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[硕士论文] 陈茹佳
作物遗传育种 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素酶是降解纤维素链中β-1,4糖苷键的一类酶的总称。根据催化水解纤维素的作用方式不同,通常将纤维素酶分为三类:内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。在植物中,纤维素酶由多种糖苷水解酶家族(GH)基因编码,并在植物生长发育和许多重要的生理过程中起着至关重要的作用。植物GH5_11类基因编码一种水解酶,属于糖苷水解酶家族5超级基因家族的一个亚族,在陆生植物中广泛存在。尽管该基因亚族的生物学功能还没有得到详细阐释,但很多数据库将该基因亚族编码的酶注释为纤维素酶(cellulase)。此外,陆生植物GH5_11基因的起源和进化模式尚不清楚。为阐明陆生植物GH5_11基因的起源和进化模式,并初步揭示其在植物生长发育中的作用,本文采用生物信息学与实验生物学相结合的方法,对该基因亚族在植物中的起源和进化模式进行了探讨,并基于水稻和拟南芥中同源基因的表达模式分析,结合对拟南芥突变体的表型鉴定,初步探究了陆生植物GH5_11基因的功能。主要结果包括:
  (1)GH5_11基因在水生的绿藻中不具有同源基因,在绿色植物中最早出现在苔藓植物中,并在大部分已测序陆生植物中具有同源基因。在陆生植物的进化中,该基因亚族经历了多次基因丢失和基因复制事件。在蕨类植物江南卷柏(Selaginella moellendorffii)和基础被子植物无油樟(Amborella trichopoda)中没有GH5_11的同源基因,这可能是由基因丢失现象引起的。该基因亚族的复制则表现出物种特异性或系谱特异性的特征,本文发现十字花科和禾本科植物的祖先物种均只具有一个GH5_11,并且基因家族的特异性扩张导致不同陆生植物基因组所包含的GH5_11基因数目有所差异。
  (2)陆生植物GH5_11的同源基因广泛存在于细菌和真菌中,系统发育分析发现陆生植物的GH5_11基因形成一个分枝,表明该基因家族为单次起源。陆生植物GH5_11基因与其在真菌中的同源基因具有最高的同源性,并且陆生植物分枝位于真菌分枝的内部,表明陆生植物的祖先物种通过一次水平基因转移从真菌获得了GH5_11基因。
  (3)适应性进化分析发现陆生植物GH5_11基因在水平转移起源后的最初阶段经历了明显的正选择作用,而在主要陆生植物分化之后,则主要选择压力为纯化选择,表明该基因在陆生植物通过水平转移获得之后,经历了功能的适应性进化。(4)模式植物拟南芥和水稻中分别具有5个和4个GH5_11基因,表达分析发现拟南芥和水稻GH5_11基因具有不同的组织表达模式,表明该基因在基因重复后具有明显的功能分化。此外,多个水稻和拟南芥的GH5_11基因表达受到干旱、高温、盐害和ABA等非生物逆境的调控,表明陆生植物的GH5_11可能与逆境响应有关。
  (5)为初步阐释陆生植物GH5_11基因的生物学功能,本文对3个拟南芥GH5_11基因的突变体进行了分析,结果发现atgh5_11a和atgh5_11c突变体表现为莲座叶叶面积增大,并且atgh5_11c突变体在短日照条件下开花时间显著延迟,而AtGH5_11d基因的突变体则没有明显的表型变化。3个基因的突变体植株中总纤维素酶活性显著降低,并且纤维素酶的三种类型中只有内切葡聚糖酶在3个基因的突变体材料中含量显著降低。3个基因突变体中的纤维素和木质素含量升高,atgh5_11a和atgh5_11c突变体中的葡萄糖和蔗糖含量均显著下降,果糖含量上升;而atgh5_11d突变体3种寡糖含量没有显著的变化。这些结果表明拟南芥GH5_11可能编码一种新的纤维素酶,并且作用方式属于内切葡聚糖酶。
  本文阐明了陆生植物祖先通过水平转移的方式从真菌获得了GH5_11基因,并且在陆生植物的演化中经历了多次基因重复和丢失;基于对水稻和拟南芥目的基因的表达分析和拟南芥3个GH5_11基因的突变体分析,揭示了复制形成的同源基因之间发生了功能分化;基于对拟南芥GH5_11基因的分析,初步证明了GH5_11基因可能编码纤维素酶,并属于内切葡聚糖酶。研究结果不仅对揭示陆生植物起源和进化的分子机理具有重要的理论价值,还对进一步揭示相关基因的功能提供了参考。
[博士论文] 陈双双
林木遗传育种 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:超积累型东南景天(Sedum alfredii Hance,HE)是一种可富集镉(Cd)/锌(Zn)/铅(Pb)的超积累植物,它可以积累大量重金属离子而没有明显中毒现象,在植物修复领域具有较大的应用价值。因此对该物种重金属耐性的作用机理研究具有重要意义。在前期转录组测序中发现热激转录因子家族(Hsf)可能与Cd胁迫应答相关,尽管已经有很多研究报道该家族在非生物胁迫中的作用,但Hsfs参与重金属胁迫响应的作用机制还尚不清楚。本研究鉴定了超积累型东南景天(HE)中Hsf基因家族,分析了家族成员的保守结构域、系统进化关系、组织特异表达和对非生物胁迫的响应,并从中筛选出2个Cd胁迫相关基因(SaHsfA4a和SaHsfA4c)。以HE东南景天为研究对象,非积累型东南景天(NHE)为对照,探讨了SaHsfA4a和SaHsfA4c基因在东南景天Cd耐性过程中的作用及作用机制。主要研究结果如下:
  1.超积累型东南景天SaHsf基因家族共有22个成员,可分为A、B、C3个亚类,其中A亚类成员最多;SaHsf家族成员结构高度保守,家族基因对热、冷、干旱、盐、外源激素ABA和重金属Cd均有响应;基因表达具有组织特异性,在Cd胁迫下SaHsfs基因和SaHsps基因分别在根、茎、叶中均存在三种类似的表达模式。
  2.从超积累东南景天和非积累型东南景天cDNA中分别分离出两个A4亚类成员(SaHsfA4a和SaHsfA4c),这两个基因在HE中呈现截然不同的表达模式;这两个基因均为核定位蛋白且具有转录活性;Western-blot结果表明SaHsfA4ch蛋白在茎中表达量最高,其次是根;经免疫组化分析表达部位主要为薄壁细胞;Cd胁迫后,SaHsfA4ch蛋白表达量明显升高。与非积累型东南景天A4类成员(SaHsfA4an和SaHsfA4cn)相比,过表达SaHsfA4ah或SaHsfA4ch基因的酵母具有较强的Cd耐受性;Cd胁迫后,转基因拟南芥植株萎黄程度较轻,SaHsfA4ah或SaHsfA4ch基因可增强转基因拟南芥的耐Cd能力,提高转基因株系中ROS清除酶活性、调节ROS含量以及相关基因的表达,包括热激蛋白、过氧化物酶基因(POD)、过氧化氢酶基因(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶基因(APX);SaHsfA4ah和SaHsfA4ch基因启动子启动GUS基因主要在拟南芥根、茎、叶的维管组织、柱头以及雄蕊组织中表达,并且受Cd诱导。以上结果说明超积累型东南景天SaHsfA4ah或SaHsfA4ch基因参与Cd胁迫响应并具有镉耐受性。
  3.超积累型东南景天SaHsfA4ah或SaHsfA4ch可以发生可变剪切,内含子长度分别为79 bp和201 bp,将保留内含子的基因命名为InSaHsfA4ah或InSaHsfA4ch,该基因仅能编码103、109个氨基酸,且DBD结构域不完整。对Cd处理前后超积累型东南景天根、茎、叶中InSaHsfA4ah基因内含子分析发现Cd处理前内含子保留而处理后剪切;InSaHsfA4ah、InSaHsfA4ch不能增强酵母及拟南芥的Cd耐受性。因此推测,超积累型东南景天SaHsfA4ah或SaHsfA4ch基因可能通过内含子的精确剪切响应镉胁迫。
  4.Nramp(Natural Resistance-Associated MacrophageProtein)基因家族广泛存在于动植物以及微生物中,可编码一类转运铁(Fe)、锌(Zn)、锰(Mn)、镉(Cd)等重金属的转运子。本研究在前期对东南景天转录组数据分析的基础上,挖掘出SaNramp6差异表达基因。研究发现,SaNramp6基因启动子区含有热激结合元件(HSE)且表达模式与SaHsfs基因类似,过表达SaHsfA4ah或SaHsfA4ch的拟南芥株系在Cd胁迫处理后可以提高AtNramp6基因表达量,预测SaNramp6可能是Hsf基因的下游靶基因。因此,本研究从亚细胞定位、拟南芥Cd吸收等方面进一步分析该基因功能。结果发现SaNramp6基因定位于细胞膜,可增强拟南芥对Cd的积累量、Cd转移系数以及Cd2+流速,此外,在杨树中过表达该基因同样可以增强转基因株系对Cd的积累量和转移系数。超积累东南景天SaHsfA4ah或SaHsfA4ch基因可能通过与下游基因HSE元件结合激活下游基因表达从而发挥作用。
[硕士论文] 齐鲁琦
遗传学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:实验室前期从自创小麦渐渗新品种山融3号(SR3)中克隆得到一个去乙酰化酶基因(TaHD2C)。研究发现,该转TaHD2C基因拟南芥过表达系具有晚花表型,且对干旱、盐碱等胁迫不敏感。本研究通过对TaHD2C基因启动子分析,推测该基因可能具有与温度胁迫相关功能。故以野生型(WT)、2个转TaHD2C拟南芥过表达系(OE17和OE46,简称OE系)和拟南芥AtHD2C突变体(athd2c,简称mu)为研究对象,开展以下实验。结果如下:
  1、实验室中对WT、OE系及mu进行低温胁迫实验。将在培养皿中生长18d的植株进行-20℃的低温1h,1.5h和2h胁迫处理,然后置于4℃解冻12h,22℃长日照恢复7d后拍照并统计各系死亡率,发现与未经冷处理的WT、OE系及mu相比冷处理后的OE系死亡率低,叶片受冷损伤低,叶绿素含量高;DAB及NBT染色也显示,2个OE系着色均浅于WT和mu,H2O2及O2-含量亦低于WT和mu。低温胁迫前后2个OE系植株中标志着膜损伤程度的MDA含量和电解质渗漏率显著低于WT和mu。以上结果证实OE系具有比WT和mu强的抗冷性。
  2、将以上经低温胁迫处理的WT、OE系及mu植株种植于到营养土中继续生长,观察发现OE系的晚花表型被恢复,抽薹时间与WT和mu基本一致。进一步追踪该花期转变发生的变化,实验中继续将获得的种子繁种两代(称作冷处理组后代),此花期转变的表型仍然保持。
  3、对冷处理组后代进行冷胁迫表型、冷胁迫相关理化指标测定及相关marker gene的表达量分析,结果显示转TaHD2C拟南芥过表达系的抗冷表型在后代中稳定存在。
  4、在冷处理组后代中观察到拟南芥OE系的抽薹时间基本恢复到与WT和mu一致。实验中,与未经冷处理组相比冷处理后代OE系花期转变通路中光周期相关的FT、AP1表达上调,春化相关的FLC表达下调,VRN2表达上调。VRN1/2与VIN3可通过形成蛋白复合体参与FLC的组蛋白去乙酰化过程,使FLC的表达受到抑制,过表达拟南芥的开花提前。
  上述结果表明,TaHD2C基因提高了拟南芥抗冷性,且能在后代中稳定遗传;低温胁迫调控了花期转换整合因子FT和FLC的表达改变,使过表达拟南芥的晚花表型被恢复。
[硕士论文] 肖娟
动物遗传育种与繁殖 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:可食用植物来源的exosomes-like纳米囊泡(Edible plant derived exosomes-like nanoparticles,EPDELNs)是植物中自然发生的超微结构,与exosome具有相似的结构和功能。据报道,多种EPDELNs具有抗炎特性且能抑制癌细胞增殖,具有跨物种调节的潜力,但对EPDELNs中植源性miRNAs的表达及其跨物种调节的相关研究鲜有报道。MicroRNAs(miRNA)作为一类长约20~25nt能作为转录后调控因子的非编码小RNA分子,能参与生长、发育及疾病等多种病理和生理过程,并且miRNA能选择性地被包裹在细胞外囊泡(Extracellular vesicle,EV)中并转移到相邻或较远的细胞中发挥调节功能。因此,本试验以11种蔬菜和水果为研究对象,从中分离出exosomes-like纳米囊泡(exosome-like nanoparticles,ELNs),分别抽提总RNA后采用Illumina平台对11种EPDELNs中的miRNA文库进行测序,通过miRpipe软件将获得的序列与52种植物miRNA成熟体比对以鉴定其中所含的miRNA。作为重要的生物医学研究模型和农业经济动物,猪是用来研究植源性miRNA跨物种调节哺乳动物的理想模型,因此本试验采用Targetscan和RNAhybrid等软件对每种EPDELNs top20miRNA在人及猪体内潜在靶基因进行预测,并通过DAVID软件对靶基因的功能富集分析。最后利用双荧光素酶报告系统来验证所预测靶基因与植源性miRNA的靶标关系。试验结果如下:
  1.通过超高速离心法获得11种EPDELNs,并使用原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)和动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)分析鉴定,结果显示,11种食用植物中含有大量的圆形或椭圆形囊泡,其大小和形状与动物exosomes有相似之处。
  2.高通量测序共获得202,560,279原始测序数据,经过一系列严格的筛选(如去除低质量数据,重复序列和接头序列读数)后,剩余的141,076,120(占原始数据的71.13%)高质量数据被认定为候选miRNA。
  3.经过严格地过滤和筛选后,与miRBase数据库中下载的52种植物miRNA成熟体比对,结果显示11种EPDELNs中共含有418种植物miRNAs。每种EPDELNs中miRNA数目各不同,其中生姜ELNs中miRNA的种类最少(34种miRNAs),而大豆ELNs具有最多种miRNA(127种miRNAs),且每种EPDELNs中top20miRNA丰度占比率高达92.06%-99.16%。功能富集分析结果显示这些miRNA的靶基因主要富集在炎症反应和癌症相关通路。
  4.根据所有miRNA在11种EPDELNs中的分布特点可将其分为三类:“frequent miRNAs”(FMs),“moderately present miRNAs”(MPMs),和“rare miRNAs”(RMs),分别包括26,39和353种miRNAs。虽然FMs的种类显著少于RMs,但是miRNA的表达水平却显著高于RMs。
  5.荧光素酶报告系统实验结果显示MIR-168c能特异地作用人的TSC22D3基因的靶位点使荧光素酶活性降低,而MIR-8155能特异地作用猪的IL8基因的靶位点使荧光素酶活性降低。
  综上所述,通过对11种EPDELNs中的miRNA表达谱的分析,结果显示EPDELNs来源的miRNA可能具有调节炎性细胞因子和癌症相关基因表达的潜力。本试验拓宽了对植物与动物之间跨界调控的观点,而且有助于更好地利用植物资源。
[硕士论文] 李旭
生物学、遗传学 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:转座子(Transposable elements,TEs)是真核生物基因组中重要的组成部分,能够引起染色体结构重排,因此在染色体进化中发挥着重要的作用。石刁柏(Asparagusofficinalis)又名芦笋,为天门冬科天门冬属多年生雌雄异株草本植物,具有同型XY性染色体,是研究植物性染色体尤其是性染色体起源及演化的模式材料之一。石刁柏基因组测序已经完成,然而,对于其基因组中转座子组成及特征,尤其是染色体分布模式等仍不清楚。因此,本文利用生物信息学技术对石刁柏基因组中转座子进行了注释,分析了其组成类型及在基因组中的比例,同时利用中期染色体FISH(Fluorescence in situhybridization,荧光原位杂交)技术对主要类型的转座子在染色体上的分布模式进行了研究。主要研究结果如下:
  1、基于一系列重复序列分析工具,我们对石刁柏已发表的全基因组序列进行了重复序列注释及分析。结果表明,石刁柏基因组中转座子比例为60.92%,主要由Ty1-copia和Ty3-gypsy两类反转座子组成,比例分别达到基因组的18.13%和37.82%。DNA转座子含量较少,比例为1.28%。对10条染色体上基因密度和转座子长度进行的分析表明,所有染色体上转座子主要富集在染色体中部,而染色体末端含量较少,与基因的分布负相关。对Y染色体的MSY区(Male-specific region of Y chromosome,雄性特异区)转座子含量分析表明,其转座子比例达到86.95%,显著高于基因组中转座子的比例,且这部分转座子主要为LTR(Long terminal repeat,长末端重复)类反转座子,这说明LTR类反转座子可能参与了石刁柏性染色体的起源和演化过程。为了了解不同雌雄异株植物基因组中转座子组成特征,我们对已测序的11种雌雄异株植物基因组中转座子含量进行比较发现,11种雌雄异株植物基因组中反转座子含量均显著高于转座子含量,且反转座子中均主要为Tyl-copia和Ty3-gypsy两大类型。但是,从桑树(Morus alba)的17.70%到菠菜(Spinacia oleracea)的67.84%,11种雌雄异株植物基因组中转座子含量变异范围较大,且基因组大小和转座子含量相关性也存在较大差异,这与雌雄异株植物独立起源的特点是一致的。
  2、为了对所获转座子序列进行中期染色体定位,对石刁柏基因组中51个转座子进行了克隆,其中包括14个Tyl-copia类反转座子,17个Ty3-gypsy类反转座子,8个其他类型的反转座子序列和12个DNA转座子。对这些转座子的中期染色体FISH结果表明,51个转座子序列均获得清晰稳定的杂交信号。反转座子中,LTR类反转座子在染色体上的分布位置主要有四种模式,包括分布在着丝粒、着丝粒及其侧翼区、除着丝粒与端粒外的染色体臂和整条染色体上弥散分布;LINE(Long interspersed nuclear elements,长散在重复元件)类反转座子在染色体上主要呈现着丝粒特异和着丝粒及其侧翼区的分布特点。DNA转座子主要出现在着丝粒及其侧翼区和染色体臂上。这说明反转座子和DNA转座子在染色体上的分布存在差异。虽然不同类型的反转座子在染色体上的分布也存在一定位置特异性,但是其杂交信号均在着丝粒及其侧翼异染色质区域广泛,说明着丝粒及其侧翼区域的异染色质区是转座子分布的热点区域。比较转座子在不同染色体上的分布结果表明,石刁柏前7对较大染色体上分布的反转座子显著多于3对小染色体,这说明反转座子的不断复制插入可能是染色体体积膨胀的主要原因。
[硕士论文] 马光婧
遗传学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:PHOSPHATE STARVATION RESPONSE1(PHR1)是拟南芥低磷胁迫应答重要的调控因子,但PHR1在低磷胁迫应答中的转录调控机制尚不清楚。生长素作为植物生长发育的重要激素,在拟南芥低磷胁迫应答中也发挥重要作用。本论文研究将拟南芥低磷应答中生长素信号与PHR1直接联系起来,发现PHR1基因是生长素应答因子ARF7和ARF19的直接靶基因,并且在拟南芥根中受生长素信号正调控。论文获得的主要研究结果如下:
  1.PHR1基因受低磷和生长素诱导
  利用PHR1p∶GUS转基因拟南芥进行启动子活性分析。GUS染色反应显示在高磷条件下PHR1在拟南芥根中有较高水平的表达;在低磷条件下PHR1表达有一定程度的提高。qRT-PCR分析也得到相同的结果。外源生长素NAA和IAA处理后发现,无论在高磷或低磷条件下,PHR1在拟南芥根中的表达均显著提高。而外源生长素极性运输抑制剂NPA和TIBA处理后,根中PHR1表达明显降低。这些结果说明在拟南芥根中PHR1在转录水平受到生长素调控。
  2.PHR1启动子生长素应答元件分析
  用生物信息学方法分析PHR1启动子中的顺式作用元件,发现PHR1启动子中有三个生长素应答元件,包括一个AuxRE(GAGACA)和两个TGA-element元件(AACGAC)。分别对这三个生长素应答元件进行单缺失突变,双缺失突变和三缺失突变,然后分析不同缺失突变启动子活性。实验结果发现三个生长素元件均是PHR1转录所必须的,其中TGA-1 element元件是最重要的。
  3.ARF7和ARF19受低磷诱导
  qRT-PCR分析表明在拟南芥根中ARF7和ARF19基因受低磷诱导。ARF7p∶GUS和ARF19p∶GUS转基因拟南芥GUS活性分析也显示低磷条件下转基因拟南芥根中GUS活性显著增强,这些结果说明ARF7和ARF19的表达模式与PHR1相似。
  4.ARF7和ARF19能与PHR1启动子结合
  酵母单杂交实验表明在酵母细胞中ARF7和ARF19能与PHR1的启动子结合并启动报告基因表达。体外凝胶迁移实验(EMSA)和体内染色质免疫共沉淀实验(ChIP)也证明了ARF7和ARF19均可以与PHR1启动子上三个生长素应答元件结合。这些研究结果第一次证明了ARF家族调控因子可以与TGA-element顺式元件直接结合。
  5.ARF7和ARF19正调控PHR1基因
  在arf7、arf19、arf7arf19突变体中PHR1及下游磷饥饿诱导基因(PSI基因)表达均明显下调。此外,arf7arf19双突变体中出现磷摄入量减少和地上部分花青素积累增多的表型。将PHRlp∶GUS载体转化arf7,arf19和arf7arf19突变体,GUS染色活性分析发现,其GUS活性呈现不同程度的下降。这些实验结果说明在拟南芥体根中PHR1基因受到ARF7和ARF19的正调控。
  6.MYB-CC家族其它成员基因受ARF7和ARF19调控
  在拟南芥中MYB-CC家族包含15个成员,除PHR1外,其它成员基因的启动子中也有生长素应答元件。CHIP分析显示ARF7和ARF19还可以与这些基因(At5g29000/PHL1, At5g06800, At3g13040, At3g12730, At4g13640/PHL3, At1g69580,At3g04030)启动子生长素应答元件结合。这些结果说明ARF7和ARF19转录因子可能是MYB-CC家族基因上游调控因子。
  7.低磷条件下PHR1对拟南芥侧根的调控不依赖于LBD16和LBD29
  ARF7和ARF19通过直接调控下游靶基因LBD16和LBD29来调控拟南芥侧根起始和发育。低磷条件下,phr1突变体表现为侧根减少,而PHR1过量表达转基因拟南芥表现为侧根增多。qRT-PCR分析显示phr1突变体和PHR1过量表达转基因拟南芥根中,LBD16和LBD29的表达并没有发生显著性改变,说明低磷条件下PHR1对侧根的影响并不依赖于LBD16和LBD29。
  综合上述实验结果,本论文揭示了拟南芥根中生长素信号和PHR1转录因子协同应答低磷胁迫的分子调控新机制。
[硕士论文] 王玉龙
细胞生物学 河南农业大学 2018(学位年度)
摘要:microRNA(miRNA)是一类长度约21nt的非编码小RNA分子,广泛存在于高等真核生物中。目前,关于miRNA基因的表达特性和功能鉴定已经成为近期科学研究的热点,如miRNA的加工成熟过程以及在转录后水平微调靶基因的表达等。在拟南芥中,已鉴定出325个miRNA前体和427个成熟miRNA分子,但绝大多数MIR基因的结构和功能尚未得到实验验证和深入研究。在此,初步分析拟南芥光形态建成关键调控因子HY5下游三个miRNA(miR858a、miR402以及miR777)在拟南芥幼苗生长发育过程中的功能。
  通过生物信息学预测分析发现miR858a能够靶向拟南芥花青素合成负调节因子MYBL2基因从而参与拟南芥花青素的合成与积累。为了研究miRNA858a参与花青素合成的分子机理,分别在野生型拟南芥背景材料中获得miR858a过表达转基因植株(MIR858a-OX)和利用Small Tandem Target Mimic(STTM)技术沉默miR858的转基因植株。通过检测发现,花青素含量以及花青素合成基因的表达量在MIR858a-OX和STTM858转基因拟南芥中分别不同程度地增加和减少。根据转录组测序结果并利用qRT-PCR检测发现,在MIR858a-OX和STTM858中MYBL2基因的表达量无显著性变化。之后构建并获得proMYBL2:MYBL2-HA/mybl2回复突变体植株,并分别与MIR858a-OX和STTM858植株杂交;另外在杂交后代中检测发现MYBL2-HA在蛋白质水平分别减少和增加。所以得出结论,miR858a可能通过抑制MYBL2基因的翻译正向调控拟南芥花青素的合成与积累。之后分别验证MIR858a和MYBL2基因依赖‘光信号—HY5’调控表达的特性,并总结出‘光—HY5—miR858a—MYBL2—花青素’分子调控模型。此结果不仅能够为更好的理解花青素的合成与调控机制提供数据支持,并为将来遗传改良获得高花青素含量的作物提供参考。
  除miR858a之外,也初步对MIR402和MIR777基因进行功能研究。首先研究它们的表达特性:通过组织化学染色,发现MIR402主要在子叶、下胚轴和根部分生组织表达;而在hy5突变体幼苗的下胚轴中MIR402表达量显著降低,在花中表达量显著增多。同样,组织化学染色结果表明MIR777在拟南芥幼苗中表达量极低;而在hy5背景下MIR777主要在叶尖和下胚轴顶端表达,说明HY5可能负调控MIR777的表达;之后设计并获得了MIR过表达转基因植株和STTM转基因沉默植株。发现在hy5遗传背景下过表达miR402和miR777均能部分回补hy5突变体下胚轴增长的表型。在后续的研究中将会从转录组表达变化方面进一步分析miR402和miR777参与调控拟南芥光形态建成和早期发育的分子机制。
[硕士论文] 吴席
生物化学与分子生物学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:迄今为止,全球范围内有大量的盐碱化土地;在中国同样也有着大量的盐碱化土地。盐胁迫是自然界中主要的几种非生物胁迫之一,对植物生长造成严重损害,且对生态环境的稳定造成威胁,因此研究植物对盐胁迫响应的机制具有重要意义。本实验室的前期研究中发现HIS1-3基因负调控植物对盐胁迫的响应,而WRKY1基因正调控植物对盐胁迫的响应。本研究进一步证实HIS1-3和WRKY1基因协同调控植物对盐胁迫的响应。主要研究结果如下:
  1.qRT-PCR分析显示,NaCl处理下,野生型拟南芥(WT)中HIS1-3基因的表达量随着盐处理时间的增加而下降,此外his1-3突变体对盐胁迫表现耐受,而HIS1-3OE过表达植株对盐胁迫表现敏感,表明HIS1-3基因负调节植物对盐胁迫的响应。
  2.NaCl处理后,his1-3突变体中根和茎的钠离子含量比WT高,而HIS1-3OE过表达植株中根和茎的钠离子含量比WT低,表明HIS1-3基因通过调节植株体内钠离子含量来调控植株对盐胁迫的响应。
  3.盐胁迫条件下,his1-3突变体中SOS1和SOS2基因的转录水平较WT高,HIS1-3OE过表达植株中SOS1和SOS2基因的表达量要比WT中低,结果说明,盐胁迫下,HIS1-3基因可能通过SOS途径调节植株体内的钠离子含量,进而增强植物的对盐胁迫的抗性。
  4.利用烟草瞬时表达系统分析,发现WRKY1可激活SOS1,SOS2和SOS3的转录活性,而HIS1-3能够抑制WRKY1对SOS1和SOS2基因表达的激活。
  5.进一步通过酵母双杂交实验发现HIS1-3和WRKY1基因并无相互作用,表明HIS1-3基因可能通过SOS1和SOS2的启动子上的占位来调节WRKY1对SOS1和,SOS2基因转录活性,进而影响植物对盐胁迫的响应。
  6.通过染色质免疫共沉淀的方法发现HIS1-3可以直接结合到SOS1和SOS2的启动子上,说明HIS1-3通过直接结合到SOS1和SOS2的启动子上,进行转录负调控。同样,发现WRKY1也直接结合到SOS1,SOS2和SOS3的启动子上,从而正调控SOS1,SOS2和SOS3基因的转录活性。
  综上所述,在正常生理条件下,HIS1-3会结合于SOS1和SOS2基因的启动子上,占据了WRKY1与SOS1和SOS2基因启动子结合的结合位点;在盐胁迫状态下,外界盐胁迫的影响会导致HIS1-3基因降低表达量,从而SOS1和SOS2基因启动子暴露出来,而此时WRKY1基因作为转录因子,直接结合到SOS1,SOS2和SOS3基因的启动子上,启动SOS1,SOS2和SOS3基因的表达。SOS1作为钠离子转运蛋白,会将植株体内多余的钠离子排出体外,减少过多钠离子对植株的毒害,从而使植株产生耐盐现象。
[博士论文] 姚恒
生物信息学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:理解生物生理过程背后的生物学逻辑是生物学研究中一个重要的目标,这样的研究有助于加深我们对生物表型背后生物学机制的了解,进而为我们预测与干预生物表型提供新的研究方向。构建一个质高质量的功能关联网络将有助于实现这一目标。在本研究中,以拟南芥的分子功能相互作用组为背景,我们构建了新一代的拟南芥预测相互作用组资源(predicted Arabidopsis interactome resource,PAIR)这一功能关联网络。随后实现了基于该网络的新一代组学数据分析方法——基因集关联分析(gene set linkage analysis,GSLA)。新一代的PAIR v5.0通过整合多种形式的功能关联证据,利用机器学习算法预测了一共335301对拟南芥的基因功能关联。随后,通过与现存的被广泛使用的一系列其他类功能关联网络的对比,我们定量地评估了PAIR v5.0作为一个功能关联网络的统计学特性。以此网络作为驱动,新一代的GSLA得以对观测到的组学数据变化展开有效的分析。组学数据的变化一般反映在从组学变化中提出的差异表达基因(differential expressed genes,DEGs)上。利用GSLA,生物学研究者可以对这些差异表达基因展开分析,以阐释这些差异表达信息所代表的生物学过程对生物个体施加了怎样的功能影响。GSLA利用现存的生物学概念来分析观测到的组学数据变化。与传统方法不同的是,GSLA不仅通过这些生物学概念来描述组学数据本身,还通过功能关联网络来来拓展我们对于组学数据的认知。该特性使得研究者能通过GSLA形成对组学数据更高层次的理解,找到有助于进一步研究的新线索与新方向。在本论文中,我们利用GSLA展开了对拟南芥种子发育过程中光响应与植物激素响应的研究,并在这两个研究案例种通过比较GSLA与一系列被广泛使用的组学数据分析工具,定量地评估了GSLA在分析组学数据中所展现出的独特能力,展现了GSLA如何帮助研究者将宏观的表型变化与微观的分子机制联系在一起,从而更加综合以及系统地理解这些变化对生物体施加的功能影响。最后,我们开发了PAIR v5.0与GSLA的在线资源,方便他研究者更广泛地使用这一组学数据分析系统。本研究中所涉及到的所有数据与分析工具,均可通http://public.synergylab.cn/pair来访问。
[硕士论文] 黄莹
生物化学与分子生物学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:由于气候变化,干旱成为当今世界亟待解决的重大环境问题之一。干旱对植物的生长发育有巨大影响,导致农作物产量急剧降低,严重影响人类的生存质量和经济发展。因此探索研究抗旱相关基因的功能及其对干旱胁迫响应的机制具有重大的理论意义和实践价值。目前,相关研究表明铁蛋白基因家族在植物抗逆反应中具有重要作用。本课题主要研究拟南芥中铁蛋白基因FER2在干旱胁迫下的响应机制及作用机理,并取得下列研究成果:
  1、干旱可以诱导FER2基因的表达,甘露醇模拟干旱表型分析显示功能缺失型突变体fer2-1,fer2-2植株较野生型更为敏感,表明FER2基因可能参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应机制。
  2、干旱及复水的土培实验结果显示,干旱胁迫时,fer2-1,fer2-2植株较野生型植株敏感。复水处理后fer2-1,fer2-2植株的死亡率远高于野生型。与甘露醇模拟干旱实验结果结论一致。
  3、外源加入ABA可诱导FER2基因的表达。外源加入ABA对fer2-1,fer2-2突变体的表型及根长鲜重量化数据分析表明,突变体植株较野生型更为敏感。ABA可能参与调控FER2基因对干旱的响应。
  4、在铁离子和过氧化氢胁迫下,fer2-1,fer2-2突变体较野生型更为敏感,表明FER2基因可能通过鏊合植物体内自由铁,维持细胞内铁离子的稳态,减少Fenton反应催化活性氧(ROS)的生成正向调控植物对干旱胁迫的响应。
  5、在对其他胁迫如氯化钠、氯化钾、硫酸锌,硫酸铜、砷酸钠等胁迫分析下,fer2-1,fer2-2突变体的生长发育较野生型无显著性差异,FER2基因可能与盐胁迫及金属胁迫的响应机制无关。
  6、以全基因组DNA为模板克隆FER2基因及启动子序列,利用双酶切技术构建FER2过表达及ProFER2-GUS融合基因表达载体。采用浸花法侵染拟南芥花序,经卡那霉素抗性筛选、PCR扩增等手段获得相应转基因植株。为后续的研究提供了不可或缺的实验材料。
  综上所述,干旱胁迫发生时植物体内ABA激增,诱导FER2基因大量表达并鏊合自由铁离子维持胞内铁离子平衡,通过抑制Fenton反应的发生降低活性氧ROS对植物的伤害,正向调控拟南芥对干旱胁迫的响应。
[硕士论文] 郭荣
遗传学 浙江师范大学 2018(学位年度)
摘要:在植物中,水杨酸(SA)作为一种重要的内源激素调控植物的抗病、抗逆、生长发育和衰老。其代谢机理是SA研究的重要内容之一。在拟南芥中,SA合成和分解代谢路径尚未被阐述清楚。为了深入揭示水杨酸代谢的分子机制及生理功能,本文利用EMS诱变因SA积累而变小的拟南芥双突变体s3h*s5h,筛选表型恢复变大的突变体,用正向遗传学方法克隆SA代谢相关基因。同时通过生物信息学、分子生物学、生物化学、遗传学等研究方法研究一个水杨酸羟基化代谢候选基因At4g10490(DLO2)的生理学功能。取得的具体研究结果如下:
  (1)本文利用一种依赖于水杨酸突变体表型筛选水杨酸相关突变体的方法,对EMS诱变的水杨酸积累的拟南芥双突变体Col-0 s3h*s5h进行筛选,筛选出表型恢复变大的突变体,建立表型恢复突变体库。对已筛选出的突变体进行表型、直径及水杨酸代谢水平进行统计。本文已筛选出20个与水杨酸代谢及叶片衰老相关的突变体,并根据其表型及水杨酸代谢水平分为四类,分别为:Ⅰ表型恢复变大且叶片晚衰,SA含量降低的突变体;Ⅱ表型恢复变大且叶片晚衰,SA含量与双突变体s3h*s5h相似的突变体;Ⅲ表型恢复变大且叶片早衰,SA含量与双突变体s3h*s5h相似的突变体;Ⅳ表型变小且叶片晚衰,SA含量降低的突变体。
  (2)将突变体与水杨酸积累的拟南芥双突变体Col-0 s3h*s5h进行回交,收获F1代种子后播种,待植株成熟后收获F2代种子并继续播种,获得F2代植株后其表型分离比符合3∶1。并挑选大的F2代植株提取DNA送去公司进行重测序,本文已经对两株突变体进行了重测序。
  (3)本文利用CRISPR/Cas9技术创建Ws生态型的双突变体s3h*s5h。将s3h*s5h/Ws与突变体进行杂交,待F1代植株成熟后收获F2代种子并继续播种,获得F2代植株后其表型分离比符合3∶1。并挑选大的F2代植株提取DNA进行图位克隆,利用不同生态型之间单核苷酸序列的多样性确定基因位置。
  (4)本文利用杂交技术将表型相似的6种突变体进行两两杂交获得F1代植株并对其表型进行观察,随机抽取F1代植株进行水杨酸代谢分析,检测不同突变体之间突变基因的异同。已证明其中5个突变体108008、109004、113016、116003、24-3之间的突变基因不同。
  (5)本文利用生物信息学手段和公共数据库基因芯片结果对所预测的基因表达模式进行分析,初步获得和水杨酸羟基化代谢有潜在关联的候选基因At4g10490(DLO2),该基因与羟基化基因S3H亲缘关系相近。
  (6)体外诱导表达纯化候选基因的蛋白后,以水杨酸为底物,利用酶活测定方法和高效液相色谱仪测定酶反应产物,结果表明DLO2基因编码的蛋白可以在体外催化水杨酸羟基化为2,5-DHBA。
  (7)利用CRISPR/Cas9技术、农杆菌介导的拟南芥转基因方法、PCR技术和酶切的方法获得了突变体s3h*s5h*dlo2和s5h*dlo2并对其叶片表型和代谢进行分析。本研究可知在突变体s3h*s5h及s5h中敲除DLO2基因,其叶片表型和代谢并没发生明显改变,表明DLO2基因在叶片衰老中的功能并不明显。
  (8)利用拟南芥转基因技术,成功将pMDC32-DLO2载体转入水杨酸积累的拟南芥双突变体s3h*s5h,获得互补型植株后对其叶片表型及代谢进行分析,结果显示其表型变大但并未恢复WT水平,而其水杨酸代谢水平已恢复至WT代谢水平。证明DLO2在拟南芥中确实有将水杨酸羟基化的功能,并具有生理功能。以上结果表明,利用EMS诱变技术诱变水杨酸积累的拟南芥双突变体s3h*s5h可获得与水杨酸代谢及衰老相关的突变体;At4g10490基因编码的蛋白可催化SA羟基化生成2,5-DHBA,在植物体内具有生理功能。
[博士论文] 付婉艺
观赏园艺学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:蒿属(Artemisia spp.)植物花粉是我国北方地区最重要的花粉过敏来源之一,拥有广泛的交叉过敏性。过敏反应是某些外来物质刺激引起,由IgE抗体介导的适应性免疫应答,而蒿花粉-食物综合症是引起严重过敏性休克最常见的诱因。近年来,随着分子生物学技术的不断发展和精准医疗时代的来临,过敏原组分诊断已成为过敏性疾病诊断和治疗中的重要方法。目前,已知的欧洲北艾(Artemisiavulgaris)花粉过敏原组分共有七种,分别被命名为Artv1-Art v6以及未知分子特性的Artv60 kDa,这些信息是研究我国蒿花粉过敏原的重要参考。我国目前对于蒿属花粉过敏原的分子生物学研究以及关于过敏组分诊断的研究极少,大大阻碍了精准的诊断和治疗的发展。本文通过转录组、蛋白组和质谱测序相结合,鉴定推导黄花蒿花粉中62 kDa半乳糖氧化酶为新的过敏原,将其命名为Artan7,并测定其理化性质和免疫活性。对六种蒿属花粉进行转录组和表达谱测序,分析了七类蒿过敏原基因序列差异,发现Artv3在不同蒿种间序列差异最大。构建双夹心ELISA法定量过敏原Art v1、Art v2和Art v3,测定黄花蒿(A.annua)、艾蒿(A.argyi茵陈蒿(A.capillaris)、细裂叶莲蒿(A.gmelinii野艾蒿(A.lavandulifolia)、大籽蒿(A.sieversiana)和北艾(A.vulgaris)七种蒿花粉提取物中的过敏原含量,并比较了不同蒿花粉提取物的IgE抗体结合活性,推测在过敏诊断和免疫治疗中,采用黄花蒿、艾蒿和大籽蒿花粉蛋白提取物混合试剂比单一蒿试剂更为全面有效。此外,还分析了中国蒿过敏患者sIgE抗体对四种蒿过敏原组分(Artv1,Art ar2,Artv3,Artan7)的识别模式与地域差异以及与过敏症状间的关系。
  主要研究结果如下:
  1、黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、野艾蒿、大籽蒿和北艾七种蒿花粉提取物与蒿过敏患者血清的免疫印迹均观察到三个主要过敏原蛋白条带,分子量分别位于12、25-35和60-70 kDa位置,中国蒿过敏患者的主要过敏原是Art v1和Art v3。在79位蒿过敏患者血清与六种蒿花粉提取物的ELISA结合实验中,IgE抗体结合程度以黄花蒿最高,野艾蒿最低,除大籽蒿外其余蒿均能完全抑制主要过敏原Art v1和Art v3与IgE抗体结合,大籽蒿只能部分抑制Art v3与IgE抗体结合,但大籽蒿在Art v1和Art v3皆为阴性的血清中抑制效果较好。
  2、黄花蓠花粉转录组测序得到5.8 Gb数据和69,007个Unigene,蛋白组测序得到317,291个多肽蛋白质谱,鉴定出2035个蛋白。从黄花蒿花粉提取物中成功纯化出一个60-70 kDa过敏原蛋白,推断为半乳糖氧化酶,并提交至国际过敏原命名委员会(IUIS)将其命名为新过敏原Art an7.0101,94%的蒿过敏患者特异性IgE抗体(sIgE)识别这一过敏原。该蛋白是一个酸性糖蛋白,分子量为61954 Da,其基因ORF序列全长为1785bp,与同为菊科植物的向日葵假定半乳糖氧化酶基因序列相似度最高(74%),在412-414aa位置还发现一个天冬酰胺N联聚糖结合位点NTL。克隆了Art an1.01和Art an3.02的基因序列,并进行原核表达得到重组过敏原,蒿过敏病人的sIgE抗体与两种重组过敏原的结合程度都很高,可进一步开发作为过敏诊断试剂。
  3、对艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、碱蒿和大籽蒿花粉进行转录组测序,各得到7.3-7.7 Gb转录组数据,艾蒿、碱蒿和茵陈蒿的Unigene中序列相似度高的序列较多,而细裂叶莲蒿和大籽蒿中较少,六种蒿表达谱测序结果显示艾蒿和北艾的基因表达量相关性最高(>0.97)。比对分析七类蒿过敏原的基因序列(Art v1-Art v7以及同源过敏原蛋白),发现其中Art v3同源蛋白在不同蒿中序列变化最大(氨基酸序列相似度为85%-100%),七种蒿Art v1、Art v2、Ar tv3和Art an7的过敏原基因序列已提交至NCBI数据库。依七类蒿过敏原的基因序列可将七种蒿聚为两大类:一类是黄花蒿、茵陈蒿和大籽蒿;另一类是北艾、艾蒿、野艾蒿和细裂叶莲蒿。对黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、大籽蒿和北艾花粉进行基因表达谱分析发现,Art v1.01、Art v4.02、Art v4.01和Art v5.01分别在黄花蒿、艾蒿、细裂叶莲蒿和大籽蒿中表达量最高,Art2.01、Art v6.01和Artv7.01则在北艾中表达量最高,Art v3由于基因序列变化程度较高,表达量测定的精度随之降低,大致可看出在黄花蒿中表达量最高。
  4、用黄花蒿和艾蒿花粉提取物分别免疫小鼠和兔制备出单抗和多抗,成功通过Art v1和Art v2的单抗纯化得到天然蒿过敏原,可进一步开发并应用于过敏诊断和治疗。构建了检测Art v1、Art v2和Art v3三种过敏原含量的单抗-多抗双夹心ELISA法,并依此测定七种蒿花粉提取物中的过敏原含量。Art v1和Art v2同源蛋白含量在各蒿提取物之间相差不大,分别以黄花蒿(7.1%)和野艾蒿(3.3%)中含量最高;Art v3同源蛋白含量差异较大,最高的为艾蒿(13.9%),最低的是大籽蒿(0.07%);三种过敏原总含量在各蒿中依次为:艾蒿(22.3%)、北艾(12.6%)、野艾蒿(12.0%)、黄花蒿(11.2%)、茵陈蒿(8.5%)、细裂叶莲蒿(8.1%)和大籽蒿(7.3%)。
  5、应用ImmunoCAP检测331个中国蒿过敏病人北艾提取物、Art v1和Artv3的sIgE抗体水平,以及209位病人Art ar2和Artan7的sIgE抗体水平,并结合病人年龄、过敏症状和地域进行数据分析,Art v1、Art ar2、Art v3和Artan7的过敏率分别为77%、48%、60%和85%,sIgE抗体中位数分别为6.4 kUA/L、0.3 kUA/L、6.6 kUA/L和2.8 kUA/L,北方病人比南方病人患哮喘的比例更高(42%vs6%),多组分过敏病人患哮喘的风险也更高,儿童、青少年与成人在北艾提取物、Art ar2和Art an7的sIgE抗体水平上存在显著差异。
[硕士论文] 钱靓雯
食品工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:硒是人和动物所必需的营养元素,而它的最低剂量和中毒剂量之间的范围很窄。植物是人和动物摄取硒的主要来源,硒缺乏在全球范围内是一种普遍现象,硒污染也同时存在着。近期研究表明,从硒积累植物中提取人体易吸收的有机硒,可用来改善缺硒地区人群饮食中硒元素的不足;硒积累植物是用于清除生态环境硒污染的植物修复技术的主要植物材料。人或动物从水体中土壤中吸收了过量的硒会在体内富集产生毒害作用,从而通过食物链最终在人体内产生毒害。本课题主要是研究拟南芥WRKY47基因在硒胁迫下的耐硒机理,及对相关基因的调控转录功能。研究结果如下:
  (1)基因表达分析显示,用Na2SeO3处理拟南芥野生型(WT)幼苗发现,WRKY47基因可以被Se诱导表达,表明WRKY47基因可能参与植物Se胁迫响应调控。
  (2)构建35S-WRKY47-GFP载体:克隆拟南芥WRK Y47基因,将其连接到含有强启动子的pART27载体上,融合蛋白亚细胞的定位显示,WRKY47基因编码的蛋白主要定位于细胞核。
  (3)进一步鉴定了WRKY47基因敲除突变体wky47-1和wrky47-2,发现在Se胁迫下突变体wrky47-1和wrky47-2较野生型表现为更加敏感,表明WRKY47基因参与拟南芥Se胁迫应答调节。
  (4)wrky47突变体中根和茎的硒含量数据显示,拟南芥幼苗生长在含有硒盐的培养基中,测得的突变体根部和茎部硒含量与野生型中无显著差异,表明WRKY47基因功能缺失有可能与硒的解毒或抗氧化机制相关。
  (5)进一步用外源H2O2处理野生型和wrky47突变体,发现突变体与野生型的表型无显著差异。通过DAB组织染色结果分析,无论是外源H2O2处理还是Na2SeO3处理,wrky47突变体染色结果都与野生型无显著差别。
  (6)通过RT-PCR技术分析参与抗氧化途径相关的基因转录水平。在外源硒处理的条件下,wrky47突变体与野生型的转录水平没有显著差异,进一步表明WRK Y47基因在硒富积下的应答机制可能与抗氧化途径无关。
  (7)为进一步确认WRKY47在植物Se响应中的作用,构建了WRKY47过表达载体:克隆拟南芥WRK Y47基因,将其连接到pBI121载体上,运用转基因技术,转入野生型植株内,通过筛选鉴定获得WRKY47过表达阳性植株,为进一步分析提供了研究材料。
  综上所述,WRKY47基因参与硒胁迫应答,其调控机制可能与活性氧参与抗氧化途径无关。据此推断出,WRKY47基因可能通过调控硒相关代谢途径上相关下游靶基因的转录进而将无机有毒的硒转变成无毒有机的硒从而增加硒耐受。然而WRKY47的直接靶基因有待进一步鉴定和研究。
[硕士论文] 孙平
生物学;细胞生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:西鄂尔多斯国家自然保护区位于内蒙古自治区,因其独特气候、地形、地貌等,使它成为了许多珍稀动植物的“避难所”。本研究中共选取了4种国家级濒危保护植物,分别是四合木(Tetraena mongolica)、蒙古扁桃(Amygdalus mongolica)、沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、革苞菊(Tugarinovia mongolica),其中四合木、革苞菊是国家一级重点保护野生植物,蒙古扁桃和沙冬青均为国家二级保护植物。
  本研究主要分两部分进行,一方面针对四合木种群,通过已开发的多态性较高的微卫星分子标记研究其种群的遗传多样性、遗传结构、种群历史动态等,为其遗传保护提供重要的科学根据。另一方面,通过高通量测序技术手段,对蒙古扁桃、沙冬青、革苞菊3种植物进行SSR微卫星位点的筛选。
  基于微卫星对四合木8个地理居群339个个体进行遗传多样性和遗传结构等分析,得到的结果如下:
  (1)种群遗传多样性分析:平均等位基因数(MNA)范围在13.17-17.67,位点丰富度(AR)范围6.860-10.529,观测杂合度(HO)的范围在0.810-0.873,期望杂合度(HE)的范围在0.832-0.882,因此可以看出本研究中8个四合木地理居群均具有较高的遗传多样性。
  (2)种群遗传结构分析:遗传距离(Fst)范围在0.00034-0.04284,且大部分得到了显著支持(P<0.05),表明8个地理居群之间的遗传分化极其微弱。由聚类分析及相关因子分析(FCA)结果表明所有种群都高度重叠,这与遗传距离的结果是一致的。所以四合木这8个地理居群应该看作一个整体的保护单元从而予以保护。
  通过高通量测序,对蒙古扁桃、沙冬青、革苞菊3个物种进行SSR微卫星位点开发,结果如下:
  (1)蒙古扁桃共开发出51对具有高多态性的位点,有效等位基因数(NA)范围是13-25,观测杂合度范围在0.875-1.000,期望杂合度的范围是0.863-0.946,多态性信息含量(PIC)为0.854-0.943,可作为蒙古扁桃群体遗传结构的可靠分子标记。
  (2)沙冬青成功开发了20对微卫星位点,都具有较高的观测杂合度和期望杂合度,范围分别0.500-1.000和0.447-0.844,多态性信息含量范围是0.374-0.807,表明这些位点具有高多态性且位点之间未出现基因连锁不平衡现象。
  (3)革苞菊成功开发了21对微卫星位点,观测杂合度的范围是0.083-1.000,期望杂合度的范围0.156-0.965,可作为革苞菊群体遗传结构的可靠分子标记。
[博士论文] 李锡花
作物遗传育种 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:棉花是重要的经济作物之一,棉纤维为纺织行业提供了自然原材料。面对着纺织行业对棉花质量要求的不断提高,棉花纤维品质改良成为棉花育种的主攻目标之一。棉花纤维是研究单细胞伸长、次生壁的合成与纤维合成的理想模式系统,基于以前对纤维长度性状的研究,纤维长度的调控是一系列的复杂调控模式来调节的。本研究以纤维长度存在显著差异的陆海回交近交系为材料来研究纤维长度相关的转录组学及基因功能验证,主要结果如下:
  1.通过对纤维长度存在差异的两个海陆回交近交系后代快速伸长期10 DPA的纤维进行转录组测序,以四倍体陆地棉为参考基因组进行分析,得到678个基因在纤维较长材料中上调表达,873个基因下调表达。对长短纤维两材料之间的SNP分析结果显示,339个差异表达基因中存在703个SNP位点。根据物理图谱将存在非同义突变的差异表达基因与之前报道的纤维长度QTL及热点区域进行共定位,筛选到8个基因。将8个基因内存在的SNP位点设计分子标记与群体性状进行连锁分析,共得到3个基因内存在的4个SNP位点与长度性状存在相关性。3个候选基因分别编码脯氨酸富集蛋白、D-半胱氨酸脱巯基酶、类甜蛋白,其中编码类甜蛋白的基因中存在的一个SNP位点与各个环境中的纤维长度性状紧密连锁。这一发现为深入研究自然变异导致的纤维长度差异的分子基理提供了基础。
  2.本研究首次对4个棉种中的SAUR基因进行全基因组分析。通过Blast比对的方法从雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉基组中分别鉴定了145、97、214、176个SAUR基因,并对基因的基本信息进行了分析。不同物种的SAUR家族进化树分析将整个家族分为10个亚组,并且基因都含有家族特有的生长素诱导的domain。染色体定位及基因重复事件分析显示重复事件导致了棉花中该家族基因数目的扩增。外施生长素处理下GhSAUR基因表现出不同的响应模式,RNA-seq与qRT-PCR结果表明SAUR基因在发育早期的纤维及胚珠中表现出多样化的表达模式。本研究为棉花中SAUR单基因的研究提供了重要的基础信息,为 SAUR在生长素信号通路调节棉花的生长发育中的功能研究打下了坚实的基础。
  3.从陆地棉中克隆到GhSAUR33基因,组织表达模式分析显示,该基因在纤维快速伸长期10 DPA高调表达,编码的蛋白主要在细胞膜表达。拟南芥中过表达该基因会导致茎秆分叉;利用VIGS技术在棉花中干扰GhSAUR33基因的表达,干扰植物的成熟纤维变短,初步推测该基因影响纤维伸长。
[博士论文] 王丽娜
林木基因组学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PECK;EC4.1.1.49)是植物主要基础代谢交叉口上的关键酶,直接或间接地参与生物过程,在植物代谢中的地位非常重要。在C4植物中起二氧化碳浓缩的作用,其在原始的C3植物中超量表达和RNAi抑制表达会肯定会影响到碳、氮流的流向,进而影响碳氮分配比例。本研究利用基因工程技术、转录组学和代谢组学等技术对84K杨进行PtPEPCK1的基因功能研究。该研究对深层次了解固碳机制、碳氮平衡调控具有重要意义,为进一步揭示碳氮关键酶基因代谢的分子机理提供理论参考。本论文的主要研究及结果如下:
  (1)采用RT-PCR、qRT-PCR和Western blotting实验技术进行组织特异性表达分析,结果显示:PtPEPCK1在杨树根、茎、叶中均有表达,表达量有明显差异,叶片中表达最高,茎、根部组织中依/次下降,根部表达量非常微弱。Western blotting在蛋白层面上检测到叶片和茎段组织有表达,根部表达未检测到。
  (2)利用Gateway系统构建PtPEPCK1基因的过表达和RNAi载体,并用根癌农杆菌介导法进行84K杨的遗传转化。分子检测确认“光诱导”转基因方法共获得12个阳性株系,“暗诱导”转基因方法共获得30个阳性株系,未分化的愈伤转化子若干。RNAi抑制表达植株“光诱导”转基因方法共获得11个阳性转化株系,“暗诱导”转基因方法共获得25个阳性转化株系,未分化的愈伤株系若干,留作后备实验材料。
  (3)对过表达和抑制表达转基因杨树进行20d、30d、60d、90d的表型观察和株高、胸径的统计分析,结果显示转基因植株并没有出现截然相反的表型生长特征,而且在生长速度、树高、直径等参数均低于野生型植株。过表达株系的发育受到最为明显的抑制。RNAi抑制表达株系的表型生长速度也同样缓慢,但程度略轻于过表达,高生长、胸径生长介于过表达和野生型之间。
  (4)采用IHC-P技术鉴定结果发现PtPEPCK1在叶片叶肉细胞海绵组织和栅栏组织中均有表达,在叶肉细胞的海绵组织中出现强阳性表达特征,有棕黄色颗粒和褐黄色颗粒呈现,细胞核呈阴性表达。
  (5)采用免疫共沉淀技术联合质谱分析,以Score和Coverage数值为选择标准,进一步明确了互作的蛋白网络,结果显示前10位互作蛋白包括以下几大类:(a)浓缩二氧化碳机制相关的酶;(b)糖酵解/糖异生中间产物;(c)ATP合酶;(d)伴侣蛋白等。
  (6)基于Illumina平台,对过表达、抑制表达和野生型杨树进行转录组测序,结果显示转PtPEPCK1基因在转录水平的总体差异基因有趋同效应,局部碳氮代谢差异基因明显。引起通路变化幅度较大的主要集中在丙酮酸代谢、TCA循环、糖异生、氨基酸生物合成、嘧啶代谢、次生代谢物质的生物合成及植物免疫系统代谢通路等变化。单独过表达和RNAi抑制表达PtPEPCK1扰动了核心代谢途径,过表达PtPEPCK1使丙酮酸代谢异常,碳流从丙酮酸过多的流入乙酰辅酶A代谢通路,乙酰辅酶A引碳流入TCA循环,而丙酮酸、乙酰辅酶A、柠檬酸、α-酮戊二酸等都是谷氨酸生物合成前体,促使碳流进一步流入Glu-Orn循环,导致鸟氨酸循环及其前体物质全部上调(5-49倍)。RNAi抑制表达PtPEPCK1,产生了苹果酸向草酰乙酸,琥珀酸向富马酸方向的回补反应,这些物质是天门冬氨酸合成的前体,使植物开启苹果酸-天冬氨酸穿梭和转氨作用。
  转PtPEPCK1基因在氨基酸的生物合成通路、嘧啶代谢途径上变化较为明显,结果显示转PtPEPCK1基因引起氨基酸生物合成变化较为明显的主线有3条:(a)柠檬酸循环引起的酸性氨基酸家族生物合成途径的变化;(b)由糖酵解作用引起的脂肪酸家族氨基酸的生物合成途径的变化;(c)磷酸戊糖代谢途径的芳香族氨基酸的生物合成途径的变化。过表达PtPEPCK1在氨基酸的生物合成通路变化较为剧烈,过表达株系在嘧啶代谢通路上调基因较多。
  (7)对转基因植株进行代谢组学分析,结果显示转基因植株代谢物检测上有趋同变化,差异代谢物主要富集在碳、氮、有机酸代谢通路。碳代谢和有机酸代谢均下降,过表达样本下降幅度较大,氨基酸、修饰氨基酸、小肽在转基因植株中均升高,过表达升高幅度也较大。
  (8)对转基因植株的转录组数据和代谢组数据进行关联分析,结果显示转PtPEPCK1基因在碳代谢通路关联程度较低,氮代谢、氨基酸生物合成及相关支路关联程度较高。
[博士论文] 焦韵桐
果树学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:葡萄是世界性重要的经济类作物之一,特别是欧洲葡萄品种,其品质优良,具有很高的经济地位,但抗病性较差。中国是葡萄属植物的起源地之一,拥有丰富的抗性野生葡萄种质资源,这些资源具有良好的抗病性。其中,中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’具有高抗葡萄白粉病的特性;中国野生毛葡萄‘丹凤-2’的白藜芦醇含量较高。白藜芦醇属于芪类化合物,不仅是一类重要的植保素可以增强植物的抗病性,而且还具有清除活性氧、抗肿瘤、预防心血管疾病等医疗保健功能。
  本研究以高抗葡萄白粉病的中国野生华东葡萄‘白河-35-1’、高含量白藜芦醇的中国野生毛葡萄‘丹凤-2’为试材,通过生物和非生物胁迫处理,研究获得了调控芪合成酶基因的相关信号物质水杨酸,揭示葡萄中水杨酸信号物质调节芪合成酶基因表达产物抗白粉病的分子过程,也探究了MAPK级联途径对毛葡萄芪类物质积累的作用。
  取得的主要研究结果如下:
  1.从中国野生华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄‘佳利酿’基因组DNA中分别克隆获得了一对芪合成酶等位基因及其启动子序列。两个芪合成酶基因组序列结构分析表明:两条序列的STS基因序列部分高度保守(碱基序列相似度98.63%),均为1538 bp,包含一个内含子和两个外显子;外显子1的核苷酸长度为178 bp,内含子长度为360 bp,外显子2的长度为1000 bp;可编码392个氨基酸的蛋白(氨基酸序列相似度99.49%)。而各自的芪合成酶基因上游调控启动子序列同源性差异较大,主要表现为缺失;克隆获得的华东葡萄VpSTS启动子片段核苷酸长度为2264 bp,克隆获得的欧洲葡萄‘佳利酿’VvSTS启动子片段核苷酸长度为2021 bp;序列比对显示VpSTS启动子有一段18 bp的缺失,而VvSTS启动子有两段缺失,分别为13 bp和244 bp。
  2.构建了野生华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄‘佳利酿’芪合成酶基因启动子与GUS报告基因融合载体,稳定整合转化模式植物拟南芥中,应用Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)分析了两个转基因植株中GUS基因的表达模式。结果表明,‘白河-35-1’芪合成酶基因(VpSTS)启动子驱动的GUS基因在根、茎、叶片、花芽和果荚中均表达,而‘佳利酿’芪合成酶基因(VvSTS)启动子驱动的GUS基因仅在叶片中表达。用拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum strain UCSC1)侵染转基因拟南芥植株,结果表明:二者均为病原菌诱导型启动子,并且VpSTS基因启动子的活性显著高于VvSTS启动子。同时,构建了2个芪合成酶基因启动子与各自芪合成酶基因融合的植物表达载体,稳定整合转入模式植物拟南芥中。在接种拟南芥白粉菌情况下,转 VpSTS::STS基因植株的抗病性明显强于野生型和转VvSTS::STS基因拟南芥,且其叶片中芪类物质含量明显高于转VvSTS::STS基因的植株。
  3.构建了芪合成酶基因启动子与双荧光素酶报告基因融合载体,通过基因枪法瞬时转入欧洲葡萄‘黑比诺’悬浮细胞中,对启动子活性进行分析。结果表明,‘白河-35-1’ VpSTS启动子能够响应细菌鞭毛蛋白flg22的诱导,而‘佳利酿’VvSTS启动子对flg22则没有响应;两种启动子对紫外诱导和植物过敏性致病蛋白harpin诱导均无响应。在外源水杨酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)处理下,VpSTS启动子对水杨酸诱导的表达活性显著高于VvSTS启动子;两种启动子对MeJA的响应均相对较弱而且差异不显著。通过对水杨酸激活芪合成酶基因启动子过程中的信号通路分析,认为VpSTS启动子响应水杨酸时依赖于钙离子通道的打开、活性氧爆发、MAPK级联途径的激活以及茉莉酸的合成。
  4.从中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中克隆了促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶基因VqMAPKKK38,开放阅读框全长为1419 bp,定位于葡萄第5号染色体上,属于MAPKKK基因家族中的RAF类亚家族。该序列编码472个氨基酸,含有Gln203到Leu450的蛋白激酶催化结构域,其中包含一个Ser/Thr催化位点(VIHCDLKPKNILL)。应用qRT-PCR技术分析了VqMAPKKK38在生物和非生物胁迫下的表达模式,结果表明VqMAPKKK38响应葡萄白粉菌的侵染、高盐胁迫和低温胁迫,而不受高温胁迫和机械损伤的诱导表达。外源激素SA、MeJA、脱落酸(ABA)和乙烯(Ethylene)处理均能诱导VqMAPKKK38表达,其中VqMAPKKK38受SA诱导表达量最高。
  5.分别构建了中国野生毛葡萄‘丹凤-2’VqMAPKKK38基因过量表达和干扰表达的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化‘丹凤-2’叶片,结合qRT-PCR和HPLC技术,检测了上述两个表达载体转化的葡萄叶片中芪合成酶基因表达水平和芪类物质的含量。结果表明:VqMAPKKK38基因通过正向调控芪合成酶基因的表达而提高葡萄芪类物质的积累。而用钙离子通道抑制剂氯化钆和活性氧清除剂二甲基硫脲预处理后,再经氯化钙和过氧化氢处理的‘丹凤-2’叶片,检测其VqMAPKKK38基因表达量显著降低。结果证明钙离子信号和活性氧(ROS)信号位于VqMAPKKK38基因的上游,激活VqMAPKKK38的表达;同时也正调控葡萄芪合成酶基因的激活和芪类物质的积累。
  综上,中国野生葡萄芪合成酶基因的表达与产物的积累受信号物质水杨酸的调控;并推测中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中的MAPKKK38对芪合成酶基因的表达以及芪类物质的积累有着积极的作用。
[硕士论文] 徐克凡
海洋生物学 厦门大学 2017(学位年度)
摘要:核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating protein,RIPs)是一类具有细胞毒性的,特异性催化断裂核糖体大亚基rRNA N-C糖苷键的N-糖苷酶。RIPs具有对肿瘤细胞,动物病毒及多种植物病毒,植物病害真菌及农业害虫的抗性,在医学和农业上应用潜力巨大。RIPs广泛存在于高等植物中,且在同种中多态性丰富。多态性的发现对追踪RIPs的起源及其功能的深入研究有重要意义。
  本研究以艳紫三角梅为材料,通过克隆同源序列进行体外表达制备抗体,以亲和层析法分离纯化艳紫三角梅(Bougainvillea glabra)和红花三角梅(Bougainvillea spectabilis)中的天然Bouganin,然后通过对亲和层析分离的蛋白进行质谱法分析,确定Bouganin蛋白的多样性。本研究主要结果及结论如下:
  1.天然Bouganin确实存在多态性。在红花三角梅中发现3种异构体:Uuiprot编号分别为Q09EH2,A0A0D3RWN7和Q8W4U4。而在艳紫三角梅中发现了4种异构体,除红花三角梅的3种外,另有编号为Q5J7U5的异构体,为艳紫三角梅叶所特有。
  2.Bouganin在同种三角梅的不同器官中的种类基本相同,但各异构体在不同器官的相对含量存在较大差异。
  3.实验所发现的4种Bouganin异构体中,Q09EH2、Q5J7U5与Q8W4U4均为305个氨基酸组成,而A0A0D3RWN7仅含238个氨基酸。
  4.实验所发现的4种Bouganin异构体均具有一定的同源性,其中A0A0D3RWN7、Q5J7U5与Q8W4U4具有高同源性。
  接下来可首先改进亲和层析技术,提高实验结果的可重复性。之后对Bouganin多态性的研究可结合转录组学和结构生物学,从微观角度了解Bouganin异构体活性差异的结构基础。
[博士论文] 郭亚宁
作物遗传育种 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:衰老是植物生命的最后一个阶段,是植物适应外界环境、进化选择的结果。叶片是植物光合作用的主要场所,因此叶片衰老对于植物衰老具有非常重要的意义。棉花作为天然纤维的主要来源,为我国的纺织工业提供了大量的原材料。短季棉能够有效地缓解麦-棉争地的矛盾,但早熟往往伴随着早衰,而早衰严重影响棉纤维的产量和品质。NAC(NAM, ATAF1/ATAF2, CUC1)转录因子是植物特有的、较大的转录因子家族之一,它在调控植物生长发育过程的同时,参与植物对生物胁迫与非生物胁迫的响应。多项研究表明 NAC转录因子在不同植物的叶片自然衰老和胁迫衰老中发挥着关键的调控作用。棉花三个基因组(D、A和AD)数据测序的完成,丰富了基因组水平NAC转录因子的相关分析,但是棉花中关于 NAC单基因功能的研究相对较少。本研究主要阐述了陆地棉中GhNAC63和GhNAC79基因的功能,并对这2个基因相关的GT转录因子进行了相关分析。研究具体有以下几个方面:
  1、陆地棉中GhNAC63转录因子的克隆及功能鉴定
  在陆地棉中同源克隆得到JUB1的同源基因GhNAC63,利用基因组数据,克隆得到该基因的启动子序列;利用qRT-PCR,检测GhNAC63在不同组织、不同衰老特性短季棉品种子叶衰老过程中的表达模式、以及在不同培养条件下,对不同非生物胁迫的响应;通过XbaI和SacI酶切位点,构建35S-GhNAC63表达载体转入拟南芥,在纯合的T4世代进行表型观察;根据 pYL156-pYL192病毒体系诱导的基因沉默原理,降低棉花中GhNAC63的表达水平,观察棉株的表型。序列分析可知:GhNAC63包含保守的 NAM结构域,定位于scaffold246.1上,其启动子不仅包含基础顺式元件,同时包含涉及植物生长发育和胁迫相关的元件;基因表达模式分析可知:GhNAC63在纤维发育0DPA时优势表达,在花和茎中的表达水平相对较高,在根和纤维发育后期的表达水平较低,同时GhNAC63对乙烯处理敏感;转基因植物表型鉴定可知:35S-GhNAC63转基因拟南芥对干旱和乙烯胁迫的抗性降低,35S-GhNAC63转基因棉花的茎匍匐缠绕生长,不能形成花器官,相反地,降低棉花中GhNAC63的表达水平可使幼苗弥补VIGS注射造成的损伤,茁壮成长。本研究结果表明GhNAC63基因负调控植物生长发育,同时可能参与乙烯和干旱调控通路,丰富了 NAC转录因子在陆地棉中的功能研究,为后续该基因的研究奠定了基础和方向。
  2、GhNAC79基因在植物开花及抗旱中的作用
  根据陆地棉叶片衰老的RNA-seq数据库和基因组数据库,克隆得到GhNAC79基因及其启动子序列;根据GhNAC79的保守结构域特点,将其ORF划分为4部分,分别构建到pGBKT7载体中,转入酵母Y2H中验证GhNAC79的转录激活活性;构建启动子表达载体pGhNAC79-GUS,转入拟南芥,T0代转基因拟南芥经过GUS染色后,在体视显微镜下观察染色结果;利用qRT-PCR,探索GhNAC79的组织表达特异性、在子叶发育过程中的表达模式、以及对外界不同刺激的响应;构建35S-GhNAC79过表达载体,转入拟南芥和棉花,进一步对转基因植株进行表型观察;根据 pYL156-pYL192和pCLCrVA-pCLCrVB两种病毒体系介导的基因沉默原理,抑制GhNAC79在棉花中的表达,观察侵染后棉花的表型;利用酵母单杂交技术,挖掘GhNAC79上游调控因子。结果表明:GhNAC79定位于染色体骨架scaffold42.1上,包含3个外显子,2个内含子,同时GhNAC79因子具有转录激活活性,活性域位于C端。GhNAC79的启动子上除包含基础顺式元件外,同时包含多种胁迫响应相关的元件;GhNAC79在早衰品种中棉所10号的子叶衰老后期大量表达,其启动子在转基因拟南芥的子叶中特异表达;干旱能够显著性诱导 GhNAC79基因在叶片中的表达,而 GhNAC79过表达能够提高拟南芥和棉花对干旱的抗性,相反地,降低棉花中GhNAC79的表达水平,导致棉花对干旱的抗性降低。同时在干旱胁迫处理后,GhNAC79过表达转基因拟南芥和棉花的气孔开度显著性小于对照,气孔数目无明显差异,说明GhNAC79通过调节气孔开度调控植物对干旱的抗性。酵母单杂交的结果表明 GhNAC79基因的上游存在干旱响应因子,进一步证明GhNAC79参与干旱调控通路。本研究证明GhNAC79基因在植物干旱胁迫通路中发挥正调控作用,为棉花抗旱育种奠定分子基础,并提供转基因抗旱材料。
  3、陆地棉GhGTs转录因子的克隆和表达分析
  根据GhNAC63和GhNAC79的启动子分析结果可知,GhNAC63和GhNAC79的启动子上均包含GT光响应元件,GT转录因子能够结合到GT元件上,进而对光合作用进行调控。本研究基于棉花的3个基因组数据库对GT转录因子家族进行了基因组水平的分析。根据拟南芥和水稻中的GT转录因子,依赖于棉花3个mRNA数据库,通过同源检索得到67个GT转录因子,其中包含39个GhGTs(陆地棉),14个GaGTs(亚洲棉)和14个GrGTs(雷蒙德氏棉),对这67个GT转录因子进行染色体定位、聚类分析以及模体分析;根据陆地棉的39个GhGTs序列,从陆地棉衰老叶片中克隆得到8个GhGTs基因。利用qRT-PCR,分析这8个GhGTs基因在棉花根、茎、子叶、真叶、花和纤维中的表达模式,在不同非生物胁迫处理后的表达情况,在子叶和真叶发育过程中的表达模式;最后,筛选得到GhGT31基因,构建35S-GhGT31表达载体,转入拟南芥,并在纯合世代对转基因拟南芥进行表型鉴定,进一步分析GhGT31基因在植物中的功能。聚类和进化分析结果表明:GT转录因子在随着陆地棉的进化过程中变异较小,为纯化选择过程,39个GhGTs基因均匀地分布于不同亚类中,且同一亚类中水稻及拟南芥的GTs成员涉及不同的信号通路,说明GhGTs作用的广泛性,同时相同亚类中的GhGTs基因包含相似的模体结构;8个衰老相关基因的表达模式分析结果表明:8个GhGTs基因在子叶和真叶衰老过程中、以及在不同胁迫处理后,表现出不同的表达模式。除GhGT20外,其余7个GhGTs基因在根中优势表达,同时8个GhGTs基因在纤维发育后期的表达水平较高。GhGT12对ABA、乙烯和茉莉酸甲酯均敏感,并在中棉所10号子叶衰老后期上调表达,说明GhGT12可能是涉及激素介导的叶片衰老通路中的一个重要因子。GhGT31在早衰品种中棉所10号的子叶衰老后期高水平表达,同时对干旱处理敏感,35S-GhGT31转基因拟南芥提前抽薹,说明GhGT31可能参与了干旱相关的叶片衰老调控通路。本研究初步分析了陆地棉中GhGTs基因的功能,为后续研究棉花中的GT转录因子打下分子基础。
[博士论文] 韩叶
果树学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:柿果实采后极易软化,不利于鲜柿的贮藏和运输,影响其商品价值。木葡聚糖是高等植物细胞壁半纤维素的主要成分,半纤维素与纤维素微纤丝构成网状结构,对细胞壁的膨胀松软起限制作用,也是细胞壁的主要机械支撑物来源。木葡聚糖内糖基转移/水解酶(XTH)具有催化木葡聚糖分子水解和糖基转移的双重作用,它在植物生长发育、果实成熟软化及逆境胁迫抗性形成等过程中都发挥重要功能。
  目前XTH发挥功能的机制尚不明确,柿果实XTH基因的发掘和功能研究也鲜有报道。本文首先对柿果实中分离得到的XTH基因家族成员进行表达分析,筛选出参与果实生长发育和成熟软化的关键基因。其次利用体外诱导蛋白和亚细胞定位,在蛋白层面上分析关键基因发挥功能的作用机制。在此基础上,利用转基因手段系统研究柿DkXTH1和DkXTH8基因的功能,揭示XTH在果实生长发育、成熟衰老及逆境胁迫中的重要作用。主要研究结果如下:
  1.利用RACE技术从‘富平尖柿’中分离得到4条新的柿XTH基因,命名为DkXTH5-8。与DkXTH1-4类似,新基因均具有其他物种XTH的共同特征。聚类分析表明,柿DkXTH1-8基因被聚在Ⅰ/Ⅱ类中。XTH三维结构中Loop2的长度可以调节木葡聚糖内糖基转移酶和水解酶的比例。预测的DkXTH1和DkXTH2三维结构中,二者Loop2结构均包含5个氨基酸,与只具有转移酶活性的PttXET16A相同,但短于只具有水解酶活性的TmNXGl。
  2.利用qPCR分析8条柿XTH基因(DkXTH1-8)在‘富平尖柿’不同组织和果实生长发育过程中的表达特征。结果发现,DkXTH5和DkXTH1分别在果实第一和第二次快速膨大期出现表达高峰,DkXTH4则在两次快速膨大期均出现表达高峰,三者可能参与果实生长发育。此外,DkXTH1主要在幼嫩组织如幼叶和幼果中起作用,且与XET活性呈明显正相关,推测其与果实的快速膨大有关。DkXTH2、DkXTH3、DkXTH6和DkXTH8在成熟期果实中的表达均高于未成熟果实,可能参与果实后熟进程。尤其是DkXTH8基因的表达伴随着果实硬度的快速下降,其在果实中的表达量远高于其他如花、叶、茎和萼片等组织中的表达。
  3.以初熟期柿果实为材料,分析不同生长调节剂和冷藏处理对DkXTH1和 DkXTH8表达的影响。结果表明,DkXTH1在果实贮藏过程中表达量很低,但GA3和冷藏处理可以明显诱导该基因表达,可能与保持细胞结构完整、减缓果实硬度下降有关。不同的是, DkXTH8在果实贮藏过程中表达量明显上升,与果实硬度下降呈正相关。丙烯和ABA处理可以明显上调DkXTH8表达,GA3和冷藏处理则相反,推测DkXTH8与果实软化关系密切。
  4.利用原核表达体外诱导获得可溶性DkXTH1和DkXTH8蛋白,经镍柱纯化后发现二者均具有典型的木葡聚糖糖基转移酶活性,而无水解酶活性。体外获得的DkXTH1和DkXTH8蛋白最适pH分别为5.5和6.0,且pH从5降至4时酶活性显著下降。与DkXTH1相比,DkXTH8蛋白具有更高的XGOs亲和性。洋葱表皮亚细胞定位结果显示,二者均依靠信号肽结构定位于细胞壁中。
  5.过表达DkXTH1可以提高拟南芥逆境胁迫抗性,延缓转基因番茄果实后熟软化进程。在干旱、盐和ABA胁迫条件下,过表达DkXTH1的拟南芥种子发芽率显著高于野生型。受胁迫后转基因拟南芥幼苗和成熟植株叶绿素含量均显著高于野生型,同时丙二醛含量较低。与野生型相比,过表达DkXTH1的番茄果实在采后贮藏过程中转色慢、果实硬度高,同时乙烯释放及相关基因表达均低于野生型。显微结构观察发现,转基因番茄细胞胞壁及胞间部位密度增大,可能有利于保持细胞壁结构的完整性。
  6.过表达DkXTH1可以促进拟南芥叶片和茎的生长,促进转基因番茄果实膨大。转基因拟南芥叶片显著较野生型宽大,显微结构观察发现其茎组织中包含更多大体积细胞。绿熟期转基因番茄果实直径也显著大于野生型,过表达DkXTH1促进了番茄细胞膨大,可能由于DkXTH1过度参与细胞壁的整合作用导致的。
  7.过表达DkXTH8促进拟南芥离体叶片衰老,加速转基因番茄果实后熟软化进程。在黑暗条件下,转基因拟南芥离体叶片叶绿素含量快速下降,伴随着丙二醛含量的上升以及膜透性的增加。此外,与衰老相关的AtSAG12和AtSAG13基因表达量也显著高于野生型。过表达DkXTH8的番茄果实在采后转色迅速、硬度下降快,果实细胞完整性也更快被破坏。与野生型相比,转基因拟南芥和番茄细胞均呈现明显的弯曲形状,且细胞大小不均一,导致细胞间隙增加、相邻细胞的联系不紧密。这种改变可能是DkXTH8过度参与细胞壁重组导致的,它在一定程度上使细胞更易受到氧化胁迫损伤,进而加速植株衰老和果实软化。
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