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[硕士论文] 郑善清
植物分子遗传学 海南大学 2010(学位年度)
摘要:海马齿主要分布于热带和亚热带海岸的沙滩上,国内外学者研究证实海马齿具有良好的盐环境适应性,且在海水和淡水环境中均能良好生长,是一种研究植物耐盐和克隆耐盐相关基因的理想材料。本研究构建了海马齿全长cDNA文库,并采用最新发展的Solexa测序技术,对盐胁迫和非盐胁迫条件下生长的海马齿,进行高通量的转录组差异表达分析,获得差异表达的tag序列,然后从cDNA文库中分离差异全长基因。
   本研究构建的盐胁迫下海马齿的全长cDNA文库:用改良CTAB法提取总RNA,SMART法反转录成cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA。LD-PCR产物经蛋白酶K消化和sfi1酶切后,经CHROMA SPIN+TE-1000分离柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照适当的比例连接λTripIEx2载体。连接产物利用MaxPlaxTM LambdaPackaging Extracts进行体外包装,得到海马齿初级cDNA文库。初始文库的独立克隆数为2.4×106 pfu,初级文库滴度大于4.80×106 pfu/mL,重组率为93.75%,插入片段在0.5-5 kb之间,扩增文库的滴度为1.21×109pfu/mL,所得文库质量较高。
   经Solexa高通量测序技术,获得了盐胁迫和非盐胁迫条件下海马齿的差异表达的tag序列,其中淡水和海水处理的海马齿转录组中,分别分析了763911和2073628个16bp长的序列,获得了海水处理苗的转录组中993662个标签,淡水处理苗的转录组中450349个标签,海水处理苗种特异表达的标签有158921,淡水处理苗中特异表达的标签有3038个,并得到226个在两转录组中表达量有显著差异的标签。
   依据转录组分析得到的标签子以及已发表的耐盐基因的序列信息,本研究在全长cDNA文库中克隆得到了甜菜碱脱氢酶基因BADH,该BADH基因共有1503个碱基,可编码500个氨基酸,编码的多肽理论分子量为54.53 kDa,理论等电点为pI:5.22,海马齿BADH基因与千穗谷、盐爪爪、滨藜、菠菜和麦冬的BADH基因进行同源性分析显示,其同源性都达到80%以上,并经初步验证,推测该基因的表达可能与海马齿的耐盐机理有关。
   本研究得到的海马齿全长cDNA文库和转录组差异表达标签,是研究海马齿耐盐机理的丰富资源,在此基础上,可以通过分析差异表达标签和利用已有耐盐基因的信息,继续克隆海马齿中耐盐相关基因、功能验证等后续研究,并利用基因工程操作,获得转基因抗盐植物,以适应并改良日益严重的土壤盐渍化现状。
[硕士论文] 黄姿梅
生物化学与分子生物学 广西师范大学 2007(学位年度)
摘要:罗汉果为葫芦科罗汉果属的雌雄异株植物,具有重要的医疗和保健价值,是广西特有的经济植物。罗汉果的栽培需要优良的罗汉果雌、雄品种。对罗汉果进行雌雄性别的分子标记研究,可为罗汉果早期性别鉴定以及雌雄单株选育提供理论基础。 本研究主要采用随机引物扩增多态性DNA(RAPD)技术和同工酶方法对罗汉果雌雄株进行性别分子标记等的研究。研究内容及结果如下: 1.以栽培品种青皮果的雌雄株叶片为实验材料,用随机引物S60(ACCCGGTCAC),S90(AGGGCCGTCT)扩增得到与罗汉果雄性性别相关的DNA 分子标记。根据引物名以及片段大小将差异带分别命名为S90-300、S90-400、S60-750。将这三条差异片段回收、克隆及测序,获得的序列大小分别为305bp,405bp,746bp。在NCBI 数据库中用BLAST 对这3 个差异片段进行序列同源性比较,结果表明这3 个序列与其它生物体DNA 序列同源性较小,且同源序列中未发现来自罗汉果或葫芦科的序列,表明这三个片段为罗汉果中新发现的DNA 序列。BLAST 分析表明:S90-300 序列中的9bp-305bp 与葡萄的基因组序列有67%同源性;180bp-220bp 与小鼠X 染色体上的41 个核苷酸有82%的同源性;232bp-260bp 与小鼠X 染色体上的29 个核苷酸有93%的同源性;201bp-243bp 与人类X 染色体上的43 个核苷酸有81%的同源性;210bp-244bp 与鸡W 染色体上的38 个核苷酸有86%的同源性。虽然均是来自动物的染色体序列,但X、W 染色体均为性染色体,因此我们认为S90-300 序列可能与性别基因有一定程度的关系。S90-400 序列与水稻的第8 条染色体的29 个核苷酸具有同源性,同源比率为93%。通过分析我们认为S90-400 序列与控制不育性的QTL 或是标记基因可能有一定的关系。另外,该序列与鸡Z 性染色体上的40个核苷酸有87%的同源性,因此我们认为S90-400 序列可能与性别基因有一定关系。S60-750 序列在102bp-136bp、443bp-480bp 片段位点分别与小鼠X 染色体上不同位置的37、38 个核苷酸有89%、86%的同源性;在560bp-584bp 、583bp-610bp 分别与黑猩猩X 染色体的25、28 个核苷酸有92%、96%的同源性。X 染色体为小鼠、黑猩猩的性染色体,因此我们认为S60-750 序列可能与性别基因有较为密切的关系。 2.以雄株和四个栽培品种(青皮、长滩、冬瓜、红毛)罗汉果雌株为实验材料,通过雄性和雌性罗汉果基因组DNA 池的RAPD-PCR 扩增,对115 个随机引物进行初步筛选,发现有8个引物在雌雄DNA 池中有差异。经过重复性验证,结果表明:S47(TTGGCACGGG)、S103(AGACGTCCAC)能在雄集群DNA 池中和单株分别扩增出约2600bp、1100bp 的雄特异性条带。而引物S43(AGACGTCCAC)则在所有品种的雌集群DNA 池扩增出约650bp 的雌性特异性条带。本实验为罗汉果性别连锁基因的克隆提供了一定的基础。 3.应用EST同工酶分别分析了暴棚、红毛罗汉果实生苗幼苗叶片,结果每品种EST同工酶图谱均可分为两种模式,其中一种可能为雄性模式,另一种可能为雌性模式,结果有待罗汉果分化出性器官(花)后的最终验证。
[硕士论文] 颜桂军
农药学 海南大学;华南热带农业大学 2006(学位年度)
摘要:从海南耕地利用状况看,农作物复种指数较低,仅189%。由于不少耕地没有合理地采用间种、套种或轮种等,耕作制度比较落后。海南目前有大面积的胡椒、芒果、黄皮等经济作物种植,行间距都较大,如果能间种一些周期短的农作物,则效益很可观。农业复合系统的建立需要正确地分析经济作物、农作物及牧草等植物间的各种相互关系,制订出合理的轮作制度、栽培选择及种植构型计划。其中,植物间化感作用(Allelopathy)的研究对农业复合系统的建立和优化有着重要的意义。 本实验对海南几种热带植物的化感作用的进行了研究。采用荔枝、胡椒、芒果、黄皮、木薯、槟榔、橡胶、番石榴作供体植物,采用玉米、黄豆、南瓜、稗草、马唐、萝卜和柱花草作为受体植物。主要研究了供体植物叶片水浸提液、供体根系周围的土壤对受体种子的萌发和露白种子生长的影响,以及胡椒、芒果、黄皮叶片浸提液通过乙酸乙酯、正丁醇萃取各相对受体种子的萌发和露白种子生长的影响,还对芒果叶片浸提液的正丁醇萃取相通过柱层析分离,紫外-可见分光光度计进行波长扫描。 实验结果表明多数供体植物叶片浸提液对受体植物的萌发和生长都产生一定的影响。其中黄皮叶片浸提液对玉米、黄豆和南瓜的萌发和生长以及对稗草和马唐的生长都具有较强的抑制作用;芒果、胡椒叶片浸提液对南瓜的萌发、稗草和马唐的生长有抑制作用;木薯叶片浸提液对黄豆、南瓜萌发和生长有抑制作用。多数供体植物叶片浸提液对受体植物的萌发影响表现为种子发芽率低、胚根、胚芽生长受到抑制;浸提液对幼苗的生长主要是影响植株长势、叶片形态等,处理的受体植物比对照生长慢、长势差,植株矮小,变黄,有烂苗、死苗等现象。多数具有高浓度抑制、低浓度促进的现象。荔枝叶片浸提液在较低的浓度下对玉米、黄豆萌发和生长有促进作用;芒果叶片浸提液在较低的浓度下对黄豆、花生萌发和生长有促进作用;槟榔叶片浸提液在较低的浓度下对玉米、黄豆、南瓜萌发和生长有促进作用。 供体植物根系周围土壤对受体种子萌发和生长的影响试验表明:胡椒根系周围土壤对花生种子的萌发有抑制作用,而对玉米的萌发,以及玉米和黄豆的生长有较强的促进作用;芒果根系周围土壤对花生的萌发和生长有抑制作用,而对玉米的萌发和生长有促进作用;槟榔、橡胶、木薯根系周围土壤对玉米的萌发和生长都有一定的促进作用;荔枝根系周围土壤对玉米、黄豆和南瓜的萌发和生长都有促进作用;番石榴根系周围土壤对玉米、黄豆和花生的萌发和生长都有促进作用。 经萃取胡椒、芒果、黄皮叶片浸提液的乙酸乙酯相、正丁醇相和水相三种不同极性部分对受体萌发和生长的影响实验结果表明:芒果叶片浸提液的正丁醇相、水相和胡椒浸提液极性较大的部分即正丁醇相和水相对受体植物的抑制作用较强,萌发和生长的抑制率都达到90%以上。黄皮叶片浸提液的水相对柱花草和萝卜的萌发和生长也都有很好的抑制作用。实验中对芒果叶片浸提液的正丁醇相进行了浓缩、萃取、柱层析分离纯化,再用紫外—可见分光光度计扫描波长,结果表明该组分在λ=262nm处有较强的吸收。文献资料记载,芒果苷在波长262nm处有强烈吸收。所以芒果叶片浸提液中具有化感作用的物质可能为芒果苷或芒果苷类似物。 实验对荔枝、胡椒、芒果、黄皮、木薯、槟榔、橡胶、番石榴八种供体植物进行化感作用的测定和分析结果表明,胡椒、芒果、木薯、荔枝、番石榴、橡胶都具有一定的化感潜力。因此,为减轻其负面的影响,建议橡胶园里不要间种黄豆和花生;荔枝园里也不适合间种花生。建议荔枝园间种玉米和黄豆,番石榴园里可以间种玉米、黄豆和花生,木薯可以间种花生。此外,胡椒和芒果叶片浸提液对稗草和马唐有较强的抑制作用,今后可以深入研究如何利用这些植物源物质来防除农田杂草的潜力。
[博士论文] 刘丰茂
农药学 中国农业大学 2000(学位年度)
摘要:该研究依据北京地区农药生产使用情况、农药污染情况以及它们的理化性质,初步确定了43种待研究农药,包括22种除草剂、17种杀虫剂、3种杀菌剂、1种生长调节剂.该文对HPLC-UVD体系在环境监测中的应用进行了研究.NPD、MSD的结合使用,是目前农药污染监测的最有力手段,该研究对多种农药在NPD、MSD的行为进行了研究.质谱检测器是环境监测体系中主要的定性确证手段,该研究选用SIM模式建立了32种农药的确证体系.环境水中的农 药浓度是极底的,一般仅有μgL<'-1>级,有效提取浓缩是进行监测的基础,该文对常用的 液分配法和固相萃取法进行了比较和研究.用GC-MS对检出农药进行确证的环境水监测体系 ,并通过调查确定采样点位置及采样时间,初步拟定了海淀区环境水中农药的监测体系.在监测海淀区部分水域水样本时,从雨水中检测到了甲萘威、马拉硫磷、乙草胺、敌敌畏、异丙甲草胺;从地表水中检测到了敌敌畏、毒死蜱;从地水中检测到了异丙甲草胺.结果表明农田用药威胁着水体安全.农药淋溶性大小是评价农药对地下水是否有污染影响的一个重要指标.该研究选用土壤薄层层析法对实验田中不同深度土壤中9种农药的淋溶行为进行了比 较研究,初步探讨了农药污染水体的机理.
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