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[硕士论文] 朱昶
森林保护学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:松脂二烯(Pinolene)是存在于松脂内的一种物质,为环烯烃二聚物,具有良好的成膜性。本论文以松脂二烯为研究对象,表征了松脂二烯的在叶片表面形态特征,分析了红叶石楠在松脂二烯处理前后的光合气体交换关键数据,分析了松脂二烯在雨水冲刷和光照下提高农药持效期能力。结果如下:
  1、成膜剂在叶片表面的成膜性能表征。采用PW-100-011扫描电镜对经成膜剂处理的红叶石楠叶、松针和山核桃叶表面进行了表征,松脂二烯和壳聚糖-聚乙烯醇在叶片表面形成了一层连续的膜。噻虫啉微胶囊颗粒在松脂二烯和壳聚糖聚乙烯醇复合膜下都得到了包被,松脂二烯在电镜下与叶片及药物亲和性好,而壳聚糖聚乙烯醇复合膜在叶片表面铺展性较差。松脂二烯浓度越高,噻虫啉颗粒被包裹更加严密,在噻虫啉微胶囊表面形成多道横向条纹。
  2、测定成膜剂对植物叶片光合作用影响。采用LI-6800便携式光合测定仪测定光合交换气体的关键数据,气体交换结果显示松脂二烯植物的蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)相比单独施用Th组显著下降,特别是3%Pinolene处理组中三个指标分别下降了15.47%,16.05%,5.73%,但对植物的净光合速率(Pn)影响不显著。由此表明,喷施松脂二烯可以抑制植物的气孔导度和蒸腾作用,但同时不会过多的影响植物的光合作用,因此松脂二烯可用于叶面喷雾成膜助剂。
  3、研究松脂二烯和农药混用后抗雨水冲刷能力。采用Waters-class超高效液相色谱仪检测经雨水冲刷后山核桃叶上的噻虫啉保持量。雨水冲刷0.5h,对照仅保留1.44%初始噻虫啉药量,添加1.2%松脂二烯和3%松脂二烯的处理组中,分别保留了初始药量的5.53%和19.07%,显著减少因雨水冲刷导致的农药损失量,从而延长噻虫啉药效,且高浓度松脂二烯抗雨水冲刷能力比低浓度更强。松脂二烯能够在植物叶表面成膜,锁住药物颗粒,提高农药抗雨水冲刷能力,减少了农药因雨水冲刷的损失。
  4、研究松脂二烯和农药混用后抗光解能力。采用Waters600型高效液相色谱分析经光分解后甲维盐的保持量,光照8h处理后,甲维盐对照组仅保留初始添加量的30.91%,而添加3%松脂二烯处理组保留了初始添加量的70.06%。表明松脂二烯能够有效地抵抗紫外线光解,减缓药物光解速度,从而延长农药的持效期。
  5、研究松脂二烯与农药混用对山核桃干腐病的田间防治效果。单独施用10%戊唑醇乳油、36%喹·戊悬浮剂和50%喹啉铜可湿性粉剂防效为34.01%、42.78%和36.18%,在农药中加入1.2%pinolene后,防效显著提高,分别达到50.95%、64.63%和61.93%。在农药中桶混成膜剂1.2%pinolene后进行喷雾防治,对山核桃干腐病有更好防治效果。
  松脂二烯能在植物叶片及枝干表面形成一层连续膜,帮助药物粘附在植物叶片表面,不影响植物光合作用,提高农药的抗雨水冲刷能力和抗光解能力,使农药在植物表面获得更长的持效期,松脂二烯来源松脂,属天然产物,对环境友好,适用于林间病虫害喷雾防治。
[硕士论文] 陈梦
微生物与生化药学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:硒是GSH-Px、IDI、TrxR等多种酶的组成成分。硒具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌症和抗衰老等功能,同时,硒可以拮抗(镉、铅等)或协同(锌、汞等)许多重金属,解除重金属的毒性。印度芥菜(Brassica juncea L.)作为被广泛研究的重金属超累积植物,对Cd、Ni、Zn、Cu和Se等都有富集效果,且富集重金属浓度范围广。硒代半胱氨酸甲基转移酶是硒元素在有机体内代谢途径的关键酶,由SMT基因编码,其对硒元素的解毒机制是将参与蛋白合成的SeCys转化成非蛋白氨基酸MeSeCys,因而不能替代硫代半胱氨酸参与到蛋白合成中,实现植物对硒的超富集。
  AP2/EREBP类转录因子参与信号级联放大系统和转录调控基因表达,是一类植物特有的、与胁迫应答有关的转录因子超家族。EeAP2.1、EeAP2.2属于长穗偃麦草AP2/EREBP类转录因子,含有AP2保守结构域。近年来,植物抗逆调控网络的研究越来越多,但对AP2/ERF家族转录因子调控网络的研究仍有较大空白,并且在长穗偃麦草中,此类转录因子未见报道。利用高通量测序技术,获得大量的基因组表达谱数据,可以对植物转录因子在生物及非生物逆境抗性中的作用机理进行整体、深入的研究,全面认识转录因子调控网络,为利用转录因子进行植物抗逆基因工程改良提供理论依据。
  通过对BjSMT转基因烟草与空载体转化烟草进行不同浓度亚硒酸钠胁迫,测定相关生长指标和生理指标,进行该基因的富硒功能研究;通过对EeAP2.1和EeAP2.2转基因烟草的RNA-Seq分析,解析二者所影响的抗逆代谢途径,揭示其抗逆相关的分子基础。取得的实验结果如下:
  1.在0~240μM不同亚硒酸钠浓度处理下,BjSMT转基因烟草在株高、鲜重等表型特征上均优于空载体烟草。
  2.测定了上述不同亚硒酸钠浓度处理下BjSMT转基因烟草和空载体烟草的叶绿素含量和GSH-Px活性,结果表明BjSMT转基因烟草比空载体烟草更耐受亚硒酸钠胁迫,显示了BjSMT基因过表达植株对高浓度亚硒酸钠有较强的耐受性。
  3.测定了0~120μM亚硒酸钠胁迫处理下的烟草总硒含量,结果显示,BjSMT转基因烟草和转空载体烟草本底总硒含量极少,而亚硒酸钠处理时,过表达BjSMT可显著提高烟草的总硒含量,表明BjSMT转基因烟草的硒富集能力优于转空载体烟草。
  4.构建了pBI121-EeAP2.1、pBI121-EeAP2.1-GFP、pBI121-EeAP2.2和pBI121-EeAP2.2-GFP真核表达载体,获得了相应载体的转基因烟草植株,并在基因水平上鉴定转化成功。
  5.利用qRT-PCR分析了苗期长穗偃麦草在10%PEG6000,125mM NaCl,4℃低温和20μM CdCl2胁迫条件下EeAP2.1和EeAP2.2的转录表达谱,初步鉴定了EeAP2.1主要响应干旱胁迫,而EeAP2.2主要响应高盐和低温胁迫。
  6.利用RNA-Seq技术分析了EeAP2.1和EeAP2.2转基因烟草的转录组,结果显示EeAP2.1转基因烟草和空载体烟草对比,差异基因在光合系统、水解酶活性、膜蛋白复合物、倍半萜类和三萜类生物合成和植物激素信号转导途径等途径增强植物的抗旱性。EeAP2.2转基因烟草和空载体烟草对比,差异基因在光合作系统、昼夜节律-植物、ABC运输、二苯乙烯类和姜酚生物合成、糖基磷脂酰肌醇(GPI)、锚定生物合成等途径增强植物的抗盐性和低温耐受性。
[硕士论文] 张丽娟
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:醇六磷酸(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate[InsP6])又称植酸,主要存在于植物的种子、根和茎中,是植物体中磷的主要储存形式。同时,植酸具有很强的螯合能力,能与多种矿质阳离子形成不溶性络合物。假设,肌醇六磷酸可能参与调节植物矿质阳离子依赖的生长表型。拟南芥中IPK1(inositol1,3,4,5,6-pentakisphosphate kinase-1)基因负责植酸的合成。本论文重点研究了IPK1基因启动子组织特异性活性;缺失IPK1基因突变体ipk1-1的矿质阳离子依赖性生长表型和相关元素含量,以及突变体对生物和非生物胁迫的反应。本论文主要研究结果如下:
  (1)将IPK1基因的启动子克隆到含有GUS报告基因的表达载体pGWB605上,花絮侵染转入拟南芥,获得稳定遗传的T3代植物。利用GUS组织化学染色法研究IPK1基因的表达模式,结果显示IPK1基因启动子在拟南芥的根、叶、花絮上均有活性。
  (2)ipk1-1具有高[Ca2+]敏感和抗低[Ca2+]的生长表型:在其他元素含量不变的情况下,培养基中[Ca2+]在0.2mM以上时,ipk1-1表现出植株矮小、根短、叶发黄的敏感现象;[Ca2+]在0.2mM时,ipk1-1长势同野生型Col-0一致;[Ca2+]低于0.2mM时,ipk1-1长势显著优于野生型Col-0。
  (3)ipk1-1具有不依赖于[Ca2+],的抗高[Mg2+]的生长表型:在0.01mM的[Mg2+]处理下,ipk1-1与野生型Col-0长势没有明显差异;而随着[Mg2+]的浓度升高至10mM,ipk1-1表现出根长、鲜重及长势显著优于野生型Col-0的现象。该突变体的抗高[Mg2+]的生长表型不受培养基[Ca2+]的影响。
  (4)ipk1-1具有不依赖于[Ca2+]的[Fe3+]敏感的生长表型:在低[Fe3+](0.01xFe3+)处理下,ipk1-1表现出植株矮小、根短、叶发黄的敏感现象;随着[Fe3+]浓度升高至1xFe3+时,敏感现象消失,ipk1-1长势同野生型Col-0一致;随着[Fe3+]浓度继续升高至5xFe3+,ipk1-1又表现出植株矮小、根短、叶发黄的敏感现象。随后将IPK1基因互补ipk1-1后,以上突变体的所有表型均恢复至野生型表型。
  (5)为了深入研究IPK1基因是否影响植物体对Ca、Mg、Fe等矿质元素的吸收和积累,通过电感耦合等离子体光谱仪(Inductive Coupled Plasma EmissionSpectrometer,ICP)测定了突变体ipk1-1体内Ca、Mg、Fe的总量。结果显示在不同浓度[Ca2+]、[Mg2+]、[Fe3+]处理ipk1-1和野生型Col-0,二者在体内Ca、Mg、Fe的总量上无显著差异,表明IPK1基因不参与植物体内Ca、Mg、Fe等元素的吸收和积累。
  (6)为了研究ipk1-1对于生物胁迫是否具有正常的抗病超敏反应(hypersensitiveresponse,HR),选择用非毒力病原菌株avrDC3000avrRPM1+来注射ipk1-1,结果显示ipk1-1具有正常的HR反应,表明IPK1基因不参与植物体抗病超敏反应。
  (7)为了研究IPK1基因的缺失是否会影响植物体对于其他非生物胁迫的反应,选择以氯化钠(NaCl)、山梨醇(sobitol)、脱落酸(ABA)作为其他非生物胁迫因素来处理ipk1-1,发现ipk1-1对NaCl、ABA胁迫更为敏感,表现为植株矮小、根短、叶发黄。而对sobitol胁迫的表型同野生型Col-0并无差异。后将IPK1基因互补ipk1-1突变体,以上非生物胁迫的敏感表型得以完全恢复,表明IPK1基因参与对于非生物胁迫的反应。
  基于植物体内植酸的含量对其矿质元素的体内平衡具有重要意义,本文中对IPK1基因的研究为后续优化农作物体内植酸的含量提供一定理论基础。
[硕士论文] 尹艳莉
生物学;植物学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:拟南芥卵形家族蛋白(Arabidopsis thaliana Ovate Family Proteins,AtOFPs)是一种新型的植物特有的转录因子,共包括19个成员,根据其过表达转基因拟南芥的表型特点将其分为3个亚类。AtOFP1被分为第Ⅰ亚类,已经被证明它能直接调控其下游的GA合成酶关键基因AtGA20ox,抑制其转录活性从而抑制细胞伸长,可以使拟南芥根、茎、叶、花器官、角果等表现出变小的性状。然而,AtOFP1本身没有可预测的DNA结合域,所以其对靶基因的转录调控需要通过和其它转录因子互作来发挥作用。
  TALE类同源结构域蛋白(Three-aa Loop Extension homeodomain protein)在植物发育过程中发挥核心作用。已有研究表明9个AtOFPs和TALE蛋白的同源结构域有紧密功能的联系,其中初步确定AtOFP1可以和TALE类蛋白的13个转录因子相互作用,包括KNAT5(homeobox protein knotted-1-like5),KNAT5在植物侧根原基表达,可能与侧根的形成有关,但是具体功能未知。目前,对于蛋白互作的研究越来越多,足以说明这种相互作用对植物生长发育有着毋庸置疑的作用。
  本研究为确定AtOFP1与KNAT5是否相互作用及其作用后的功能,首先采用定向的酵母双杂交技术验证其存在蛋白相互作用,然后再用双分子荧光互补的方法,进一步确定OFP1在体内与KNAT5可在植物细胞内发生蛋白互作。另一方面,以野生型(Col-0)拟南芥、atofp1突变体植株、35S:HA-OFP1转基因植株、knat5突变体植株及35S:HA-KNAT5转基因植株为试验材料,对它们的植株表型进行分析,然后,通过qRT-PCR方法对拟南芥OFP1及KNAT5基因进行定量分析,并在外源赤霉素处理下分析OFP1及KNAT5基因的表达情况。主要方法与结果如下:
  (1)利用酵母双杂交技术,将获得的OFP1基因全长,KNAT5基因全长分别构建到pGADT7载体和pGBKT7载体中,共同转化到Y2HGold酵母菌株中,观察显示,AtOFP1可以与KNAT5相互作用;
  (2)利用双分子荧光互补技术,将AtOFP1与KNAT5分别亚克隆至pS AT6-nEGFP-N1和pSAT6-cEGFP-N1中,然后利用聚乙二醇转化法将其共转化到拟南芥原生质体中,进一步证明AtOFP1可以与KNAT5在体内发生互作;
  (3)筛选knat5纯合体突变体,并构建HA-KNAT5过表达转基因植株,观察其根部的变化情况,发现ofp1突变体及knat5突变体植株出现明显的侧根数增多,HA-OFP1过表达体侧根数减少,说明其能影响侧根数目,然而在对根的观察中,ofp1突变体及knat5突变体植株根长无明显变化,但是HA-OFP1过表达体植株根长明显变短;
  (4)通过qRT-PCR方法分析野生型拟南芥、atofp1突变体拟南芥、35S:HA-OFP1转基因拟南芥植株、knat5突变体拟南芥及35S:HA-KNAT5转基因拟南芥植株中OFP1及KNAT5基因在其根及叶中的表达情况,发现在植物生长过程中OFP1与KNAT5存在协同表达。
  (5)通过让拟南芥种子短时间内在不同浓度的GA培养基生长,分析OFP1基因及KNAT5基因表达情况,发现,OFP1基因和KNAT5基因在外源赤霉素处理下依然存在协同表达,而且外源赤霉素使得OFP1及KNAT5基因的表达量出现明显上升。
  综上所述,本研究根据酵母双杂交结果及BiFC结果证明了OFP1及KNAT5在体内的相互作用,在拟南芥根和叶中,OFP1基因及KNAT5基因存在协同表达,且它们的突变体植株在侧根数及根长的表型分析上也具有相似性,所以OFP1和KNAT5可能通过相互作用形成OFP1-KNAT5复合体共同影响侧根数目和根长,对植物生长发育有重要影响。另外,在外源GA处理下,qRT-PCR数据依然显示OFP1和KNAT5基因协同性表达。
[硕士论文] 阮凤英
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:SMC5/6复合物是广泛存在于生物体中的一种蛋白复合物,研究表明SMC5/6复合物与同源重组修复,核糖体DNA及异染色质的结构维持,端粒延伸和染色质的拓扑结构调节密切相关。SMC5/6复合物由两种SMC蛋白,SMC5和SMC6,和多个Nse亚基组成。大部分生物体内只发现Nse1-Nse4这4种亚基。近年来相继在在酵母、拟南芥和人中发现了两个新的Nse亚基,Nse5和Nse6,并发现它们调控SMC5/6与DNA损伤位点的结合并进行DNA损伤修复。在拟南芥中,Nse5和Nse6的同源蛋白分别为ASAP1和SNI1。此前有研究表明SNI1是植物获得性免疫的负调控因子,能够抑制防卫基因的表达。SNI1的双重身份表明植物的免疫反应和DNA的损伤修复存在某种关联,而SNI1在其中可能发挥着十分关键的作用。为了揭示其中的分子机理,我们决定对ASAP1-SNI1复合物进行结构生物学研究。
  本研究对ASAP1-SNI1复合物的结构生物学研究进行了初步探索:1)我们尝试在大肠杆菌中单独重组表达ASAP1和SNI1,但两者均在包涵体中且难以纯化;2)我们将SNI1与ASAP1进行共表达,成功纯化出性质良好均一的ASAP1-SNI1复合物蛋白,验证了ASAP1和SNI1的直接相互作用;3)我们对ASAPI和SNI1进行约200多种截短体蛋白筛选,确定了它们的相互作用区域,并进行约24000多个晶体条件筛选,遗憾的是暂未获得晶体。
  本研究中虽然未能获取ASAP1-SNI1复合物的晶体,但对ASAP1-SNI1的表达条件进行了优化,并确定了ASAP1-SNI1复合物的互作区域,为后续开展ASAP1-SNI1复合物结构与功能研究提供了一定基础。
[硕士论文] 胡银梦
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:果蝇的SINA(seven in absentia)蛋白是泛素-26S蛋白酶体降解途径中RING-finger类型的E3泛素连接酶。在植物中,SINA同源蛋白主要在生长发育和外界环境胁迫响应等方面起关键作用。在拟南芥中,SINATs(SINA of Arabidopsis thaliana)受到光信号的调控。SINATs蛋白从光下移动到暗处后蛋白量明显减少,然而SINATs如何响应光信号却是未知的。本论文以拟南芥为研究材料,通过生物化学、细胞生物学、植物生理学、遗传学等方法,系统研究了拟南芥中光信号调控SINATs蛋白降解的分子机制。主要结果如下:
  SINATs蛋白从光到暗的降解是自我调控降解。首先通过转基因方法分别获得E3泛素连接酶活性缺失形式的SINATs过表达系:35S∷SINAT2C63S-FLAG和35S∷SINAT4C67S-FLAG。当35S∷SINAT2C63S-FLAG和35S∷SINAT4C67S-FLAG过表达系从光下移动到暗处时,SINAT2C63S和SINAT4C67S蛋白量未发生明显变化。其次对35S∷SINAT2C63S-FLAG和35S∷SINAT2-FLAG过表达系进行qRT-PCR和蛋白定量分析,发现35S∷SINAT2C63S-FLAG过表达系中SINAT2C63S蛋白较35S∷SINAT2-FLAG过表达系中SINAT2蛋白更加稳定。最后对35S∷SINAT2-FLAG和35S∷SINAT2C63S-FLAG过表达系进行SINAT2蛋白半衰期检测,发现35S∷SINAT2-FLAG过表达系中的SINAT2蛋白比35S∷SINAT2C63S-FLAG过表达系中的SINAT2C63S蛋白降解的更快,明确了35S∷SINAT2C63S-FLAG中SINAT2C63S蛋白更加稳定。以上结果表明SINATs蛋白的稳定性依赖于自身E3泛素连接酶活性。
  光受体phyB是调控SINATs蛋白稳定性的关键因子。已知SINATs受到红光,蓝光的调控,且SINATs在黑暗中的降解不依赖COP1,分别检测了SINATs蛋白与红光受体phyB和蓝光受体CRY1是否互作,发现SINATs与两者均在细胞质中相互作用。接下来,获得了35S∷SINAT2-FLAG/phyB-9纯合杂交系植株,发现在phyB-9突变体背景下,SINAT2蛋白的蛋白量在光下和黑暗中均不发生明显变化。同时对35S∷SINAT2-FLAG/phyB-9杂交系和35S∷SINAT2-FLAG过表达系分别进行qRT-PCR和蛋白定量分析,发现在phyB-9突变体背景下,SINAT2蛋白变得更稳定,表明phyB与SINATs蛋白的互作可能促进了SINATs蛋白的降解。
  因此,发现:SINATs作为蛋白稳定性的调控者它又能调控自身的蛋白稳定性,以及26S-泛素蛋白酶体途径参与调控光信号通路的新机制。对SINATs响应光信号调控机理的深入了解不仅有利于拟南芥光形态建成理论基础的奠定,而且对其他植物响应光信号调控的认识具有重要的指导意义。
[博士论文] 汪秀志
发育生物学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:紫外光诱导花青素合成是植物光形态建成的一种响应,是由光受体及其信号分子共同协调调节。本实验室前期研究显示:津田芜菁‘Tsuda’的膨大肉质根表皮花青素合成受UV-A单色光及蓝光+UV-B复合光的诱导,有哪些光受体和信号转导因子参与该过程尚不清楚。为研究非模式植物津田芜菁对UV-A和蓝光+UV-B的反应及相关信号调控,解析芜菁中紫外光信号转导调控途径,本研究对实验室前期所获得的系列光不敏感型花青素合成突变体进行了初步鉴定包括突变表型稳定遗传突变体的F2群体构建及遗传分析、花青素合成相关基因表达初步分析,高通量测序结合MutMap分析对三个目标突变体g56w、g97w和g142w进行候选基因初步定位,获得以下结果:
  1.光不敏感型花青素合成突变体的遗传及下游基因表达分析
  野生型与花青素合成相关突变体膨大肉质根表皮见光及未见光部分的花青素含量测定揭示野生型津田芜菁花青素合成属光敏感型花青素合成模式,而突变体花青素合成模式则为光不敏感型花青素合成模式。
  突变体g56w、g83w、g97w、g140w、g141w、g142w和g143w在光照条件下无花青素合成,属于花青素缺失突变体表型,且经多代自交后其突变性状稳定遗传。不同突变体系之间测交分析显示,突变体之间杂交的F1代表型和野生型表型一致,推测本研究中获得的7个花青素缺失突变体的表型为不同位点突变导致。突变体g56w、g83w、g97w、g140w、g141w、g142w、g143w和g19r与野生型芜菁分别构建F2群体,表型调查及F2群体中单株个体花青素含量测定分析显示:g56w、g83w、g97w、g142w和g143w后代F2群体中,野生型表型个体与突变体表型个体分离比符合3∶1,推测g56w、g83w、g97w、g142w和g143w的花青素缺失表型性状受隐性单基因控制,花青素组成型合成突变体g19r的突变表型为单基因显性遗传,g140w和g141w不符合孟德尔遗传。
  突变体及野生型花青素合成相关基因定量PCR分析结果显示:与野生型相比,花青素合成缺失突变体g56w、g83w、g97w、g142w和g143w中花青素合成途径的多数结构基因及转录因子的表达显著下调,如BrCHS、BrCHI、BrANS、BrDFR和BrTT8、BrPAP1等。而花青素组成型合成突变体g19r的花青素合成相关结构基因及转录因子则为显著上调表达,因此推测:控制突变体性状的突变基因是非结构基因突变导致的突变表型,该突变基因可能位于花青素合成途径的上游光信号网络通路中,从而能够抑制光诱导花青素的合成或调控花青素组成型的合成。
  2.花青素缺失突变体g56w和g97w的突变基因初步定位
  利用重测序结合MutMap方法进行突变体目标性状候选基因的初步定位,采用HRM技术进行后续的候选SNP位点的F2群体表型连锁分析,进一步将g56w突变位点定位在A07染色体的16,825,203到17,401,586之间的区域,间距576kb。g97w突变位点初步定位在17,221,786到17,341,239之间区域,间距119kb,主要包括具备甲基转移酶、跨膜受体蛋白、核苷酸结合蛋白、锌指蛋白、蛋白激酶、蛋白质氨基磷酸化、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶功能与活性的侯选基因。
  3.花青素缺失突变体g142w的突变基因定位
  以不同短波长光质(UV-A、蓝光和蓝光+UV-B)处理野生型芜菁和突变体g142w幼苗,结果表明野生型和g142w下胚轴花青素积累模式不同,推测突变体g142w可能是我们的目标突变体。利用HPLC比较野生型与突变体g142w中花青素类化合物的组成成分,结果显示:突变体花青素积累量发生改变,而合成代谢途径尚未发现变化。利用重测序结合MutMap方法进行突变基因定位,候选基因定位在A07号染色体的16.0Mb-18.0Mb区域内,同时利用HRM技术进行候选SNP的F2群体表型连锁分析,进一步将突变位点定位在A07染色体的16,902,778到17,061,871区域,间距159kb,结合SNP index>0.8进行候选基因筛选后,该区间内包括聚半乳糖醛酸酶、酰基载体蛋白、钙调蛋白结合蛋白、受体激酶、生长素响应因子等8个功能基因。利用RNA-seq结合定量PCR数据分析推测Bra004127、Bra004129和Bra004136基因可能为候选基因。
  以上结果表明所获得的突变体g56w、g97w和g142w均具有花青素合成非敏感型的特性,因此,控制这一突变性状的候选基因可能参与依光型花青素合成的生物过程,这为深入分析UV-A和蓝光+UV-B诱导的植物花青素合成途径奠定了基础。
[硕士论文] 包向男
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:锌(Zn)是动植物体内非常重要的一种微量元素,Zn营养平衡失调会影响动植物的生长和健康。本实验室前人发现在相对高的Zn2+培养条件下,At3g08650的T-DNA插入拟南芥突变体幼苗生长受到抑制,叶片叶脉周围细胞早衰,即出现高锌敏感表型,表明At3g08650可能参与调控植物叶细胞Zn2+营养平衡,因此将该基因命名为ZNE1(ZINC NUTRITION ESSENTIAL1)。
  本论文对ZNE1是否参与Zn2+转运以及ZNE1功能位点的鉴定展开研究。首先将ZNE1克隆入酵母表达载体pFL61,并将其转化进Zn吸收缺失型酵母突变体zrt1zrt2(ZHY3)中进行酵母异源功能互补实验,结果显示,ZNE1基因使酵母突变株ZHY3恢复Zn2+吸收功能,即证实ZNE1具有Zn2+转运功能。随后为了鉴定ZNE1基因的功能位点,通过KinasePhos网站预测了ZNE1的10个磷酸化位点,并对其进行了单碱基(S39A,W105R,G115R,S133A,G144D,S185A,G189V,V192L,S560I,T584A),双碱基(S185A,G189V)以及三碱基(S185A,G189V,V192L)突变。将含有点突变的ZNE1基因克隆入pFL61质粒并转化进ZHY3中,实验结果显示,转化后的酵母突变株均不能使ZHY3恢复Zn2+吸收功能,说明这10个磷酸化位点是Zn2+转运相关的功能位点。最后通过等温滴定微量热法确定ZNE1的Zn2+结合位点,通过TMHMM网站对ZNE1进行分析,发现其具有14个跨膜区域,膜外有8个短肽(被命名为outside1-8),膜内有7个短肽(被命名为inside1-7)。用超灵敏等温滴定微量热仪MicroCal iTC200测定ZnSO4滴定不同短肽的热力学数据,根据滴定曲线确定Zn2+结合短肽,结果显示inside2和outside1是与Zn2+发生结合反应的重要短肽。通过MicroCal iTC200以及酵母异源功能互补实验,进一步确定126位的赖氨酸和131位的组氨酸是ZNE1的Zn2+结合位点。ZNE1功能的研究有助于揭示植物Zn稳态调控的分子机制,为后续培育合理的Zn营养作物奠定基础。
[硕士论文] 赵亚林
发育生物学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:START(the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains)结构域是含有200个氨基酸左右的序列,在植物、动物及细菌中都广泛存在含有编码START保守结构域的基因。已有报道表明植物中START结构域往往辅助其它结构域共同调控着植物的生长发育,但生物信息学分析表明拟南芥能编码START结构域蛋白的基因共有35个,除与HD、HD-ZIP、HD-ZLZ等结构域共同存在的START结构域家族成员外,还有9个仅含START结构域的亚家族成员,对这些成员功能的分析有助于人们对START结构域功能的认知。我们前期工作已对仅含START结构域的4个成员进行了生物学功能分析,这些基因有着各自不同的时空表达特性,参与到不同的逆境胁迫和生长发育调控中。
  拟南芥PCST5(由At5g54170编码)是拟南芥START结构域蛋白家族中的第5个成员,其在调控植物生长发育方面的功能未知,本研究对PCST5的功能和作用机制进行分析,对深入阐明START结构域的功能及其在植物生长发育过程的调控中具有重要理论和应用价值。
  通过生物信息学分析可得知,PCST5基因的片段总长度为1350bp,位于拟南芥第5条染色体上,编码共含有449个氨基酸的蛋白质,该蛋白质仅含有一个START结构域,结构域内有磷脂酸胆碱的结合位点,PCST5编码的蛋白质具有两个跨膜的片段。这为我们研究其功能提供了重要的参考价值。
  PCST5的表达模式分析
  (1)PCST5时空表达特性:PCST5主要在拟南芥的幼苗期表达,子叶、真叶以及根中有较多的表达,叶片中主要在叶脉中表达,随着发育时间的延长,在叶和根中的表达降低,成苗期主要分布在叶柄基部和花器官的花药中表达,同时在花瓣和萼片的表达量也较少。
  (2)PCST5的亚细胞定位:PCST5定位在细胞质膜上。
  PCST5的生物学功能分析
  通过创制PCST5的功能获得和缺失的转基因拟南芥,对其表型和抗逆性进行分析,结果表明PCST5参与拟南芥的抽薹开花和逆境的调控:
  (1)PCST5对拟南芥花期的调控。
  与野生型拟南芥相比,过表达PCST5的转基因植株抽薹时间提前4d左右。为研究其调控拟南芥开花的分子机制,本研究分析了PCST5对开花关键基因SPY、FLC(FLO WERING LOCUS C)、CO(CONSTANS)、FT(FLOWERING LOCUST)、LFY(LEAFY)的表达量的影响,抑制开花的SPY和FLC基因的表达,促进FT、LFY基因的表达,从而促进提前抽薹开花。
  (2)PCST5对拟南芥抗逆性的调控。
  由于PCST5的START结构域内具有磷脂酰胆碱结合位点,而且知道磷脂酰胆碱是细胞膜的主要成分,因此START结构域可能影响细胞膜的稳定性,参与调控拟南芥的抗逆反应。研究发现,在渗透胁迫(NaCl和甘露醇处理)下,PCST5和T-DNA插入突变体的种子萌发均受到轻微抑制,但幼苗耐渗透胁迫能力增强。在热和冷冻胁迫(45℃和-7℃)条件下,PCST5和T-DNA插入突变体抗热和冷的能力高于野生型拟南芥。说明PCST5在拟南芥不同时期及相应不同的胁迫信号具有不同的作用机制。
  为明确PCST5参与调控拟南芥抗渗透胁迫能力的分子机制,本研究分析了PCST5对拟南芥盐诱导关键基因SOS1、NHXI以及与细胞膜稳定性相关的FAD2基因。和其它株系相比,发现PCST5过表达突变体和T-DNA插入突变体中SOS1变化不明显,而NHXI的表达量呈现下降的趋势,说明PCST5可通过间接调控上述相关基因的表达来调控拟南芥的耐渗透胁迫能力。同时测定其相对电导率的变化情况,过表达株系的电导率值相对较高。
  为明确PCST5调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制,本研究分析了PCST5对拟南芥热诱导关键基因(热激蛋白转录因子)HsfA1e、HsfA1α、HsfA1b、HsfA1d和冷胁迫关键基因P5CS1表达量的影响。结果表明,PCST5表达量升高后明显诱导HsfA1e、Hsf1α、HsfA1b、HsfA1d的表达量,并且促进P5CS1的表达,此为PCST5调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制提供了理论基础。
  综上所述,本论文明确了PCST5的时空表达特性;确定了其参与拟南芥种子萌发、抽薹开花和逆境调控方面的功能;分析了PCST5对拟南芥抽薹开花、盐、干旱、冷、热信号转导途径关键基因表达量的影响,对深入分析PCST5调控拟南芥生长发育的作用机理具有重要的意义。
[硕士论文] 高天
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:钙和铁是植物生长发育所必需的营养元素,在植物生长发育过程中起着重要的作用。生物体细胞中核糖体新合成的蛋白质生物分子大部分是没有活性的,需要经过一系列精确的翻译后修饰的加工,才能够成为有生物学功能的蛋白质生物分子。糖基化修饰是植物细胞中常见的翻译后修饰,寡糖基转移酶(oligosaccharyltransferase,OST)在糖基化修饰的过程中起着重要的作用。STT3B(staurosporin andtemperature sensitive3-like b)是寡糖基转移酶(OST)的活性亚基。近年来,关于STT3B基因的相关报道很少,主要集中在哺乳动物,在植物中的相关报道比较少。关于AtSTT3B蛋白在植物Ca2+和Fe2+依赖性生长方面的功能、植物响应盐胁迫过程中的功能及在植物体内确切的亚细胞定位尚未有报道。
  运用生物信息学方法对AtSTT3B基因及其编码蛋白质的氨基酸序列、理化性质、保守结构域和跨膜结构域等进行预测分析,系统地研究了AtSTT3B基因及其编码蛋白质的特征,为AtSTT3B生理功能的研究提供理论依据。以模式植物拟南芥为实验材料,对AtSTT3B在植物体内的生理功能进行了一系列研究。发现AtSTT3B特异性调节拟南芥Ca2+依赖性和Fe2+依赖性根的生长并在植物响应外界盐胁迫的过程中起着重要的作用。发现atstt3b突变体在糖基化抑制剂衣霉素的培养基上,叶的生长被显著抑制。为了研究AtSTT3B基因是否影响植物对Ca、Fe矿质元素的吸收和积累,通过电感耦合等离子体光谱仪(ICP)对植物中Ca、Fe的含量进行测定。发现AtSTT3B基因不参与植物对Ca、Fe矿质元素的吸收和积累。运用GUS组织化学染色法研究AtSTT3B启动子的组织特异性表达模式,发现AtSTT3B启动子在侧根生长部位及主叶脉有强活性。通过构建编码AtSTT3B和绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因,并借助烟草瞬时转化表达体系,研究AtSTT3B蛋白的亚细胞定位,发现AtSTT3B定位在内质网。本研究用辣根过氧化物酶抗体和刀豆蛋白A检测生长在全营养培养基和低钙培养基上的Col、atstt3b的总蛋白N-糖基化程度,发现AtSTT3B在植物体内不参与调节蛋白N-糖基化过程以及低钙胁迫下蛋白N-糖基化过程。本研究用蛋白质二硫键异构酶抗体检测生长在全营养培养基和低钙培养基上的Col、atstt3b的蛋白质二硫键异构酶,发现植物体内蛋白质二硫键异构酶参与植物响应低钙胁迫,但AtSTT3B基因缺失对蛋白质二硫键异构酶参与植物响应低钙胁迫没有影响。
  综上所述,本论文以模式植物拟南芥为实验材料,研究了AtSTT3B蛋白在植物Ca2+和Fe2+依赖性生长方面的功能、植物响应盐胁迫过程中的功能及在植物体内确切的亚细胞定位,为完善AtSTT3B基因功能及发掘植物适应土壤钙和铁贫瘠及耐盐的基因提供了理论基础,有助于解决植物缺铁缺钙问题及培育耐盐植物,且有助于更好地揭示植物响应逆境胁迫的机制。
[硕士论文] 闫青地
植物学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:START(StAR-related lipid-transfer)结构域广泛存在于生物体内。在动物中,START结构域家族成员往往仅含1个START结构域,与磷脂运输和脂质代谢有关,START结构域氨基酸发生变化后会导致先天性疾病(如先天性类脂性肾上腺增生等)。拟南芥中START结构域家族有35个成员,包括仅含START结构域的9个成员、既含START又含HD-ZLZ结构域的16个成员、既含START又含HD-ZIP结构域的5个成员、既含START又含PH结构域的5个成员。但至今START结构域在植物中的功能仍不清楚,因此,研究仅含START结构域蛋白质的功能,对揭示植物中START结构域作用具有重要意义。
  PCST6(由At1g64720编码)是拟南芥中仅含START结构域家族成员,本研究对PCST6启动子顺式作用元件、蛋白结构、时空表达特性、生物学功能及作用机制进行了分析,获得以下主要结果:
  1.PCST6生物信息学分析
  PCST6由385个氨基酸组成,仅含STAR结构域,具有磷脂酰胆碱结合位点,为类球体含疏水空腔的蛋白,PCST6启动子区含有低温等逆境响应元件。
  2.PCST6的表达模式
  (1)PCST6组织定位分析
  构建PCST6组织定位载体,获得PCST6组织定位转基因拟南芥,分析发现:在成熟的种子中PCST6表达量很低,几乎不能染色;随着种子的吸水萌动,PCST6表达量迅速增加;但在幼苗中,PCST6表达量迅速减少,随着幼苗发育时间的延长,叶片中PCST6表达量增加,21d的幼苗中表达量最高,但随后随着拟南芥的成熟衰老,PCST表达量又开始下降;叶片中PCST6主要在叶脉中表达;花中PCST6主要在花瓣中表达。
  (2)PCST6基因时空表达的实时定量PCR分析
  PCST在根、叶、花、角果等拟南芥各个组织中都有表达,但在莲座叶中表达量最高;随着拟南芥的生长发育,PCST基因表达量呈先升高后下降的趋势,随着拟南芥幼苗的发育,PCST表达量逐渐升高,在第21d表达量达到最高,随着拟南芥的成熟,PCST6表达量开始下降。
  (3)PCST6的亚细胞定位
  PCST6在细胞中主要定位在细胞质膜上。
  3.PCST6生物学功能及分子机制分析
  (1)PCST6功能获得和缺失的转基因材料的创制
  本研究创制了PCST6功能获得(过表达,OE)和缺失(T-DNA插入,pcst6)的转基因拟南芥,在生长发育表型上并没有明显差异。
  (2)PCST6受各种非生物胁迫的诱导
  利用qRT-PCR分析技术,对非生物胁迫(NaCl、甘露醇、冷、热和ABA)下PCST6的表达量进行了分析,发现PCST6的表达受各种胁迫的诱导。
  (3)PCST在拟南芥耐NaCl胁迫过程中的功能分析
  在不同浓度NaCl处理下,过表达PCST6的转基因拟南芥种子萌发率均高于WT种子萌发率,T-DNA插入突变体pcst6种子萌发率降低,表明在种子萌发过程中PCST6的表达升高增加了对盐渗透胁迫的耐受性。但在幼苗期,T-DNA插入突变体pcst6幼苗对NaCl的耐受能力增加。这说明在种子萌发和幼苗期PCST对NaCl胁迫所起的作用不同。
  为探讨PCST6如何参与盐胁迫信号的途径,本研究分别对种子萌发期和幼苗期的PCST6相关转基因拟南芥中盐胁迫关键基因SOS1、SOS2、SOS3、HKT1的表达量进行了分析,结果表明:在种子萌发和幼苗发育阶段,PCST表达量的高低对SOS1、SOS2、SOS3、HKT1的影响不同。在种子萌发阶段,NaCl胁迫处理后,过表达PCST6转基因中SOS1、SOS2、SOS3基因被迅速诱导表达,HKT1基因表达无明显变化;而T-DNA插入突变体pcst6中SOS1、SOS2、SOS3基因几乎没有变化,HKT1基因被迅速诱导。在幼苗期,NaCl胁迫下,过表达PCST6对SOS1、SOS2、SOS3基因表达无明显影响,但HKT1被明显诱导,T-DNA插入突变体pcst6中SOS1、SOS2、SOS3基因被明显诱导表达,HKT1基因无明显变化。说明在种子时期和幼苗时期PCST6对NaCl胁迫的调控机制不同。
  (4)PCST在拟南芥耐甘露醇胁迫过程中的功能分析
  在不同浓度甘露醇处理下,与野生型对照相比,过表达PCST6的转基因拟南芥和T-DNA插入突变体pcst6无论在种子萌发还是在幼苗期对甘露醇的敏感性无明显差异。
  (5)ABA处理对PCST6转基因拟南芥的影响
  在不同浓度ABA处理下,与野生型对照相比,过表达PCST6的转基因拟南芥和T-DNA插入突变体pcst6种子萌发无明显差异。
  (6)PCST6在拟南芥耐冷、热胁迫过程中的功能分析
  在12℃处理下,过表达PCST6的转基因拟南芥种子萌发明显受到抑制。在45℃处理下,T-DNA插入突变体pcst6种子萌发明显受到抑制,过表达PCST6的转基因拟南芥和T-DNA插入突变体pcst6幼苗对热胁迫抗性均明显增强。
  为探讨PCST6在热胁迫信号途径的地位,本研究分别对种子萌发期和幼苗期的PCST6相关转基因拟南芥中热诱导关键基因HsfA1a、HsfA1b、HsfA1d、HsfA1e、HsfA2和HsfB2b表达量的分析,结果表明:在种子萌发和幼苗发育阶段,PCST6表达量的高低对HsfA1a、HsfA1b、HsfA1d、HsfA1e、HsfA2和HsfB2b的影响不同。45℃处理种子后,PCST6过表达转基因拟南芥种子中HsfA1b、HsfA1d和HsfA1e基因受诱导表达,HsfA1a、HHsfA2和HsfB2b基因不受诱导表达;而T-DNA插入突变体pcst6种子中只有HsfA1a基因受诱导表达,HsfA1b、HsfA1d、Hsf1e、HsfA2和HsfB2b基因不受诱导表达。45℃处理幼苗期后,PCST6过表达转基因拟南芥幼苗中HsfA1b、HsfA1d、HsfA1e、HsfA2及HsfB2b基因受诱导表达,只有HsfA1a不受诱导表达;T-DNA插入突变体pcst6中HsfA1a、HsfA1b基因受诱导表达,而HsfA1d、HsfA1e、HsfA2和HsfB2b基因不受诱导表达。表明PCST6在种子萌发和幼苗时期对热胁迫的调控机制不同。
[硕士论文] 刘子赫
生物工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:在植物体的生长发育过程中,磷元素是必不可少的一种大量元素。土壤中磷元素的含量虽然很丰富,但是可以被植物体直接吸收并利用的磷元素含量并不高。因此在众多限制农作物产量的因素中,磷元素含量是一种很关键的因素。PHR是植物体内的一种转录调控因子,负责调控植物体内磷饥饿响应基因的转录;SPX1是植物体内的一种磷响应蛋白,两种蛋白可以相互作用,并在植物磷元素含量水平的调节上具有重要作用。对两种蛋白复合物的结构研究可以帮助人们更好地了解植物体内磷平衡的调节机制,继而为培育能够高效吸收和利用土壤中有限磷元素的农作物提供理论支持。
  本论文成功构建了拟南芥PHR1(208-362aa)及水稻PHR2(243-426aa)、SPX1(1-295aa)共三种重组质粒。通过在蛋白N端连接组氨酸标签,使三种蛋白在大肠杆菌表达系统中成功表达,再通过镍柱亲和层析,及分子筛凝胶层析的方法成功得到纯度达到95%以上的蛋白。在得到状态均一、纯度较高的蛋白后,分别对AtPHR1(208-362aa)/OsSPX1(1-295aa)及OsPHR2(243-426aa)/OsSPX1(1-295aa)进行了蛋白结合实验,在尝试了多种孵育方法后,获得了AtPHR1/OsSPX1及OsPHR2/OsSPX1两种蛋白复合物。在分别对三种单独的蛋白及两种复合物蛋白进行晶体筛选实验后,获得了AtPHR1及AtPHR1/OsSPX1两种蛋白的晶体生长条件,并进行了晶体优化。其中AtPHR1在经过筛选pH条件,筛沉淀剂浓度等一系列晶体优化操作后获得了衍射较好的晶体,随后制备了其硒代甲硫氨酸衍生物蛋白并成功获得了晶体。对晶体进行X射线衍射实验、收集数据,但最终数据的处理结果和SDS-PAGE结果都显示该蛋白在结晶的过程中发生了降解,所获得的并不是目的长度的AtPHR1的晶体。
  综上,本论文获得了AtPHR1和AtPHR/OsSPX1蛋白复合物的结晶条件,为后续对二者的晶体优化、结构解析工作奠定了重要基础。
[硕士论文] 艾玉
生物学;植物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)是一种吲哚类色胺,最早在动物的松果体中发现,是一种广为人知的动物激素。褪黑素作为一类重要的生物内源分子,广泛分布于细菌、真菌、动物,甚至植物中,具有广泛的生物学功能。与在动物细胞中的研究不同,褪黑素在植物代谢方面的研究尚不多见。
  花青素是植物特有的黄酮类次级代谢产物,在植物的生殖和逆境防御方面发挥着重要功能。花青素的合成受许多内源和外源因素调控。其中,植物激素茉莉酸在花青素合成过程中起正调控的作用。茉莉酸通过诱导花青素合成基因的表达来促进花青素的合成。
  本课题以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为研究对象,利用茉莉酸诱导拟南芥积累过量花青素,探究褪黑素对植物花青素代谢的作用。通过观察发现,外源褪黑素单独处理拟南芥不仅可以轻微地减少花青素的产量,还可以削弱茉莉酸对花青素的诱导效应。接着,对拟南芥褪黑素过量积累和缺陷型植株进行研究,发现过量积累的内源褪黑素也可以改变茉莉酸对花青素的诱导效应。本课题接下来对这新发现展开了深入的探究。
  JASMONATE-ZIM-DOMAIN(JAZ)蛋白是茉莉酸信号通路的抑制子。在茉莉酸存在下,JAZs蛋白会被泛素化,后被26S蛋白酶体识别并降解。实验发现,褪黑素对JAZ1蛋白的稳定没有作用,也不会改变茉莉酸诱导的JAZ1蛋白降解。褪黑素也不会改变茉莉酸诱导的响应基因(JAZ1、JAZ2、JAZ3、JAZ5,JAZ9和JAZ10)表达以及其它茉莉酸相关表型。而且褪黑素也会抑制在茉莉酸诱导条件下的拟南芥茉莉酸相关突变体jazQ和aos的花青素积累。这些结果说明褪黑素抑制茉莉酸诱导的花青素积累不是通过阻断茉莉酸信号途径。
  同时,我们用茉莉酸诱导拟南芥突变体pap1-D积累过量的花青素,发现褪黑素不能降解突变体pap1-D过量积累的花青素,说明褪黑素不能催化花青素的降解。茉莉酸会诱导所有花青素合成基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR,LDOX和UF3GT)的表达,而褪黑素不能改变茉莉酸的诱导趋势,也不能改变花青素合成基因的表达,说明褪黑素不是从转录水平上调控花青素的合成。
  最后,我们添加了花青素合成通路中的前体物质(L-苯丙氨酸,肉桂酸,柚皮苷查尔酮,柚皮素或香橙素),发现低浓度的香橙素可以部分恢复褪黑素抑制茉莉酸诱导花青素积累的效应,说明褪黑素作用于花青素合成过程,很可能抑制了黄烷酮-3-羟化酶(F3H)的活性,使得香橙素生成量减少,导致花青素产量降低。
  本课题揭示了褪黑素在植物细胞代谢过程中的作用。褪黑素在花青素代谢过程中起负调控作用。同时,也证明了褪黑素不会阻断茉莉酸信号通路。此外,初步研究发现,褪黑素作用于花青素合成通路,很可能作用于黄烷酮-3-羟化酶(F3H)催化香橙素生成的过程中。
[硕士论文] 严星星
生物化学与分子生物学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:前期研究表明,由MAN3介导的甘露糖在植物应对镉胁迫响应中扮演着重要的角色。然而,所涉及的潜在分子机制和信号传导途径却鲜为人知。在本研究中,展示了拟南芥中MYB4-MAN3-Mannose-MNB1这一信号通路调控镉积累和耐受的分子机理。研究发现MNB1功能缺失突变体降低了植株对Cd的积累和耐受性,而MNB1的过表达则显著增强了植株对Cd的积累和耐受。与之一致的是,无论在有无镉胁迫条件下,mnb1突变体中GSH依赖的PC合成途径相关基因如GSH1、GSH2、PCS1和PCS2的表达显著下降,而在MNB1过表达植株中得到明显相反的结果。这表明MNB1基因是通过GSH依赖的PC合成途径来正向调控植株对镉的积累和耐受。
  此外,发现甘露糖能够与MNB1特异性结合并且该结合依赖于MAN3介导的镉耐受。进一步分析表明,MYB4能直接激活MAN3的转录,并且MYB4基因也是通过GSH依赖的PC合成途径来正向调控植株对镉的积累和耐受。并且进一步构建了一系列双突变体材料,通过表型分析结果发现,MAN3的过量表达能恢复myb4突变体对镉敏感的表型,但不能恢复mnb1突变体对镉敏感表型,然而MNB1的过量表达则能恢复myb4突变体的镉敏感表型,这些结果共同说明MAN3作用于MYB4下游,但作用于MNB1上游。
  综合来看,我们的研究结果提供了令人信服的证据,证明了在拟南芥中MYB4-MAN3-Mannose-MNB1这一信号通路正是通过GSH依赖的PC合成途径来调控镉的积累和耐受。该研究在一定程度上揭示植物对重金属胁迫的调控机理,研究植物在多个基因的调控下对重金属镉胁迫的响应机制,为植物修复技术提供更多的理论依据。
[硕士论文] 张天茹
生物化学与分子生物学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:传统的观点认为活性氧(ROS)诱导的体内氧化胁迫具有毒性效应,然而越来越多的证据表明ROS是植物体内应对外界胁迫因子(如干旱、病虫害等)的重要信号分子,其中过氧化氢(H2O2)是ROS中具有最稳定性和较强活性的自由基,介导水杨酸(SA)有关的植物免疫反应。与H2O2相似,谷胱甘肽亚硝基硫醇(GSNO)也被认为是一种重要信号分子,也参与调控SA有关的防御反应,但是H2O2与GSNO之间是否存在相互作用,进而影响SA相关途径还不是很清楚。因此,本研究选用了拟南芥过氧化氢酶突变体cat2和谷胱甘肽亚硝基硫醇还原酶突变体gsnor1-3作为研究材料,分析了H2O2与GSNO调控SA途径的相关性。研究发现CAT2突变导致的H2O2积累不仅诱导SA的合成,而且显著性地激活SA下游防御基因(如PR1)表达和叶片自发性细胞死亡现象。然而GSNOR1突变则完全阻断了H2O2诱导的SA积累和信号。转录组学研究进一步发现,cat2gsnor1-3双突变体几乎完全抑制了H2O2诱导的SA合成和信号基因表达。这些结果表明GSNO负调控H2O2诱导的SA信号途径。
  另一方面,为了进一步解析GSNO介导H2O2信号途径的调控机制,本研究利用激光共聚焦显微镜观察叶片和根尖ROS水平、测定谷胱甘肽含量以及乙醇酸氧化酶酶活等指标,发现与cat2相比,cat2gsnor1-3双突变体内H2O2含量及诱导的氧化胁迫强度没有明显削弱。转录组学证据和抗氧化酶活分析发现,GSNOR1突变并没有增强主要的H2O2代谢酶的活性及其相关基因表达。进一步分析发现,外源高水平ROS诱导剂(百草枯)未显著地诱导gsnor1-3突变体内的ROS响应基因表达。因此得出结论,GSNO负调控H2O2诱导的SA信号途径是通过影响H2O2的下游信号途径而不是抑制H2O2的含量。
[硕士论文] 贺伟敏
遗传学 浙江师范大学 2018(学位年度)
摘要:细胞分裂素作为一类植物激素,在植物体生长发育、抗病、抗逆、营养物质的吸收利用以及叶片衰老中起到重要作用。细胞分裂素的生物合成、代谢及信号转导的研究已经比较详细,但是细胞分裂素转运的分子机制研究尚不清楚。AtABCG14是首个被发现的细胞分裂素长距离转运蛋白,它主要负责将根部合成的细胞分裂素通过木质部运输到地上组织,促进地上组织的生长和发育。AtABCG14是ABC转运蛋白家族的一员,它作为一个半分子转运蛋白,需要与其他蛋白相互作用来完成细胞分裂素的转运。但是目前为止还未有其互作蛋白被报道。
  本研究的目的是鉴定AtABCG14的互作蛋白,进而阐明细胞分裂素的转运机制。本文首先是利用免疫共沉淀方法以及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)获得了与AtABCG14互作的候选蛋白,之后结合分子生物学,遗传学等研究方法鉴定ABCG14的互作蛋白。具体研究结果如下:
  (1)通过免疫共沉淀和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)相结合的方法获得了124个目的蛋白,从中选取了26个可能在植物体内与AtABCG14互作的候选蛋白进行后续的验证实验。
  (2)将候选基因构建到荧光素酶(luciferase)的N端载体上,同时将AtABCG14基因构建到荧光素酶的C端载体上,把两个载体同时转入烟草中验证候选蛋白与AtABCG14在烟草中的互作。结果显示有15个候选蛋白与AtABCG14在烟草中相互作用。
  (3)鉴定出10个候选基因的T-DNA插入突变体,对突变体的表型进行统计,结果发现aha1突变体和abcg36突变体的莲座叶变小,花序减少,茎变矮小,这些表型与abcg14突变体的表型相似,都是细胞分裂素缺失的表型。此外,本研究还用6-BA处理了aha1突变体和abcg36突变体并统计了根长的变化,以此来检测aha1突变体和abcg36突变体对6-BA的响应,结果显示aha1突变体对6-BA不敏感,与abcg14突变体表型相似,abcg36突变体对6-BA敏感,与野生型表型相似。
  (4)把AHA1基因、ABCG36基因构建到酵母表达载体pPR3N上,同时将AtABCG14基因构建到酵母表达载体pBT3N上,然后把两个基因构建的载体分别与pBT3N-AtABCG14一起转入到酵母菌株NMY51中验证其互作情况。结果表明AHA1与AtABCG14在酵母中互作,而ABCG36和AtABCG14在酵母中不互作。
  (5)通过Pro ARR5∷GUS/aha1和Pro ARR5∷GUS/abcg36转基因株系的GUS染色,检测细胞分裂素报告基因ARR5在aha1突变体和abcg36突变体中的表达,GUS染色结果表明aha1突变体地上组织中的细胞分裂素含量大量减少,而abcg36突变体地上组织中的细胞分裂素减少程度要弱于abcg14突变体。
  以上结果表明AHA1蛋白与细胞分裂素的转运存在一定的关系。
[硕士论文] 虎娟
植物学 宁夏大学 2018(学位年度)
摘要:植物花青素是类黄酮物质在生物合成中所产生的重要次生代谢产物,广泛存在于植物体内液泡中,是花卉、水果和蔬菜中的主要呈色物质。黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)果皮和马蔺(Iris lactea Pall.var chinensis(Fisch.)Koidz,以下简称(I.lactea vat chinensis)花瓣中都富含大量的花青素,而这两种植物的花青素生物合成代谢机制目前尚未见报道。
  本文以黑果枸杞和马蔺为材料,提取黑果枸杞果皮和马蔺花瓣的RNA进行转录组测序,从中筛选出黑果枸杞和马蔺花青素生物合成途经的关键基因并对其进行分离克隆和生物信息学特征分析;同时通过构建原核细胞表达载体及体外酶活性测定分析马蔺二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol4-reductase,DFR)基因的底物结合特性,并与荷兰鸢尾、矮牵牛、烟草等植物的DFR基因的底物结合特性进行比较,明确马蔺DFR基因编码的蛋白(酶)的底物偏好特性。本研究的研究结果如下:
  1.根据转录组测序分析结果,筛选得到了黑果枸杞花青素生物合成途径中的7类关键基因,即查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)、黄烷酮3-羟化酶(flavanone3-hydroxylase,F3H)、类黄酮3’-羟化酶(flavonoid3’-hydroxylase,F3'H)、类黄酮3'5’-羟化酶(flavonoid3’,5’-hydroxylase,F3'5'H)、二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol4-reductase,DFR)和花青素合酶(anthocyanidin4-synthase,ANS)等基因(分别命名为rCHS、LrCHI、LrF3H、rF3'H、LrF3'5'H、LrDFR和LrANS)以及马蔺花青素生物合成途径中的1个关键基因,即二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)(命名为llDFR)的序列。将其登录到NCBI基因数据库上,并对这些基因进行了生物信息学特征分析和克隆验证。
  2.将马蔺IlDFR、荷兰鸢尾IhDFR、矮牵牛PhDFR和烟草NtDFR基因构建原核表达载体pTrc-CKS(多克隆酶切位点MCS下游含6×His-Taq标签),并在大肠杆菌JM109中分别成功表达了4种蛋白,利用镍琼脂糖凝胶填充柱亲和层析法纯化得到这4种目的蛋白。
  3.四种目的蛋白在NADPH的辅助作用下分别与二氢槲皮黄酮(dihydroquercetin,DHQ)、二氢山奈黄酮醇(dihydrokaempferol,DHK)和二氢杨梅黄酮(dihydromyricetin,DHM)三种底物在体外进行酶促反应,通过HPLC检测发现,马蔺IlDFR蛋白可以有效的催化DHK、DHM两种底物,而基本不催化底物DHQ,并且对DHM的催化效率高于DHK;荷兰鸢尾IhDFR蛋白可以有效地催化DHQ、DHK和DHM三种底物,对DHK、DHM的催化效率高于DHQ;矮牵牛PhDFR蛋白和烟草NtDFR蛋白可以有效的催化DHQ、DHK和DHM三种底物,并且其催化效率相差不大。马蔺IlDFR和荷兰鸢尾IhDFR的底物特异性结构域均为“TVKRVVFTS SAGTVDVKEHQQMEYDESS WSDVEFCRRV”,而矮牵牛PhDFR、烟草NtDFR的底物特异性结构域分别为“TVKRLVFTSSAGTLDVQEQQKLFYDQTSWSDLDFIYAK”和“TVKRLVFTSSAGTLDA QEHQKLFYDETSWSDLDFIYAK”。第3个氨基酸残基均为赖氨酸(K),带负电荷,理论上这4种蛋白主要催化DHQ和DHM,而催化DHK的效率较低,但这4种蛋白对底物的偏好和催化效率都不尽相同,再次证明了该结构域的其他氨基酸残基也影响着DFR对底物的选择。
  该研究为今后利用分子生物学与基因工程技术定向培育花卉、水果和蔬菜的颜色提供新的基因资源和奠定技术基础。
[硕士论文] 魏云竹
生物学·植物学 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:水稻的耐冷性研究对于水稻生产十分重要,研究表明冷调控关键蛋白OsICE1和OsICE2发挥着重要作用。最新的研究发现,茉莉素信号通路参与调控拟南芥的冷胁迫。然而目前,茉莉素信号通路调控OsICE1和OsICE2的分子机制,还不清楚。
  本文以拟南芥的茉莉酸信号通路介导AtICE1、AtICE2调控冷胁迫为基础,探索茉莉酸信号通路调控冷调控关键蛋白OsICE1和OsICE2的分子机制。本文研究结果主要包括以下六个方面:(1)拟南芥AtICE1、AtICE2和水稻OsICE1、OsICE2进化上具有较高保守性。蛋白序列比对结果显示,四个ICE蛋白的bHLH结构域序列完全相同。系统进化树分析显示,四个ICE蛋白蛋白序列进化关系较近。(2)JA信号通路中,COI1为JA受体,拟南芥和水稻的COI1在进化上具有较高保守性。拟南芥AtCOI1与水稻OsCOI1a、OsCOI1b、OsCOI1c氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析显示拟南芥和水稻的COI1进化上是保守的。(3)JA信号通路中,JAZ蛋白为受体COI1的底物,水稻OsJAZs和拟南芥JAZs进化上具有保守性。同源性分析显示,拟南芥参与冷胁迫的三个JAZs蛋白(JAZ1、JAZ4、JAZ9)与水稻的四个OsJAZs(OsJAZ1、OsJAZ3、OsJAZ4、OsJAZ10)氨基酸具有较大相似性。(4)水稻JA信号通路OsJAZ与OsCOI1相互作用。酵母双杂交实验表明,OsJAZ1能够与OsCOI1a、OsCOI1b、OsCOI1c互作。(5)水稻OsJAZs、OsICE1、OsMYBS3之间关系。酵母双杂交实验发现,OsJAZs家族与OsICE1不互作,但二者分别能够与MYB蛋白互作。推测可能存在OsJAZs家族与OsICE1竞争MYB蛋白,从而参与调控JA介导的水稻冷胁迫信号通路。(6)OsICE1、OsICE2的功能保守性研究。将水稻OsICE1、OsICE2基因导入拟南芥中构建超表达材料后进行冷胁迫表型分析,结果发现OsICE1/2-OE植株比野生型(Col-0)更加耐冷。同时,冷调控基因在OsICE1/2-OE植株中的表达量相对于野生型Col-0要高。上述结果表明水稻的OsICE1、OsICE2基因在拟南芥中也发挥了耐冷的功能,水稻的OsICE1、OsICE2基因与拟南芥的AtICE1、AtICE2功能保守。
[硕士论文] 王耀辉
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:拟南芥At3g08650被预测编码锌转运蛋白,但是没有直接的实验证据。我们将At3g08650命名为ZINC NUTRITION ESSENTIAL1(ZNE1)。为了确定ZNE1蛋白的亚细胞定位,在烟草表皮细胞内瞬时表达ZNE1-GFP(绿色荧光蛋白)融合基因。
  本研究在激光共聚焦显微镜下,通过对比发射红色荧光的细胞器标记蛋白位置,证明ZNE1定位在高尔基体。进一步将ZNE1在哺乳动物细胞HEK293T中表达,利用免疫荧光证明ZNE1存在于细胞质中。为了确定ZNE1在植物锌依赖生长中的生理功能,纯合鉴定到两个拟南芥T-DNA插入缺失突变体zne1。进一步在水培条件下,对比拟南芥野生型Col和zne1锌依赖生长表型,发现zne1在高锌水培液中表现叶片发黄的敏感表型。将完整的ZNE1编码序列整合到zne1突变体基因组可以使zne1对高锌环境的反应恢复到野生型,证明ZNE1是拟南芥适应高锌环境的必需基因。为了探索质外体Zn2+在活体叶片中的分布,我们利用离体叶片叶柄浸泡法和膜不通透性Zn2+特异性荧光染料FluoZin-3,发现在高锌处理条件下,拟南芥zne1一、二级叶脉中Zn2+浓度显著高于野生型,证明ZNE1是调节拟南芥叶子内Zn2+分布的重要基因。
[硕士论文] 石嵘
微生物 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:WRKY70和LRR-RLK在许多植物中都参与了植物的抗病反应, WRKY70是植物信号传导过程中的重要成员,在植物抗病过程中发挥着重要作用,主要参与了茉莉酸(JA)与水杨酸(SA)途径,LRR-RLK可以直接或间接的识别病原物,并将信号传递下去,使植物产生一系列抗病反应。本研究在利用黑胫病菌侵染油菜的转录组测序基础上,筛选高表达及差异表达基因,结合油菜全基因组测序数据,获得WRKY70和LRR-RLK两个基因全长,为了深入了解这两个基因的信息及验证其在油菜中的抗病功能,为鉴定油菜抗病通路中重要基因的功能提供数据信息,利用生物信息学进行了序列分析,然后采用VIGS技术,将携带外源基因的cDNA导入宿主,诱发宿主同源基因沉默,来达到验证基因功能的目的。
  本研究主要内容包括:⑴根据前期用弱侵染型菌株NM-1侵染油菜得到的转录组测序结果中WRKY70和LRR-RLK基因的全长CDS序列,利用CLC SequenceViewer6推导WRKY70和LRR-RLK氨基酸序列,并对WRKY70和LRR-RLK氨基酸序列进行蛋白大小、等电点、结构域、磷酸化位点、N-糖基化位点以及疏水性分析。其中WRKY70基因CDS全长858bp,编码285个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子;LRR-RLK基因CDS全长2775bp,编码924个氨基酸,含有丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性位点。⑵克隆WRKY70和LRR-RLK基因部分CDS序列,WRKY70片段大小为308bp,LRR-RLK基因片段大小为394bp,测序后进行序列比对,与转录组序列100%一致。⑶将成功构建的VIGS沉默载体pTRV2-WRKY70和pTRV2-LRR-RLK,转入大肠杆菌MC1061中进行菌液PCR及单、双酶切验证后,提取质粒转化农杆菌GV3101,用于侵染油菜叶片。⑷农杆菌介导的沉默载体侵染油菜叶片14d后接种黑胫病病原菌NM-1,收集4h、12h、24h、36h、48h、96h叶片,提取RNA通过qPCR检测目的基因表达量,并观察植株发病情况。结果显示,沉默植株中目的基因的相对表达量低于未沉默植株,并且沉默植株叶片的病斑较大,叶片褪绿发黄较明显。
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