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[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[博士论文] 耿朝辉
护理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  本课题立足于体力活动(Physical Activity,PA)对乳腺癌患者化疗期及长期康复产生的积极作用,旨在充分了解乳腺癌患者化疗期体力活动水平与亚人群特质,获悉患者体力活动纵向变化轨迹的前提下,结合乳腺癌患者及医务人员对体力活动的体验及认知,初探乳腺癌患者化疗期体力活动规律,基于此,构建乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案,并完成干预依托的移动手机应用程序(Application,App)开发,进而检验其干预效果,以期达到增强患者活动意识,改善体力活动行为现状,进一步提升患者化疗期体验,提高生活质量的目的。
  研究方法:
  本研究共分为三部分:
  1、乳腺癌患者化疗期体力活动规律的研究
  (1)乳腺癌患者化疗期体力活动的现状调查及人群特质研究
  基于前期文献及理论研究,确立横断面研究纳入的变量,进而对435名乳腺癌患者进行问卷调查,了解其化疗期体力活动水平现状,并通过潜在类别分析(Latent Class Analysis,LCA)探究患者体力活动行为的亚人群特征。
  (2)乳腺癌患者化疗期体力活动纵向变化轨迹的研究
  采用纵向研究设计,分别对153名乳腺癌患者化疗前、化疗第一疗程后、化疗6周后及化疗3个月后T1-T4四个时间点体力活动进行问卷调查,运用增长混合模型(Growth Mixture Model,GMM)识别样本子总体的体力活动随时间变化的不同轨迹类型。
  (3)乳腺癌患者及医务人员对化疗期体力活动体验与认知的质性研究
  采用质性研究方法,分别对18名乳腺癌患者及14名医务人员进行质性访谈,了解患者化疗期体力活动的体验,并探究医务人员对化疗期体力活动的认知,收集体力活动相关临床照护实践经验,探究影响体力活动的有益因素或阻碍,进而探讨开展体力活动移动干预的必要性及可操作性建议。
  2、基于体力活动规律的乳腺癌患者化疗期移动医疗干预方案的构建
  基于前期挖掘出的化疗期体力活动规律,在社会认知理论、自我效能理论、计划行为理论的框架指导下,结合文献研究起草体力活动干预文稿及配套管理方案,召开专家工作组会议并进行专家一对一咨询,修订并确定干预方案的细节、后期技术开发要点,最终确立干预方案终稿。
  3、基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与应用
  (1)基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与测试
  依据前期阶段性研究结果明确的乳腺癌患者移动医疗干预需求,应用敏捷开发模式,由技术人员与研究者通力合作进行iOS系统、Android系统及PC端后台数据管理系统的研发与测试。3名研究人员在开发过程中对不断交付的分模块进行功能检测,软件开发完成后纳入4名乳腺癌患者对App测试版进行功能测试并完成研究后系统可用性评估问卷调查及反馈,对应用程序进行初步评价。
  (2)基于App的乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案的适用性检验
  以成功研发的“乳腺康”手机应用程序为主要技术手段,采用混合研究方法,对20名乳腺癌化疗期患者开展为期三个月的体力活动干预,对移动医疗干预方案进行适用性检验,通过量性研究确认该方案对提升乳腺癌患者化疗期体力活动水平的作用效果,通过质性访谈了解患者对干预方案及App使用的感受及体验。
  研究结果:
  1、乳腺癌患者化疗期体力活动规律的研究
  (1)乳腺癌患者化疗期体力活动的现状调查及人群特质研究
  横断面调查结果显示乳腺癌患者化疗期总体力活动平均水平为1441.94±1880.703MET-min/w,每周静坐时间约为5小时,完全静坐人数达43.7%,研究对象中仅有15例有重体力活动,176例报告了有中等体力活动,总体体力活动达标人数为40.9%。LCA结果显示研究对象被识别为三类亚人群:体力差、睡眠情绪障碍组(N=69),体力中低等、疲乏组(N=108)与体力中低等、无明显症状组(N=258)。
  (2)乳腺癌患者化疗期体力活动纵向变化轨迹的研究
  153名乳腺癌患者化疗期T1-T4体力活动纵向数据描述性结果显示,除T4外,患者的T1-T3体力活动三个时间点的总体力活动平均水平均比横断面调查平均水平低,T2即化疗第一疗程结束后,体力活动水平下降至最低水平。该样本体力活动等级水平分类结果显示:T1与T2时间点静坐人数比例最大,分别占到44.7%与68.8%;T3与T4时间点体力活动活跃者人数比例较大,分别为44.4%与56.8%。增长混合模型将该人群识别为两类:类别1(N=99)的个体体力活动起始值较高同时随时间总体呈上升趋势;类别2(N=54)的个体体力活动值起始较低在化疗第一疗程下降至最低点,随即缓慢上升。
  (3)乳腺癌患者及医务人员对化疗期体力活动体验与认知的质性研究
  通过对18名乳腺癌患者的质性访谈分析得出四个主题:化疗扭转生活常态,体力活动动机不足;治疗相关副作用应接不暇,体力活动步履维艰;躯体心智遇折磨,社交经济遭挑战;化疗适应促成长,社会支持添动力。通过对14名医务工作者的质性访谈分析得到的主题如下:患者体力活动需求凸显,潜在益处逐步感知;体力活动相关指导匮乏,连续专业性照护支持待加强;推荐个性化安全的体力活动干预,多角度增强患者依从性及参与度。
  2、基于体力活动规律的乳腺癌患者化疗期移动医疗干预方案的构建
  经专家工作会议及专家一对一咨询后确立的干预方案终稿包含以下内容:拟实现的干预目标、干预核心内容、其它干预要素(干预时间、地点、对象、手段、流程、策略及效果评价工具等);确立的软件开发功能要点包括移动用户终端及后台数据管理平台两部分。
  3、基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与应用
  (1)基于App的乳腺癌患者体力活动移动医疗干预平台开发与测试
  经过三名软件工程师系统开发及研究者与用户的多轮软件测试及修正,“乳腺康”手机应用程序客户端最终锁定为以下五个主页面:首页、日历、圈子、运动、个人中心。后台数据管理系统可实现用户管理、知识库管理、动态管理、评论管理、短信发送、数据Excel导出等功能。4名乳腺癌患者就App的系统有用性、信息质量、界面质量与总体评价等方面做出初步评价,问卷测评得分分别为4.5,4.33,4.78与4.5。
  (2)基于App的乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案的适用性检验
  纳入干预的20名研究对象,有12名患者表示其运动习惯或兴趣为散步或快走,根据其基线测评结果进行群组差异化干预,分为活跃组(N=12)及静坐组(N=8)。三个月后观察结果显示,用户累计使用App的时间平均每人每周达40min,每人每周登录App的次数为3次。量性研究结果表示患者的总体体力活动有所改善,总体体力活动平均增长了945.70MET-min/w。干预前后患者在交通有关、闲暇时间、步行及总体力活动水平有统计学差异。质性研究结果提示患者对干预方案及App的认可度高,在有用性及易用性方面评价较好。
  研究结论:
  乳腺癌患者化疗期体力活动总体水平偏低,体力活动达标人数严重不足;横断面调查识别出的体力活动三组潜类别人群、纵向研究探究到的两组潜类别发展轨迹,合并患者及医务人员的质性访谈共同为构建乳腺癌患者化疗期体力活动移动医疗干预方案提供依据与理论支撑,该方案对促进患者化疗期体力活动行为的改变,提高其活动意识、改善化疗期体验具有重要作用,研发的手机App具有较高的接受度,易用性、可用性及有效性效果突出。
[硕士论文] 房蒙
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  乳腺癌作为女性所罹患恶性肿瘤中最常见的病种之一,约占所有恶性肿瘤的30%。尽管包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗在内的综合治疗显著降低了早期死亡率,但乳腺癌仍然是女性癌症死亡最常见原因中的第二位。恶性肿瘤的发生是由多种致癌因素引起的,其特点是细胞增殖失控和远处转移。骨是晚期乳腺癌最常见的转移部位,据报道发生率约为60-80%,骨转移大大增加了病理性骨折和脊髓压迫等并发症,严重影响生活质量。鉴于晚期乳腺癌患者发生骨转移的后续治疗策略及疗效较为有限。故探明乳腺癌骨转移的分子生物学机制,寻求新的药理学靶点,对患者的预后意义重大。
  微纤维相关蛋白5(Microfibrillar-associated protein5,MFRP5)也称为微纤维相关糖蛋白2(microfibril-associated glycoprotein2,MAGP2),是细胞外弹性微纤维的一个组成部分,在骨骼生长、心血管发育、肺泡弹性发育和马凡综合征中发挥重要作用。研究表明,MFAP5由骨髓间充质基质细胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)分泌,并在造血和免疫系统中发挥作用,而MFAP5的缺失可预防小鼠骨质疏松。这些结果表明MFAP5在骨微环境中的关键作用。最近的研究进一步表明,MFAP5在头颈部恶性肿瘤、胰腺癌、肺癌和舌癌中过度表达,但是MFAP5在这些肿瘤中的作用仍有待阐明。已有研究表明,血清MFAP5水平与卵巢癌患者预后负相关,而癌细胞分泌的MFAP5能够促进肿瘤增殖,内皮细胞迁移,肿瘤血管生成和化疗药物耐药。然而,课题组成员经过文献检索,发现关于MFAP5在乳腺癌骨转移中作用机制的文献尚属少数。
  由于MFAP5在恶性肿瘤和骨微环境中的重要作用,设计实验,想进一步了解MFAP5在乳腺癌骨转移中的作用。在本研究中,首先验证了MFAP5在乳腺癌骨转移灶中的高表达,并探究了MFAP5对乳腺癌肿瘤细胞增殖和迁移的影响,并进一步探讨了可能的分子机制,特别是ERK/MMP信号通路。
  方法:
  我们的研究采用在海军军医大学附属长征医院收集的乳腺癌原发病灶、癌旁正常组织及骨转移组织。首先,进行MFAP5的免疫组化染色,随后通过western blot及qR-T PCR实验,分别在蛋白水平和mRNA水平验证MFAP5的表达。
  第二部分的实验中,首先构建MFAP5过表达质粒,并通过PCR扩增的MFAP5的密码序列插入pcDNA3.1+质粒中。一方面进行CCK8实验:在含10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养两珠乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231,细胞用DNA转染试剂或siRNA转染质粒。用过表达质粒或siRNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞以每孔5×103的起始密度接种在96孔板中,48h后使用细胞计数试剂盒进行计数,使用酶标仪在450nm处测量吸光度来测量结果。随后,使用8-μm孔径的transwell室进行transwell迁移试验。消化并计数用过表达(OE)质粒或siRNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞。
  为进一步研究MFAP5调控乳腺癌骨转移的分子机制,进行western blot实验,研究MFAP5与MMP2,MMP9,p-FAK,FAK,p-Erk1/2,Erk1/2,p-cJun(Set63),p-cJun(Set73),cJun之间表达的相互影响及关系。
  实验中,均使用SPSS19.0统计软件进行统计分析。数据格式为平均值±平均值的标准误差,数据比较使用独立样本t检验。所有实验均重复3次,并纳入代表性结果。p<0.05被认为是有统计学意义的。
  结果:
  IHC显示MFAP5主要在细胞间隙中表达,并且在骨转移灶中的表达显著高于原发灶。western blot检测进一步证实MFAP5在骨转移中的表达高于原发灶。此外,qRT-PCR检测结果显示,在乳腺癌骨转移灶中MFAP5的mRNA水平显著高于原发灶(p<0.05)。MFAP5在MDA-MB-231细胞中MFAP5的表达水平最高,在MCF7细胞中最低。
  Western blot实验证实了过表达质粒和siRNA分别对MFAP5的表达起到促进及抑制作用。MCF7和MDA-MB-231细胞中进行的CCK8实验显示,MFAP5过表达后细胞活力明显增强,而抑制MFAP5后细胞增殖明显下调,表明MFAP5介导乳腺癌的细胞增殖。Transwell实验显示,MFAP5过表达的细胞迁移能力明显增强,而抑制MFAP5后,细胞迁移能力显著降低。这些结果提示MFAP5可能通过增强细胞的迁移能力而促进乳腺癌的转移。
  在MCF7和MDA-MB-231细胞中,MFAP5过表达时MMP2和MMP9的mRNA水平显着增高,而MMP7和MMP14的mRNA水平几乎不变。Western blot进一步表明,与OE-Ctrl质粒相比,转染OE-MFAP5质粒的MMP2和MMP9的表达显著上调,相反,siRNA对MFAP5的抑制则明显抑制了MMP2和MMP9的表达。这些结果表明MFAP5可能通过调节MMP2和MMP9的表达在乳腺癌骨转移中发挥作用。MFAP5的过表达对FAK,Erk1/2和cJun的表达无明显影响,但MFAP5明显激活了FAK,Erk1/2和cJun的磷酸化。相反,通过siRNAs抑制MFAP5的表达则明显抑制了p-FAK,p-Erk1/2和p-cJun的表达。这些结果提示MFAP5可能通过ERK信号通路调控MMP2和MMP9的表达。
  结论:
  通过本研究,首先报道了乳腺癌骨转移灶中MFAP5表达水平相比原发灶的明显上调,并进一步发现MFAP5过表达加速了乳腺癌细胞的增殖和迁移,而当MFAP5被抑制时则呈现相反的效果。此外,MFAP5能够能激活ERK信号通路,增加MMP2和MMP9的表达,相反,抑制MFAP5的表达后,MMP2、MMP9、p-FAK、p-Erk1/2和p-cJun的表达也受到抑制。这些结果表明MFAP5作为癌基因在乳腺癌骨转移中发挥作用,希望通过我们的研究能够找到乳腺癌骨转移新的诊断和治疗方法。
[博士论文] 鲍一
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肾癌是人类常见的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升。约有20%的患者在初次诊断时就已经发生转移,而近30%的局限性肾癌在手术切除肿瘤后仍会出现复发转移。索拉非尼(Sorafenib)早在2006年就被国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准作为肾癌的一线治疗,然而,约有20%的患者在初次用药时即表现出对索拉非尼的先天耐药,而剩余的绝大多数患者在6-15个月左右也会出现继发性耐药,这些因素导致患者在使用索拉非尼治疗后总生存期延长有限。目前肾癌靶向治疗的难点在于耐药机制不明,缺乏有效的生物学标志物来预测索拉非尼的疗效,在出现耐药后没有很好的方法逆转耐药。血管生成素类似物(ANGPTL)在肾癌靶向耐药过程中所起到的作用以及机制尚未见报道。本研究拟探讨血管生成素类似物在肾癌索拉非尼耐药过程中所起到的作用,寻找相关的分子标志物以及逆转耐药的联合治疗靶点,为提高肾癌靶向治疗的效果、进一步延长患者的总生存期提供依据。
  方法:
  1.选取7种常见的肾癌细胞系,测定索拉非尼对其的半数抑制浓度(IC50);同时测定这些细胞中ANGPTL家族8个成员(ANGPTL1-8)的mRNA表达量,结合IC50筛选可能与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。
  2.选取20例接受索拉非尼治疗的肾癌患者肿瘤组织标本,其中对索拉非尼耐药和敏感的各10例。测定其中ANGPTL1-8的mRNA表达量,进一步筛选与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。结合1的结果,发现ANGPTL3与肾癌索拉非尼耐药关系最大,于是选择ANGPTL3为进一步验证的对象。
  3.进一步扩大样本量验证ANGPTL3mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。在一个有68例肾癌样本的队例中研究ANGPTL3mRNA表达量和其对索拉非尼反应性之间的关系。
  4.在蛋白层面验证ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。选择32例肾癌(16例耐药和16例敏感)组织标本进行Western blot检测,比较ANGPTL3表达量和对索拉非尼敏感性之间的关系。收集136例肾癌患者的肾癌资料(70例术后索拉非尼治疗,66例术后无辅助治疗),免疫组化检测ANGPTL3表达量并进行生存分析。
  5.使用两条独立的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低肾癌细胞株中ANGPTL3的表达量,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  6.使用慢病毒转染肾癌细胞株,构建稳定过表达ANGPTL3的肾癌细胞株,使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。
  7.将稳定过表达ANGPTL3的OS-RC-2细胞注射于裸鼠皮下构建皮下荷瘤模型。裸鼠予以索拉非尼灌胃(80mg/kg/day)模拟临床给药。每周测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线,并通过小动物活体成像检测肿瘤大小。
  8.使用人类蛋白组芯片筛选和ANGPTL3结合的蛋白,并通过siRNA缩小筛选范围,最后用蛋白质免疫共沉淀和激光共聚焦验证获得与ANGPTL3相结合的蛋白。并通过构建ANGPTL3的截短体明确ANGPTL3发挥作用的结构域。
  9.利用Rescue方法,证明上述筛选的蛋白在ANGPTL3促进肾癌索拉非尼敏感性过程中发挥作用,并进一步明确其介导调控肾癌索拉非尼敏感性的具体机制。
  结果:
  1.肾癌细胞株中ANGPTL3和ANGPTL7的mRNA表达量与索拉非尼对肾癌的半数抑制量相关。
  2.小样本的肾癌组织筛选发现ANGPTL3的mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药性相关。结合1的结果发现ANGPTL3和肾癌索拉非尼耐药性可能有关,于是选择ANGPTL3作为进一步的研究对象。
  3.扩大样本量验证上述结论:在对索拉非尼耐药的组织和细胞系中ANGPTL3低表达,而在对索拉非尼敏感的组织和细胞系中ANGPTL3高表达。
  4.蛋白水平的验证同样证实ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼敏感性相关。ANGPTL3的表达量和预后相关:ANGPTL3高表达组中,服用索拉非尼的肾癌病人预后要好于未服用索拉非尼的肾癌病人;但是ANGPTL3低表达组中服用索拉非尼无效。
  5.敲低ANGPTL3后肾癌细胞对索拉非尼的敏感性下降:IC50升高,凋亡减少。
  6.过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:IC50降低,凋亡增加。
  7.体外实验证实过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:过表达ANGPTL3的肾癌移植瘤在索拉非尼作用下肿瘤生长更慢。
  8.ANGPTL3的FBG-like结构域和Focal adhesion kinase(FAK)相互结合。
  9.过表达FAK可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药,而过表达ANGPTL3可以逆转此效应。敲低ANGPTL3可以提高肾癌细胞对索拉非尼的耐药性,同时敲低FAK可以抵消此效应,而使用FAK的激酶抑制剂PF-562271则并不能逆转ANGPTL3敲低所导致的耐药性提高。进一步研究发现索拉非尼可以抑制FAK的磷酸化,并且促进FAK的入核,进而导致了p53的降解;而过表达ANGPTL3可以抑制FAK的入核,从而抑制p53的泛素化降解,提高p53的表达量。
  结论:
  ANGPTL3在肾癌索拉非尼敏感的组织中高表达,在索拉非尼耐药的组织中低表达,并且索拉非尼在治疗ANGPTL3高表达的肾癌时有着较好的疗效。在索拉非尼作用下FAK进入细胞核促进p53的泛素化降解,导致细胞的耐药;ANGPTL3通过结合FAK,影响了FAK的入核,抑制了p53的泛素化,从而促使p53保持在一个较高的水平,促进了细胞的凋亡等过程,提高了索拉非尼的治疗效果。因此,ANGPTL3可能作为预测肾癌索拉非尼敏感性的生物学标志物,其下游FAK的入核以及p53的泛素化降解也有望成为肾癌靶向治疗的新靶点,有着较好的临床转化前景。
[硕士论文] 楼棪
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨转移是乳腺癌患者肿瘤发展的终末期。多达70%的BC患者在尸体解剖时可见骨转移灶。骨转移病灶主要是溶骨性的,因为BC细胞可以调节骨肿瘤微环境。乳腺癌细胞分泌的细胞因子可以进一步促进破骨细胞分化成熟,促进破骨活动,破骨细胞活动增强可释放更多的因子刺激乳腺癌细胞,进一步促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,进一步促进转移病灶的发展。形成一个“恶性循环”。目前治疗BC骨转移的策略主要集中在打破这种“恶性溶骨循环”。绝大多数乳腺癌产生溶骨性骨转移。该过程的特征在于过度活化的破骨细胞形成和随后的骨破坏。BC细胞在定植于骨之后,甚至之前,可形成一个复杂的多基因程序性“恶性溶骨循环”,重塑骨微环境,促进癌症发展。IL-6,PTHRP(甲状旁腺激素相关蛋白)和TNFα(肿瘤坏死因子α)等BC细胞分泌的细胞因子可刺激成骨细胞,上调RANKL/OPG(骨保护素)比例,从而进一步刺激髓系破骨细胞前体细胞的分化。同时其他细胞因子如IL-11(白细胞介素11)和OPN(骨桥蛋白)也能直接促进其向破骨细胞分化。活化的破骨细胞降解骨基质,并释放主要储存在骨基质中的TGFβ(转化生长因子β),BMPs(骨形态发生蛋白)和IGFs(胰岛素样生长因子),反过来,促进BC进展。
  有研究已经证明了乳腺癌细胞系中PAF及其受体PTAFR的表达。在肿瘤微环境中,PAF由浸润的炎症细胞和肿瘤细胞本身分泌和积累,形成自分泌循环。PTAFR是G蛋白偶联受体(GPCR)。PAF/PTAFR信号通路激活导致复杂的细胞反应,包括细胞运动的增加,IL-6(白细胞介素6)和MMP(基质金属蛋白酶)表达的上调以及NF-κB信号的激活。迁移能力的增加是癌细胞形成转移性病变的重要特征,包括骨转移。已发表的文献和我们的结果都揭示了PAF处理后乳腺癌细胞的迁移能力增加。
  在本实验中,我们首先通过生物信息学分析提供了PAF/PTAFR信号通路在调节BC骨转移和破骨细胞生成中起重要作用的线索。
  在目前的研究中,我们证明PAF可以促进BC细胞迁移并诱导BMMs分化。海风藤酮可以减弱这两个过程,并且表现出很小的细胞毒性,可以被认为是BC骨转移的潜在治疗剂。与“恶性溶骨循环”相比,PAF能够通过两种平行方式促进BMMs分化为破骨细胞。一方面,PAF能刺激BC细胞上调IL-6,IL-11,MMPs和NF-κB等下游信号,进一步激活破骨细胞生成。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。在目前的研究中,我们证明了海风藤酮可以抑制BC诱导或PAF直接刺激破骨细胞生成。海风藤酮处理后破骨细胞分化标记的表达均下调。这个过程主要是由于NF-κB激活的抑制。
  总之,海风藤酮可能是一种有效的策略,通过阻断PAF/PTAFR信号通路,减弱乳腺癌形成的溶骨性骨转移。
[硕士论文] 夏清明
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:前列腺癌是目前西方发达国家中男性肿瘤发病率和死亡率最常见的肿瘤之一。近年来我国前列腺癌发病率也在逐年攀升。雄激素剥夺治疗一直以来是前列腺癌最经典的治疗方式,但随着治疗的前行,前列癌晚期几乎都会发展为雄激素非依赖性,传统的治疗方式对雄激素非依赖性前列腺癌疗效不佳。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤的一种新型治疗手段,在肿瘤临床治疗上已取得了较好的疗效。本课题选用含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)免疫激活剂,通过穿膜肽修饰的多壁碳纳米管为介导,研究其抗雄激素非依赖性前列腺癌的体内外作用。
  本课题第一部分报道了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体的构建和表征。通过多肽固相合成法合成含有3个组氨酸和6个精氨酸的多肽H3R6,利用制备液相进行纯化以及高效液相色谱和质谱进行纯度分析,检测其纯度符合实验要求。用浓硫酸和浓硝酸对多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)进行羧基化,然后再和多肽反应形成载体MHR。利用核磁共振氢谱,红外光谱、透射电镜和热比重分析鉴定复合物合成成功。利用MHR载体中精氨酸富含正电荷,CpG是核酸类物质带负电荷,通过静电作用形MHR/CpG纳米复合物。在N/P=6时,MHR载体能够有效负载CpG免疫激活剂,当N/P=20时电位处于一个较稳定的状态,电位约=25±2.62mV。通过HEK293转染实验,得出MHR载体在N/P=20转染效率较高。
  本课题第二部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂进行体外细胞学评价,RAW264.7细胞明显对负载CpG纳米免疫制有较高的摄取,CpG能够和胞内内吞体膜上的TLR9受体结合。CCK8细胞毒性实验中,MHR载体对DU145、RM-1和RAW264.7细胞的毒性较低。体外免疫活性ELISA和PCR实验结果显示,MHR/CpG对RAW264.7细胞刺激促进IL-6和TNF-α促炎因子的分泌明显高于单体CpG组,和LPS(10ng/ml)刺激效应具有可比性。
  本课题第三部分报道了MHR/CpG纳米免疫制剂体内的抗前列腺癌效应和免疫活性。我们成功构建了DU145前列腺癌BALB/c裸鼠和RM-1前列腺癌BALB/c小鼠模型,通过小动物活体成像系统观察结果显示,MHR/CpG可以有效的在肿瘤和肿瘤引流淋巴结部位蓄积,有靶向效果。体内药效结果表明MHR/CpG对前列腺癌的增殖有较强的抑制作用,从小鼠脾脏淋巴细胞流式分析看出MHR/CpG可以在体内有效刺激CD4和CD8T细胞的分化增殖。同时从小鼠的肾脏和肺肺脏的HE染色图看出,MHR/CpG的体内用药安全性较高。
  本课题成功构建了负载免疫激活剂CpG的肽修饰多壁碳纳米管载体,为去势抵抗性前列腺癌治疗提供了新策略,同时也为其它肿瘤的治疗提供了好的参考和借鉴。
[硕士论文] 王卫平
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  临床上mTOR抑制剂应用于多种肿瘤的治疗,以依维莫司在转移性肾癌治疗中的应用较为广泛。但实际应用中疗效个体差异较大,耐药现象较为常见,大大限制了其疗效。在mTOR抑制剂耐药机制中,肿瘤的遗传学改变与之关系密切。现有相关研究多局限于从有限差异疗效病例中寻找耐药相关基因靶点,尚缺乏从全基因组水平评估基因的功能改变与mTOR抑制剂药敏之间相关性。而CRISPR/Cas9技术的发展应用为研究基因功能提供了巨大的便捷。将采用CRISPR/Cas9文库筛选的方法,从全基因组水平筛选mTOR抑制剂耐药相关靶点,并进行靶点功能验证及临床相关性分析,以期为逆转mTOR抑制剂耐药提供新的理论和依据。
  方法:
  1、通过质粒文库扩增、病毒文库制备、筛选条件摸索、耐药筛选等过程建立肾癌依维莫司耐药靶点CRISPR/Cas9筛选模型,并进行高通量测序。
  2、利用MAGeCK等一系列生物信息学方法,进行测序数据的质控和分析,结合体外耐药细胞株转录组测序分析,筛选若干潜在耐药靶点;
  3、利用CRISPR敲除、质粒转染方法,结合药敏实验、平板克隆和凋亡实验等,对靶点进行进一步的功能验证;
  4、利用实时定量PCR的方法,在接受依维莫司治疗的肾癌组织标本中验证耐药靶点表达水平与临床疗效的相关性;
  5、利用组织芯片的方法,结合临床数据库数据,分析新型靶点在评价肾癌预后中的临床价值。
  结果:
  通过CRISPR/Cas9耐药基因筛选、生信分析、临床疗效相关性分析以及药敏功能验证,发现,靶向敲除MAGIX后能够介导肾癌依维莫司耐药,而过表达则能逆转该过程。较正常肾癌细胞肾,在同样浓度依维莫司作用下,靶向敲除MAGIX后,细胞克隆形成能力明显增强,而凋亡细胞比例明显减少。同时,组织芯片分析和TCGA数据库分析发现,在肾癌患者整体人群中,MAGIX表达水平越低提示患者预后越差。
  结论:
  MAGIX的差异表达水平与肾癌依维莫司治疗药物反应性相关,可作为指导肾癌依维莫司个体化治疗的生物标记物。在临床病理标本中发现,MAGIX在依维莫司耐药组中表达水平低于敏感组。此外,MAGIX的低表达提示肾癌患者预后差,具有预测肾癌预后的潜在临床价值,相关作用机制尚需进一步探讨明确。
[硕士论文] 沈吉子
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  通过对妊娠滋养细胞疾病患者的临床资料进行回顾性分析,研究分析可能影响疾病预后的相关因素,总结临床诊治经验和不足。
  研究方法:
  1.回顾性分析2009~2016年海军军医大学附属第一医院妇产科收治的55例妊娠滋养细胞疾病病历资料,滋养细胞肿瘤按妊娠滋养细胞肿瘤解剖学2015FIGO分期及FIGO/WHO预后评分系统进行分组、评分。
  2.用卡方检验分析葡萄胎患者清宫次数与血HCG转阴时间的关系;
  3.用卡方检验分析妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic neoplasiaGTN)患者单纯化疗、化疗联合手术治疗对血HCG转阴时间的影响;
  4.统计分析低危组及高危组妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)患者初治采用不同化疗方案的治疗效果;
  5.用Kaplan Meier生存分析及Cox回归分析GTN患者临床特征与治愈时间的关系;
  研究结果:
  1.比较葡萄胎患者清宫1次与清宫2~3次的血HCG转阴时间,清宫1次者血HCG在4周内转阴者有1例,>4周转阴者为10例。而清宫2~3次组中有2例在4周内转阴,余13例均>4周趋于阴性,两者差异无统计学意义(P=0.453,P>0.05)。
  2.比较GTN患者单纯化疗及化疗+手术治疗患者的血HCG转阴时间,单纯化疗患者中血HCG转阴时间≤4周7例,>4周8例,而化疗+手术患者血HCG转阴≤4周4例,>4周7例,两组差异无统计学意义(P=0.599,P>0.05)。
  3.低危组初治治疗采用单药方案有效率为66.7%(2/3),多药联合有效率为100%(7/7)。高危组GTN化疗患者初治治疗采用单药有效率为75%(3/4),联合用药有效率为83.3%(10/12)。
  4.Cox回归单因素分析发现足月产史、流产史与化疗完全缓解时间有关(均P<0.05),年龄接近有统计学意义(P=0.051);多因素分析显示足月产史(P=0.020)是影响GTN化疗完全缓解时间的独立因素。Kaplan-Meier生存分析发现GTN化疗完全缓解时间与年龄(P=0.043)、足月产史(P=0.016)、流产史(P=0.026)有关。
  5.除外年龄>40岁且无生育要求的患者后,葡萄胎患者治疗后再次妊娠率为31.8%,GTN患者的再次妊娠率为6.9%,均为化疗后患者。
  研究结论:
  1.增加清宫次数并不能缩短血HCG的转阴时间,故葡萄胎患者一经诊断及时行清宫术,但如果没有持续性出血,一般不必要行二次清宫。
  2.手术联合化疗与单纯化疗相比并不能显著缩短GTN患者血HCG转阴时间,故GTN患者仍首选化疗,手术可能会对部分患者有益,但不适用于全部患者,临床上需严格掌握手术指征。
  3.对于年龄大、有过足月产史及流产史的妇女化疗完全缓解时间较无以上危险因素患者时间长。治疗期间及治疗后需密切监测血HCG的动态变化,避免耐药及复发影响预后。
  4.妊娠滋养细胞肿瘤患者症状不典型,临床表现形式多样,除考虑妊娠相关疾病外,要警惕妊娠滋养细胞疾病,避免漏诊、误诊。
  5.不足:本研究为回顾性分析,病例数少,部分化疗不规范,有可能影响统计分析,结果需进一步扩大样本量分析验证。
[硕士论文] 戴利和
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  在中国,膀胱癌(Bladder cancer,BC)发病率居泌尿系统恶性肿瘤之首。依据生长方式的不同,膀胱癌可以分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),前者占初诊膀胱癌患者的70%左右,主要采用经尿道膀胱恶性肿瘤电切术(TURBT),5年生存率达90%,NMIBC患者术后易复发进展,约15%术后会进展为MIBC,患者预后变差;后者占30%左右,主要采用根治性膀胱切除术,术后约50%发生转移,发生转移后5年生产率仅为5%。膀胱癌侵袭进展对人类健康造成很大的威胁,明确膀胱癌侵袭进展的机制,对改进膀胱癌现有治疗和预后判断具有重要作用。
  癌蛋白Gankyrin在众多恶性肿瘤的形成中发挥促癌作用。Gankyrin最初在肝癌研究中被发现,近来研究表明Gankyrin在结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肺癌和食道癌等多种恶性肿瘤发挥促癌作用,且与肿瘤恶性程度有关。目前,Gankyrin在膀胱癌发生、发展中的具体作用和分子机制尚未明确。
  前期对10例膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,结果显示Gankyrin在膀胱癌组织中表达高于癌旁正常组织,根据膀胱癌经典分子起源学说及最新膀胱癌组织高通量测序结果,P53信号通路与膀胱癌侵袭性高度相关,而根据文献检索,Gankyrin为P53分子的上游调控分子,因此推测Gankyrin在膀胱癌的侵袭进展过程中发挥重要作用。
  目的:
  研究Gankyrin在膀胱癌中的表达情况,探讨其在膀胱癌侵袭进展中的作用及机制,以期为膀胱癌靶向治疗和预后判断提供新依据。
  方法:
  1.对10对膀胱癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行转录组测序,根据膀胱癌发生分子机制假说及文献报道,筛选出Gankyrin作为研究对象。
  2.提取90对膀胱癌组织及癌旁正常组织的RNA及20对膀胱癌组织及癌旁正常组织的总蛋白,分别通过qRT-PCR和western blot验证Gankyrin在膀胱癌中的表达情况。
  3.通过公共数据库Oncomine挖掘数据,验证Gankyrin在膀胱癌患者的肿瘤组织中存在高表达。
  4.通过免疫组化,对3例肌层浸润性膀胱癌病理大切片行Gankyrin染色,分析肿瘤侵犯粘膜层、浅肌层、深肌层时的表达情况,研究其和膀胱癌侵袭性的关系;分析130例膀胱癌患者肿瘤组织中Gankyrin的表达量,探讨其与膀胱癌临床病理资料和预后的关系。
  5.通过western blot和qRT-PCR检测Gankyrin在正常尿路上皮、2种非肌层浸润性膀胱癌、2种肌层浸润性膀胱癌细胞系中的表达量。
  6.利用慢病毒载体构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞系和Gankyrin稳定敲减的UMUC3细胞系,通过EdU细胞增殖试验和NOD/SCID小鼠的皮下成瘤实验,研究Gankyrin过表达和敲低对膀胱癌细胞增殖、成瘤能力的影响。通过细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭实验,检测Gankyrin对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测Gankyrin对膀胱癌细胞凋亡的影响。
  7.利用BBN诱导小鼠自发产生膀胱癌,通过免疫组化检测Gankyrin在小鼠自发膀胱癌模型中的表达情况并探讨其意义。
  8.通过连续切片免疫组化染色,分析32例膀胱癌组织中Gankyrin和MDM2表达的相关性,利用western blot检测Gankyrin过表达和敲低后MDM2的表达水平,通过免疫荧光检测Gankyrin和MDM2在膀胱癌中的亚细胞定位,利用蛋白免疫共沉淀检测Gankyrin与MDM2在膀胱癌中的相互作用,以探讨Gankyrin调控膀胱癌侵袭进展的可能机制。
  结果:
  1.转录组测序结果表明Gankyrin表达量在9例膀胱癌组织中高于对应癌旁正常尿路上皮组织,对10对癌及癌旁组织RPKM值进行统计分析,Gankyrin在膀胱癌组织中表达显著上调(P<0.05),差异表达倍数为1.21倍。
  2.通过qRT-PCR检测90例膀胱癌患者中Gankyrin mRNA的表达情况,发现其中66例患者肿瘤组织中Gankyrin mRNA表达量高于癌旁正常组织,24例患者中肿瘤组织Gankyrin表达量低于癌旁组织,Gankyrin高表达比例为73.3%。对20对膀胱癌组织及癌旁正常组织进行western blot检测,发现其中17例样本的肿瘤组织中Gankyrin蛋白的表达量明显高于癌旁正常组织。
  3.公共数据库Oncomine检索发现Dyrskjot Bladder3数据集中,Gankyrin mRNA在膀胱癌患者肿瘤组织中的表达含量高于正常尿路上皮组织(P<0.01)。
  4.在3例膀胱癌病理大切片中,Gankyrin表达量从粘膜、浅肌层到深肌层逐渐升高;130例免疫组化的结果显示,Gankyrin表达量在肌层浸润性膀胱癌中显著高于非肌层浸润性膀胱癌(P<0.01)、在高级别膀胱癌组织中显著高于低级别组织(P<0.01),Gankyrin高表达患者总体生存期、疾病特异性生存期和无进展生存期显著低于低表达患者(均P<0.001),多因素分析显示,Gankyrin为膀胱癌不良预后的独立危险因素。
  5.western blot和qRT-PCR结果显示,Gankyrin在膀胱癌细胞系中的表达量高于正常尿路上皮细胞系,Gankyrin在NMIBC细胞系BIU87和SW780中表达量低,而在MIBC细胞系UMUC3和J82中存在高表达。
  6.成功构建Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞株和Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞株,EdU细胞增殖实验表明Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞增殖能力显著强于对照组(P<0.01),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞的增殖能力显著降低(P<0.001);Gankyrin稳定过表达后的BIU87细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力明显强于对照组(P<0.001),而Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞小鼠皮下肿瘤增殖能力显著弱于对照组(P<0.001);划痕实验和Transwell小室迁移实验显示,Gankyrin稳定过表达的BIU87细胞迁移能力显著增强,Gankyrin稳定敲低的UMUC3细胞迁移能力显著下降;Transwell小室侵袭实验显示,Gankyrin过表达可显著增强膀胱癌细胞的侵袭能力,而Gankyrin敲低可显著抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。流式细胞术检测结果显示Gankyring过表达或敲低并不影响BIU87或UMUC3细胞的凋亡。
  7.成功利用BBN诱导小鼠自发形成膀胱癌,免疫组化结果显示,Gankyrin在膀胱癌中的表达量高于正常尿路上皮组织,在NMIBC、MIBC及肺转移组织中表达量逐渐升高。
  8.32例膀胱癌连续切片免疫组化显示,Gankyrin和MDM2呈正相关(R=0.583,P<0.001)。上调BIU87细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应上调,下调UMUC3细胞Gankyrin表达量,MDM2表达相应下调,免疫荧光显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞及膀胱癌组织中存在共定位,蛋白免疫共沉淀显示Gankyrin和MDM2在BIU87细胞中相互结合。
  结论:
  癌蛋白Gankyrin在膀胱癌组织中显著上调,Gankyrin的表达水平升高与膀胱癌的分期分级升高密切相关,且是膀胱癌不良预后的独立危险因素。上调Gankyrin的表达可以增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调Gankyrin的表达显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Gankyrin在膀胱癌中与MDM2直接结合,为调控膀胱癌侵袭进展的潜在分子机制。
[硕士论文] 吉应征
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,在全球肿瘤致死性疾病中位居第二,近年来其发病率不断上升。乳腺癌最常见的转移部位是骨,乳腺癌骨转移患者在晚期会发生骨痛、病理性骨折、神经压迫等骨相关症状,严重影响患者生存质量和预后。乳腺癌的骨转移是一个复杂的过程,目前针对乳腺癌骨转移尚没有特效的药物治疗方法。找到可以预防和治疗骨转移的靶点成为肿瘤治疗的首要任务。
  KISS1基因是是1996年由Lee JH等在恶性黑色素瘤细胞中作为抑癌基因发现的,1997年,Lee JH等再次报道了KISS1转染人乳腺癌MDA-MB-435细胞对细胞转移的抑制作用。KISS1基因编码含145个氨基酸的肽链,可水解成不同长度的肽片段,总称为Kisspeptins,其中Kisspeptins-10(KP-10)是最短且活性最强的多肽。
  Kisspeptins的受体被命名为GPR54,和大多数的G蛋白偶联受体一样,GPR54由398个氨基酸组成,形成7次跨膜结构。G蛋白偶联受体是目前市场上许多药物的治疗靶点。研究KISS1/GPR54在乳腺癌骨转移过程中的作用机制有可能为治疗乳腺癌骨转移找到一个靶点。
  方法:
  在该实验中,通过对从癌症基因组图谱数据库(TCGA)获得的大量的乳腺癌患者样本数据进行生物信息学分析,发现了在Luminal型乳腺癌中GPR54的表达明显升高。对来自TCGA的乳腺癌样本数据中ER,PR,Her2的表达情况进行分类对比,并对取自临床的118例原发性乳腺癌标本进行免疫组化染色方法检测GPR54的表达情况,结果表明ER、PR阳性与GPR54的表达高度相关。同时对乳腺癌骨转移和原发乳腺癌标本中进行GPR54免疫组化染色对比,发现乳腺癌骨转移标本中GPR54高度表达所占比例比原发乳腺癌标本中的更高。GPR54的这种表达情况表明GPR54可能是乳腺癌,尤其是Luminal型乳腺癌骨转移的潜在治疗靶点。
  培养不同的乳腺癌细胞并利用蛋白免疫印迹实验发现GPR54在BT474细胞中高表达,因此选用BT474细胞进行下一步细胞和动物实验。在Transwell细胞迁移试验中,KP-10对乳腺癌BT474细胞的迁移具有明显的促进作用。利用小鼠单核细胞破骨细胞分化模型发现Kp-10可以促进乳腺癌细胞诱导的破骨细胞分化。利用不同浓度的Kp-10刺激培养的BT474细胞发现,Kp-10可以促进乳腺癌骨转移协同基因OPN,MMP1,CTGF,IL-11,RANKL的表达。
  进一步利用小鼠左心室注射模型和胫骨注射模型进行动物体内实验,通过注射BT474细胞,尾静脉注射Kp-10,并进行生物发光分析及胫骨X线摄片及Micro CT三维重建,结果显示Kp-10可以明显的促进乳腺癌细胞BT474的骨转移和骨破坏。
  结果与结论:
  发现了GPR54在Luminal型乳腺癌高表达,与ER、PR阳性表达正相关,GPR54高表达于乳腺癌骨转移患者。通过实验证实了Kp-10可以促进乳腺癌细胞BT474的迁移和促进乳腺癌细胞诱导的破骨细胞分化,以及KP-10可以促进BT474细胞转移协同基因OPN,MMP1,CTGF,IL-11,RANKL的表达。通过小鼠左心室乳腺癌细胞注射骨转移模型和骨髓腔乳腺癌细胞注射模型证实了Kp-10可以明显的促进小鼠体内乳腺癌细胞BT474的骨转移和引起的骨破坏。提示有可能通过控制或调整KISS1基因的表达来治疗Lumianl型乳腺癌的骨转移和骨破坏作用。
[博士论文] 李骁
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:越来越多的断层扫描检查导致偶然发现的小肾肿瘤(small renal masses,SRMs)日益增加,这些小肾肿瘤已成为很常见的临床问题。目前小肾肿瘤的定义为影像检查中最大直径不超过4cm的强化肿瘤。这些小肾肿瘤中80%为肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC),从临床角度出发,最重要的有三种肾细胞癌:肾透明细胞癌(clear cell RCC,ccRCC)最多见,占肾细胞癌总数的80-90%;乳头状肾细胞癌(papillary RCC,pRCC),可分为Ⅰ型和Ⅱ型,占肾细胞癌总数的10-15%;肾嫌色细胞癌(chromophobe RCC,chRCC),占肾细胞癌总数的4-5%。余下的20%小肾肿瘤为良性肿瘤,其中肾血管平滑肌脂肪瘤(angiomyolipoma,AML)最常见。当影像检查偶然发现小肾肿瘤时,对临床的挑战包括肾脏良恶性肿瘤之间的鉴别以及肾脏恶性肿瘤的最佳治疗选择。传统的肾脏肿瘤影像检查方法包括超声检查,电子计算机断层扫描(computed tomography,CT)检查以及核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查。大多数的肾脏肿瘤可以通过影像学检查正确诊断,但是CT和MRI并不能可靠地鉴别乏脂肪AML(fat-poor angiomyolipoma,fp-AML)和肾脏恶性肿瘤,同时也无法预测肾脏恶性肿瘤的生物学侵袭性。肾脏穿刺活检术在一定程度上可以认为是鉴别诊断肾脏肿瘤组织学类型的金标准,但其作为有创检查,可能会对患者造成一定程度的危险并增加患者额外的经济负担。考虑到目前传统影像学检查方法和肾脏活检穿刺术的局限性,开发一种全新的能够准确且无创的对肾脏肿瘤病理组织学类型进行预测的技术将具有很大的临床价值。
  深度学习,作为机器学习的一个分支,最近在计算机视觉、图像分类、语音识别、自然语言处理和游戏开发等多个领域取得了显著的进步。卷积神经网络是深度学习方法中最典型的人工神经网络系统,它的架构由许多“层”组成,每层有大量类似神经元的节点相连接。众所周知,卷积神经网络中的卷积层中有多种类型的卷积核,它对图像特征的识别极其有效。传统的机器学习算法在学习之前需要先从图像中提取特征,而深度学习中卷积层是在学习过程中自动挖掘图像数据的特征。因此,同传统的机器学习受限于人类特定领域知识设计的手工特征不一样的是,基于卷积神经网络的深度学习方法能够使用图像本身包含的所有信息,这是深度学习方法的核心优势。通过这种学习方式,基于卷积神经网络的深度学习方法很快被医学影像领域所采用,并应用在分类,探测和分割等多种影像学图像处理任务中。因此这一方法具备在动态增强CT图像上鉴别肾脏肿瘤病理分类的潜能。
  第一部分 基于MSCT的深度卷积神经网络鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌
  目的:使用基于卷积神经网络的深度学习方法,通过四期动态增强CT图像,构建卷积神经网络模型用于鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌,并评价模型的性能。
  方法:这一回顾性单中心研究由医院伦理委员会批准。所有乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌患者均在我院病理科电子档案库中查询得到,时间为2013年1月至2017年7月。共200位患者纳入研究中,其中包括42名乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤患者,158名肾癌患者。这200位患者由124位男性患者与76位女性患者组成,平均年龄55.07岁,年龄范围20-83岁。所有患者均使用设备320排容积CT进行肾脏四期规范化扫描,流程包括:平扫期、皮髓质期、实质期和排泄期。
  预处理的第一步就是对每张CT图像中的肿瘤区域进行分割以及分割后的非肿瘤区域的背景去除。该研究采用人工的肿瘤整体分割法,所有患者的分割工作由一位影像科医师进行,该医师对所有患者信息均不知情。平扫图像上的肾脏肿瘤边界由该医师与另外一名医师使用相应层面的三期增强图像共同商量后决定。所有去除非肿瘤背景后的肿瘤图像将用于卷积神经网络模型的构建。200位患者的12317张分割图像(平扫期786张,皮髓质期3854张,实质期3900张,排泄期3777张)用于实验研究。预处理的第二步是在上一步得到的肿瘤分割图像中截取肿瘤部分,将图像改为96×96像素大小。第三步是将所有图像整理放入文件夹中,六个文件夹分别对应平扫期、皮髓质期、实质期、排泄期、后三期合并和四期合并。每个文件夹下设两个训练用子文件夹包含小肾肿瘤的两种不同类别。这两个文件分别命名为:0(所有fp-AML的图像),1(所有RCC的图像)。
  论文中构建的卷积神经网络包括十一层,其中四个卷积层,每一个卷积层后面紧跟一个最大池化层即四个最大池化层,最后面三层为一个扁平层和两个全连接层。模型建立过程包含两个阶段:训练阶段,采用十折交叉验证的方法,采用有监督的基于卷积神经网络模型的深度学习方法,类别作为学习数据;测试阶段,采用未用于训练的剩余数据作为测试集,用以评价模型性能。应用平扫期、皮髓质期、实质期和排泄期图像单独四期期相的图像,三期增强期相的图像以及四期所有期相的图像构建出六组模型。卷积神经网络模型分别预测该图像为两种类别的概率,二者概率和为1,最终概率大者作为模型的输出结果。应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析来评估卷积神经网络模型对于鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌的诊断效能。计算受试者工作特征曲线下面积(area under curve,AUC)。六组不同模型的平均AUC值间的比较应用DeLong检验(DeLong's test)得到。P值小于0.05认为差异有统计学意义。
  结果:model unenhanced鉴别乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌的平均AUC值为0.64,95%可信区间为(95%confidence interval,CI):0.58-0.69;model corticomedullary为0.83,95%可信区间:0.81-0.85;model nephrographic为0.83,95%可信区间:0.81-0.85;model excretory为0.81,95%可信区间:0.79-0.83;model enhanced为0.85,95%可信区间:0.84-0.86;model quadruple为0.84,95%可信区间:0.83-0.85。
  结论:除model unenhanced外,其余五组卷积神经网络模型能够稳健的鉴别出乏脂肪肾血管平滑肌脂肪瘤与肾癌,接下来的研究可以应用这个方法去鉴别其它良性肿瘤与肾癌。
  第二部分 基于MSCT的深度卷积神经网络预测肾透明细胞癌Fuhrman分级
  目的:使用基于卷积神经网络的深度学习方法,通过四期动态增强CT图像,构建预测T1a期肾透明细胞癌病理分级的卷积神经网络模型,并评价诊断模型的性能。
  方法:这一回顾性单中心研究由医院伦理委员会批准。所有肾透明细胞癌患者均在我院病理科电子档案库中查询得到,时间为2013年1月至2017年7月。共97位患者纳入研究,由72位男性患者与25位女性患者组成,其中69例低级别肾透明细胞癌;28例高级别肾透明细胞癌。这97位患者平均年龄55.64岁,年龄范围28-83岁。所有患者均使用设备320排容积CT进行肾脏四期规范化扫描,流程包括:平扫期、皮髓质期、实质期和排泄期。
  预处理的第一步分割与第二步方法同第一部分一致。97位患者的4936张分割图像(平扫期390张,皮髓质期1499张,实质期1547张,排泄期1500张)用于实验研究。第三步是将所有图像整理放入文件夹中,六个文件夹分别对应平扫期、皮髓质期、实质期、排泄期、后三期合并和四期合并。每个文件夹下设两个训练用子文件夹包含肾透明细胞癌的两种不同类别。这两个文件分别命名为:0(所有低级别ccRCC的图像),1(所有高级别ccRCC的图像)。
  论文中构建的卷积神经网络包括十二层,其中四个卷积层,每一个卷积层后面紧跟一个最大池化层即四个最大池化层,最后面四层为一个扁平层和三个全连接层,模型建立过程同第一部分一致。卷积神经网络模型分别预测该图像为两种类别的概率,二者概率和为1,最终概率大者作为模型的输出结果。应用ROC曲线分析来评估卷积神经网络模型对于鉴别T1a期肾透明细胞癌病理分级的诊断效能。计算AUC值。六组不同模型的平均AUC值间的比较应用DeLong检验(DeLong's test)得到。P值小于0.05认为差异有统计学意义。
  结果:模型unenhanced鉴别肾透明细胞癌病理分级的平均AUC值为0.55,95%可信区间为:0.49-0.61;模型corticomedullary为0.77,95%可信区间:0.74-0.79;模型nephrographic为0.76,95%可信区间:0.74-0.79;模型excretory为0.69,95%可信区间:0.66-0.72;模型enhanced为0.78,95%可信区间:0.76-0.79;模型quadruple为0.75,95%可信区间:0.74-0.77。
  结论:我们的结果表明除模型unenhanced外,其余五组卷积神经网络模型或许能够用于区分高低级别的T1a期肾透明细胞癌。这一结果需要在更大规模数据集上的得到验证后才能用于临床。
[硕士论文] 石伟林
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  表没食子儿茶素表没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最丰富的成份,前期研究报道,EGCG具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,但其具体的作用机制还不明确。本研究旨在探讨EGCG抑制乳腺癌细胞迁移及炎症反应的分子机制,为EGCG的进一步开发及其在乳腺癌临床防治中的应用提供科学依据。
  方法:
  1.研究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响
  用不同浓度的EGCG(5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,分别在24h、48h、72h采用Alarmar blue染色法检测细胞活性,确定EGCG最适的作用浓度和时间。按照上述实验确定EGCG作用于乳腺癌细胞的合适浓度和时间,依次处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,进行划痕和Transwell实验,进而探究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响。
  2.EGCG影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过RT-qPCR和Western blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的表达水平,同时检测肿瘤抑制基因SCUBE2的表达变化,分析SCUBE2与迁移相关基因表达的关系。
  3.证明EGCG是通过影响SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移
  首先,利用免疫组化技术,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2的蛋白表达水平,确定SCUBE2与乳腺癌发生发展的关系;然后,构建SCUBE2基因的shRNA重组慢病毒载体,筛选得到干扰SCUBE2的稳转乳腺癌细胞系,检测干扰SCUBE2对E-cadherin和Vimentin基因表达的影响;最后,EGCG处理敲降SCUBE2的稳转细胞,采用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。
  4.确定EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区DNA甲基化实现的
  利用重亚硫酸盐处理及克隆测序的方法,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2启动子区的DNA甲基化水平差异。EGCG处理乳腺癌细胞后,与对照组比较,分析SCUBE2基因启动子区甲基化程度的改变,同时通过RT-qPCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin基因的表达,证明EGCG能够影响SCUBE2启动子区DNA的甲基化,进而影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达。
  5.探究EGCG对乳腺癌细胞炎症因子释放的影响
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和MCP-1的表达水平;此外,采用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用含EGCG培养基培养,检测细胞因子的变化,分析参与EGCG抑制细胞因子释放的可能信号通路。
  结果:
  1.细胞活性检测结果显示,当EGCG浓度为20μM、作用时间达到24h时,乳腺癌细胞活力受到显著抑制(p<0.05),因此本研究随后以此条件开展实验。划痕和Transwell结果表明,EGCG能够显著抑制LPS诱导的乳腺癌细胞迁移(p<0.01)。
  2.EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用,伴随着迁移相关标志基因E-cadherin的上调和Vimentin的下调,此外,我们发现肿瘤抑制基因SCUBE2显著上调,由此我们推测SCUBE2基因可能与EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用有关。
  3.免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,SCUBE2在乳腺癌组织中的表达明显降低,说明SCUBE2的低表达能够促进肿瘤的发生发展。干扰SCUBE2基因后,E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,说明SCUBE2在E-cadherin和Vimentin的上游对其进行调控。用EGCG处理干扰了SCUBE2的稳转细胞系后,我们发现EGCG的抑制作用减弱,证明EGCG是通过上调SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移。
  4.SCUBE2启动子区的DNA甲基化程度在乳腺癌组织中显著高于癌旁组织(p<0.05),这与基因表达检测结果一致。EGCG处理乳腺癌细胞后,检测SCUBE2的甲基化变化,结果显示EGCG可以显著降低SCUBE2的甲基化比率(p<0.05),由此说明EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区甲基化实现的。
  5.ELISA结果显示,EGCG处理能够显著抑制炎症相关因子(IL-6和MCP-1)的表达。用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用EGCG处理,我们发现EGCG对炎症相关因子表达的调控作用与单独S3I-201处理组相比变化不显著,因此,我们推测EGCG可能通过STAT3信号通路来调控乳腺癌相关炎症因子的表达。
  结论:
  EGCG通过影响SCUBE2启动子区的甲基化水平来实现对其表达的调控,SCUBE2进而通过调节迁移相关基因(E-cadherin和Vimentin)的表达,最终抑制乳腺癌细胞迁移。此外,EGCG可能通过STAT3信号通路来抑制的乳腺癌相关炎症因子的表达。
[博士论文] 施晓磊
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球男性人群中最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居第二位,死亡率居于第六位,严重威胁着老年男性的健康。虽然目前中国的前列腺癌发病率低于欧美国家,但是其增长速度非常迅速,预计至2020年发病率接近欧美发达国家平均水平,达到40/10万男性人口。由于前列腺癌症状隐蔽,国内患者诊断前列腺癌时分期较晚,超过50%的患者确诊时已发生局部进展或转移,与美国确诊时超过80%以上都是局部前列腺癌相比差距巨大,除了PSA筛查尚未在国内大规模普及的原因外,可能存在的种族差异也是重要的原因。美国国家癌症中心SEER(Surveillance Epidemiology and End Results,SEER)数据库2006-2012年的资料显示,局限性前列腺癌的5年生存率达到100%,而转移性前列腺癌的5年生存率仅为29.3%。因此,探索前列腺癌早期诊断标志物对于中国前列腺癌诊疗和研究意义重大。
  人类基因组计划研究成果表明,仅有约19000个基因编码蛋白质,占整个基因组的1-2%,剩下98-99%都是“暗物质”非编码序列。随着下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的成熟,最初被认为转录噪声的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)逐渐展现出其重要的作用。正是这些lncRNA才使得基因组调控异常复杂,充分发挥生物学功能。lncRNA是转录本长度超过200个碱基的RNA,不编码蛋白质或只编码较短的多肽——微肽,具有广泛的组织表达谱,较强的组织和细胞表达特异性,lncRNA可在表观遗传、转录和转录后水平等多个层面调控基因表达,调节蛋白基因功能。越来越多的研究表明lncRNA可通过多项机制调节基因功能,从而影响肿瘤细胞的生物学功能,发挥促进或抑制肿瘤的作用。同时,也有大量的lncRNA用于前列腺癌的早期诊断和分子分型。
  研究目的:
  本课题的主要研究目的是基于前列腺癌组织的二代测序数据筛选出肿瘤相关长链非编码RNA,并研究其在调节前列腺癌增殖和侵袭迁移中的作用机制,探寻前列腺癌的治疗靶点,寻找前列腺癌微创体液诊断的生物标志物,为前列腺癌的个体化诊治提供参考。从而为研发新型的前列腺癌靶向药物、优化临床治疗方案提供可靠的理论依据。
  研究方法:
  本课题采用NGS技术对65例中国人前列腺癌组织样本进行测序,分析RNA-seq数据,筛选显著差异表达的肿瘤相关lncRNA分子。对于筛选出来的lncRNA分子进行组织学和细胞学验证,利用生物信息学方法验证lncAPP的编码能力。qRT-PCR检测长海医院单中心291例拟行前列腺穿刺患者的前列腺按摩后尿渣中lncAPP表达水平,分析其是否能作为早期诊断指标有效区分前列腺癌患者与良性前列腺增生患者,和作为分子分型标志物区分低级别前列腺癌与高级别前列腺癌。
  应用RNA荧光原位组织杂交技术与核质分离技术明确lncAPP在前列腺癌肿瘤细胞系中的功能定位。应用干扰lncAPP表达的siRNA和外源性表达lncAPP的质粒作用于前列腺癌肿瘤细胞系,研究其对于维持肿瘤细胞生长能力包括肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响。应用慢病毒介导的稳定外源性表达lncAPP细胞系建立动物体内皮下荷瘤模型,应用瘤内持续注射siRNA介导的干扰lncAPP表达的皮下荷瘤模型,研究lncAPP对于维持肿瘤生长能力的影响。应用尾静脉注射稳转过表达lncAPP细胞系构建裸鼠转移模型,研究lncAPP对于肿瘤细胞转移能力的影响。
  应用生物信息学分析预测可能与lncAPP结合的miRNA及其结合位点,构建lncAPP-MS2-12X质粒通过RNA免疫沉淀(RIP)实验验证lncAPP能够与miRNA结合,构建野生型和突变型荧光素酶报告基因明确lncAPP与miRNA的结合位点。探索miRNA靶向的mRNA分子,验证lncAPP通过与miRNA竞争性结合调节下游关键分子,从而发挥维持肿瘤细胞生长的能力。运用micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的表达谱,筛选出差异表达的重要基因和信号通路。
  研究结果:
  分析65对中国人前列腺癌组织的RNA-seq数据发现存在显著差异的肿瘤相关lncRNA表达谱,按照临床分期、Gleason评分及进展转移三个标准筛选出lncAPP。前列腺癌患者尿渣和血浆中可检测到lncAPP,且前列腺癌患者体液中的表达水平高于良性前列腺增生患者。按摩后尿液lncAPP可以作为早期诊断分子标志物,能够区分穿刺阳性和穿刺阴性患者,且能区分高级别和低级别前列腺癌。
  通过外源性过表达和RNAi敲减的功能实验,证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞迁移和侵袭。动物皮下荷瘤模型证实lncAPP能够维持前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力,且能够促进肿瘤的转移。尾静脉注射稳转细胞系的体内转移模型,证实lncAPP能够促进肿瘤细胞的转移能力。
  应用miRDB和Target Scan数据库分析预测可能与lncAPP结合的miRNA,qRT-PCR检测外源性表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系中miRNA表达水平。运用MS2-RIP实验验证lncAPP能够与miR218/646结合,构建包含lncAPP与miR218/646结合位点及结合位点突变的荧光素酶质粒,明确其具体结合位点。证实lncAPP通过结合miR218/646,调节miR218/646靶向的下游mRNA发挥调节作用。Micro-array芯片分析外源性高表达和敲减lncAPP的肿瘤细胞系的转录谱,发现显著差异表达的基因和重要信号通路。
  研究结论:
  本研究基于中国人前列腺癌组织的RNA-seq测序数据,筛选出肿瘤相关的lncRNA分子,证实lncAPP能够作为早期诊断前列腺癌和区分高级别前列腺癌的分子标志物。体外和体内实验证实lncAPP可维持前列腺癌肿瘤细胞增殖和迁移侵袭能力。机制实验证明lncAPP结合miR218/646,阻断miR218/646对下游关键分子的抑制作用。lncAPP不但能作为早期诊断标志物应用于前列腺癌的早期诊断和分子分型,提高前列腺穿刺的阳性率,减少过度穿刺带来的痛苦和经济负担有着重要的转化医学意义;还可作为肿瘤治疗和抗转移的新靶点,从而为研发新型药物、优化临床诊治方案提供可靠的理论依据。
[硕士论文] 赵娜
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 弥散基组光谱成像在乳腺良、恶性病变鉴别诊断中的应用探究
  目的:探究弥散基组光谱成像(DBSI)参数在正常乳腺腺体及乳腺病变组织中的变化特点,并进一步比较DBSI参数及常规ADC对乳腺良、恶性病变的鉴别诊断效能。
  方法:收集我院2016-09至2017-11行术前DBSI检查且经术后病理证实的乳腺可疑病变患者75例,共81个病灶(良性病灶20例,恶性病灶61例)。DBSI图像后处理之后,依据T1WI增强扫描图像准确选择肿瘤感兴趣区,测量并收集相应DBSI参数(HR,RF,HF,FF,ADC*)及常规ADC值。利用多个独立样本非参数检验(Kruskal-Wallis检验)比较正常腺体、乳腺良性及恶性病变的DBSI参数和ADC的不同;使用MedCalc绘制DBSI各参数及ADC的ROC曲线,比较DBSI参数及ADC对于乳腺良、恶性病变的鉴别诊断效能。
  结果:乳腺正常腺体、良性及恶性病变的ADC(P<0.0001)及DBSI各参数均明显不同(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001,P=0.011,P<0.0001)。良性病变和恶性病变的HR值均低于正常腺体组织(P=0.001,P<0.0001);恶性病变、良性病变、正常腺体的RF值依次减低(P=0.001,P<0.001,P=0.033);恶性病变的HF值低于良性病变及正常腺体组织(P<0.001,P<0.001);恶性病变的FF值小于正常腺体组织(P=0.034)。当HR阈值选择为0.08%时,鉴别乳腺良、恶性病变的特异性为95%,但敏感性极低(5%),曲线下面积(AUC)为0.549;RF阈值为51.45%时,鉴别良、恶性病变的敏感度和特异度为83.6%、90%(AUC=0.906);HF阈值为14.51%时,鉴别良、恶性病变的敏感度和特异度为70.5%、85%(AUC=0.872);FF阈值选择为23.78%时,鉴别诊断良、恶性病变的特异度为86.9%,但敏感度仅为35%(AUC=0.559);ADC*≤0.82×10-3mm2/s时,诊断恶性病变的灵敏度和特异度为80%、82.0%(AUC=0.837);ADC阈值选择为1.20×10-3mm2/s时,对良、恶性病变鉴别诊断的敏感度和特异度分别为85.3%、75%(AUC=0.813)。当RF和HF联合使用时,鉴别诊断良、恶性病变的敏感度和特异度为77.0%、99.0%(AUC=0.929)。
  结论:DBSI各参数可以较好地区分组织内炎性细胞、肿瘤成分、水肿或正常乳腺腺体以及纤维等病理构成成分。DBSI特有参数(HR,RF,HF,FF)鉴别乳腺良、恶性病变的特异度较高,RF与HF联合应用可进一步提高对恶性病变诊断的特异度。RF、HF、ADC*可以获得与常规ADC相近的良、恶性病变鉴别效能。
  第二部分 DBSI参数与乳腺癌病理预后因子及分子亚型的相关性研究
  目的:探究DBSI各参数与乳腺浸润性导管癌组织学分级的关系;探究DBSI各参数与乳腺癌预后因子(ER,PR,HER-2,Ki-67)表达状态及乳腺癌分子亚型(Luminal A、Luminal B、HER-2过表达、TNBC)的关系。
  方法:收集我院2016-09至2017-11行术前DBSI检查且经术后病理证实的乳腺恶性病变患者共57例,61个病灶。DBSI图像后处理之后,依据T1WI增强扫描图像准确选择肿瘤感兴趣区,测量并收集相应DBSI参数(HR,RF,HF,FF,ADC*)。利用两样本比较的Wilcoxon秩和检验比较浸润性导管癌低级别、高级别组病灶的HR、RF、HF、FF、ADC*值的差异;同样用Wilcoxon检验比较不同ER表达(ER+/-)、不同PR表达(PR+/-)、不同HER-2表达(HER-2+/-)、Ki-67高与低表达乳腺癌之间DBSI参数的差异,并用Spearman相关对DBSI各参数与Ki-67表达率之间是否存在相关性进行分析;利用多个独立样本的非参数检验(Kruskal-Wallis检验)比较四个分子亚型乳腺癌DBSI参数的差异,并进一步使用Nemenyi检验进行两两组间差异的比较。
  结果:乳腺低级别浸润性导管癌的RF (62.33%)低于高级别组(73.71%),HF (14.43%)及ADC*值(0.78× 10-3mm2/s)高于高级别组(8.40%,0.72×10-3mm2/s),均具有统计学意义(P=0.011,P=0.004,P=0.005)。ER阳性乳腺癌的HF(7.66%)及ADC*值(0.71×10-3mm2/s)低于ER阴性组(14.02%,0.77×10-3mm2/s)(P=0.012,P=0.007),FF值(14.09%)高于ER阴性组(4.35%) (P=0.023)。PR阳性组HF (7.60%)及ADC*值(0.71×10-3mm2/s)低于PR阴性组(13.33%,0.75×10-3mm2/s) (P=0.009,P=0.013)。HER-2阳性组HF (14.28%)及ADC*值(0.76× 10-3mm2/s)高于HER-2阴性组(8.40%,0.72× 10-3mm2/s) (P=0.048,P=0.024)。Ki-67高表达(>20%)与低表达组的DBSI各参数差异均不具有统计学意义,且各参数与Ki-67表达百分率间相关性不明显。Luminal B亚型的FF值大于TNBC (P=0.024)。余诸亚型乳腺癌的各DBSI参数间的差异均不具有统计学意义。
  结论:DBSI各参数对乳腺癌组织学分级及各预后因子的表达情况具有一定预测作用,并且一定程度上能够揭示不同类型病灶内部组织学构成的差异,尤其是参数RF和HF。但DBSI参数与分子亚型的关系尚不明确。
[博士论文] 陈津
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,其发病率一直高居女性各器官恶性肿瘤发病率之首,每年因乳腺癌死亡人数多达50多万。ErbB2过表达型乳腺癌是恶性程度较高、预后较差的乳腺癌分子亚型,约占乳腺癌患者的25~30%。紫杉醇作为乳腺癌化疗方案中重要的候选药物,被广泛地用于转移性乳腺癌的化疗实践中,也是ErbB2阳性乳腺癌新辅助治疗中采用最多的紫杉烷类。随着紫杉醇药物的广泛使用,原发和继发性紫杉醇耐药性的产生这一问题也日益凸显,鉴于目前对其相关耐药分子机制的了解甚少,这极大的限制了紫杉醇在乳腺癌综合治疗中的临床疗效。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性可以是内在的或是后天获得的。内在的耐药意味着一开始化疗就无效;获得性耐药是在肿瘤治疗过程发展的,可能是由于突变也可能是由于其他适应性反应如激活代偿信号通路引起的。ErbB2介导的耐药性增加是导致肿瘤恶性程度增强和病人存活率降低的重要原因,然而迄今尚未发现ErbB2自身可识别的配体,它必须与其它可识别相应配体的受体相互作用方可有效发挥其生物学功能。ErbB3与ErbB2同属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶(RTK)家族,是ErbB2最为重要的相互作用受体伙伴,经常共表达于ErbB2阳性乳腺癌细胞。我们先前的研究发现ErbB3活性升高可导致紫杉醇耐药,靶向抑制ErbB3可增强紫杉醇对ErbB2-过表达乳腺癌的抗肿瘤活性。ErbB2/ErbB3对下游信号转导通路的激活有赖于ErbB3与其配体NRG-1的有效结合,但研究发现ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞NRG-1的表达水平极低。
  近年来,肿瘤微环境在肿瘤生物学中的作用日益得到认可。间充质干细胞(也称间充质基质细胞,MSC)能够特异性的募集到包括乳腺癌在内的许多原发和转移的肿瘤部位,是构成肿瘤微环境的重要组成部分。MSC可通过旁分泌细胞因子、外泌体等方式影响肿瘤细胞生长、迁移和治疗耐药。然而,MSC与肿瘤细胞之间的相互作用关系复杂,既可能支持肿瘤生长,也可能抑制肿瘤生长,在不同分子亚型乳腺癌中甚至出现截然相反的结果;因此,进一步深入揭示MSC与特定分子亚型乳腺癌之间确切的相互作用关系及作用机制,阐明作为肿瘤微环境中一个大群体的MSC与肿瘤细胞的关系,有助于进一步了解实体肿瘤的耐药机制。
  研究目的:
  探讨MSC对ErbB2/ErbB3共表达的乳腺癌细胞增殖以及对紫杉醇敏感性等肿瘤生物学行为的影响,并进一步探讨其可能的分子机理,冀望能拓展我们对肿瘤化疗耐药分子机制的认知水平,从而为临床ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌病人克服紫杉醇耐药和新的靶向治疗策略提供初步的实验依据。
  研究方法:
  1.首先分离脐带来源的MSC作为细胞的种子来源,通过超滤法、超离法富集脐带MSC培养上清的外泌体,通过透射电镜鉴定外泌体的大小,WB和流式鉴定外泌体特异性标志物的表达。
  2.通过MTS和ELISA凋亡定量检测,分析MSC或其外泌体(0,1,2,5,10,20μg/ml)、重组NRG1对乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖的影响,以及对不同浓度紫杉醇(0,2,4,8,16,32nM)诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。并通过平板克隆形成试验、流式凋亡分析等方法进行验证;qPCR和WB检测与增殖相关的细胞周期调控基因p21、p27、Cyclin D1、Cyclin E1的表达情况。
  3.通过PCR分析MSC和乳腺癌细胞的NRG-1基因mRNA的表达情况;WB分析MSC及其外泌体的NRG-1蛋白表达以及MSC外泌体、NRG-1作用后乳腺癌细胞ErbB3、Akt、MAPK等信号通路活化和Survivin、PARP等蛋白的表达情况,探讨MSC或其外泌体对乳腺癌MDA-MB-453细胞紫杉醇耐药性影响的分子机制。
  4.构建慢病毒载体pLKO.1_NRG-1_shRNA,用NRG-1shRNA、ErbB3shRNA分别特异性敲低MSC的NRG-1表达和乳腺癌细胞ErbB3受体的表达后,通过平板克隆形成试验、凋亡分析以及WB检测Survivin、PARP蛋白等验证NRG1-ErbB3介导的信号通路在MSC诱导乳腺癌MDA-MB-453细胞紫杉醇耐药中的作用。再通过小分子抑制剂LY294002,Akt抑制剂Ⅷ和YM155分别抑制乳腺癌细胞PI3K、AKT、Survivin,分析MSC外泌体对紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。
  研究结果:
  1.从脐带wharton胶中分离出MSC,经鉴定符合MSC的标准。采用超滤法可以富集脐带MSC培养上清中的外泌体,经鉴定为30-100nm大小,表达CD9,CD63,CD81等外泌体标志,同时还表达脐带MSC的表面标志CD73,CD90,CD105,说明获得的外泌体来源于脐带MSC。
  2.MTS试验结果显示,以乳腺癌细胞MDA-MB-453单独培养组为对照(100%),MSC共培养组、加外泌体组乳腺癌细胞的增殖率分别为(116±2.53%,114.5±0.48%,n=3),与对照组相比没有统计学差异(p=0.061,p=0.092)。RT-qPCR结果显示,加入MSC外泌体组乳腺癌细胞周期调控相关基因CyclinD1、CyclinE1、p21和p27的表达水平无明显改变;与对照组相比分别增加(1.322±0.121倍,1.142±0.158倍,0.889±0.08倍和1.248±0.244倍,n=4),无统计学差异(p=0.125,p=0.171,p=0.068,p=0.135)。WB结果也证实细胞周期调控蛋白表达没有明显变化。
  3.平板克隆形成试验结果显示,随着紫杉醇浓度(0,2,4,8nM)增加,乳腺癌细胞克隆数逐渐减少;与对照组相比,紫杉醇诱导凋亡中加入MSC共培养或重组NRG1,乳腺癌细胞克隆数明显增多。定量结果显示(n=3),对照组乳腺癌细胞活率分别为(100±1.19%,85.69±1.04%,51.71±0.60%,18.88±0.62%);MSC共培养组分别为(104±1.24%,92.44±1.2%,75.29±1.2%,46.78±0.22%);rNRG1组分别为(107±1.022%,94.24±0.67%,76.49±0.39%;40.69±0.37%);MSC和NRG1明显提高乳腺癌细胞对紫杉醇的耐受性,促进乳腺癌细胞存活(p=0.013,p=0.001,p=0.0001和p=0.0007,p=0.0003,p=0.0006)。
  4.MTS结果显示,在不同浓度紫杉醇诱导乳腺癌细胞MDA-MB-453凋亡模型中,随着紫杉醇浓度的增加,乳腺癌细胞存活率逐渐降低;加入MSC外泌体或rNRG1后,乳腺癌细胞活率明显提高,紫杉醇浓度(2,4,8nM)组具有明显差异(p<0.001)。并且,MSC外泌体降低乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性具有浓度依赖性,随着外泌体浓度的增加(0,1,2,5,10,20μg/ml),乳腺癌细胞活率增加;当外泌体浓度大于2μg/ml时,具有统计学差异(p=0.0518,p=0.018,p=0.008,p=0.0003,p=0.0001)。
  5.细胞凋亡分析结果显示,MSC外泌体显著降低了紫杉醇对乳腺癌细胞的诱导凋亡作用(p=0.0009,n=3);凋亡相关指示蛋白PARP活性剪切体cleaved-PARP表达降低。流式细胞凋亡分析结果也证实,MSC外泌体明显抑制紫杉醇引起的乳腺癌细胞凋亡(加入MSC外泌体组,紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡率由43.2±0.71%降至23.35±0.64%,p<0.01,n=3)。
  6.MSC及其外泌体高表达ErbB3的配体NRG-1,乳腺癌细胞不表达;MSC外泌体可明显激活MDA-MB-453乳腺癌细胞ErbB3受体,引起Akt信号通路磷酸化,上调Survivin表达,而MAPK信号通路不受影响。当MSC细胞的NRG-1被shRNA特异性敲低或MSC外泌体NRG-1被特异性抗体中和后,MSC及其外泌体的作用效果被逆转。当乳腺癌细胞ErbB3被shRNA特异性敲低,或当PI3K、AKT、Survivin被小分子抑制剂特异性抑制后,乳腺癌细胞凋亡增加,MSC外泌体对对乳腺癌细胞紫杉醇耐药的影响也被消除。
  研究结论:
  1.通过超滤离心法可以较简便地对MSC条件培养基中的外泌体进行富集。
  2.MSC没有明显促进ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞MDA-MB-453增殖,但是MSC明显降低乳腺癌细胞对化疗药紫杉醇的敏感性,促进肿瘤细胞的存活。
  3.MSC通过外泌体旁分泌NRG-1,通过与Erb3/ErbB2介导的信号级联反应,引起Akt信号通路磷酸化,上调Survivin表达,抑制细胞凋亡,诱导乳腺癌MDA-MB-453细胞对紫杉醇耐药性。
  4.特异性靶向抑制MSC的NRG-1或肿瘤细胞的ErbB3、PI3K、AKT、Survivin,可消除MSC诱导的ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌细胞紫杉醇耐药。
  5.研究结果表明靶向肿瘤微环境中的MSC,可能是克服ErbB2/ErbB3共表达乳腺癌患者中紫杉醇耐药性的新策略.
[硕士论文] 张春雷
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:作为男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,前列腺癌(PCa)发病率随年龄增长而增加,一项最新研究报告表明PCa在美国男性癌症发病率中排在第1位,病死率中排在第2位。近年来我国男性前列腺癌发病率持续升高,在上海地区,前列腺癌发病率已位列男性常见肿瘤第5位和泌尿系统肿瘤第1位,因此研究PCa发生发展的分子机制,为肿瘤的治疗提供理论依据显得越来越重要。
  环状RNA(Circular RNA,circRNA)是一种通过反向剪接机制由线性RNA前体的5'端和3'端共价相接形成的非编码RNA,与基因的转录及后转录表达调控有关。近年,circRNA逐渐被发现不仅存在于细菌、真菌、植物中,也大量存在于哺乳动物中。作为一种竞争性内源RNA(CeRNA),circRNA与miRNA、lncRNA及蛋白之间具有相互作用的关系。随着研究的不断深入,circRNA先后被证明与多种疾病及肿瘤进程有关,因其表达量丰富、具有独特的稳定结构和组织表达特异性,有望为相关疾病及肿瘤发生发展机制提供新的理论依据。
  首先我们对三种细胞系的测序结果进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR,以下简称qPCR)验证,得到了与测序结果一致的结论,然后利用qPCR及琼脂糖凝胶电泳检测circRNA CDR1as特性,并选取表达相对较高的两种细胞系PC3及C4-2进行细胞功能学验证,在两种高表达细胞系中通过siRNA干扰方法下调CDR1as表达量后进行CCK8检测、Edu增殖实验、流式细胞术周期及凋亡实验、transwell迁移及侵袭实验等,结果表明CDR1as可以影响前列腺癌细胞的增殖、周期、迁移和侵袭功能。核质分离实验、miRIP实验表明CDR1as主要存在于细胞质中,并可能通过miR-23a/b等调节下游基因的表达,mRNA高通量测序以及qPCR结果证明CDR1as表达下调后CCND1及CXCL5表达量发生变化,并得到Western blot实验的证明,多个数据库预测软件表明miR-23a/b与CCND1及CXCL5具有结合位点,相关报道表明CCND1和CXCL5与肿瘤细胞周期及转移能力有关。
  总之,circRNA之前的研究重点在于对其形成机制的阐明,目前研究较多的是其在疾病中的功能作用,因circRNA具有稳定性好、保守性高、表达特异性强等特点,无论对于研究疾病发生机制还是作为诊断的生物标记物都有重要的研究价值。我们的结果证实了CDR1as作为ceRNA通过吸附miR-23a/b抑制其功能,进而增加CCND1和CXCL5的表达,促进PCa的进展。我们首次报道CDR1as作为ceRNA在PCa发生发展中的作用机制,并可能作为PCa治疗的一个潜在靶点以及可能作为诊断PCa的生物标志物。
  第一部分 前列腺癌相关细胞系circRNA表达谱分析
  目的:探索circRNA在前列腺癌相关RWPE-1、22RV1和PC3三种细胞系中的表达谱。
  方法:(1)通过circRNA的特异性测序法富集circRNA。(2)通过高通量测序对正常前列腺上皮细胞RWPE-1、前列腺癌上皮细胞22RV1和前列腺腺癌细胞骨转移细胞PC3的circRNA表达谱进行检测。(3)对测序结果进行生物信息学分析。(4)对测序结果进行qPCR验证。
  结果:(1)三种细胞系共识别出9545种circRNA。(2)三种细胞系差异表达的circRNA有数百种。(3)GO分析和KEGG通路分析表明差异表达circRNA的宿主基因与前列腺癌疾病进展密切相关。(4)与RWPE-1相比,PC3中CDR1as上调近200倍。(5)CDR1as有多个miRNA结合位点,如miR-7-5p等。
  结论:CircRNA在前列腺癌细胞系中表达量十分丰富,差异表达circRNA较多,与前列腺癌的发展可能存在密切关联,CDR1as在PC3中表达量增加,且与miRNA关系密切,可能影响前列腺细胞的增殖和转移能力。
  第二部分 CircRNA-CDR1as在前列腺癌细胞系及组织中的表达量分析
  目的:在前列腺癌细胞系及组织中对CDR1as测序结果进行检测、验证及表达量分析。
  方法:(1)通过前期的高通量测序,我们获得了CDR1as的序列结果,并与Circnet数据库进行了对比,最终确定了我们测序结果的准确性。(2)对CDR1as表达量的测序结果我们在测序的三个细胞系中利用qPCR进行了验证。(3)对扩增片段进行了sanger测序,来验证我们结果的可靠性。(4)增加三个前列腺癌细胞系(LNCaP、DU145和C4-2)以及肾癌细胞系786O和膀胱癌细胞系T24,验证CDR1as表达特异性。(5)通过cDNA及gDNA的反、对向引物扩增以及琼脂糖凝胶电泳验证其cbcRNA的特性。(6)利用RNA酶R消化来验证其circRNA的稳定性。(7)利用核质分离的方法进行分子在细胞中的分布定位。(8)CDR1as在65对癌与癌旁组织中表达量分析。
  结果:(1)CDR1as是一条X染色体上反义链来源circRNA,含有1485个碱基,其circRNA ID为has-circ-0001946chrX:139865339-139866824。(2)CDR1as在PC3中表达量是RWPE-1中的近1000倍,是22RV1中的近30倍。(3)Sanger测序的序列经匹配确定扩增片段准确无误。(4)CDR1as在前列腺癌细胞系PC3中特异性表达,并且在C4-2中表达量也较高,约为RWPE-1的200倍。(5)反向引物只在cDNA中有扩增结果,而对向引物在两者中均有扩增产物,说明在基因组中不存在与其序列相类似的环状DNA分子。(6)RNA酶R消化后对照线性分子的表达量下降程度显著高于对CDR1as的表达量影响。(7)核质分离结果表明CDR1as主要分布于细胞质中。(8)癌与癌旁CDR1as的表达量差值与PSA值呈正相关关系,r=0.30。
  结论:CDR1as是一条X染色体上反义链来源circRNA,主要分布于细胞质中,在前列腺癌细胞系PC3及C4-2中特异高表达。
  第三部分 CircRNA-CDR1as的功能鉴定
  目的:探索CDR1as对前列腺癌细胞功能的影响。
  方法:(1)转染siRNA以干扰CDR1as表达。(2)利用CCK8法检测CDR1as干扰表达的细胞PC3和C4-2的增殖能力。(3)通过流式细胞术实验检测CDR1as干扰表达的细胞PC3和C4-2细胞的周期和凋亡情况。(4)使用transwell小室检测CDR1as干扰表达的细胞PC3和C4-2细胞的迁移和侵袭能力。(5)利用病毒转染的方式构建CDR1as敲低表达的稳转株。(6)采用CDR1as敲低表达的稳转株进行小鼠皮下荷瘤模型的构建,进而探究其对成瘤能力的影响。
  结果:(1)SiRNA效率较高,转染后CDR1as表达下调80%以上。(2)CDR1as干扰表达后两种细胞增殖受到抑制。(3)CDR1as干扰表达后细胞周期阻滞在G1期,对凋亡无影响。(4)CDR1as干扰表达后细胞的迁移和侵袭能力减弱。(5)稳转株的CDR1as敲低效率在90%以上。(6)CDR1as敲低表达的稳转株成瘤能力降低。
  结论:CDR1as通过周期影响前列腺癌细胞增殖,不影响凋亡,CDR1as促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力,CDR1as敲低表达后可降低癌细胞的成瘤能力。
  第四部分 CircRNA-CDR1as在前列腺癌细胞中作用机制分析
  目的:探索环状RNA CDR1as促进前列腺癌细胞增殖、迁移的作用机制。
  方法:(1)采用miRIP方式探索与CDR1as结合的miRNA。(2)采用mRNA测序的方式对CDR1as干扰表达的细胞系进行测序以寻找下游的靶点mRNA。(3)RT-qPCR方式验证测序结果。(4)采用多组数据库对靶点mRNA与miRNA结合位点进行预测。(5)双荧光素酶报告基因检测筛选的miRNA是否与CDR1as结合。(6)采用miRNA mimics转染方式和miRNA抑制剂转染补救实验方式进一步验证CDR1as、miRNA、mRNA三者之间的关系。(7)Western blot方式对EMT marker进行验证。
  结果:(1)CDR1as可吸附miR-183、miR-23a、miR-23b等miRNA。(2)CDR1as表达干扰后CCND1和CXCL5基因表达下调。(3)CCND1与miR-183、miR-23a/b存在结合位点,CXCL5与miR-183、miR-23a/b、miR-200b/c存在结合位点。(4)双荧光素酶报告基因检测实验证明CDR1as与miR23a/b之间存在相互作用。(5)MiR23a/b过表达后CCND1和CXCL5基因表达量下调,CDR1as干扰表达后miRNA23a/b抑制剂转染补救可使CCND1和CXCL5表达量恢复。(6)Western blot结果表明,CDR1as干扰表达后CCND1和CXCL5蛋白水平表达下降,Ncadherin和Snail在PC3的两干扰组中表达量下调,Ecadherin在C4-2两干扰组中明显上调而Snail在C4-2两干扰组中明显下调。
  结论:CDR1as通过miR-23a/23b调节CCND1的表达,进而促进前列腺癌细胞周期进程,同时也通过miR-23a/b调节分泌因子CXCL5的表达,改变EMTmarker表达量,提高前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
[硕士论文] 宫春爱
临床药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一。在美国女性癌症中是除了皮肤癌之外的最普遍的癌症,占接近三分之一。美国癌症协会2018年最新数据表明,乳腺癌在预计新发人数上位居第一,预计死亡人数上排名第二(仅次于肺及支气管癌)。目前,乳腺癌治疗存在很多难点,特别是一些患者在接受治疗时发生耐药及术后放化疗后肿瘤复发、转移。近些年来,有研究表明,自噬在乳腺癌的发生发展以及治疗过程中发挥着重要的作用。如何改善乳腺癌的治疗效果已成为研究热点。自噬是一种广泛存在于真核生物的细胞中高度保守的一种依赖溶酶体的降解途径,是通过清除自身衰老、受损的细胞器,或通过降解蛋白质、脂类等生物大分子供细胞再次利用,以维持细胞内环境稳态。自噬常作为一种细胞在特殊情况下的保护自我的一种机制,例如在机体出现损伤、缺氧、应激等病理生理情况后一种调控细胞代谢活动的过程,可被认为是与化疗失败的重要耐药机制之一。本课题选用广谱抗癌药多西他赛(DTX)和自噬抑制ATG7siRNA(siATG7),通过硫辛酸修饰的固有无序多肽形成的多肽胶束加以介导,并载入化疗药多西他赛,从体内和体外对其抗乳腺癌的作用机制进行研究。
  本课题分为三个部分,第一部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束的构建及表征进行了报道。通过固相合成法合成了含有硫辛酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸的硫辛酸修饰的固有无序多肽的单体,然后进一步通过制备型高效液相色谱对产物进行纯化,且纯度检测结果显示符合实验要求。利用硫辛酸五元环内二硫键在一定比例的半胱氨酸催化下可实现分子间交联,进一步形成多个多肽单体聚合的载体。通过核磁共振氢谱对其结构进行了检测,结果显示了多肽单体聚合成功。然后采用超声乳化的方法制备胶束及载药,利用多肽胶束结构中分别含有疏水性的空腔以及富含带正电的阳离子型氨基酸,分别包载疏水性化疗药物多西他赛和包裹压缩带负电荷的siATG7基因药物。表征结果表明超声乳化法所制备的多肽胶束的平均粒径为165nm左右,电位值在31mV左右,且载药量在8.81%左右。
  本课题的第二部分进一步报道了共载化疗药多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌的体外评价。首先我们选用了以下五种不同种类乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-468,BT474,SKBR-3),对其进行抗增殖、促凋亡,以及周期阻滞实验研究,结果表明不同种类乳腺癌细胞对于自噬水平的依赖性不同,抑制自噬所引起的疗效也不相同。我们选择其中MCF-7细胞进一步研究通过siATG7对自噬的调控研究其抗乳腺癌的作用机制进行研究。用尼罗红代替多西他赛,荧光素FAM标记siATG7,对其摄取进行考察,结果显示尼罗红和siATG7可以在多肽胶束的介导下进入细胞。体外细胞实验表明,硫辛酸多肽胶束可以有效介导siATG7在MCF-7细胞内发挥作用并抑制了化疗药多西他赛引起的自噬,通过自噬抑制而实现增强化疗药的疗效的作用。多西他赛和siATG7可协同抗乳腺癌细胞增殖及周期阻滞并促进乳腺癌细胞凋亡。自噬抑制作用的考察上,我们通过构建稳定表达mRFP-EGFP-LC3的MCF-7细胞,然后对不同给药组的自噬流进行了考察,同时,通过Western Blot和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)对自噬相关的蛋白及ATG7mRNA的表达水平进行了考察,并通过电镜考察不同给药组产生的自噬泡的情况。结果显示共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束可以有效的抑制乳腺癌细胞MCF-7的自噬水平。
  本课题的第三部分对共载多西他赛和siATG7的硫辛酸多肽胶束抗乳腺癌体内作用机制进行了报道。实验成功构建了MCF-7乳癌裸鼠移植瘤模型,通过siRNA用Cy5荧光标记后通过多肽胶束进行体内递送研究,活体成像结果显示胶束具有较好的体内靶向性。肿瘤生长抑制实验和肿瘤组织的HE染色切片观察显示,多西他赛和siATG7在硫辛酸多肽胶束介导下,可以起到协同抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长。最后进一步通过HE对其安全性进行了考察,结果表明该多肽胶束具有较低的系统性毒性。免疫组化实验也表明,多西他赛和siATG7硫辛酸多肽胶束可以有效抑制自噬水平。
  通过对本课题进行研究,以硫辛酸进行修饰的固有无序多肽胶束作为载体,共载疏水性化疗药物和siRNA基因药物。通过抑制化疗药引起的自噬实现增敏为临床治疗乳腺癌以及其他癌症的综合治疗提供了参考依据和借鉴。
[硕士论文] 王安邦
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,具有起病隐匿和高致死率的特点。大约有30%的患者在肾癌确诊的时候已经发生转移。肾癌对放疗及化疗均不敏感,靶向药物的应用改善了肾癌患者的总体预后,但用药一段时间后,患者大多会出现耐药。因此,研究肾癌发展和转移的机制,就显得十分迫切而重要。除此之外,肾癌缺乏有效的早期诊断标志物。近年来,长链非编码RNA的在细胞的多种生物学进程中发挥着重要作用,如细胞生长、凋亡、分化和转移。很多研究报道了长链非编码RNA在肿瘤进展和转移中发挥着重要的作用,这类非编码RNA可以通过多种途径影响编码基因的转录和翻译。然而,长链非编码RNA在肾癌中的研究仍存在很多不足,因此,通过对大样本中lncRNA表达谱的分析,探索lncRNA在肾癌发展和转移中的作用以及寻找肾癌相关的分子标志物,为肾癌的治疗提供可能的靶点。
  方法:(1)利用GEO和TCGA芯片数据库查找肾癌相关的数据集,通过质检和样本分析,选定GSE40911、GSE61763、GSE76207、GSE82122和TCGA数据库进行lncRNA的筛选。对这5个数据库进行深入的芯片分析,再根据p值和差异倍数筛选出有意义的lncRNA。(2)进一步增大样本量进行验证,筛选最有意义的lncRNA,确定研究对象。(3)分析选定标本的临床特征,检测研究lncRNA的表达量,分析lncRNA与患者临床特征和指标的相关性。(4)分析lncRNA的基因组学特点,设计功能实验,观察lncRNA对肾癌细胞增殖和迁移能力的影响。(5)根据基因组位置及既往文献报道,探索长链非编码RNA EGFR-AS1与EGFR的相关作用关系。(6)利用RNA免疫共沉定等,探索EGFR-AS1如何调控EGFR的表达,寻找EGFR-AS1直接作用的靶蛋白或靶基因。
  结果:(1)通过大数据分析,筛选出与肾癌发展和转移相关的长链非编码RNA EGFR-AS1。临床样本验证发现EGFR-AS1在肾癌组织中显著上调表达,并且EGFR-AS1的高表达与TNM分期,T分期和淋巴结转移有关。(2)细胞功能学实验表明,EGFR-AS1能促进肾癌细胞的增殖和转移,体外实验研究表明,下调EGFR-AS1后能降低肾癌细胞的增殖和转移能力。(3)在肾癌组织标本中,发现EGFR的表达和EGFR-AS1表达量呈显著正相关。EGFR-AS1可通过增加EGFR的稳定性,促进其表达。(4)RIP实验证实HuR与EGFR-AS1存在富集效应,并且HuR与EGFR mRNA存在比较明显的结合。沉默HuR的表达可以减少EGFR的mRNA的稳定性。HuR参与对EGFR mRNA稳定性的调节。(5)EGFR-AS1通过EGFR促进肾癌细胞的增殖和转移。并且EGFR-AS1和EGFR mRNA存在共定位现象。EGFR-AS1通过结合HuR维持EGFR的稳定性,抑制EGFR的降解。
  结论:EGFR-AS1在肾癌组织中高表达,EGFR-AS1通过结合HuR维持了EGFRmRNA的稳定性,进而促进肾癌的增殖和转移。在此研究基础上,EGFR-AS1有望成为肾癌诊断的标志物以及潜在的治疗靶点。
[博士论文] 杨琦
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA的表达谱
  目的:(1)通过高通量转录组测序的方法获取前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA(circRNAs)的表达谱。(2)筛选出前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达的circRNAs。(3)对差异表达的circRNAs进行功能预测及分析。
  方法:选择3种前列腺癌相关细胞系(正常前列腺上皮细胞系RWPE-1、前列腺癌原发灶细胞系22RV1、前列腺癌骨转移细胞系PC-3)及65对前列腺癌与癌旁组织,进行高通量转录组测序,并结合生物信息学方法综合分析。
  结果:(1)3种前列腺癌相关细胞系中共识别出9,545个circRNAs,其中845个circRNAs在3种细胞系中均有表达,同时还发现了大量差异表达的circRNAs。GO功能分析和KEGG通路分析提示这些差异表达circRNAs的宿主基因具有重要的生物学功能并在许多重要的分子信号通路中发挥关键作用。(2)采用DCC、find circ和circRNA_finder这三种算法在65对前列腺癌与癌旁组织中共识别出277,122个circRNAs,其中三种算法共同识别出的circRNAs有82,797个。非监督聚类和PCA分析提示前列腺癌与癌旁组织中circRNAs的表达谱存在明显差异,其中有9个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著上调,86个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著下调。对这95个差异表达的circRNAs进行功能预测提示其与相应的miRNAs具有多个结合位点。
  结论:(1)circRNAs在前列腺癌相关细胞系及组织中均广泛存在,而且不同细胞系及组织之间具有显著表达差异;(2)生物信息学分析显示,前列腺癌中差异表达的circRNAs可能通过竞争性吸附miRNAs发挥相应生物学功能,或与其宿主基因一起参与前列腺癌的疾病进展,并可能具有潜在的诊断应用价值。
  第二部分 前列腺癌中差异表达环状RNA的验证及作用研究
  目的:(1)对前列腺癌相关细胞系及组织中circRNAs的测序结果进行验证。(2)结合细胞系测序及验证结果分析环状RNA-circFUT8在前列腺癌相关细胞系中的表达差异及意义;(3)结合组织测序及验证结果探讨环状RNA-circAMACR在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  方法:(1)选择测序结果中部分差异表达的circRNAs,采用qRT-PCR的方法分别在正常前列腺上皮细胞系与前列腺癌细胞系、前列腺癌与癌旁组织中对其进行表达量验证。(2)结合细胞系测序结果选择circFUT8(在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1中低丰度表达,在前列腺癌原发灶细胞系22RV1和前列腺癌骨转移细胞系PC-3中表达逐渐升高)为研究对象,对其在前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并结合其宿主基因功能,分析circFUT8在前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化过程中的作用及意义。(3)结合组织测序结果选择circAMACR(在前列腺癌组织中表达上调最为显著,fold change=6.19,P=1×10-13)为研究对象,对其在前列腺癌组织与癌旁组织、前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并通过siRNA干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响,探讨其在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。
  结果:(1)前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达circRNAs的qRT-PCR验证结果与测序结果基本一致。(2)circFUT8在前列腺癌细胞系中的表达显著高于正常前列腺上皮细胞系,在前列腺癌转移细胞系(PC-3、DU145)中的表达显著高于前列腺癌原发灶细胞系(22RV1),在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)中的表达也显著高于雄激素依赖性前列腺癌细胞系(LNCap)。(3)circAMACR在前列腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织,在前列腺癌细胞系中的表达也显著高于正常前列腺上皮细胞系。circAMACR主要表达于细胞质中,干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达后,细胞的增殖和迁移能力减弱。
  结论:(1)通过高通量转录组测序获取的前列腺癌相关细胞系及组织中的circRNAs表达谱是可靠的。(2)circFUT8在前列腺癌相关细胞系中具有独特的差异表达模式,可能参与了前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化的生物学过程。(3)circAMACR在前列腺癌中具有肿瘤特异性并且在其进展过程中具有一定的肿瘤生物学作用。
  第三部分 环状RNA应用于前列腺癌血浆检测的初步研究
  目的:(1)提高前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的稳定性;(2)筛选前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目及最适内参基因组合。(3)初步探讨circRNAs应用于前列腺癌血浆检测的临床意义。
  方法:(1)改进血浆样本总RNA提取方法,优化前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的qRT-PCR反应条件。(2)利用前列腺癌和良性前列腺增生各10例患者的血浆样本,对β-Actin、GAPDH、18s rRNA、β2M、GUSB、HPRT1、PPIA、SDHA等8个候选内参基因进行qRT-PCR检测,并使用NormFinder和geNorm软件分析实验数据。(3)利用45例前列腺癌和30例良性前列腺增生患者的血浆样本,对组织测序结果中差异表达显著的29个circRNAs(表达上调9个,表达下调20个)进行qRT-PCR检测,并结合组织测序及验证结果进行分析。
  结果:(1)本研究实验体系下前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目为2个,最适内参基因组合为GAPDH和PPIA。(2)血浆qRT-PCR检测时,有9个circRNAs无扩增曲线,14个circRNAs的扩增产物电泳时无目的条带,3个circRNAs的扩增产物电泳时杂带明显,只有3个circRNAs(circAPLF、circLPAR1和circSLC45A4)在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中稳定表达。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中的总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,而circLPAR1在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中的总体表达水平无显著差异。
  结论:(1)在前列腺癌患者血浆中进行circRNAs检测是可行的,但应根据具体实验体系做出适当优化。(2)GAPDH和PPIA的内参基因组合可作为均一化标准用于前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆样本的qRT-PCR检测。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中稳定存在,且总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,提示其对于前列腺癌具有一定的诊断应用价值。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
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