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[硕士论文] 周骏杰
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:类黄酮物质广泛分布于各种植物中,在生物的许多生理活动中起着重要的作用。它也是人类饮食中来源最广含量最丰富的一类多酚化合物,具有抗炎症、抗氧化、抗癌及预防心血管疾病等诸多功效。柑橘类水果中含有丰富的类黄酮化合物,是人类摄入类黄酮的主要膳食来源之一。然而,对于各类柑橘品种不同组织中黄酮类化合物的综合代谢谱与自然多样性的报道还很少。
  本研究基于非靶向代谢组学方法对62份柑橘种质资源建立了类黄酮代谢物数据库,并通过广泛靶向代谢组学方法进行了定量研究。首先,通过非靶向代谢组学方法在柑橘种质各组织混样中检测到7416个代谢信号,主成分分析揭示了黄皮与其他组织的显著差异;在主要栽培的柚子、柠檬、葡萄柚、甜橙以及宽皮柑橘5大类柑橘种质中注释出117种不同修饰类型的类黄酮,包括7种类黄酮苷元,10种C-糖基化类黄酮,10种C-/O-糖基化类黄酮,44种O-糖基化类黄酮,39种多甲氧基化黄酮以及7个新注释的O-糖基化多甲氧基化类黄酮。
  定量结果表明,不同类型的类黄酮在各组织间有不同的积累模式。多甲氧基化类黄酮特异在皮层特别是黄皮层富集;含C-糖修饰的类黄酮表现为在黄皮组织中较其他组织更高的积累;而O-糖基化黄酮则较为均衡的分布于各个组织中;至于黄酮苷元,除木犀草素外,含量都普遍较低。对于不同种类的柑橘,宽皮柑橘中的多甲氧基化类黄酮和氧糖基化多甲氧基化类黄酮含量最高,其次则是甜橙。
  根据类黄酮的种间代谢多样性,聚类分析结果将62个种质清晰地分为5个不同的簇,这与本研究使用的柑橘亚属分类高度吻合。聚类热图显示宽皮柑橘和甜橙的代谢谱表现的极为相似,柠檬和柚子的代谢谱迥异于其它三类品种,而与柚子有高度亲缘关系的葡萄柚却表现出与甜橙更为相似的代谢谱。在邻接树图中,甜橙和宽皮柑橘紧密聚集,与其他3个种类的距离较远,这显示出宽皮柑橘和甜橙具有很密切的遗传关系。同时,葡萄柚也显示与甜橙较近的关系,从代谢角度佐证了其母本是柚,父本是甜橙的假说。
  综上所述,柑橘的各组织中黄皮层具有较显著的类黄酮积累差异,并且类黄酮含量在不同种群中的变异可以做为柑橘种属驯化演变的一个重要参考指标。
[硕士论文] 朱宗瑛
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文以栽培面积较大的2个柑橘品种(纽荷尔脐橙(Citrus sinensis Osbeck)和温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.))为试验材料,在降水量大于1000mm的宜昌市和郴州市开展田间试验,设置不同氯水平处理,研究含氯肥料施用对柑橘产量、品质、矿质养分吸收及土壤氯离子残留的影响。主要研究结果如下:
  (1)含氯肥料的施用均有提高柑橘产量的趋势。完全氯化钾处理(T3)产量较硫酸钾处理(T1)有增加趋势,纽荷尔脐橙和温州蜜柑T3处理产量较T1分别提高22.3%和21.1%;在完全氯化钾基础上补施氯化钙,纽荷尔脐橙产量较T1有增加趋势,温州蜜柑产量有显著提高。
  (2)施用含氯肥料对纽荷尔脐橙和温州蜜柑果实可溶性固形物、维生素C、出汁率和单果重指标有改善作用,对果皮厚度、单果重、纵经、横径、果皮色差值指标影响较小。完全氯化钾处理(T3)果实可溶性固形物、可滴定酸、固酸比、维生素C、出汁率和纵横比指标均优于硫酸钾处理(T1),其中2017年纽荷尔脐橙和温州蜜柑氯化钾处理(T3)维生素C含量较硫酸钾处理(T1)分别提高11.38%和9.51%,温州蜜柑可溶性固形物显著提高了13.94%。
  (3)含氯肥料的施用可显著提高纽荷尔脐橙和温州蜜柑叶片氯离子含量,对果肉和果皮氯离子含量影响较小。叶片氯离子含量与施氯水平呈现极显著相关,连续两年施用含氯肥料,温州蜜柑和纽荷尔脐橙叶片氯离子含量仍处于缺乏水平(0.2%)。根据叶片氯离子含量增加速度,用氯化钾代替硫酸钾在柑橘整个经济寿命期叶片氯离子含量不会达到毒害水平(0.7%)。
  (4)受降水、施肥等因素的影响,土壤中氯离子处在动态变化中。施用含氯肥料在一定时间内(6月和9月)可显著提高土壤氯离子含量,随柑橘的吸收和降水量的增加,施肥对土壤氯离子的影响越来越小,在柑橘生长周期的末期(12月)土壤氯离子含量整体下降到较低水平。随土壤剖面的加深,各处理土壤氯离子含量整体呈增加趋势,这是土壤中氯离子随水向下层土壤迁移的缘故。施用含氯肥料会增加氯在土壤中的残留量,但残留量不会随施肥年数的增加而增加,在本试验设置的施氯水平范围内,可连续施用含氯肥料。
  (5)含氯肥料的施用可以显著提高纽荷尔脐橙和温州蜜柑叶片氮含量,对果肉、果皮氮磷钾及叶片磷钾含量影响较小。氯化钾逐步代替硫酸钾,纽荷尔脐橙和温州蜜柑果肉和果皮钙含量呈增加趋势,补施氯化钙处理果肉果皮钙含量均显著高于硫酸钾处理(2017年)。各处理温州蜜柑叶片钙随施氯水平的增加而增加,纽荷尔脐橙叶片钙含量呈先下降后上升的规律,这有可能是氯促进纽荷尔脐橙叶片中钙向果实中的转移。
  综上所述,在试验设置的施氯水平范围内,施用含氯肥料对纽荷尔脐橙和温州蜜柑有提高产量、改善品质的作用;会提高叶片氮和钙含量,及果肉果皮钙含量,会造成叶片和土壤氯离子含量增加,但含量低于柑橘遭受氯毒害的临界水平。因此可以在温州蜜柑和纽荷尔脐橙上施用含氯肥料。
[博士论文] 何义仲
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:纽荷尔脐橙(Citrus sinensis Osbeck‘Newhall’)是我国主栽脐橙品种,因采收期集中且以鲜食为主,采后贮藏保鲜是缓解销售压力的重要措施。柑橘采后生产过程主要包括果实清洗、防腐保鲜、打蜡和包装等商品化处理。上述不当处理不仅容易导致果实产生异味,而且化学防腐保鲜剂长期使用和生产废弃物排放对消费者健康和产区生态环境造成的不利影响已引起社会普遍关注。果面蜡质层既是果实与外界环境互作的最外围屏障,也是果实适应和抵抗不良贮藏环境的第一道防线,对保持果实食用品质和延长贮藏寿命具有重要意义。适应果实食用安全、产区生态安全、生产绿色低能耗等是柑橘产业发展的新要需求,深入解析柑橘果实角质层的生物学特性及贮藏环境对其采后品质的影响是实现果实采后绿色、有机生产的重要前提。本研究以纽荷尔脐橙果面光亮型芽变突变体‘赣南1号’和野生型纽荷尔脐橙果实为材料,从形态学、细胞学、代谢和转录等不同层次对比研究了两种类型果实表面蜡质生物学特性和贮藏性能差异,分析‘赣南1号’果实蜡质缺失、抗病性增强及衰老延缓的生物学基础。同时,系统分析贮藏环境及出库温度对纽荷尔脐橙果实货架期品质的影响。主要结果如下:
  1.果面蜡质生物学特性及果实贮藏试验结果显示,‘赣南1号’是一个表面蜡质缺陷的光亮型纽荷尔脐橙突变体,其果实耐病性增强且采后贮藏品质更加稳定。果面蜡质晶体结构和角质结构观察表明,‘赣南1号’果面蜡质晶体显著下降,且角质结构保持完整。田间自然发现,‘赣南1号’果面菌丝数量较少且菌丝生长状态均弱于纽荷尔脐橙。未经防腐保鲜处理,将果实置于通风库贮藏135d和180d,‘赣南1号’果实腐烂率分别为44.44%和76.67%,显著低于野生型纽荷尔脐橙果实(72.22%和90.00%);但是两者失重率、含水量和出汁率无显著性差异。‘赣南1号’果实始终维持良好的果蒂状态、可滴定酸(TA)和可溶性固形物含量(TSS),各项指标均显著高于其野生型果实。以上结果表明‘赣南1号’果实采后耐病性显著增强,且贮藏期果实品质更加稳定,耐贮藏性能显著提高。
  2.柑橘全基因代谢网络和生化分析果实耐病特性显示,‘赣南1号’果实超长链脂肪酸(VCLFAs)延伸受阻和蜡质缺失,同时激活JA调节抗性反应介导果实耐病性。CitrusCyc2.0分析表明:‘赣南1号’果实VCLFAs延伸且蜡质合成通路受阻;结合发育时期的‘赣南1号’果实蜡质和总脂质数据表明,其果实C24-C32蜡质组分和VLCFAs显著降低;与此同时,参与蜡质延伸CER2等基因表达量显著下降,且其启动子元件发生改变;CER3,CER1-1和CER1-3表达量下降,且CER3与CER1互作,推测这是引起‘赣南1号’果面蜡质醛类和烷烃显著下降的原因。更为重要的是,CitrusCyc2.0分析表明‘赣南1号’多不饱和脂肪酸(PUFAs)及其衍生物茉莉酸(JA)合成被激活;代谢物如脯氨酸、谷胱甘肽、生育酚和类黄酮物质显著积累。人工接种试验表明‘赣南1号’果实显著增加了对采后病害的耐病性;结合细胞学和生物化学分析显示,‘赣南1号’果实耐病性与蜡质减少无直接关系,而是主要依赖于JA生物合成及其下游抗性基因如PDF1.2表达量增加。外源MeJA可提高柑橘果实耐病性,相反JA抑制剂(二乙基二硫代氨基甲酸钠、布洛芬和没食子酸丙酯)可降低其耐病性,从而证实‘赣南1号’活跃的JA合成是其采后耐病性提高的原因。
  3.代谢组和生化分析表明,‘赣南1号’果实增加不饱和脂肪酸同时激活维生素C-谷胱甘肽-生育酚循环,维持生物膜结构稳定,从而提高果实采后品质。‘赣南1号’和野生型纽荷尔脐橙果实经过常规商业包装后放置于通风贮藏库贮藏180d(温度12-20℃和RH75%-85%)。出库后经10%和30%聚乙二醇6000处理发现,‘赣南1号’果肉组织的生物膜损害率分别是8.77%和16.11%,显著低于野生型果实(41.16%和52.59%);‘赣南1号’果实在贮藏过程中膜内电势、丙二醛和脂质过氧化物含量也显著低于亲本果实,但是ATP含量和SOD酶活性显著高于亲本果实,证实‘赣南1号’更加稳定膜结构。与亲本果实相比,‘赣南1号’显著增加不饱和脂肪酸如C16:1和C18:3FA和不饱和度,积累柠檬酸、脯氨酸、类黄酮物质(橙皮素7-0-葡萄糖甙),激活维生素C-谷胱甘肽-生育酚循环,从而提高果实生物膜流动性和膜脂质抗氧化能力。生物膜指数与贮藏和品质参数关联性分析表明,‘赣南1号’稳定的膜结构提高了其对采后贮藏环境的耐受性。
  4.对不同商业贮藏库内赣南纽荷尔脐橙果实贮藏期品质分析结果显示,山区水冷简易贮藏库贮藏效果优于机械冷库和通风库;贮藏与运输环境的温度差过大是导致冷藏脐橙货架期短的主要原因。对比研究以上柑橘贮藏库对赣南纽荷尔脐橙果实贮藏期和货架期的影响,发现:随着气温升高机械冷库贮藏与环境的温差以及库内C02、乙烯和乙酰酯类物质含量显著高于山区水冷简易贮藏库和通风贮藏库。贮藏105d,机械冷藏果实可滴定酸、柠檬酸和苹果酸含量最高,但是其在贮藏160d时消费者满意度最低,乙醇含量(723.02μg/L)显著高于其它贮藏库果实。相反,山区水冷贮藏果实160d的硬度、可溶性糖和Vc含量显著高于机械冷藏和通风库贮藏。综上所述,通风贮藏和机械冷藏果实货架期品质分别在65d和135d显著下降,但是山区水冷简易贮藏果实的寿命可达到160d。
  分析低温贮藏果实出库后‘浮皮’的机制,结果表明贮藏与运输环境的温度差过大引起乙烯介导的细胞壁果胶组分降解、膜系统裂解和质地软化等生理失调是导致长期冷藏脐橙果实‘浮皮’、货架期缩短的主要原因。
[博士论文] 余惠文
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柚(Citrus maxima)是柑橘基本种之一,在柑橘中具有重要的生物学地位,同时在中国柑橘产业上占有重要的经济地位。中国是柚类的原产国和主要栽培国之一。根据《禹贡》的记载,柚在中国已有4,000多年的栽培历史。柚多以实生繁殖,在不同的地理环境下,形成了现在丰富多样的种质资源。然而由于各种原因,有些古老品种正在逐渐丢失,且柚类资源的调查和保护工作又比较滞后,对于中国丰富多样的柚类遗传资源,目前尚无比较全面的群体遗传学研究;且多数研究主要针对果实性状进行,而对于叶片的研究比较缺乏。
  本研究从全国柑橘适栽地区广泛收集柚类资源,包括主栽品种和地方品种,基于nSSR标记技术,分析了中国柚类资源的遗传多样性和群体结构,为中国柚类传播提供了遗传学的证据;进一步通过全基因组重测序技术,开展了琯溪蜜柚果肉色泽突变体研究,挖掘可能与果肉色泽相关的SNP位点;围绕琯溪蜜柚叶片渐绿性状,构建了有性分离群体,挖掘渐绿突变相关的候选基因,为柚遗传改良提供群体基础。主要结果如下:
  1.柚群体遗传多样性、群体结构及色泽突变分析
  2010-2013年,连续4年时间从全国13个柚类适栽省份收集了近300份的柚种质资源,其中包含经济栽培品种60份,地方品种212份,柚类杂种2份。该柚类自然群体资源表型丰富,其中果肉为白色的资源有109份,果肉为红色有113份,少数资源果肉为绿色;其它果实性状,如果实大小、果形、种子数、果皮厚度等,均表现出丰富的遗传多样性,表明柚资源收集比较全面。应用定位于柑橘9条染色体上的31对多态性nSSR引物对该自然群体进行多样性分析,共扩增得到147个多态性条带,平均每个位点检测到4.7条带,平均观测杂合度(Ho)为0.325,平均期望杂合度(He)为0.430,31对引物的多态信息含量(PIC)平均值为0.414。群体结构预测显示该自然群体具有2个基本的基因库(K=2),即亚群A与亚群B,且这2个亚群与地理分布相关;其中,亚群A包含中国东南地区大多数品种和中国南方中部地区的部分品种,亚群B则主要由中国西南地区的大多数品种和中国南方中部地区的部分品种组成。与亚群A的Ho(0.307)和He(0.368)相比,亚群B的Ho和He的值分别为0.345和0.465,反映出中国西南地区的柚品种具有较高的杂合度。结合群体结构(K=3)、主成分分析(PCoA)和系统发育分析的结果表明,收集的柚自然群体可分为三个亚群:Pop-a(主要由中国东南地区的品种组成)、Pop-b(主要由中国南方中部的柚品种组成)和Pop-c(主要由中国西南地区的柚品种组成)。分子标记结果显示,Pop-b可能是在柚传播过程中由两个基因库交汇而形成的一个新的多样性子群。瓶颈效应分析发现中国柚自然群体在近期驯化经历了一个微弱的瓶颈效应,并未造成种群有效种群数目的大量减少。
  以收集的白肉琯溪蜜柚及其突变体红肉琯溪蜜柚为材料进行全基因组重测序,基于生物信息学分析,挖掘到5个差异SNP位点,其中一个SNP位点验证为阳性,且该差异SNP位点为琯溪蜜柚红肉突变体的汁胞层所特有。序列分析显示该位点在白肉琯溪蜜柚中为纯合T,而红肉琯溪蜜柚中由T突变成T/G杂合,导致该位点所在基因(CiPR)可以继续编码81个氨基酸。进一步分析CiPR基因在琯溪蜜柚不同发育时期果肉内的表达模式发现,在150DAF(花后天数)红肉琯溪蜜柚高积累番茄红素时期,CiPR基因在红肉琯溪蜜柚的表达量高于白肉琯溪蜜柚。将CiPR基因转化柑橘愈伤,分析超表达阳性系愈伤组织的类胡萝卜素通路基因的表达模式,结果显示相关基因在表达上并没有显著差异,表明该SNP可能是柚类的一个多态性位点。
  2.琯溪蜜柚叶片渐绿性状研究
  叶片渐绿突变体琯溪蜜柚(CP)为琯溪蜜柚芽变品种,果皮橙色,叶片有渐绿(缓慢绿化或延迟绿化)性状。以其为母本,晚白柚(WBY)为父本构建有性杂交分离群体,获得551株杂交F1分离后代,其中135株叶片具有渐绿性状(MCW),416株叶片为正常绿叶的表型(WCW)。对MCW和WCW幼年叶片的色素含量分析显示,MCW的叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著低于WCW(P<0.05)。将亲本CP,WBY,50株渐绿子代混池和50株绿叶子代混池分别提取DNA进行基因组重测序,测序深度分别为27.73×、31.32×、60.18×和57.06×,亲本测序结果的基因组覆盖度约为75%,混池的基因组覆盖度约为80%。BSA(bulk segregant analysis)分析显示与渐绿性状相关的区域位于6号染色体上,候选区域长度为1.45Mb。开发6个InDel标记将候选区域缩小到包含22个候选基因的0.2Mb范围内。对这22个候选基因进行表达模式的分析,挖掘到4个在子代之间表达差异显著的基因,分析4个基因的eDNA序列,未发现与性状关联的差异位点。将这4个基因进行烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,结果显示超表达Chl660基因的烟草叶片中叶绿素含量显著低于空载(P<0.05)。基因Chl660预测的功能为编码YLS9(Yellow-leaf specific gene)蛋白,亚细胞定位显示该基因位于叶绿体上,说明该基因很可能参与琯溪蜜柚叶片渐绿性状的形成。
[硕士论文] QAZI SHOAIB ALI
观赏园艺 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:蜡梅(Chimonanthus praecoxL.)是中国古老而特有的植物物种蜡梅科的成员。它花开冬季,是含有药用化合物的观赏花木。在长期的栽培过程中,不同蜡梅品种之间形态差异分化较大,如花色、花型、花香等方面。构建杂交群体有利于今后解析这些观赏性状的形成机制。
  本实验选取了蜡梅株系H29和H64互为父母本做杂交。以H29为母本,得到了72个后代。以H64为母本的杂交组合没有得到后代,说明蜡梅不同品种之间的结实率存在着显著差异。其后代的真实性尚未鉴定。筛选并利用SSR标记对72个后代进行真实性鉴定,发现引物Cp-33在亲本中产生的条带类型为aa×bb型,其真子代的条带类型为ab型,依据这一标准,发现在72个子代中仅有30个是真杂种,真杂种率仅为41.67%,其它可能都是自交种。这一结果与蜡梅的传粉方式有关。遗传群体构建中,子代鉴定非常重要,决定着基因定位的准确性和真实性,因此在蜡梅的遗传学分析中,子代鉴定应是必不可少的一个步骤。
  在多样性分析中,48对SSR引物中的10对引物(Cp-9,Cp-18,Cp-23,Cp-26,Cp-30,Cp-33,Cp-38,Cp-41和Cp-44)在父母本中发现多态性。用10个SSR标记筛选72个单株,发现只有5个标记(Cp-23,Cp-30,Cp-33,Cp-38和Cp-41)具有多态性。其中Cp-30的Nie遗传多样性值(He)和Shannon相似系数(Ⅰ)分别为0.739和1.363,高于其他4个SSR位点。假杂种的Nei值(0.222)低于真实杂种(0.263)。
[博士论文] 戴文珊
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:干旱与高盐严重影响柑橘类植物的生长、发育、产量和品质。利用具有抗逆功能的转录因子开展基因工程是创制抗逆种质的重要手段,也为柑橘类植物分子改良提供了新的思路。WRKY是植物特有的一类转录因子,在植物应答生物及非生物胁迫中起着十分重要的作用。虽然在不同植物中鉴定了一些WRKY转录因子,但大多数WRKY的功能及调控网络仍不清楚。在初步验证了金柑转录因子FcWRKY40抗氧化胁迫中发挥作用的基础上,本研究进一步解析FcWRKY40在非生物胁迫(盐及干旱)应答中的功能,并阐明其作用机制。研究主要结果如下:
  1.FcWRKY40抗盐功能鉴定。
  超表达FcWRKY40的烟草转基因系在盐胁迫下发芽率显著高于野生型,植株生长状态更好,相对电导率、MDA及ROS含量显著低于野生型,叶绿素含量及光合效率高于野生型。采用农杆菌介导的转化方法获得了超表达FcWRKY40的柠檬转基因植株。盐胁迫下,柠檬转基因系较野生型受害程度较轻,叶绿素含量更高,ROS累积更少。利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术获得了FcWRKY40金柑沉默材料。盐胁迫下,金柑沉默材料受害更严重,叶绿素含量更少,ROS累积显著高于野生型,表明FcWRKY40在植物盐胁迫抗性中起正调控作用。
  2.FcWRKY40调控SOS2及P5CS1同源基因从而正调控盐胁迫耐受性。
  分析柠檬转基因系中九个与盐胁迫相关的基因表达,发现SOS途径的三个基因SOS1、SOS2及SOS3与脯氨酸合成关键酶基因P5CS1表达量在转基因植株中升高。相反,这四个基因在VIGS系中表达下调。生理测定表明,柠檬转基因植株Na+含量降低,K+含量和脯氨酸增加,而VIGS植株则呈现相反的趋势。P5CS1合成抑制剂处理可以削弱转基因柠檬的抗盐能力,外源施加脯氨酸增强VIGS系的抗性。金柑FcSOS1、FcSOS2、FcSOS3和FcP5CS1启动子分别含有2个、1个、4个及2个W-box元件。酵母单杂交、EMSA及双荧光素酶活性分析证实FcWRKY40特异地结合FcSOS2及FcP5CS1启动子上的W-box元件并激活其表达。FcWRKY40可以被盐及ABA诱导表达,且盐诱导的表达依赖ABA。FcWRKY40启动子拥有ABF转录因子的结合元件ABRE,利用酵母单杂交、EMSA及双荧光素酶活性分析表明,FcWRKY40可以被FcABF2直接调控,是后者的靶基因。
  3.FcWRKY40抗旱胁迫功能鉴定。
  超表达FcWRKY40的烟草在脱水及干旱胁迫下均表现出更高的抗性,相对失水率、MDA、相对电导率与ROS累积显著低于野生型,叶绿素含量显著高于野生型。超表达FcWRKY40柠檬转基因系脱水处理后叶片萎蔫情况更轻,相对失水率、MDA与ROS含量均显著低于野生型。沉默FcWRKY40的金柑系在干旱胁迫下表现出更高的敏感性,相对电导率、MDA与ROS含量增加,叶绿素含量降低,表明FcWRKY40在植物干旱抗性中起正调控作用。
[博士论文] 耿晶晶
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子(TF)是植物最大的基因家族之一,广泛参与植物生长发育的多种生理过程,包括生物和非生物胁迫应答。目前,虽然在一些植物中已经鉴定出了bHLH基因并进行了研究,但主要集中在模式植物;大多数非模式植物,尤其是多年生果树bHLH转录因子所发挥的生理作用以及调控功能仍然不清楚。基于甜橙(Citrus sinensis)全基因组数据库信息,我们在全基因组水平上发掘甜橙bHLH家族基因,筛选低温响应的成员,并对受低温诱导最明显的一个成员CsbHLH18的功能与作用机制进行了研究。得到的主要结果如下:
  1、从甜橙中共鉴定出56个非冗余的bHLH家族候选基因,分别命名为CsbHLH1-CsbHLH56。除4个成员外,其他的Csb HLHs基因以不同密度不同数量分布于甜橙的9条染色体上。甜橙CsbHLHs分为19个亚家族,相同亚家族成员之间具有类似的基因结构和DNA结合特性。
  2、对CsbHLHs响应低温处理的表达模式进行分析,结果表明,大多数甜橙bHLH基因会响应冷胁迫,但呈现出不同的表达模式,所有低温响应成员中表达上调最强烈的是CsbHLH18。CsbHLH18全长783bp,编码260个氨基酸,相对分子质量和等电点分别为28.92kDa和7.09。CsbHLH18定位于细胞核,并具有转录激活活性且激活结构域位于N端。
  3、为验证CsbHLH18的抗寒功能,通过农杆菌介导获得了超表达CsbHLH18的烟草与柠檬转基因植株。低温胁迫下,烟草转基因植株生长状态比野生型好,有更高的存活率、光合能力及脯氨酸含量,但活性氧(ROS)含量及电导率降低。同样,柠檬转基因株系在低温处理后叶片萎蔫程度轻于野生型,电导率、MDA(丙二醛)及活性氧含量显著降低,但SOD、POD及CAT三种抗氧化酶活性及基因表达量明显增加。通过RNAi技术获得枳bHLH18被干涉的转基因系,发现干涉系比野生型对低温更敏感,低温处理后干涉系相关生理指标及基因表达的趋势与超表达系相反。
  4、SOD、POD及CAT三个基因启动子分别有3、8、4个潜在的E-box元件,酵母单杂交发现CsbHLH18只与POD基因启动子上的E-box元件结合,EMSA吸双荧光素酶活性检测表明CsbHLH18可以特异结合并激活CsPOD启动子。此外,CsbHLH18与CsICE1互作,后者能结合CsSOD及CsCAT基因启动子上的E-box元件。上述结果表明CsbHLH18通过直接或间接调控抗氧化酶基因的表达调节ROS稳态,最终在增强植物抗寒性方面发挥功能。
  5、对低温处理前后的柠檬野生型和超表达系进行RNA-Seq,结果发现低温处理后富集在植株激素信号传导途径的差异基因数量最多且富集程度最显著,同时在淀粉蔗糖合成途径也有一定数量差异基因的富集,说明C sbHLH18增强植物抗寒性的作用机制可能与这些途径相关,但具体的作用方式还需进一步的实验验证。
[博士论文] 谭丰全
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:多倍体化是一种普遍的自然现象,是植物进化的主要动力。绝大多数开花植物在进化历程中至少经历过一轮以上多倍体化事件。目前农业生产中很多农作物为多倍体,包括小麦、油菜、棉花、马铃薯、甘蔗等。果树类作物中多倍体也十分普遍,包括香蕉、草莓、猕猴桃、柿等。现存的二倍体包括拟南芥、玉米、水稻等,其实是经过二倍体化的古多倍体。多倍体化通常伴随着多种多样的性状变异,具有很好的农业利用价值,尤其是在提高生物量和环境适应性等方面。前人研究主要集中在多倍体化后植物形态生理变异和涉及的基因组、转录调控、表观修饰变异等相关机制解析。代谢物与植物生长、发育及环境适应性等密切相关。同时,植物很多代谢物如糖、有机酸、Vc、氨基酸、类胡萝卜素、类黄酮等,是人类生命活动必须的营养物质。然而,多倍体化对植物的代谢影响及其分子机制还很大程度上不清楚。本研究以我国常用柑橘砧木—资阳香橙、红橘、枳,短童期资源—早实枳,以及栽培品种‘鄂柑1号’椪柑为实验材料,在己发掘其双二倍体的基础上,比较了双二倍体(4x)与二倍体(2x)在形态和代谢水平上的差异,并从转录水平解析其变异机制。主要研究结果如下:
  1.基因组加倍提高资阳香橙(Citrus junos Sieb.ex Tanaka)叶片胁迫相关代谢物积累和胁迫相关基因表达,促进其耐胁迫能力。与2x亲本相比,资阳香橙4x具有典型的形态和解剖特征,如植株矮小,叶片大而厚,气孔变大,气孔密度变低。GC-MS分析表明,四倍体化对叶片初级代谢产物的积累有促进作用;许多与胁迫相关的代谢物如蔗糖、脯氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)在4x显著上调。LC-MS分析表明,四倍体化对次生代谢的积累有抑制作用;检测到的33种黄酮均在4x下调。RNA-seq分析表明,4x和2x叶片之间212个基因(检测到的基因的0.8%)显著差异表达。值得注意的是,这些基因与逆境响应高度相关,包括对盐胁迫、水和脱落酸的反应。此外,部分转录差异和代谢变化不吻合,可能由转录后调控引起。
  2.基因组加倍在红橘(Citrus reticulata Blanco)、枳(Poncirus trifoliata L.Raf.)和早实枳(P.trifoliata L.Raf.)叶片引起的代谢变异不是完全随机的,其促进TCA循环中间底物积累,抑制次生代谢物积累。红橘、枳和早实枳的4x具有典型的多倍体形态特征,表现为植株矮化、叶片增大增厚、气孔增大和气孔密度降低,表明基因组加倍在柑橘属和枳属中引起共同的形态变化。对3组4x和2x亲本进行非靶向代谢组学分析,结果表明:主成分分析将3组4x和2x的代谢组明显区分,意味着基因组加倍引起明显的代谢组成变异;3组4x和2x有11%-34%的总检测代谢物含量存在显著差异,绝大部分差异代谢物的差异倍数都小于5,表明基因组加倍对代谢的影响程度有限。初生代谢在基因组加倍后增强,尤其是TCA循环中间物,柠檬酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸的含量在所有4x都高于2x。因此,基因组加倍后的代谢变化并非完全随机,其中TCA循环在植物应对多倍体化过程中可能起着重要的作用。同时,次生代谢在基因组加倍后受到抑制,3组材料4x中,大部分苯丙烷类和萜类代谢物的含量普遍比2x低。此外,3组材料的C/N比在基因组加倍后都显著降低。以上结果表明:为应对基因组加倍初期引起的基因组胁迫,植物通过促进初生代谢为生长发育提供所需的碳源和能量,同时通过抑制次生代谢减缓碳源和能量消耗。
  3.基因组加倍通过抑制成熟后期柠檬酸的运输和降解利用,促进椪柑(Citrus reticulata Blanco)果实柠檬酸积累。椪柑4x的形态特征和2x亲本明显不同,4x具有更大的叶片、花器官、果实和种子。值得注意的是,4x果实中种子大幅减少。果实品质分析表明,4x果实可滴定酸、Vc和总酚含量连续3年比2x亲本显著提高。柠檬酸是椪柑果实的主要有机酸,其含量增高是4x果实有机酸显著提高的主要原因。4x果实的主要可溶性糖和氨基酸含量和2x亲本相比无明显差异,表明柠檬酸含量增高不影响4x果实中糖和氨基酸的积累。类胡萝卜素和类黄酮组成分析表明,4x果实的大部分类胡萝卜素和类黄酮含量相比2x亲本显著降低,表明基因组加倍对果实次生代谢物积累有抑制作用。基因表达分析显示,果实成熟过程中柠檬酸合成相关基因在同源4x和2x间无表达差异,表明4x果实积累更多柠檬酸,不是因为其柠檬酸合成能力高于2x。果实成熟后期(花后180d和210d),柠檬酸运输相关基因,包括液泡H+-ATPase(VHA)、液泡H+-PPase(VHP)和柠檬酸/H+协同转运体(CsCit1),在4x中显著下调表达,意味着其柠檬酸运输能力低于2x。同时,柠檬酸降解途径中的GABA支路相关基因,包括谷氨酸脱羧酶(GAD)、γ-氨基丁酸透性酶(GABP)和γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T),以及ACL支路相关基因柠檬酸裂解酶(ACL)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)也在4x显著下调表达,表明4x柠檬酸降解和利用效率在果实成熟后期低于2x。因此,在果实成熟后期,4x的柠檬酸运输能力低于2x,同时柠檬酸降解和利用效率也低于2x,导致4x果实积累更多柠檬酸。
  本研究从代谢角度阐释多倍体化对柑橘类植物的影响,丰富了植物多倍体化相关基础理论;本研究同时为植物多倍体育种,特别是柑橘砧木抗性和果实品质改良提供了新的基础理论支撑。
[博士论文] 徐君驰
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:中国甜柿自然脱涩性状受显性单基因控制,因而在完全甜柿遗传改良中具有重大的应用价值,但其自然脱涩关键基因及其调控网络尚不完全明确。已知中国甜柿自然脱涩过程与乙醛介导的“凝固效应”(即可溶性单宁向不溶性单宁的转化过程)有关,但乙醛代谢下游的关键基因ALDH2(醛脱氢酶2基因家族)在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中国甜柿(‘鄂柿1号’和‘罗田甜柿’),日本甜柿(‘阳丰’)和非完全甜柿(‘磨盘柿’)为试材,首先基于转录组数据库中ALDH2基因相关差异表达片段,从‘鄂柿1号’(Diospyros kaki Thunb.‘Eshi1’)中分离获得了ALDH2基因家族成员的cDNA全长,分析其表达模式并利用柿叶片瞬时表达技术体系对ALDH2基因进行功能验证;进而,应用酵母单杂交系统筛选与ALDH2基因互作的转录因子,进一步明确中国甜柿自然脱涩的分子调控网络;最后,结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系,分析ALDH2及部分单宁代谢关键基因在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的差异表达基因,进一步挖掘与中国甜柿自然脱涩直接相关的候选基因,以期为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供科学依据。
  主要研究结果如下:
  1.基于转录组数据库中的序列信息,通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术获得ALDH2基因家族两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b,其cDNA序列全长分别为1,984bp和1,933bp,分别编码542和540个氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中国甜柿叶片中瞬时超表达后,叶片可溶性单宁和不溶性单宁含量均显著升高;瞬时干涉表达后,叶片中可溶性单宁含量前者无明显变化,后者显著降低。二者均可通过减少可溶性单宁的消耗进而抑制脱涩。
  2.DkALDH2a主要作用于种子器官,其表达量在果实发育过程中逐渐降低,以致大量乙醛从种子扩散到果肉中,进而通过凝固效应促进脱涩。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表达,这可能是由于果肉中底物乙醛的积累所致,但其消耗的乙醛不足以阻止中国甜柿自然脱涩。因此,DkALDH2a和DkALDH2b的表达量与中国甜柿自然脱涩呈负相关关系。
  3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全长序列信息,通过染色体步移技术分别分离到515bp和1,209bp启动子序列。以DkALDH2b启动子构建pALDH2b-AbAi诱饵载体并转化Y1HGold酵母菌株,应用酵母单杂交技术从酵母文库中筛选到16个阳性克隆,经序列分析后新发现1个与ALDH2b互作的BBR/BPC1转录因子。
  4.结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系,筛选ALDH2及单宁代谢关键基因LAC1和ANR在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的特异表达基因,共得到119.63GbClean Data。通过Trinity软件从头拼接(de novo assembly),共得到192,597个转录本、100,371条Unigene。其中56,009条Unigene(约55.8%)获得了功能注释信息。注释为ERF家族的转录因子基因数目最高,且在三种处理中上调表达,说明其可能参与中国甜柿自然脱涩的调控过程。
  综上所述,本研究明确了ALDH2基因家族的两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b与中国甜柿自然脱涩之间的关系,并发现可能调控中国甜柿自然脱涩的两类转录因子BBR/BPC1和ERF。该结果为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供了参考。
[博士论文] 宋放
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柑橘根系根毛稀少,严重依赖与丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhzial Fungi,AMF)形成菌根来吸收土壤养分。除了AMF,根际其他微生物也能够促进植物生长,同时提高植物对病原菌入侵、干旱、寒冷和高盐和重金属等生物或非生物胁迫的抗性。因此,系统鉴定柑橘根系微生物尤其是AMF的群落结构,并探讨其功能和调控对柑橘生产具有重要的实践意义。本研究采用高通量测序技术鉴定了柑橘根系的AMF群落结构以及柑橘响应菌根共生的miRNA,并通过超表达或干涉技术对关键miRNA进行了功能验证,为深入研究菌根共生形成的分子机制提供了依据。利用微生物组和宏基因组技术对柑橘根系微生物群落的结构和功能及其受黄龙病侵染的影响进行了鉴定。本研究主要研究结果如下:
  1.柑橘根系AMF群落鉴定及其主要影响因素分析
  以来自8个柑橘产区的柑橘实生苗及不同嫁接组合为材料,通过对柑橘根系AMF的18S rRNA基因片段进行454焦磷酸测序,鉴定了柑橘AMF的遗传多样性,并且评估了生境、砧木和接穗基因型对AMF群落结构的影响。通过测序我们从77个柑橘根系样品中总共得到740000条有效序列,对应产生1028个AMF的OTU分子种。这些序列被进一步注释到75个AMF种中,其中66个都属于球囊霉属,说明球囊霉属真菌为柑橘AMF的优势菌属。主成分分析(PCA)表明:柑橘AMF群落结构受到生境和寄主基因型的显著影响,其中生境是最主要的影响因素。有意思的是,尽管AMF与砧木根系存在直接接触,但我们发现柑橘接穗基因型可能比砧木基因型对AMF群落结构的影响更大,意味着接穗可能通过代谢物运输或其他途径远距离调控菌根共生形成。
  2.柑橘响应菌根共生miRNA的鉴定及功能分析
  以常用柑橘砧木枳为材料,采用Small RNA测序鉴定了枳根系响应丛枝菌根共生的miRNA。结果共鉴定到148个己知miRNA和15个新miRNA,其中20个miRNA及miRNA*受到菌根诱导或抑制表达。这20个差异表达miRNA包括了两个已知共生相关的miRNA(miR171b和miR167h),以及可靶定丛枝菌根共生相关基因(如GRAS家族基因RAD1和RFCb)的miRNA,如miR473,miR1446b/c和miR477a/c。为验证这些miRNA的功能,我们选取miR477a构建了超表达及STTM载体并遗传转化枳获得了阳性植株,为下一步表型鉴定提供了材料。此外,我们找到了其在苜蓿中的同源miRNA(miR5037a/b/c),定量PCR发现miR5037a/b/c在苜蓿中同样受到菌根诱导表达。由于miR5037a/b/c有3个前体但只有1个成熟体,我们分别构建了3个超表达载体和1个STTM载体并转化苜蓿毛状根。表型检测发现miR5037的超表达植株的菌根侵染率与丛枝丰度均轻微上升但未达显著水平,而miR5037的STTM转基因株系的菌根侵染率与丛枝丰度均显著下降,说明miR5037a/b/c可能参与了丛枝菌根共生调控。
  3.柑橘根系微生物群落结构鉴定及其对黄龙病侵染的响应
  以赣州柑桔科学研究所同一果园健康和感染黄龙病的枳砧纽荷尔脐橙根系为材料,通过对细菌16S rRNA特异区段进行高通量测序,鉴定了柑橘根系内生及根际细菌群落结构,并分析了感染黄龙病对柑橘根系细菌群落的影响。我们从16个柑橘根系及根际样品中获得1010116条有效序列,总共鉴定到2464个细菌OTU。其中变形菌门细菌在柑橘根系内生及根际细菌群落均为优势菌种,占总OTU数的37.42%,占总序列数的58.25%,说明变形菌门细菌为柑橘根系微生物群落的优势菌。与健康树相比,感染黄龙病的树其根系的细菌总丰度和多样性无显著性差异,但部分细菌种类的相对丰度发生了显著变化从而影响细菌群落结构。其中与抗病相关的拟无枝酸菌属和与降解相关的鞘氨醇盒菌属在感染黄龙病的柑橘根系中的丰度均显著上升,暗示这两类菌参与了黄龙病胁迫响应过程。
  4.基于宏基因组学的柑橘根际微生物群落结构及功能鉴定
  本研究以赣州柑桔科学研究所同一果园健康和感染黄龙病的枳砧纽荷尔脐橙根际土壤为材料,采用宏基因组测序鉴定柑橘根际微生物群落结构及功能,同时检测黄龙病侵染对柑橘根际微生物功能的影响。我们对16个样本测序后总共获得102474个基因。通过基因注释,我们总共检测到43个门类,1167个属以及3571个种的微生物类群,说明柑橘根际微生物群落具有极高的多样性,并且宏基因组方法在属和种水平测序精度较高。柑橘根际宏基因组中细菌基因占总基因数的99.59%,其中变形菌门是基因数最多的菌种门。柑橘根际微生物群落的功能主要为氨基酸转运和代谢、能量产生与保存、水化合物运输与代谢、细胞壁/薄膜/膜生物合成、转录、信号转导机制等。受黄龙病侵染影响的柑橘根际微生物中超过74%的丰度差异基因均参与代谢相关通路,其中丰度最高的三个通路为代谢通路、不同环境中细菌代谢、次级代谢产物生物合成,说明黄龙病侵染对柑橘根际微生物的代谢功能具有重要影响。在黄龙病侵染的柑橘根际微生物群落中麦芽糖酶、β-葡糖苷酶、磷酸葡萄糖异构酶、烯醇酶和丙酮酸激酶这些降解糖分的关键酶的丰度均显著降低,而降解芳香烃类化合物的乙醛脱氢酶和4-草酰巴豆酸异构酶的丰度则显著升高。该结果表明,黄龙病侵染引起的柑橘韧皮部的筛管堵塞会减少柑橘根系分泌物,并导致柑橘根际微生物群落中以根系分泌的代谢物为主要碳源的细菌丰度的降低;另外根系因为缺乏碳水化合物而坏死,增加了土壤中难降解的木质素等芳香烃类化合物的含量,从而导致降解芳香类化合物的丛毛单胞菌属、雷氏菌属、鞘氨醇盒菌属和鞘氨醇杆菌属的丰度增加。因此我们推断黄龙病侵染能够通过改变柑橘根际分泌物以及根际的环境条件来改变其群落结构。
[硕士论文] 肖壮
农业电气化与自动化 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着我国经济的快速发展和人们消费水平的普遍提高,葡萄产业得到了很大的发展,葡萄已成为我国最受欢迎的水果之一。但是我国葡萄商品化处理程度低,一直制约着葡萄产业向规模化和产业化的方向转变。葡萄为穗状结构、果粒较多、果实柔软、易碰伤,故葡萄产后加工存在较大困难。目前,我国绝大多数地区仍采用人工分级方法,利用简陋的工具根据经验分级。人工分级效率低下、成本高、强度大,因此,市场迫切需要葡萄品质在线检测分级技术及装备。
  本文以葡萄的一个品种——红提为研究对象,运用机器视觉技术,建立了红提果粉附着率和红提果粒尺寸的在线分级模型,设计了一套红提在线检测与分级硬件与软件系统,具体研究内容如下:
  (1)搭建了红提图像采集试验平台。在一个试验用环形运输线上,搭建红提图像在线采集装置,设计了尺寸大小为600×450×450mm3的暗箱,暗箱顶端的切槽保证了夹持机构的持续运输,暗箱内的光电传感器感知红提串并触发相机,实现红提图像的连续采集;分析对比了多种不同光源的优缺点,选用了环形光源和前光源的照明方式;为能够同时提取红提形态轮廓和颜色特征,选用了能同时获取红提彩色图像和近红外图像的工业相机和镜头。
  (2)研究了红提果粉附着率等级的判别方法。在图像的预处理阶段,采用了归一化超绿法,去除了红提图像中的绿色果梗信息的干扰;采用交互式取点的方法,提取了果粉及果肉区域的颜色特征,分别采用朴素贝叶斯、BP神经网络和SVM支持向量机的方法建立了果粉的判别模型,通过比较发现,SVM支持向量机模型检测时间短,预测准确率高,应用于果粉的在线识别可行。通过对比人工的分级结果,红提果粉附着率的分级准确率为93%。
  (3)研究了红提果粒尺寸检测和分级方法。采用了基于形态学的开闭重构和局部极大值的方法,采集到近红外图像每粒果粒表面光斑位置,获取果粒中心位置坐标,完成果粒的粗定位。采用梯度分割算法,获取每粒果粒轮廓像素点,但一些轮廓重叠严重的像素点仍会干扰目标果粒的拟合,因此设计了一种随机最小二乘的椭圆拟合算法,提取目标果粒尺寸,并完成果粒的精确定位。经过与人工实测分级结果的验证,本研究设计的红提尺寸检测和分级准确率为91%,实现了整串红提果粒大小的自动分级。
  (4)针对红提果粉和尺寸的检测和分级模型,设计了基于机器视觉的在线控制系统和检测软件。在线控制系统主要包括了电机控制系统和图像采集控制系统,分别实现了环形运输生产线速度的实时控制和红提图片的在线采集。在线检测软件是利用VS软件中MFC控件设计的,其主要功能包括了上位机的协议设定、实时显示红提图像、监测串口通信状态和获取红提果粉和尺寸模型的分级结果等。
  (5)设计了一套红提在线检测分级流水线装备。流水线装备主要包括输送装置、图像采集装置、分级踢出装置和分拣装置。输送装置采取了环形悬挂输送链式的设计方法,保证了红提运输的稳定性,模拟了实际生产应用的场景;设计了具有棘齿自锁功能的夹持机构,方便了红提上下料过程,减少了人工工作量;设计有固定缺口形状的分级踢出装置实现了对红提自动连续的分选;设计由多个皮带滚筒组合成的分拣装置,实现了对应等级的红提分拣。
[硕士论文] 刘建雄
农业电气化与自动化 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柚子重量分级是柚子采后处理的重要环节,然而现有分级设备多为适用于工厂的大型通用果品重量分级装备,园地分拣仍以人力为主。因此,开发适用于中小农户的柚子称重分级设备对于提高生产效率具有重要意义。该文提出小型模块化柚子称重分选方案,设计了由上果机构、疏离机构、分选机构组成的分选线,编写了基于LABVIEW与MATLAB的数据采集与分析软件,设置6个柚子重量等级,设计了基于PLC的分选机构控制程序,以实现自动上果、自动单排化、电子称量与智能分选,理论分选速度为6000个/小时,用户可根据需要选择是否为称重分级核心模块搭配其他机构;此外,针对柚子单果重量大而导致的对称重传感器的冲击载荷和称重信号干扰,开展了信号分析区间均值重量预测的称重算法研究与基于BP神经网络的称重算法研究。主要研究结果如下:
  1.设计了小型模块化柚子重量分选机,分选机上果机构由具有挡板的带式输送机构成,上果机底部设置果箱收集倾倒的柚子,疏离机将柚子单排化后有序进入分选机构,分选机构对柚子进行电子称量,自动分级。
  2.搭建了分选系统控制电路和通讯电路。分选机硬件上使用单点式悬臂梁传感器产生重量信号,信号经电压变送器放大后送入数据采集卡,采集卡以串口通讯形式与PC连接,将采集电压信号以数字量形式传入PC,PC通过LABVIEW与MATLAB软件分析处理后得到重量,重量通过PC送入PLC内,PLC根据编好的分级程序对柚子进行等级判断,光电开关作为柚子到来触发装置,触发信号将传入PLC,当满足当前等级时PLC输出分选执行信号控制电磁铁动作,实现柚子分选。
  3.开发了分选系统电子称量软件,设计了基于LABVIEW与MATLAB的滤波算法与重量预测模型,设计了符合分级标准的分级程序和上位机界面等。
  4.动态称重装置固有频率测量,采用单位脉冲方式作用于称重装置,将输出信号进行傅里叶变换观察信号频率情况,测试显示称重装置有一个频率为39Hz的较强共振峰,此外频域图中还有一个较弱频率为54Hz的共振峰。称重装置空载试验,在三种速度下测试空载信号,结果表明不同速度下信号主频大小不同,在0.33m/s时主频为82Hz,在0.4m/s时为85Hz,在0.5m/s时为90Hz,且主频峰值随速度变大而变大。动态称重信号分析,使用5种数字滤波器对信号滤波,分析滤波后信号重量预测结果,结果表明,使用IIR滤波器、FIR滤波器与小波去噪均具有较好精度,其中使用IIR滤波器误差最小,而使用自适应滤波器误差最大。数字滤波算法执行时间分析,IIR程序运行时间为0.9ms,FIR程序运行时间为2.78ms,小波去噪程序运行时间为3.085ms,NLMS程序运行时间为12.4ms,RLS程序运行时间为39.6ms。基于BP神经网络进行重量预测,选择动态称重信号特征变量,建立神经网络模型,利用模型对数字IIR滤波后信号进行重量检测,试验中最大平均误差和最大误差均出现在速度为0.5m/s时,BP神经网络算法误差较均值法更小,且最大平均误差为2.17%,最大误差为4.56%,分选准确率为92.3%。
[硕士论文] 位高生
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:针对当前福建省平和县琯溪蜜柚施肥过量问题,以酸柚砧木白肉琯溪蜜柚为试验材料,以前期问卷调查结果为依据设置氮磷最高施肥量:N1.60kg/(株·年),P2O51.30kg/(株·年),结合平和当地土壤养分状况和琯溪蜜柚需肥特性,以30%梯度递减氮肥用量,设高氮(N1)、中氮(N2)和低氮(N3);以35%梯度递减磷肥用量,设高磷(P1)、中磷(P2)和低磷(P3),采用双因素交互设计以及田间试验方法,研究分析了氮磷减量施肥对琯溪蜜柚果实产量、品质以及树体和土壤养分的影响,为建立试验区琯溪蜜柚化肥减量与提质增效技术,推进当地琯溪蜜柚产业绿色高效发展提供依据和技术指导。获得的主要结果如下:
  (1)2016年,各氮磷减量施肥处理均比施肥量最高的N1P1处理有不同程度的增产,增产率在27.04%-58.93%之间。2017年,与N1P1处理相比,其他氮磷减量施肥处理的产量增减不一,其中N1P2、N1P3、N3P1和N3P3处理产量有所下降,以N1P2处理下降幅度最大,达20.11%;N2P1、N2P2、N2P3和N3P2处理产量有所上升,以N2P3处理上升幅度最大,达11.55%。在不同氮磷水平下,随着氮肥施用量的降低,产量均呈现先增加后降低的趋势,而随着磷肥施用量的降低,均以低磷水平(P3)下的产量最高。
  (2)综合2016年和2017年琯溪蜜柚内外果实品质结果可知,减少氮磷肥施用,可以提高果实出汁率、可食率、可溶性固形物、固酸比和维生素C含量,并降低纵横比、单果重、果皮厚和可滴定酸含量;与氮水平相比,磷水平对琯溪蜜柚各品质指标的影响相对较小;氮磷水平及交互作用对各品质指标的影响因时间不同而有所差异。总体而言,N2P2、N2P3和N3P1处理的果实品质相对较好,其中主成分分析的综合得分以N2P3处理最高,达1.65,其果实品质也相对较好。
  (3)果肉磷、钾、镁含量和果皮磷、钙、镁含量在不同氮水平之间无显著差异,果肉氮、磷、钾、钙、镁含量以及果皮氮、磷、钾含量在不同磷水平之间无显著差异。整体来说,氮磷减量施肥对琯溪蜜柚果肉和果皮氮、磷、钾、钙和镁含量的影响较小。此外,果皮钙、镁含量高于果肉,而果肉的磷含量高于果皮,果肉和果皮的氮、钾含量基本相当。
  (4)2016年和2017年两年5、7、9、11月琯溪蜜柚叶片氮、磷、钾、钙和镁含量结果表明,各处理叶片中氮、磷、钾和镁含量均在5月份相对较高,在7月份和9月份有所下降,在11月份相对稳定或略有上升;叶片钙含量随叶龄增加而增加。根据丰产琯溪蜜柚叶片矿质养分诊断标准,2016年和2017年各月份叶片氮、磷、钾和钙的含量均值基本均处在适宜范围,而镁含量均值相对较低。
  (5)2016年-2017年各处理表层土壤有机质、碱解氮和交换性钙、镁含量均高于亚表层土壤;各处理表层和亚表层土壤速效磷含量较高,且其磷环境均处于高风险等级,面临磷素面源污染的风险较大;各处理表层和亚表层土壤速效钾含量均处于丰富范围内,甚至有超标的风险,当地果农也应重视钾肥施用过量的问题;氮磷减量施肥以及于3月上中旬撒施钙镁混合物有助于缓解因过量施肥造成的土壤酸化并可有效补充土壤交换性钙镁含量。
  (6)综合考虑,建议对土壤磷处于高风险的果园,氮肥减量30%,磷肥减量70%,即氮肥(纯N)1.12kg/(株·年),磷肥(P2O5)0.39kg/(株·年);土壤磷环境风险相对较低的果园,氮肥减量30%,磷肥减量35%,即氮肥(纯N)1.12kg/(株·年),磷肥(P2O5)0.85kg/(株·年)。
[博士论文] 张斯淇
果树学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:柑橘是世界第一大果树,柑橘珠心胚特性是独特的无融合生殖现象。这一现象一方面导致柑橘常规育种难以产生真正杂种,因此育种进展缓慢。另一方面由于珠心苗的遗传组成与母本一致,可以在柑橘生产砧木育种中广泛利用,产生性状整齐一致的后代。柑橘珠心胚形成的机理研究一直受到广泛关注,前人对柑橘属和枳属的不同遗传群体进行了遗传定位,但尚未鉴定到控制珠心胚性状的候选基因。本研究利用特有的短童期材料山金柑(Fortunella hindsii),通过构建杂交分离群体,并结合柑橘属、枳属杂交群体分析,定位控制珠心胚性状的关键基因。利用特有的山金柑单胚和多胚材料,用转录组测序的方法对两者胚珠进行了差异基因挖掘,首次挖掘到柑橘珠心胚候选基因CitR WP,并对该基因进行初步分析验证,同时开发了有效的分子标记可以在柑橘属中区分单胚和多胚品种。主要研究结果如下:
  1、多个遗传群体锁定控制柑橘珠心胚性状的候选区域
  本研究利用短童期的山金柑种质资源,以来源于广东和福建的5个单胚山金柑为母本,以来源于江西的1个多胚山金柑为父本,创建了F1代分离群体,通过分子标记检测得到杂种共1321株,杂种率为95.24%。2015至2016年连续两年对5个山金柑杂交群体的胚性进行了分析,发现单胚和多胚的分离比均为1∶1。将30个单胚和30个多胚的子代DNA分别进行混池,利用BSA-seq法对混池进行测序,将金柑属珠心胚性状锁定到甜橙参考基因组4号染色体上特定位置。在山金柑分离群体中筛选到重组单株36个,利用重组单株将金柑属珠心胚性状进一步缩小到3.51MB-3.75MB区域内,该区域内共35个基因,其中17个基因与共分离标记连锁。
  连续5年对HB柚(Citrus grandis)×Fairchild橘(C.reticulata×Citrus grandis)的杂交F1分离群体已结果的后代进行表型分析,5年结果总计单胚后代66株,多胚后代58株,单胚和多胚的分离比例近似1∶1。利用BSA-seq法对20个单胚子代和20个多胚子代分别进行DNA混池分析,将控制珠心胚性状的基因定位于4号染色体2.5Mb至3.9Mb区间。利用分子标记对该位点在此群体中进行了验证,并将候选定位区域缩短到480Kb内,该区域内77个基因,同时也确认控制金柑属和柑橘属多胚性状基因处于同一个位点,并与前人报道的区域相符。
  连续3年对两个多胚材料红橘(C.reticulata)×枳壳(Poncirus trifoliata)杂交F1群体进行表型鉴定,共检测到39株为多胚,28株为单胚,分离比例趋近2∶1或1∶1。将前面柑橘属和金柑属群体定位到的候选位点在该杂交群体中做了遗传连锁验证,发现有子代中有59株的表现型与该位点的基因型连锁,但有8个多胚植株与该区段不连锁,并发现该区段内与性状连锁的标记均来源于红橘亲本,而枳壳亲本中杂合标记在该区域并没有连锁现象,推测枳壳中可能存在其他控制位点。
  2、RNA高通量测序挖掘山金柑珠心胚起始发育相关基因
  山金柑有无融合生殖和有性生殖两种类型,通过对无融合生殖起始发育时期进行细胞学观察,确定花前胚囊单核时期和花后双核胚囊时期为无融合生殖起始关键时期,对这两个时期的胚珠进行RNA高通量测序。通过denovo转录组分析,共获得66,699个unigenes和156040个转录本,其平均长度分别为1647bp和900bp。利用Nr,Nt和Swiss-Prot三个数据库对unigene进行同源序列比对,分别注释3,665(35.48%),15,959(23.92%),18,267(27.39%)个unigene。
  基因差异表达分析发现,珠心胚起始细胞开始出现的阶段中,与单胚胚珠相比多胚胚珠有316个基因上调表达,557个下调表达;珠心胚起始细胞大量出现的阶段中,多胚胚珠有532个基因上调表达,541个下调表达。通过分析候选区域内基因的表达差异发现CitRWP基因(comp57556_c0,Cs4905960)可能为珠心胚发育的关键基因。此外,KEGG相关途径分析显示激素信号路径有差异,差异基因中共检测到25个差异表达基因与生长素和细胞分裂素转导途径相关。从差异基因中随机挑选20个基因进行qPCR验证,结果表明RNA-seq数据可靠。
  3、柑橘无融合生殖候选基因CitRWP的功能分析和相关分子标记的开发应用
  克隆了HB柚、Fairchild橘、克里曼丁橘、山金柑等品种的CitR WP基因,发现品种间仅有极少SNP差异。实时定量PCR分析表明,CitRWP在晚白柚(C.grandis cv.Wanbai)、枸橼(C.medica)、克里曼丁橘(C.clementina)等单胚品种的胚珠中低表达,但在Flame葡萄柚(C.paradisi cv.Flame)、柠檬(C.limon)、椪柑(C.reticulata cv.Ponkan)、伏令夏橙(C.sinensis cv.Valencia)等多胚品种中则高表达;选取5个胚珠发育时期分析CitRWP表达水平,结果表明CitRWP随着胚珠发育表达水平逐渐降低,在多胚山金柑中的表达水平显著高于单胚。在HB×FC分离群体中,多胚胚珠中该基因的表达量是单胚中上百倍,并且多个时期结果一致。亚细胞定位表明该基因主要定位于在细胞核中,同时在细胞质中也有少量分布。进化分析表明CitRWP不属于拟南芥已报道的RKD家族,而与小立碗藓PpRWP3和PpRWP4以及地钱MpRWP1更为相近。
  多胚品种中CitRWP启动子区域存在一个特异插入的MITE转座子。利用该转座子开发出候选基因相关联的分子标记mite_p1,并在786份柑橘属种质资源中进行验证,证明该标记与多胚性状完全连锁。此外,构建了该基因超表达载体,在拟南芥中进行遗传转化验证。
[博士论文] 刘晓
果树学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:在柑橘生产中,缺硼、缺镁现象十分普遍,不过不同柑橘砧木对缺硼或缺镁的耐受力不同。前期研究表明枳橙[Citrus sinensis(L.)Osb.×Poncirus trifoliata(L.)Raf.]与枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]相比有着较强的耐缺硼及耐缺镁能力。但是,在柑橘硼营养研究方面,这两种耐缺硼能力不同的砧木对接穗在转录水平上的影响尚不清楚。此外,在柑橘镁营养研究中,前人对柑橘砧木耐缺镁能力的研究主要是在直接缺镁的条件下进行,而对不同砧木在离子拮抗造成的缺镁胁迫下的耐受力差异研究较少。同时,镁离子转运基因家族Magnesium Transporter(MGT)在柑橘中鲜有报道,该基因家族的表达差异是否是造成不同柑橘砧木镁效率差异的原因也未有研究。为此,本文主要研究如下:
  1.缺硼胁迫下两种柑橘砧穗组合叶片转录组分析
  为了研究缺硼胁迫下两种柑橘砧穗组合叶片在转录水平上的差异,以‘纽荷尔’脐橙为接穗,分别嫁接在枳和枳橙上,形成两种砧穗组合:纽荷尔/枳和纽荷尔/枳橙。两种砧穗组合在正常及缺硼条件下砂培处理180天后,采用RNA-Seq技术对叶片转录情况进行分析,同时测定叶片相关的生理指标。结果表明:(1)缺硼条件下,枳砧纽荷尔叶片中的硼含量、光合作用能力、叶绿素、类胡萝卜素的减少率以及可溶性糖和木质素含量的增加率均显著高于枳橙砧纽荷尔的叶片。(2)缺硼使纽荷尔/枳和纽荷尔/枳橙中分别有934和642条基因上调表达,198和282条基因下调表达。其中,有6条光合作用相关基因在纽荷尔/枳中显著下调表达,而在纽荷尔/枳橙中只是微弱下调;纽荷尔/枳和纽荷尔/枳橙中各有1条叶绿素分解相关的基因显著上调表达;2条类胡萝卜素合成相关的基因在纽荷尔/枳中显著下调表达,而在纽荷尔/枳橙中表达并没有显著变化;3条葡萄糖合成基因在纽荷尔/枳中显著上调表达,而在纽荷尔/枳橙中表达并没有显著变化;6条木质素合成基因在纽荷尔/枳中显著上调表达,而在纽荷尔/枳橙中只有3条显著上调表达。这些基因表达的变化趋势与对应生理指标变化一致,说明枳橙通过调节这些代谢途径使得其接穗在缺硼的条件下有着更好的表型。
  2.直接缺镁及拮抗性缺镁对两种柑橘砧穗组合的影响
  为了分析不同柑橘砧穗组合在直接缺镁及离子拮抗性缺镁条件下的差异,将上述两种柑橘砧穗组合进行直接缺镁及离子拮抗性缺镁(钾过量、低pH及铝毒害)条件下分别砂培处理120天,结果表明:(1)在直接缺镁及钾过量引起的缺镁条件下,纽荷尔/枳橙叶片中的镁含量显著高于纽荷尔/枳,而纽荷尔/枳橙根中的镁含量则显著低于纽荷尔/枳。这说明枳橙通过将更多的镁离子从根部转运到地上部位使得其比枳有更强的耐直接缺镁及钾拮抗引起的缺镁的能力。同时纽荷尔/枳橙叶片含有更高的叶绿素含量及更低的淀粉、可溶性糖和丙二醛的含量,进一步说明枳橙在直接缺镁和钾过量的情况下表现力优于枳。(2)在低pH和铝毒害引起的缺镁条件下,纽荷尔/枳整体上比纽荷尔/枳橙有着更高的镁含量,叶片生理指标变化也说明枳比枳橙对接穗有着更好的影响。以上结果不仅说明枳比枳橙有更强的耐低pH和铝毒害的能力,还说明枳在低pH和铝毒害引起的缺镁条件下对镁有着更强的吸收能力。
  3.柑橘中MGT基因家族表达分析及功能鉴定
  (1)柑橘中MGT基因家族的鉴定:通过搜索比对共得到8个柑橘PtrMGT基因(命名为PtrMGT1-PtrMGT8),分别位于5条染色体上,编码区大小在1182bp到1479bp之间,含有两个保守跨膜区域及一个GMN位点。等电点和相对分子量预测结果显示PtrMGT蛋白等电点范围为4.85-6.64,相对分子量为43.82-55.17kDa。亲缘关系分析显示PtrMGT基因家族成员可以分为五个亚家族。
  (2)柑橘中MGT基因家族的表达分析:组织表达分析发现PtrMGTs主要在营养器官(根,茎,叶)中表达。直接缺镁及钾过量条件下,枳橙根中有更多的MGT基因表达受到上调诱导表达;而在高pH及铝过量条件下枳根中MGT基因表达更剧烈,这可能是造成在不同缺镁条件下枳橙和枳中镁含量不同的原因之一。
  (3)PtrMGT5基因的功能鉴定:PtrMGT5定位于细胞膜上,超表达植株在多种缺镁胁迫下均比对照有着更好的表型及更高的镁含量,说明PtrMGT5在调控柑橘体内镁离子平衡中起到重要作用。PtrMGT5启动子分析表明其核心调控区域为起始密码子上游-1kb~-0.5kb范围,该区域存在两个WRKY及一个MYB调控位点,说明该基因表达可能受到这两类转录因子的调控。
[博士论文] 朱峰
果树学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:柑橘属于非跃变型果实,其成熟衰老机制及采后生物学特性有别于拟南芥等模式植物及水稻等大田作物,也不同于番茄和苹果等呼吸跃变型果实。目前对于柑橘果实成熟衰老的研究主要集中在对表型性状(果皮色泽、果肉糖酸及采后抗性能力等)的描述方面,对调控机制的认识还十分有限。本课题组前期已构建了柑橘果实采后衰老的分子调控网络,发现转录因子和激素子网络可能在柑橘果实成熟衰老中行使着重要功能,但还缺乏具体的实验数据支撑。因此,本研究依托普通瓯柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)、其成熟衰老延缓突变体青瓯柑及青瓯柑回复突变为普通瓯柑果实为材料,系统地研究了果实成熟衰老过程的转录调控机制。此外本实验室前期研究表明水杨酸(Salicylic acid,SA)和油菜素内酯相关基因在青瓯柑和普通瓯柑果实贮藏期及不同柑橘种类贮藏期差异表达基因中呈现明显的富集趋势。为了探究这两种激素对柑橘采后衰老的影响,本研究以成熟的温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)果实为材料,通过外源SA及油菜素内酯类似物24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide,EBR)处理,深入解析了它们对柑橘采后衰老的影响。主要研究结果如下:
  1.证明了青瓯柑是果实成熟衰老延缓突变体。对普通瓯柑、青瓯柑及回复突变材料果实成熟衰老相关表型分析发现,青瓯柑果实成熟衰老明显延缓,其有色层色泽转变、果肉含酸量下降等表型较普通瓯柑果实均显著延缓。对有色层叶绿素及类胡萝卜素定量后发现,青瓯柑中叶绿素及在叶绿体中积累的α、β-胡萝卜素及叶黄素下降速率显著减缓。作为有色层中β-胡萝卜素下游产物及成熟柑橘果实主要呈色色素,青瓯柑中β-隐黄质、玉米黄质及9-顺式紫黄质等色素含量显著低于普通瓯柑。普通瓯柑有色层中ABA含量随着果实成熟进程的推进而逐渐升高;青瓯柑有色层ABA含量并未伴随着成熟推进而升高,并且其浓度显著低于普通瓯柑有色层ABA浓度。青瓯柑与回复突变材料相关表型差异与青瓯柑和普通瓯柑果实类似。以上结果表明青瓯柑果实呈现出明显的成熟衰老延缓表型,并且其表型是由于α、β-胡萝卜素向下游转化延缓导致叶绿体转化及有色层呈色色素合成受阻,以及ABA合成延缓导致果实成熟衰老进程无法正常起始所致。
  2.转录因子CrMYB68和CrNAC036通过调控类胡萝卜素代谢及ABA合成,延缓了青瓯柑果实的成熟衰老。对青瓯柑和普通瓯柑果实发育期多个时间点类胡萝卜素及ABA代谢通路相关基因表达分析发现两者之间α、β-胡萝卜素转化及ABA合成延缓的差异是由于CrBCH2和CrNCED5在青瓯柑中持续下调表达所致。对前期转录组数据深入分析发现CrMYB68和CrNAC036两个转录因子的表达与CrBCH2和CrNCED5的表达呈显著负相关关系。这四个基因的表达差异在青瓯柑及其回复突变材料中得到进一步证实。通过选择性扩增结合位点分析(Selected amplification and binding,SAAB)实验证实CrMYB68蛋白能特异地结合到ACCTAC、ACCAAC和AACAAC序列上,而在CrBCH2和CrNCED5启动子中包含CrMYB68的潜在结合位点。本研究通过凝胶迁移实验(EMSA)证实CrMYB68能特异性结合到CrBCH2和CrNCED5启动子上;双荧光素酶实验表明CrMYB68能显著抑制CrBCH2和CrNCED5启动子活性。通过瞬时超量转化烟草(Nicotiana benthamiana)叶片及EMSA实验进一步证实CrMYB68同样能特异性结合到NbBCH2和NbNCED5启动子并抑制其基因的表达。对CrNAC036研究发现其能结合到CrNCED5启动子上并抑制其基因表达。而ABA所诱导的成熟衰老相关基因如参与类胡萝卜素合成的八氢番茄红素合成酶基因(CrPSY)、参与细胞壁降解的果胶裂解酶基因(CrPectate Lyase)和细胞壁伸展蛋白A1和A8基因(CrExpansinA1,A8)在青瓯柑中的表达量均低于普通瓯柑。以上结果表明青瓯柑果实成熟衰老延缓是由于CrMYB68及CrNAC036在青瓯柑中高表达所致:一方面高表达的CrMYB68通过抑制CrBCH2基因的表达而影响α、β-胡萝卜素转化从而影响有色层叶绿体转化及有色层呈色色素合成;另一方面高表达的CrMYB68及CrNAC036通过抑制CrNCED5基因的表达而延缓ABA合成从而导致依赖ABA的果实成熟衰老进程无法正常起始。以上结果表明ABA在正调控柑橘成熟衰老进程中行使着重要功能,而综合分析本课题前期预实验、课题组前期调控网络及前人研究进展发现SA和油菜素内酯可能在负调控柑橘成熟衰老调控中发挥着重要作用。
  3.外源SA和EBR处理柑橘果实,可显著改善其采后贮藏性能。为了验证外源SA和EBR处理对柑橘采后性能的影响,本研究选择了在我国栽培面积最大,成熟衰老快且不耐贮藏的温州蜜柑果实为材料,进行后续研究。选用2mmol L-1SA以及10μmol L-1EBR分别处理已达商业成熟度的国庆一号温州蜜柑果实,并模拟生产进行贮藏实验和生理生化分析。结果表明:SA处理果实在贮藏50d后腐烂率为对照果实的42.9%,并且显著延缓了果实贮藏期间硬度的下降。而对抗病相关代谢物含量分析发现,SA处理能显著诱导H2O2和多甲氧基黄酮的积累从而增强果实抗病能力。外源EBR处理后,贮藏50d时处理果实腐烂率仅为对照果实的21.4%,但EBR处理对果实内在品质并没有显著影响。我们还发现经EBR处理后,果实存在一个快速失水的过程,此表型与发汗处理类似。进一步的实验证明,EBR处理后果实中H2O2、丝氨酸、苏氨酸、鸟氨酸和脯氨酸等化合物的积累以及几丁质酶基因(chitinase)、苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanin ammonia lyase)的表达均被诱导。这些代谢物的积累及基因的表达进一步增强了果实的抗病能力。
[博士论文] 卢素文
果树学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:类胡萝卜素是一类对植物和人体健康非常重要的次生代谢物。尽管类胡萝卜素代谢研究已经取得了很大的进展,但是关于类胡萝卜素代谢调控的分子机理还不够清晰。柑橘果实含有丰富的类胡萝卜素,并且类胡萝卜素含量和组成决定了果实外观品质、营养价值和经济效益。因此,研究柑橘类胡萝卜素代谢具有重要的理论和实践意义。番茄红素β-环化酶(LCYb)是位于类胡萝卜素合成途径分支点的关键酶。大量研究表明,LCYb基因表达水平与类胡萝卜素含量和组成密切相关。但是,关于LCYb基因表达的转录调控机制还未知,在柑橘乃至整个植物界中还没有转录因子被证明能直接调控其表达。因此,本研究以柑橘LCYb基因为切入点,深入分析该基因表达模式、序列多态性以及酶活性特点;并克隆和鉴定该基因启动子序列、表达活性及其关键顺式作用元件;进一步利用酵母单杂交系统,筛选可能与LCYb启动子互作的转录因子;采用遗传学、分子生物学和生物化学等方法,验证候选转录因子参与类胡萝卜素代谢的转录调控功能。主要研究结果如下:
  1.LCYb基因功能分析。大多数柑橘品种含有2种类型的LCYb基因,并且每种类型又含有2个不同的等位基因(LCYb1a、LCYb1b、LCYb2a和LCYb2b)。本研究首先对暗柳和红暗柳甜橙(Citrus sinensis)中2个LCYb基因的表达进行分析,发现CsLCYb1基因具有组成型表达模式,而CsLCYb2基因具有组织特异性表达模式:有色体特异性CsLCYb2基因的表达量降低可能与红暗柳甜橙中番茄红素的大量积累有关。对不同柑橘品种LCYb2基因进行序列多态性和聚类分析,发现LCYb2基因序列的等位多态性与不同柑橘品种的进化关系密切相关。利用工程菌实验,对所获得的LCYb2等位基因分别进行功能分析,发现除了CsLCYb2b基因没有活性外,其他的等位基因均具有番茄红素β-环化酶活性,即能将红色番茄红素转变成橙色β-胡萝卜素。对甜橙2个LCYb2等位基因进行点突变分析,发现72位和359位氨基酸是影响酶活性的关键位点。
  2.LCYb启动子克隆和活性分析。从甜橙中克隆了CsLCYb1启动子序列,对其进行生物信息学分析和活性鉴定。将CsLCYb1启动子全长和一系列的5'端缺失片段融合到GUS报告基因上游,并转入不同植物(番茄、拟南芥和柑橘愈伤)中检测启动子活性。结果表明,从翻译起始位点开始至其上游1584bp片段具有最强启动子活性,746bp片段具有最基本的启动子活性。此外,CsLCYb1启动子活性在转基因拟南芥中受组织特异性和发育时期的调控,在转基因柑橘愈伤组织中受激素等各种外源因子处理的影响。进一步精细缺失分析,发现在启动子区域-574bp到-513bp之间存在1个增强子元件的串联重复,该串联重复数对CsLCYb1启动子活性非常重要。对不同柑橘品种LCYb1启动子序列进行分析,发现此增强子元件的拷贝数不同,从而开发出1个简单序列重复的分子标记,可用于区分不同的柑橘品种。
  对甜橙中2个CsLCYb2等位基因的启动子序列进行克隆和生物信息学分析,发现这2条启动子序列含有一些相同的和不同的顺式作用元件。采用番茄果实瞬时表达的方法对启动子活性进行鉴定,发现这2条启动子在有色体含量比较丰富的果实中都具有活性。
  3.LCYb启动子互作因子的筛选。以LCYb启动子及其关键顺式作用元件的序列为诱饵,利用酵母单杂交系统,筛选甜橙果实cDNA文库,初步获得一些能与LCYb启动子互作的调控因子。
  4.候选转录因子CsMADS6、CsMADS5和CsGARP4的功能鉴定。根据酵母单杂交系统筛库结果,结合前人文献报道,本研究选取了3个可能参与类胡萝卜素代谢的转录因子做进一步的功能分析。
  CsMADS6属于MADS转录因子家族AGAMOUS-like亚家族,其表达与果实发育和着色高度一致。作为一个核定位的转录激活因子,CsMADS6能直接结合并激活LCYb1启动子。在柑橘愈伤组织中超表达CsMADS6基因,增加了类胡萝卜素含量,诱导了LCYb1和其他类胡萝卜素基因包括PSY、PDS和CCD1的表达。进一步分析表明,CsMADS6直接与PSY、PDS和CCD1启动子结合,从而上调这些基因表达。这一结果说明,CsMADS6能多靶点调控类胡萝卜素代谢。此外,在番茄中异位表达CsMADS6基因,增加了果实中类胡萝卜素含量,促进了类胡萝卜素合成基因表达。CsMADS6超表达系萼片中类胡萝卜素组成和含量发生剧烈变化,并伴有质体超微结构的改变。对转基因萼片进行RNA-seq分析,结果显示CsMADS6调控了一系列生物途径,从而引导代谢流特异进入类胡萝卜素代谢通路。
  CsMADS5属于MADS转录因子家族SQUAMOSA亚家族,与拟南芥、番茄FUL蛋白同源性较高。基因和蛋白表达分析表明,CsMADS5表达水平与果实发育和色泽形成呈正相关。CsMADS5蛋白定位于细胞核中,并具有转录激活活性。生化实验证实,CsMADS5能直接与LCYb1启动子结合并激活它的活性。在柑橘愈伤中超表达CsMADS5,发现α-胡萝卜素含量显著增加;LCYb1及其他类胡萝卜素合成关键基因,包括PSY、PDS和CCD1表达也都显著上调。进一步分析表明,CsMADS5能直接结合并激活PSY、PDS和CCD1启动子。此外,在番茄中异位表达CsMADS5,导致果实中类胡萝卜素含量显著增加,类胡萝卜素相关基因表达也发生明显变化。蛋白互作分析表明,CsMADS5和CsMADS6在细胞核中能相互作用。
  CsGARP4属于GARP转录因子家族,该蛋白含有1个Myb_DNA-binding和1个Myb_CC_LHEQLE保守结构域。基因表达分析表明,CsGARP4在所有组织中均能表达,在叶片中表达量最高;在果实中,随着果实发育其表达量逐渐增加。作为一个核定位的转录激活因子,CsGARP4能直接结合并激活LCYb1启动子活性。在番茄中异位表达CsGARP4基因,发现转基因植株呈现缺磷表型。基因表达分析结果显示,转基因植株中CsGARP4超量表达而内源同源基因的表达不受影响。生理生化分析发现,番茄CsGARP4超表达系叶片中,类胡萝卜素含量及相关基因表达显著降低;花青素含量增加、叶绿素含量减少,伴随着相关基因表达也显著增加;总磷含量没有明显变化,但是磷饥饿诱导响应相关基因的表达受到显著影响。
  本研究探索和验证了3个转录因子参与LCYb基因表达和类胡萝卜素代谢转录调控的功能。CsMADS6和CsMADS5均通过直接调控LCYb1及其他类胡萝卜素关键基因,从而协同正调控类胡萝卜素代谢;并且CsMADS6还具有更广泛的调控作用,能重排转录网络,引导代谢流特异进入类胡萝卜素代谢通路。CsGARP4可能通过直接调控LCYb1基因,来调控独脚金内酯(一种类胡萝卜素衍生物)的含量,进而影响植物对磷胁迫的响应。
[博士论文] 陈嘉景
果树学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:柑橘风味中的苦味作为其重要的品质性状而备受关注。类黄酮中的新橘皮糖苷类(Neohesperidoside;NEO)是影响柑橘果实前苦味(‘primary'bitterness)的主要物质,且其在柑橘果实中的代谢差异一直是近些年的研究热点。柑橘种属关系复杂、突变材料和种质资源多样,丰富的次生代谢差异性使其成为研究类黄酮的理想材料。因此,从生理和分子水平上对柑橘进行种质资源评价以及苦味形成机理进行探讨具有特殊优势且对产业发展意义重大。本研究首先对种植广泛但不积累NEO的甜橙果实组织进行类黄酮的定性和定量分析,初步研究甜橙中类黄酮的组成以及随果实发育的含量变化;其次,克隆不同柑橘种质中调控NEO合成的J,2RhaT(1,2-rhamnosyltransferase gene),分析该基因序列的多态性与不同种质中苦味品质产生的相关性,并利用自然群体和杂交群体提供更多遗传学依据;最后,探索柚中与NEO代谢有直接竞争关系的代谢支路,利用基因转化BY2烟草悬浮细胞系对1,2RhaT-like蛋白dGlcT进行功能表征分析,且通过转录组以及基因表达定量分析数据阐明dGlcT和1,2RhaT在柑橘类黄酮代谢中的竞争作用。主要研究结果如下:
  1.以两个红肉甜橙(‘红肉’和‘红暗柳’)和两个普通果肉甜橙(‘清家’和‘暗柳’)不同发育期果实四个组织(黄皮层、白皮层、囊衣和汁胞)为材料,通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)法结合添加内标实验,初步鉴定了甜橙果实各组织中黄烷酮糖苷和聚甲氧基黄酮的组成,并利用液相色谱(HPLC)法进行定量分析。结果显示,甜橙各组织中所检测的四种黄烷酮糖苷类均属于芸香糖苷类(Rutinoside;RUT),与NEO的前体物质相同,但并不具有苦味,表明甜橙在NEO代谢上并没有遗传柚的性状;对甜橙中Csl,2RhaT-like基因进行克隆分析,发现一条与Cml,2RhaT(GenBank accession:AY048882)核苷酸序列同源性为92%的候选基因,但其编码区出现两处单碱基缺失,此基因的移码突变可能是导致甜橙中类黄酮NEO无法合成的直接原因。
  2.对柑橘各种属不同栽培种中1,2RhaT基因及其高度同源序列进行克隆,并结合柑橘基因组数据库进行比对分析,发现柑橘基因组中拥有两类与Cml,2RhaT高度同源且被注释作为1,2RhaT-like的基因。一类具有丰富的序列多态性(命名为dGlcT-1),其编码的氨基酸序列与Cm1,2RhaT同源性高达88%,且仅在个别柚种质中能扩增到完整的编码区序列;另一类则包括两个基因(命名为dGlcT-2和dGlcT-3),其编码的氨基酸序列与Cm1,2RhaT同源性均为67%,且以串联复制的方式广泛分布在各柑橘种质的基因组中。
  3.对分属柑橘属、枳属和金柑属的50个柑橘栽培种进行1,2RhaT及1,2RhaT-like(dGlcT-1,dGlcT-2和dGlcT-3)基因型与柚皮苷积累表现型的关联分析,发现仅J,2RhaT与枳属和柑橘属果实中柚皮苷的积累直接相关。此外,通过红橘×枳壳以及HB柚×Fairchild杂交群体分析表明,含完整1,2RhaT序列的杂交子代(对比Cm1,2RhaT,AY048882;NCBI)果实能正常合成柚皮苷,相反则不能,进一步证明1,2RhaT对柑橘属和枳属中柚皮苷的合成具有重要作用。值得关注的是,尽管具有完整的1,2RhaT序列,但金柑属各种质中依然无法积累柚皮苷或者黄烷酮糖苷类,且将凤凰柚中的Cm1,2RhaT转化山金柑后依然无法检测到柚皮苷的产生,预示着金柑属中橘皮糖苷类的代谢缺失并非由1,2RhaT所致。
  4。研究结果同时表明,1,2RhaT-like基因与柑橘中NEO的产生并无直接关联性。因此,通过基因转化烟草BY2悬浮细胞体系对CmdGlcT-1,CsdGlcT-2以及Cm1,2RhaT进行了功能验证及功能差异分析。结果显示,dGlcT-1和dGlcT-2是一个底物广泛的类黄酮-7-O-二-葡萄糖苷转移酶,最优底物是黄烷酮-7-O-葡萄糖苷;dGlcT不具有1,2RhaT功能且无法催化NEO的形成,但是其催化产物与类黄酮NEO可共用黄烷酮/黄酮-7-O-葡萄糖苷作为直接前体,两者间可能存在直接的底物竞争关系。但是,虽然有功能,dGlcT的代谢产物在果实整个发育期内含量均极低,转录组和基因表达定量分析结果表明在果实发育初期,NEO或者RUT对底物的强烈竞争导致其代谢受阻;随着果实的成熟,流向类黄酮代谢底物的供应不足可能是类黄酮-7-O-二-葡萄糖苷乃至整个类黄酮糖苷类代谢受阻的主要原因。
  通过对柑橘NEO特别是柚皮苷代谢积累机理的研究,为揭示柑橘前苦味形成机制奠定了理论基础。而dGlcT的发现,对间接改变柚果实中NEO的积累进而改善果实苦味有着重大意义。
[硕士论文] 赵宪坤
果树学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:梨是蔷薇科植物,具有典型的配子体型自交不亲和性,是亚洲及我国的重要主栽树种之一,具有良好的经济价值。“金坠梨”是自交不亲和品种“鸭梨”的芽变品种,表现为自交亲和性。本研究通过对金坠梨和鸭梨花粉管的蛋白质进行蛋白组测序,研究花粉在体外萌发条件下差异蛋白质的表达,进而找出导致金坠梨自交亲和的差异蛋白质,以便进一步研究梨属自交不亲和的机理。主要研究结果如下:
  1、体外培养鸭梨和金坠梨的花粉1h后,在培养基内加入鸭梨的S-RNase和金坠梨的S-RNase,发现均对鸭梨花粉的生长有抑制作用,但是都对金坠梨花粉的生长没有明显抑制作用。本实验以不加入任何S-RNase的处理作为对照,对照鸭梨和金坠梨花粉均生长正常。
  2、通过iTRAQ技术对体外培养4h的鸭梨和金坠梨花粉进行蛋白质组测序。通过二维液相色谱串联质谱鉴定出了306812个二级质谱,39301个谱图匹配到已知谱图,其中38842个谱图匹配到唯一谱图,共获得肽段20909个,唯一肽段15788个,共鉴定出3878个蛋白质。本研究共筛选得到差异蛋白173个,其中上调差异蛋白93个,下调蛋白差异80个。
  3、泛素化途径是降解非自我S-RNase的主要作用路线,通过对差异蛋白的分析发现,UBP14、UPL1、UBP12等几个泛素相关酶均在金坠梨中低表达,这个结果表明,在金坠梨中,泛素化途径受阻,影响S-RNase酶的活性,可能导致了自交亲和。PME7、PME13、LTP3和MALD3等多个和细胞转运功能相关的基因在金坠梨中丰度较高,表明金坠梨的花粉的细胞转运功能要比鸭梨要强。通过分析在差异蛋白中找到了几个与花粉和花粉管生长密切相关的蛋白质,还发现了一个非常重要的F-box蛋白,F-box kelch-repeat protein At3g06240,此蛋白可能直接参与自交不亲和作用,但功能尚需进一步验证。
[硕士论文] 沈超
林木遗传育种 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:薄壳山核桃(Carya illinoensis K.Koch),是世界上著名的高效生态经济型干果树种,能提供品质优良的干果、良好的木材等产品。然而,林农在经济利益的驱使下盲目施肥,特别是氮肥和钾肥,导致很多薄壳山核桃林地出现施肥过量现象,不仅降低了肥料的利用效率,而且造成资源的浪费和环境的污染。为寻找适宜薄壳山核桃生长的N、K营养元素浓度,本试验以两年生的薄壳山核桃实生苗‘Pawnee’为材料,从生长、酶活和光合特性等方面,研究不同氮钾营养水平、不同钾营养水平(K0、K0.5、K1、K2、K5)对两年生薄壳山核桃幼苗生长和生理特性的影响,探讨薄壳山核桃幼苗对不同氮钾浓度处理的生理响应差异,主要研究结果如下:
  1.不同钾浓度对薄壳山核桃幼苗生理生化特性的影响
  1)随着钾浓度的提高,新根长、新根数、生物增长量、新梢长和地径五个生长指标、根茎叶中的氮钾含量、叶片碳水化合物(可溶性糖、蔗糖、葡萄糖和总淀粉)含量、叶片色素含量、可溶性蛋白含量、POD和CAT活性均呈现先增后减的趋势,均于K2(2 mM)处理时达到最大值;叶片中钙镁含量、SOD活性、MDA含量呈逐渐下降趋势,于K0(0 mM)处理时达到最大值;对根茎中锰、锌含量的影响不大。
  2)Pn、Gs、Tr均在K2(2mM)处理40天时达到最大值,较缺钾K0(0 mM)时分别上升了122.27%、61.35%和120.48%。缺钾和高钾K5(5mM)处理下,薄壳山核桃幼苗的NPQ都有不同幅度的升高,相应光系统(PSⅡ)的电子传递效率(ΦPSⅡ)下降,这主要是由于PSⅡ的激发能捕获效率(F'v/F'm)降低所致。
  3)薄壳山核桃幼苗的潜在CO2同化速率(Wc)、潜在CO2同化速率(Wj)、表观羧化效率(CE)在缺钾(0 mM)和低钾(0.5 mM、1 mM)处理下均出现不同幅度的下降。低钾和高钾(5 mM)浓度处理均降低了薄壳山核桃幼苗的Vcmax、Jmax、TPU、LSP、LCP、AQE,而缺钾则显著降低了这六个指标。钾浓度越低,对薄壳山核桃幼苗Amax的抑制越强,在处理0-40d,钾浓度越低,薄壳山核桃幼苗的Rd越大,表明低钾胁迫增加了薄壳山核桃幼苗对光合产物的消耗。
  2.氮钾对薄壳山核桃幼苗生长和生理特性的影响
  缺钾K1(0mM)处理下,薄壳山核桃幼苗生物增长量和新根长随着供氮水平的提高而显著提高。K2处理下,叶N含量显著高于K1处理,根N含量变化并不大。随着氮浓度的增加,叶片Pn升高,当氮浓度达到1.5 mM后再增加氮浓度Pn反而降低。缺钾和低氮(K2N1、K2N2)处理下F'v/F'm、ΦPSⅡ和qP均显著降低,说明光能捕获效率下降,光合电子传递受到抑制,影响了植株对碳的固定和同化。
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