pX458)载体,利用T7E1酶切和DNA测序等方法初步鉴定出sgRNA-2、sgRNA-3及sgRNA-4有剪切活性。⑵构建Zfp217基因敲除单克隆细胞系,研究Zfp217对3T3-L1细胞成脂分化的影响。将含有sgRNA-4的pX458载体转染3T3-L1细胞,获得了纯合敲除Zfp217单克隆细胞系。采用油红 O染色,观察 Zfp217基因敲除单克隆细胞系,发现纯合Zfp217基因敲除细胞系比对照组细胞的脂滴数量明显减少;Western Blot分析脂肪标志基因表达发现,敲除Zfp217明显抑制脂肪标志基因PPARγ和aP2蛋白表达。以上结果表明,敲除Zfp217能够抑制3T3-L1细胞的成脂分化。⑶制备Zfp217基因敲除小鼠。首先PCR扩增sgRNA-2和sgRNA-4体外转录模板,利用体外转录试剂盒将其进行体外转录及纯化,运用原核显微注射方式将sgRNA-2、sgRNA-4及Cas9 mRNA混合注射到小鼠受精卵并发育成囊胚,然后将其胚胎移植到假孕母鼠子宫内,21 d后共获得15只小鼠。⑷Zfp217基因敲除阳性小鼠的鉴定。F0代小鼠中,利用PCR基因分型和DNA测序方法获得10只阳性敲除的小鼠,结果表明Zfp217基因敲除小鼠构建成功。
[硕士论文] 张宇良
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:真核生物的细胞周期通过连续激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依赖性激酶复合物活性进行调控。在哺乳动物细胞周期中,周期蛋白A和周期蛋白B通过泛素化降解途径使靶蛋白去磷酸化,促进有丝分裂中期向后期转化;周期蛋白D通过磷酸化Rb蛋白终止G1期,促进细胞G1/S期转化。
  不同的生物体包含的周期蛋白类型不同,单细胞真核生物纤毛虫表现出周期蛋白多样性,表明单细胞生物体内存在精细的调控机制。嗜热四膜虫含有1个小核和1个大核,小核为二倍体,在营养生长期转录沉默,大核为多倍体,转录活跃,营养充足时细胞进行无性生殖,饥饿条件下进行有性生殖。有性生殖过程中,小核进行减数分裂,产生4个原核,其中3个降解,另外1个原核进行有丝分裂产生配子核,配子核交换,融合产生合子核。合子核通过有丝分裂产生新的大核和新小核,完成有性生殖。嗜热四膜虫含有34种周期蛋白,其中Cyc2, Cyc17和Cyc28在四膜虫小核减数分裂期特异表达,Cyc2调控了小核减数分裂的起始,而Cyc17对减数分裂后期的起始和同源染色体的分离是必需的,但是Cyc28的功能目前并不清楚。
  本研究首次从嗜热四膜虫鉴定了有性生殖特异表达的周期蛋白基因CYC28,对其功能进行了分析,主要结果如下:
  1. CYC28生物信息学分析基于四膜虫大核基因组数据库(http//:www.ciliate.org)和功能基因组数据库(http://tfgd.ihb.ac.cn)分析表明嗜热四膜虫 CYC28(TTHERM_00082190)基因全长1174 bp,开放阅读框801 bp,预测编码266个氨基酸。RT-PCR产物测序分析表明CYC28序列正确。序列比对分析N端有一个由121个氨基酸组成的保守性周期蛋白框,周期蛋白框后有一个由9个氨基酸残基组成的破坏框。周期蛋白框同源序列分析表明Cyc28可能属于周期蛋白B3亚家族。Microarray表达谱和实时荧光定量检测结果表明CYC28在营养生殖期和饥饿期不表达,在有性生殖期特异表达,4 h时表达量最高。
  2. HA-Cyc28的细胞定位及表达分析为研究Cyc28的功能,构建带有HA标签的表达载体 pXS75-CYC28,该表达载体由MTT1启动子调控,在Cd2+诱导下高效表达,经基因枪转化,巴龙霉素浓度梯度筛选,选择稳定的细胞株。免疫荧光定位表明,Cyc28在有性生殖早期定位于细胞质,在8 h定位在凋亡的旧大核上,表明Cyc28可能通过泛素化途径,在凋亡的亲本大核中降解或者直接参与了亲本大核的凋亡。蛋白免疫印迹结果表明,HA-Cyc28在四膜虫有性生殖0 h没有表达,2 h后表达上调,在4h和8h蛋白条带变弱,可能部分发生泛素化降解,在16h配对分开后蛋白质消失。
  3.敲减CYC28对有性生殖进程无显著影响 CYC28是有性生殖期特异表达的基因,为进一步分析Cyc28在嗜热四膜虫有性生殖过程中的功能,我们首先构建了CYC28的敲除载体pNeo4-Δ-CYC28,转化不同交配型的四膜虫细胞,通过同源重组,筛选得到CYC28敲减细胞株。同野生型细胞相比,敲减株在有性生殖过程中,细胞配对,小核拉伸,小核减数分裂以及原核选择,合子核的有丝分裂都未见异常。由于未能获得CYC28完全敲除的突变体细胞株,进一步构建了CYC28的干扰质粒pCYC28hpCYH,该质粒由Cd2+调控表达。干扰质粒通过基因枪转化四膜虫,经放线菌酮抗性梯度筛选,获得不同交配型的突变体细胞株。qRT-PCR检测得到稳定的干扰株。观察四膜虫在有性生殖过程中核发育,结果表明小核发育过程未受影响,细胞配对,小核拉伸,减数分裂,配子核交换,新大核形成以及结合后的个体均正常,表明Cyc28的敲减对有性生殖的进程无显著影响。
  4.过表达Cyc28影响有性生殖期原核的有丝分裂在突变体细胞OE-CYC28-B和OE-CYC28-C配对后,CYC28基因的转录水平比野生型提高约10倍,观察有性生殖过程,过表达Cyc28引起原核有丝分裂进程的异常。同野生型相比,在有性生殖3.5h,45.5%细胞第一次减数分裂后期出现浓缩的染色体,未见染色体解聚后的小核;在4h,36.5%的细胞停留在第一次减数分裂后期,31.5%细胞进行的第二次减数分裂,小核松散;而在6h,大多数细胞选出的小核无法进行有丝分裂;在8h,45.3%细胞中未出现新大核,在12 h,未出现发育完成的两个大核一个小核的细胞。过量的外源Cyc28导致细胞核发育异常,原核有丝分裂受阻,有性生殖未能完成。
  本研究首次鉴定了嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC28,实时荧光定量PCR表明CYC28在有性生殖期特异表达。敲减CYC28不影响细胞的发育,而过表达CYC28导致细胞有性生殖过程小核有丝分裂异常,暗示它的正常表达和降解对原核有丝分裂的完成是必需的。进一步获得CYC28的敲除株,有望揭示Cyc28在嗜热四膜虫生殖过程中具体功能,完善周期蛋白在纤毛类原生动物中的复杂调控机制。
[硕士论文] 王冰花
生物医学工程 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)是一种十分重要的生命活动调控方式,可以改变蛋白质的结构并完善蛋白质的功能。因此深入研究蛋白质翻译后修饰的原理、种类、作用机制对于理解人类疾病的发病机制具有重要意义。
  近年来,随着实验技术的不断发展,积累了大量的蛋白质翻译后修饰位点数据,极大地推动了蛋白质翻译后修饰的研究进展。然而实验方法往往耗时耗力且成本较高,因此有必要发展高效、精确的计算方法预测翻译后修饰位点,为后续实验工作提供有用的参考信息。现有的计算方法大部分使用蛋白质氨基酸序列信息进行预测,忽视了蛋白质翻译后修饰间的功能联系信息。有研究表明insituPTM指的是相同蛋白质同一个位点上发生多种翻译后修饰类型,可以反映出翻译后修饰间的功能联系。因此由多位点-多修饰相互作用关系的insituPTM启发本文从磷酸化相关位点-修饰网络的角度充分考虑网络拓扑结构信息,进而应用于翻译后修饰位点预测中来。本文主要研究内容如下:1、利用多种翻译后修饰数据库中收集的丝/苏/酪氨酸位点上的翻译后修饰位点数据,构建了磷酸化相关位点-修饰网络。在该网络的基础上,提出了基于资源配置的网络链路预测算法SMNBI用于磷酸化位点预测。该算法主要利用网络中已知的链路信息对未知的位点与修饰相互作用关系进行预测。将SMNBI算法与现有的网络链路预测算法及磷酸化位点预测方法进行比较,结果表明磷酸化相关位点-修饰网络在磷酸化位点预测中发挥重要作用,能够大幅度提高预测精度。
  2、为解决磷酸化相关位点-修饰网络中孤立节点的预测问题,本文进一步提出了多核支持向量机算法MK-SVM用于全面预测丝/苏/酪氨酸位点上的多种翻译后修饰类型。首先采用高斯核函数和氨基酸置换矩阵BLOSUM62分别设计了高斯互作谱相似性核和蛋白质局部序列相似性核,然后通过线性加权组合核函数的方式输入到SVM进行训练和预测。MK-SVM算法不仅有效解决了磷酸化相关位点-修饰网络中孤立节点的预测问题,而且可对丝/苏/酪氨酸位点上的多种翻译后修饰进行预测。与多种常用的翻译后修饰预测方法的比较结果显示,该算法对于磷酸化、O-GlcNAc、硝基化、硝化等翻译后修饰类型均取得了良好的预测性能。
  
[硕士论文] 班琳
生化与分子生物学 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:因为后基因组时代的到来,蛋白质的表达以及蛋白质间互相作用网络的研究和分析变得越来越重要。近年来,很多研究发现异质性是细胞过程固有的,包括干细胞的分化,发育以及免疫应答等。为充分了解复杂的细胞群体中多样且很罕见的蛋白质行为,迫切需要建立一种高通量的单细胞水平的蛋白质组学分析方法。常规分析单细胞蛋白质组学的方法主要有流式细胞术以及质谱等。因为无法准确记录单细胞的动态过程,这些分析方法在应用上有很大的局限性。微流控芯片以可精确操控,通道尺寸与单细胞的大小完美相当等优点,在单细胞分析中占有一定优势。
  因此,本文自行搭建了一种聚丙烯酰胺凝胶芯片电泳-激光诱导荧光实时成像系统,用来对单细胞水平的蛋白组进行通量化的快速分析。结合激光诱导荧光实时系统,自行设计和制作了单细胞进样平台和简易水平电泳装置,并对进样通道的宽度和厚度、细胞裂解的方式和时间、施加电压的大小和时间等条件进行了摸索和优化。
  利用上述平台,通过具有穿膜能力的特异性ABP荧光探针标记细胞内半胱氨酸组织蛋白酶,采用单细胞水平和群体细胞水平的凝胶电泳对比,以研究单细胞中某些蛋白质的表达异质性;此外通过可稳定遗传的融合蛋白探针CD3标记单细胞溶酶体中半胱氨酸蛋白酶,来探究单细胞的半胱氨酸蛋白酶的差异性表达。研究结果发现上述搭建的系统可以在1min内完成蛋白质的分离,在2h内完成单细胞蛋白组的快速分析和实时成像;还发现单细胞中半胱氨酸蛋白酶的表达具有一定的差异。
  本文搭建的基于聚丙烯酰胺凝胶的芯片电泳以及激光诱导荧光实时成像系统实现了对单细胞内蛋白质的通量分析,为以后研究和分析单细胞蛋白质组学提供了新的思路和方法。
[硕士论文] 李丽岑
生物化学与分子生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:不健康的生活方式,是导致非酒精性脂肪肝的重要原因。现有研究表明,急性饥饿容易诱导肝细胞脂肪变性,而间歇性饥饿可以减轻体重,延长寿命。因此,本文旨在探讨间歇性饥饿是否可以改善急性饥饿诱导的肝细胞脂肪变性。
  方法:以小鼠为研究对象,首先对小鼠进行一段时间的间歇性饥饿训练,然后进行急性饥饿处理,最后分离肝脏组织进行生物化学分析和分子生物学分析,探索间歇性饥饿对脂肪代谢的调控和相关机制。
  结果:⑴小鼠在间歇性饥饿处理期间,其累积进食量与自由进食对照组基本一致。间歇性饥饿训练17个循环后,相对于自由进食对照组,间歇性饥饿小鼠体重显著下降(P<0.05)。两组小鼠的肝指数未见显著差异,且肝脏切片染色也未见明显空泡。急性饥饿24小时后,两组小鼠肝指数均下降,而自由进食饥饿24小时组小鼠血清中谷丙转氨酶含量显著上升。肝脏切片染色观察发现自由进食饥饿24小时组中存在许多小泡状脂滴,而间歇性饥饿训练后的小鼠肝脏中未见明显空泡。⑵分离各组间小鼠肝脏组织进行生化和基因分析,间歇性饥饿组小鼠胰岛素水平显著上升,随之小鼠肝脏内糖原含量也明显提高,而肝脏中甘油三酯含量则显著降低。进一步测定小鼠肝脏中与能量代谢相关基因表达情况发现,间歇性饥饿组小鼠Pparα和Glut4表达显著下调。急性饥饿24小时后,间歇性饥饿训练后的小鼠肝脏中与脂代谢相关基因Ppara、Fgf21、Cpt1a和Hmgcs2的表达都显著下调,而与糖代谢相关基因Glut4、Pgc1a和Pygl的表达则显著上调。⑶检测各组间小鼠肝脏中氧化应激反应程度,间歇性饥饿组小鼠血清中丙二醛含量显著下降,总抗氧化能力显著提高,而总巯基含量和抗氧化物酶活力均未见明显差异。急性饥饿24小时后,丙二醛含量显著上升,且自由进食饥饿24小时组小鼠显著高于间歇性饥饿训练小鼠。而抗氧化物酶活力显著下降,且自由进食饥饿24小时组下降更为显著。
  结论:①相比于自由进食对照组小鼠,间歇性饥饿训练可以减缓小鼠体重上升,上调胰岛素水平,促进肝糖原的合成并减少脂肪动员。②间歇性饥饿训练后的小鼠能够减少体内脂质过氧化产物丙二醛含量,提高抗氧化物酶活性,降低肝细胞中氧化应激水平,减少肝损伤。③因此,间歇性饥饿训练可能通过促进糖代谢,抑制脂代谢,改善氧化应激,减少肝损伤,从而抑制非酒精性脂肪肝的发生。
[硕士论文] 吕静溪
生物学 温州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:芘是多环芳烃的一种极具代表性物质,为4个苯环的结构,其本身是不具有遗传毒性的,但其醌类代谢物具有很强的毒性,并且有致突变性。孕烷X受体(PXR)和组成型雄甾烷受体(CAR)在肝脏外源性物质和类固醇类化合物代谢中起着非常重要的作用。近年来芘等PAHs对肝脏的损伤也逐渐步入较深的研究阶段。然而,目前关于芘的毒理学研究局限于毒性现象的描述、尿中代谢物分析以及与总PAHs一起研究等,但未进行深入、系统研究,从而导致芘的研究较缺乏。并且目前芘与核受体CAR、PXR相互作用关系的研究报道比较少见。本项目就是通过小鼠动物模型,研究核受体PXR和CAR在芘暴露后对肝脏代谢酶基因表达的影响,对其他化学物对肝脏代谢酶的影响研究具有一定的借鉴意义。
  方法:过PCR和DNA凝胶电泳技术鉴定出8周大WT、CAR(-/-)以及PXR(-/-)的子代雄性小鼠用于实验。选择的芘暴露剂量为0mg/kg、300mg/kg,进行为期4天的经口灌胃。第5天,收取尿样并解剖小鼠取得肝脏样品。提取肝脏总RNA,通过反转录实验和荧光定量PCR技术,定量分析小鼠肝脏代谢酶的mRNA表达情况。
  结果:芘暴露后,WT小鼠和PXR基因敲除小鼠的喂药组与对照组相比,肝脏和体重比明显升高,而CAR基因敲除小鼠的肝脏和体重比基本没变化。核受体PXR能够明显地上调CYP1A1、CYP1A2基因的表达水平;核受体PXR和CAR均能够明显上调CYP3A11的基因表达水平;小鼠核受体PXR对CYP2B10、GSTm1、GSTm3、SULT1A1,UGT1A6基因的表达均没有调节作用,但是核受体CAR能够上调 CYP2B10、GSTm1、GSTm3、SULT1A1的基因表达水平,并能够下调UGT1A6的基因表达水平;但是核受体CAR和PXR均不能明显地诱导UGT1A1基因的表达。
  结论:⑴PXR能够调控CYP1A1、CYP1A2基因的表达,而CAR不能调控这个两个基因的表达。同时也表明芘暴露后,PXR被激活。⑵PXR和CAR均能调控CYP3A11基因的表达。⑶核受体PXR不能够调控CYP2B10、GSTm1、GSTm3、SULT1A1、UGT1A6基因的表达,而核受体CAR能够对以上5种基因的表达起到调控作用。⑷PXR和CAR均不能调控UGT1A1基因的表达。
[硕士论文] 葛炳强
食品科学与工程 浙江工商大学 2017(学位年度)
摘要:研究囊泡界面自催化生成脂肪酸的物理化学机理对于理解脂肪消化具有重要的意义。在大分子拥挤环境中脂肪酸酐水解对于理解人体胃肠道囊泡自组装催化脂质进一步水解的物理化学机理是一个合适的模型。本研究采用多种浓度和分子量的聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖(Ficoll)和葡聚糖(Dextran)作为大分子拥挤试剂,选用3种不同链长的脂肪酸酐:癸酸酐、月桂酸酐和油酸酐,探究拥挤剂剂量效应对脂肪酸囊泡自催化生成动力学链长依赖性影响的机理。
  (1)聚乙二醇中脂肪酸囊泡自催化生成动力学研究
  通过对聚乙二醇中脂肪酸囊泡自催化生成速率研究发现,在PEG200、PEG2000和PEG20000中,癸酸生成速率与稀溶液中相比是下降,而月桂酸、油酸生成速率是增加。且PEG浓度或分子量越大,癸酸生成速率越慢,月桂酸、油酸生成速率越快。通过测定癸酸囊泡和油酸囊泡在PEG中的粒径发现,PEG会增大癸酸囊泡粒径,减小油酸囊泡粒径,且随着PEG浓度和分子量增加,粒径变化幅度增大。流变实验表明,癸酸囊泡粘度随着PEG浓度增加而增大,油酸囊泡粘度变化趋势正好相反,随着PEG浓度增加而减小。高浓度的PEG溶液在癸酸囊泡作用下网状结构塌缩表现出粘性行为,但在油酸囊泡作用下由于更加结实的网状结构的形成而表现出弹性行为。
  (2)聚蔗糖和葡聚糖中脂肪酸囊泡自催化生成动力学研究
  通过对多糖中脂肪酸囊泡自催化生成速率研究发现,在聚蔗糖70、聚蔗糖400和葡聚糖20中,实验结果与在聚乙二醇中相似,癸酸生成速率与稀溶液中相比是下降,而油酸生成速率是增加。且多糖浓度越大,癸酸生成速率越慢,油酸生成速率越快。与在聚乙二醇溶液中相比,在聚蔗糖溶液中,我们发现聚蔗糖分子量增加对脂肪酸生成速率影响不明显,可见大分子性质对脂肪酸生成速率也有一定影响。通过测定癸酸囊泡和油酸囊泡在聚蔗糖和葡聚糖中的粒径发现,多糖聚合物会增大癸酸囊泡粒径,减小油酸囊泡粒径,且随着多糖聚合物浓度和分子量增加,粒径变化幅度增大。流变实验表明,癸酸囊泡粘度随着聚蔗糖浓度增加而增大,油酸囊泡粘度变化趋势正好相反,随着聚蔗糖浓度增加而减小。高浓度的聚蔗糖溶液在癸酸囊泡作用下网状结构塌缩表现出粘性行为,但在油酸囊泡作用下由于更加结实的网状结构形成而表现出弹性行为。
  上述结果表明,在聚乙二醇和多糖溶液中,癸酸和油酸生成速率变化趋势一致,说明脂肪酸囊泡自催化生成动力学链长异常效应在不同大分子拥挤剂构成的拥挤环境中是存在一定的普遍性。拥挤程度(浓度和分子量)增加使癸酸生成速率减慢,月桂酸和油酸生成速率加快。实验表明,这背后的原因主要有三点:1、拥挤环境中脂肪酸囊泡粒径变化影响囊泡催化效率;2、拥挤环境中脂肪酸囊泡粘度变化影响囊泡界面物质扩散速率;3、大分子网状结构粘弹性变化影响物质转运。综上而言,拥挤环境中,在复杂的催化反应情况下,脂肪酸和大分子之间存在不同的疏水相互作用。在脂肪酸囊泡自催化生成过程中,对于中链脂肪酸,扩散对反应速率起到了主要作用;但是对于长链脂肪酸,大分子拥挤剂的拥挤效应促进了脂肪酸囊泡自催化反应速率。本研究为拥挤环境中脂肪酸囊泡自催化生成链长差异性分析提供了有用的信息,也对理解生理相关的脂肪酸消化链长依赖性提供了依据。
[博士论文] 赖恩平
材料学 东华大学 2016(学位年度)
摘要:蛋白质组学是在细胞、组织的整体蛋白质水平上对其活动规律进行研究的学科。“Shotgun”(鸟枪法)策略是蛋白质组学中常用的研究策略。在该策略中,对样品的酶解是基础而关键的步骤,它直接影响到蛋白鉴定的结果。为了改善自由酶的稳定性差、酶解效率低等问题,研究者们开展了对自由酶进行固定化的研究。尽管固定化酶的酶解效率有所提升,但是也存在一些不足。在酶解过程中,疏水性载体易对蛋白产生不可逆吸附,造成酶解后载体对肽段释放率较低,而亲水性载体使蛋白质难以靠近,从而低丰度蛋白酶解不完全。这些问题导致蛋白质的检出率降低,甚至严重影响鉴定结果。因此,改善固定化酶的性质,并实现其亲疏水性的可控调节,对蛋白质组学中高效样本处理具有重要意义。基于此,本文创新性地将pH/温度双重敏感性智能微球与固定化酶技术相结合,成功构建出兼具刺激响应性和酶生物活性的智能载酶微球体系,并将其运用于蛋白质的酶解处理过程。研究工作主要从双敏智能微球的制备与表征、智能微球结构的调控、智能微球载酶体系的构建及其在蛋白质组学中的应用等方面展开。主要研究内容如下:
  (1)采用快速膜乳化技术结合低温一步聚合法,以聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)和聚丙烯酸(PAAc)为原料,在微米尺度上成功制备出pH/温度双重敏感性的半互穿网络结构微球(PPS)。通过对快速膜乳化技术的工艺参数进行优化,可制备出平均粒径在6.5?m左右、粒径分布均一的智能微球。利用红外光谱(FT-IR)、扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度仪和差示扫描量热仪(DSC)对微球的结构和性能进行分析,证实了半互穿网络结构的有效形成。对微球的刺激响应性能表征发现:微球具有较好的温度敏感性和pH敏感性,且两种刺激响应性之间不会相互影响。另外,与PNIPAM微球相比,PPS微球的分散性和储存稳定性有大幅度提升,这为其在生物化工领域的应用奠定良好基础。
  (2)为了实现对智能微球的结构调控,改变亲水组分和交联剂的含量制备了一系列智能微球,对微球的结构与性能之间的关系进行了探讨,并结合透光度法和凝胶时间测定对聚合过程中微球内部相分离行为进行分析。研究发现,随着PAAc投入量的增加,微球表面的褶皱区域尺寸和内部孔洞尺寸减小,但微球始终保持贯穿孔结构。随着AAc投入量的增加,微球的表面从多孔逐渐变为少孔,并且微球的结构从较为均匀的半互穿网络结构向“核-壳”型半互穿网络结构转变。交联剂对微球结构和性能的影响更为明显,其投入量的增加,可以使微球从松散的结构转变至较均匀的半互穿网络结构,直至最后转变为“核-壳”型半互穿网络结构。基于多种分析数据,本文提出不同交联剂浓度下,智能微球的半互穿网络结构模型。
  (3)采用共价固定法,将胰蛋白酶与智能微球载体材料相结合,成功构建出智能载酶微球系统。在前期工作的基础上,以P(NIPAM-co-AAc)无规共聚结构微球(PcA)为载体,对固定化酶的过程进行分析,并优选出最佳参数。在此条件下,又以半互穿结构微球为载体,构建智能载酶微球体系,并探讨其酶学性质和刺激响应性质。研究表明,所制备的载酶体系保持了较好的酶活性和刺激响应性,且酶固载量高。同时,固定化酶的最适催化温度与微球载体材料的临界相转变温度(LCST)接近。另外,由于载体是阴离子型载体,三种固定化酶的最适催化pH均向碱性方向移动。在25~45℃温度范围内,与自由酶相比,固定化酶的最大反应速率有较大提升,还具有更好的热稳定性和储存稳定性。
  (4)基于上述对不同智能载酶微球系统的性能评价,利用智能载酶微球系统的刺激响应性,对细胞色素C(Cyt-C)、肌红蛋白(Myo)及牛血清白蛋白(BSA)三种模型蛋白进行酶解。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDT-TOF MS)和液相色谱-质谱联用仪(LC-MS MS)对酶解效果进行分析。研究发现,智能载酶微球体系具有较高的酶解效率和较好的酶解效果,5min内即可将Cyt-C酶切。与其他载酶体系相比,智能微球载酶体系对模型蛋白酶解15min,所鉴定得到的肽段数目和序列覆盖率更高。这是由于智能微球载酶体系可以在高于LCST温度下对蛋白分子进行吸附和酶解,并在低于LCST的温度下对肽段进行有效的释放。另外,Try-PPS和Try-PcPS还展现出可优先选择小分子蛋白进行酶解的能力。这些优势与特点,使得智能微球载酶体系可以进一步应用于酶解复杂蛋白混合物领域中。
  (5)以智能微球载酶系统为基础,分别通过调节体系温度、调节体系pH值以及结合红外辅助酶解技术,对HepG2细胞提取物进行酶解,并对酶解产物进行生物信息学分析。结果表明,与常规条件下进行酶解相比,采用红外加热方式,或者在加热过程中调节体系pH至6.0,均能提高酶解效率。在红外条件下,利用Try-PcPS酶解30min后,产物中所检测到的匹配蛋白最多(116个)。对检测所得的蛋白质的理化性质进行分析,结果表明,60%以上的蛋白质分子量小于40kDa。大部分蛋白的等电点处于4.5~9.5,过酸或过碱蛋白含量很低。蛋白的GRAVY值几乎小于0,说明检测到的蛋白大多数为疏水性蛋白。对这些鉴定的蛋白进行分类,发现大部分蛋白质具有催化活性,并且参与代谢过程,与细胞的转运、迁移、分化、增殖、防御应答等相关,由此可见肝脏所承担的生理功能很多,是人体的代谢中枢。
  本论文利用快速膜乳化技术结合低温一步聚合法,在微米尺度上成功制备出具有温度和pH双重敏感性的互穿网络结构水凝胶微球,并完成了智能载酶微球体系的构建及其用于酶解复杂蛋白质混合物的研究。本文首次提出“高温富集酶解,低温释放肽段”这一酶解新思路,并开拓了一种新型的蛋白质快速高效酶解方法,这有助于拓展智能温敏水凝胶微球在蛋白质组学领域中的应用,同时为后续的研究工作提供理论基础。
[博士论文] 罗辉
生物化学与分子生物学 厦门大学 2016(学位年度)
摘要:甘油三酯(TAG)是真核细胞储存能量的基本单位,白色脂肪细胞超过百分之九十是由TAG组成,肝细胞合成TAG组装成极低密度脂蛋白分泌到血液中被其他组织吸收利用,乳腺上皮细胞也需要合成TAG来产生乳汁,TAG的合成对于小肠上皮细胞从食物中吸收脂肪是必需的。但TAG的异常累积会导致以肥胖为主的代谢综合症,通过增加糖尿病和心血管疾病的风险带来极高的死亡率,已严重威胁全人类健康。TAG通过甘油磷酸和单酰甘油两条途径合成,由多种酶参与。但目前对于这些酶的调控机制还未研究透彻。本文发现Refed或是橄榄油灌胃后,Aida-/-小鼠空肠Gpat3蛋白水平显著高于WT。 Gpat3是甘油磷酸途径中的限速酶,因此Gpat3蛋白水平的升高导致Aida-/-小鼠对脂肪的吸收及TAG的重新合成能力增强,释放到血清的乳糜微粒增多,促进高脂诱导的肥胖,脂肪肝,胰岛素抵抗。在机制上我们的实验数据表明,Gpat3是内质网相关降解途径(ERAD)的底物, Aida通过增强Gpat3与其泛素连接酶Hrd1的相互作用,促进Gpat3的降解。总的来说,Aida在调节机体对膳食脂肪的吸收和储存,以及肥胖及其并发症的发展等方面发挥重要作用,对这些调控过程的了解将可能为我们预防和治疗人类的代谢综合症提供新的的思路。
[硕士论文] 焦亚森
计算机科学与技术 天津大学 2016(学位年度)
摘要:了解一种蛋白质所位于的亚细胞位置是了解其生物学功能的一个重要的步骤。高尔基体作为真核细胞中常见的细胞器和一些重要的疾病有着紧密的联系,比如:奥兹海默症以及帕金森症。了解了高尔基体蛋白的功能将会对治愈这两种疾病有着重要的意义。
  在本篇论文中,我们对于高尔基体蛋白定位预测进行了系统的分析。首先,我们提出了一种方法,用于确定一种蛋白质是否为植物细胞中的Golgi-resident蛋白。这种方法使用了创新形式的Chou提出的伪氨基酸序列构成方法,并融合了跨膜域信息以及多种不同的氨基酸物化特性。基于使用支持向量机分类方法,我们的方法在5折交叉验证实验中,取得了超过90%的预测效果,优于目前存在的同类方法。确定了一个蛋白质是不是Golgi-resident蛋白是远远不够的,需要进一步确定其具体类型。了解Golgi-resident蛋白的类型对于理解其生物学意义上的分子功能起着关键的作用。Golgi-resident蛋白主要分为两大类:cis-Golgi蛋白以及trans-Golgi蛋白。不同类型的Golgi-resident蛋白起着不同的作用。因此,我们在此基础上提出了一种基于支持向量机算法的分类器,并结合了蛋白质的位置特异性物化特性以及基于互信息理论的特征选择算法。在留一交叉验证实验中,我们的方法仅仅使用了49维特征便取得了91.24%的预测准确率。为了检验我们的性能,同时避免过拟合现象的发生,我们还与其他现存方法进行了全面的比较。得到的结果显示,我们的方法优于目前就我们所知的全部同类算法,且具有最少的特征数量。此外,我们还对不同的特征选择算法在此类问题上的应用表现进行了分析。实验结果表明,我们提出的方法对于高尔基体蛋白的位置预测十分有效而且具有预测多种蛋白质属性的潜力。在本篇论文中,我们旨在全面系统地对高尔基体蛋白质进行分析。算法的两个步骤为:首先确定一种蛋白质是否为Golgi-resident蛋白,进而判断Golgi-resident蛋白的具体类型,是停留在cis-Golgi网络或是trans-Golgi网络中。实验结果证明,我们的方法是目前同类别算法中表现最好的,并且特征向量维度最少。
[硕士论文] 任玺
生物学(生物信息学) 上海交通大学 2016(学位年度)
摘要:蛋白质在基质表面上的吸附动力学研究是生物学、医学、食品加工等许多领域共同关切的重要科学问题。时间分辨光谱技术通常被用来实时监测蛋白质的结合动力学过程,但是基于单变量分析的传统数据处理方法难以区分复杂动力学数据中的重叠组份,因此有必要引入多变量分析方法来实现对复杂体系的动力学分析和数学建模。本论文围绕蛋白质和金纳米的动态相互作用深入开展了以下两个案例的研究。
  第一个案例研究和揭示了金纳米(AuNPs)和两种高度同源的血清白蛋白(即人血清白蛋白HSA和牛血清白蛋白BSA)的结合动力学差异。首先,我们收集了两种同源蛋白的紫外可见光谱动力学数据。然后,通过结合多变量分析及数学建模等分析手段,我们设计出了一个可行性较高的蛋白质吸附动力学研究策略,实现了对蛋白质和纳米材料之间发生的相互作用的定量和定性分析。在此基础上,我们又利用多级指数函数对该动态转换过程进行了数学刻画,通过对拟合公式中的参数进行定量分析从而推算出两种蛋白质的不同吸附特性。我们发现血清蛋白和金纳米的结合过程可被两个一级指数反应方程所描述,故整个的反应可被看作两个过程:一个快过程和一个慢过程,恰好对应于血清蛋白的三角棱柱形结构所能采取的两种可能的结合构象。两种蛋白质所不同的结合构象偏好性取决于不同的结构特性以及表面电荷分布。
  作为一个方法学的拓展研究,我们又进一步研究分析了一种具有自聚集特性的抗菌蛋白—胰岛再生源蛋白(REG3A)在金纳米(AuNPs)表面的结合及聚集特性。已知内毒性分子脂多糖(LPS)能够抑制REG3A的杀菌功能,故我们利用多变量分析手段对二元的AuNPs-REG3A和三元的AuNPs-REG3A-LPS作用体系分别进行了研究,发现REG3A在金纳米上同样具有非常强的自聚集成纤维网络的倾向,当聚集到一定程度时,REG3A会从金纳米表面脱落下来从而在动力学光谱上表现为多过程行为。而LPS加入后,LPS会在REG3A之前迅速吸附到纳米颗粒表面上,且对REG3A蛋白的自聚集起到比较明显的抑制效应,从而在其吸附动力学数学模型中出现体系组份数减少以及结合动力学曲线平滑化等现象。
  本论文将多变量分析方法和结合动力学的研究相结合实现了一种新的二维动态光谱数据分析方法,这种数据处理方法能够对蛋白质-纳米体系的相互作用模式和机制进行较为准确的研究和探索。该分析流程方案简单、有效、灵敏,可以应用于构建和开发基于纳米材料的生物传感器,从而揭示体液中的一些疾病相关且低表达蛋白在纳米材料上的特殊动力学行为,同时也为探究具有特殊结构组成或聚集能力的蛋白质或多酶体系提供了新的思路和手段。
[硕士论文] 杨景晶
药物分析学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2016(学位年度)
摘要:复杂生物体系中的蛋白质以及因不同修饰而产生的蛋白质异构体的数量可达百万种。随着蛋白质组学研究的深入进展,这些动态范围过宽、理化性能差异过大的复杂蛋白质为探索生命活动的本质带来了巨大挑战。高丰度蛋白质因其表达水平高而容易被有效分离鉴定,与此相比中低丰度蛋白质由于本身数量庞大,组成复杂而不易被有效检测,在分离和鉴定过程中,高丰度蛋白质的强信号也会掩盖或结合大量的低丰度蛋白质,为中低丰度蛋白质的分离鉴定造成极大干扰。不仅是低丰度蛋白质,对于很多高丰度蛋白质的研究,同样面临质谱分析结果的序列覆盖率低,定量稳定性差等问题,这给蛋白质组研究中的分析鉴定方法学带来了巨大的挑战。针对此问题,科研人员从不同的角度入手提出解决方案。
  在蛋白质组的研究中,鸟枪法被广泛地应用于蛋白质检测。蛋白质混合物被酶解为肽段的混合物,然后利用质谱进行测序分析,计算机根据科研人员已经设定的计算法则,将实验谱图与理论谱图匹配,并找到鉴定肽段在蛋白质序列中的相应位置,从而确定该混合物中具体的蛋白质成分。鸟枪法的应用摆脱了传统凝胶分离技术中的限制与不足,同时也带来了相应的弊端。
  通过鸟枪法,混合溶液中不仅产生了易于质谱检测的高丰度肽段,也产生了难以检测到的低丰度肽段。所谓低丰度,并不意味着这些肽段含量非常低,它们可能仅仅是被数量巨大的高丰度肽段抑制,或者在质谱分析时,离子化效率偏低,由于质谱灵敏度的限制,在图谱采集时更容易被遗漏掉。但是,即便是因为各种原因,部分肽段的序列及其翻译后修饰变体,无法有效监测,并不意味着这些序列携带的信息不重要。相反,我们要发展相应的技术体系与方法,帮助发现这些遗漏的肽段或蛋白质。
  大量的研究结果表明,低丰度肽段、蛋白质,在生物界中往往携带着重要的信息或是发挥着不可取代的作用。经过多年来的研究表明,在疾病治疗方面,低丰度肽段或是蛋白质往往充当了诊断、预后和治疗效果的标记物,同时它们也可能是治疗的靶点。因此,对于高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质的富集、鉴定成为了具有重要意义的研究方向。
  要改善低丰度蛋白质的鉴定,一般通过三种机制:(1)消耗高丰度蛋白质;(2)富集低丰度蛋白质;(3)提高质谱对蛋白质的灵敏度与准确度。其中提高色谱、质谱的分离与分辨率成本高,且容易受到仪器本身的条件限制,因此,目前国际上对于中低丰度的分离与鉴定主要在富集低丰度蛋白质方面,例如抗体免疫去除;蛋白均衡器;修饰蛋白质、核酸结合蛋白质富集等,但是这些方法具有选择性,对于复杂样本的通用性较差。现在的问题是,我们缺乏通用性好的蛋白质复杂体系简化策略,因此该研究课题从两个方面展开:第一,利用氨基活性反应基团或羧基活性反应基团与化学基团的无差别反应,达到复杂系统中高丰度蛋白质或肽段的消减;第二,靶向富集含某种特定氨基酸的肽段,从而简化体系,降低基质效应。
  本论文共分为三个部分,第一章概述了蛋白质组研究中低丰度蛋白质的富集、鉴定技术,以及靶向富集含特定氨基酸肽段的意义、现状与研究进展,同时对目前国际上低丰度研究的常用方法,例如抗体免疫去除、蛋白均衡器、修饰蛋白质、核酸结合等进行了分析研究,在此基础上提出了本论文的研究内容与目标,即通用性强的高丰度蛋白质去除方法以及特异性肽段富集策略。
  在第二章,我们开展了通用性强的高丰度蛋白质去除方法的探究。在这一部分中,我们利用酶切后肽段末端氨基活性反应基团或羧基活性反应基团与活性试剂发生结合作用从而去除高丰度肽段,并进一步优化结合氨基或羧基的浓度速率关系实现研究目的。
  首先是对该实验的基础部分进行研究,我们考察了模型生物酵母细胞三种常用的不同方法,对比了它们的提取效率,提取方法的重复性考察,不同提取方法得到酵母蛋白质的丰度与其相对谱图数的线性关系的考察,可鉴定到的蛋白质丰富范围与理论值的比较。经过该部分实验,我们发现虽然NETN超声破碎法的提取效率最高,但经过FASP酶切处理,质谱分析的结果显示SDS碱裂解法与Urea超声破碎法鉴定到了蛋白质数量更多,其中SDS碱裂解法对肽段的修饰作用明显,因此Urea超声破碎法是理想的提取方法。
  在第二部分的研究中,我采用Urea超声破碎法进行酵母蛋白质提取。通过调研对比其他活性试剂,我选用了通用性强的CNBr活化琼脂糖珠作为肽段氨基端反应试剂,质谱分析结果显示经过多次结合后,部分肽段有损失,但是高丰度与低丰度之间拉平作用明显。
  在第三章中,由于随着高通量蛋白质组研究技术的发展,液相色谱-串联质谱被广泛的运用于深度地鉴定并定量分析目标肽段和蛋白质。但由于峰容量限制、基质效应等问题,在液相色谱-质谱(LC-MS)分析中,只能获得有效的蛋白质序列覆盖度,大量隐含肽段、色谱分离时的共洗脱肽段,严重影响以二级质谱为核心的定量方法的准确度。为了简化分析体系,提高质谱定量分析的准确度,本研究对含组氨酸肽段开展选择性富集方法的探索,建立组氨酸肽段与定量蛋白质组研究串联的分析方法。实验结果表明,Cu-beads与肽段反应30mins,肽段上样量与Cu-beads比例为1:1(μg:ul)的情况下为最优条件,可以实现稳定性好,重现性高的his肽段选择性富集。在iTRAQ按比例标记试验中,含组氨酸肽段富集可以明显改善定量分析的准确度。因此,his肽段富集,可以作为一种简单、有效的复杂蛋白质组简化策略,并提高定量蛋白质组研究的准确性。
[硕士论文] 王君
食品科学 安徽农业大学 2016(学位年度)
摘要:蛋白磷酸酶5(protein phosphatase5,PP5)是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,在细胞生长、增殖、分化、迁移以及胁迫条件下细胞的生存等多个方面发挥着重要作用。实验中发现 PP5基因敲除小鼠的体重较野生型轻,体型也较小。进一步以PP5基因敲除小鼠(PP5KO)为模型,较为深入地研究了PP5在脂肪代谢和骨发育中的作用。首先对高脂饲养WT和PP5 KO小鼠体重进行了动态检测,MRI检测小鼠体内脂肪的分布,HE和油红O染色对小鼠肝脏组织进行病理学和组织化学分析,利用体外诱导WT和KO小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells,MEF)脂肪分化,利用western blotting和realtime-PCR研究了PP5基因对脂肪分化及脂代谢相关通路基因的调控。同时为探究PP5在骨分化方面的作用,首先对WT和KO小鼠的体重及股骨长度进行测量分析;利用HE染色、CT扫描分别对WT和KO小鼠股骨组织结构进行比较分析;利用生物力学仪检测了WT和KO小鼠股骨应力的差异;利用体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)成骨分化、利用siRNA干扰前成骨细胞系MC3T3-E1 PP5基因的表达,研究PP5对骨分化的影响;利用western blotting、realtime-PCR和免疫组化技术研究了PP5基因对骨发育调控通路相关基因的调控。主要结果如下:
  1.与WT对照小鼠相比,高脂饲喂的PP5 KO小鼠体重显著减轻且体重增加显著变慢;肝脏中脂滴数量显著减少,且脂滴较小;CT扫描显示PP5 KO小鼠体内脂肪积累显著少于WT对照组。
  2.通过体外诱导MEF细胞脂肪分化,发现与WT MEF细胞相比,PP5 KO MEF细胞脂肪分化明显减弱,同时形成的脂滴较小。
  3.real time PCR检测PP5 KO小鼠肝脏组织中脂肪分化标记基因:脂肪酸转位酶(fatty acid importer cluster of differentiation36,CD36)、AP2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(peroxisome proliferator activated receptorγ2,PPARγ2)、葡萄糖转运子4(glucose transporter4,GULT4)的相对表达量与WT小鼠相比显著降低;western blotting的结果表明PP5 KO小鼠肝脏组织中磷酸化糖皮质激素受体(phosphorylation glucocorticoid receptor,p-GR)和解耦联蛋白1(uncoupling protein1,UCP1)蛋白表达量显著高于WT小鼠。
  4.在骨发育方面,与WT小鼠相比,PP5 KO小鼠体重显著减轻、股骨变短、变粗,骨小梁数量增加、骨小梁分离度变小、骨小梁厚度变大,相对骨体积(股骨中骨成分的体积/股骨的总体积)增大、骨密度显著增大,皮质骨厚度增加,骨相对表面积(股骨中骨成分的表面积/骨体积)减少,利用生物力学仪检测发现PP5 KO小鼠股骨最大载荷显著减小,说明PP5基因敲除后小鼠骨分化增强但是股骨承重能力显著减弱。
  5.体外诱导骨分化实验表明,与WT骨髓间充质干细胞相比,PP5 KO间充质干细胞体外骨分化显著增加。
  6. real time PCR结果显示,PP5 KO小鼠骨髓间充质干细胞及软骨中骨分化相关基因:骨桥蛋白(osteopontin,Opn)、骨钙素(osteocalcin,Ocn)、成骨转录因子(runt-related transcription factor2,Runx2)相对表达量明显升高,而骨分化抑制基因(peroxisome proliferator activated receptorγ1,PPARγ1)和(peroxisome proliferator activated receptorγ2,PPARγ2)相对表达量显著降低;免疫组化结果显示Runx2蛋白表达量显著升高,PPARγ蛋白表达量无显著性变化;利用 western blotting检测 PP5 si-RNA干扰后的MC3T3-E1细胞蛋白表达变化时发现磷酸化PPARγ(p-PPARγ)蛋白表达量显著升高。
[硕士论文] 李晓静
预防兽医学 河南农业大学 2016(学位年度)
摘要:基因工程技术、基因组学和蛋白质组学技术的发展使得重组蛋白表达技术日益成熟。重组蛋白已经在生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域得到广泛应用。但是,重组蛋白的快速和廉价纯化依然是蛋白质规模化制备的瓶颈。亲和标签是蛋白质纯化的高效工具,能够从污染的宿主蛋白中一步纯化重组的目的蛋白。目前,已经有多种亲和标签被用于蛋白质的表达和纯化。最常用的亲和标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S转移酶(GST)标签、葡萄球菌蛋白A(SPA)、硫氧还蛋白(TRX)、小泛素样修饰蛋白(SUMO)和六聚组氨酸标签(6×His)等。使用这些标签需要将标签对应的配体偶联到固相载体上,利用标签与配体的可逆性结合特性,利用合适的洗脱条件将目的蛋白洗脱和纯化。考虑到与将配体偶联到固相载体相关的蛋白纯化费用,商品化纯化介质均十分昂贵且只能重复利用数次等问题,现有的纯化标签系统无一适合蛋白质的规模化制备。
  本论文利用硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)可逆性结合琼脂糖的特性,将其作为融合标签,建立了一种一步纯化LSL标签融合蛋白的方法。不用任何处理的琼脂糖凝胶柱和乳糖溶液分别作为LSL标签蛋白的特异性吸附剂和洗脱剂。所构建的表达载体中在LSL标签的下游含有烟草花叶病毒(TEV)蛋白酶识别位点,方便后续融合蛋白分子中LSL标签的去除。为了纯化不含标签的目的蛋白,本论文表达了带有LSL标签的TEV蛋白酶。本研究构建的LSL融合标签表达与纯化系统具有表达蛋白可溶性好、纯化工艺简单、成本低等优点,为实现规模化生产和纯化性状确切的蛋白提供新的思路。研究内容包括以下三个方面:
  1.硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建
  本研究通过合成硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)N端含187个氨基酸的糖结合域,并在其下游引入烟草花叶病毒蛋白酶(TEV)的识别位点,通过克隆获得重组质粒pET-LSL,随后将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。所构建的pET-LSL重组质粒能够在BL21(DE3)中表达可溶性的硫磺菌蘑菇凝集素,而且所表达的凝集素可以经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的凝集素。为构建以硫磺菌蘑菇凝集素为标签的廉价、高效重组蛋白表达和纯化方法奠定基础。
  2.模式蛋白表达与纯化
  本研究在硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建成功后,以该重组质粒为基础,分别以绿色荧光蛋白GFP和PCV2的衣壳蛋白(Cap)为模式蛋白,进一步研究硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白表达上的应用。通过克隆的方法,成功构建了重组质粒pET-LSL-GFP和pET-LSL-Cap。分别将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。实验表明GFP和Cap重组蛋白都能以可溶性形式进行表达,可溶性表达水平在90%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的重组蛋白。在荧光下观察重组蛋白LSL-GFP,可以看到明显的荧光,通过Western Blot,重组蛋白LSL-Cap可被PCV2多克隆抗体特异性识别,证明LSL融合标签不影响模式蛋白的生物学活性和抗原性。
  3.用于切割融合蛋白的TEV工具酶表达与纯化
  本研究利用硫磺菌蘑菇凝集素作为标签,构建了表达TEV蛋白酶的重组质粒pET-LSL-TEV,将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌后,经IPTG诱导表达。实验表明TEV重组蛋白酶以可溶性形式表达,可溶性水平为60%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化后,可以得到单纯的重组蛋白。所表达的TEV蛋白酶具有良好生物学活性,可以将目的蛋白与LSL标签一步分离。
  总之,本论文研究结果证明硫磺菌蘑菇凝集素LSL可以作为有效的亲和标签,并且具有以下优势:(1)LSL标签可以一步亲和层析纯化融合蛋白;(2)LSL标签可以提高目的蛋白的可溶性,并且对靶蛋白的功能不产生影响。值得指出的是,Sepharose-4B柱经过含0.2M乳糖的PBS洗净残留蛋白后,再用PBS洗涤,可以多次重复使用。此外,因为琼脂糖本身就是树脂,并且可以作为LSL标签的配体,本研究所使用的方法比传统需要配体固定到树脂上的亲和纯化方法更廉价、方便。
[硕士论文] 熊乐
生物信息学 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:真核生物广泛使用组合调控方式调节基因表达。在该过程中,转录因子蛋白-蛋白相互作用与其DNA结合特异性存在耦合关系。然而,其背后的分子机制所知甚少。
  在本论文中,我们对碱性亮氨酸拉链(Basic leucinezipper, bZIP)转录因子组合调控分子机制进行了深入的理论研究。通过生物信息学分析,鉴定了一个对碱性亮氨酸拉链超家族DNA结合特异性至关重要的蛋白-蛋白互作位点。随后,以cAMP响应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)作为模型,通过分子动力学模拟研究,发现上述蛋白互作通过控制连接区域的柔性和移动性与Argl7-DNA相互作用耦合,进而影响CREB蛋白的DNA结合特异性。进一步的结构分析支持Arg17-DNA相互作用耦合的组合调控机制普遍存在于整个bZIP超家族中。本研究为理解bZIP蛋白组合调控机制提供了基本的分子模型,对理解真核生物其他转录因子超家族组合调控具有一定的启发意义。
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