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[硕士论文] 蔡凯
竹林培育与利用 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:毛竹(Phyllostachys edulis)为禾本科竹亚科刚竹属竹种,是我国竹类植物中分布最广、面积最大、经济价值最高的笋材两用竹种,在我国南方重要的森林资源。毛竹在栽培过程中也会经常遭受季节性干旱和土壤盐碱化的威胁,造成竹材、竹笋和竹副产品减产,所以研究毛竹的抗逆机理,具有重要的社会、生态意义。本实验从生物信息学与基因功能角度系统分析毛竹SOD基因家族特征与功能。本实验取得以下研究结果:
  1.在NCBI网站下载模式植物SOD蛋白序列,利用Blast软件在毛竹蛋白数据库中比对得到七条蛋白序列,其中包括三条PeCZSOD蛋白、两条PeMnSOD蛋白以及两条PeFeSOD蛋白;并从毛竹CDS数据库中找到相对应的毛竹SOD基因序列。
  2.通过对毛竹SOD蛋白理化性质、基因结构以及与模式植物SOD基因家族聚类分析,发现毛竹同一亚家族蛋白理化性质与基因结构较为相似,从SOD基因家族聚类分析得出毛竹SOD基因家族与水稻、二穗短柄草SOD基因遗传距离较近,与拟南芥SOD基因遗传距离较远。
  3.对毛竹SOD各亚家族蛋白进行亚细胞定位预测,发现PeCZSOD亚家族成员主要定位在细胞周质和叶绿体中,而PeMnSOD亚家族成员定位在线粒体中,PeFeSOD亚家族成员定位在叶绿体中。
  4.毛竹进化过程中SOD家族基因Ka/Ks率远小于1,表明该基因进化过程中受到强烈的纯化作用。通过Ks值计算出毛竹SOD基因发生基因复制事件的时间主要集中在9-17百万年和180百万年附近;毛竹与绿竹(Pe-Bo)、毛竹和水稻(Pe-Os)家族基因发生分化时间分别集中在3-19百万年和9-82百万年之间。
  5.从基因组数据库中,找到SOD启动子序列,并通过Plant Care在线工具对毛竹SOD家族基因启动子区域顺式元件进行分析,结果表明毛竹SOD家族基因启动子区域含有大量的胁迫与激素响应元件,并且不同的SOD基因家族成员间元件种类与数量具有明显差异,表明不同的SOD基因具有不同种类的胁迫响应机制。
  6.对毛竹SOD基因启动子启动活性分析,发现PeCZSOD1基因启动子每个区段都具有启动活性,但PeCZSOD1-3段(-497bp至-1bp)启动子活性最强。
  7.对毛竹实生苗幼苗进行三种非生物胁迫与三种激素处理,不同时间段进行取样。通过荧光定量PCR测得不同种类非生物胁迫和不同种类激素处理条件下各时间段毛竹SOD基因家族各成员的表达量变化,并对表达量变化相似基因进行聚类。结果表明,同一亚家族SOD基因表达量变化聚类距离较近,相似度较高;同时测得其SOD酶活性变化,结果表明ABA处理后最终酶活性低于未处理毛竹SOD酶活性,其余处理毛竹最终SOD酶活性都高于未处理时期。
  8.将不同亚家族的SOD基因分别选一个基因构建载体并转化拟南芥,在转基因拟南芥种植到T2代时,将幼苗转移到含有300mM NaCl浓度的1/2MS培养基中进行抗盐性试验,结果表明各亚家族转化SOD基因拟南芥抗盐性显著高于野生型拟南芥。
[硕士论文] 孙璐
森林生物工程 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:白桦三萜因其具有的抗肿瘤和抗艾滋病毒等活性,而成为最有潜力的药物制剂,具有重要的应用前景。转录因子具备通过调控途径基因的表达量,进而调节次生代谢物质产量的功能,是常用的从整体改造代谢途径的一种有效工具。本研究以白桦(Betula platyphlla Suk.)为材料,结合实验室前期筛选的响应MeJA和SA信号的MYB转录因子基因,拟克隆与白桦三萜合成相关的BpMYB21和BpMYB61基因全长及启动子序列,并进行生物信息学分析,表达特异性分析,研究其在白桦和酵母中的表达特征及功能。以期为白桦三萜类物质代谢工程遗传改造和生物技术利用提供技术支持和理论依据。
  本研究结果如下:
  1.利用特异引物和RT-PCR技术,从白桦组培苗cDNA中克隆了白桦BpMYB21和BpMYB61基因的cDNA全长。通过生物信息学分析发现,BpMYB21基因的ORF全长为1014bp,编码337个氨基酸,该蛋白质具有一个MYB binding site和两个SANT超家族,为亲水性蛋白,与胡桃MYB30-Like具有64%的相似性,与胡杨MYB86的相似性为61%。BpMYB61基因的ORF长为1203bp,编码400个氨基酸,具有两个MYB binding site保守结构域,为亲水性蛋白,与光皮桦myb-Like的同源性最高为97%。系统进化树表明,BpMYB21转录因子与胡桃,而BpMYB61与光皮桦MYB基因在一个分支上。进一步分析表明,本研究获得的BpMYB21是白桦MYB家族中的新成员。
  2.利用Real-time PCR技术,分析了BpMYB21和BpMYB61基因时空及激素处理表达模式。结果表明,在六月中旬至九月中旬期间,三年树龄的白桦植株中,BpMYB21和BpMYB61基因均在7、8月份表达量较高。两个基因的组织特异性表达分析表明,茎和叶中的表达水平显著高于根中的表达水平。BpMYB21和BpMYB61两个基因对不同激素诱导的响应模式差异显著。在叶中,除ABA和GA处理12h时BpMYB21基因的表达量最高,其余处理均为6h时BpMYB21基因表达量最高;在茎中,ABA和乙烯在处理12h时BpMYB21基因的表达量达到最高,其余处理均为6h时BpMYB21基因的表达量达到最高。在叶中,除了乙烯和伤害处理6h,BpMYB61基因的表达量最高外,其余处理均在12h,基因的表达量达最高;在茎中,ABA、MeJA、SA的处理使BpMYB61的表达量下调,而GA、乙烯、伤害处理上调BpMYB61基因的表达。通过亚细胞定位实验,明确白桦BpMYB21和BpMYB61在细胞核和细胞膜中均有表达。
  3.通过染色体步移技术分别扩增得到长度为1302bp和850bp的BpMYB21、BpMYB61基因的启动子序列。这两个基因的启动子序列分析结果表明,BpMYB21和BpMYB61启动子包含TATA盒和CAAT盒等基本元件。同时得到多个植物激素应答元件,如赤霉素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸响应元件。还存在干旱、热胁迫、厌氧菌诱导响应元件等防御与胁迫相关的表达元件等。此外发现,BpMYB21和BpMYB61基因启动子序列中还存在MYB转录因子结合的位点MBS元件以及bHLH转录因子的结合位点G-Box元件,暗示两个转录因子之间及与bHLH类转录因子可能存在互作。
  4.以pYES3/CT质粒为载体分别得到BpMYB21和BpMYB61的酵母表达载体,分别转化INVScl,INVScl-pYES2-SS,INVScl-pYES2-SE酵母菌株。重组酵母细胞中的角鲨烯和总三萜含量分析表明,与对照INVScl-pYES3酵母菌株相比,上述六种重组酵母菌中的角鲨烯和总三萜含量均有不同程度提高,其中BpMYB21重组酵母INVScl-pYES-MYB21-SS角鲨烯含量最高,比对照菌株INVScl-pYES3提高了89%;在BpMYB61重组酵母INVScl-pYES3-MYB61中角鲨烯含量最高,比对照酵母INVScl-pYES3提高了78%;BpMYB21重组酵母INVScl-pYES-MYB21-SS中总三萜含量比对照酵母INVScl-pYES3提高20%;BpMYB61重组酵母INVScl-pYES3-MYB61总三萜含量比对照INVScl-pYES3酵母提高23%。
  5.利用pCAMBIA1303-BpMYB21和pCAMBIA1303-BpMYB61农杆菌分别侵染白桦组培苗的叶片、叶柄和茎段,分别获得pCAMBIA1303-BpMYB21和pCAMBIA1303-BpMYB61抗性植株44株和45株,经PCR鉴定分别各获得4株和7株转基因苗。利用实时荧光定量PCR检测pCAMBIA1303-BpMYB21和pCAMBIA1303-BpMYB61转基因白桦苗中均有不同程度上调。在转基因植株MYB21-44中,三萜途径关键酶基因的相对表达量均表现出不同程度的上调,其中上调效果最为显著的是HMGR基因,是对照组的28.24倍;而SE基因的表达量出现了轻微的下调。在转基因植株MYB61-5中,三萜途径关键酶基因FPS和SS的相对表达量出现上调,分别比对照提高了35%和13%,而HMGR、BPW、SE、BPY的基因表达量均出现不同程度的下调,其中下调效果最为显著的为BPY基因,比对照下调了84%。暗示两个基因在调控三萜合成中的功能不同。
  6.从白桦三萜合成关键酶基因中筛选得到6种MYB转录因子结合的顺式作用元件,并成功构建了pHis-元件的诱饵载体。实验成功的构建了捕获载体pGADT7-Rec2-MYB21和pGADT7-Rec2-MYB61,互作实验结果表明,1号和4号元件分别存在于SE基因启动子和BPX基因的启动子,两个元件与BpMYB21存在微弱的互作,而与BpMYB61存在较强的互作。暗示BpMYB21、BpMYB61对SE基因和BPX基因具有调控作用,而BpMYB61的调控作用可能更强。
[硕士论文] 童亮
森林经理学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:随着气候变化问题得到人们的重视,森林作为最大的陆地生态系统在固碳方面的作用日益凸显。毛竹作为一种典型的森林类型是我国南方重要的森林资源之一,对竹林而言,地下根鞭系统是其生长发育的基础。而竹鞭参数的准确获取对于研究毛竹地下根鞭系统及其生物量具有重要意义。本文使用传统方法先对竹鞭基本信息进行调查,分析竹鞭基本情况,之后凭借探地雷达(GPR)这一粗根无损探测技术对竹鞭直径进行估计。具体是先通过GprMax软件模拟两种场景并结合填埋竹鞭控制实验得到直径的模拟值和实测值,接着利用回波双曲线模型的两种方法分别对直径进行估计,最后利用实测的竹鞭参数构建竹鞭生物量模型。研究结果如下:
  (1)从竹鞭直径结构来看,竹鞭直径分布不均匀,具体表现为横向直径大于纵向直径,且直径由一端向另一端增大或减小。幼龄鞭直径变化幅度更大而随深度增加竹鞭直径也随之增加。从竹鞭年龄结构来看,调查样地内以幼龄鞭为主,根据竹鞭比鞭根生物量比值发现壮龄鞭拥有更多鞭根、其次是幼龄鞭最后是老龄鞭。竹鞭集中分布与-10~40cm土层,在该土层中竹鞭各指标比例均达到90%以上。竹鞭单位生物量的分布在水平方向上多为同一水平,不存在很大差异。
  (2)对于GprMax正演数据和竹鞭直径实测而言,使用L-M算法的双曲线参数优化方法的直径估计误差较小,而基于椭圆拟合改进的方法仅适用于拟合双曲线以及估计直径较大的目标,对于小直径的物体其参数估计值准确性极低且毫无实际应用价值。
  (3)双曲线模型能稳定估计双曲线顶点坐标,其直径的估计精度取决于波速下限值的设置,在选择合适的波速后,直径的估计精度能大幅提高。
  (4)对比交叉验证后建立的三类十种竹鞭生物量模型,以D2L为变量的指数函数为最佳模型,R2和RMSE分别为0.9352和21.43g,模型的形式为:BR=65.17·e0.002496D2L。
[硕士论文] 商天其
生态学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:植物挥发性有机化合物(Plant volatile organic compounds,BVOCs)具有重要的生理生态功能,而香樟(Cinnamomum camphora)作为广泛分布于亚热带地区的BVOCs重要释放源,在我国南方地区的城镇园林景观和生态系统中均具有重要地位。为研究香樟叶片不同发育时期单萜排放速率和光合特征,及成熟叶单萜排放、光合生理对高温和大气CO2浓度的响应,本试验分季节测定香樟叶片的光合和单萜排放特征,以及测定成熟香樟叶片单萜排放、光合特征对高温和大气CO2浓度的响应变化规律。结果表明:
  (1)香樟叶片释放的单萜以蒈烯(Careen)和罗勒烯(Ocimene)为主。在本试验的基础状态下(温度28℃,光照强度800μmol·m-2·s-1和CO2浓度400ppm),净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO2浓度(Ci)大小规律为成熟叶>幼龄叶>衰老叶,总单萜释放速率(E)为幼龄叶>衰老叶>成熟叶。
  (2)叶片三个发育阶段的单萜-光响应曲线变化趋势与光合的光响应曲线类似,但受CO2浓度的影响不明显。成熟叶具有最高的初始量子效率(α)、最大净光合速率(Pnmax)、Rubiscom酶最大羧化速率(Vcmax)、光下呼吸速率(Rp)和光饱和点(LSP),但是幼龄叶的光补偿点(LCP)、暗呼吸速率(Rd)和响应曲线的曲角系数(θ)最大。衰老叶具有最高的最大电子传递速率(Jmax)和最低Vcmax,因此其Jmax/Vcmax比率为三个阶段最高,意味着衰老叶光能利用率最低,强光下光能过剩,这很可能也是常绿植物冬天利用过剩光能保持一定温度越冬的一个调控机制。
  (3)幼龄叶的最大单萜排放速率(Emax)最大,其次为衰老叶,成熟叶最小。在三个阶段中,成熟叶的表观量子效率(β)和真实量子效率(βT)均是最大,幼龄叶的β最小,但βT却仅次于成熟叶。
  (4)叶片受单一短时高温,Pn随温度上升呈下降趋势,其中48℃短时高温对Pn会造成不可逆伤害;对Tr具有促进作用,但除48℃对Tr造成不可逆伤害外,其余温度对其的影响具可恢复性;43℃、48℃短时高温对Ci具有促进作用,且无不可逆伤害;Gs受短时高温的影响与Pn相似;对叶片的SOD、POD、MDA和叶绿素含量均无显著影响(P>0.05),但CAT含量随温度增加显著下降(P<0.05);E随温度增加呈上升趋势,复温后相比处理之前排放水平,38℃、43℃显著上升(P<0.05),其他温度处理无显著变化。
  (5)CO2浓度倍增使叶片的Pn、Ci显著上升(P<0.01),对Tr、Gs、E无显著影响(P>0.05)。CO2浓度倍增下,叶片Pn随温度增加呈先升后降趋势,其中48℃处理对Pn造成不可逆伤害;叶片Tr、Gs随温度的变化规律与正常CO2浓度下的变化规律相似,Tr随温度上升逐渐增加,Gs不受影响;Ci在33℃、48℃高温处理下并无显著改变(P>0.05),但在38℃、43℃处理下显著下降(P<0.01),复温后,各温度处理之间都出现显著下降(P<0.01);CO2浓度倍增下,在33℃、38℃处理下E无显著变化(P>0.05),而在43℃、48℃处理下E极显著增加(P<0.01),复温后,与正常CO2浓度环境下的恢复规律相似。
  综上所述,香樟叶片在不同发育阶段可通过调节光电子运输和光合效率调控单萜排放速率,以满足自身生长物质能量需要及应对外界季节性环境变化带来的各类胁迫。香樟成熟叶在面临外界短时高温胁迫、CO2浓度倍增时,其叶绿素含量、MDA含量、抗氧化酶活性基本未受影响,对部分指标的影响也只是暂时的,具有可恢复性,其抵御外界短时高温、CO2浓度倍增的胁迫主要还是通过调节光合效率和单萜排放水平,以应对外界高温和CO2浓度倍增带来的各种胁迫。
[硕士论文] 汪紫阳
森林工程 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:木制品现已成为人类社会中不可或缺的一部分。同时继茶叶之后,越来越多的树叶制品也慢慢渗透到人们的日常生活中。树种识别是这些产业发展中最基本的一个环节。近红外光谱技术能够无损、快速、准确地对树种进行识别,在树种识别及木材鉴别等方面发挥着重要的作用,同时能够为天然林保护、次生林抚育和人工林定向培育提供经营决策方面的技术支持,本论文主要从以下几方面进行了基于近红外技术的树种识别:
  (1)应用近红外光谱技术,研究了市场流通的40种名贵木材的识别及模型优化,经过一阶导数预处理方法和距离法建立识别模型的识别准确率为98.75%。用识别模型预测5周后和17周后采集的样本的近红外光谱,准确率为82.81%。经过Norris导数滤波优化后模型的识别准确率为95.31%。
  (2)利用近红外光谱技术研究了东北林区的14种主要树种基于活立木采样的树种识别。样品使用生长锥从活立木1.3m胸高处由南向北钻取。采用距离法建立识别模型,比较了不同波段和不同预处理方法对模型识别效果的影响。研究表明基于Norris二阶导数滤波的距离法识别模型的准确率最高,达98.21%。
  (3)以东北林区常见的9种树种树叶为研究对象,分别比较了距离法和DPLS对识别模型精度的影响。结果显示,使用距离法建立的识别模型识别9种树种的准确率为99.16%。使用单列识别变量矩阵的偏最小二乘法(DPLS)识别4个树种的准确率为100%,识别模型的相关系数为0.9936,交叉验证误差均方根(RMSEC)为0.120,预测误差均方根(RMSEP)为0.144。使用多列识别变量矩阵的偏最小二乘法(DPLS)识别9种树种的准确率为99.58%,识别模型的相关系数为0.8886~0.9569,交叉验证误差均方根(RMSEC)为0.0845~0.15,预测误差均方根(RMSEP)为0.0887~0.155。
  (4)研究了重现性对近红外光谱识别模型的影响。试验发现在不同条件下采集的近红外光谱会出现差异,且相隔时间越长,差异越明显。在采用不同时间采集的近红外光谱进行树种识别时,光谱采集间隔时间越长,模型的识别准确率越低。论文同时探索了S-G平滑和Norris导数滤波最优参数组合选择方法对树种识别模型精度的影响。结果表明随着参数递变,模型的识别准确率也存在递变规律。实验发现由生长锥取样的针叶树材和阔叶树材在波长点为1637nm和1687nm处的近红外长波段有明显差异。在1637nm处,4种针叶树材样本的近红外光谱有吸收,而10种阔叶树材样本没有吸收。在1687nm处,10种阔叶树材在该波段有明显吸收,而4种针叶树材吸收不明显。
  本实验为近红外光谱技术快速识别树种,快速识别名贵木材,快速识别针叶、阔叶树种,快速识别树叶树种提供了一种新的方法;为S-G平滑和Norris导数滤波的参数选择提供了参考;为近红外光谱模型的构建及随时间推移的模型维护提供了思路。
[硕士论文] 曹延珺
森林工程 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:微生物引起活立木腐朽的现象普遍存在于森林生态系统中,尽管这是一种普通的自然现象,但是对森林生态系统的健康和价值存在着巨大的威胁。在活立木腐朽的调查中发现,立地生境不同,林分中发生腐朽的概率也不同,说明立地条件与活立木的腐朽有着密切的联系。
  红松是中国东北林区的优势树种之一,也是珍贵的保护树种,具有很高的生态价值和经济价值。近年来,很多研究发现,小兴安岭林区的很多红松活立木都存在中重度腐朽,因此本文以凉水自然保护区针阔混交林中的红松活立木为研究对象,初步研究探讨了红松活立木干基腐朽程度和立地土壤微生物特性的关系,以期为红松活立木腐朽的防治和红松林的合理经营管理提供科学的理论依据和新思路。
  本文的主要研究内容包括:(1)红松活立木干基腐朽程度的检测。测定木芯失重率作为红松样木的腐朽程度。(2)土壤理化性质对土壤微生物特性(土壤微生物数量和物种多样性)的影响。(3)土壤微生物特性与红松干基腐朽程度的关系研究。根据前面所测得的数据,结合环境因子、土壤理化性质的影响,探讨立地土壤微生物数量和多样性对红松干基腐朽程度的影响。研究结果表明:
  (1)10棵样木的木芯失重率从0-48.3%,说明凉水自然保护区红松活立木存在不同程度的腐朽。
  (2)土壤微生物数量和多样性与土壤理化性质之间存在相关性,但不同条件下得出的结论不同。
  (3)10个土样中共得到1496个真菌OTU和1413个细菌OTU,鉴定出203个已知真菌和34个已知细菌,真菌种类多于细菌。真菌Alfa多样性高于细菌Alfa多样性,且样品中的物种分布不均匀,优势种所占的比例较高。
  (4)相关性分析表明,真菌Alfa多样性和细菌Alfa多样性与红松腐朽程度都不存在显著相关性。单样本T检验结果表明,健康红松和腐朽红松根部土壤的真菌Alfa多样性不存在显著差异(Sig.(2-tailed)=0.062>0.05),细菌Alfa多样性也不存在显著差异(Sig.(2-tailed)=0.195>0.05)。
[硕士论文] 高新雨
设施园艺与观赏园艺 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:白蜡树(Fraxinus chinensis Roxb)是木犀科白蜡属的落叶乔木,在我国栽培历史悠久,具有树体优美,姿态挺拔,绿期较长,生长速度快,管理便捷等特点,多用作行道树。由于气候变化极端天气频发,晚秋或早春极易出现低温霜冻,对观赏树木的正常生长产生较大的影响。本研究选取两年生的白蜡树为研究对象,应用电阻抗图谱(Electrical impedance spectroscopy,EIS)参数和电解质渗出率法(Electrolyte leakage,EL)测定不同模拟霜冻低温和持续时间下茎和叶的抗寒性,同时测定相应低温条件下的可溶性蛋白含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化物酶(POD)活性,丙二醛(MDA)含量,脯氨酸含量,干物质含量等生理指标,确定白蜡生理活动受到胁迫的低温范围以及找出适于估测白蜡抗寒性的生理指标和EIS参数,为快速、非破坏性地检测观赏树木抗寒性提供新的可借鉴方法,研究结果对预防和减轻气候变化下因霜冻对观赏树木带来的灾害具有指导意义。
  主要结果如下:
  1、在晚秋11月,白蜡叶和茎的最强抗寒性分别为-19.58℃和-27.90℃,在早春3月白蜡茎的最强抗寒性为-35.08℃。在11月温度低于-5℃持续时间超过24h或温度低于-10℃持续时间超过6h,和在3月温度低于-10℃持续时间超过12h或-15℃持续时间超过6h时,应对白蜡采取相应的保护措施,以避免因温度降低导致的霜冻灾害。
  2、白蜡的茎和叶在模拟霜冻温度处理时EIS图谱表现为单弧,抗寒性增强EIS图谱的弧度变大,EIS图谱可以作为判断白蜡抗寒性强弱的定性指标。
  3、EIS参数中,茎的胞外电阻率rc,胞内电阻率ri,弛豫时间τ,弛豫时间分布系数ψ与抗寒性的线性相关系数分别为0.839,0.936,0.887和0.815,均可作为估测白蜡茎抗寒性的参数;叶的rc和ri与抗寒性相关,相关系数分别为0.965和0.535,可以作为估测叶抗寒性的参数。
  4、可溶性蛋白含量、SOD酶活性、MDA含量、脯氨酸含量、干物质含量可以作为估测白蜡叶的抗寒性指标,其中可溶性蛋白含量、MDA含量、干物质含量与白蜡叶抗寒性极显著相关,相关系数分别为0.876,-0.922,0.934。可溶性蛋白含量、SOD酶活性、POD酶活性、脯氨酸含量可用作估测白蜡茎抗寒性的指标,其中SOD酶活性和POD酶活性与白蜡茎抗寒性极显著正相关,相关系数分别为0.974和0.942。
  5、经过模拟霜冻处理的白蜡叶中N、P、K、Ca、Mg等矿质元素的含量均无显著性变化。
[硕士论文] 杨意宏
设施园艺与观赏园艺 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:竹子作为我国最具特色的森林资源,在环境保护、经济发展等方面占据着重要地位。赤霉素(Gibberellin,GA)在竹子生长发育中起着重要的调控作用。因此,开展竹子GA合成途径的全基因组分析及其基因功能研究具有重要价值。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为研究材料,利用基因组数据对其GA合成途径中的相关基因进行了全面分析,并在此基础上对PeGA3ox-2基因功能进行了初步研究。主要研究结果如下:
  1.采用生物信息学方法,对毛竹基因组中GA合成途径的酶基因进行分析。结果表明:毛竹基因组中涉及到GA生物合成的酶基因有7类共50个,包括4个CPS,3个KS,5个KAO,1个KO,10个GA20ox,20个GA2ox,7个GA3ox。不同类酶基因的各个成员虽是比较保守的,但其基因结构、基本理化性质均存在着一定的差异。系统进化树分析表明,毛竹GA合成途径中的酶整体上与水稻的亲缘关系最为接近。
  2.利用转录组数据,构建毛竹GA合成途径酶基因的表达谱热图,分析各基因在不同组织中的表达模式,结果显示,不同类酶基因以及同一类酶基因的不同成员的表达均存在一定的差异。例如:PeCPS-1、PeCPS-4和PeKO的表达模式为组成型,PeKAO-5主要在笋幼芽中表达,PeGA20ox-10仅在幼芽和根中表达;PeGA2oxs中有9个为组成型表达,7个为特异性表达,而PeGA3oxs中分别有5个和2个。
  3.选择催化活性GA的关键酶基因PeGA3ox-2进行基因表达模式验证。结果表明,PeGA3ox-2在毛竹茎中的表达量最高,根和叶鞘次之,在叶中几乎不表达;PeGA3ox-2在笋尖内的表达随着笋高度的增加呈现先上升后下降的趋势;GA3(100μM)处理后毛竹实生苗茎秆中PeGA3ox-2的表达量受到抑制,而ABA(100μM)能在短时间内诱导茎秆中PeGA3ox-2的表达量迅速升高。由此可见,PeGA3ox-2在不同组织的表达模式及对不同外源激素的响应均存在一定的差异。
  4.采用同源克隆的方法,克隆得到了毛竹PeGA3ox-2的基因组cDNA和DNA序列,分别为1098bp和1361bp,具有2个内含子和3个外显子,与利用基因组数据预测的完全一致。PeGA3ox-2共编码365个氨基酸,含有1个Fe2+结合域和1个依赖2-酮戊二酸离子结合区域,符合GA3ox蛋白的结构特点,表明其可能具有催化活性GA的功能。
  5.构建PeGA3ox-2的植物过量表达载体,利用蘸花法转化模式植物拟南芥。RT-PCR结果表明,PeGA3ox-2在拟南芥中得到表达。表型分析发现,PeGA3ox-2过表达转基因植株的生长速度快于野生型,表现为莲座叶叶片变大,茎秆增粗,分枝数增多。石蜡切片观察结果显示,转基因植株茎秆韧皮部和维管束间纤维的细胞数量和体积都有所增加,说明PeGA3ox-2能促进转基因拟南芥的细胞增长和分裂。
  本研究为进一步全面了解毛竹GA合成途径中酶基因奠定了基础,同时PeGA3ox-2的功能初步研究,为揭示其在毛竹茎秆快速生长中的作用提供了参考,有助于利用基因工程技术通过调控GA合成实现对其生长的人为控制。
[硕士论文] 吕建华
生态学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:凋落物作为森林生态系统养分循环的重要组成部分,是土壤氮(N)、磷(P)等养分的重要来源。植物对叶片凋落前的养分重吸收效率能够反映植物对养分保存、利用以及对养分贫瘠环境的适应能力。氮沉降增加作为全球变化的重要现象之一,已经并将继续对植物叶片养分重吸收、化学计量特征以及植物凋落物产生影响。为了探讨氮沉降对毛竹(Phyllostachys edulis)林叶片养分重吸收以及凋落物的影响,本实验通过人工模拟不同强度氮沉降(低氮:N30,30kgN ha-1year-1;中氮:N60,60kg Nha-1year-1;高氮:N90,90kgNha-1year-1;对照:Control,0kg N ha-1year-1)的方法,研究了氮沉降对集约经营(IM)毛竹林不同年龄(1龄、3龄和5龄)毛竹叶片化学计量特征及养分重吸收的影响,以及对粗放经营(CM)和集约经营毛竹林凋落叶养分归还及其化学计量特征的影响,从而为全面认识大气氮沉降的生态学效应提供重要参考。主要研究结果:(1)氮沉降显著增加了1龄毛竹叶片N、P浓度但显著降低了N/P比,增加了3龄竹叶片N/P比;(2)氮沉降显著降低了1龄、3龄毛竹叶片对N、P的重吸收,但增加了5龄毛竹叶片对P的重吸收;(3)毛竹叶片凋落和N、P归还主要发生在3~6月,低、中氮沉降强度下显著增加了集约经营毛竹林凋落物量以及N、P的归还,对粗放经营毛竹林无显著影响;(4)集约经营比粗放经营毛竹凋落叶C、N、P浓度分别提高了9.3%、32.4%、22.7%,而C/N、C/P、N/P比则分别降低了17.4%、54.3%、44.6%,两种经营强度下低、中氮强度显著提高了毛竹凋落叶P浓度,降低了C/P、N/P比,高氮强度与之相反。
[硕士论文] 徐超
生态学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:毛竹(Phyllostachys edulis)有别于其它树种,幼笋出土后出现一个“爆发式”生长期。为了阐明该时期各度母竹的生理生态特征以及找到竹笋“爆发式”生长的原因,本文测定了快速生长期各度母竹的同化能力,水势传输的方向和强度,以及地上器官生物量的分配格局和营养元素的分配规律,并与小年期同期相应值做对比。研究结果表明:
  (1)毛竹笋高的生长呈现“慢—快—慢”的生长规律。在出笋18d左右达到最大值,约为0.78m/d。根据其高生长速率,将其分为初期、上升期、盛期和末期。毛竹日高生长量与空气温度、土壤温度、土壤含水量呈现显著相关。
  (2)快速生长期,各度竹叶的相对叶绿素含量呈现:Ⅲ度竹>Ⅱ度竹>Ⅰ度竹。除初期以外,在上升期、盛期和后期,快速生长期各度竹的相对叶绿素含量大于小年期相应值,其中在盛期差异性达到极显著水平;快速生长期,各度竹叶片净光合速率(Pn)呈现:Ⅲ度竹>Ⅱ度竹>Ⅰ度竹。快速生长初期各度竹叶冠层的净光合速率(Pn)比小年期相应值要高,但是差异不显著。在上升期,Ⅰ度竹之间差异不显著,但是Ⅱ度和Ⅲ度竹差异显著,在盛期和末期,各度竹之间差异性达到极显著水平;快速生长期,Yield、Fo、Fm和Fv/Fm均表现为Ⅲ度>Ⅱ度>Ⅰ度,但NPQ和Fv/Fo值与之相反,快速生长期Fo、Fm、Fv/Fo和Yield的值均大于小年期相应值,Fv/Fm值两个时期基本相等,但是快速生长期的NPQ值远远小于小年期相应的值。
  (3)快速生长期,各度竹叶冠层水势呈现:Ⅲ度竹>Ⅱ度竹>Ⅰ度竹,快速生长期各度竹的叶片冠层水势均大于小年期相应的值,并且差异显著。
  (4)快速生长期,各度竹地上器官的含水率均表现为叶>秆>枝,含水率随着竹龄的不同亦有所不同,各度竹地上器官生物量格局波动较平缓,没有明显的规律。快速生长期竹叶生物量占比大于小年期相应值,并且差异显著,而秆和枝的生物量占比无显著差异。
  (5)快速生长期,各度竹器官营养元素含量均表现为氮元素的含量最高,钾元素次之,磷元素最低。快速生长期氮元素在叶、枝、秆和根中的含量比小年期低,磷元素在叶、根的含量相对于小年期的含量较低,但在枝、秆中的含量要高于小年期,且在叶、枝和秆差异显著,钾元素在叶、秆和根中的含量要高于小年期,但在枝中的含量低于小年期,且在叶、枝和根中差异显著。
  总之,在毛竹快速生长期各度母竹展示自己的生态生理策略,通过向幼竹源源不断的提供营养物质和能量,供应新竹的生长,使得竹笋呈现出不同于其它树种的特征即“爆发式”生长。
[硕士论文] 沈燕
生态学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:随着社会经济的发展,土地盐碱化、干旱等生态问题不断出现,植物的生长因此受到影响。本研究通过对盆栽土浇入NaCl溶液以及控制水分的方法分别模拟了盐、干旱环境,研究欧美杂交杨(Populus deltoides×Populus nigra)雌雄植株对盐、干旱胁迫的生理生态响应,得出的主要结果如下:
  (1)盐胁迫导致欧美杂交杨的净光合速率(Pn)、气孔导度(gs)、蒸腾速率(Tr)、异戊二烯释放速率、异戊二烯合成酶(Isps)常数、相对生长速率(RHG)、茎干重(SW)、叶干重(LW)、总干物质量(TW)显著下降,提高了雄株的根冠比(Rs)。气孔导度在盐胁迫下降低,但是细胞间CO2浓度并没有受到影响,由此推测非气孔因素限制了欧美杂交杨的净光合速率。相关性分析表明异戊二烯的释放速率与光合速率呈线性正相关,由此认为异戊二烯的释放速率一方面受光合的影响,另一方面异戊二烯的释放可能是为了保护因盐害造成伤害的光合机构。盐害虽然降低了异戊二烯的释放速率,但是却并没影响异戊二烯的直接前体二甲基烯丙基二磷酸(DMADP)库容,而是降低Isps反应活性常数,因此盐害逆境下,异戊二烯的释放主要受异戊二烯合酶的调控。
  (2)干旱胁迫期间,从处理的第12天开始遭遇持续10多天的高温天气,因此研究结果是干旱协同高温的影响。首先干旱导致欧美杂交杨雌雄植株光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2浓度(Ci)等光合参数降低,说明气孔因素显著限制了Pn。然而荧光参数表明,干旱降低了光化学猝灭系数(qL)、光系统Ⅱ(PSⅡ)的实际量子效率和相对电子传递速率(rETR),同时增加了非光化学猝灭系数(NPQ)以及量子产额Y(NPQ),显示了PSⅡ原初电子受体(Qa)的还原状态,反映了植物的光合机构受损,也就是说Pn的降低还存在非气孔因素。抗氧化酶对干旱的响应比较复杂,超氧化物歧化酶(SOD)在重度干旱下降低,过氧化氢酶(CAT)上升,但是过氧化物酶(POD)没有显著的变化,重度干旱导致了丙二醛(MDA)的累积,说明抗氧化酶系统对活性氧的清除低于其积累能力,最终叶片因干旱受到伤害,表现为Pn下降,PSⅡ的电子传递受到阻碍,叶片脱落较多。干旱没有显著影响异戊二烯的释放速率、DMADP库容以及Isps反应活性常数。
  综上所述,无胁迫条件下,欧美杂交杨雌雄植株的生存能力大致相同,而在盐、干旱环境下,雄株的抗性相对较好;异戊二烯的释放水平以及抗氧化酶作为单独因素可能均不是欧美杂交杨雌雄植株抗逆性产生性别差异的直接原因;干旱与盐胁迫均能抑制欧美杂交杨的生长,但两者对欧美杂交杨的作用机制不一样。
[博士论文] 杨佳
植物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:获得有明确生理功能的基因是作物分子育种的重要基础。丰富的野生植物资源是天然基因文库。现代高通量测序技术使开发野生植物基因资源成为可能。沙地柏是分布于中国干旱半干旱地区的柏科匍匐灌木,具有耐旱生、耐土壤贫瘠的生理特性,在中国北方生态绿化工程中广泛应用。本论文在收集中国北方沙地柏种质资源的基础上,对沙地柏种质进行了生长和抗旱性评价;进一步通过转录组测序技术,以期鉴定到沙地柏特有Ca2+结合蛋白编码基因,但是意料之外的是,发现了一个预测为含有Ca2+结合结构域的钙调素类蛋白SvCML1是Zn2+特异结合蛋白,对SvCML1在植物Zn2+依赖生长方面的生理功能进行了探索。本研究工作主要内容和结论如下:
  (1)从内蒙古四个地区,以及甘肃、青海、陕西三个沙地柏原生态分布区,收集到总共221份种质资源,在扩繁基地生长3年半以后,对49个株系匍匐茎长度进行测量,每个株系至少取10株进行测量,并计算其平均值及标准差,结果表明来自陕西衡山、内蒙古陶利的沙地柏,生长最快,枝条长度1.5到2米;来自内蒙古贺兰山、甘肃天祝祁连山的沙地柏生长速度较慢,枝条长度0.5-1米。
  (2)2015年开始,分别对其中49个株系进行干旱处理6和11个月,同时以复水1个月以后材料为对照,收集扦插苗的地上部分进行抗旱指标的测定。每个株系,至少选择3株长势一致的枝条采样测量。对其枝条进行了脯氨酸(Pro)和丙二醛(MTA)含量测定,以及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定。基本抗旱能力判断依据为:在干旱处理条件下,Pro含量,SOD和POD活性,升高幅度越高,MDA含量升高幅度越低,植物越抗旱;反之,Pro含量,SOD和POD活性,升高幅度越小,MDA含量升高幅度越高,植物越干旱敏感。按照这个标准,大多数株系的四个指标之间没有明显规律,无法判断抗旱性。
  (3)具有明显抗干旱特征的株系包括来自内蒙古图克的#7,干旱处理以后,MDA没有显著升高,但是Pro含量和SOD酶活显著升高;来自内蒙古同德格尔的#30株系、内蒙古陶利的#8株系、陕西衡山的#5株系,干旱处理以后,MDA含量没有显著变化,但是Pro含量升高幅度在群体中位于前5位。
  (4)具有明显干旱敏感特征的株系包括来自内蒙贺兰山的#30株系和来自甘肃祁连山的#7株系:干旱处理以后,这两个株系的Pro含量、POD和SOD酶活都没有显著升高;但是,MDA含量升高幅度位于群体前2位。
  (5)以内蒙古陶利#8株系和内蒙古锡林浩特阿巴嘎旗的#2株系根为材料,进行了转录组测序。最初重点分析了沙地柏特有的编码Ca2+结合蛋白的基因,鉴定到SvCML1,预测编码Ca2+结合钙调素类蛋白。但是,利用体外表达纯化的SvCML1蛋白和等温滴定分析技术,SvCML1被证实不是Ca2+结合蛋白,而是Zn2+特异结合蛋白。
  (6)SvCML1蛋白被发现定位于植物细胞内的内质网。在相对高【Zn2+】培养条件下,SvCML1提高了转基因拟南芥根组织和根细胞内质网内的Zn含量。
  (7)在拟南芥体内过量表达SvCML1使转基因植物在相对高【Zn2+】和低【Fe2+】培养条件下,表现生长被抑制的表型。低【Fe2+】显著诱导拟南芥根积累Zn2+;在低Fe2+条件下,SvCML1转基因植物根Zn2+含量显著高于野生型。降低培养基的【Zn2+】,可以完全恢复SvCML1转基因拟南芥的低【Fe2+】敏感表型。
  (8)SvCML1抑制编码Zn2+转运蛋白AtZIF2(Zinc-Induced Facilitator2,At2g48020)和AtMTP1(Metal Tolerance Protein1,At2g46800)基因的表达。以前的研究发现,缺失AtZIF2和AtMTP1基因的拟南芥突变体,在相对高【Zn2+】培养条件下,有生长受抑制的表型。
  (9)以SvCML1为诱饵蛋白,利用拟南芥酵母cDNA文库,进行了酵母双杂交实验,筛选得到SvCML1互作蛋白AtCLC2(Clathrin Light Chain2,At2g40060)。缺失AtCLC2或其同家族基因AtCLC3(AT3G51890)的拟南芥,同SvCML1转基因拟南芥类似,在低【Fe2+】培养条件下,表现生长受抑制的表型。
  综上所述,在种质资源收集和生长、干旱性状评价的基础上,在沙地柏转录本中鉴定到一个编码钙调素类蛋白的基因,该蛋白体外实验和体内实验证明为Zn2+结合蛋白,具有提高植物Zn含量的功能,从多个途径调节植物Zn依赖的生长。本研究成果一方面对在生态绿化中沙地柏的应用提供了种质选择的力量依据,另一方面为通过分子育种改善作物Zn营养提供了具体的功能基因。
[硕士论文] 姚志红
园林植物与观赏园艺 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:生长素响应因子(auxin response factor,ARF)属于多基因家族,其中拟南芥的ARF1能影响开花、雄蕊发育、花器脱落和果实开裂以及根部的生长。现有的研究多以草本植物为对象,对其在木本植物中的功能研究很少。木霉菌是世界公认的环保型生防因子,不仅具有土壤污染修复作用,还能促进植物生长,对植物的多种病害具有防御作用。本研究以山新杨ARF1过表达组培苗(PodaARF1-H)为试材,野生苗(Poda-W)为对照,接种木霉菌(T)、细链格孢菌(A)以及混合接种2种真菌(TA)48h后,分析2种组培苗内源激素含量变化及与不定根生长、抗性相关的激素信号转导途径中关键基因的差异表达,从而揭示木霉菌促进PodaARF1-H生长和提高其对病原菌抗性的激素分子调控模式,主要研究结果为:
  1.对PodaARF1-H与PodaARF1-InR培养发现,ARF1过表达能使山新杨生长加快,并能显著增加山新杨不定根数量,从而有利于其吸收水分和营养,增强稳定性,贮存和合成有机物质。而ARF1抑制表达之后,山新杨的生长受到抑制且不定根数量明显降低。
  2.对激素含量测定发现,PodaARF1-H与Poda-W相比IAA、JA和SA含量普遍升高,并且PodaARF1-H植株的处理组中激素含量变化较大,说明ARF1过表达能促进山新杨生长并能提高植株对外界刺激响应的敏感性,从而更快地作出防御反应。此外,PodaA-W和PodaARF1-H组培苗的三个处理组中IAA、JA和SA含量均普遍提高,说明根际定殖木霉菌与在功能叶上接种细链格孢菌在短时间内(48h)有利于山新杨组培苗生长和提高植株抗性。
  3.叶片组织化学染色结果发现,NBT和DAB染色中PodaARF1-H叶片显色较Poda-W浅,说明ARF1过表达能够通过降低植株体内.O2-和H2O2的积累来提高山新杨抗氧化能力。Evans Blue染色中,PodaARF1-H叶片颜色较Poda-W深,说明ARF1过表达能够提高植株对外界刺激的敏感性。此外,山新杨根际接种木霉菌或功能叶上接种病原菌初期能增强植物防御反应。
  4.Poda-W在三个处理组中茎尖、被处理功能叶和根部的基因表达模式无规律性变化。而在PodaARF1-H植株的茎尖中在T组中IAA、JA和SA相关基因大部分为上调表达,而在A组中JA和SA相关基因多数为下调表达;被处理功能叶和根中在T组中JA和SA信号相关基因多数为下调表达,而在A组中这些基因均为显著上调表达。说明在接种短时间内ARF1过表达改变了抗性相关基因的表达模式,提高山新杨对木霉和细链格孢菌刺激响应的敏感性。并且,PodaARF1-H植株对细链格孢菌的反应更为敏感。
  5.将山新杨组培苗移栽到土壤中后发现,木霉菌能够增加山新杨幼苗的高度和叶片数量,并能减少叶枯病对植株造成的伤害。
[硕士论文] 康海滨
生态学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:我国酸雨区占国土面积的7.2%,酸雨城市比例达19.8%。美丽箬竹(Indocalamus decorus)是原产于我国南方的一种优良观赏竹,在园林绿化中有很高的应用价值。美丽箬竹在推广种植过程中难免遭遇酸雨。为揭示酸雨对美丽箬竹光合能力和土壤性质的影响,探讨提高其抗酸性的途径,本试验模拟酸雨,设定pH3.5、5.0和6.8(CK),对美丽箬竹盆栽幼苗进行短期处理。测定了叶绿素相对含量、气体交换参数、叶绿素荧光参数、根系活力、土壤pH值、土壤氧化铝和土壤速效养分含量并进行分析。主要结果如下:
  (1)在酸雨作用下叶绿素相对含量(SPADR)、净光合速率(A)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(GH2O)和蒸腾速率(E)呈下降趋势。在处理后期,酸雨处理的SPADR、A、GH2O、E与CK达到显著差异。酸雨也降低美丽箬竹PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)、PSⅡ反应中心的开放比例、光化学反应效率,增加过剩光能和光抑制程度。不过在初期和中期,pH5.0处理的美丽箬竹PSⅡ实际光化学效率(Yield)受到明显促进,其光抑制系数(Ki)也明显偏低。
  (2)处理结束后,美丽箬竹根系活力最高的是pH3.5处理,最低的是CK,两者差异达到显著。酸雨处理的表层土和底层土pH值均比CK低,但没有显著差异。而酸雨处理的表层土氧化铝含量均比CK低,差异达到极显著。酸雨处理的表层土速效养分含量均明显降低,其中pH5.0处理的速效氮和速效磷含量均与CK达到极显著差异。受养分向下迁移影响,各速效养分在底层土中的含量均高于表层土,但pH3.5处理的底层土速效钾含量显著低于另外两个处理。
  (3)相关分析表明在酸雨作用下,GH2O是A和E的主要限制因子,Yield和Ki呈负相关是因为PSⅡ反应中心受到伤害,活性下降。表层土pH值对表层土氧化铝含量具有显著影响,表层土速效氮与速效磷含量具有相似的变化规律。
  本文得出结论:轻度酸雨对美丽箬竹的光化学效率具有一定的促进作用,随着酸度增强和处理时间延长,光合能力呈下降趋势。酸雨还酸化土壤、溶解土壤氧化铝,促进速效养分向下淋溶,使美丽箬竹生长的土壤条件变差。提高土壤对酸雨的缓冲能力、改善土壤条件可能是提高美丽箬竹抗酸性的有效途径之一。
[硕士论文] 邬彩丽
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:许多野生植物携带抗旱、抗寒和抗盐碱等抗性基因,对农作物改良和增加农作物多样性极其重要,是农业育种的“基因库”,高通量和低成本的DNA和RNA测序技术极大地加快了这些基因的挖掘。首次对樟子松Pinus sylvestris L.var.mongolica Litv.(中国东北部的常绿松树)进行转录组分析,鉴定出一种新型的钙调素类蛋白编码基因PsCML1(Pinus sylvestris CALMODULIN-LIKE),在NCBI蛋白数据库中并未发现与PsCML1同源的蛋白,结果表明PsCML1是樟子松特异蛋白,对其生理功能进行研究。主要实验研究结果如下:
  (1)对PsCML1蛋白结构域进行预测,结果显示其N-末端具有一个非胞质结构域、1个单跨膜结构域和在C-末端具有4个EF-Hand结构域(Ca2+结合结构域)。通过MicroCal ITC200等温滴定量热法分析,发现PsCML1蛋白的EF-Hand结构域确实可以与Ca2+结合。
  (2)将PsCML1在烟草叶片中进行亚细胞定位,发现PsCML1定位于内质网。
  (3)在拟南芥中异源表达PsCML1基因,发现PsCML1可以促进幼苗的生长,并可以增强转基因植物对盐胁迫和低Ca2+胁迫的抗性。通过统计PsCML1转基因植物和野生型根尖分生组织(Root Apical Meristem,RAM)的细胞数目和长度,发现转基因拟南芥的分生区显著长于野生型,分生区的细胞数目明显多于野生型,但是分生区细胞长度无显著差异,这表明PsCML1基因促进拟南芥根生长。
  (4)因为细胞壁组分的生物合成与内质网中的蛋白质糖基化和活性氧稳态相关,采用Immunoblotting测定PsCML1对蛋白质糖基化的影响;采用H2O2特异探针二氢罗丹明(DHR)测定植物根的H2O2水平。结果显示PsCML1对拟南芥蛋白质糖基化无影响;PsCML1提高了植物H2O2水平,可能是由于H2O2含量的提高造成细胞壁组分的改变。
  PsCML1蛋白的鉴定和生理功能的研究为日后野生植物特异抗性相关基因提供了理论依据。
[博士论文] 杜超
植物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:WRKY转录因子家族是植物体内最大的转录因子家族之一,在植物生长发育以及响应环境胁迫的过程中起到重要的调控作用。目前有大量的研究探索了WRKY转录因子家族的调控机理,然而关于WRKY转录因子家族中WRKY1和WRKY23蛋白的研究仍然很少,WRKY1和WRKY23蛋白在植物响应盐胁迫和生殖发育过程中发挥的生物学功能未见报道。长叶红砂(Reaumuria trigyna,R.trigyna)是一种具有泌盐盐生植物特征的濒危双子叶小灌木,生长于中国的东阿拉善-西鄂尔多斯地区。长叶红砂对盐渍化荒漠环境具有很好的适应性,是防风固沙、改良荒漠区域的优良资源植物。目前关于长叶红砂的研究多集中在其形态特征和生理特征方面,而关于长叶红砂适应盐渍化荒漠环境的分子机理的研究却较少。本研究分析了两个长叶红砂WRKY转录因子基因RtWRKY1和RtWRKY23在多种非生物胁迫和ABA处理条件下的表达模式,将RtWRKY1和RtWRKY23基因在拟南芥中进行过表达,探索了它们在植物响应盐胁迫过程中以及生长发育过程中所发挥的生物学功能。并利用qPCR、基因芯片分析、酵母单杂交等技术,对其调控机理进行了深入研究,发现RtWRKY1和RtWRKY23基因能够通过调控抗氧化系统、离子转运系统以及脯氨酸代谢相关基因的表达,增强了植物在盐胁迫条件下的抗氧化系统效率和渗透平衡调节能力,提高了植物的盐胁迫耐受性。另外,RtWRKY23基因不经能够调控植物的盐胁迫响应过程,而且还调控了植物的生殖发育过程。具体研究结果如下:
  1.经qPCR分析,RtWRKY1和RtWRKY23基因主要在长叶红砂的茎中表达,在叶中表达量次之,而在根的表达量低。RtWRKY1基因的表达受盐胁迫、冷胁迫和ABA处理诱导,而被热胁迫抑制。RtWRKY23基因的表达能够受到盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫、紫外胁迫和ABA处理诱导,而被热胁迫抑制。
  2.在拟南芥中过表达RtWRKY1和RtWRKY23基因,均能够提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。相对于野生型拟南芥,RtWRKY1和RtWRKY23转基因拟南芥在盐胁迫条件下具有更高的根长、鲜重和叶绿素含量。同时在正常的生长条件下,RtWRKY1转基因拟南芥的生长状况和鲜重同样显著高于野生型拟南芥。
  3.RtWRKY1转基因拟南芥在盐胁迫条件下的抗氧化酶SOD、POD、CAT和GSH-Px的活性以及脯氨酸含量显著高于野生型拟南芥植株,而Na+和MDA含量显著低于野生型拟南芥植株。与野生型拟南芥相比,与抗氧化酶、离子转运和脯氨酸新陈代相关的基因AtAPX1、AtCAT1、AtSOD1、AtP5CS1、AtP5CS2、AtPRODH1、AtPRODH2和AtSOS1的表达量发生显著变化。
  4.RtWRKY23转基因拟南芥的基因芯片分析结果显示,在盐胁迫条件下,与野生型拟南芥相比,共有449条基因的表达量在RtWRKY23转基因拟南芥中发生显著变化,其中上调DEGs102条,下调DEGs347。GO和KEGG富集分析显示,这些DEGs富集到了多个与植物生长发育、植物激素以及响应环境胁迫相关的途径当中,例如“Plant hormone signal transduction”、“Peroxisome”、“Starchand sucrose metabolism”等KEGG途径,以及“Response to stress”、“Response tohormone”、“Response to abiotic stimulus”等GO分类。
  5.在RtWRKY23转基因拟南芥的基因芯片分析结果中筛选到3条表达量显著升高的POD基因POD、POD22和POD23,1条表达量显著降低脯氨酸降解途径基因PRODH2。qPCR和酵母单杂交实验结果显示,RtWRKY23蛋白能够结合在POD22、POD23和PRODH2基因的启动子序列上,从而调控了这3个靶基因的表达量。RtWRKY23转基因拟南芥体内的超氧阴离子清除率、POD酶活性和脯氨酸含量在盐胁迫条件下显著高于野生型拟南芥,而过氧化氢含量显著低于野生型拟南芥。
  6.RtWRKY23转基因拟南芥的基因芯片分析、qPCR分析和酵母单杂交实验分析发现,RtWRKY23蛋白能够结合在MAF5、HAT1和ANT基因的启动子序列上,并调控了这3个靶基因的表达量。与野生型拟南芥相比,RtWRKY23转基因拟南芥出现了开花延迟、种荚数目和长度减小和种子产量降低的现象。
[博士论文] 王丽云
森林培育 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:降香黄檀(Dalbergia odoriferaT.Chen.)俗称海南黄花梨,其木材属极珍贵红木,且具有极高的药用价值,目前在我国华南地区广为栽培。降香黄檀幼龄初期大量开花结实是其重要的特性之一,开花结实消耗养分,不利于其营养生长乃至木材生产;另一方面,生长旺盛的降香黄檀优树往往开花结实晚且种子产量低,远远满足不了林业生产对于优良种质材料的需求。因此,开展降香黄檀营养和生殖生长调控研究,对于促进降香黄檀珍贵用材树种速生丰产或优良种质材料生产具有重要意义。本研究于降香黄檀幼林设置系列氮、磷、钾施用量梯度试验,于中幼林铺设氮磷钾配比、复合肥用量以及生长调节剂种类和用量系列试验,通过树体生长、开花结实、养分状况等方面指标的测定,探究施肥措施和生长调节剂应用对降香黄檀营养和生殖生长的影响。主要研究结果如下:
  (1)施用氮肥显著影响降香黄檀幼林的营养生长和生殖生长(p<0.05)。所有施氮肥处理的降香黄檀树高、地径、胸径和冠幅均显著高于对照,随着氮肥用量的增加,这些指标总体上呈现升高的趋势。低氮和高氮用量促进降香黄檀生殖生长,中氮则表现出抑制作用。在所有处理中,92.8 gN·株-1施氮量可以显著促进降香黄檀幼林的营养生长,降低其开花株率、花枝率、果枝率、花序数、小果数和百果重,换言之,对生殖生长的抑制效果最佳。
  (2)7个施磷肥处理间降香黄檀幼林的营养生长差异不显著(p≥0.05),而生殖生长存在显著差异(p<0.05)。施用磷肥可以提高降香黄檀的开花株率、结果株率、花枝率、果枝率、花序数,且开花株率、结果株率、花枝率的差异均达显著水平。在所有处理中,120 g P2O5·株-1施磷量最有利于降香黄檀的生殖生长,表现为显著提高降香黄檀幼林的开花株率、结果株率、花枝率、小果数。
  (3)钾肥施用量显著影响降香黄檀幼树的营养生长和生殖生长(p<0.05)。随着施钾量的增加,树高、胸径和地径均表现出先升高后趋于平稳的变化趋势,36、72和108 gK2O·株-1施钾量均显著高于对照,但三者之间差异不显著。而降香黄檀生殖生长随着施钾量的增加表现为先促进后抑制的效果,18g·株-1K2O施钾量显著提高花枝率和果序数,36g·株-1K2O显著提高果序数、小果数、花序长和花序直径,72和108 g K2O·株-1显著降低开花株率、结果株率和果枝率。综合考虑营养和生殖生长的差异性,72 g·株-1K2O施钾量是控制降香黄檀幼林过早开花结实、促进营养生长的最佳施钾用量。
  (4)不同NPK复合肥组合对降香黄檀中幼林营养生长和生殖生长的影响差异达显著水平(p<0.05)。N(185.6 g N·株-1)处理的营养枝率、营养枝复叶数和小叶宽分别比对照提高40.25%、21.75%和9.52%,花序直径和花序生物量则降低12.75%和48.63%,显示N肥能促进降香黄檀营养生长,抑制生殖生长,有利于其大径材培育;P(120 g P2O5·株-1)、PK(120 g P2O5+120 g K2O·株-1)处理的营养枝率较对照显著降低47.96%和46.84%,表明P肥和K肥能促进生殖生长,有利于种子生产;NPK(185.6 gN+120 g P2O5+120 gK2O·株-1)处理能同时显著促进营养生长和生殖生长,其营养枝率、营养枝长度、营养枝复叶数、营养枝小叶长、宽和枝生物量比对照提高26.04%、68.16%、32.98%、15.20%、11.40%和83.60%,花序数量和花序生物量亦提高54.20%和49.84%。因此,可通过调整肥料的NPK配比(偏向N或PK)以实现营养生长或生殖生长调控之目的。
  (5)不同NPK复合肥用量显著影响降香黄檀的营养生长和生殖生长(p<0.05)。500g·株-1复合肥(N∶P2O5∶K2O为16∶16∶16)可以显著增加降香黄檀中幼林的花序数;1000 g·株-1复合肥处理后降香黄檀的百果重和百粒重是所有处理中最高的,显著高于2000 g·株-1处理。2000 g·株-1处理显著降低降香黄檀的花枝率和百果重。
  (6)不同种类和用量的生长调节剂对降香黄檀中幼林营养生长和生殖生长的影响差异显著(p<0.05)。叶面喷施200、100 mg·L-1的GA3和500 mg·L-1的6-BA显著促进降香黄檀的营养生长,抑制生殖生长;叶面喷施1500、2000 mg·L-1的PP333和50 mg·L-1的6-BA均能显著促进降香黄檀的生殖生长。总体而言,200 mg·L-1的GA3对生殖生长的抑制效果最理想,施用后花枝率和花序数显著降低,100 mg·L-1的GA3对营养生长的促进效果最显著,其营养枝长、直径、复叶数和单叶干重显著增加;喷施2000 mg·L-1 PP333对生殖生长的促进效果较好,能显著提高其花枝率、花序数量和花序径和千粒重。
[硕士论文] 张瑞芝
森林保护学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:杨树是世界上适应性最强、分布最广的树种。随着杨树人工林面积的不断扩大,我国现拥有世界上面积最大的杨树人工林。杨树是一个易发生病虫害的树种,其中危害杨树的致病菌株有300多种,我国报道存在的有110多种。在杨树叶部病害中,落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)引起的杨树叶锈病分布最广、危害最大。
  通过落叶松杨栅锈菌E4强致病株系接种后两个杨树品种的症状及其间苯三酚染色判定杂交杨与E4锈菌互作为非亲和型互作,欧美杂交杨与E4锈菌互作为亲和型互作。以杂交杨为主要研究对象,欧美杂交杨作对照,对E4锈菌侵染后96h两个品种转录组数据进行分析发现,转录因子参与杂交杨应答E4锈菌侵染,其中NAC、WRKY、MYB、AP2和ERF所占比例较大。进一步对转录组数据中重要的5个转录因子家族进行分析发现,大部分WRKY转录因子在杂交杨应答E4锈菌12h和96h上调表达,起正向调控作用。
  WRKY转录因子家族属于调控蛋白家族,是植物防御信号转导中至关重要的因子。以杂交杨转录组数据为基础,鉴定到100个PdtWRKY基因,其中99个PdtWRKY基因分别对应在毛果杨19条染色体上,PdtWRKY100定位于Scaffold_41。转录组数据分析表明杂交杨接种E4锈菌后有53个基因差异表达(8个基因下调,45个基因上调),选择上调表达的基因进行进一步研究。对45个基因进行靶基因预测,其中有28个基因找到相应的靶基因,共有305个靶基因,建立调控网络。对靶基因进行分类整理后,发现其中有21个靶基因具有转录因子活性,其中包括PdtWRKY64,它的上游基因为PdtWRKY86。PdtWRKY86在杂交杨接种E4锈菌后上调表达,转录调控唯一的靶基因PdtWRKY64,PdtWRKY64又转录调控18个基因,其中12个与植物抗病相关。由此表明PdtWRKY86具有多级调控网络,它的靶基因在杂交杨接种E4锈菌后也上调表达,因此筛选出Pdt WRKY86基因作为研究对象。
  为明确PdtWRKY86基因在杂交杨与E4锈菌互作过程中的功能,克隆该基因、对7个时间点表达量进行分析并进行转基因验证。PdtWRKY86CDS全长为965bp,编码311个氨基酸。除6h外其余6个时间点均上调表达,表明PdtWRKY86在杂交杨与E4锈菌非亲和互作过程中起到正向调控作用。PdtWRKY86转基因拟南芥阳性植株较野生型拟南芥接种灰葡萄孢和致病疫霉后发病慢、病斑小,PdtWRKY86转基因拟南芥较野生型拟南芥抗病性强,表明PdtWRKY86转基因植物通过多级调控抗病相关基因的表达,提高转基因植物的抗病性。综上所述,证明PdtWRKY86是杂交杨-E4锈菌非亲和型互作过程的正向调控因子。
[硕士论文] 王若宁
森林植物资源学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:氮素是植物生长发育必不可少的大量元素之一,也是限制植物生长的主要原因。氮素的吸收与利用效率直接影响植物的生长与发育。研究表明,Dof转录因子家族的一些成员参与调控一系列与氮素的吸收及利用相关的基因的表达,进而提高植物的生长指标。为了筛选出小黑杨中可能促进氮素同化的Dof转录因子成员,设计并进行了一系列实验,结果如下:
  1.利用生物信息学的方法,基于2012年公布的毛果杨V3.0数据库,对毛果杨Dof家族进行重新鉴定,共鉴定出毛果杨中44个Dof家族成员;根据构建的系统进化树的结果将毛果杨Dof家族成员分成4个亚家族,除了PnDof29外,每个Dof成员都具有完整的Dof保守结构域;除PnDof29蛋白定位在线粒体中外,其他Dof成员都定位在细胞核中;毛果杨Dof成员大多在嫩叶、根中表达。
  2.为了鉴定出受到氮素诱导的小黑杨Dof转录因子基因,本研究设计了两组独立的氮素处理实验,一组是缺氮3天后,重新进行氮素供应48h,然后再次断氮48h,探索缺氮和氮素恢复对小黑杨Dof基因表达的影响。另一种是用三个浓度的铵态氮和硝态氮分别处理小黑杨,探索在不同浓度和不同种类氮素处理下Dof基因表达量的变化。通过这两组实验,筛选出6个响应氮素的Dof基因,PnDof10、PnDof12、PnDof19、PnDof20、PnDof30、PnDof32,选择3个基因进行后续实验:PnDof19、PnDof20和PnDof30。
  3.根据已完成基因组测序的毛果杨V3.0数据库设计引物,克隆出小黑杨中上述三个基因的同源基因PnDof19、PnDof20和PnDof30,氨基酸序列分析发现他们都具有Dof结构域和核定位信号;系统进化分析显示PnDof20和PnDof30与已验证具有调控氮素代谢功能的拟南芥AtDof1和海岸松PpDof5聚在一起,说明这两个基因可能参与调控氮素代谢。
  4.利用基因枪介导的瞬时转化方法,对这3个Dof转录因子进行亚细胞定位,发现它们都定位在细胞核中,这说明PnDof19、PnDof20和PnDof30基因具有核定位信号。
  5.将PnDof30基因转化至拟南芥中并进行氮素处理,结果表明,在低氮水平下,过表达基因拟南芥具有更好的生长表型;可溶性蛋白和叶绿素含量显著提高,可溶性糖含量显著降低;AMT、NRT和GS基因家族成员一部分上调表达,一部分下调表达,PEPC和PK基因的表达量显著提高;PEPC、PK、GS、NR的酶活均显著提高。这些结果说明在低氮条件下,过表达PnDof30拟南芥能够提高生长和C/N代谢水平。
[硕士论文] 刘小英
森林培育 中国林业科学研究院 2018(学位年度)
摘要:造林树种种源选择已成为人类应对气候的重要途径,探讨主要造林树种不同地理种源树轮指标对气候变化的响应及评价未来气候变化对树木种源生长的影响的研究较少。本文运用杉木(Cunninghamia lanceolata)树轮稳定碳同位素指标进行相关研究。首先采用3个杉木种源的树轮全木和α-纤维素统计特征及其与栽植地气候因子相关性分析,选出对气候变化响应较灵敏的组分。之后提取30个不同地理种源的杉木树轮的α-纤维素并测定δ13C值,分析不同种源及所处种源区与栽植地平均温度、降水、平均相对湿度、最低气温、最高气温、最小相对湿度、日照时数的当年、当年之前1年、当年之前2年的年、季、月值的相关性,选择相关性较强的年最小相对湿度等气候因子进行逐步回归,筛选影响杉木种源树轮δ13C值的主导气候因子。之后对这些主导气候因子建立响应函数。然后对未来温度升高0.5-0.8℃下不同种源区及种源的杉木树轮δ13C值进行预测,以期为气候变化条件下杉木造林的种源及种源区的选择提供理论依据。主要结论有:
  (1)比较分析杉木树轮全木和α-纤维素中δ13C对气候的响应,发现杉木树轮α-纤维素中的δ13C对气候的响应更加灵敏。
  (2)通过对30个杉木种源树轮δ13C值的年表统计分析,发现其变幅-23.67‰~-24.25%,且自相关系数较大,不同种源杉木树轮δ13C值对气候因子的响应存在明显的“滞后效应”。
  (3)不同种源树轮α-纤维素中δ13C对不同尺度的气候因子的响应情况是不同的,对于多数种源而言,其主要受到当年最小相对湿度、当年春季降水和最小相对湿度、当年夏季最低气温、上年和当年7月最低气温、当年8月最低气温和相对湿度、上年10月最高气温、当年7月平均气温的影响。而不同种源区则主要受到当年最小相对湿度、当年夏季降水及最低气温、上年及当年7与最低气温的影响。
  (4)通过建立不同种源杉木树轮δ13C值与当年最小相对湿度及当年夏季最低气温的单因素响应函数,建立当年春季降水和最小相对湿度、上年和当年7月最低气温、当年8月最低气温和平均相对湿度、上年10月最高气温和当年7月平均气温的双因素响应函数,我们发现上年及当年7月的最低气温对不同种源杉木树轮δ13C的平均贡献率达到50.57%。且最低解释量为23.88%,拟合精度高,能更好的表示树轮δ13C值的变化。
  (5)通过不同种源区杉木树轮δ13C值与当年最小相对湿度及单因素响应函数,建立当年夏季降水和最低气温、上年和当年7月最低气温的双因素响应函数,发现当年夏季降水和最低气温对不同种源区杉木树轮δ13C的平均贡献率最大,平均贡献率达到68.03%,而最低贡献率达到59.09%,该模型拟合精度较高。
  (6)采用拟合效果较好的模型进行未来最低气温升高0.5-0.8℃情景下对树轮稳定碳同位素含量的预测。我们发现随着温度的升高,不同种源区及种源的杉木树轮α纤维素中的δ13C值均呈现上升趋势。30个种源以高、中、低3中不同灵敏度响应模式适应未来气候变化,北亚热带的秦巴山地种源区较其他种源区响应更为灵敏。
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