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[硕士论文] 王义华
观赏园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:葡萄科植物物种丰富,分布广泛,且具有重要的经济价值和观赏价值。近年来,对葡萄科植物的研究从未停歇。目前,绝大多数被子植物叶绿体全基因组序列已经测定完成。将不同物种叶绿体基因组全序列进行比较以及对4个区域边界的差异分析,有助于了解叶绿体基因组序列差异,理解物种之间的进化过程。叶绿体基因组序列因具有较强的保守性和较低的碱基替换率等特点,使其成为系统发育研究较为理想的数据。本研究利用Illumina二代测序技术对葡萄属11个种叶绿体基因组进行测序,对包括蛇葡萄、垂盆草和烟草在内的16个叶绿体基因组进行比较分析,并以叶绿体基因组79个共有的蛋白编码基因对葡萄科39个种进行系统发育研究,揭示葡萄科各属种之间的进化关系。主要研究结果如下:
  1.测定和注释了葡萄属11个种叶绿体全基因组序列,得到11条完整的叶绿体基因组。葡萄属叶绿体基因组十分保守,大小为160935-160982bp;具有典型的四分体结构,包含一个大单拷贝区(LSC,89159-89193bp),一个小单拷贝区(SSC,19045-19073bp)和一对反向重复区(IRs,26250-26373bp);含有113个不同的基因(79个蛋白编码基因,30个tRNA和4个rRNA),此外,注释了两个特殊的没有编码蛋白功能的基因:ycf15和ycf68,均位于反向重复区;11个种叶绿体基因组GC含量非常相似,约为37.4%;密码子偏好A和T,尤其是密码子第二位和第三位,高达61.61%和69.74%;对重复序列和简单重复序列(SSR)进行了统计分析,为葡萄属植物的相关研究提供了基础。
  2.16个叶绿体基因组全序列比对结果表明:IR区域比LSC/SSC区域更加保守;葡萄属内叶绿体基因组非常保守,葡萄科蛇葡萄属植物与葡萄属植物也具有较强的共线性,而与其他被子植物(垂盆草和烟草)具有较大的差异。葡萄属13个种之间的遗传距离反映了物种亲缘关系的远近;分别对编码区和非编码区的核苷酸多态性(Pi)进行分析,共检测到10个变异度较高的区域(psbZ-trnG(UCC),csA-ndhD,atpF-atpH,accD-psaI,ndhF-rpl32,rps15-ycf1,trnK(UUU)-rps16,rpl32,rpl33,atp),其中3个位于编码区,其余均位于非编码区。四个区域边界的比对结果显示,基因rps19、ndhF、ycf1、φrps19和φycf1等的大小和分布存在不同程度的差异,这些差异反映了叶绿体基因组的进化过程。
  3.本研究基于叶绿体基因组79个共有的蛋白编码基因对葡萄科39个种进行系统发育研究,以更加全面的数据确定和验证葡萄科各属种之间的系统进化关系。两种不同的分析方法(ML和MP)得到了相同的拓扑结构,将葡萄科植物分为5个主要的分支(Vitis-Ampelocissus clade,Parthenocissus-Yua clade,core Cissus clade,Cayratia-Cyphostemma-Tetrastigma clade,Ampelopsis-Rhoicissus clade),且每个分支均为单系分支;葡萄属内15个种进一步分为圆叶葡萄亚属和真葡萄亚属,而真葡萄亚属包括欧亚支系和新世界支系。
[硕士论文] 孙中峰
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:丛枝菌根(AM)真菌是一种土传真菌,属于古老的球囊菌门,是丛枝菌根的重要共生体,增强植物养分的获取和对各种非生物逆境的抗性的重要来源。与其显著的生理意义相反,所涉及的分子基础尚不清楚,主要是由于它们的专性生物营养和复杂的遗传学。
  14-3-3蛋白是一种高度保守的蛋白质家族,它广泛存在于真核细胞中,14-3-3的同源或异源二聚体可以通过与其它蛋白质相互作用参与真核生物的信号传导和代谢活性。
  本实验以摩西球囊霉(Funneliformis mosseae)的Fm201EST Tag为起点,分别从摩西球囊霉(Funneliformis mosseae)和根内球囊霉(Rhizophagus irregularis)中分离和鉴定了三个编码丛枝菌根真菌14-3-3like蛋白的编码基因,并分别命名为Fm201,Ri14-3-3和RiBMH2。通过荧光定量分析,发现Fm201,Ri14-3-3和RiRMH2的表达量在前共生(孢子萌发)和共生阶段(附着胞形成,根内菌丝形成,丛枝形成时期)中都出现了明显的激增。因为缺乏有效的丛枝菌根真菌转化系统,为了Fm201,Ri14-3-3和RiBMH2基因编码的功能,引入了酵母异源验证系统。酿酒酵母的14-3-3的双突变(bmh1,bmh2)是致死的,本实验通过在突变酵母BMH2时引入一个半乳糖诱导的Ga17启动子启动的丛枝菌根真菌14-3-3基因。数据表明,所有三个14-3-3like基因编码蛋白在半乳糖培养基中均可以恢复酿酒酵母bmh1,bmh2致死双突变的正常代谢表型。
  此外,本实验在对Fm201基因进行3'RACE和5'RACE时,分别在它的5'UTR和3'UTR中各发现了一个内含子(或称为选择性剪接外显子)。5'UTR的内含子被认为参与了基因转录的增强,而3'UTR内含子的出现时由加尾信号的选择性识别引起的,这些被认为是高真核生物的基因调控机制。在对菌根共生过程中的Fm201L(含有长的3'UTR)和Fm201S(含有短的3'UTR))进行荧光定量分析是,且长短不同的Fm201在共生的不同时期出现了不同比例的波动。为了揭示这两种选择性剪切的内含子在14-3-3转录和翻译过程中的作用。分别以YGPF为报告基因,以酵母BY4741为宿主分别检测了5'UTR的转录活性和3'UTR在转录和翻译水平上的稳定性。结果表明,Fm201的UTRs可能对稳定RNA或增强转录具有重要意义。
  在对这三个14-3-3蛋白进行启动子分析(ATG上游1.5Kb序列)时,在酵母启动子相似的位置上发现了多个与非生物胁迫相关的STRE(CCCCT/AGGGG)顺式作用元件。重要的是,酵母单杂交分析表明,丛枝菌根真菌转录因子RiMsn2(酵母中STRE顺式作用元件识别因子Msn2的同源蛋白)能够识别存在于Fm201基因启动子区的STRE元件。不仅如此,在酵母中当对Fm201的STRE元件进行点突变时,报告基因在非生物胁迫反映下的表达量出现了明显的下降。
  为了探索14-3-3蛋白在菌根共生关系维持过程中的作用,引入了宿主介导的基因沉默(Host Induced Gene Silence)。当对根内球囊霉-蒺藜苜蓿共生体中的丛枝菌根真菌Ri14-3-3和RiBMH2基因进行沉默时时,共生体中的丛枝出现了早衰(或称为提前降解)的现象。不仅如此,苜蓿一侧与菌根丛枝形成相关的MtPT4和MtMST2基因的表达也出现了明显的下调。这些现象均说明了丛枝菌根真菌14-3-3蛋白在共生关系的维持过程具有十分重要的意义。
  进一步将丛枝菌根真菌和苜蓿蒺藜的菌根共生系统进行干旱或盐分胁迫等非生物胁迫,并收集材料进行荧光定量分析。非生物胁迫处理下的菌根(主要包括跟内菌丝和丛枝)和外生菌丝中的表达谱表明,这三个14-3-3基因均分别参与了干旱或盐分胁迫的响应。这一结果可能也与这三个基因启动子上的STRE顺式作用元件密切相关。
  总的来说,上述实验结果为丛枝菌根真菌14-3-3蛋白在AM共生过程中非生物胁迫反应和菌根共生关系建立和维持过程中的分子功能提供了新的见解。
[硕士论文] 蔡爱明
林学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:生物入侵会对本地植物群落组成和结构,生态系统稳定性,社会经济和人类健康造成巨大影响与危害,其与动植物栖息地丧失、全球气候变化并称为全球环境三大问题。人类纪时期的无节制和不合理的生产与生活,使得全球气候发生极显著的变化,这也影响着植物生存区间内各种资源条件水平,改变生境内植物物种组成,进而影响生境的可入侵性。目前关于外来克隆草本植物对单一资源斑块性和波动性的响应研究较多,但不同生境条件压力(地上开放天敌,地下开放天敌,光照、养分和水分限制)对多物种对外来入侵和本地木本生长和竞争影响的尚未报道。关于外来入侵木本对不同类型压力(生物和非生物压力)的响应机制研究仍然不足。
  本研究以6对同科或同属的外来入侵和本地共存木本植物为研究对象,进行温室控制实验。每对物种设置3因素实验:物种来源(入侵和本地)、压力类型(对照、地上开放天敌,地下开放天敌,光照、养分和水分限制)和竞争(种间竞争,入侵单株和本地单株),共36个处理,以此来探究物种来源,压力类型和种间竞争及其交互作用对外来入侵与本地木本植物生长的影响。研究结果表明:
  1.外来入侵木本植物的总生物量、叶生物量和茎生物量均显著大于本地共存木本植物。生物压力(地上和地下开放天敌)对木本植物生物量指标影响不显著,木本植物生长主要受到非生物压力(光照、养分和水分限制)的影响。种间竞争显著降低入侵与本地木本植物的生物量。无竞争条件下入侵与本地木本植物间没有显著性差异,而存在种间竞争时,入侵木本植物显著大于本地木本植物,表明竞争对于本地木本的不利效应显著强于外来入侵木本。
  2.不同类型压力条件下,入侵与本地木本植物存在不同的响应机制。处于地上开放天敌和地下开放天敌环境中,竞争条件下的入侵与本地木本间叶生物量差异大于无竞争条件;而对照资源水平下,无论是竞争还是非竞争时,入侵与本地木本之间没有显著差异。资源(光照、水分和养分)限制条件下入侵与本地木本之间的叶或茎生物量差异显著小于对照处理。
  3.不同类型资源环境压力(光照、水分和养分限制)对土壤中氮磷钾含量产生的影响不同。低光环境促进土壤中氮素积累,水分限制环境降低土壤中全磷增量,降低土壤养分水平不利于土壤中全钾的积累。不同竞争类型中种植外来入侵单株的土壤氮增量最低,而土壤磷增量最高,同时也受到外界环境压力的影响。
  4.植物叶片碳氮含量表现为外来入侵显著大于木本植物。地上开放天敌和低养压力环境下叶片碳氮含量均显著下降,而降低光照强度明显增加叶片碳氮含量。同时,对照处理下入侵木本植物的碳氮含量均显著大于本地木本植物,但地上开放天敌、光照和水分限制环境中,不同来源木本植物间的叶片碳氮含量差异不显著。
[硕士论文] 杨学
细胞生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:细菌人工染色体文库是生物基因组研究的重要资源,它们被成功地应用于图位克隆,构建物理图谱以及全基因组测序。本研究工作由两部分组成:1.放线菌BAC载体改造及放线菌0026BAC文库构建;2.矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选。
  放线菌(Actinomycetes)产生的次级代谢产物在医药和学术研究上有着重要意义。常用于构建放线菌BAC(Bacterial artificial chromosome)文库的载体为pMSBBACs,用其构建的放线菌BAC文库在进行质量检测时存在一定的缺陷。本研究通过在放线菌复合载体pMSBBACs中引入归位内切酶Ⅰ-SceI位点,改造出适用于放线菌属大片段基因组DNA克隆和异源表达的pHZAUBACFXJ复合载体。pHZAUBACFXJ1载体不仅在构建放线菌文库方面简单实用,在验证文库质量时用Ⅰ-SceI代替NotI进行酶切,也方便放线菌BAC文库外源插入片段大小的计算,评估放线菌BAC文库质量。本研究使用pHZAUBACFXJ1复合载体成功构建了一个放线菌0026的BAC文库。该文库总计3,456个克隆,保存在9块384板中,随机挑拣40个放线菌BAC克隆用Ⅰ-SceI酶切检测,平均插入片段约130kb,空载率约10%。以放线菌0026基因组8Mbp计算,约覆盖放线菌0026基因组40倍。构建了该BAC文库行列混合池,并提取行列混合池DNA。合作者已成功利用该文库筛选到克隆。
  矮牵牛(Petunia hybrida)因其花期长、花开繁盛等优点,广泛应用于街边花坛布置和园林景观摆设,在研究植物花发育中具有重要意义。为了研究矮牵牛开重瓣花的基因调控序列,本研究利用pHZAUB AC1复合载体构建了一个含有78,336个重组克隆的矮牵牛重瓣花BAC文库,保存在204块384板中。随机挑选440个矮牵牛BAC克隆检测外源DNA插入片段大小,平均外源插入片段约为120kb,空载率小于2%。以矮牵牛基因组900Mbp计算,约覆盖整个矮牵牛基因组10倍。通过构建高效二维混合池PCR筛选方法,利用6对引物(SCF1-9FR、SCF2-2FR、SCF43FR、SCF4-1FR、SCF1-12FR、SCF101FR)对矮牵牛BAC文库进行筛选,共筛选出9个阳性BAC克隆,对矮牵牛开重瓣花调控机理的研究具有重要意义。
[博士论文] 赵成
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:蓝细菌和红藻的捕光复合物藻胆体中含有大量的酶催化形成的色素化藻胆蛋白。目前已知3类不同的藻胆蛋白裂合酶特异性催化藻胆蛋白色素化。S/U型裂合酶催化藻胆色素不仅可以结合到别藻蓝蛋白的Cys81,也可以结合到藻蓝蛋白、藻红蛋白和藻红蓝蛋白β亚基的Cys82。T型裂合酶特异性催化藻胆色素与藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基的Cys153结合。E/F型裂合酶特异性负责藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白α亚基的Cys84结合藻胆色素。与S/U型和T型裂合酶不同,E/F型裂合酶还具有去色素化活性。此外,E/F型裂合酶中有一亚类具有藻胆色素异构化的活性。裂合酶CpcS和CpcT的结构在无色素或有色素的条件下分别被解析,但其结构都是β桶形,与脂肪酸结合蛋白的结构类似。尽管E/F型裂合酶早在25年前就被发现,但是至今其蛋白结构仍然未知。
  本研究以1.89A的分辨率解析了来自于Nostoc sp.PCC7120的裂合酶CpcE/F的结构。CpcE和CpcF亚基都是扭曲的星月形的α-螺线管形结构。CpcE由15个α-螺旋组成,CpcF由10个α-螺旋组成。CpcE的内(凹面)层螺旋和CpcF的外(凸面)层螺旋围成一个洞。根据CpcE/F复合物两个亚基界面处和洞内部的氨基酸位点突变结果,模拟得到了PCB:CpcE/F复合物的结构。以CpcE/F为模板模拟得到高同源性的裂合酶PecE/F的结构,但PecE/F具有异构化活性。保守的H87C88基序位于PecF亚基的h20和h21之间的loop上,这个保守基序被证实是PecE/F实现异构化活性所必需的,同时也支持了假说:Cys88与藻蓝胆素PCB的C10的亲核加成诱导了PCB异构化为藻紫胆素PVB。此外,与藻胆体降解有关的非漂白蛋白NblB的结构也以CpcE为模板模拟得到。
  为了得到更多的有关裂合酶催化机制的信息,本研究模拟了两种裂合酶CpcE/F和PecE/F分别和底物的相互作用模型。根据这些docking模型可以得出,色素分子结合藻胆蛋白的Cys84时,需要与之接触的藻胆蛋白的螺旋.螺旋之间松散以允许色素转移到结合位点。CpcE/F不仅可以催化脱辅基藻蓝蛋白CpcA结合PCB,也可以催化PCB从色素化蛋白PCB-CpcA上分离。考虑到反应的可逆性,本文提出一种假设:在色素化和去色素化时,色素分子向不同的方向移动。色素化时色素PCB向CpcE亚基方向移动,这个移动促进了PCB和CpcA的结合;相反的,去色素化时色素PCB向CpcF亚基方向移动,从而导致色素PCB的分离。位于CpcF亚基上方的CpcE的N端手臂序列阻碍了色素的移动,从而可以解释N端截短后去色素化活性增强。
  本研究解析了首个E/F型裂合酶的结构,从而补全了藻胆蛋白裂合酶家族的结构和催化机制,这将有助于更好地理解藻胆蛋白裂合酶如何参与蓝细菌捕光复合物的组装。此外,裂合酶CpcE/F具有特有的去色素化活性,这种活性与藻胆体的降解有关:比如在营养缺失条件下藻胆蛋白发生降解,或光照发生变化时藻胆体重构,这为研究藻胆体的降解提供了一个新的思路。
[硕士论文] 陈冲
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:豆科植物的生物固氮作用是农业生态系统中最重要的氮元素来源,生物固氮过程需要大量的磷元素参与。植物通过磷转运蛋白吸收和转运磷。本实验室前期分别从紫云英和丛枝菌根真菌Gigaspora margarita(BEG34)中分离得到了磷转运基因AsPT6和GigmPT。本文利用时空表达、化学组织定位、及超表达和RNAi等方法研究了AsPT6在紫云英结瘤固氮过程中的功能以及作用机制,检测接种表达GigmPT蛋白的7653R、1021和HH103根瘤菌的紫云英、蒺藜苜蓿和大豆中的结瘤固氮表型,研究了GigmPT对豆科植物结瘤固氮的影响。主要结果如下:
  1、AsPT6在紫云英的根茎叶中均有表达,在地上部分表达量最高;接根瘤菌后,该基因在根和根瘤中的表达量显著提高。
  2、GUS化学组织定位分析结果表明,AsPT6在根和根瘤的维管组织中均有表达,且在根和根瘤的连接处也有表达,表明AsPT6在植物内起到转运磷的作用,与根和根瘤之间的磷转运有关。
  3、AsPT6超表达和RNAi结果显示,AsPT6能显著影响紫云英的结瘤及根瘤的固氮酶活,表明AsPT6起到向根瘤转运磷的功能,能促进紫云英的结瘤固氮。
  4、紫云英、蒺藜苜蓿以及大豆分别接种表达GigmPT蛋白的根瘤菌7653R、1021和HH103后,三种植株的生长和结瘤固氮均受到抑制。将表达GigmPT蛋白根瘤菌加大接种量后,蒺藜苜蓿和大豆植株生物量、结瘤数及固氮酶活与野生型根瘤菌后表型无显著差异,但是接种7653R(GigmPT)的紫云英在高磷处理下结瘤数和固氮酶活仍有下降。
  5、表达GigmPT蛋白的根瘤菌和野生型根瘤菌的生长曲线测定发现:该外源蛋白的表达会影响根瘤菌的生长,这种影响在7653R菌株中更为明显。
[硕士论文] 张瑜
园林植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:蜡梅(Chimonanthus praecox L.)冬天开花,香气怡人,广泛应用于切花和园林种植。芳香是蜡梅最为重要的观赏特征,其中乙酸苄酯是蜡梅的主要香气成分之一。本实验室前期对花香物质测定,发现芳香的H93株系乙酸苄酯含量较高,而无香的SW001株系不含乙酸苄酯。本文在实验室前期基础上,以蜡梅芳香的H93和无香的SW001株系为研究材料,比较2个材料3个时期乙酸苄酯含量的差异。筛选转录组库中控制乙酸苄酯合成的差异表达基因CpBEAT5、CpBEAT8,通过实时定量表达分析,结合乙酸苄酯释放量差异,寻找基因表达与花香释放之间的联系。另外将蜡梅CpBEAT5、CpBEAT8转入早花烟草,初步探究该基因的功能。主要研究结果如下:
  1.芳香株系H93中能检测到乙酸苄酯,但在无香株系SW001任何花期都未发现挥发物中有乙酸苄酯。在H93中不同花期乙酸苄酯的含量变化趋势与底物苯甲醇的含量变化趋势一致,在盛花期两者出现了最大值,与蜡梅花香总挥发物在盛花期达到最高峰现象相同。而在SW001中虽没检测到乙酸苄酯,但在末花期挥发物中存在微量的苯甲醇。
  2.经蛋白序列比对,CpBEAT5、CpBEAT8在H93和SW001株系中无差异。CpBEAT5含有一个内含子,不同株系中内含子存在差异,而CpBEAT8没有内含子。
  3.在H93和SW001蜡梅株系中CpBEAT5、CpBEAT8表达存在显著差异。在H93中CpBEAT5、CpBEAT8在盛花期的表达量最高,且呈现出上升后下降的表达趋势,与乙酸苄酯的含量变化趋势一致。但在SW001中,CpBEAT5、CpBEAT8在盛花期表达量最低。CpBEAT5在H93中露瓣期、盛花期、末花期三个时期的表达量都远远高于SW001,CpBEAT8在H93中,盛花期的表达量是SW001的近4倍,而露瓣期和末花期的表达量都低于SW001。
  4.经启动子序列比对,CpBEAT5启动子在H93和SW001株系中存在17个碱基的差异,H93的启动子比SW001多了一个的决定基因转录始TATA-box。CpBEAT8启动子在两个株系中序列一致。
  5.在转CpBFAT5、CpBEAT8基因烟草花中,挥发物成分测定显示野生型植株与转基因植株花都能检测到底物苯甲醇,但未检测到乙酸苄酯和苯甲酸苄酯。
[硕士论文] 易志杰
生理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:氮磷营养富集所导致的富营养化,常造成水体藻类暴发,透明度下降,水质恶化,水生态系统受损。沉水植物是湖泊生态系统的重要组分,具有吸收水体营养物质、净化水质、抑制藻类生长繁殖、维持水生态系统稳定等重要作用。菹草(Potamogeton crispus L.)是一种典型的大型沉水植物,对污染水体有较强的净化和适应能力,尤其是在冬季其他植物衰亡时其净化功能尤为重要。菹草主要依靠无性繁殖体石芽进行繁殖,石芽的形成和萌发是菹草种群延续的关键。本文在人工培养条件下,研究了上覆水氮(0.2mg N/L和20mg N/L)、磷(0.02mg P/L和2mg P/L)水平和光强(高光强、中等光强和低光强)对菹草生长和繁殖体形成的影响,以及细胞分裂素抑制剂对其调控作用,试图阐明水体富营养化因子影响菹草生长和繁殖形成的生理机制,为菹草资源的合理利用以及富营养化湖泊的生态修复提供理论指导。主要研究结果如下:
  1.菹草茎叶生物量积累受上覆水氮磷互作的显著影响。在低氮低磷条件下,菹草叶片光合色素含量、植株可溶性糖含量均显著提高,而茎叶氮磷吸收量和ABA、JA含量显著降低。在高氮高磷条件下,菹草植株氮磷吸收量和茎叶ABA、JA含量显著升高,而叶片光合色素含量、植株碳水化合物含量显著降低。上覆水低氮促进繁殖体的形成和生长,高氮虽促进植株生长,但推迟繁殖体形成的时间。在低氮低磷条件下,菹草茎尖IAA含量显著提高,在高氮高磷条件下,菹草繁殖体形成数、生物量和碳水化合物含量、积累量显著降低。在低氮高磷和高氮低磷两种营养条件下,菹草繁殖体形成数增多,但繁殖体大小和生物量较低氮低磷处理低。上覆水高氮高磷组合显著抑制繁殖体形成和生长,不利于菹草种群的繁殖。
  2.在不同上覆水氮、磷水平下,光照不足均影响菹草的营养体生长,并抑制繁殖体的形成,造成菹草繁殖力下降。在低氮条件下,低光显著降低植株的氮磷吸收量、叶片光合色素含量和植株碳水化合物含量,增加茎叶ABA、JA含量。低氮低磷条件下,高光增加植株碳水化合物含量,促进顶生石芽形成,提高繁殖体碳水化合物含量和积累量;中等光强增加植株氮磷吸收量、叶片光合色素含量和茎尖ABA、IAA含量,显著促进茎叶生长和腋生石芽、鳞枝形成。低氮高磷条件下,高光增加植株氮磷吸收量、碳水化合物含量,提高茎叶生物量和繁殖体形成量;中等光强提高茎叶光合色素含量和茎尖IAA含量,促进繁殖体生长。高氮低磷条件下,高光促进菹草生长和繁殖体形成,增加繁殖体数量、生物量和碳水化合物积累量;中等光强增加叶片光合色素含量,植株磷吸收量和可溶性糖含量,繁殖体淀粉含量。高氮高磷条件下,中等光强增加茎叶生物量和氮磷吸收量,提高叶片光合色素含量,促进繁殖体形成和生长,提高繁殖体生物量和碳水化合物积累量;高光不利于植株生长和繁殖体形成,并导致菹草植株茎基腐烂。高光与高氮高磷组合显著影响菹草后期的营养生长,抑制繁殖体形成和生长,导致种群繁殖能力下降。
  3.在繁殖体形成前降低内源细胞分裂素代谢水平,有利于提高高磷条件下菹草的繁殖能力。在繁殖体形成前15d、10d和5d分别应用1μM洛伐他汀处理菹草植株,均可提高茎叶氮磷吸收量、可溶性糖含量和生物量,促进繁殖体形成,提高繁殖体生物量和淀粉积累量,但不影响繁殖体形态、大小和淀粉含量,其中在繁殖体形成前10d处理效应最为显著。在繁殖体形成前18d、13d和8d分别应用1μM洛伐他汀处理菹草植株,可不同程度地降低营养体生物量、氮磷吸收量和可溶性糖含量,但提高植株淀粉含量;在繁殖体形成前8d洛伐他汀处理,显著促进石芽形成并提高石芽碳水化合物含量,但石芽生物量没有增加。
  4.对不同光照强度下菹草茎尖和叶片进行转录组测序和数据分析,并应用七大数据库对unigene进行功能注释和分类,共得到了472570个unigene,注释到了286796个基因。在KEGG数据库中对生长素、细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸和糖代谢相关差异基因进行富集分析,共筛选到了13个差异表达基因,为后续研究植物激素调控不同环境条件下菹草繁殖体形成的分子机制奠定了基础。
[硕士论文] 李来
园林植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:蜡梅科是第三纪孑遗植物,起源十分古老,演化的历史悠久。蜡梅科植物都为灌木,为南、北温带以及东亚、北美间断分布。其中夏蜡梅和蜡梅属植物原产于我国,并且都是我国的国家二级珍稀濒危植物,而且都是优良的观赏植物,应用十分广泛。同为观花植物,蜡梅科植物开花时间差异较大,夏蜡梅于4月底、5月初开花,蜡梅属的植物多于10月开花,特别地,蜡梅于12月下旬开花,与绝大多数植物不同。为了弄清楚蜡梅科植物间开花时间差异的原因,首先有必要从形态学角度比较各物种花芽分化及花发育的过程。
  本研究以蜡梅科的4个物种(美国蜡梅属的夏蜡梅、蜡梅属的柳叶蜡梅、亮叶蜡梅和蜡梅)不同时间的芽为研究对象,通过石蜡切片技术和光学显微镜对其进行了形态学观察,以了解蜡梅科植物花形成的整个形态过程,确定花芽在不同时间所处的阶段及形态特征,记录了各个阶段花芽的芽长芽宽及外部特征,并比较分析了这4个种的花形成阶段和时间的差异,以期为今后蜡梅科植物栽培、花期调控、花形成机理、各物种开花时间差异原因等方面的研究提供形态学依据。本研究获得的主要结论如下:
  1.可以将夏蜡梅的成花过程划分为7个阶段:成花诱导阶段、花发端阶段、苞片阶段、花被片阶段、雄蕊阶段、雌蕊阶段和花发育阶段,将蜡梅属植物的成花过程划分为6个阶段,与夏蜡梅相比没有苞片阶段。
  2.这四个物种虽然开花时间差异很大,但都属于当年分化型。4个物种花发端的时间差异不大,夏蜡梅开花时间比蜡梅属的植物开花早5~8个月,但是花发端的时间只比蜡梅早1~2个月左右。蜡梅开花时间比柳叶蜡梅和亮叶蜡梅晚两个月左右,但是其花发端的时间却比柳叶蜡梅早一周,比亮叶蜡梅早接近一个月。
  3.夏蜡梅从形态分化开始到开花只需要45天左右,柳叶蜡梅接近6个月,亮叶蜡梅为5个多月,蜡梅为8个月左右。差异原因主要为两点:(1)夏蜡梅形态分化及花发育速度比蜡梅属植物快,夏蜡梅整个形态分化过程历时3周左右,柳叶蜡梅形态分化持续接近两个月,亮叶蜡梅的接近三个月,蜡梅的持续约5周。夏蜡梅在花药和胚珠形成后,其分化出雌雄生殖细胞然后开花的速度也比蜡梅属植物快,夏蜡梅从花药形成到开花只需半个月,柳叶蜡梅和亮叶蜡梅需要1个月左右,蜡梅甚至需要3个月。(2)夏蜡梅不存在休眠。蜡梅属的植物在形态分化完成后,花芽都会进行休眠,这一阶段花芽的生长非常缓慢,芽的大小也几乎不变。蜡梅的休眠期最长。蜡梅10月24日形成了单核花粉粒,雌蕊比雄蕊晚熟
  4.夏蜡梅花芽的长和宽在花芽分化和花发育过程中始终保持增长。蜡梅属的这三个物种花发端之前芽长芽宽均保持增长趋势;花芽形态分化过程中芽长增长,芽宽不变化;雌蕊原基形成后至花药和胚珠形成前,芽长和芽宽都基本不变化;花药和胚珠形成后直至开花,芽长和芽宽均迅速增长。
[硕士论文] 阮凤英
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:SMC5/6复合物是广泛存在于生物体中的一种蛋白复合物,研究表明SMC5/6复合物与同源重组修复,核糖体DNA及异染色质的结构维持,端粒延伸和染色质的拓扑结构调节密切相关。SMC5/6复合物由两种SMC蛋白,SMC5和SMC6,和多个Nse亚基组成。大部分生物体内只发现Nse1-Nse4这4种亚基。近年来相继在在酵母、拟南芥和人中发现了两个新的Nse亚基,Nse5和Nse6,并发现它们调控SMC5/6与DNA损伤位点的结合并进行DNA损伤修复。在拟南芥中,Nse5和Nse6的同源蛋白分别为ASAP1和SNI1。此前有研究表明SNI1是植物获得性免疫的负调控因子,能够抑制防卫基因的表达。SNI1的双重身份表明植物的免疫反应和DNA的损伤修复存在某种关联,而SNI1在其中可能发挥着十分关键的作用。为了揭示其中的分子机理,我们决定对ASAP1-SNI1复合物进行结构生物学研究。
  本研究对ASAP1-SNI1复合物的结构生物学研究进行了初步探索:1)我们尝试在大肠杆菌中单独重组表达ASAP1和SNI1,但两者均在包涵体中且难以纯化;2)我们将SNI1与ASAP1进行共表达,成功纯化出性质良好均一的ASAP1-SNI1复合物蛋白,验证了ASAP1和SNI1的直接相互作用;3)我们对ASAPI和SNI1进行约200多种截短体蛋白筛选,确定了它们的相互作用区域,并进行约24000多个晶体条件筛选,遗憾的是暂未获得晶体。
  本研究中虽然未能获取ASAP1-SNI1复合物的晶体,但对ASAP1-SNI1的表达条件进行了优化,并确定了ASAP1-SNI1复合物的互作区域,为后续开展ASAP1-SNI1复合物结构与功能研究提供了一定基础。
[博士论文] 曹玲
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:ICKs/KRPs(Inhibitors of cyclin-dependent kinase/Kip-related proteins,以下简称ICKs)是植物细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent Kinase,CDK)的抑制因子,能抑制细胞周期进程和细胞分裂进而在细胞周期调控中起着重要作用。拟南芥基因组中有7个ICK基因,由于成员之间功能上的冗余性,目前对植物中ICK基因家族的功能以及各成员之间的功能特异性还缺乏深入了解。本实验室先前对ICK1/2/5/6/7的T-DNA插入五突变体进行了研究。本研究旨在创建ICK T-DNA插入六突变体和七突变体的基础上,系统研究ICK基因家族所有成员的敲除对植物生长发育的影响。
  对一个拟南芥六突变体ick123567和七突变体(所有ICK基因被敲除)表型分析显示,与五突变体ick12567和野生型相比,七突变体的植物幼苗鲜重和粒重显著增加。多种非生物胁迫处理,包括植物生长素、细胞分裂素、脱落酸、氯化钠、蔗糖、paraquat和S-甲基甲烷硫代磺酸,野生型和七突变体的根长及生长量之间的差异不显著。
  ICK七突变体角果变短、每个角果种子数减少。细胞学观察发现,七突变体中有47%的胚珠败育,而五突变体ick12567、六突变体ick123567和野生型中胚珠正常。正反交结果显示七突变体作为母本时才能观察到短角果的表型,说明这个表型是由于雌配子体发育缺陷造成的。对处于雌配子体发育第7时期(FG7)的胚囊发育观察表明,野生型胚囊在授粉之前三个反足细胞降解;而七突变体胚囊中除了正常的配子外,还有额外的细胞核,这些细胞核可以被区分为是具有一个卵细胞、一个中央细胞和两个助细胞的两套、三套或者四套的配子体,不同配子体间有时可见清楚的界限,表明突变体胚珠中有多个独立的胚囊存在。利用卵细胞标记pEC1.1::GUS和中央细胞标记pFIS2::GUS确定了七突变体胚珠中多个卵细胞和中央细胞的存在。
  功能大孢子时期,野生型胚珠只观察到一个功能大孢子。七突变体中,有30%的胚珠观察不到功能大孢子,而其余70%胚珠中可观察到1-3个功能大孢子,极少胚珠中有4个。在FG2时期,野生型胚囊中有一对典型的细胞核,七突变体中有1-4对细胞核,每对细胞核之间界限分明。但在2-Ⅰ阶段的胚珠中,野生型和七突变体中均只有一个大孢子母细胞。这些结果说明,七个ICK基因的敲除导致多个功能大孢子的形成并且能继续发育成多套雌配子体。
  开花后三天,野生型胚珠有一个胚和形态一致且分布在整个胚囊中的胚乳细胞核,而在七突变体胚珠中观察到胚乳中有不同类型的细胞核,或两个或三个独立的胚乳囊室,并且有双胚的存在。在携带pEC1.1::GUS标记的七突变体开花后三天的胚珠中,除了胚能观察到GUS染色外,在合点端有1-2个不同的点也可观察到GUS染色,说明受精后三天胚珠中没有受精的额外卵细胞依然存活在胚囊中。与双胚发育一致,七突变体中有2%的种子可以观察到双胚苗。经野生型和携带有中央细胞标记(pFIS2::GUS)的七突变体混合花粉授粉的七突变体,其后代中双胚苗的基因型检测发现每一对双胚苗具有相同或不同的基因型,表明双胚苗是两个卵细胞分别接受两个不同花粉管所释放的精子细胞经受精产生的。
  互补实验证明,单个ICK4或ICK7基因组片段导入七突变体中均能回复其突变表型。本研究证明了ICK基因不仅调控植物生长的细胞周期调控,还在非功能大孢子细胞的退化过程起重要作用。正常植物中多个ICK基因功能上的冗余性,可以确保每个胚珠中只形成一个功能大孢子和一个雌配子体以及随后胚的正常发育。
[硕士论文] 李晶晶
园林植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:蜡梅(Chimonanthus praecox L.)又名黄梅,隶属于蜡梅科(Calycanthaecae),蜡梅属(Chimonanthus Lindl.),为我国特有的传统名花,有着悠久的历史和灿烂的花文化。蜡梅花开严冬,傲然于冰雪严寒之中,且香味沁人心脾;寓意忠实、独立、坚韧、创新,自古以来颇受我国文人雅士的喜爱,同时也涌现出许多赞颂蜡梅的诗篇。
  蜡梅的花为两性花,花朵结构由内而外分别为雌蕊、雄蕊、花被片和苞片。雄蕊从初花到衰老期,属于多雄蕊缓慢运动,逐渐向中心雌蕊靠近;花药由未开裂—开裂—衰老状态转变。这些转变对蜡梅的繁殖进化具有重要意义。目前在分子方面对蜡梅花发育、花香、花色和抗寒方面研究较多,对蜡梅雄蕊发育和运动方面研究较少;而激素,尤其是生长素,对植物花药的发育和细胞伸长方面有重要作用。因此,本文对蜡梅雄蕊发育后期的四个时期即平卧期(An11),直立未散粉期(An12)、直立散粉期(An13),衰老期(An14)进行转录组测序,并结合石蜡切片观测和IAA处理以及相关基因表达量的测定,以初步探究蜡梅雄蕊后期发育的分子机制,为后续相关方面的研究奠定基础。获得主要研究结果如下:
  1.对蜡梅雄蕊做石蜡切片进行观察,结果显示蜡梅花丝弯曲部分的远轴端细胞伸长,近轴端细胞大小基本不变。在An11时期远轴端的细胞明显小于近轴端的细胞;An12时期,两端细胞大小近似。An12时期远轴端细胞明显大于An11远轴端细胞。IAA免疫定位结果显示蜡梅雄蕊中的生长素主要分布在雄蕊花丝的维管束和药室内壁上,其他部位也有生长素的分布但量相对较少。由此可见,蜡梅雄蕊从An11向An12时期转变的过程中,远轴端花丝细胞逐渐变大,近轴端细胞大小基本不变,属于细胞不对称生长,这可能与促进细胞生长的生长素有关。
  2.采用RNA-seq技术对四个时期的雄蕊进行测序,分别得到55271946、49326090、54791199、57632908条原始序列。对组装出来的潜在转录本(Potential Transcript)和Unigene进行各项指标的统计得到237975条潜在转录本,176726条Unigene。并将基因与数据库Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG进行序列比对、功能注释及代谢通路分析,得到蜡梅雄蕊转录组文库。
  3.通过对差异表达基因(DEGs;|log2Ratio|≥1,q≤0.05)进行分析,共筛选出16905条DEGs,An12An11有4289个DEGs,其中2915个基因激活表达,1374个基因受到抑制;An13_An12共有6478个DEGs,其中2871个激活表达,3607个基因受到抑制;An14_An13共有2993个DEGs,其中1857个基因激活表达,1136个基因受到抑制。通过GO功能富集分析及KEGG富集分析得出这些DEGs主要参与细胞代谢、蛋白质翻译、细胞外基质受体相互作用等生物学进程。
  4.在这些DEGs中,共筛选出45个与雄蕊运动和花药开裂相关的基因,如c46107-g1(AUX2))、c74989-g1(PIN)等,这些基因主要参与到木质素和生长素合成代谢途径中,从候选基因中随机挑选16个,并从数据库中随机挑选4个基因进行表达水平验证(qRT-PCR),实验结果与转录组中基因表达量的趋势相符。
  5.用100μmol/L的生长素处理蜡梅初开期的花朵(切枝处理),蒸馏水处理为对照,每隔一小时观测一次。结果得出蜡梅雄蕊在生长素处理后8h左右出现明显的表型变化,而对照组则稍迟。生长素处理结果表明处理组雄蕊比对照组先达到直立状态,并呈显著性差异(P=0.045)。说明生长素加速雄蕊的运动和花药的开裂。对处理后的雄蕊进行相关基因(如ABCBs)的表达量测定;与对照组相比,实验组材料c71215-g1、c50946-g1等基因表达量显著升高,这些实验结果为进一步研究蜡梅雄蕊运动的机理奠定基础。
[博士论文] 刘广超
植物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:植物作为一类营固着生长的生物,在其漫长的进化过程中演变出极强的可塑性来适应外界不断变化的生存环境,而这种可塑性生长反应在植物的根中表现得尤为明显。根系是植物吸收水分和营养物质的主要器官,同时也参与植物对各种逆境的响应。植物可通过改变根系的结构和功能来更好的应答各种逆境,这种为适应不同的生存环境而表现出根系构型的变化是根可塑性生长发育的重要体现。因此,深入研究植物根的可塑性生长发育不仅具有重要的生物学意义,也为将来基于根型改良的作物育种提供重要理论基础。
  铝作为土壤中含量最丰富的金属元素,只有在酸性条件(pH≤5.5)下,游离态的铝离子(Al3+)才显著抑制植物根的功能和生长发育,成为仅次于干旱胁迫的限制作物产量的关键因子,地球上多达50%的潜在可耕地为酸性土壤,且60%以上的酸性土壤集中在热带及亚热带的发展中国家和地区。因此铝胁迫成为世界范围内影响作物产量和粮食安全问题的重要因素,而探究酸性土壤中铝胁迫的分子调控机理则受到越来越广泛的关注。利用现代生物学技术手段培育适应酸性土壤的植物品种具有重大的战略意义,是解决酸性土壤作物产量问题最经济、有效和根本的方法。
  作为调控植物生长发育的关键信号分子,植物激素在介导植物响应其周围环境信号的可塑性生长发育过程中发挥重要作用。已有研究发现,植物激素如乙烯、生长素、脱落酸能够参与植物对铝胁迫的响应,但对这些激素如何响应铝胁迫的分子机制及不同激素间如何共同介导铝胁迫抑制主根的伸长等过程目前还知之甚少,需要进一步的深入探究。
  本论文以模式生物拟南芥为材料,从植物激素与铝胁迫相互作用的角度,利用分子生物学、细胞生物学、遗传学及生理学等技术手段,发现生长素、细胞分裂素和乙烯等植物激素可通过其生物学合成、信号转导等途径特异性参与植物根尖转换区(TZ)对铝胁迫的应答反应,而且这一应答反应受到其它转录因子的直接调控。
  本研究首先检测了生长素合成关键基因YUCCA(YUC)的功能缺失突变体对铝耐受性的变化,发现单基因功能缺失突变体只有yuc9具有一定的铝胁迫耐受性,这种耐受性在多突变体yucQ中则尤其显著,而施加YUC基因特异抑制剂yucasin处理也使野生型植株产生明显的耐铝表型。另外在yuc突变体中或yucasin处理均减弱了生长素报告基因DR5rev∶GFP在根尖TZ区受铝胁迫的诱导表达。说明YUC基因特异性参与铝胁迫在根尖TZ区对生长素的响应以及对主根伸长的抑制过程,且YUC基因间存在一定的功能冗余。接下来对YUC基因的表达模式进行分析,我们发现在没有铝处理的情况下,除了YUC9基因在根尖有少量表达外,其它的YUC基因并没有在根尖表达。但是在铝处理后,这些YUC基因都可以在TZ区被特异性的诱导表达。乙烯合成前体ACC与铝共同处理可以增强TZ区YUC基因的诱导,而乙烯合成抑制剂AVG结合铝处理则减弱了TZ区YUC基因的表达,说明YUC基因在根尖TZ区对铝胁迫的响应是受乙烯所调控的。
  进一步的研究发现乙烯信号参与YUC基因对铝胁迫的响应是通过EIN3转录调控YUC9基因的表达来实现的。EIN3和EIL1均可在根尖TZ区响应铝胁迫的诱导上调表达,而在乙烯信号突变体ein3-1eil1-1中,YUC9基因在根尖TZ区对铝胁迫的响应显著降低,说明E1N3对铝胁迫的应答反应依赖于YUC9。此外,铝结合乙烯前体ACC可以增强根尖TZ区生长素的响应,而这种诱导在yuc突变体及yucasin处理后则显著减弱,而且铝结合ACC增强对主根伸长的抑制作用在yuc突变体或yucasin处理后也明显缓解,说明乙烯调控铝胁迫在根尖TZ区对生长素信号的诱导以及对主根伸长的抑制是依赖于YUC基因的。
  之前的研究证实bHLH类转录因子PIF4直接调控YUC8基因的转录,参与高温胁迫下植物下胚轴的伸长。本研究发现PIF4对YUC5及YUC9基因也存在直接的转录调控。PIF4功能缺失突变体pif4-101具有耐铝表型,而超表达株系35S PIF4则对铝胁迫超敏感。此外,在pif4-101突变体背景下,YUC8、YUC9及生长素报告基因DR5rev∶GFP受铝胁迫在根尖TZ区的诱导表达均显著降低,证实铝胁迫诱导根尖TZ区生长素的合成及响应是受PIF4所调控的。进一步分析发现乙烯信号通过下游EIN3/EIL1基因直接调控PIF4的转录激活,进而参与对铝胁迫的响应。
  除生长素外,本研究也对另一重要植物激素细胞分裂素如何参与对铝胁迫的响应进行了分析。与野生型相比,细胞分裂素合成或受体基因的功能缺失突变体均具有耐铝表型,而细胞分裂素代谢基因的功能缺失突变体或B型ARR基因的超表达株系则对铝处理更加敏感。细胞分裂素报告基因TCSn.GFP及受细胞分裂素诱导表达的A型ARR基因ARR3、ARR4在根尖TZ区均受到铝胁迫的诱导,说明铝胁迫诱导根尖TZ区细胞分裂素的信号响应。
  为了进一步验证细胞分裂素与其它激素在响应铝胁迫过程中的相互关系,我们检测了生长素过表达突变体yuc1D或NAA处理后细胞分裂素信号受铝胁迫的响应变化,结果发现生长素显著增强了铝胁迫对TCSn∶GFP的诱导表达。而在生长素信号缺陷突变体arf7arf19或PEO-IAA处理则减弱TCSn∶GFP在根尖TZ区对铝胁迫的响应。此外,生长素加重铝胁迫对主根伸长的抑制在arr1arr10arr12突变体中显著减弱,而细胞分裂素加重铝胁迫抑制主根伸长的表型在生长素合成或信号缺失突变体中则没有明显的变化。以上结果说明铝胁迫抑制植物主根伸长的过程中,细胞分裂素位于生长素的下游。接下来我们通过共聚焦显微镜的观察,发现乙烯过表达突变体eto1-2或ACC处理增强铝胁迫在根尖TZ区对TCSn∶GFP的诱导,而乙烯信号缺陷突变体ein3-1eil1-1或AVG处理则减弱TCSn∶GFP在根尖TZ区对铝胁迫的响应。进一步的表型实验也发现乙烯加重铝胁迫对主根伸长的抑制在arr1arr10arr12突变体中显著减弱,而细胞分裂素加重铝胁迫抑制主根的伸长在ein3-1eil1-1突变体中则与野生型没有明显的区别,证明在响应铝胁迫抑制主根伸长的过程中,细胞分裂素也位于乙烯的下游。此外,铝结合ACC增强根尖TZ区TCSn∶GFP信号的积累可被PEO-IAA显著减弱,而PEO-IAA结合铝处理下调TCSn∶GFP在TZ区的表达并不能被ACC所恢复,因此乙烯介导铝胁迫诱导细胞分裂素在根尖TZ区的响应依赖于生长素。
  为了阐明铝胁迫诱导根尖TZ区细胞分裂素信号的积累是否和调控植物内源细胞分裂素的合成有关。我们首先分析了细胞分裂素合成途径关键基因IPT突变体的表型,结果发现细胞分裂素合成关键基因IPT的功能缺失具有耐铝的表型,这种耐受性在多突变体ipt1ipt3ipt5ipt7中则更为明显。此外,IPT基因在根尖TZ区受铝胁迫诱导表达,且这种诱导表达在arf7arf19突变体或PEO-IAA处理后明显减弱。说明铝胁迫通过生长素信号调控IPT基因在根尖TZ区异位表达,造成细胞分裂素在该部位的大量积累从而抑制根的伸长。接下来通过对IPT基因启动子区进行序列分析,我们发现IPT1、IPT5及IPT7的启动子区存在保守的生长素响应元件AuxRE,通过酵母单杂交、染色质免疫共沉淀技术(ChIP)等实验均证实生长素响应因子ARF7可以直接结合在IPT5和IPT7基因的启动子区并激活其转录表达,最终影响内源细胞分裂素的合成并参与对铝胁迫的响应。
  综上所述,我们的研究发现生长素合成关键基因YUC参与根尖TZ区响应铝胁迫下生长素的积累,从而造成对主根伸长的抑制。转录因子EIN3和PIF4可能通过直接转录调控YUC基因的表达参与铝胁迫对主根伸长的抑制过程。我们的研究还发现,铝胁迫能够通过生长素信号调控细胞分裂素合成基因IPT在根尖TZ区上调表达,造成细胞分裂素在根尖TZ的大量积累并造成对植物主根伸长的抑制。该研究不仅证实了细胞分裂素在植物响应铝胁迫的过程中的重要作用,同时进一步揭示了生长素和细胞分裂素除了在正常发育条件下以拮抗的方式参与根伸长的调控,而且能够在响应铝胁迫的过程中以协同的方式介导铝胁迫信号调控植物根的生长。
[博士论文] 郭琼
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:遗传物质的准确复制并精确分配到子代细胞中是生物体存活与延续的基础。根据细胞分裂类型又可分为有丝分裂和减数分裂。但无论哪种细胞分裂,都需要纺锤体的纺锤丝附着在染色体的特定区域上,最终牵引染色体被拉向细胞的两极。人们把这个特定的区域称之为着丝粒,大分子复合物——动粒在着丝粒上进行组装,指导染色体的分离。
  根据在动粒上的位置,可将动粒组分分为内层动粒蛋白、外层动粒蛋白以及调节蛋白。目前一致认为内层动粒主要由16个CCAN蛋白(哺乳动物类)组分组成,该区域与着丝粒DNA紧密连接,随后招募其他的动粒组分。而CENP-L/CENP-N作为CCAN复合物的核心组成元件,在动粒组装的上游发挥作用,并招募其他组分在染色体上装配。但CENP-L/CENP-N是如何被招募到着丝粒核小体上目前还不是很透彻。
  本文以酿酒酵母着丝粒动粒蛋白Iml3/Chl4(哺乳动物CENP-L/CENP-N的同源蛋白)为研究对象,解析了Iml3蛋白和Iml3-Chl4378-458复合物的晶体结构。结构显示:Iml3是一个较新的结构组装模式,主要由两个分离的结构域组成:不完全的β折叠桶和扭曲的平面,通过分子间的疏水作用维持着整个结构的稳定性。在晶体结构中,尽管一个不对称单位中只有一个Iml3分子,但它与晶体学对称所产生的另一个Iml3分子通过βstrand上的主链氢键形成同源二聚体。当Chl4蛋白存在时,Chl4能破坏Iml3的同源二聚界面,以更加稳定的方式结合Iml3。Chl4的C端形成4个βstrands,以反平行的方式与Iml3的11个βstrands组成一个连续、延伸的β-sheet,并通过多对氢键以及盐桥相互作用保证了复合物的稳定和结合特异性。
  结构分析与文献查阅发现,Chl4通过与着丝粒Cse4核小体(哺乳动物CENP-A核小体)的直接相互作用被招募,除了Chl4的N端与Mif2蛋白(哺乳动物CENP-C的同源蛋白,具有DNA结合能力)相互作用的推动,是否还存在其他的作用力促使这个过程的发生呢?凝胶阻滞和荧光偏振实验结果表明,Iml3和Chl4具有协同结合dsDNA的能力,而单独的Iml3和Chl4都不具有与dsDNA的结合能力。结构分析及突变体实验发现,这种非特异性结合dsDNA的能力主要来源于Iml3-Chl4复合物的β-sheet内侧碱性富集区。与几乎同时发表的的Stephen et al.研究组的研究表明:破坏Iml3与Chl4的二聚作用界面,直接导致了染色体分离的准确性以及使孢子的生成率降低,他们将此现象的最终原因归结为异源二聚界面的破坏。我们的凝胶阻滞以及荧光偏振等实验表明,异源二聚界面的破坏只是表象,二聚界面的破坏导致了Iml3-Chl4复合物上的β-sheet内层表面的碱性残基富集区被破坏,从而失去了dsDNA的结合能力,这可能直接阻碍了自身的着丝粒定位以及其下游内层动粒蛋白的招募,从而抑制了动粒的组装,最终影响了染色体的分离。
  胆固醇作为一种环戊烷多氢菲的衍生物,广泛存在于动物的脑及神经组织中,为哺乳动物生长发育所必须,同时也是细胞膜结构的重要组成部分。但是作为两性分子,胆固醇的转运以及信号传导既需要可溶蛋白的协助,又需要膜蛋白的参与。
  在哺乳动物中,胆固醇除了内质网上的从头合成,还涉及到外源性摄取:低密度脂蛋白结合到低密度脂蛋白受体上,随后内化进早期内涵体,在酸性pH的作用下,两者解离。低密度脂蛋白被转运至晚期内涵体,经溶酶体酶水解成自由胆固醇,在可溶蛋白NPC2/膜蛋白NPC1的协同作用下,转运出内涵体。当NPC2/NPC1基因发生突变时,会引起自由胆固醇在内涵体中的积累,在人源中这种疾病称为Niemann-Pick type C(NPC)疾病。可以看出,膜蛋白NPC1是一种非常重要的转运蛋白。近来研究发现,NPC1还可以作为某些包膜丝状病毒感染宿主细胞的受体蛋白,帮助丝状病毒在宿主细胞内的复制、组装。但膜蛋白NPC1是如何既作为转运蛋白帮助胆固醇的转运,又作为受体蛋白帮助子代病毒感染宿主细胞还不是很透彻。
  本文以膜蛋白NPC1为研究对象,成功克隆了NPC1蛋白在不同物种中的50个同源蛋白,筛选出了能在pichia系统中稳定表达的TlNPC1(Thermomyces lanuginosus);同时根据多次实验以及二级结构的预测,成功筛选出能够稳定存在的TlNPC1截断片段;结合去垢剂的筛选、去甲基化、去糖基化、蛋白酶解、LCP脂质体以及冷冻电镜等方法,但都没有成功解析出NPC1蛋白的三维结构。
[博士论文] 薛涛
细胞生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:植物离体器官诱导是目前植物干细胞领域的一个研究热点,指植物外植体材料(包括根、下胚轴、子叶及种子等)在适宜的离体培养环境中诱导离体苗、根等器官形成的生物学过程。目前,植物离体器官的再生体系相对成熟,一般包括愈伤组织形成和离体苗分化两个过程。研究人员在此基础上发掘了一些调控愈伤组织形成和离体器官再生的相关基因,然而离体器官再生的调控机制仍不清楚,尤其是表观遗传调控子在植物离体器官再生中的功能有待系统研究。
  MicroRNAs(miRNAs)作为小分子非编码RNA,主要通过转录后水平剪切抑制靶基因的表达或翻译,进而表观调控植物的形态建成及逆境胁迫响应等生物学过程。目前,部分研究揭示了miRNAs参与调控植物的离体苗再生,进而揭开了植物离体器官再生过程中miRNAs的功能研究,因而,为了解析miRNAs在离体苗再生中的调控机制,更多的功能miRNAs有待挖掘。
  本实验室前期通过分析拟南芥胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织miRNAs的表达谱芯片,发现miR159、miR165/6在两类愈伤组织中表达差异明显,推测其在离体苗再生中起作用。
  本论文利用mir159ab双突变体材料,分析了miR159在离体苗诱导过程中的功能,并进一步明确了miR159调控愈伤组织形成和离体苗再生过程中的靶基因。鉴于离体器官诱导所用外植体为拟南芥的根,因而进一步开展了miR159对拟南芥主根生长及根尖分生组织区发育的调控研究。另外,miRNAs对靶基因的表观调控离不开AGO家族蛋白的参与,而AGO10可与AGO1竞争结合miR165/6进而减少沉默复合体的形成,因此本论文拟开展miR165/6及其调控子AGO10在离体苗诱导过程中的功能,并对其调控离体苗再生的机制进行了初步研究。
  主要研究结果如下:
  1)mir159ab双突变体根外植体形成的愈伤组织团数目明显增多,Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的CIM培养物中表达均显著提升。通过比较pMYB65:159-GFP和mir159ab×pMYB65:159-GFP株系外植体在CIM培养阶段的GFP信号,发现mir159ab×pMYB65:159-GFP外植体诱导的愈伤组织中GFP信号显著增强,进一步证明了愈伤组织形成过程中miR159对MYB65表达的抑制模式。分析MYB65的抗剪切系pMYB65:mMYB65及myb33myb65myb101三突变体的愈伤组织形成能力,发现pMYB65:mMYB65形成的愈伤组织团数目显著提升,而myb33myb65myb101三突变体形成的愈伤组织数目明显减少。结果表明miR159通过抑制靶基因MYB33、MYB65和MYB101的表达抑制CIM阶段愈伤组织的形成。
  2)mir159ab双突变体根外植体离体苗分化的数目明显减少,Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的SIM培养物中的表达均显著提升。通过比较pMYB6:159-GFP和mir159ab×pMYB65:159-GFP株系外植体在SIM培养4-10d的GFP信号,发现mir159ab×pMYB65:159-GFP外植体形成的细胞团中GFP信号显著增强,进一步证明了离体苗再生过程中miR159对MYB65表达的抑制模式。分析pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65、pMYB101:mMYB101(靶基因MYB33/65/101的抗剪切系)及myb33myb65myb101三突变体的离体苗再生表型,发现3个靶基因的抗剪切系的离体苗再生数目均显著减少,而靶基因的三突变体的离体苗再生数目未见显著变化,表明MYB33、MYB65和MYB101均抑制离体苗的再生。Real-time PCR分析表明,WUS、CLV3和STM在pMYB65:mMYB65系SIM培养物中的表达均显著降低。GFP信号检测表明pTCSn:GFP信号在pMYB65:mMYB65系SIM培养物中减弱,而pDR5:GFP信号增强。上述结果表明miR159为离体苗再生的促进子,通过抑制靶基因(MYB33、MYB65和MYB101)的表达,进而促进WUS、CLV3和STM的表达和细胞分裂素的响应并降低生长素信号响应实现对离体苗再生的表观调控。
  3)mir159ab双突变体的主根长度及其根尖分生组织区大小显著高于野生型。Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab主根中的表达量显著增强,同时pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65和pMYB101:mMYB101系的主根长度明显增加,表明miR159通过抑制靶基因的表达进而抑制拟南芥主根的生长。通过检测pMYB65:mMYB65×pCYCB1;1:GUS、pMYB65:mMYB65×pPIN1:PIN1-GFP、pMYB65:mMYB65×pWOX5:GFP、pMYB65:mMYB65×pPLT1:PLT1-GFP和pMYB65:mMYB65×pSCR:GFP株系的GUS及GFP信号,发现MYB65促进CYCB1;1的表达,EMSA实验进一步证明MYB65可直接结合促进CYCB1;1基因的表达进而促进根尖分生组织区细胞的分裂,并促进主根的生长。
  4)利用实验室建立的成熟种子的液体诱导体系分析了AGO10在离体苗再生中的功能。发现p35S:AGO10离体苗再生比率低于野生型,而ago10(功能缺失突变体)离体苗再生比率显著升高,同时p35S:AGO10转化ago10可明显降低其离体苗再生频率,表明AGO10为离体苗再生的抑制子。通过观察离体苗再生过程中pAGO10:GUS及pAGO10:GFP报告基因的信号,发现AGO10表达于形成的突起结构及原分生组织(pro-SAM)的起始部位。通过比较离体苗再生过程中,pU2:MIR165/6-GFP在野生型与ago10中的GFP信号,发现ago10×pU2:MIR165/6-GFP的培养物中GFP信号显著降低,表明miR165/6在ago10中的表达明显增强。RNA原位杂交结果显示,AGO10表达部位集中于突起结构的pro-SAM部位,并与miR165/6的表达部位重叠,抑制miR165/6的表达,从而促进HD-ZIPⅢ的表达。分析MIM165/6(artificial miR165/6target mimics)及men1(miR166a-ox)的离体苗再生表型,发现MIM165/166的离体苗再生频率降低而men1的离体苗再生频率增高,表明miR165/166为离体苗再生的促进子。进一步分析ago10×MIM165/6杂交系的表型,发现ago10×MIM166的离体苗再生数目显著低于ago10外植体分化的离体苗数但高于MIM165/6的再生数,表明AGO10可能部分通过抑制miR165/6成熟体的表达进而抑制离体苗的再生。
  综上,本论文鉴定了表观遗传调控子miR159和miR165/6及其调控子AGO10在离体苗再生过程中的功能,并对其调控离体苗再生的分子机制做了初步研究,为进一步深入解析表观遗传调控植物离体再生的机理奠定了基础。
[博士论文] 葛海涛
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:蓝藻广泛分布在地球上几乎所有的陆地和水生栖息地,在长期进化过程中蓝藻形成了一套灵敏且高效的环境信号感知及应答调控系统,以应对长期进化过程中不断变化的不利环境条件。众所周知,二元信号转导系统(TCS)是原核生物中主要信号转导系统,TCS在蓝藻感知环境变化并将其转化为细胞内信号的过程中发挥着重要作用,TCS感知环境信号并进一步调控细胞内相应蛋白的差异表达,最终实现细胞对环境的适应。典型的TCS通常由负责信号感知的组氨酸激酶(Hik)和负责基因调控的响应调节因子(Rre)构成。
  自然生长条件下的蓝藻经常需要面对各类环境胁迫条件,如高光胁迫、氧化胁迫、低温胁迫、盐胁迫、渗透压胁迫等。组氨酸激酶Hik33在蓝藻响应各种环境胁迫条件的过程中发挥着极其重要的作用。Hik33在蓝藻中高度保守且在其它原核生物中同源性很低,这预示着Hik33在协调光合作用和应激反应过程中起着不可替代的作用。
  虽然大量研究已表明Hik33在蓝藻应急调控中发挥着重要的作用,但Hik33如何感受环境信号并进一步调控蓝藻细胞做出相应应答反应在很大程度上仍然未知。系统性研究Hik33依赖的差异基因的表达可以为研究Hik33在应急反应中的作用提供重要信息。但目前已知的信息仅停留在转录水平,且大多数研究仅局限于单一胁迫条件。由于转录水平往往与蛋白质水平缺乏较好的一致性,且Hik33在多种胁迫条件下均发挥着重要的调控作用,因此单一的转录水平信息远远无法满足Hik33作为全局性胁迫调控因子发挥作用的机理分析。
  本论文研究中,我们以大规模定量蛋白质组学的方法在细胞不同的营养方式和不同碳源可获得性条件下研究了集胞藻Hik33缺失突变体中不同功能蛋白的差异表达变化情况。
  1.Hik33调控通用型应激响应(CSR)蛋白的差异表达实现对集胞藻6803环境压力应答的调控。
  通过使用定量蛋白质组学方法和生物信息学分析手段,我们发现Hik33的敲除显著影响了集胞藻6803中208个蛋白下调和369个蛋白质上调。在这些变化显著的蛋白中还包含了60个通用型应激响应(CSR)蛋白。
  在下调的蛋白中,最显著的功能富集分类是光合作用,特别是光系统Ⅰ和藻胆体蛋白,此类功能蛋白可提供细胞生长所需的碳源和能量,因此对集胞藻的生长和增殖是至关重要的。这些功能蛋白的下调表明,Hik33突变体或应激条件下的野生型细胞需要分别通过牺牲生长或增值水平来应对由Hik33敲除或应激引起的细胞内部的不良反应。
  相比之下,许多热休克蛋白、伴侣蛋白、蛋白酶蛋白和参与细胞内氧化还原状态调节的蛋白都因Hik33的敲除或胁迫应激而上调。蛋白质变性发生在几乎所有胁迫应激条件下,并导致变性蛋白质在胞质溶胶中的积累,这些变性蛋白的积累会进一步引发胁迫反应。热休克蛋白、伴侣蛋白和蛋白酶蛋白,如HspA、HtpG、GroEL1、DnaJ和ClpC的上调对于修复这种损伤是必要的,对于细胞存活也是必须的。此外,胁迫条件和Hik33的缺失也可能诱导细胞内氧化还原状态的改变和ROS的产生。因此,参与氧化还原调节和ROS清除的蛋白,包括MrgA(Slr1894)、过氧化物酶Sll0755和Slr0242、Gpx1(Slr1711)和Gpx2(Slr1922)、SodB、KatF(Sll1987)和Tpx(S07575)也同样上调。最后,在胁迫条件或Hik33突变体中,光系统Ⅱ的损伤也将导致应激反应,这需要更多的蛋白质,如FtsH和OCP进行保护和修复。综上所述,上调蛋白质的功能虽然各异,但对于保护蓝藻免受胁迫条件或Hik33敲除引起的损伤都是至关重要的。
  因此,我们认为,对于增殖和生存的协调可能是蓝藻在环境压力条件下经长期进化而演变出的生存策略,而Hik33则可能是这一生存策略的具体实施和关键调控因子。这也更加凸显了Hik33作为集胞藻6803中全局性调控因子的重要地位。
  2.△Hik33通过上调OPP途径获得更高效的葡萄糖利用率
  生长表型研究发现,当培养基中额外添加葡萄糖时可显著恢复Hik33突变体生长。为了进一步探究Hik33缺失诱导的应激反应是否是由于碳素缺乏导致,以及光抑制条件下蓝藻细胞如何利用有机碳源。我们在培养过程中额外补充葡萄糖(5%),定量比较该培养条件下Hik33突变体与野生型细胞蛋白质组水平的差异,进一步探究了Hik33突变体对有机碳源的同化策略。
  根据蓝细菌光合活性的水平,葡萄糖可以通过不同的途径被分解代谢。当光合作用被抑制时,例如在黑暗中或在PET抑制剂的存在下,如DCMU,外源葡萄糖主要通过可产生NADPH的戊糖磷酸途径(OPP)途径分解代谢。当光合作用被激活时,如在光照条件下或不存在PET抑制剂的情况,外源葡萄糖主要通过糖酵解的上游部分和卡尔文循环(Calvin cycle)途径代谢。然而,葡萄糖在受到部分光抑制的野生型细胞或Hik33敲除突变体细胞中是如何被降解利用的,目前为止对于该领域的研究还并不清楚。
  为了揭示Hik33突变体快速光合混合营养生长的蛋白质组学基础,我们比较了Hik33突变体和野生型细胞之间在正常和额外添加葡萄糖培养条件下,与碳代谢相关蛋白的差异表达情况。
  通过蛋白质组学数据的分析,我们发现,所有涉及NADPH产生的OPP通路中的关键酶蛋白,如Zwf、OpcA、Gnd和Pgl等,与野生型细胞相比该类蛋白表达量水平都由在正常培养条件下的显著或微量下调变成了在外加葡萄糖培养条件下的显著或微量上调,这也预示着Hik33突变体可能获得了额外的利用葡萄糖的能力。
  事实上,在光激活的异养生长(LAHG)条件下培养时,此时葡萄糖是唯一的碳源和能源,而且葡萄糖只能通过OPP途径降解,在该条件下Hik33突变体生长速率较野生型细胞有一定幅度的上升。这一结果进一步表明,Hik33突变体通过上调OPP途径获得了较高的葡萄糖利用效率。值得注意的是,在LAHG条件下,突变体的叶绿素含量仍然低于野生型细胞,这表明在LAHG条件下Hik33缺失诱导的应激反应并没有被消除。
  总之,以上结果均表明,Hik33敲除突变体可以更好的利用葡萄糖,而且最有可能通过上调OPP途径的关键酶蛋白来实现这一目的,但与此同时,由于Hik33本身缺失引发的细胞内应激反应并没有消除。
  基于蛋白质组学和表型实验结果,我们提出了一个模型来解释在光合混合营养生长条件下葡萄糖在Hik33缺失突变体中分解代谢的途径。在野生型细胞中,正如前人使用13C标记的葡萄糖进行的代谢通量分析实验结果所示,经过OPP途径代谢的碳流量几乎可以忽略不计。然而,在Hik33突变体细胞中,OPP变成了葡萄糖降解利用的主要途径,或者至少部分提供了用于CO2同化的NADPH和RuBP。
  3.△Hik33通过调控PetE和PetJ的差异性表达实现高浓度CO2培养条件下快速生长
  在培养Hik33缺失突变体时发现,向培养液中额外补充5%浓度的CO2气体,可显著提高Hik33突变体的生长。为了探究hik33缺失突变体在光合受损及NADPH供应量不足的情况下CO2的固定策略,我们在培养过程中额外补充过量CO2(5%),定量比较该培养条件下Hik33突变体与野生型细胞蛋白质组水平的差异,以期揭示蓝藻在光系统受损情况下(如Hik33突变体)NADPH供应及CO2同化策略。与在正常培养条件下Hik33突变体和野生型细胞的蛋白质组学数据相比较,高浓度CO2培养条件并没有大范围改变突变体和野生型细胞中的蛋白表达水平,但同时也存在个别变化显著的蛋白。如CupB、NdhD4、PetE和PetJ。虽然CupB和NdhD4表达水平的变化预示着CO2可获得性的变化,但这些变化并不能促进Hik33突变体的光自养生长。
  在蓝藻中,光合电子传递链(PET)和呼吸电子传递链(RET)均位于类囊体膜上,两个电子传输链彼此相互交织并且共享几个共同组分,例如,质体醌,细胞色素b6/f符合体和可溶性电子载体等。因此,不产生NADPH的RET可能与PET在内囊体膜电子流分配上存在竞争关系。
  PetE和PetJ是蓝藻细胞中仅有的两个可以将电子从细胞色素b6/f复合体传递到光系统Ⅰ和/或呼吸电子传递链末端氧化酶的可溶性电子载体。正常培养条件下,与野生型细胞相比,这两个蛋白在Hik33突变体中的表达量并没有太大变化,说明在普通培养条件下Hik33缺失突变体中,PetE和PetJ并没有被诱导或抑制表达。然而,在高浓度CO2培养条件下,与野生型集胞藻细胞相比Hik33缺失突变体中PetE蛋白的表达量出现了显著上调,而PetJ的表达量却显著下调。
  PetE的上调和PetJ的下调可能揭示了Hik33缺失突变体在高浓度CO2培养条件下实现快速生长的策略。在此条件下,CO2的可获得性已经不再是突变体生长的主要限制因素,但突变体的快速生长仍需要光合作用提供大量的NADPH用于CO2的固定。然而,突变体中主要光合机元件,如PsbO,PBS和PSI的下调并没有因高浓度CO2的培养条件而显著改变,NADPH的产生依赖于光系统的光电子传递,因此这仍构成了突变体实现高速生长的瓶颈。克服这个瓶颈的一个潜在的方法便是通过控制类囊体膜上电子传递的流向,使其尽可能少的流向呼吸电子传递链而最大化流向光合电子传递链,并用于NADPH生产。由于光合电子传递链和呼吸电子传递链都定位在类囊体膜上,且共享相同的两个可溶性电子传递载体PetE和PetJ。在高浓度CO2培养条件下,与野生型藻细胞相比,Hik33突变体中显著上调的PetE和显著下调的PetJ可能致使类囊体膜上的电子大量流向光合电子传递链的PSI而非呼吸电子传递链的末端氧化酶,这便可以为光合电子传递链提供充足的电子,进而产生充足的NADPH供应藻细胞固定CO2使用。
[博士论文] 沈辉
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:酿酒酵母Hda1是典型的Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶,Hda1酶活性的发挥需要两个相关蛋白Hda2和Hda3的参与,它们组成去乙酰化复合体(HDAC),可特异性作用于H2B和H3的去乙酰化,发挥表观遗传调控的功能。Hda1以二体形式发挥酶活功能,由N端的催化结构域和C端结构域组成。其催化结构域的同源结构已有较多报道,并且其催化机制也得到很好的阐述。C端结构域由于与裂殖酵母中新发现的Argonaute结合蛋白Arb2具有一定序列同源度,因此被命名为ARB2结构域。已有的研究表明,Arb2蛋白能够结合Argonaute形成新的Argonaute复合体,参与RNA介导的基因沉默过程。对ARB2结构域结构和功能的研究既有利于对Hda1去乙酰化过程的深入了解,又有助于对Arb2蛋白家族结构与功能的认识。
  在本研究中,解析了2.86(A)Hda1-ARB2结构域的晶体结构,ARB2结构域由α/β三明治核心结构和一段长的延伸手臂区构成。在晶体结构中ARB2结构域一个不对称单位含一个亚基分子,但其延伸手臂区可通过晶体学对称相关形成相互作用二体。突变实验和分子排阻层析实验也证实ARB2结构域在溶液中以二体形式存在,两个APB2结构域通过手臂区氨基酸的疏水相互作用形成倒“V”形二体结构。ARB2结构域与α/β折叠水解酶显示出结构相似性,但由于延伸区域不同,而且并不存在催化三联体,因此不具有水解酶活性。Pull-down实验和ITC实验表明ARB2结构域具有组蛋白结合能力,能够结合H2A/H2B和H3/H4。ARB2结构域二体作用面残基的突变将丧失其与组蛋白结合的能力,表明ARB2的二体结构为结合组蛋白所必须。突变实验和ITC实验证明ARB2结构域通过二体结构形成的沟槽与组蛋白结合。
  甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解中的重要酶,在辅因子尼古酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)存在下催化甘油醛-3-磷酸(GAP)氧化磷酸化为1,3-二磷酸甘油酸(BGP)。除此之外,大量的研究表明GAPDH还在DNA复制和修复,起始凋亡,细胞表面定位,结合细胞分子,膜融合和转运,tRNA出核和调节mRNA的稳定中发挥多种功能。GAPDH调节mRNA稳定性依赖于其对mRNA3'端AU富集元件(ARE)的结合,但是GAPDH对RNA结合的机制还没有阐明。
  在本研究中,通过荧光偏振实验确定酿酒酵母GAPDH3能够结合3段AUUUA重复的RNA序列,并对相同长度的polyA有近似的结合能力,但对相同长度的polyU和polyC却不能结合。修正了2.49(A)GAPDH3的晶体结构,在晶体学的一个不对称单位中含有一个分子,而分子排阻层析实验表明GAPDH3在溶液中以四聚体形式存在。利用晶体学对称操作获得了GAPDH3四聚体结构模型。根据表面电势分析,发现该四聚体两端有两个连续的正电荷区域,该区域包含了NAD+结合位点。荧光偏振实验证明NAD+可抑制GAPDH3对RNA的结合。在GAPDH3与NAD+复合物晶体结构中,发现NAD+分子的嘌呤环插入到GAPHD3窄的疏水口袋中并结合到GAPDH3的正电荷沟中。而腺苷酸与NAD+具有相同的腺嘌呤环头部,因此推测,GAPDH3对RNA识别的特异性来自于其正电荷沟槽中两个疏水的结合口袋紧密结合腺嘌呤,而其他位置只提供非特异的结合表面。
  金黄色葡萄球菌能够产生多种毒力因子引发人类疾病,毒力因子的表达受到一系列调控因子严格调控。最近发现金黄色葡萄球中的核苷磷酸酶SA1684蛋白能够影响毒力因子的表达。核苷磷酸酶从原核生物到真核生物广泛存在,从蛋白序列上看,SA1684蛋白与这些报道的核苷磷酸酶大不相同,这暗示着SA1684蛋白可能成为一个很有前途的抗金黄色葡萄球菌的药物靶点。因此对SA1684蛋白对底物结合模式和催化机制的研究具有重要意义。
  在本研究中,解析了SA1684蛋白的apo、ATPγS+钙离子、GDPβS+镁离子和GTPγS+钙离子四种形式的晶体结构,晶体学一个不对称单位中含有一个分子。结构比对发现SA1684蛋白活性口袋有两处碱基结合位点,可以结合长度不同的核苷二磷酸(NDPs)和核苷三磷酸(NTPs)。在不同的复合物结构中都存在两个金属离子,两个金属离子之间都存在一个保守的水分子,根据与同源蛋白结构比对推测这个水分子可能通过亲核攻击底物上的磷原子来参与水解反应。
[硕士论文] 孙丽敏
植物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:硫化氢(H2S)作为继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三种气体信号分子,在植物体内发挥着非常重要的生理调节作用。随着植物中H2S信号的研究受到空前关注,H2S在植物体内的多种生理生化功能逐渐被揭示:调节种子萌发、根器官发生、光合作用、气孔运动、花器官发育、叶片衰老等生长发育过程,以及响应环境的各种生物和非生物胁迫。虽然植物内H2S作为一种新型信号分子的研究已取得很大进步,但系统地阐述其生理功能和作用机制及与其它信号分子之间的信号网络关系仍然是急需解决的问题。因此,多角度多层次地阐释植物体内源H2S的生理功能和作用机理至关重要。
  本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型WT(Col-0),H2S产生酶L-Cys脱巯基酶编码基因LCD缺失突变体(lcd),WRKY18、WRKY40和WRKY60编码基因缺失三突变体(wrky18wrky40wrky60),H2S产生酶编码基因DES的T-DNA插入突变体(des),以及H2S产生酶编码基因DES过表达突变体(OE-DES)为实验材料,从表型、生理、细胞及分子等多水平探究气体信号分子H2S在拟南芥根生长、气孔运动、光合作用、叶片衰老过程中的生理功能和作用机理。主要研究结果如下:
  (1)H2S信号与ABA在调节根生长和气孔运动中关系的研究显示:外源ABA可诱导拟南芥WT的LCD表达量升高和内源H2S含量显著增加;H2S信号可以调节WRKY18、WRKY40、WRKY60三个转录因子的转录表达;lcd突变体由于H2S缺失使得ABA对WRKY18和WRKY40的转录抑制作用消失,表明H2S参与ABA对这三个WRKYs转录因子的转录调节;施加外源ABA,lcd幼苗根生长受ABA抑制作用较弱;施加外源H2S,wrky18wrky40wrky60的根生长受H2S促进作用仍然很显著。以上这些结果说明:H2S可能通过影响WRKY18、WRKY40、WRKY60转录表达参与ABA对幼苗根生长调节,但H2S对植物根生长的调节部分依赖于WRKYs,即H2S对植物根生长的调节作用还存在有不依赖于WRKY18/40/60的途径。此外,外源ABA促进野生型拟南芥WT的气孔关闭,但对于lcd的气孔关闭作用显著减弱,外源H2S促进wrky18wrky40wrky60和WT气孔关闭,但两者间无显著差异,暗示H2S参与ABA对气孔运动的调节不是通过WRKY18,WRKY40和WRKY60实现的。
  (2)H2S信号对拟南芥叶片光合作用调节的研究显示:植株在正常生长条件下,内源H2S促使叶片净光合速率、蒸腾速率、叶绿素含量显著升高;植株遭受干旱胁迫时,内源H2S可以保护叶绿体结构完整,促使叶片净光合速率显著上升和蒸腾速率显著下降,并且引起叶片气孔关闭和胞间CO2浓度显著升高。因此,H2S可能通过调节气孔运动达到蒸腾速率和光合效率之间的动态平衡,进而有效促进植物光合作用,保证植株正常生长以响应干旱胁迫。
  (3)H2S信号对能量代谢和叶片衰老过程作用机制的研究显示:正常生长条件下,内源H2S主要通过下调叶龄依赖基因SAG12表达,延缓OE-DES的叶片早衰;des体内ATPβ-1、ATPβ-2、ATPβ-3编码基因的表达量上调,而ATPε编码基因的表达量下调。干旱胁迫下,des体内的SAG13的表达量显著升高,导致其叶片早衰;OE-DES中ATPβ-1、ATPβ-2、ATPβ-3编码基因的表达量上调,而ATPε编码基因的表达量下调;并且OE-DES线粒体内ATPase活性显著高于des,des线粒体内ATP含量显著高于OE-DES。这些结果暗示:内源H2S调控ATP合成酶相关基因表达模式、ATPase活性和ATP含量,扮演能量代谢调节器的角色,维持植物生长发育的能量动态平衡。同时,内源H2S可以减轻干旱胁迫下线粒体肿胀损伤,维持线粒体结构和功能的完整,提高线粒体能量产生,进而延缓干旱诱发的植物叶片衰老。
  综上所述,内源H2S信号通过对拟南芥根生长、气孔运动、光合作用及叶片衰老过程进行调节,增强植物抵抗干旱胁迫的能力。
[硕士论文] 余道兵
微生物学 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:黑曲霉植酸酶PHYA目前被公认为最具应用前景的饲用植酸酶之一,但是野生型菌株所产生的植酸酶不能满足工业生产的需求,本研究以Aspergillus niger ZJUY中的植酸酶基因phyA为亲本,借助定点突变的方法,对植酸酶的关键位点的密码子进行优化,并引入氢键(T295S,Q296R和V43N)和对二硫键Cys196-Cys446进行缺失突变,以解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题。最终将絮凝素Flo1p与改造过的植酸酶以N端融合的方式,展示在Pichiapastoris GS115细胞表面,用1%的甲醇进行诱导表达,通过细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测,证实植酸酶在毕赤酵母细胞表面成功展示。
  本研究的主要研究结果如下:
  (1)以黑曲霉基因组为模板,通过三轮PCR获得去除内含子的植酸酶基因phyA,该法的优势在于在所提取的RNA质量较差的情况下仍可获得完整的去除内含子的植酸酶基因。
  (2)以野生型的PHYA为亲本,通过PCR最终成功引入R62、H63、G64、R66、P68、R146、H342、D343、S295、R296、N43和S446等12个突变位点,突变效率较高,操作简便易行。
  (3)借助无缝克隆的方法,成功将锚定片段FS、携带标签Flag的目的片段phyA插入到酵母表达载体pPICZαC中,相比于采用传统的载体构建方法,该法阳性克隆效率较高。
  (4)采用氯化锂转化的方法,成功将构建的8种表达载体pPICZαC-FS/phyA通过同源重组的方式整合到毕赤酵母GS115基因组上,并通过甲醇的诱导成功展示到GS115细胞表面。
  (5)通过展示酶特性的研究发现,二硫键Cys196-Cys446的缺失能够使展示酶的内源荧光的发射波长发生红移,改变了酶分子的构象。此外,二硫键Cys196-Cys446的缺失突变能够提高展示酶对底物的亲和力和底物专一性,但会使催化效率下降。
  (6)展示植酸酶引入氢键和缺失二硫键会导致酶促反应的最适温度和最适pH发生一定程度的改变。
  (7)通过热稳定性的研究发现,重组菌株A61在90℃水浴处理的过程中,展示酶活丧失比较缓慢,这一特性可以克服制粒过程中(60~90℃)植酸酶变性失活的不足。
  (8)通过酸碱耐受性研究发现,重组菌株A31、A61、A84在pH1.6-4.0的范围内,残余酶活均保持在80%以上,可以较好的满足动物饲料用酶的要求。
  (9)金属离子Na+、K+、Fe2+、Zn2+在低浓度时可以激活展示植酸酶的活性,而Cu2+、Mn2+、Co2+对展示植酸酶主要表现为抑制作用。
[硕士论文] 廖茂芪
生态学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:光照、水分、养分等资源在自然生境中常呈异质性分布。异质性氮素资源条件下,克隆整合能够显著提高群落地上生物量,但机制还不清楚。氮素是植物生长代谢的重要元素,对植物光合作用具有重要影响。异质性氮素条件下,氮素能够通过克隆整合实现在分株间的传输与再分配,并改善分株所在斑块氮素水平。因此,我们提出假说,克隆整合对氮素资源的传输分配可能有助于提升相连的分株及其所在斑块内共生植株的光合生理表现和叶片化学性质,进而影响相连分株所在斑块内全部植株的地上生物量积累。
  本实验以活血丹为研究对象,设置对照、低对比度与高对比度氮素异质性处理(即给予母株不同浓度的氮素资源);根据相连分株所在斑块与母株的距离设置邻近、间隔和远端斑块。通过测定氮素资源传输分配对不同斑块内相连分株和共生植株(即目标植株,由两个独立的活血丹幼嫩分株所组成)的光合生理表现(Pmax、Vcmax和Jmax)、叶片化学性质(叶绿素含量、叶片氮素含量光合器官氮素分配等)和生物量积累,旨在探究克隆整合提高斑块内全部植株地上生物量的机制,并了解相连分株间氮素传输分配与斑块氮素对比度和传输距离的关系。实验主要结果与结论如下:
  1)克隆整合对氮素的传输分配,显著提高了邻近、间隔斑块内相连分株和目标分株的叶片化学性质(叶片氮含量、叶绿素含量等)。随着分配到光合器官中的氮显著提高,分株光合生理表现(Pmax、Vcmax、Jmax)和氮素利用效率显著提升,进而显著提高相连分株与目标植株生物量积累。
  2)仅高对比度处理下相连远端分株光合生理表现(Pmax、Vcmax、Jmax)和叶片化学性质(叶片氮素含量和叶绿素含量)与相应的同质处理远端分株表现出显著差异。与低对比度处理相比,高对比度处理不同位置目标分株光合生理表现(Pmax、Vcmax、Jmax)、叶片化学性质部分参数(叶片叶绿素含量、叶片氮素含量)、生物量积累均显著增加。可见,随着斑块对比度增强,克隆整合强度相应地增强,并且克隆整合对相连分株的影响范围相应增加。
  3)受传输距离限制,异质性氮素资源条件下,受到无论是相连分株或是目标分株,不同位置分株光合生理表现(Pmax、Vcmax、Jmax)和叶片化学性质部分参数(氮素利用效率、叶片光合器官中氮分配系数)均表现出随着与母株距离的增加,呈现下降的趋势;但是分株叶片氮素、叶片绿叶素呈现出随着传输距离增加,而先增加后减小的格局,表现出一定的顶端效应。可见,克隆整合对不同叶片性状的影响可能呈现不同的整合格局。
  克隆整合对资源传输分配有利于提高相连分株及斑块内共生目标植株叶片光合器官中的氮分配,这有助于提升分株光合生理表现,从而提升斑块内植株地上生物量积累。因此,本研究证明提出的假说,并且这种资源传输可能受斑块对比度与传输距离的影响,呈现不同的分配格局。这有助于认识植物克隆生活史性状对生态系统功能的影响机制,有助于进一步阐明和揭示异质性环境下克隆整合的生态适应意义。
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