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[硕士论文] 高翠珠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:设施大棚草莓、番茄灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染引起的一种世界性病害。本文主要研究湖北省设施大棚草莓和番茄灰霉病的发生动态及影响因素分析。2016年在湖北省农业科学院草莓大棚种植基地及武穴市吴谷英村番茄大棚种植基地分别选取3个具有代表性的设施大棚。结合保湿培养法和特异性PCR法检测健康组织上灰霉菌带菌率,系统调查各生育期不同时间、不同组织的病害发生动态。选取与果实发病率具有显著相关性的因子建立线性回归方程,分析草莓和番茄灰霉病的发生与不同流行因子之间的关系,主要结果如下:
  (1)分析设施大棚中草莓灰霉病发生动态及影响因素结果表明:在12月下旬即可检测出草莓不同组织带菌,果实带菌率高峰期在3月下旬、4月中上旬和5月初,1月初、2月下旬和4月中上旬为花朵带菌率的高峰期,叶片带菌无明显高峰期。调查田间发生动态发现,在12月下旬即可在草莓不同组织上观察到灰霉病的发生,果实发病高峰期为3月上旬、4月下旬和5月上旬,3月上旬和5月中上旬为花朵发生灰霉病的高峰期,叶片无明显发病高峰期。基于对设施大棚草莓不同组织带菌率及发生动态的调查,选取其中两个设施大棚数据分析草莓果实发病率与花朵发病率、叶片发病率、果实带菌率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度和相对湿度的相关性,结果表明:草莓果实发病率与花朵发病率、果实带菌率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度显著相关。果实带菌率、花朵发病率和温度所建方程预测值与实际值拟合程度好。
  不同成熟度草莓果实影响灰霉病的发生,结果发现果实红熟期发病程度较绿熟期、白熟期和粉熟期重。
  (2)分析设施大棚中番茄灰霉病发生动态及影响因素结果表明:在3月中上旬即可检测到番茄叶片上的灰霉菌,4月上旬即可检测到花朵带菌;3月下旬、4月下旬和5月中下旬均为叶片带菌率的高峰期,4月下旬和5月中下旬为花朵带菌高峰期。对番茄不同组织灰霉病的田间发生动态进行调查,发现叶部灰霉病在3月中上旬开始发病,4月中上旬花朵发病,茎秆发病时间在4月中下旬,果实发病时间在4月底;叶片发病高峰期在4月上旬、4月下旬和6月中上旬,花朵发病高峰期在6月中上旬,茎秆发病高峰期在5月下旬和6月中上旬,果实发病高峰期在5月中下旬和6月中旬。基于对设施大棚番茄不同组织带菌率及发生动态的调查数据分析番茄果实发病率与花朵发病率、叶片发病率、茎秆发病率、花朵带菌率、叶片带菌率、温度、相对湿度相关性结果表明:花朵发病率、叶片发病率、花朵带菌率、叶片带菌率和相对湿度与果实发病率呈显著相关性。花朵发病率、花朵带菌率、叶片带菌率所建回归方程预测值和实际值拟合程度好。
  不同成熟度番茄果实与灰霉病的发生,结果发现果实白熟期和转色期发病程度较绿熟期和红熟期重。
  不同温湿度及保湿时间对灰霉病发生的影响显著;果实有伤情况下接种,10-25℃不同保湿时间灰霉病均会发生,保湿12h后,病斑扩展明显,30℃时需保湿12h后才会发病。无伤情况下接种,在最适温度20℃时,至少需要保湿36h才会发病,10℃和30℃下,均需要保湿4d以上才能发病。番茄灰霉病在20℃下随着相对湿度(RH)的增加病斑直径也随之增大。在果实有伤条件下RH需达到66%可发病,无伤条件下RH需达到92%可发病。不管接种果实有无伤口,在RH为100%时病斑直径最大,在RH为20%时,均无病斑产生。
  番茄叶片和茎秆病残体中的灰霉菌在不同土壤湿度中存活期为:干燥土壤>半湿润土壤>湿润土壤。在不同土壤深度中存活期为:土壤表面>土下10cm>土下20cm。
[博士论文] 顾琼楠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:由希金斯刺盘孢引起的炭疽病是十字花科蔬菜生产上的毁灭性病害之一。近年来,希金斯刺盘孢全基因组序列的公布和遗传转化体系的完善加速了希金斯刺盘孢致病相关基因的发掘和鉴定,同时也为从基因组水平上深入研究希金斯刺盘孢致病分子机制提供了新的平台。本研究对希金斯刺盘孢致病缺陷突变体Ch-1-G281的ChRgf基因和突变体Ch-1-E240的ChAcs基因的功能进行了研究,并观察了希金斯刺盘孢侵染荧光标记拟南芥植株寄主活体营养阶段的亚细胞反应,主要结果如下:
  (1)利用农杆菌介导的转化方法构建了希金斯刺盘孢Ch-1菌株的T-DNA插入突变体库,获得了2000个转化子。通过将突变体分生孢子接种拟南芥植株,观察接种第4天的发病症状及突变体侵染结构的形成情况,筛选得到了7株致病缺陷型突变体,分别为致病丧失突变体Ch-1-G281及致病减弱突变体Ch-1-G090、Ch-1-G256、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240。通过Southern杂交验证了7株致病缺陷型突变体的T-DNA插入拷贝数,其中Ch-1-G256、Ch-1-G281、Ch-1-G310、Ch-1-G323、Ch-1-G668、Ch-1-E240为单拷贝插入,而Ch-1-G090为双拷贝插入。通过Inverse-PCR对致病缺陷型的侧翼序列进行扩增,分别获得了7个T-DNA插入突变体的侧翼序列。侧翼序列分析结果显示:突变体Ch-1-G281T-DNA插入破坏了RasGEF(Ch063_04179)基因,该基因全长3057bp,编码1018个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。突变体Ch-1-G090T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_10682)基因,该基因全长543bp,编码180个氨基酸,有1个外显子;另一个插入位点破坏了RNA加工蛋白FCF1(Ch063_10671),基因全长324bp,编码108个氨基酸,有2个外显子,1个内含子。突变体Ch-1-G256T-DNA插入破坏了乳糖透过酶(Ch063_16024)基因,该基因全长477bp,编码159个氨基酸,有2个外显子,1个内含子。突变体Ch-1-G310T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_15059)基因,该基因全长243bp,编码80个氨基酸,有1个外显子。突变体Ch-1-G323T-DNA插入破坏了丝氨酸苏氨酸激酶cot-1(Ch063_12968)基因,该基因全长1983bp,编码660个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。突变体Ch-1-G668T-DNA插入破坏了假定蛋白(Ch063_01887)基因,该基因全长645bp,编码214个氨基酸,有1个外显子。以及突变体Ch-1-E240T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶(Ch063_08070)基因,该基因全长1275bp,编码424个氨基酸,有4个外显子,3个内含子。
  (2)T-DNA插入突变体Ch-1-G281在PDA上的菌落形态变化较大,其菌丝生长速度变慢,菌丝呈多分支状。突变体分生孢子产量降低,孢子液喷雾接种拟南芥叶片后,分生孢子不能在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞,推测该基因影响了分生孢子的萌发以及附着胞的形成。证实T-DNA插入破坏了Ras鸟氨酸交换因子(ChRgf),ChRgf基因全长为3276bp,编码1018个氨基酸。敲除ChRgf基因影响了希金斯刺盘孢的营养生长和菌丝形态,敲除转化子⊿ChRgf-42生长缓慢,菌丝呈现多分枝;产孢量显著下降,仅为野生型的8%;在塑料玻片上诱导孢子萌发,孢子萌发率明显降低,为野生型的50%,萌发的孢子不能正常形成附着胞,而附着胞产率约为野生型及互补突变体的5-10%,而附着胞膨压与野生型菌株并无明显差异。敲除转化子⊿ChRgf-42孢子液喷雾接种拟南芥叶片后,敲除转化子⊿ChRgf-42分生孢子不能在叶片表面萌发并产生黑化的附着胞。敲除转化子⊿ChRgf-42孢内cAMP含量显著降低,仅为野生型胞内cAMP含量的60%,外源加入cAMP以及IBMX可使敲除转化子⊿ChRgf-42对外界疏水信号产生响应。敲除转化子⊿ChRgf-42对外界胁迫如NaC1,KCl的耐受性增强。基因互补实验结果表明,基因敲除菌株的产孢、萌发、附着胞形成及致病性均恢复至野生菌株水平。表明希金斯刺盘孢ChRg基因作为cAMP,Ras等通路的上游调控因子在调控营养生长、产孢以及致病相关的侵染结构的发育等方面具有重要的生物学功能。
  (3)T-DNA插入突变体Ch-1-E240在菌丝生长、产孢、孢子萌发及附着胞形成等方面与出发菌株Ch-1相比没有显著差异。孢子液喷雾接种拟南芥植株后拟南芥植株发病严重度低于野生型,显微观察表明分生孢子在叶片表面正常萌发产生黑化的附着胞,能正常侵染产生初生菌丝,但次生菌丝产量明显降低,推测该基因影响了次生菌丝的产生。T-DNA插入破坏了乙酰辅酶A合成酶基因(ChAcs1),ChAcs1基因全长为1441bp,编码432个氨基酸。生物信息学分析发现,希金斯刺盘孢中有两个乙酰辅酶A合成酶编码基因,分别命名为ChAcs1(Ch063_08070)和ChAcs2(Ch063_00691),采用基因敲除和互补策略,分别对这两个基因进行了功能分析:ChA cs1基因敲除对希金斯刺盘孢的营养生长、产孢和附着胞的形成与野生型无明显差异;ChAcs2基因敲除无明显的表型改变。通过GFP融合表达及蛋白定位分析,发现ChAcs1蛋白、ChAcs2蛋白的表达分布于整个细胞质。⊿Chacs1不能利用乙醛、乙醇、乙酸等非发酵碳源,胞内脂质含量下降。⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥叶片4天后,植株发病严重度低于野生型,只有47%的初生菌丝能正常发育并形成次生菌丝;而⊿Chacs2敲除转化子对致病性无明显影响。对⊿Chacs1敲除转化子接种拟南芥活体营养阶段(侵染40小时后)进行全基因组RNA-seq分析,表明ChAcs1参与调控了一系列与致病、乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环以及乙醛酸循环相关的基因,致病相关基因如MAPK,STE7等基因下调表达,乙醇代谢、糖酵解、三羧酸循环中重要节点基因如乙醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶等基因下调表达。基因互补实验结果表明,基因敲除菌株的致病性恢复至野生菌株水平。以上结果表明ChAcs1可能参与调控了丙酮酸-乙醛-乙酸代谢途径,在调控脂类代谢、致病相关侵染结构如次生菌丝的形成等方面具有重要的生物学功能。
  (4)用希金斯刺盘孢侵染不同荧光蛋白标记的转基因拟南芥植株,以研究拟南芥与希金斯刺盘孢互作过程中的活体营养界面的膜区室的重分布。在活体营养寄生阶段,寄主细胞的质膜蛋白表现出不同的定位模式,肉豆蔻酰化和棕榈酰化蛋白MAP,异戊二烯蛋白PAP,低温诱导蛋白LTI6b均定位于活养寄生界面,突触融合蛋白PEN1与ABC转运蛋白PEN3定位于初级初生菌丝的活养寄生界面,质膜H+-ATP酶PMA与质膜固有蛋白PIP2定位于初生菌丝的基部。与此同时,寄主细胞细胞膜脂也在初生菌丝侵染阶段呈现出不同的定位模式:磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P定位于初生菌丝的基部,磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸PI(4,5)P2定位于活体营养界面,磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养寄生界面。同时磷脂酰肌醇-3-磷酸PI3P定位于初生菌丝的活养界面说明液泡也参与了活养界面的合成以及互作。后期由不同的液泡膜标记蛋白包括液泡膜水通道蛋白以及囊泡相关蛋白VAMP711均包裹初生菌丝界面,证明了液泡参与初生菌丝界面的互作过程。随着初生菌丝的发展,液泡逐渐变小,直至液泡膜破裂,与此同时,粗大的初生菌丝向细长的次生菌丝进行转化,说明寄主细胞死亡与液泡的破裂以及初生菌丝向次生菌丝转变是同一时间点发生的。此外,内吞囊泡ARA7/RABF2b单一定位于初生菌丝的活体营养界面说明寄主细胞的内吞性质发生了改变。上述研究结果表明,希金斯刺盘孢与拟南芥互作过程中存在特殊的活养寄生界面,这一活养寄生界面可能是通过细胞膜的分化或者通过囊泡运输而来,同时,液泡也参与了活养寄生界面的形成。
[硕士论文] 强翠翠
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:盾壳霉(Coniothyrium minitans)作为防治菌核病的生物制剂已经被大量研究。本论文主要研究盾壳霉与田间两种灭生型除草剂草甘膦和草铵膦共同施用问题,并针对试验过程中出现的现象,主要研究了除草剂草铵膦的靶标基因在盾壳霉生长过程中的功能。试验结果如下:
  1.盾壳霉对两种除草剂敏感性评价:草甘膦和草铵膦对盾壳霉菌丝均有较强抑制作用,EC50分别为714.3μg/mL和574.5μg/mL;对孢子抑制作用相对较弱,草甘膦EC50为1019.8μg/mL,而草铵膦对盾壳霉孢子的萌发基本没有抑制作用;对核盘菌菌丝均有较强的抑制作用,EC50分别为1695.8μg/mL和223.5μg/mL,草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著;两种除草剂存在下会延迟盾壳霉孢子的萌发时间,但是对盾壳霉孢子没有杀灭作用;两种除草剂存在下,会影响盾壳霉对核盘菌菌核的寄生,草铵膦较草甘膦抑制作用更为显著。但结合两种除草剂的性质,草铵膦在田间能快速被降解且不能杀灭孢子,草甘膦也不能杀灭孢子且在较高浓度下仍对盾壳霉寄生核盘菌菌核没有太大影响。所以,在田间正常条件下盾壳霉孢子均可以和两种除草剂进行混合施用。
  2.盾壳霉在含草铵膦的PDA平板上生长异常,推测草铵膦的靶标对盾壳霉的生长起重要作用,为了探究生长异常原因,了解草铵膦的作用机理,为研究抗药性材料提供依据,我们研究了草铵膦对盾壳霉的作用。盾壳霉中存在三个含有谷氨酰胺合成酶保守结构域的基因,其中一个为FluG蛋白,另外两个为谷氨酰胺合成酶类似蛋白,将其分别命名为GlnA1(CmZS1_02675)和GlnA2(CmZS1_07614)。基因GlnA1敲除会使盾壳霉致死,加入一定量谷氨酰胺之后,敲除转化子可以恢复生长和产孢,但是菌落偏白,疑似黑色素产量降低,且加入其它类氨基酸不能恢复其生长和产孢。耐药性试验表明,草铵膦对GlnA1敲除转化子无抑制作用。GlnA2敲除转化子与菌株ZS-1相比,在菌落形态、菌丝尖端、生长、产孢、生物学产量和对草铵膦的抗药性方面均无显著差异。因此可以确定,在盾壳霉中GlnA1为除草剂草铵膦的靶标,而GlnA2不是。
[博士论文] MUHAMMAD ADNAN
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:(厌)葡萄孢(Botrytis cinerea)是包括番茄和草莓在内的超过200种寄主植物的病原菌,其引起的(厌)霉病是世界范围的严重病害。本研究调查了采自番茄和草莓的(厌)葡萄孢对二甲酰亚胺类和苯甲酰胺类杀菌剂的抗性发生情况,同时对抗性菌株进行了抗性分子检测和适合度测定。主要结果如下:
  1)草莓和番茄是世界上种植的重要经济作物。中国作为重要的草莓种植国和最大的番茄生产国,深受(厌)霉病的困扰。本研究测定了从湖北省不同地区番茄和草莓保护地采集的(厌)葡萄孢对杀菌剂腐霉利的敏感性。腐霉利敏感和抗性菌株的平均EC50值(抑制50%生长时的有效浓度)分别为0.25μg/ml和3.02μg/ml。抗性菌株(ProR)的频率为16%,最高的频率发生在荆门。腐霉利抗性菌株对其他二甲酰亚胺类杀菌剂存在正交互抗性,但对苯吡咯类杀菌剂没有交互抗性。敏感菌株和抗性菌株的适合度,比如菌丝生长、渗透压敏感性和致病力,两者之间存在显著差异。此对BcOs1基因的氨基酸序列发现腐霉利抗性菌株在第365位密码子(舍)有点突变(I365S),或者在369位密码子和373位密码子存在一对点突变(Q369P,N373S)。
  2)本研究还测定了以上(厌)葡萄孢菌株对苯甲酰胺类杀菌剂苯酰菌胺的敏感性。经菌丝生长分析,苯酰菌胺敏感(ZoxS)和抗性菌株(ZoxR)的平均EC50值分别为0.27μg/ml和4.98μg/ml。来自八个地点的菌株约有8.5%对苯酰菌胺有抗性。在所检测的样品中,最高的抗性频率发生在荆门。苯酰菌胺抗性菌株对多菌灵存在正交互抗性。敏感菌株和抗性菌株的适合度之间不存在显著差异,表明抗性发生风险较高。对(厌)葡萄孢的TUB2基因进行序列分析发现三个之前报道的点突变(E198A,E198K,F200Y)和一个新点突变(T351I)。这个新突变总出现在舍有E198K点突变的菌株中。在高抗菌株中则检测到点突变F200Y。新点突变T351I和所有其他突变的发现表明抗性发生的风险与日俱增。本研究较好地阐明了中国湖北省(厌)葡萄孢对常用杀菌剂的抗性发生特点,结果有利于提高杀菌剂抗性的治理策略。
[硕士论文] 田甜
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和主要的作物虫害线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:
  基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955(41.032~125.246)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825(30.139~264.375)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为:y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。
  为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10_C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10_C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。
  将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12h和24h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。
[硕士论文] 马超
农药学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉蚜(Aphis gossypii Glover)是世界性害虫,由于其多食性的特点,在与不同植物长期协同进化的过程中,形成了不同的寄主专化型。目前认为能够对昆虫寄主隔离产生关键性影响的是植物体内的次生代谢化合物。葫芦素B(Cucurbitacin B)与表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是两种专化型棉蚜寄主瓜类和棉花中的典型次生代谢物,本文研究了葫芦素B和EGCG对两种不同寄主专化型棉蚜生长发育和解毒代谢酶的影响,探讨葫芦素B和EGCG在两种专化型棉蚜形成中的作用及两种次生代谢物作为棉蚜防治候选物的可能。
  1.通过室内建立棉蚜种群生命表的方法,发现棉蚜取食Cucurbitacin B处理的寄主植物叶片后,棉花型与黄瓜型棉蚜子代存活率、存活天数均明显低于对照组差异显著,净增殖率R0、平均世代时间T均小于对照组。表明Cucurbitacin B一定程度上抑制了两种专化型棉蚜的生长发育,有望开发其作为一种新型农药为棉蚜的绿色防控做出贡献。
  通过建立室内棉蚜寄主转换生命表的方法,发现棉花型与黄瓜型棉蚜子一代、子二代、子三代平均世代时间T、净增殖率R0、内禀增长率rm与对照组相比均无明显差异,表明葫芦素B不能提高棉花型与黄瓜型棉蚜对非寄主植物的适合度。
  2.通过建立室内棉蚜种群生命表的方法,发现棉蚜取食EGCG处理的寄主植物叶片后,棉花型与黄瓜型棉蚜子代存活率、存活天数均明显低于对照组且差异显著,净增殖率R0均小于对照组。说明EGCG抑制了两种专化型棉蚜的生长发育,有望开发成为新型绿色农药,为新型杀虫剂的合成提供新思路。
  通过建立室内棉蚜寄主转换生命表的方法,发现棉花型棉蚜子一代处理组净增殖率R0、平均世代时间T均大于对照组且差异显著,内禀增长率rm无明显差异;子二、三代处理组净增殖率R0、内禀增长率rm均小于对照组且差异显著,平均世代时间T无明显差异。黄瓜型棉蚜子一、二、三代处理组R0、T、rm均高于对照组且差异显著,综上所述EGCG稳定提升了黄瓜型棉蚜对于非寄主植物棉花的适和度,因此EGCG有可能是影响黄瓜型与棉花型棉蚜寄主专化型形成的一种物质。
  3.分析了棉花型与黄瓜型棉蚜取食Cucurbitacin B、EGCG处理的寄主植物叶片后,对其体内Car E、GSTs、ACP、Ach E及CYP450酶活性的影响。结果表明,随着取食Cucurbitacin B时间的延长,棉花型与黄瓜型棉蚜体内GSTs、ACP、Ach E酶活性均逐渐升高,在72h时达到最大值;CarE酶活性均逐渐降低,72h时活性最低;CYP450酶活性则先降低后升高。随着取食EGCG时间的延长,棉花型与黄瓜型棉蚜体内GSTs、ACP、Ach E、Car E酶活性均逐渐升高,在72h时达到最大值;CYP450酶活性则先降低后升高。
[硕士论文] 柴思睿
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:黑点病是一种世界范围内常见的柑橘真菌性病害,在中国江西,广西,广东,陕西,福建,湖南,重庆,上海等柑橘产区均有发生。该病原菌为间座壳科(无性态,拟茎点霉属),Diaporthe属具有很高的种群多样性。目前在世界范围内已经报道了22个种和柑橘有关。本研究目的在于鉴定在江西省引起柑橘黑点病的Diaporthe种,Diaporthe的种群结构。
  在江西省的12个果园内,我们在两个柑橘品种(纽荷尔脐橙和南丰蜜桔)上收集并鉴定了802个单孢菌株。其中,420株来自于叶片,309株来自于果实,73株来自于枝条,病枝、病叶和病果均具有典型的黑点病症状。
  我们从802个菌株中随机选取140个。基于5个位点(核糖体内转录间隔区(ITS),转录延伸因子1-α(TEF),β-微管蛋白(TUB),钙调蛋白(CAL),组蛋白-3(HIS))进行物种的分子鉴定。
  从140个单孢菌株中共鉴定出27个Diaporthe种。其中发现了5个新种(种名尚未确定)。并在柑橘上首次报道了13个新纪录种D.apiculata,D.lagerstroemiae,D.mali,D.momicola,D.penetriteum,D.perniciosa and D.sennicola,D.eucalyptorum,D.longicicola,D.passifloricola,D.podocarpi-macrophylli,D.sackstonii,D.tectonendophytica,其中的6个新纪录种在中国首次发现。总的来说,在江西省发现了18个一起柑橘黑点病的Diaporthe种。南丰蜜桔上鉴定出19个种,纽荷尔脐橙上鉴定出17个种。南丰县发现了19个Diaporthe种,南康县发现了14个Diaporthe种,信丰县发现了4个Diaporthe种。同样的在叶片上分别发现了21个种,在果实上发现了11个种,枝条上发现了8个种。不同的柑橘品种和组织上,Diapothe citri均是优势种。
[硕士论文] 何有为
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌广泛存在于自然界中,可产生丰富的次生代谢物质,具有极强的抗逆能力和环境适应性,是一类具有实际用途和经济价值的微生物类群。本研究通过室内筛选获得对油菜根肿病菌(Plasmodiphora brassicae)具有较好抑制效果的生防芽孢杆菌F85和T113,此外还发现了一株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有很强拮抗效果的枯草芽孢杆菌BJ-1。本研究以此为材料,分别对生防菌株抑制油菜根肿病和稻瘟病的生防机理进行探讨,并综合评价生防芽孢杆菌的生防效果。主要研究结论如下:
  1.从湖北省当阳市油菜根肿病发生严重田块的健康油菜根际土壤先后分离微生物菌株667株,其中细菌323株,真菌253株,放线菌91株;以棉花枯萎病菌及稻瘟菌作为根肿菌指示菌进行平板对峙筛选,其中有54株分离菌株抑菌带宽度大于3mm;通过离体试验发现有20株生防菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制率达30-50%,16株可使根肿菌休眠孢子失活率达40-55%;通过盆栽防治试验发现有2株生防菌株F85和T113对根肿病防治效果达60%以上;两株生防菌处理后显著降低根肿菌的根毛侵染率,降低根肿菌休眠孢子初级原质团的分化,抑制次级游动孢子囊的形成。进一步对生防菌株F85和T113进行鉴定。生防菌株F85和T113菌体细胞均呈杆状,革兰氏染色反应显示阳性,16S rDNA分子鉴定且系统进化树分析都表明菌株F85和T113属于Bacillus,利用Biolog微生物快速鉴定系统鉴定结果也显示为芽孢杆菌属,但不能准确鉴定到种。
  2.通过传统的形态学,16S rDNA序列分析和Biolog微生物快速鉴定系统将对稻瘟菌具有强拮抗作用的菌株BJ-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液经不同温度(4-100℃)和不同pH(2-12)处理后对稻瘟菌菌丝的生长抑制效果不变,表明枯草芽孢杆菌BJ-1分泌产生的抑菌成分具有热稳定性及耐强酸、碱能力。平板对峙试验结果表明,枯草芽孢杆菌B J-1具有较广的抑菌谱,对多种植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对稻瘟菌的抑菌带达22.7mm。显微观察发现,枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液(0.5%v/v)处理后的稻瘟菌菌丝尖端膨大畸形,有菌丝溢断现象。分生孢子经发酵液处理后萌发不正常,产生的芽管畸形膨大,对附着胞形成具有明显的抑制作用。在离体叶片上,浓度为1x108CFU/mL的BJ-1菌体悬浮液和浓度为5%的发酵液和发酵滤液已可完全防治稻瘟病。盆栽试验结果表明,10%枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理,防治效果达50.0%;BJ-1发酵液浸种处理防效更好,对稻瘟病防效可达74.3%,且对水稻植株生长有促生作用。通过实时荧光定量PCR检测,发现BJ-1发酵液处理种子后能诱导SA信号通路PAL、ICS1基因、JA信号通路AOS2基因以及抗性相关蛋白PR1a和PR10的上调表达。说明BJ-1发酵液处理种子可诱导水稻植株体内SA和JA信号通路相关基因的表达,激活水稻的防卫反应,诱导寄主产生系统抗性。
[博士论文] 哈米德
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:真菌病毒是寄生真菌的病毒,其中一些病毒可以引起植物病原真菌致病力的衰退,具有控制作物病害的潜力。引起菌核病的核盘菌在自然界中广泛存在,可感染450多种或亚种植物。在此研究之前,实验室已经从核盘菌中发现了一些对核盘菌具有显著影响的真菌病毒,它们显著地降低了致病性。从中国湖北省、江西省和安徽省等地方分离获得了2000株核盘菌菌株,获得了173株生长异常菌以期从中筛选新的真菌病毒。分别从173个菌株中提取获得了总RNA并等量混匀,之后对总RNA样品进行了RNA_Seq分析。经过拼接,获得了247个具有显著病毒序列特性的contig,这些contig预示测定的173个菌株中存在多种多样的真菌病毒。对contig所推定编码的蛋白序列在NCBI数据中进行比对,发现247个contig可能代表了48种真菌病毒,其中35种ssRNA(+)病毒,7种ssRNA(-)病毒,5种dsRNA病毒和1种ssDNA病毒,其中线粒体病毒是主要类型。
  对四个Contig(contig3,contig50,contig71和contig1178)所代表的新RNA病毒进行了确认,其中contig3和contig50代表的为负链RNA病毒,contig3所代表的病毒命名为Sclerotinia sclerotiorum bunya-like virus1(SsB1V1),隶属于Bunyaviridae科;contig50所代表的病毒命名为Sclerotinia sclerotiorum negative-stranded RNA virus9(SsNsRV9),与一些分类地位待定的病毒具有较近的亲缘关系。contig71和contig1178代表的为新的(+)ssRNA病毒,均为Tymovirales目的病毒,分别命名为Sclerotinia sclerotiorum mycotymovirus1(SsMTV1)和Sclerotiniasclerotiorum deltaflexivirus2(SsDFV2)。
  对SsDFV2进行了详细的研究,发现该病毒与Botrytis porri RNA virus1(BpRV1)共同侵染低毒菌株228。228菌株在PDA上生长缓慢,产生菌核少,而且产生时间延迟,几乎不能诱导油菜差生病斑。建立在Contig序列的基础上采用5'-和3'-RACE等对SsDFV2的基因组进行了全长测定。发现SsDFV2的基因组全长为6711nt,含有Poly(A)尾。SsDFV2的基因组只含有一个推定的大开放阅读框架,编码一个假定的病毒RNA复制酶,包括典型的甲基转移酶、RNA解旋酶和RdRp等三个功能域。SsDFV2与核盘菌上的另外一种病毒
  Sclerotinia sclerotiorum deltaflexivirus1(SsDFV1)具有较高的同源性,复制酶中氨基酸相同性达到446/1185(38%),相似性达到625/1185(52%)。它们在系统上聚为一支,同属于拟建立的Deltaflexiviridae科。SsDFV1的基因组编码4推定的蛋白,而SsDFV2的基因只编码RNA复制酶,推定SsDFV2在核盘菌中可能丢失了其它的基因。
  营养体不亲和性反应严重限制了真菌病毒在寄主真菌间的扩散,严重制约了真菌病毒防治病害的效果。我们研究发现SsDFV2具有强的侵染能力,将菌株228与其营养体不亲和的菌株Ep-1PNA367和菌株1980进行对峙培养,发现病毒SsDFV2可以扩散到这两个菌株的菌落之中,而与SsDFV2共同感染菌株228的BpRV1却没有这种扩散能力。进一步将感染SsDFV2的Ep-1PNA367与菌株1980对峙培养,发现Ep-1PNA367同样可以扩散到菌株1980之中,进一步表明SsDFV2的扩散不受营养体不亲和性的限制。我们的发现表明真菌中存在高效突破寄主营养体不亲和性限制的RNA病毒,为利用真菌RNA病毒研究提供了新的思路。
[硕士论文] 刘磊
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:东方粘虫Mythimna separata属鳞翅目夜蛾科,幼虫可危害小麦、玉米和水稻等粮食作物,危害面积广,造成的损失严重,因此成为我国重要的农业害虫。雄蛾信息素参与了两性求偶、交配过程中的信号交流,但关于东方粘虫雄蛾信息素的生物学特性和具体功能还不清楚。本课题通过气相色谱-触角电位联用仪(GC-EAD)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对粘虫雄蛾味刷提取液进行鉴定和定量分析;通过观察粘虫两性交配行为,明确雄蛾信息素的释放方式;最终通过风洞测试以及室内求偶、交配试验确定雄蛾信息素的具体功能。主要结果如下:
  1.粘虫雄蛾信息素的提取与鉴定
  通过对雄蛾信息素的测定,发现了苯甲醛与苯甲醇这两种物质对雌、雄蛾均有明显的触角电位反应。采用内标法对两种物质进行定量分析,测得单头4日龄雄蛾含有苯甲醛19.63μg、苯甲醇约1.89μg。
  2.粘虫雄蛾信息素的生成与释放
  位于粘虫雄蛾前腹的味刷是信息素释放器官,而其干内部中空和表面孔状结构有利于信息素的储存与散发。雄蛾羽化后8小时,味刷开始从腹部第二节节间膜处缩回至3-4节囊内,羽化后24小时绝大多数雄蛾的味刷缩回。利用GC-MS检测不同时间段、不同位置状态的味刷中气味物质的含量,得知雄蛾信息素在味刷开始缩回时合成,并在缩回囊内后大量生成。粘虫成虫求偶、交配的整个过程中味刷不会外翻,雄蛾在两性生殖器接触过程中会弯曲腹部并张开其中一侧腹部囊的边缘,而雄蛾在交配后信息素下降了约16%。
  3.粘虫雄蛾信息素对成虫电生理反应及生殖的影响
  EAG测试结果表明,随着味刷提取液浓度的增加(0.1ME-2ME),雌、雄蛾的触角电位反应随之增大,在高浓度下,雌蛾反应值大于雄蛾;雄蛾信息素能够使雌性求偶提前以及提高求偶率;雄蛾味刷或雌蛾触角的缺失与对照相比,交配率没有显著差异,而缺失触角的雄蛾交配率为0;雌蛾与1日龄剪去味刷的雄蛾交配,能提高产卵量;剪去味刷的雄蛾与正常雄蛾具有相同竞争雌蛾的能力;风洞行为测试结果表明,味刷提取液对雌蛾没有吸引作用,但是会一定程度上抑制雄蛾接近处于求偶状态的雌蛾;在雌蛾腹部滴加雄蛾信息素或正己烷,处理组雌蛾交配率为17.24%,对照组雌蛾交配率为52.72%,组间有显著性差异,表明雄蛾信息素能抑制同种其他雄蛾接近雌蛾。
[硕士论文] 牛炳棵
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是我国新近发现的危害柠檬的重要病毒,目前对其致病机制的研究较少。本研究以1年生柠檬实生苗为寄主植物,对嫁接接种CYVCV和模拟接种的柠檬植株叶片分别进行了转录组及小RNA测序,利用生物信息学技术挖掘CYVCV侵染诱导差异表达的基因和miRNA,研究这些基因和miRNA在柠檬应答CYVCV胁迫中的功能。取得的研究结果如下:
  1.将接种后第30d、60d和90d三个时间点收集的CYVCV侵染及对照柠檬植株叶片样品分别进行等量混合后进行转录组测序。测序结果显示,受CYVCV侵染的柠檬样品中有679个基因上调表达,637个基因下调表达,这些基因中分别有1114个和453个注释到GO功能和KEGG通路。GO功能主要集中在生物学过程和分子功能,其中细胞间信息传递、氧化还原过程、对真菌的防御反应、酶激活和酶抑制等功能富集最为显著。KEGG通路主要集中在代谢通路,其中光合作用、叶绿素生物合成与代谢、碳代谢和光合作用中的碳固定途径富集最为显著,共包含68个差异表达基因,推测这些代谢途径的基因表达量变化可能与柠檬受CYVCV侵染后叶片表现的叶片褪绿及黄化等症状相关。
  2.选取与光合作用、叶绿素生物合成与代谢以及碳代谢等通路相关的16个差异表达基因进行qRT-PCR分析,结果显示这些基因存在时间动态变化,其中有6个基因为先下调后上调表达,4个为先上调后下调表达。同时选取5个AGO同源基因和3个DCL同源基因进行qRT-PCR分析,结果显示有7个基因存在差异表达变化。分析这些基因的时间动态变化发现多数基因在第60d的表达量变化明显与30d和90d不同。根据qRT-PCR结果筛选出6个差异显著的基因,分析其在CYVCV侵染的甜橙和小梾檬植株中表达量变化,结果显示同一基因在柠檬、甜橙和小梾檬植株中的表达模式相似。此外采用qRT-PCR方法对接种CYVCV的柠檬植株叶片样品进行检测,发现柠檬接种CYVCV后第30d可检测到该病毒,至第60d病毒含量最高而第90d略有降低。
  3.从接种CYVCV(CY)和对照(MC)柠檬植株叶片样品中获得包含miRNA的Clean read各17170461条和18472346条,接种CYVCV和对照样品中分别有5360339条和6043365条read可比对到甜橙基因组。从2组样品共预测到159个miRNA,包括56个甜橙中已知的保守miRNA和103个从柠檬中新预测的miRNA。其中有13个保守的miRNA和20个新预测的miRNA受CYVCV侵染诱导差异表达。
  4.对20个新预测miRNA进行了miRNA茎环引物法RT-PCR扩增,其中12个扩增产物的序列与预测序列一致。测序结果显示,12个新鉴定的miRNA中,仅有两个下调表达,其余均为上调表达。差异表达的4个保守miRNA和4个新鉴定miRNA的qRT-PCR结果显示,miRNA的表达水平在接种CYVCV后第30d至第90d呈时间动态变化,其中保守miRNA均下调表达,新鉴定miRNA先下调后上调表达。以转录组测序数据作为参考,对25个差异表达miRNA进行靶基因预测,其中2个新鉴定miRNA和6个已知miRNA共预测到靶基因52个。靶基因功能分析表明,靶基因涉及应激反应和代谢等生物过程。此外,在甜橙基因组预测差异表达miRNA靶基因,靶基因功能分析表明,这些miRNA大部分与植物对非生物和生物逆境响应相关,保守miRNA靶基因的KEGG通路显示这些基因在植物逆境反应及光合作用和能量代谢相关通路中具有明显的富集现象。
[硕士论文] 王梅菊
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究旨在分离和筛选生防细菌菌株,明确其分类属性,评估其生防潜力。取得了如下研究结果:
  1.分离筛选获得了促生细菌菌株AW-17和CanL-30。
  分别从湖北武汉、湖北咸宁和安徽芜湖采集的植物样品中分离到82个菌株,包括细菌菌株和酵母菌菌株。采用拟南芥平板对峙培养试验和油菜浸种促生试验相结合的方法筛选得到2个促进植物生长的细菌菌株AW-17和CanL-30。菌株AW-17和CanL-30均能够通过产生挥发性有机物促进拟南芥幼苗生长,另外菌株AW-17还能够产生吲哚乙酸IAA,具有溶解不可溶性磷的能力。将这两株细菌用于盆栽油菜促生试验,结果表明:菌株AW-17对油菜生长有稳定促生效果,而菌株CanL-30则不具备盆栽促生能力。
  2.明确了菌株AW-17和CanL-30的生物学特性,并对其进行了鉴定。
  菌株AW-17单菌落乳黄色,质地光滑粘稠,在8℃~35℃条件下均能生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阴性,不产生芽孢。生理生化测定结果和16SrDNA序列分析表明:菌株AW-17属于液质沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)。菌株CanL-30单菌落乳白色,质地光滑干燥,在15℃~40℃条件下能较好的生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阳性,产生芽孢。鉴定结果表明菌株CanL-30属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
  3.筛选出拮抗菌株CanL-30,并对其产生的抗真菌代谢产物进行了分离纯化。
  利用平板对峙培养和离体油菜叶片接种相结合的方法,筛选到1株能够稳定抑制灰葡萄孢的拮抗菌株CanL-30,其能够对多种病原菌产生拮抗作用,二分格皿试验和带毒平板试验结果表明菌株CanL-30主要通过产生抗真菌代谢产物抑制病原菌的生长。菌株CanL-30在NB培养基中,28℃、150r/min的条件下摇培72h,产生的抗菌代谢产物抑菌效果最好,抑菌率达到90%,利用酸沉淀和甲醇萃取的方法对该条件下CanL-30产生的抗菌代谢产物进行提取,带毒平板试验结果显示,不同浓度粗提物平板对灰霉菌均有不同程度的抑制作用,其中365μg/mL粗提物平板对灰霉菌的抑菌率高达100%。CanL-30抗真菌粗提物具有耐高温、抗紫外的特性,其在100℃的水浴锅中处理60min钟后,抑菌活性与对照相比无差异。用紫外灯(UV-C,30W)处理抗菌粗提物150min后,其抑菌圈大小与对照无显著差别。对粗提物中的活性物质进行了分离和鉴定,发现CanL-30产生的代谢产物中含有iturin。
  本研究获得的油菜促生菌株AW-17和灰葡萄孢生防菌CanL-30存在着进一步研究和开发的潜力。
[博士论文] 刘方舟
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在不同外界环境条件的影响下,同一种生物可以发育成形态不同、生活习性不同的个体,即发育可塑性。发育可塑性是生物在自然选择的压力下,为适应不断变化的生态环境而形成的一种极其重要的生存策略。很多昆虫(如蜜蜂、蚂蚁、蝗虫、稻飞虱)具有发育可塑性现象。稻飞虱是水稻重要害虫,翅的发育具有可塑性。成虫具有长翅型和短翅型类型:在寄主营养恶化时,主要产生长翅型个体,长翅型成虫飞行能力强,前翅与后翅均长于身体,且前翅长于后翅,、但繁殖能力较弱;在寄主营养丰富时主要产生短翅型。短翅型个体不能飞行,前翅与后翅均短于身体,、且后翅非常退化,类似果蝇平衡棒,但繁殖能力强。多年来,稻飞虱的翅二型现象吸引了众多昆虫学者的兴趣,取得了大量研究进展。褐飞虱翅型转换的开关基因已经鉴定出来:胰岛素受体Insulin Receptor1/2(InR1/2)。然而,InR1/2是非常上游的调控因子,翅发育基因是翅发育调控的具体执行者,翅发育基因是否能够响应InR1/2的信号,启动长翅型或短翅型翅发育的进程,进而调控翅型分化,目前还没有相关相关报道。
  本论文克隆了Ultrabithorax(Ubx)、Decapentaplegi(Dpp)、Vestigial(Vg)、apterous-A(apA)4个翅发育基因,利用本室构建的长翅型与短翅型种群,通过同源比对、分子克隆、RNAi、荧光定量、原位杂交、Gal4-UAS转基因果蝇品系等技术研究了以上4个基因对长翅型和短翅型稻飞虱翅发育的调控作用,并初步研究了翅发育基因对InR1/2的应答,取得以下研究结果:
  褐飞虱Ubx(NlUbx)对翅发育及翅型分化的调控作用
  通过定量PCR、原位杂交实验,发现稻飞虱Ubx的表达模式与已知的昆虫Ubx不同,与甲壳纲动物更为相似。稻飞虱Ubx在前翅与后翅中均有表达,且短翅型种群表达量高于长翅型品系。无论是长翅还是短翅品系,若虫后翅翅芽表达量高于前翅翅芽。而昆虫已知的Ubx只在后翅表达,前翅不表达。
  稻飞虱Ubx蛋白在结构上也与已知的昆虫Ubx不同,与甲壳纲动物更为相似。稻飞虱Ubx的MXSXFE结构域序列为MMNSYFE,QA结构域序列为QAQAAK,Ploy-Ala结构域序列为AAALAASQAQ。而昆虫已知的Ubx,这三个结构域的序列分别为:MNSYFE,QAQAQK和AAAAAAAAAA。
  稻飞虱Ubx不但在前翅表达,而且对前翅的发育也承担着重要功能,并调控前翅与后翅的大小。通过RNAi干扰,降低稻飞虱Ubx表达量之后,产生以下表型:长翅和短翅成虫的前翅和后翅畸形且短翅型成虫前翅和后翅刚毛增多,长翅和短翅成虫后翅前翅化且短翅型成虫后翅变大程度尤为明显。稻飞虱Ubx在长翅种群与短翅种群中,对其靶标基因的调控模式不同。根据前人的研究,NlDp,NlVg,NlapA,NlASH等基因是Ubx的靶标基因。通过定量PCR,检测了褐飞虱长翅、短翅种群中Ubx被干扰之后,这些靶标基因的表达量。结果表明:NlUbx在长翅和短翅品系的前翅和后翅中对靶标基因的调控作用均有不同。
  考虑到NlUbx在短翅型、长翅型种群若虫翅芽表达量不同,且Ubx对翅的大小有调控作用,推测Ubx可能通过剂量效应调控褐飞虱翅的大小。为了验证这一推测,本文利用Gal4-UAS转基因果蝇品系使褐飞虱Ubx(NlUbx)、果蝇(Drosophila melanogaster)Ubx(DmUbxIa)、丰年虾(Acanthokara kaputensis)的Ubx(AkUbx)在果蝇前翅(Ubx空背景组织)异位表达,并通过三种不同强度的启动子(Nub-Gal4(强),Sd-Gal4(中);C765-Gal4(弱))使转基因果蝇前翅表达不同剂量的Ubx。结果表明:DmUbxIa在前翅表达高、中、低3个剂量下,果蝇的前翅仍然是平衡棒,而NlUbx与AkUbx在中等剂量下,果蝇前翅变成一个较小的翅,在低剂量下,果蝇前翅转换成一个相对完整的翅。因此,DmUbxIa剂量效应不明显,而NlUbx与AkUbx剂量效应明显,通过剂量的变化,可以使翅的大小灵活变化。同时也说明NlUbx与AkUbx对翅形成基因的压制作用弱于DmUbxIa。
  通过点突变技术使果蝇前翅表达突变后的DmUbxIa、NlUbx、AkUbx,证明NlUbx负责抑制翅形成相关基因的结构域的压制能力显著弱于DmUbxIa,压制能力与AkUbx相似。因此,稻飞虱Ubx蛋白保留或者半保留了原始物种Ubx结构,这是其存在灵敏的剂量效应的分子基础。在此基础上,我们也发现营养丰富的分蘖期水稻诱导稻飞虱InR2表达量上升,营养贫乏的黄熟期水稻诱导稻飞虱InR1表达上升。Ubx对寄主营养也存在响应,即营养丰富的分蘖期水稻诱导稻飞虱Ubx表达量上升,营养贫乏的黄熟期水稻导稻飞虱Ubx表达量下降。
  褐飞虱apA(NlapA)对翅发育的调控作用
  apA在褐飞虱二龄和四龄短翅种群若虫中的表达量显著高于长翅种群。NlapA被干扰之后,造成成虫前翅刚毛消失,翅卷曲,翅长变短。进一步研究发现,apA RNAi导致稻飞虱翅刚毛变少的原因是由于apA的表达量降低致使控制刚毛发育的关键基因Achaete-scute homolog(NlASH)表达量降低。NlapA是NlASH的上游调控因子。
  褐飞虱Dpp(NlDpp)和g(NlVg)对翅发育的调控作用
  Dpp和Vg在长翅和短翅稳定遗传系若虫中的表达量存在显著差异,在长翅若虫中的表达量显著高于短翅。干扰长翅和短翅稳定遗传系三龄若虫Dpp和Vg表达,发现Dpp被干扰后成虫翅的翅脉完全消失;Vg被干扰后,长翅型成虫的前翅和后翅臀田域顶角区出现水泡;但是短翅成虫的前翅臀田域顶角区并无水泡(后翅为翅芽状,无臀田域顶角区)。
  本论文以Ubx、Dpp、Vg、apA4个翅发育基因为对象,比较这些基因在长、短翅型种群中的表达差异,揭示翅发育基因对翅发育、翅型分化的调控作用。研究结果将丰富不完全变态昆虫翅型分化分子机制理论,对揭示褐飞虱灾变的内在原因、实现褐飞虱虫源迁出时间的精细化预测、在褐飞虱迁出地进行源头治理具有重要的意义。
[硕士论文] 王文君
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:转Bt基因抗虫作物对大部分鳞翅目害虫具有较高的抗性。Bt杀虫蛋白可能通过对寄主的寄生而传递至其天敌体内。鳞翅目寄主取食转Bt基因抗虫作物后,其生长发育通常受到显著不利影响,从而产生“猎物质量介导效应”导致无法对其天敌进行准确的安全性评价。消除这种效应后,能大大提高转基因植物安全性评价的可靠性。本研究选择鳞翅目害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)及其寄生天敌麦蛾柔茧蜂(Habrobracon hebetor)作为研究对象,通过显微注射Bt蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴中,将印度谷螟幼虫血淋巴作为Bt蛋白的载体,构建了一种适合外寄生寄生蜂的Tier-1安评体系。结果表下:
  (1)单头印度谷螟老龄幼虫注射70ng浓度为0.5ng/nl的Cry1C蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中先快速下降,后缓慢下降。在注射0h时,近注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量显著高于远离注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量;注射0.5h后,两者无差异。被麦蛾柔茧蜂寄生后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的浓度在7天内趋于稳定,且含量始终高于直接取食转Bt基因稻谷印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白含量(1.72ng/g)的10倍以上,生测结果表明印度谷螟幼虫血淋巴中Cry1C蛋白具有生物活性。而未被麦蛾柔茧蜂寄生的状态下,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的含量会一直下降。
  (2)印度谷螟幼虫血淋巴中的高剂量Cry1C蛋白对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率、卵至成虫发育历期、雌性率、蛹重、初羽化(雌、雄)成虫体重、成虫寿命、存活率以及生殖力均无显著负面影响;而阳性对照GNA对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率初羽化雌成虫体重、初羽化雄成虫体重、成虫寿命以及生殖力造成负面影响。(3)Cry1C蛋白能通过印度谷螟血淋巴传递至麦蛾柔茧蜂体内。Cry1C蛋白可在麦蛾柔茧蜂幼虫体内不断累积,在麦蛾柔茧蜂老熟幼虫体内富集量最高;麦蛾柔茧蜂蛹内、成虫体内的Cry1C蛋白含量不断下降,低于麦蛾柔茧蜂幼虫的Cry1C蛋白蛋白含量,远低于印度谷螟血淋巴中的Cry1C蛋白含量。然而,麦蛾柔茧蜂成虫体内Cry1C蛋白含量低于检测值下限。
[硕士论文] 易时雨
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  (一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析
  1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性
  通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。
  2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性
  成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析
  Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1∶1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。
  (二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制
  1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析
  SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1∶1。
  2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析
  利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH3.0,最少的为pH5.0;设定pH7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1∶1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。
  以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制
  针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。
  综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。
[硕士论文] 李秋玲
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)是一种严重危害棉花的重要入侵性害虫,而班氏跳小蜂(Aenasius bambawalei Hayat)是其专性寄生性天敌,在扶桑绵粉蚧生物防治过程中具有较好的应用潜力。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是气味分子和气味受体之间的桥梁,能够携带疏水性气味分子穿过亲水性淋巴液到达受体细胞,对气味的特异性结合和选择运输上有着重要的研究意义,若能明确班氏跳小蜂气味结合蛋白与配体的相互作用关系,将为筛选班氏跳小蜂寄主定位行为活性物质提供理论依据,也为扶桑绵粉蚧的生物防治提供绿色通道。为此,本课题以班氏跳小蜂为研究对象,在构建转录组的基础上筛选并克隆出了5个AbamOBPs基因,完成AbamOBP50与AbamOBP1的表达与纯化:测定了AbamOBP50与22种寄主挥发物的结合特性;利用荧光猝灭、圆二色谱及同源建模和分子对接分析了AbamOBP1与配基的相互作用关系;利用RNAi及Y型嗅觉仪初步筛选出了对班氏跳小蜂具有行为活性的物质。主要研究结果如下:
  1、班氏跳小蜂AbamOBPs基因克隆、蛋白表达和纯化
  通过RT-PCR技术成功克隆出了班氏跳小蜂基因AbamOBP50、OBP47、OBP43、OBP41及OBP1。开放阅读框分别为369bp、378bp、405bp、402bp、408bp,分别编码123个、126个、135个、134个、136个氨基酸,分别包含有21个、21个、17个、23个、20个氨基酸残基的信号肽,氨基酸序列结果显示AbamOBP50、OBP1和OBP41属于Classic OBPs,OBP47属于Plus-C OBPs,OBP43属于Minus-C OBPs。成功构建重组质粒pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1。pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1主要在包涵体中表达,分别通过Ni离子亲和层析柱及DE52弱阴离子交换柱,在体外成功获得AbamOBP50和AbamOBP1的纯蛋白。
  2、班氏跳小蜂AbamOBP50结合特性分析
  以1-NPN(N-苯基-1-萘胺)为荧光探针,利用荧光竞争结合实验测定了班氏跳小蜂AbamOBP50在中性和酸性环境下与22种棉花挥发物单体的结合特性。在中性环境下,AbamOBP50与挥发物单体均有较强的结合能力;在酸性环境下,AbamOBP50与8种物质结合能力较强,分别是1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、S-(-)-柠檬烯、月桂烯、α-水芹烯、β-石竹烯、莰烯和橙花叔醇,其中月桂烯、S-(-)-柠檬烯、α-水芹烯和β-石竹烯在酸性环境下的结合能力高于中性环境下的结合能力。
  3、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体荧光猝灭分析
  利用荧光猝灭测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯的相互作用关系。实验结果表明,AbamOBP1与1-NPN在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,在pH5.0条件下AbamOBP1与1-NPN是通过静电作用结合,在pH7.4条件下是以疏水作用结合,AbamOBP1与1-NPN是以1∶1比例结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是静态猝灭,在pH5.0条件下是动态猝灭。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下都是通过疏水作用结合,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是以氢键作用结合。AbamOBP1与2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯是以二聚体的方式结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮可能以二聚体,三聚体甚至多聚体结合。
  4、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体圆二色谱分析
  利用圆二色谱(CD)仪测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯的CD光谱。通过CD光谱可以观察到AbamOBP1与配基结合后二级结构构象的变化。实验结果表明,AbamOBP1在pH7.4条件下,在208和222nm处负峰值最低,表明α-螺旋含量最高,其次是pH3.0,在pH5.0条件下的负峰值最高,表明α-螺旋含量最低。在pH7.4条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置四种配比1∶1;1∶3;1∶5和1∶10。在pH5.0和pH3.0条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置两种配比1∶1和1∶3。在这三种不同pH条件下,随着蛋白与气味物质比例的增加,AbamOBP1的CD光谱中负峰逐渐减弱,表明AbamOBP1蛋白中的α-螺旋含量逐渐降低。说明蛋白与气味物质的结合导致蛋白肽链延伸,改变了蛋白二级结构。
  5、AbamOBP1在班氏跳小蜂寄主定位中的功能
  利用Y-型嗅觉仪测定了班氏跳小蜂雄蜂对1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、2,4,4-三甲基-2-戊烯和S-(-)-柠檬烯这4种挥发物单体的行为选择实验。结果发现1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯对其有明显的吸引作用,而1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯对其没有吸引作用。RNAi实验表明在干扰48h和72h后AbamOBP1基因的相对表达量显著降低。干扰后对具有吸引作用的两种物质1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯进行行为选择验证。结果表明在干扰48h和72h后,这两种物质对班氏跳小蜂雄蜂的吸引作用明显降低。
  6、班氏跳小蜂AbamOBP1同源建模和分子对接
  以同源蛋白Apis mellifera的ASP1(3CAB pH7.0,3CDN pH4.0)为模板,建模得到AbamOBP1的三维结构,其具有六个α-螺旋,三个二硫键,属于Classic OBPs。通过预测发现在pH4.0条件下的结合腔要比pH7.0条件下的结合腔要大。分子对接显示,在pH4.0条件下,氨基酸lle3、Phe51、Phe54、Leu56、Leu63、Va168、Arg71、lle72、Gly80、Met83、lle84、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115、Val116和lle117主要参与了AbamOBP1与配基的结合。在pH7.0条件下,氨基酸Phe51、Leu56、Leu57、His62、Leu63、Asp64、Lys67、Val68、Leu69、Arg71、lle72、Ala99、Leu102、Val103、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115和Val116主要参与了AbamOBP1与配基的结合。
[硕士论文] 苏晓云
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在稻田生态系统中,水稻在其生长发育过程中会受到来自植食性昆虫和植物致病病原的侵害,这二者的发生往往不是独立的,已有研究表明,水稻病害的发生会对水稻与植食性害虫及其天敌互作产生影响。我们前期的研究也发现,水稻感染白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)后会对褐飞虱及其天敌黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis的行为产生了影响。但病害与植物及昆虫之间的互作又会受到复杂生态系统中其它非生物因素或生物因素的影响。氮肥作为一种重要的非生物因素,对作物病害或虫害的发生具有显著的影响。但对于氮肥是否会影响病害、植物及昆虫之间的互作并不是很清晰。为此,本课题以水稻重要病害白叶枯病、水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvata lugens(St(a)l)及其天敌稻虱缨小蜂Anagrus nilaparvatae为研究对象,分析了不同施氮量水平(低氮:不施氮肥;中氮:90kg纯氮/公顷;高氮:180kg纯氮/公顷)对水稻感染白叶枯病与水稻、褐飞虱及稻虱缨小蜂互作关系的影响,以期为探明复杂生态系统中水稻与褐飞虱及其天敌互作的化学生态学机制奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  1.在不同施氮量条件下水稻白叶枯病的发生
  随着感病时间的增加,白叶枯病斑相对面积增大;对感病水稻的剑叶观察后发现,在感病3d时,低氮的水稻可出现水渍状病斑及叶缘发黄等典型病征,感病10d时整叶焦枯,卷叶发黄;中氮的水稻感病3d时开始发病,5d后发病显著,出现暗绿色斑点,叶尖和叶缘发黄;高氮的水稻发病较慢,感病3d与健叶无差异,5d后发病显著,10d时出现叶片发黄卷曲等病征。感病后水稻的株高与根长无显著差异,但出现了叶片叶绿素含量降低,植株含氮量积累降低等一系列不利于水稻生长的现象。
  2.不同施氮量水稻白叶枯病发生对褐飞虱产卵和发育历期的影响
  不同施氮量条件下,褐飞虱在感病5d水稻与健康水稻上的产卵量、孵化率及若虫的发育历期无显著差异。不同施氮量条件下,白叶枯病的发生对水稻韧皮部游离氨基酸的含量影响的效应不同,低氮水稻在感病10d时,甘氨酸(Gly)和天冬氨酸(Asp)的含量显著低于健康水稻;中氮水稻在感病3d时,天冬氨酸(Asp)的含量显著高于健康水稻,感病10d时,苯丙氨酸(Phe)的含量显著低于健康水稻;高氮水稻在感病5d时,亮氨酸(Leu)的含量显著高于健康水稻,感病10d时,苯丙氨酸(Phe)的含量显著低于健康水稻。
  3.不同施氮量水稻白叶枯病发生对褐飞虱寄主选择行为的影响
  褐飞虱H-型嗅觉仪实验表明,不同施氮量条件下,褐飞虱对感染白叶枯病不同时间的水稻的行为选择影响效应不同。在低氮条件下,感病3d时,褐飞虱趋向选择感病水稻,感病5d和10d时,褐飞虱趋向选择健康水稻;在中氮和高氮条件下,水稻感病5d和10d时,褐飞虱显著地趋向选择感病水稻。
  通过GC-MS分离鉴定了不同施氮量条件下,白叶枯病侵染后水稻与同期健康水稻的挥发性物质组分。在感病与健康水稻间,有6种挥发物的含量有显著差异,主要为萜烯类物质和烷烃类化合物。其中,α-蒎烯(α-Pinene)和莰烯(Camphene)的含量在感病水稻中显著升高,呈现出较强的规律性。在中氮和高氮条件下,感病10d时,感病水稻中α-蒎烯(α-Pinene)、莰烯(Camphene)、十三烷(Tridecane)和十六烷(Hexadecane)等挥发物的含量显著高于健康水稻。
  4.不同施氮量水稻白叶枯病发生对稻虱缨小蜂寄主选择行为的影响
  不同施氮量与白叶枯病的发生时间,对褐飞虱的天敌稻虱缨小蜂的行为选择产生影响。在中氮和高氮条件下,水稻感病5d和感病10d时,稻虱缨小蜂趋向选择褐飞虱诱导后感病的水稻。
  通过GC-MS分离鉴定了褐飞虱诱导后的49种水稻挥发性物质。其中α-蒎烯(α-Pinene)、单萜烯(Monterpene)、异丁酸香叶酯(Propanoic acid,2-methyl-)、β-柏木烯(β-Cedrene)、十七烷(Heptadecane)。其中,在中氮条件下,水稻感病5d和10d时,α-蒎烯(α-Pinene)、单萜烯(Monterpene)、异丁酸香叶酯(Propanoic acid,2-methyl-)、β-柏木烯(β-Cedrene)和十七烷(Heptadecane)在感病水稻中含量显著高于健康水稻;在高氮条件下,水稻感病5d和10d时,α-蒎烯(α-Pinene)、单萜烯(Monterpene)和β-柏木烯(β-Cedrene)在感病水稻中的含量显著高于健康水稻。
[硕士论文] 王昭
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:由子囊菌门真菌稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(Rice Blast Disease)是水稻上为害严重的几种病害之一,每年稻瘟病在世界范围内造成重大的水稻产量损失,平均达到水稻总产量的30%左右。当前对于水稻稻瘟病最为绿色有效的防治方法是抗病品种的选育,但是由于病菌遗传变异快以及田间选择压力的影响,田间易形成新的毒力群体,从而使抗病品种失效。因此,我们有必要对稻瘟菌致病过程的分子机制进行研究,以期为绿色农药的靶标开发提供理论依据。随着稻瘟菌基因组数据的公布,加速了科研工作者对稻瘟菌致病过程中一些重要基因的功能研究,至今已有大量稻瘟菌致病过程的机理得到详细地解析。
  泛素化修饰是真核细胞中一种十分保守且非常重要的蛋白质翻译后修饰作用,参与到多种细胞学过程中,包括蛋白酶体介导的蛋白降解,DNA损伤修复,内吞作用,信号转导等。泛素化修饰能够可逆地被去泛素化酶(Deubiquitinase)水解,从而达到对细胞内蛋白质泛素化修饰精准的调控。有报道称在模式病原真菌稻瘟菌(M.oryzae)中,泛素化过程在其生长,发育,致病过程中发挥重要作用,然而对于去泛素化酶在其致病过程中的作用却未见报道。
  本研究初期,在稻瘟菌中鉴定到一个酵母去泛素化酶UBP14基因的同源基因,将其命名为MoUBP14。通过同源重组的策略,在稻瘟菌中定向将MoUBP14基因进行敲除,并对突变体菌株的生物学表型以及该蛋白的分子功能进行了初步的研究。研究结果表明,MoUBP14基因敲除后,敲除体致病力发生严重衰退,菌丝营养生长明显缓慢,产孢量严重下降,附着胞发育缓慢,附着胞膨压明显降低,对环境胁迫条件更加敏感,碳源代谢存在缺陷。在总蛋白水平上,△Moubp14敲除体细胞内游离泛素链含量更高,即敲除体中泛素化水平发生紊乱。通过Pulldown试验,鉴定到在糖异生途径中两个关键限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck1),果糖-1,6-二磷酸酶(Fbp1)是MoUbp14蛋白的结合蛋白,实验结果显示Fbp1、Pck1在敲除体中的泛素化水平有升高趋势,表明其可能是MoUbp14去泛素化酶的去泛素化底物。在葡萄糖诱导糖异生途径酶降解过程中,敲除体中Pck1和Fbp1蛋白丰度明显较野生型高,证明了Ubp14参与到UPS(泛素蛋白酶体系统)介导的Fbp1和Pck1降解过程中,说明Ubp14有可能参与到对碳源代谢基因的调控从而影响稻瘟菌的生长发育和致病过程。
  本文初步研究了去泛素化酶MoUbp14在植物病原真菌稻瘟菌致病过程中的功能,明确了其去泛素化功能在稻瘟菌生长、产孢、附着胞发育、抗逆和碳源代谢等方面发挥着广泛的作用,也为更进一步研究其它去泛素化酶提供了坚实的实验基础和理论支持。
[硕士论文] 杨姗琳
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:马铃薯是继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物,也是我国农民增收的重要途径和粮食安全的重要保障。马铃薯疮痂病是链霉菌引起的一种表皮性病害,多发生在北方,近年来,疮痂病在我国一些南方马铃薯产区也频繁发生,严重影响块茎的外观品质。本研究收集了广东和湖北两省的疮痂病块茎,进行了疮痂病的分离鉴定,在此基础上建立了疮痂病的相关检测体系,为疮痂病的防控奠定了基础,主要结果如下:
  1.收集了广东、湖北两省五个地区的疮痂病块茎102个,观察分析了它们的症状类型,及在培养基上链霉菌的培养特征,孢子链形态,并从湖北襄阳的疮痂症状块茎中分离得到XY-12菌株;
  2.通过表型和显微观察、16S rDNA测序,初步鉴定襄阳疮痂病分离菌株XY-12为Streptomyces bottropensis,进一步的盆栽接种鉴定表明,该分离菌株在接种浓度1.68×103CFU/mL以上能够导致马铃薯中薯5号产生疮痂病症状;
  3.在收集Streptomyces scabies、S.acidiscabies、S.bottropensis、S.stelliscabiei、S.europeascabiei五种致病菌的66条txtA基因序列的基础上,设计了txtA的特异PCR引物CS-67s/379a,并对退火温度以及模板、引物浓度进行了优化;通过对田间样品的检测,表明该方法能特异检测疮痂病,能够灵敏的检测到106ng疮痂病菌的DNA;
  4.进一步基于txtA基因设计了5对RPA引物,经检测效果良好,选取其中的一对引物CS-RPA126s/395a分别进行PCR和RPA分析,RPA能够检测104ng疮痂病DNA,低于PCR的灵敏度10倍,但RPA技术可以不依赖复杂的仪器就实现等温扩增,且与PCR引物CS-67s/379a的检测结果有高度的一致性。
[硕士论文] 夏婵
生理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativa)是世界上约一半以上人口的主食,在可耕地面积减少的形势下,理想株型对提高水稻单产尤为重要,而水稻叶夹角是理想株型的主要特征之一。很多研究表明,油菜素甾醇(Brassinosteroid,BR)在调控水稻叶夹角过程中起重要作用,而赤霉素(Gibberellin,GA)对水稻叶夹角的调控机理尚不清楚。本试验利用GA合成受阻突变体(d18)、GA信号减弱突变体(d1、slr-D3)、GA信号增强突变体(slr1)、BR合成受阻突变体(d2-1)和BR信号减弱突变体(d61-2)材料,探索了GA对水稻叶夹角的调控机制,主要试验结果如下:
  1.GA促进水稻叶夹角增大。与野生型相比,GA合成受阻突变体及GA信号减弱突变体的第二叶夹角减少,GA信号增强突变体的第二叶夹角增大;与对照相比,外源GA3处理的水稻叶夹角增大,GA合成抑制剂PP333处理下的水稻叶夹角减小。
  2.GA可以与BR协同调控水稻叶夹角。与野生型相比,GA合成受阻突变体及GA信号减弱突变体对BR的敏感性降低,BR合成受阻突变体及BR信号减弱突变体对GA的敏感性减弱;与对照相比,GA3+BR处理下水稻叶夹角增加值大于GA3、BR单独处理时水稻叶夹角增加值之和。
  3.GA还可以不依赖于BR调控水稻叶夹角增大。外源GA3、BR处理下水稻叶枕细胞形态观察结果表明GA减少了水稻叶枕远轴厚壁组织细胞层数和细胞大小,而不改变叶枕近轴细胞层数;BR不改变叶枕近轴、远轴细胞层数,而是促进叶枕近轴伸长和扩张。转录组数据和qRT-PCR结果证实BR促进叶枕近轴细胞膨胀素基因的表达上调,而GA降低远轴细胞的细胞周期蛋白和细胞壁纤维素合成酶基因的表达。
  综上所述,本研究结果证实GA能够促进水稻叶夹角增大。GA可以与BR协同促进水稻叶夹角的增大;GA还可以不依赖于BR调控水稻叶夹角增大。BR主要是促进水稻叶枕近轴细胞膨大,GA主要是减少叶枕远轴细胞数目和细胞大小来促进水稻叶夹角增大。
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