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[硕士论文] 王金华
生态学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何将有限的水土资源有效利用,在粮食供给得以保障的前提下,降低农业生产对资源环境的负面影响,是当今全球各农业大国面临的重大挑战。稻虾共作通过稻田养殖小龙虾,能充分利用稻田光、热、水及生物资源,将水稻种植和小龙虾饲养有机结合起来,具有农田减排和农民增收的双重效应,社会、经济和生态效益显著,应用前景广阔。
  本试验通过室内养虾试验和田间秸秆还田投食试验,研究投食和秸秆还田对水稻和小龙虾生长及稻田土壤氮素动态变化的影响,为稻虾共作氮肥运筹提供理论依据和技术支撑。(1)室内养虾试验于2016年4月-2016年7月在华中农业大学水产学院实习基地(114°29′E,30°28′N)以克氏原螯虾为研究对象,通过设置不同含氮量的饲料:玉米(9.86mg/g)、花生(17.34mg/g)、复合饲料(22.22mg/g)、大豆(37.98mg/g)、不投食(CK)五个处理,研究饲料对小龙虾生长动态的影响,明确小龙虾对饲料中的氮的同化量和排泄量的差异性和相关性;(2)秸秆还田与投食试验于2016年和2017年在湖北省潜江市后湖管理区华中农业大学稻虾试验基地(112°71′E,30°39′N),以水稻泰优390和克氏原螯虾为供试材料,设置秸秆还田投食(S+F)、秸秆还田不投食(S+NF)、秸秆不还田投食(NS+F)、秸秆不还田不投食(NS+NF)、水稻单作秸秆还田(CK+S)、水稻单作秸秆不还田(CK+NS)6个不同处理,每个处理设置3个重复,研究稻田氮素转化的动态特征,明确秸秆还田和投食双因素影响下,不同处理对稻虾系统水稻产量及构成因子、小龙虾产量、土壤理化性质、氮素动态特征以及氮素利用效率的影响。主要结果如下:
  (1)投喂不同饲料对小龙虾生长动态、饲料摄取与同化的影响研究表明,投食显著增加了小龙虾的体重、头胸甲长和头胸甲宽。不同处理间,放养前和收获后小龙虾体重的差异表现为:投喂复合饲料>投喂大豆>投喂花生>投喂玉米>不投食,差异显著;体长的差异表现为:投喂复合饲料>投喂大豆>投喂花生>投喂玉米>不投食;小龙虾头胸甲长和头胸甲宽在不同处理间没有显著影响。投喂复合饲料可以使小龙虾的同化量氮达到最大值,不同处理同化量氮大小表现为:投喂复合饲料(337.18mg)>投喂玉米(299.39mg)>投喂大豆(294.11mg)>投喂花生(216.26mg)>不投食(66.65mg);粪便中氮总累计量的大小表现为:投喂复合饲料>投喂玉米>投喂大豆>投喂花生>不投食;小龙虾对饲料氮的利用率差异显著,具体为:投喂玉米>投喂复合饲料>投喂花生>投喂大豆。投喂复合饲料不仅有利于小龙虾的生长,还可以提高饲料中氮的利用率,取食复合饲料的小龙虾排放的粪便中氮总累计量高,进入稻田中可以达到氮肥补偿和减肥增效的目的。
  (2)秸秆还田与投食对产量的影响研究表明,稻田养虾对水稻产量比较结果为:NS+F>S+F>NS+NF>S+NF,投食对产量有一定的正效应,秸秆还田对产量的影响不显著,投食能显著增加水稻的产量、有效穗数、结实率和每穗粒数,但对千粒重的影响不显著。稻虾系统中不同处理对小龙虾产量影响结果表现为:S+F>NS+F>S+NF>NS+NF,投食显著增加了小龙虾的产量,秸秆还田对小龙虾的产量没有显著影响。
  (3)秸秆还田与投食对土壤氮素的影响研究表明,土壤总氮含量相对稳定,在整个水稻生育期不同处理间、周年间没有显著差异,但总氮含量在S+F处理中最高,于收获期达到了2.0338g/kg,与CK+S相比,增加了18.8%,稻虾系统中投食会增加土壤总氮含量;土壤铵态氮、碱解氮含量在水稻整个生育期的变化趋势较一致,均表现为先升高后降低的趋势,同一生育期不同处理之间,NS+F处理中的铵态氮含量显著高于其他处理,稻田养虾增加了土壤铵态氮和碱解氮的含量;稻虾系统中土壤硝态氮含量在整个生育期内表现为先降低后升高的趋势,与CK相比,硝态氮含量偏低,稻田养虾降低了土壤硝态氮含量。
  (4)秸秆还田与投食对氮素利用的影响研究表明,稻田养虾增加了氮肥偏生产力,同时也增加了氮收获指数和谷物收获指数。在稻虾系统中,不同处理之间氮肥偏生产力的大小表现为:NS+F>S+F>NS+NF>S+NF,稻虾系统中投食提高了氮肥偏生产力,秸秆不还田也会提高氮肥偏生产力;在氮素利用效率方面,不同处理之间表现为:S+NF>NS+F>NS+NF>S+F,稻谷收获指数大小表现为:S+F>S+NF>NS+NF>NS+F,表明S+F处理虽然会增加稻谷收获指数,可以达到增产的目的,同时会造成氮素利用效率偏低,导致氮肥流失和浪费,也会造成环境污染,因此在稻虾田中应合理秸秆还田和适当投喂饲料。
  (5)秸秆还田与投食对稻虾系统中氮平衡的影响研究表明,在四个不同处理中,氮素累计输出量和氮素输出/投入比值大小均表现为:S+F>NS+F>S+NF>NS+NF,S+F处理更有利于稻虾系统中投入的氮素流入到水稻籽粒和小龙虾体内。在稻虾系统中,氮素转化率偏低,处于21.2%-58.7%之间,大部分氮素流失到了环境中,造成了资源的浪费。
[硕士论文] 吕韩
海洋科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:中国的大规模海藻养殖占全球海藻养殖产量的一半,是世界水产养殖总产量的1/4(按重量计)。除了其巨大的直接经济价值,海藻养殖在生态系统服务方面的贡献也相当巨大,而这并没有得到人们充分的认识和量化。海藻养殖产生的生态系统服务除了固碳释氧净化空气、水体富营养化调节和重金属去除等直接生态系统服务以外,相比陆地农业海藻养殖节省了许多成本,如避免了淡水、农药和化肥的消费,以及巨大的由于耕地性质的改变造成的生态系统服务损失。因此,为加强人们对海藻养殖生态系统服务直接价值与间接价值的认识,本文以2005年-2014年我国以及浙江省和江苏省的养殖海藻为研究对象,利用替代成本法和机会成本法对海藻养殖直接与间接生态系统服务价值进行评价,分析各项服务的重要性。结果显示,直接生态服务价值主要包含三项:海藻固碳价值、海水富营养化调节价值和重金属移除价值。固碳价值采用中国碳交易市场价格(35元/t碳),占比13.72%;富营养化调节及重金属移除价值参照《排污费征收标准管理办法》,占比分别达到65.91%和20.36%。间接生态系统服务价值远大于直接生态系统服务价值,其中1吨海藻可以避免0.22公顷森林转化为耕地,0.077吨肥料,146吨淡水和0.011吨农药以及所产生的生态系统服务损耗。2014年,全国海藻养殖直接和间接生态系统服务分别达到了13700万元和227.0亿元,浙江省和江苏省的海藻养殖生态系统服务价值分别达到了49430和31180万元。其中,浙江省和江苏省的海藻养殖三项直接生态服务价值分别达到了40.96万元、196.55万元、60.71万元和25.83万元、123.98万元、38.29万元,而四项间接生态服务价值分别达到46487.04万元、1160.78万元、308.52万元、1176.71万元和29321.52万元、732.15万元、194.60万元、742.21万元,远大于海藻直接经济价值,而我国绵长的海岸带以及滞后的海藻产业发展规模表明我国海藻养殖具有巨大的发展潜力,促进海藻养殖将成为缓解土地压力和解决全球粮食危机的方案之一。
[硕士论文] 缪栋
农用海洋资源 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:海参养殖业是我国特色海水养殖产业之一,主要分布在辽宁和山东沿海。海参养殖业发展迅速,2010年全国海参养殖面积已达到万公顷,产量达万吨,产值接近亿元。然而,相对于其迅速发展的规模,与海参养殖技术相关的基础研究还比较滞后。因此,相关基础研究越来越受到人们的重视。
  海参养殖环境中微生物有着十分重要的地位,大部分微生物以生产者或分解者作用参与水生生态系统,部分寄生或共生型病原微生物会造成海参疾病爆发,与海参的健康生长有着十分紧密的联系。而在人工养殖过程中,不规范的投放饵料、药物滥用等造成池底物质堆积,往往会导致水体微生态平衡受到严重破坏,水质恶化、缺氧等,造成海参免疫力下降或死亡;另外,水体富营养化也会造成水体优势青苔与养殖生物饵料藻类竞争,造成底质腐败等,进而给海参养殖造成直接或间接的负面影响。因此,海参养殖环境的健康状况与微生物群落的丰度、群落结构有着紧密的联系,探究养殖环境中微生物群落的组成与动态变化对于海参养殖业具有重要的理论和实践意义。
  基于以上背景,本工作对海参养殖池塘中的微生物多样性和年度动态变化进行了研究,采用流式细胞术检测水体中浮游微生物丰度;通过高通量测序检测真菌、古菌、细菌等不同类型的微生物多样性及其丰度变化;利用连续流动分析仪对海参养殖水体的环境因子进行测定;综合群落结构和环境因子寻找影响微生物群落变化的制约性因素。另外,针对青苔爆发频繁的实际性问题,利用特异性引物设计和定量PCR技术相结合,探讨检测海参养殖池中青苔孢子的分子检测方法,以期达到对青苔爆发的早期预警。本研究旨在为海参养殖池塘环境微生物生态调控模式的建立提供一定的基础资料。主要研究结果如下:
  1.海参养殖池浮游微生物的分布
  利用流式细胞仪技术研究了海参养殖池塘水体环境浮游微生物丰度变化及其与环境因子的关系。
  结果表明:
  (1)浮游微生物检测出聚球藻、皮微级浮游植物、纳微级浮游植物、隐藻、高低核酸异养细菌几大类型,其中细菌数量级非常大,几乎达到106/mL,而浮游植物的数量级较小,只有102/mL~103/mL。
  (2)浮游微生物一般都是3月开始生长,到6月份处于爆发顶峰期,9月份的时候已经处于衰退期。
  (3)浮游微生物数量与环境中的溶解氧,盐度、pH、可溶性总氮具有一定的相关关系,其中,溶解氧和pH对于浮游微生物的影响是最大的。
  2.海参养殖池微生物多样性分析
  水样过滤膜提取DNA,并进行高通量测序,再结合环境因子对比,研究海参养殖池微生物多样性。
  结果表明:
  (1)细菌中变形菌门是重要组成部分,其中α-变形菌(Alphaproteobacteria)是主要类群。CCA分析结果显示,原核生物类群受pH、亚硝态氮、硅、氨态氮、温度控制。
  (2)古菌生物中,大部分样品优势类群是DHVEG-6。而且大部分古菌如DHVEG6、MHVG、GroupC3、MBGB等都与各种形态可溶性氮元素有着显着甚至是极显著相关性。CCA分析的结果显示出微生物群落受盐度和硅控制。
  (3)真核微生物中泛植物界占据主要组成部分,而在泛植物界中绿藻门是最主要的。CCA结果显示生物类群受盐度、温度、pH、溶解氧、亚硝态氮、氮磷比控制影响。
  3.海参养殖池三种藻类孢子/配子qPCR检测
  对海参养殖池三种爆发性青苔进行了18S和ITS区间测序,设计了以核糖体转录间隔区(ITS)为靶区域的种类特异性PCR引物,通过藻类和环境水样DNA对照实验检验其特异性和适用性。
  结果如下:
  (1)所得三种藻类ITS引物均具有一定种类或类群特异性。
  (2)三对引物在qPCR方法中呈现一定的灵敏度,三株藻类最低检出限度:缘管石莼约1.66×10-4 ng/μL,200个ITS基因拷贝数;未能鉴定到种约6.6×10-6 ng/μL,200个ITS基因拷贝数;萱藻1.66×10-4 ng/μL,400个ITS基因拷贝数。
  (3)使用qPCR方法对烟台海参养殖水体6个季度环境水样中的萱藻孢子/配子进行定量检测,发现样品中萱藻孢子/配子ITS拷贝数的季节变化与青苔爆发规律呈现较高的吻合度,萱藻爆发前期伴随水体中孢子/配子量的增高,初步显示藻类爆发可被qPCR方法预测。
[硕士论文] 黄岩
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:1.饲料中牛磺酸水平对斜带石斑鱼生长性能、抗氧化能力的影响
  配制添加0、0.5%、1%、1.5%牛磺酸的饲料投喂斜带石斑鱼幼鱼,通过56天的养殖实验,测定斜带石斑鱼生长性能各相关指标:SR、WGR、DFI、FE、SGR和CF。结果发现,饲料中添加牛磺酸具有明显的促生长作用。当牛磺酸缺乏时,石斑鱼表现出较差的生长性能。牛磺酸添加组斜带石斑鱼DFI随着牛磺酸添加量的增加而升高,且在1%牛磺酸水平下达到最高,与对照组差异显著(P<0.05)。FE的变化趋势与DFI相同。WGR和SGR随着牛磺酸水平升高先升后降,在牛磺酸水平为1%时最高。因此,1%的牛磺酸水平对于斜带石斑鱼的促生长作用最为明显。
  饲料中添加不同水平的牛磺酸均能够显著提高肝脏、肌肉、血清中主要抗氧化酶:SOD、CAT、GSH-Px活性以及T-AOC,显著降低MDA含量。其中,饲料中添加1%的牛磺酸对于斜带石斑鱼的抗氧化能力提高以及脂质过氧化产物的清除效果最佳,并且与对照组、其余实验组差异显著(P<0.05)。这与生长性能实验的效果相一致,因此饲料中1%的牛磺酸添加量最有利于斜带石斑鱼生长及抗氧化能力的提高。
  2.斜带石斑鱼原代培养肝细胞四氯化碳氧化损伤模型的建立
  本实验利用肝细胞体外培养模型,采用CCl4作为氧化损伤毒物构建肝细胞四氯化碳氧化损伤模型,研究不同CCl4浓度(0、4、8、16mM)在不同作用时间(2、4、8h)下对于斜带石斑鱼离体肝细胞的损伤作用。实验采用MTT法检测肝细胞活性,并测定肝细胞培养上清液中GPT、GOT和LDH活性以及抗氧化相关指标(SOD、CAT、GSH-Px、MDA)。结果显示,不同浓度CCl4均能够降低细胞活力,4mM时与8mM时差异不显著(P>0.05),但8mM时显著高于16mM(P<0.05)。CCl4作用4h时肝细胞活力降低程度显著低于作用8h(P<0.05)。CCl4浓度为8mM时作用4h能够显著增加GPT、GOT、LDH的释放量(P<0.05)。8mM的CCl4作用4h能够显著降低SOD、CAT活性(P<0.05),显著提高MDA含量(P<0.05)。因此,8mM可作为CCl4氧化损伤模型的最佳损伤浓度,CCl4作用4h可作为损伤实验最适作用时间,以此作为牛磺酸保护作用的实验依据。
  3.牛磺酸对斜带石斑鱼原代培养肝细胞氧化损伤的保护作用
  本实验以CCl4肝细胞氧化损伤模型为基础,采用牛磺酸对受损的斜带石斑鱼肝细胞进行预先保护和损伤修复。采用三种不同的作用方式加入牛磺酸(牛磺酸前处理:CCl4损伤肝细胞之前加入牛磺酸;牛磺酸前后处理:CCl4损伤肝细胞前后均加入牛磺酸;牛磺酸后处理:CCl4损伤肝细胞之后加入牛磺酸),每种作用方式加入三种不同浓度牛磺酸:5mM、10mM、15mM。同时,设立空白对照组、CCl4对照组、牛磺酸对照组,对照组和处理组均作用相同时间。通过测定培养上清液中肝细胞活力,肝细胞功能指标,抗氧化酶活力以及抗氧化酶基因表达量,探究离体条件下牛磺酸对斜带石斑鱼肝细胞保护作用,确定牛磺酸最佳作用方式和最适浓度。结果表明,牛磺酸的加入均能够显著提高斜带石斑鱼肝细胞的活力(P<0.05)。牛磺酸前处理组和牛磺酸前后处理组在浓度为10mM时细胞活力最高,而牛磺酸后处理组则在15mM时最高。牛磺酸前处理组和牛磺酸前后处理组在10mM牛磺酸浓度时能够显著抑制肝细胞GPT、GOT、LDH的活性(P<0.05),牛磺酸后处理组在浓度为15mM时GPT、GOT和LDH活性才显著下降。抗氧化能力方面,牛磺酸对照组能够显著提高SOD、CAT酶活性(P<0.05),牛磺酸前处理组和前后处理组的SOD酶活性随着牛磺酸浓度升高呈现先升高后降低的趋势,在10mM时活性最高。牛磺酸后处理组SOD酶活性则随牛磺酸浓度升高逐渐上升,最大值出现在15mM时,并且显著高于5mM和10mM(P<0.05)。CAT活性的变化趋势与SOD相似。GSH-Px酶活性在牛磺酸前处理组和前后处理组随着牛磺酸浓度升高出现先升高后降低,10mM时活性最高,且显著高于5mM(P<0.05),牛磺酸后处理组则在15mM时活性最高。MDA含量在CCl4组时最高,且显著高于其余各组(P<0.05)。牛磺酸的加入显著降低了MDA含量(P<0.05),牛磺酸前处理组、后处理组和前后处理组的MDA含量均在10mM浓度时最低。由抗氧化酶基因表达量可以看出,CCl4显著下调了抗氧化酶基因的表达水平(P<0.05),牛磺酸的加入能够显著影响抗氧化酶基因的表达水平(P<0.05)。SOD、CAT酶基因表达量随牛磺酸浓度升高先升高后降低,10mM的表达量最高。GSH-Px酶基因表达量则随着牛磺酸浓度升高而升高,15mM时最高,但与10mM时差异不显著(P>0.05)。结果显示:牛磺酸能够显著提高因CCl4氧化损伤造成的斜带石斑鱼肝细胞抗氧化能力的下降。综合比较各种处理方式和作用浓度,发现牛磺酸前后处理的作用方式,10mM的牛磺酸浓度是牛磺酸保护肝细胞的最适宜组合。
[硕士论文] 张润蔚
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:1.H2O2诱导斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型的建立
  通过不同的过氧化氢培养浓度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用时间(2、4、6、8、12、24h)探索适宜的斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤浓度和时间,以建立的斜带石斑鱼原代肝细胞氧化损伤模型,并检测培养过程中肝细胞的数量和活性的变化。采用单因子完全随机设计实验,根据台盼蓝对死细胞拒染法利用血球计数板测定细胞活力及数量,并通过MTT法测定细胞存活率。结果显示,800μmol/L H2O2,作用8h,斜带石斑鱼肝细胞的存活率降低至61.98%。
  2.H2O2对斜带石斑鱼原代肝细胞活性及功能的影响
  本研究采用斜带石斑鱼原代肝细胞模型,主要探究过氧化氢对原代培养的肝细胞氧化损伤机制的影响。通过测定不同培养时间下过氧化氢不同作用浓度的肝细胞或培养上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)的变化,分析细胞生长代谢状态。结果显示,使用过氧化氢处理后其他各组与800μmol/L和1000μmol/L组相比显著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性,显著升高LPO、MDA含量(P<0.05),但是800和1000μmol/L组之间没有显著差异(P>0.05)。结果发现:H2O2过氧化氢作用时间为8h、作用浓度为800μmol/L,使斜带石斑鱼原代肝细胞产生了明显的氧化应激,该条件可作为建立斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型的适宜条件。
  3.利用转录组学技术研究过氧化氢对肝细胞差异表达影响
  本研究以过氧化氢为刺激源诱导建立了斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型,试验基于RNA-Seq技术对正常处理组(L-15)和对照组(800μmol/L H2O2)的斜带石斑鱼肝细胞进行测序,利用转录组学技术深度分析细胞内部基因的转录调控以及过氧化氢处理后细胞表型和功能的改变。结果显示,通过转录组数据分析发现,对83,802,103条原始reads的筛选和排除,拼接获得到了112,618条Unigenes,平均长度为957.45bp,N50为1,687bp。按照Blast等相关软件,对数据进行相关分析后,共得到功能注释基因110,560个。依据GO富集分析发现,差异表达基因主要被集中在代谢通路、细胞过程、生物调控等通路中,在KEGGpathway富集分析中结果显示,代谢通路涉及基因最多,有170个。两种水平下(过氧化氢处理组和对照组)共差异表达的基因共2,570个,其中上调的基因1,520个,下调的基因1,020个。结果显示,800μmol/L H2O2对斜带石斑鱼肝细胞的代谢和生物调控等相关基因表达产生影响。本实验对差异表达的基因进行后续分析及预测,为斜带石斑鱼生长代谢及疾病预防等方面的研究提供了丰富的数据来源。
[硕士论文] 刘岚萍
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:小G蛋白是重要的分子开关,可以调节细胞分裂、细胞骨架形成、囊泡运输、核质运输等多种细胞功能,在免疫中发挥重要作用。本研究克隆得到大黄鱼Rac1、Rac2、Rac3、Rab7和Rab5A(分别称为lycRac1、lycRac2、lycRac3、lycRab7和lycRab5A)的cDNA序列,通过与基因组序列图比对获得完整的基因序列,分析了这些基因的分子特征、组织表达特性,以及LPS、PolyI∶C、副溶血弧菌等刺激后大黄鱼肝脏、脾脏和肾脏中的表达变化并对利用免疫胶体金技术对肝脏中表达的lycRAC2进行亚细胞定位,利用GST-Pulldown和质谱鉴定研究了与lycRAB5A互作的蛋白质。主要结果如下:
  1、RAC蛋白包括3个类型,分别为Rac1、Rac2和Rac3。lycRac1的cDNA全长2329 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac2的cDNA全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac3的cDNA全长2182 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。氨基酸多重比对显示,lycRac1与海龟(Chelonia mydas)、斑马鱼(Maylandiazebra)和红鳍东方纯(Takifugu rubripes)的Rac1基因有高相似性;lycRac2与尖吻鲈(Lates calcarifer)、亚马逊花鳉(Poecilia formosa)和剑鱼(Xiphophorusmaculatus)同源性高;lycRac3与牛(Bostaurus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)和蓝鲶鱼(Ictalurus furcatus)有较高同源性。通过基因组分析发现lycRac1有6个外显子,5个内含子;lycRac2有7个外显子,6个内含子;lycRac3有7个外显子,6个内含子。进化树分析表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3均与鱼类Rac1、Rac2和Rac3聚成一支。利用荧光定量PCR技术检测三个基因在组织中的表达量,发现它们在所有检测的组织中均可以表达,其中,lycRac1在心脏中的表达量最高,血液和脑中也有较高的表达,头肾中的表达量最低;lycRac2在头肾中的表达量最高,肾脏和脾脏中也有较高的表达,肌肉中的表达量最低;lycRac3在血液中的表达量最高,脾脏和脑中也有较高的表达,肠中的表达量最低。大黄鱼受到Lpopolysaccharide,Polyinosinic Polycytidylic acid和VibrioParahemolyticus刺激后lycRac1、lycRac2和lycRac3在肝脏、脾脏、头肾中的表达量有不同程度的升高,纯化的lycRAC2蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。免疫电镜结果表明,lycRAC2亚细胞定位于细胞间质。以上结果表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3可能是与免疫相关的基因,它们在应对细菌感染中发挥不可或缺的作用,lycRAC2的亚细胞定位进一步说明lycRac2与信号传递有关。
  2、Rab7是属于Ras家族的小G蛋白,lycRab7的cDNA全长2218bp,开放阅读框(ORF)624 bp,编码207个氨基酸。氨基酸多重比对结果显示,lycRab7与斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)、家兔(Oryctolagus cuniculus)的Rab7基因同源性较高。通过基因组分析发现,lycRab7有5个外显子,4个内含子。系统进化树分析表明,lycRab7与其它鱼类可以聚成一支。实时荧光定量PCR结果显示,lycRab7在12个组织中均有表达,其中脑中的表达量最高,血液和心脏中也有较高的表达,胃中的表达量最低。大黄鱼受到LPS、polyI∶C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏和头肾中lycRab7的表达量均明显上调。纯化的lycRAB7蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。以上结果表明,lycRab7在抵御细菌入侵中发挥重要作用。
  3、Rab5A是Ras家族的一员,已得到纯化的lycRAB5A蛋白,根据GST pull down结果可知,lycRAB5A蛋白与腺苷三磷酸酶(Calcium-transporting ATPase)、肌酸激酶(Creatine kinase M-type)、肌动蛋白(Actin,alpha skeletal muscle)等蛋白互作。结果表明lycRAB5A与其他蛋白协同在机体免疫中发挥作用。
[硕士论文] 徐双斌
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:环状RNA在三十年前就已被报道。最近随着高通量测序技术的发展,研究人员在越来越多的物种中发现环状RNA,但在硬骨鱼中却仍鲜有报道。大黄鱼是我国一种重要的海水养殖鱼类,本研究通过利用大黄鱼基因组模拟得到的数据,对现有的两种挖掘环状RNA的生物信息学流程进行评估,从中选取合适的流程对实验室原有大黄鱼的真实转录组数据进行环状RNA的挖掘,并进行了大黄鱼雌雄鱼性腺环状RNA的测序、挖掘,比较了两者之间环状RNA的表达差异。主要的研究结果如下:
  1.利用模拟数据对目前常用的两种环状RNA挖掘流程,从不同的环性与线性转录本测序量方面进行评估,发现在环性转录本较低的条件下,其中的一款流程CIRCexplorer检测到的环状RNA的准确率较高。但在环性转录本较高的情况下,另一款流程CIRI检测到的环状RNA的准确率有所升高,挖掘到的环状RNA的数量也较多,但CIRCexplorer的准确率仍高于CIRI,挖掘到的环状RNA的数量仍低于CIRI。
  2.根据模拟数据的评估结果,利用CIRCexplorer对大黄鱼多组织混合样本的RNA seq数据进行环状RNA挖掘,检测到了975个环状RNA分子,其中65.95%来自编码基因的外显子;随机挑选3条进行验证,其中2条得到了确认。对挖掘到的外显子环状RNA来源基因进行GO以及KEGG富集分析,结果显示,这些来源基因主要富集在结合、翻译起始因子、细胞质内大分子代谢、翻译等通路中。对其进行microRNA靶点预测的结果显示,大黄鱼环状RNA中有丰富的miRNA的结合位点,其中有363个环状RNA具有超过5个潜在的microRNA结合位点,22个具有10个以上的miRNA-430与let-7家族的结合位点。
  3.进行了大黄鱼精巢和卵巢环状RNA测序,从测序数据中,共检测到环状RNA6115个,其中2693个在精巢中特异表达,1053个在卵巢中特异表达;余下2369个在精巢和卵巢都有表达的环状RNA中。表达差异分析结果显示,有1065个环状RNA的表达量在精巢相对上调,而有621个表达量在精巢中相对下调。对这些差异表达的环状RNA的编码基因进行GO富集分析,结果表明这些基因主要富集在神经系统发育(GO:0007399 nervoussystem development)、蛋白质结合(GO:0005515 protein binding)以及谷氨酸受体活动(GO:0004972 NMDA glutamate receptor activity)等GO术语上。KEGG代谢通过分析结果显示,雌雄性腺环状RNA的编码基因在脂类代谢途径(Ubiquitin meditated proteolysis)、孕激素介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)以及泛素介导的蛋白酶解(TNF signaling pathway)等代谢通路中具有明显差异。性腺中检出的环状RNA具有丰富的miRNA结合位点,网络分析结果显示大黄鱼性腺中的circRNA-miRNA-mRNA可能具有复杂的调控网络。
[硕士论文] 贾雪卿
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:肠道菌群是一个受遗传、营养和环境因子影响的动态生态系统,复杂的肠道菌群因其对宿主生长、健康等方面的影响而日益受到研究学者的关注,是宿主体内不可缺少的“器官”之一。花鳗鲡,是鳗鲡类中体型较大的一类,广泛地分布在热带和亚热带的海水与淡水水系里,是一种珍贵的鱼类资源,为中国国家二级保护动物。随着养殖集约化的增加和养殖技术的限制,花鳗鲡养殖水平参差不齐。在花鳗鲡养殖过程中,因为营养不良和管理不当等因素,会出现一些养殖时间长却生长极缓慢的个体。它们通常头大尾小,体色多呈棕黄色或黑色,被称为僵鳗。
  本研究中,运用传统培养手段和高通量测序技术揭示不同生长程度花鳗鲡肠道菌群结构,并结合饲喂实验初步探讨花鳗鲡肠道关键菌群对其生长的影响。实验设计三组鳗鲡肠道样品(快速生长组Am-R、缓慢生长组Am-S和僵滞生长组Am-F)和两组环境样品(养殖水体组Am-W和饲料组Am-B),本研究结果如下:
  1、利用传统培养手段分离Am-R组和Am-F组的鳗鲡肠道细菌共包括14个属,分别为乳球菌属、肠球菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、变形菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、不动杆菌属、邻单胞菌属、柠檬酸杆菌属、埃希氏菌属、爱德华氏菌属,和微杆菌属。其中,仅在Am-R组中分离得到了乳球菌属和肠球菌属。
  2、利用高通量测序技术分析花鳗鲡样品菌群结构,经过滤和去冗余处理,11个样品共获得625,583有效读段和36,863个可操作分类单元(OTU)。所有样品中,Shannon指数平均值Am-W>Am-B>Am-F>Am-R>Am-S,Simpsom指数平均值Am-W<Am-B<Am-F<Am-R<Am-S,ACE和Chao指数平均值Am-B>Am-W>Am-S>Am-R>Am-F。其中,Am-W组菌群微生物多样性最高,Am-B组菌群丰度最高,而在肠道样品中Am-S组菌群多样性最低、丰度最高。花鳗鲡肠道样品中Am-R组和Am-S组菌群结构相似,共有核心菌群为鲸杆菌属、梭菌属、乳球菌属和拟杆菌属。而Am-F组核心菌群为螺原体属。Am-W组核心菌群为黄杆菌属、新鞘氨醇菌属和假单胞菌属。Am-B组核心菌群为棒状杆菌属。此外,在快速生长和僵滞生长的花鳗鲡肠道中,主要差异菌群为鲸杆菌属、梭菌属、乳球菌属、拟杆菌属、爱德华氏菌属、邻单胞菌属、魏斯氏菌属、肠杆菌科和螺原体属等。
  3、三组饲料添加剂均对僵鳗生长产生了促进作用,其中以拟杆菌属与梭菌属添加组(BC组)促生长效果最好,乳球菌属与肠球菌属添加组(LE组)的促生长效果与甘露寡糖添加组(MO组)的促生长效果没有显著差异。
  本研究结果阐明了养殖花鳗鲡肠道菌群基本组成,分析了影响鳗鲡生长的关键菌群,对几种潜在益生菌能否促进僵鳗生长进行了初步探索,为后续关于鳗鲡保护和养殖的研究提供了基础,并丰富了肠道微生物和饲料添加剂方面的研究。
[硕士论文] 孙庆学
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:本研究在实验室前期获得大黄鱼(Larimichthys crocea)两种类型TLR5(LcTLR5M,LcTLR5S)cDNA序列的基础上,分别克隆了它们的启动子序列,通过片段缺失,定点突变等技术,筛选并验证了其启动子结构及转录结合位点;构建了LcTLR5M和LcTLR5S的亚细胞定位质粒,研究了其在细胞内的表达特征;构建了它们的过表达质粒,将其分别以及共同与NF-κB家族p65基因启动子共转染细胞系,检测了LcTLR5M和LcTLR5S过表达对NF-κB-p65启动活性的影响。克隆了大黄鱼NF-κB家族RelB基因的全长cDNA序列,分析了它的分子结构及组织表达谱,检测了病原相关分子模式(PAMP)刺激后,其在细胞系内的时空表达特征;研究了RelB亚细胞定位并分析了其过表达后对TNF-α等部分细胞因子的影响及IκB家族IκB-α对其调控机制。扩增了NF-κB家族成员p65基因的启动子序列,检测了其活性,以及病原刺激后对其启动活性的影响;研究了p65基因亚细胞定位及分析了其过表达对下游细胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-I基因的启动子活性的影响,及IκB-α对其调控机制。结果如下:
  (1)大黄鱼TLR5M启动子区域在-1829bp至+189bp之间,无CpG岛区域,转录结合位点含有CEBP、Oct-1、GA TA-1、AP1等元件,系列片段缺失分析基本启动子活性所需的顺式作用元件可能位于-417至+189之间,负调控元件可能位于-799至-417之间。大黄鱼TLR5S启动子区域在-1932bp至+106bp之间,无CpG岛区域,转录结合位点含有CEBP、SP1、Oct-1、AP1、NF-B等元件,片段缺失表明TLR5S基因顺式作用元件可能位于-808至+106之间,Oct-1和NF-κB结合位点对TLR5S启动子活性有正调控作用且大黄鱼NF-κB家族亚基p65过表达可显著上调TLR5S启动子活性,表明预测正确。亚细胞定位分析表明,大黄鱼TLR5M蛋白主要定位在细胞膜上,而TLR5S蛋白主要定位在细胞浆中。TLR5M过表达对NF-κB-p65启动子的活性无显著影响,而TLR5S过表达可以显著上调NF-κB-p65启动活性。
  (2)大黄鱼RelB(LcRelB)基因全长为1946bp,ORF为1788bp,编码595个氨基酸,包含RHD-DNA-bind结构域和IPT结构域,等电点pI=5.6,分子量为66.5KDa。进化分析表明,大黄鱼RelB基因与红鳍东方纯亲缘关系最近;LcRelB广泛分布于多种组织,其中在血细胞中含量最高,其次是脾脏和头肾,皮肤中含量最低;LPS和poly I∶C刺激后,大黄鱼LCK细胞系中LcRelB上调表达显著,而PGN免疫刺激后表达下调(p<0.05)。LcRelB蛋白定位于细胞核中。LcRelB过表达后,其下游细胞因子IL-1β启动子活性显著下调,而TNF-α和IFN-I启动子活性显著上调(p<0.05),而当NF-κB家族抑制因子LcIκB-α与其共转染后,可以显著抑制TNF-α启动子活性(p<0.01)。
  (3) Lcp65启动子区域为-1695bp至+111bp,预测其转录结合位点含有USF、AP1、SRF、IRF-1、NF-κB等元件,含有CpG岛以及(GT)n重复区域;LPS,PGN,Flagellin刺激后均能够显著诱导p65启动活性上调,其中Flagellin诱导能力最为显著(p<0.01);亚细胞定位表明,Lcp65蛋白主要定位于细胞核中;Lcp65过表达后能显著上调其下游细胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-I启动子的活性,其中,TNF-α的启动活性最强。抑制因子LcIκB-α与其共转染后,可以显著抑制其对TNF-α启动子活性的诱导(p<0.01)。
[硕士论文] 曾秋辉
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:本文以牛蛙Rana(Lithobates) catesbeiana为试验动物,研究饲料中添加两种蛙源产植酸酶菌(阴沟肠杆菌E.cloacae和枯草芽孢杆菌B.subtilis)对其生长、营养吸收及肠道健康的影响。主要研究内容如下:
  1.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis的耐热性及产酶能力的研究
  从牛蛙肠道中筛选出两株产植酸酶细菌(E.cloacae和B.subtilis)。试验一,研究不同温度(25℃,28℃,31℃,34℃,37℃),不同培养周期(24h,48h,72h,96h)对B.subtilis产芽孢能力的影响,研究其最适产孢条件。试验二,通过设置5种不同温度(65℃、75℃、85℃、95℃、105℃),研究两株菌的耐热性。试验三,以WBE为植酸酶液体发酵培养基,30℃下摇瓶培养72h,测定E.cloacae和B.subtilis的产酶能力。结果:试验一,B.subtilis最适产芽孢条件为(31℃,96h),芽孢率>95%。试验二,B.subtilis具有较高的耐热性,105℃下存活率高达93.56%,而E.cloacae并不耐热。试验三,E.cloacae产酶能力为33.72U/mL,B.subtilis产酶能力为26.31U/mL。
  2.饲料中添加不同水平产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙生长性能、体成分和血清抗氧化能力的影响
  选取252只平均体重为(42.5±0.2)g的幼蛙,随机分为7个处理组,每个处理组3个重复,每个重复12只。试验选用两种产植酸酶细菌(E.cloacae和B.subtilis),每种细菌设3个添加梯度(105、107和109cfu/g)以及对照组(无菌),共制作7种饲料,进行为期56d的摄食生长实验。结果:B.subtilis109 cfu/g剂量组(KG)的饲料效率(FE)最高(1.21),除B.subtilis107cfu/g剂量组(KZ)外,显著高于其余各组(P<0.05)。E.cloacae添加组中,饲料效率(FE)和蛋白质效率(PER)都随E.cloacae添加量的升高呈上升趋势,在E.cloacae109cfu/g剂量组(YG)时达到最大,显著高于对照组(P<0.05)。血清中总抗氧化力(T-AOC)随着B.subtilis添加量的增加,T-AOC有先升高后降的趋势,在KZ达到最高水平且显著高于对照组(C)(P<0.05)。随饲料中两种产植酸酶菌添加量增加,血清CAT水平皆有先升高后降低趋势,分别在YZ和KZ组达到最高,但与对照组无显著差异(P>0.05);SOD水平皆有先升高后降低趋势,分别在YZ和KZ组达到最高。以上结果表明:饲料中添加E.cloacae(1×109)和B.subtilis(1×107和1×109)不影响牛蛙生长性能,但能够提高牛蛙FE和PER,提高血清抗氧化能力。
  3.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙钙、磷沉积以及营养物质表观消化率的影响
  8周养殖试验结束后,对采样后剩余的牛蛙收集粪便并进行饲料营养物质表观消化率的测定试验。结果:随着两种菌添加量的增加,牛蛙全体钙、磷水平皆有上升趋势,在YG和KZ达到最大值,且显著高于对照组(P<0.05)。血清磷水平随B.subtilis添加的增加显著升高(P<0.05),KG达最大值,且显著高于对照组(P<0.05)。碱性磷酸酶(AKP)随两种产植酸酶菌添加量增加,皆有降低趋势。
  由表观消化率结果可知,随两种产植酸酶菌添加量增加,干物质的表观消化率分别在YG和KZ达最大值且显著高于对照组(P<0.05)。随B.subtilis添加量增加,粗蛋白质表观消化率有先升高后降低趋势,KZ达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。随着两种产植酸酶菌添加量的增加,钙、磷的消化率皆有先升高后降低的趋势。钙表观消化率分别在YZ和KZ达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。以上结果表明:两种产植酸酶菌的添加能够促进全体和血清钙磷的沉积以及提高饲料表观消化率。
  4.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙肠道组织结构的影响
  单因素方差分析结果显示,前肠:随着两种产植酸酶菌的增加,绒毛长度、绒毛宽度和肌层厚度皆呈现升高趋势。而肠上皮细胞高度并不受两种产植酸酶菌添加量的影响(P>0.05)。中肠:变化趋势与前肠相似。后肠:绒毛长度和绒毛宽度随两种产植酸酶菌添加量增加呈现先升高后降低趋势,分别在YZ和KZ达到最大值。肠上皮细胞高度随两种产植酸酶菌的添加,呈现上升趋势,在YG和KG达到最大值,YG显著高于对照组(P<0.05)。从牛蛙肠道组织学分析,两种产植酸酶菌的添加能够提高肠壁、绒毛完整性和前肠、中肠杯状细胞的数量,减少肠上皮细胞自溶现象。综合本试验结果,饲料中添加1×107-1×109cfu/g的E.cloacae和1×107cfu/g的B.subtilis有利于维护牛蛙肠道健康。
  5.产植酸酶E.cloacae和B.subtilis对牛蛙肠道微生物菌群结构的影响
  两种产植酸酶菌的添加对牛蛙肠道OTUs有显著影响(P<0.05)。随着两种菌添加量的增加,OTUs皆呈现上升趋势,分别在YG和KZ时达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。两种产植酸酶菌添加显著提高了牛蛙肠道菌群的Alpha多样性指数(P<0.05),其分别在YG和KZ达到最大值且显著高于对照组(P<0.05)。7组样品的菌群组成在Phylum(门)的水平上,两种细菌的添加改变了优势菌群菌落(门水平)所占比例。随两种产植酸酶菌的添加,肠道内变形菌门所占比例也呈升高趋势且高于对照组。而厚壁菌门随这两种菌的添加呈先升后降趋势,分别在YZ和KZ达到最大比例。拟杆菌门在YD时高于其余各组,但随E.cloacae的添加水平增加,呈降低趋势,YG、B.subtilis添加组以及对照组皆低于YD、YZ。7组样品在Genus(属)水平上的菌群多样性丰富,随着两种产植酸酶菌添加量的逐渐升高,支原菌数量降低。随E.cloacae添加量增加,克雷伯氏菌属(Klebsiella)水平降低且低于对照组。乳球菌属在B.subtilis添加组中有增加趋势,且高于对照组。芽孢杆菌属(Bacillus)随B.subtilis添加量增加呈现升高趋势。本试验结果说明,添加E.cloacae和B.subtilis能够提高肠道微生物的丰度和多样性。在一定程度上可促进有益菌比例的增加,并抑制致病菌的增殖。
[硕士论文] 胡水城
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:本试验采用脱脂蚕蛹粉替代凡纳滨对虾饲料中的鱼粉,探讨不同替代水平对凡纳滨对虾生长,肝胰腺组织结构以及蜕壳周期的影响。共设计5组饲料,分别为D1(0%替代鱼粉组)、D2(25%替代鱼粉组)、D3(50%替代鱼粉组)、D4(75%替代鱼粉组)和D5(100%替代鱼粉组),每组4个重复,每个重复36尾虾,试验对虾初始体重为0.20±0.02g,养殖周期为56天。主要研究结果如下:
  1.脱脂蚕蛹粉替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能、体成分以及营养物质表观消化率的影响
  脱脂蚕蛹粉组对虾增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、成活率以及对虾全体营养成分与全鱼粉组无显著差异(P>0.05)但是全体蛋氨酸含量随脱脂蚕蛹粉替代鱼粉比例增加而显著降低(P<0.05),全体矿物质钙随替代水平升高而显著提高(P<0.05);脱脂蚕蛹粉替代鱼粉比例超过75%时,对虾对饲料干物质、能量和磷的表观消化率显著提高(P<0.05),而粗蛋白表观消化率无显著差异(P>0.05),钙表观消化率随替代水平呈下降趋势(P<0.05)。结果表明,脱脂蚕蛹粉能够提高凡纳滨对虾对干物质、能量以及磷的消化,但是对钙的消化降低,有必要在饲料中补充钙源;脱脂蚕蛹粉替代鱼粉对凡纳滨对虾生长以及体组成没有不良影响。
  2.脱脂蚕蛹粉替代鱼粉对凡纳滨对虾非特异免疫以及肝胰腺组织形态的影响
  各组对虾血清碱性磷酸酶和一氧化氮合酶无显著差异(P>0.05),脱脂蚕蛹粉组对虾血清丙二醛显著降低(P<0.05),蚕蛹粉替代75%和100%鱼粉时,对虾血清总抗氧化能力显著提高(P<0.05);脱脂蚕蛹粉组对虾血清葡萄糖含量显著降低(P<0.05),但甘油三酯与基础组无显著差异(P>0.05);总胆固醇以及高、低密度脂蛋白胆固醇皆在100%替代组达到最低,显著低于基础组(P<0.05);脱脂蚕蛹粉替代0-75%鱼粉未对凡纳滨对虾肝胰腺组织结构产生影响,替代100%鱼粉时,对虾肝小体出现萎缩。结果表明,对虾肝胰腺组织结构先出现损伤,损伤严重后才会导致血清碱性磷酸酶活力的升高;脱脂蚕蛹粉替代75-100%鱼粉显著提高对虾抗氧化能力;100%替代鱼粉时对虾肝胰腺出现损伤,胆固醇代谢降低。
  3.脱脂蚕蛹粉替代鱼粉对凡纳滨对虾蜕壳周期以及蜕壳相关基因表达量的影响
  各组对虾肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基己糖苷酶活力、蜕皮激素受体和维甲酸类X受体基因相对表达量无显著差异(P>0.05);脱脂蚕蛹粉替代100%鱼粉显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中几丁质脱乙酰酶活力(P<0.05);脱脂蚕蛹粉替代100%鱼粉显著降低凡纳滨对虾的蜕壳周期(P<0.05)。
[硕士论文] 李晓丽
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:为了讨论羟基蛋氨酸硒对凡纳滨对虾生长、抗氧化和抗亚硝酸盐胁迫能力的影响,本实验设置两个鱼粉水平的饲料,分别含鱼粉30%和15%。分别向两个鱼粉水平饲料中添加羟基蛋氨酸硒,使硒的添加水平分别为0.0、0.15、0.30、0.60和0.90mg/kg,配制成10种实验饲料。主要研究结果如下:
  1.饲料中添加羟基蛋氨酸硒水平对凡纳滨对虾生长性能、体组成、血清生化指标和抗氧化能力的影响
  在30%鱼粉组中,凡纳滨对虾的MBW、WG、SGR和FER在0.3mg/kg硒水平组达到最大值,并且显著高于0.9mg/kg硒水平(P<0.05);在15%鱼粉组中,MBW、WG、SGR、FER和PER在0.30mg/kg硒水平组达到最大值,并且显著高于0.60和0.90mg/kg硒水平组(P<0.05)。双因素分析,MBW、WG、SGR、FER、FI、PER和SR分别显著受到鱼粉水平和硒水平的影响(P<0.05)。在30%鱼粉组和15%鱼粉组中粗脂肪显著受到硒水平和交互作用的影响(P<0.05)。对虾虾体和肌肉中的硒含量都随着饲料中硒水平的添加而呈增加的趋势并且达到差异显著(P<0.05)。
  在30%鱼粉组和15%鱼粉组中,对虾血清中血糖血脂的含量TG、CHO、ALT和AST同时受到饲料中硒水平、鱼粉水平和交互作用的显著影响(P<0.05)。在30%鱼粉组中,饲料中添加0.15mg/kg硒水平显著提高了血清GSH-Px、T-AOC和T-SOD的活力,添加0.30或0.60mg/kg硒水平能显著提高肝胰腺GSH-Px、T-SOD、GST和CAT的活力(P<0.05);GSH-Px和C-MnSOD mRNA表达量在0.15mg/kg硒水平组以及CAT和LZM mRNA表达量在0.60mg/kg硒水平组分别最高(P<0.05);在15%鱼粉组中,在饲料中添加0.90mg/kg硒水平能显著提高血清GSH-Px和T-SOD的活力、肝胰腺CAT的活力以及GSH-PxmRNA表达量(P<0.05),LZM mRNA表达量在0.60mg/kg硒水平组最高(P<0.05)。双因素分析结果表明,饲料中的硒水平、鱼粉水平和交互作用显著影响对虾的抗氧化能力。
  2.亚硝酸盐胁迫下饲料中添加羟基蛋氨酸硒水平对凡纳滨对虾存活率、血清生化指标和和抗氧化能力的影响
  亚硝酸盐胁迫后,在30%鱼粉组和15%鱼粉组中,对虾的成活率都在0.30mg/kg硒水平组达到最高,显著高于对照组(P<0.05)。在30%鱼粉组和15%鱼粉组中,血清中GLU、TG、CHO、ALT和AST同时受到饲料中硒水平、鱼粉水平和交互作用的显著影响(P<0.05)。在30%的鱼粉组和15%鱼粉组中,在亚硝酸盐胁迫后,血清中GSH-Px、T-SOD和ALP的活力以及肝胰腺中GST、T-SOD和CAT的活力都低于胁迫前的活力,而血清T-AOC的活力以及肝胰腺GSH-Px的活力和MDA的含量则高于胁迫前水平。
  综上所述,在30%鱼粉组和15%鱼粉组中添加适宜0.30mg/kg水平的羟基蛋氨酸硒能提高凡纳滨对虾的生长性能和饲料利用;添加适宜水平的硒能增强机体的抗氧化能力以及抗亚硝酸盐胁迫的能力,但促进效果要受到鱼粉水平、硒水平以及交互作用的影响。
[硕士论文] 王学习
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:本文通过营养生理学和代谢组学方法研究饲料中添加不同水平脂肪和牛磺酸对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)生长性能、脂肪沉积、脂肪代谢及差异代谢物的影响。主要研究内容如下:
  1.饲料中不同牛磺酸和脂肪水平对斜带石斑鱼生长性能、脂肪沉积和脂肪代谢的影响
  本试验旨在研究饲料中不同水平脂肪和牛磺酸对其生长性能、脂肪沉积和脂肪代谢的影响。以酪蛋白和明胶为蛋白源,设置2个脂肪水平(正常10%和高脂15%)和4个牛磺酸水平(0,0.5%,1%和1.5%)的试验饲料。将平均初始体重约17.5g的斜带石斑鱼随机分为8组,每组3个水族箱,每箱放养20尾。试验鱼每天投喂饲料2次至表观饱食,养殖周期为56d。研究结果表明:在两种脂肪水平下添加牛磺酸饲料组的增重率、摄食率、饲料效率和特定生长率均显著高于未添加组(P<0.05),且随着牛磺酸添加量的增加呈现增加的趋势(P>0.05),其中增重率、摄食率、饲料效率和特定生长率水平在饲料中添加1%牛磺酸时达到最高(P>0.05);全鱼粗蛋白和肝糖原含量,肝脏苹果酸脱氢酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶活性及血清中高密度脂蛋白胆固醇水平随着牛磺酸添加量的增加显著增加(P<0.05);牛磺酸添加组间的粗脂肪、肝脂、肌脂、肝体比和脏体比水平没有显著性差异(P>0.05),却显著低于未添加组(P<0.05),腹脂率在10%脂肪组没有显著性差异(P>0.05),在15%脂肪组中牛磺酸添加组显著低于未添加组(P<0.05),且各添加组间无显著性差异(P>0.05);全鱼灰分、肝脏脂肪酸合成酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量随着牛磺酸添加量增加显著下降(P<0.05);血清中低密度脂蛋白、甘油三酯、总胆固醇和葡萄糖水平随着牛磺酸添加量的增加而呈现下降的趋势且均显著低于未添加组(P<0.05)。与10%脂肪组相比,15%脂肪组的全鱼粗脂肪、腹脂率、肝脂、肌脂、肝体比和脏体比水平,肝脏苹果酸脱氢酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶活性及血清低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、总胆固醇和葡萄糖水平显著增高(P<0.05),全鱼水分、灰分、粗蛋白、肝脏脂肪酸合成酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和血清高密度脂蛋白胆固醇含量显著降低(P<0.05)。综上所述,本试验条件下,在脂肪含量分别是10%和15%的两种饲料中添加牛磺酸都能显著促进斜带石斑鱼生长,过量添加则会出现抑制作用。添加牛磺酸能显著改变脂肪代谢酶活性、促进甘油三酯分解和转运,降低血清、肝胰脏、腹腔和肌肉中的脂质水平,降低斜带石斑鱼鱼体体脂含量,而且这些作用在高脂饲料中的作用更为显著。
  2.饲料脂肪和牛磺酸对斜带石斑鱼代谢影响的代谢组学分析
  本试验以饲喂脂肪水平10%和15%,牛磺酸水平0和1%的实验结果为研究素材,利用核磁共振技术对这4组斜带石斑鱼的肝脏和血清进行PCA,PLS-DA和OPLS-DA分析,寻找差异代谢物,并探寻饲料中脂肪或牛磺酸添加量的变化对斜带石斑鱼代谢的影响。在两种水平下,与未添加牛磺酸组相比,饲料中添加1%牛磺酸造成斜带石斑鱼肝脏中差异代谢物分别有20和17种,具有相同变化趋势的种类有12种,其中丙酮酸、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、甘油磷酸胆碱、甘氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、和尿嘧啶含量显著下降,组氨酸、牛磺酸和氧化三甲胺含量显著升高;在血液中的差异代谢物分别有22和29种,具有相同变化趋势的种类有19种,亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、色氨酸、对羟基苯乙酸、乳酸和脱氧鸟嘌呤核苷含量显著上升,α-葡萄糖、β-葡萄糖、肌酸、甘油天冬氨酸和牛磺酸则都显著下降。而当牛磺酸水平分别为0和1%时,饲料中脂肪含量从10%增加到15%分别使肝脏产生3和5种,血清产生10和12种差异代谢物,而且这些代谢物种类和变化趋势存在很大差异。结果表明,斜带石斑鱼对脂肪的代谢应答会因饲料牛磺酸的含量不同而受到影响;相对于脂肪,饲料牛磺酸水平对斜带石斑鱼代谢的影响更大。
[硕士论文] 袁香丽
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:本文以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为试验动物,研究低鱼粉饲料添加壳寡糖对其生长、免疫、肠道健康以及对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力的影响,进一步确定壳寡糖用于凡纳滨对虾饲料中的适宜添加量,为免疫增强剂COS的推广与应用提供理论指导。
  1.低鱼粉饲料中添加壳寡糖对凡纳滨对虾生长性能的影响
  选取健康的凡纳滨对虾幼虾1400尾(0.9g左右)随机分为7组,每组4个重复,试验期8周。高鱼粉对照饲料(HFM),向低鱼粉基础饲料中分别添加0g、3g、6 g、9g、12g和15g(g/kg)10%的壳寡糖预混剂,制作6种低鱼粉试验饲料,记作LFM0、LFM0.3、LFM0.6、LFM0.9、LFM1.2和LFM1.5。结果:各组之间凡纳滨对虾FAW、WGR、SGR、FCR、和SR差异不显著(P>0.05),但LFM0.6和LFM0.9两组组SR提高了;LFM0、LFM0.3、LFM0.6、LFM0.9和LFM1.5组之间LDL-C差异不显著(P>0.05),但显著低于HFM组(P<0.05),HFM、LFM0.3、LFM0.6和LFM0.9组HDL-C显著高于LFM0组(P<0.05)。
  2.低鱼粉饲料中添加壳寡糖对凡纳滨对虾肝胰腺和肠道炎性因子mRNA相对表达量及组织形态的影响
  肝胰腺中AIF和Cyt-c mRNA相对表达量在LFM0组最高,其他各组之间无显著性差异(P>0.05)。LFM0、LFM1.2和LFM1.5组HSP70 mRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)。LFM0、LFM1.2和LFM1.5组TGF-β的mRNA相对表达量显著下调(P<0.05),而其他各组mRNA相对表达量显著上调(P<0.05)。LFM0.3组TNF的mRNA相对表达量显著低于HFM、LFM0.6和LFM0.9组(P<0.05)。肠道中HFM、LFM0.3和LFM0.6组AIF的mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)。HFM、LFM0.3、LFM0.6和LFM0.9组Cyt-c的mRNA相对表达量显著低于LFM0和LFM1.5组(P<0.05)。HFM、LFM0.3、LFM0.6和LFM0.9组HSP70mRNA相对表达量显著下调(P<0.05)。HFM和LFM0.6组TGF-β的mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05),但显著高于其他组(P<0.05)。HFM、LFM0.3和LFM0.6组TNF的mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05),显著高于其他各组(P<0.05)。与LFM0组相比,HFM组肝小体排列比较紧密,肝小体之间基底膜基本完整,低鱼粉组除LFM0和LFM1.5组外,其他组肝小体排列紧密,且具有明显的R细胞和B细胞,尤以LFM0.6、LFM0.9和LFM1.2组更为紧密。与HFM组相比,LFM0组肠壁完整性遭到破坏,绒毛与肠壁脱离,排列杂乱有断裂,且绒毛较短,而壳寡糖添加组肠壁相对完整。
  3.低鱼粉饲料中添加壳寡糖对凡纳滨对虾免疫及抗副溶血弧菌感染能力的影响
  HFM组AKP和NOS活力显著高于其他组(P<0.05);LFM0.3组ACP活力显著高于其他LFM组(P<0.05);HFM、LFM0.3和LFM0.6组LZM活力显著高于其他各组(P<0.05)。HFM和LFM1.5组ACP活力显著低于其他各组(P<0.05);肝胰腺碱性磷酸酶(AKP)活力HFM组与LFM0.3、LFM0.9和LFM1.2组差异不显著(P>0.05),LFM1.5组显著低于其他各处理组(P<0.05)。HFM组和LFM1.5组之间肝胰腺谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力差异不显著(P>0.05),显著低于其他各处理组(P<0.05),低鱼粉组之间LFM0.3、LFM0.6和LFM0.9组最高,显著高于其他组(P<0.05);T-SOD活力LFM0.3组显著高于HFM组及其他LFM组(P<0.05);LFM0.9组T-AOC显著高于HFM组和其他LFM组(P<0.05)。肝胰腺免疫基因HFM和LFM0.3组mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05),显著高于其他各组(P<0.05)。HFM组ACP的mRNA相对表达量显著高于其他各处理组(P<0.05)。LFM0.3和LFM0.6组Crustin的mRNA相对表达量显著高于其他各处理组(P<0.05)。HFM、LFM0.6和LFM0.9组Pen3a的mRNA相对表达量显著高于其他各处理组(P<0.05)。LFM0.3和LFM0.5组proPO的mRNA相对表达量最高,显著高于其他各处理组(P<0.05)。感染副溶血弧菌后,添加壳寡糖组死亡率低于LFM0组。
[硕士论文] 林师
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:中华锯齿米虾(Neocaridina denticulata sinensis)广泛分布于亚洲淡水水域,因其体色丰富多样,自2003年开始成为一种重要的观赏虾。但是其体色的分子遗传基础尚未知。在观赏中华锯齿米虾中,红、黄和透明3种纯色品系的体色遗传最稳定。因此,本文通过比较红、黄和透明3种纯色米虾皮肤组织的转录组,获得了大量体色差异表达基因,并利用qPCR在纯色品系和琉璃虾中对重要候选基因进行验证。希望为揭示米虾体色遗传机制提供资料。主要研究结果如下:
  1.一共获得了268,629,208个clean reads,经TRINITY软件拼接后获得45,434条Unigenes。Unigene的平均长度为837bp,N50为1551bp。与NCBI nr、Swiss-prot、KOG和Kegg数据库比对后,共有19,992条Unigenes获得注释。
  2.通过对3种纯色品系米虾皮肤转录组的基因表达量分析,共得到14,915个差异表达Unigene。核糖体蛋白基因、actin、calmodulin、EF1α和AK等基因可能通过色素迁移及色素体状态维持这一细胞学过程引起米虾体色差异。红色品系的鸟嘌呤合成通路高表达,表明米虾红色素的主要成分可能是蝶啶类色素。黄色品系没有显著高表达色素合成通路,但是甲壳蓝蛋白基因在黄色品系米虾中高表达,表明米虾黄色素可能与类胡萝卜素有关。
  3.通过与已知果蝇、家蚕和赤拟谷盗体色基因的比对发现了大量可能参与色素沉积的基因,其中包括黑色素、眼色素、蝶呤等合成酶系及其调节基因并从中筛选出25条与体色相关的候选基因。利用实时荧光定量PCR获得25条候选基因在红、黄和透明3种纯色品系及在2种琉璃虾的表达模式。3种纯色品系的RT-qPCR结果与转录组RPKM值的高低趋势吻合。
  4.原位杂交实验结果表明,ebony、GC-I、 SPR和XDH基因在米虾的复眼期幼体和仔虾阶段均有表达,而在无节幼体阶段没有检测到表达信号。在色素沉积过程中,米虾这4个基因可能具有与其昆虫的同源基因类似的作用。
  转录组获得这些数据为米虾体色相关基因的发掘和体色遗传机制的解析提供丰富的序列资源。
[硕士论文] 苏保元
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:为研究不同抗菌肽Surfactin添加剂(Surfactin粗提品和Surfactin发酵产物)对斜带石斑鱼生长、血清生化指标、脂肪代谢和肠道健康状况的影响,选取400尾平均体重为(23.36±0.06)g的试验鱼,随机分为5个处理组,即对照组、Surfactin组Ⅰ(基础饲料+100mg/kg Surfactin)、Surfactin组Ⅱ(基础饲料+2.4% Surfactin发酵产物;饲料中Surfactin水平为100mg/kg)、天蚕素组(基础饲料+200mg/kg天蚕素)和黄霉素组(基础饲料+4mg/kg黄霉素)。每个处理组4个重复,每个重复20尾鱼。试验期为56d。
  结果:与对照组相比,Surfactin添加组末均重、增重率和特定生长率显著提高(P<0.05),Surfactin组Ⅰ日摄食量增加(P<0.05),Surfactin组Ⅱ饲料系数降低(P<0.05);血清白蛋白水平、高密度脂蛋白胆固醇水平、酸性磷酸酶活性、碱性磷酸酶活性和溶菌酶活性升高(P<0.05),血尿素氮、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平降低(P<0.05),Surfactin组Ⅰ谷草转氨酶活性降低(P<0.05),两组的谷丙转氨酶均无显著变化(P>0.05);Surfactin组Ⅰ肝脏脂肪含量降低(P<0.05),全鱼脂肪含量还低于Surfactin组Ⅱ(P<0.05),Surfactin组Ⅱ仅有降低的趋势(P>0.05);Surfactin组Ⅰ的脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶水平降低(P<0.05),肝脂酶、脂蛋白脂酶和总脂酶活性升高(P<0.05),Surfactin组Ⅱ脂肪酸合成酶水平和肝脂酶活性无显著变化(P>0.05);肠道脂肪酶活性升高(P<0.05),仅Surfactin组Ⅰ蛋白酶活性上升(P<0.05),两组的淀粉酶无显著变化(P>0.05);超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性升高(P<0.05),丙二醛、过氧化氢水平和超氧阴离子水平降低(P<0.05),仅Surfactin组Ⅰ总抗氧化能力和谷胱甘肽水平上升(P<0.05),羟自由基水平下降(P<0.05);肠道皱襞高度、肌层厚度、总菌数和乳酸菌数增加(P<0.05),弧菌数降低(P<0.05)。
  Surfactin组Ⅰ与Surfactin组Ⅱ的血清白蛋白和高密度脂蛋白胆固醇水平,谷草转氨酶活性,全鱼脂肪含量,肠道蛋白酶活性,肠道谷胱甘肽过氧化物酶活性、自由基和丙二醛水平、皱襞高度等指标存在显著差异(P<0.05),其他指标接近(P>0.05)。表明,不同Surfactin添加剂(饲料中Surfactin水平为100mg/kg)对斜带石斑鱼的促生长作用类似,Surfactin粗提品比其发酵产物调节血液生化指标和肠道自由基水平效果更好。
  此外,饲料中添加100mg/kg抗菌肽Surfactin促生长效果与添加200mg/kg天蚕素或4mg/kg黄霉素接近,Surfactin对部分血液生化指标、脂肪分解代谢酶活性以及肠道健康指标的有益调节作用更强。
[硕士论文] 王亚如
水产 集美大学 2017(学位年度)
摘要:本试验以初重为(6.07±0.03g)的花鲈为养殖对象,研究豆粕替代鱼粉对花鲈生长及肠道健康的影响。用豆粕替代饲料中0(D1)、50%(D2)和75%(D3)的鱼粉,配制3种等氮(粗蛋白43%)等脂(粗脂肪13%)的试验饲料,实验分为3个处理,每个处理3个重复,每个重复20尾鱼,饱食投喂2次/天(08:30和18:00),试验周期8周。主要研究结果如下:
  1.豆粕替代鱼粉对花鲈生长性能、体组成、消化酶活性和表观消化率的影响
  花鲈的增重率(WG)、特定生长率(SGR)、饲料效率(FE)、蛋白质效率(PER)和成活率(SR)的最低值和最高值分别出现在D3组和D1组。D3组花鲈体内水分和灰分的含量显著高于其他组,蛋白和脂肪含量显著低于其他组(P<0.05)。花鲈肠道消化酶活力随豆粕替代量的升高而降低。花鲈对饲料蛋白、能量和干物质表观消化率随豆粕替代量升高而显著降低(P<0.05)。以上结果表明:豆粕替代鱼粉可能通过降低花鲈肠道消化酶活力和表观消化率,从而降低其生长性能,影响其体组成。
  2.豆粕替代鱼粉对花鲈肠道组织形态和肠道机械屏障功能的影响
  肠道形态学测量显示:随着豆粕替代量的逐渐升高,花鲈前肠、中肠绒毛长度、绒毛宽度、肌层厚度和绒腺比逐渐降低。肠道组织结构观察发现:与D1组相比,D2组和D3组的肠黏膜结构遭到破坏,出现肠黏膜上皮细胞逐渐稀疏、排列紊乱、固有层加宽等现象。豆粕的替代水平的增加显著升高了花鲈血清D-乳酸浓度(P<0.05)。当替代鱼粉比例为50%时,花鲈血清二胺氧化酶活性与全鱼粉组相比没有显著性变化(P>0.05),当替代量达到75%时,血清二胺氧化酶活性显著升高(DAO)(P<0.05)。以上结果表明:豆粕替代鱼粉会损伤花鲈肠黏膜组织结构,破坏其机械屏障功能。
  3.豆粕替代鱼粉对花鲈肠道小肽、氨基酸转运载体及炎性因子基因表达量的影响
  与D1组相比,D2和D3组花鲈前肠肽转运载体PepT1基因的表达量显著上升(P<0.05),而中肠PepT1表达量没有显著差异(P>0.05);花鲈前肠氨基酸转运载体(LAT1)表达量在D1和D2组差异不显著(P>0.05),但显著低于D3组(P<0.05),氨基酸转运载体(SLC1A5)表达量在D1和D3组差异不显著(P>0.05),但显著低于D2组(P<0.05);中肠LAT1和SLC1A5表达量随着豆粕替代水平的增加而显著上升(P<0.05)。与全鱼粉组相比,饲料中豆粕替代鱼粉显著增加花鲈前肠促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-8基因的表达量(P<0.05);也显著增加中肠TNF-α、IL-1β和IL-2表达量,但对IL-8基因表达量无显著影响(P>0.05)。饲料中豆粕替代鱼粉显著降低花鲈前肠和中肠抗炎因子IL-4基因表达量(P<0.05)。然而,抗炎因子IL-10基因表达量在前肠D2组最高,而在中肠则D3组最高(P<0.05)。以上结果表明,豆粕替代鱼粉会影响花鲈肠道小肽和氨基酸转运载体的表达;高比例豆粕替代鱼粉会增加肠道促炎因子的表达,降低抗炎因子的表达,且前肠的敏感性高于中肠。
  4.豆粕替代鱼粉对花鲈肠道菌群结构的影响
  肠壁微生物多样性测序结果如下:豆粕替代鱼粉水平没有改变花鲈前肠肠壁菌群的种类多样性,但很大程度影响了其肠壁菌群的数量。豆粕替代鱼粉水平没有改变花鲈前肠肠壁的优势菌群种类组成,却很大程度改变了优势菌群菌落的数量组成。且随着豆粕替代鱼粉水平的逐渐升高,花鲈前肠肠壁的有害菌群(假单胞菌、不动杆菌、乳球菌、肠杆菌)数量提高,有益菌(芽孢杆菌)数量降低。
[硕士论文] 孙玉龙
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:杂色鲍(Haliotis diversicolor),隶属软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鲍科(Haliotidae)、鲍属(Halio tis)。杂色鲍自然分布于我国浙江以南沿海以及日本、越南等地,是我国南方沿海一种重要的经济养殖贝类。当前随着养殖业集约化的发展导致生产中面临着应激性疾病频发的严峻挑战,尤其在夏季水体的高温缺氧影响杂色鲍正常的生理状态,降低其应对外界病原侵染的能力,对鲍养殖业的健康发展产生较大的影响。
  本研究通过二代高通量测序平台Illumina HiseqTM2000对杂色鲍缺氧应激下不同时相的血细胞进行了大规模测序,比对了不同转录样品之间的差异,筛选出差异表达和特异表达的unigenes。在转录组测序结果的基础上,筛选免疫相关的重要基因及免疫相关通路多个,重点研究了作为先天免疫调节过程中的重要信号通路PI3K-AKT信号通路在杂色鲍应对外界环境刺激的调节机制。主要研究结果如下:
  1、对杂色鲍缺氧应激下的14个血细胞RNA样品进行了转录组测序共获得307395572reads,所有reads数经拼接组装后共产生99774条unigenes,其中有47154条unigenes获得注释,为后续挖掘与免疫调节机制相关的基因和通路提供了大量基础数据。对已拼接完成的unigene进行筛选分析,共得到免疫通路相关基因242条。这些基因涉及PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、P53信号通路(P53 signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-κB signaling pathway)、HIF信号通路(HIF-1 signaling pathway)等免疫、凋亡主要相关通路。对获得的多个转录组的样本进行了生物信息学比较分析,得到多条差异表达unigenes,其中缺氧应激实验组0h样本和对照组0h样本之间具有最多的差异表达unigenes,共24189条,注释率为59%;实时荧光定量PCR实验验证了41条筛选后的差异表达基因,其中27条的表达趋势与转录组分析结果一致。
  2、首次克隆获得杂色鲍PI3K-AKT信号通路关键基因:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(protein-serine-threoninekinase,AKT),并分别命名为HdAKT和HdPI3K。HdAKT cDNA总长2126bp,可编码479个氨基酸,其中包含1440bp的开放阅读框(ORF),198bp的5'非翻译区(UTR)和488bp的3'UTR。HdPI3K cDNA全长序列为6052 bp(GenBank登录号:KX245017),包括5'UTR496 bp,3'UTR2262 bp和3294 bp的ORF,可编码1097个氨基酸。
  3、选择了PI3K-AKT信号通路中的共14条相关基因进行了实时荧光定量PCR分析。结果表明这14条基因在检测的杂色鲍7个组织中均有广泛表达,且HdAKT基因在血细胞中表达量最高(p<0.05),其次是肝胰腺(p<0.05),HdPI3K在血细胞的表达水平高于其他组织。在正常的温度和溶氧条件下,副溶血弧菌感染后HdAKT,HdPI3K和其他PI3K-AKT信号通路成员基因表达水平显著上调,表明PI3K-AKT信号通路在杂色鲍先天免疫系统中发挥重要的作用。但是当处于环境应激(高温、缺氧和高温&缺氧联合)条件下,再次受到弧菌感染时,这些基因的表达水平在鳃、血细胞和肝胰腺组织中被显著抑制,表明PI3K-AKT信号通路可能参与杂色鲍在环境压力下诱导产生免疫抑制的过程,导致杂色鲍的免疫系统处于抑制状态。
  4、对杂色鲍血细胞中HdAKT基因进行dsRNA干扰实验,结果表明:在dsRNA干扰血细胞后的各时相(4h、12h、24h),HdAKT基因的表达水平均出现显著下调(P<0.05)。同时,PI3K-AKT信号通路相关基因的表达情况与绿色荧光蛋白组以及空白对照组相比也均有不同程度的显著变化(P<0.05)。同时利用Cytoscape构建了HdAKTRNA干扰后PI3K-AKT信号通路相关基因各时相的相互作用网络。随着干扰时间的加长,HdAKT的干扰效果加深,PI3K-AKT信号通路相关基因也逐渐显现出被抑制的趋势,这一结果也说明了HdAKT在对上述基因的调控过程中起到了关键性的作用,并对PI3K-AKT信号通路相关基因具有正向调控作用。
[硕士论文] 马辰婕
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:随着抗菌药物在水产养殖中的广泛使用,水产养殖源细菌的耐药性逐渐变强,耐药多样性也渐渐增加,进而促使动物细菌性疾病的控制效果变差。气单胞菌是主要的水产动物致病菌之一,容易引起败血症、疖疮和溃疡等出血性疾病。抗菌药物的使用,是诱导气单胞菌耐药性的主要因素。本文以水产养殖源气单胞菌为研究对象,对其耐药性、耐药基因的分布特征及传播机制进行研究分析。
  本研究中,49株气单胞菌对8类17种抗菌药物的药敏结果显示,对AMX的耐药率高达100%,对SMZ、TMP、SXT和RIF的耐药率介于60%~90%之间,而对CTX、NEO、DOX以及喹诺酮类的ENR、NOR和OFL的耐药率均低于15%;在所有菌株中,41株菌株对3类及以上的抗菌药物具有抗性,24株菌株对9种及以上抗菌药物具有抗性。
  最小抑菌浓度(MIC)检测结果显示,TMP和SMZ的MIC50值最高(2048μg/mL),其余按MIC50值高低依次为STR(64μg/mL)、CHL(32μg/mL)、NEO(16μg/mL)、TET(16μg/mL)、FFL(16μg/mL)、DOX(4μg/mL)、ENR(1μg/mL)。最小杀菌浓度(MBC)检测结果显示,TET、TMP、SMZ ENR和NEO的MBC50与MIC50相等,CHL、STR和DOX的MBC50(64、256、和8μg/mL)则高于MIC50。抑菌圈直径与MIC值的相关性研究发现,两者之间均呈对数或指数负相关。
  25种耐药基因的PCR检测结果显示,基因组中,blaTEM的检出率最高(83.7%);其次是sul1和aadA,检出率分别是69.4%和61.2%;再者是arr2/3、aphA1、tetC、sul2、dfrA5和floR,检出率均高于40%。质粒中,sul1的检出率最高,为51%;其次是aphA1与aadA,分别为40.8%和38.8%; blaTEM、tetB、qnrB、qnrS、dfrA7、cat1和cmlA均未检出,其余耐药基因检出率均在35%以下。
  5类可移动元件的PCR检测结果显示,在基因组中,intI1检出率最高(65.3%);其次是IS26、ISCR2和tnpU,分别是63.3%、57.1%和51%;其余均低于50%。质粒中,intI1检出率依旧最高,为57.1%;其次是IS26、ISCR2和merA,检出率介于20%~35%之间;其余均低于15%。在1型整合子的可变区中,共发现13种基因盒排列,dfrA12-orfF-aadA2比例最高。ISCR2的可变区主要为两种:ISCR2+glmM+sul2(10株)和ISCR2-like+ str+strA+ sul2(2株)。
  本研究中共获得16株大肠杆菌转化子、21株气单胞菌转化子和4株大肠杆菌接合子。转化实验结果显示,耐药基因aadA、aphA1、sul2、tetA和floR较易通过转化的方式传递给大肠杆菌,其中tetA基因阳性转化子均表达四环素抗性;维氏气单胞菌转化子新增表型以RIF抗性为多,嗜水气单胞菌转化子多新增STR、KAN和CHL抗性,结果表明这4种药物抗性较易通过转化在种内进行传播。接合实验结果显示,只有嗜水气单胞菌成功与大肠杆菌接合,基因strA-B和oR较易通过接合在种间进行传播,且基因型阳性接合子均表达出对应抗性。此外,所有的转化子与接合子中,ISCR2的检出率均是最高的。
[硕士论文] 孙丽雪
动物遗传育种与繁殖 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:动物性别决定一直以来是生物学领域的研究热点,它对个体的发育和自然种群性别比例组成等都具有深刻的影响。依据性别决定因素,性别决定模式可分为遗传性别决定(Genotypic Sex Determination,GSD)和温度性别决定(Temperature-dependent Sex Determination,TSD)两类。鱼类的性别决定模式介于遗传性别决定(GSD)和温度性别决定(TSD)之间,也称为GSD+TE(Temperature Effect)类型,即在性腺分化期温度变化能部分影响鱼类的性别决定。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是一种性别分化方向受到基因和温度双重影响的鱼类,即在尼罗罗非鱼的性别分化期,温度能够对其性别分化的方向起到一定的导向作用,而温度是如何影响其性别分化,以及尼罗罗非鱼性腺分化早期的高温处理对其性腺发育的影响如何,具体的分子机制是什么,目前还不是很清楚。
  本研究通过伪雄鱼和野生型雌鱼交配的方式建立3个尼罗罗非鱼全雌家系,三个家系高温处理后的性逆转率分别为90.4%、86%和74%。我们挑取雄性率最高的家系分别利用HE染色和Illumina Hiseq技术对受精后120天全雌家系(对照组)和高温处理组雌雄尼罗罗非鱼性腺进行组织学检测和高通量转录组测序。组织学结果显示高温处理后的雌鱼卵母细胞排列松散,高温处理后的雄鱼性腺和正常野生型雄鱼相似,没有显著变化。将测序所得转录组数据与尼罗罗非鱼基因组进行比对,对照组雌鱼(CF)、高温处理组雌鱼(TF)、高温处理组雄鱼(IM)共获得149624210 Raw Reads,共有124515460 Clean Reads,平均有80.09%Clean Reads比对到尼罗罗非鱼基因组上。CF、TF和IM三组间两两比较,结果显示差异表达基因(DEG)上、下调数目分别为:CF/TF共有DEG79个,其中上调DEG34个,下调DEG45个;CF/IM共有DEG11117个,其中上调DEG5779个,下调DEG5338个;TF/IM共有DEG11000个,其中上调DEG5607个,下调DEG5393个。Venn图显示CF/TF和CF/IM、CF/TF和TF/IM、CF/IM和TF/IM共有的DEG分别为54、44和9451个。将CF/TF DEG按照不同差异倍数进行分析,发现有很多差异倍数大于7的差异基因。另外将所获得的DEG分别通过COG、NR、KEGG、GO和Swiss Prot注释,其中GO分析将DEG分为三类,分别为Cellular Component(CC),Molecular Function(MF)和Biological Process(BP)。另外还在Ovarian steroidogenesis,Cell cycle,GnRH signaling pathway,Natural killer cell-mediated cytotoxicity等生物学通路中鉴定出许多DEG。
  本研究接着对鉴定出的性类固醇激素合成相关基因和温度响应相关基因,利用qRT-PCR进行验证,共验证了10个基因,发现雄性激素合成相关基因表达上调如hsd17b7、3β-hsd,雌性合成相关基因表达下调如cyp19a1a。并且短暂性腺分化早期的高温处理持续影响了cyp19a1a、pycrl、mrpl28、cdc42和ccnh基因。为了进一步检测短暂性腺分化早期的高温处理对雌激素合成关键基因cyp19a1a的持续性影响,本研究利用本实验室构建的cyp19a1a表达载体,诱导原核表达cyp19a1a蛋白,利用亲和层析技术纯化蛋白,用其免疫8周龄昆明白小鼠获得多克隆抗体。利用Western blot检测高温处理后cyp19a1a蛋白表达情况,结果发现高温处理后cyp19a1a蛋白在TF和IM中均表达显著下调。
  总之,本研究结果显示了高温处理导致尼罗罗非鱼雌鱼卵母细胞排列疏松,对于雄鱼没有显著影响;显著下调了雌激素合成基因,显著上调了雄激素合成基因,并持续影响了卵巢分化和发育重要基因cyp19a1a相关基因、温度响应基因和一些核受体基因的表达水平。初步证明了性激素合成代谢可能在一定程度上介导了高温处理尼罗罗非鱼性逆转的过程以及性腺分化早期的高温处理对一些基因具有持续性调控作用。本研究的结果为进一步探索高温处理尼罗罗非鱼性逆转过程中的分子机制提供了重要基础。
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