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[硕士论文] 阎珍珍
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:H2S作为第三种气体信号分子的假说由来已久,H2S的生理作用表现为两重性,一方面,H2S能抑制细胞色素氧化酶的活性[1],影响电子传递链上的电子传递,抑制生物呼吸;另一方面,适量的H2S又对生物体的心血管系统、中枢神经系统及炎症反应的调节等方面有重要功能[2]。现有研究表明,H2S的信号作用与靶向蛋白的硫巯基化(-SSH)修饰有关。但是这一修饰仍然存在争议,也有研究者认为H2S是通过硫烷(S0,sulfane sulfur)对蛋白进行了-SSH的修饰。
  H2S作用的两重性还表现在其与活性氧自由基(ROS)的关系上。有研究表明,H2S的积累可以使生物体内ROS提高;但也有文章证明,敲除大肠杆菌中主要的负责产生H2S的基因3-巯基丙酮酸转移酶(sseA),会导致大肠杆菌对抗生素(通过氧化压力升高造成细菌死亡的抗生素类型)的抗性降低。可见,H2S与生物体内的ROS息息相关,
  本论文以大肠杆菌为载体,构建了一系列不同H2S产量的菌株,在此基础上对H2S与氧化应激之间的关系作了相应的研究。通过survival test、抑菌圈的测定等实验,证实H2S在改变菌体内的氧化还原状态及应对外界氧化压力方面都有相应功能。选取了大肠杆菌主要应激系统—ArcAB系统、SoxRS调控系统及OxyR调节子进行研究,结果表明,多硫化物(polysulfides)可以使OxyR的活性状态发生改变,进而影响菌体内若干基因的表达。
  本论文首次提出OxyR除了受H2O2诱导外,还受到polysulfides的调控。论文选取已有文献报道的受OxyR调控的四个基因katG、dps、grxA、trxC进行实验,用PCR的方法扩增这些基因的启动子区,构建含有egfp/mkate荧光基因的报告质粒,利用诱导物诱导大肠杆菌本底水平或经质粒过量表达的OxyR,通过荧光值的改变来判定OxyR的状态变化。氧化态和还原态的OxyR虽然都能与DNA结合但只有氧化态OxyR才能激活下游基因的表达。利用H2O2和polysulfides作为诱导物进行比较分析,我们得出,在对OxyR的诱导方面,polysulfides所起作用与H2O2相似,不同在于,较低浓度的polysulfides就可以使OxyR产生构象的改变,并且敲除oxyR基因,polysulfides对菌体生长的抑制作用比H2O2更强烈。这说明,OxyR对polysulfides更为敏感。
  通过对其反应机理的分析,我们发现通过polysulfides处理的OxyR更易以四聚体的形式与DNA结合,说明polysulfides对OxyR活性的调节可能是通过改变蛋白的聚合状态来实现的。本论文还对OxyR蛋白受诱导后的结构改变做了分析,通过DTT、H2O2、polysulfides分别对纯蛋白进行了处理,并进行了MALDI-TOF分析。结果表明,H2O2和polysulfides对蛋白的修饰是两种不同的形式。并且无论何种处理,OxyR活性状态时两个活性位点的半胱氨酸之间都没有二硫键的生成。除此之外,我们对OxyR氧化过后还原型状态的恢复做了相应研究,据已有文献报道grxA、trxC基因对OxyR的还原起到重要作用。但是我们对这两个基因进行敲除发现OxyR的活性没有发生明显改变。
  本论文首次提出polysulfides对OxyR具有诱导作用,为OxyR的研究开辟了新的方向,同时,我们也证明不同的信号分子对OxyR的修饰形式不同,不同的修饰形式对OxyR功能的影响不同,打破了传统意义上OxyR只通过二硫键的形成进行活性转变的说法。
[硕士论文] 李玲
生物医学工程 东南大学 2016(学位年度)
摘要:产电微生物具有胞外电子转移(Extracellular Electron Transfer,EET)能力,可以通过EET机制将电子传递给人工电极构成微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell,MFC)。MFC在提供可再生能源、处理废水、净化环境等诸多方面具有重要的应用前景。然而目前MFC的产电效率很低,还没有大规模应用于实际中。理解产电微生物EET机制是提高MFC产电效率的一个关键环节,大量研究表明生物网络可以高效预测生物学路径,因此可用于研究EET相关的电子传递通路。本文的目的就是通过产电微生物蛋白质相互作用网络分析来研究产电微生物的EET机制,识别可能与EET功能相关的蛋白,并构建各种可能的EET通路,为通过基因工程技术改造微生物、提高微生物产电效率提供科学依据。
  本文选取重要的产电模式菌Shewanella oneidensis MR-1作为研究对象,构建了其电子传递相关蛋白的相互作用网络,对网络拓扑特性和重要功能模块进行了分析,并重构了EET通路,为在分子水平认识产电微生物的EET机制提供基础。主要研究结果如下:
  (1)构建了全基因组规模的电子传递相关蛋白相互作用网络。借助相关数据库,整合基因组注释信息、蛋白质相互作用信息和相关文献信息,最终构建了S.oneidensisMR-1全基因组规模的电子传递相关蛋白相互作用网络,包括682个蛋白质,5854个相互作用对;
  (2)通过网络结构分析发现关键EET蛋白。分析了网络的拓扑特性,发现网络具有无标度特征和小世界效应。另外通过中心性方法识别网络中关键蛋白,发现其中大部分负责生产电子,少数为EET通路蛋白。通过k-shell方法分析网络,发现S.oneidensisMR-1电子传递网络有不同的功能区,通过网络内的合作实现EET。
  (3)预测并重构了EET通路。将网络划分为小的功能模块,其中一个模块包含两条经典的EET通路分支,结合亚细胞定位、蛋白质折叠结构、基因表达数据等信息重点分析该模块蛋白,预测了3条可能的EET通路,并结合已知通路重构了EET通路。
  论文利用生物信息学方法系统研究产电微生物S.oneidensis MR-1,从基因序列、基因表达、蛋白质结构和蛋白质相互作用网络等各个层面,全面分析产电微生物,认识EET机制,研究结果可能为阐明微生物产电机制提供一定信息。
[硕士论文] 吴雅茜
生物物理学 华中科技大学 2016(学位年度)
摘要:水是地球上广泛存在的物质,是生物体重要的组成成分,也是所有生命体赖以生存的重要条件。生物体具备感知内外界环境中水含量及其变化的能力即水感受,感觉信号在神经系统中进行分析与整合,使机体做出相应的生理与行为反应,以适应环境变化,维持生理活动的动态稳定及生存。
  在生物体对水感受的研究中,秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)可以作为一个理想的模式生物。不论在野生还是人工培养环境中,线虫都生存在含有水膜的介质表面上,线虫需要借助水的张力在介质表面移动,水膜太厚会给线虫运动带来很大的阻碍,而水膜太薄会让线虫失水而亡,所以介质表层的水含量对于线虫至关重要。线虫能够感受多种刺激,具备完善的感觉器官和神经系统,这让线虫在面临水刺激时能够做出相应的反应。然而,目前线虫水感受的分子机制和神经回路还未研究清楚。
  本研究在我们发展的楔形圆柱体琼脂模型和琼脂糖四相板模型的基础上进行优化,设计了6%-2%琼脂糖二相扩散模型和钠离子均等四相模型,从而排除了钠盐离子及其他水溶性离子的干扰,只引入水含量这一个变量。通过优化模型我们验证了野生型线虫的避水行为,对 GPCR– G蛋白– DAF-11– cGMP– TAX-2/TAX-4信号通路的关键基因进行逐一验证,并证实这一通路作用于带纤毛的感觉神经元中。
  在找寻参与线虫水感受神经元的过程中,采用空气和水交替刺激模式对感觉神经元进行钙成像。发现在tax-4(ks28)突变型的背景下,用特异性启动子在神经元ASER中回复tax-4基因,能够恢复ASER神经元对水刺激的钙信号,这说明ASER参与水感受。然而daf-11基因并不在ASER中表达,于是对其他在ASER神经元中表达的受体型鸟苷酸环化酶进行基因筛选,综合钙成像结果发现gcy-22基因参与水感受。在gcy-22(tm2364)突变型背景下,用特异性启动子在ASER神经元中回复gcy-22基因能够恢复钙信号,这证明了GCY-22作用于ASER神经元来介导避水行为。本实验对线虫水感受基因及神经通路进行了初步研究,为探索完整的神经回路提供了基础。
[硕士论文] 高磊鑫
生物物理学 华中科技大学 2016(学位年度)
摘要:肠道微生物,例如大肠杆菌,可以强酸性条件下存活数小时。在不同的生长条件、生长阶段、酸性环境中,大肠杆菌会诱导出不同的耐酸系统。正是凭借精细的耐酸系统,大肠杆菌可以顺利通过胃部的强酸性环境到达肠道,引起某些疾病的发生。因此更加全面深入地去研究耐酸系统,对于肠道疾病的预防和临床治疗是非常重要的。
  我们在前期的研究中发现,大肠杆菌nudB基因敲除可以导致耐酸相关基因表达量的下调。以此为基础,我们探究nudB基因敲除对大肠杆菌耐酸表型的影响。
  我们的研究结果显示:1)在生长过程中有高浓度的氯霉素(50μg/mL)存在时,携带 pCA24N载体的野生型大肠杆菌在酸性条件下的存活能力会比不含有氯霉素时,发生轻微下降。2)一方面当携带有pCA24N载体的ΔnudB基因敲除菌株在生长过程中有高浓度的氯霉素(50μg/mL)存在时,在酸性条件下的存活能力跟相同条件下生长的携带有pCA24N载体的野生型菌株相比发生显著下降;另一方面当携带有pCA24N载体的ΔnudBΔfolX双基因敲除菌株在生长过程中有高浓度的氯霉素(50μg/mL)存在时,在酸性条件下的存活能力跟相同条件下生长的携带有pCA24N载体的野生型菌株基本相同。培养过程中高浓度的氯霉素(50μg/mL)和nudB基因的敲除是携带pCA24N载体的大肠杆菌耐酸能力显著下降所必须具备的两个条件,缺一不可。3)由于在携带有pCA24N载体的ΔnudB基因敲除菌株中超量表达gadX基因能够将其在酸性条件下的存活能力恢复到相同条件下生长的野生型水平,因此推测生长过程中高浓度的氯霉素和四氢单喋呤的堆积共同干扰了RpoS激活gadX基因表达的过程。对于具体的机理,我们需要进一步地研究探索。
  我们实验室前期的研究发现,在大肠杆菌中,nudB基因的敲除会导致其对甲氧苄啶和新诺明的超敏感。因此我们想知道在沙门氏杆菌中,nudB基因的敲除是不是也会影响沙门氏杆菌对两种药物的敏感性?我们构建了沙门氏杆菌nudB基因敲除菌株,并且测定敲除菌株对叶酸拮抗剂类抗菌药物的敏感性。本研究结果显示,在沙门氏杆菌中,nudB基因的敲除会导致其对甲氧苄啶和复方新诺明的敏感性发生轻微下降。nudB基因敲除菌株对于新诺明的敏感性跟野生型一致,没有发生下降。该结果跟nudB基因大肠杆菌敲除菌株对甲氧苄啶和新诺明的超敏感相比,存在很大差异,因此我们怀疑在沙门氏杆菌中除了NudB以外,可能还存在其他的具有二氢新喋呤三磷酸焦磷酸水解酶活性的同源蛋白。
[硕士论文] 张永柱
生物学 河南科技大学 2016(学位年度)
摘要:随着现代微生物技术的快速发展,尤其是基因工程技术和微生物高密度培养技术的紧密结合,使得一些人类需要而又无法大量获得的目的产物能进行大规模的工业化生产。目前,大肠杆菌作为宿主细胞由于其易培养、遗传背景清楚等优点,已在重组蛋白生产中得到了广泛的应用。但随着大肠杆菌培养技术的不断发展,传统的高密度培养方法要想进一步提高菌体发酵的最终浓度变得越来越难,成本也越来越高,所以一部分工作者正在尝试一些新的方法。近几年来研究发现,光、磁场、声波等物理因素在一定条件下也能促进微生物的生长和代谢。研究表明,声波作为一种周期性震荡的机械波,在通过溶液的过程中,不仅能加强培养体系的传质过程,还能对细胞的表面形成一种周期性的“挤压”,增加细胞膜的流动性,加速胞内流体的运动,促进细胞生长代谢,加速产物的积累。但目前声效应产生的具体机制尚不清楚,所以开展声刺激对大肠杆菌高密度培养影响的研究,揭示其生物学效应产生的可能途径及分子机理,对声效应的合理开发和利用具有积极的指导作用,同时还可为建立基于声效应的促生长、促代谢、促合成的新型生物技术等奠定坚实基础。
  本研究主要内容包括:⑴在液体培养条件下,研究了不同声学参数及相关剂量对大肠杆菌群体密度的影响。结果表明,固定声强级为80dB,固定声功率级为55dB时,声频率在250Hz-16KHz之间,能明显促进菌体的生长,并且这种促进效应呈现出明显非线性的频率依赖性关系;当声频率为2KHz和8KHz时,处理组生物量比对照组分别提高了21.0%和27.1%,最大比生长速率分别提高了25.0%和25.5%,菌体处于对数期的时间分别延长了8.3%和16.7%。固定频率为8KHz,固定声功率级为55dB时,促生长效应为单峰性曲线,在声强级为80dB处促生长效应达到最大。固定频率为8KHz,固定声强级为80dB时,在55dB-63dB声功率级之间,声效应同样呈现出单峰性曲线,在声功率级为61dB处时,处理组生物量是对照组的1.7倍,最大比生长速率是对照组的2.5倍,菌体处于对数期的时间是对照组的1.3倍。同时,还观察了声刺激下大肠杆菌菌体形态的变化,结果表明声刺激使处理组的菌体平均长度明显增加,当声强级为100dB时,菌体平均长度增加了27.3%,但菌体平均宽度没有发现明显变化。⑵细胞分裂与胞内生物大分子的合成,以及与细胞吸收营养物质的能力之间存在密切的联系。本文研究了在最佳声效应窗口下,声刺激对大肠杆菌胞内大分子合成以及底物消耗速率的影响。研究发现声刺激可以明显促进胞内蛋白质和 RNA合成,尤其是在声暴露6h时,RNA量和蛋白量达到最高,分别是对照组的1.1倍和1.3倍;同时,利用以葡萄糖或麦芽糖为主要碳源的基本培养基培养菌体,发现处理组在对数期对葡萄糖或麦芽糖的最大消耗速率分别是对照组的1.2倍和1.1倍,底物消耗速率明显加快。⑶群体感应是细菌依赖于细胞密度、调节群体适应能力的一种普遍机制。大肠杆菌群体感应系统是由 AI-2介导的,有研究表明 pfs和 luxS两个基因可能在 AI-2合成过程中起着重要的作用。本研究发现,声刺激可能明显抑制了luxS和 pfs基因的表达,使 AI-2在溶液中的最大积累量降低了10.6%,并使得大肠杆菌达到密度阈值的时间延长了1.0倍,从而显著提高了菌体生物量。⑷转录组学分析结果表明,声刺激对大肠杆菌基因调控的影响是一个复杂的过程,有200余个基因参与其中。声刺激信号的跨膜及胞内传达过程,可能通过一系列磷酸化和去磷酸化来实现,尤其是一些与膜结构、功能和应急响应相关的基因在声刺激下响应尤为明显,如basSR系统、yehZYXW系统等。分析发现声刺激明显促进了膜上ABC转运体的合成以及ATP酶的合成,提高了细胞吸收底物的能力;同时,声刺激还加强了大肠杆菌的有氧呼吸能力,使细胞能够产生更多的能量参与菌体的生长和繁殖。
[硕士论文] 王影
生物物理学 大连海洋大学 2015(学位年度)
摘要:随着抗生素和化学农药的弊端和副作用的逐渐暴露,益生菌因具有无毒、无污染等特性在各个领域的应用越来越受关注,然而,在电磁领域对益生菌的影响的研究相对甚少。
  本文主要研究益生芽孢杆菌电磁场生物效应,其中电场强度选择0V/cm、0.5V/cm、1.0V/cm、1.5V/cm、2.0V/cm、2.5V/cm、3.0V/cm七个梯度,磁场强度选择0mT、5mT、10mT、15mT、20mT、25mT、30mT七个梯度,芽孢杆菌在电磁场的每个梯度下分别处理20min、40min、60min,研究不同时间不同电磁场强度刺激后芽孢杆菌的生长、菌液pH、芽孢杆菌通透性、芽孢杆菌形态、营养成分含量及净化养殖水质的能力的变化。
  结论如下:
  (1)从整体来看,电磁场刺激40min时,电磁场对芽孢杆菌的生长代谢促进作用最大,其中,电场强度为2.0V/cm,磁场强度为15mT时,对芽孢杆菌的生长促进作用最显著。因此,控制外加电磁场刺激芽孢杆菌,在适宜的场强和刺激时间下,可以促进芽孢杆菌菌体增殖。在刺激时间为60min时,电场和磁场对芽孢杆菌的生长代谢、营养成分合成和净水能力均有抑制作用,其中,电场强度为1.0V/cm,磁场强度为25mT时,对芽孢杆菌的抑制作用最显著。因此说明,外加电磁场对芽孢杆菌的作用时间过长,对芽孢杆菌的生长有明显的抑制作用。
  (2)适宜的电磁场在适宜时间下对芽孢杆菌菌液pH也有一定的影响,刺激40min时,在电场强度为2.0V/cm,磁场强度为15mT时,与对照组相比,pH值均减小,由此推断可能是芽孢杆菌代谢产酸大于代谢产生的碱性物质对菌液的作用导致 pH的变化。因此,适宜刺激时间和电磁场强度下,电磁场在一定程度的提高了芽孢杆菌的代谢水平。
  (3)由芽孢杆菌的形态与菌液上清液中蛋白质和核酸含量的变化,我们可以推断,外加适宜强度的电磁场在一定范围内在不损害菌体的情况下可以增强芽孢杆菌通透性。
  (4)适宜电磁场强度,适宜的刺激时间也可以提高芽孢杆菌胞内蛋白质和维生素B6的含量。其中刺激时间为40min时,电场强度为2.0V/cm,磁场强度为15mT时,芽孢杆菌总蛋白和维生素B6的含量最高。
  (5)电磁场刺激芽孢杆菌能够提高芽孢杆菌对养殖污水的净化能力,其中在电磁场刺激40min时,电场强度为2.0V/cm,磁场强度为15mT时,芽孢杆菌对水中氨态氮和亚硝酸盐氮的去除能力最强。
  综合以上几点,我们发现对芽孢杆菌生长代谢、营养成分含量、芽孢杆菌通透性及净化水质能力影响最有利的电磁场强度分别为2.0V/cm和15mT,最佳刺激时间为40min。
[博士论文] 陈三友
生物物理学 华中科技大学 2014(学位年度)
摘要:细胞中胞吞和分泌途径协调作用维持一种动态平衡以调节细胞膜的物质组分。这种动态平衡对于细胞维持内环境稳态,快速反应以应对细胞外环境和细胞内代谢的变化具有很重要的意义。在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的研究阐明了膜结构转运在生理和发育中的许多功能,并且在分子水平上解释了介导货物分选,囊泡出芽,膜结构的分裂和融合的很多基本机制。在本文中,我们用线虫的肠道作为研究模型,研究了从基底面向顶面的极性运输,顶面胞吞后循环转运和基底面胞吞后循环转运过程。我们鉴定了一些调节这些膜结构转运的重要蛋白。
  在顶面侧,我们观察到了RAB-11标记的顶面循环内涵体结构(Apical recycling endosomes,AREs)从基底面向顶面的极性运输过程。八亚基蛋白复合物exocyst是AREs向顶面细胞膜栓系所必需的。Exocyst亚基SEC-15在从基底面向顶面的转运过程中被RAB-11动态募集。
  不同于在顶面侧介导向细胞膜的栓系,exocyst在基底侧作用于内涵体小管之间的栓系/融合。在过去的十几年时间里,网格蛋白非依赖型内吞途径(clathrin-independent endocytic pathways,CIE)不断吸引大家的兴趣,越来越多通过CIE途径进入细胞的内源细胞膜(PM)蛋白被鉴定出来。尽管有越来越多的调节蛋白被鉴定出来参与CIE途径,但我们对这些蛋白的具体功能和相互作用关联的了解依然有限。在本文中,我们观测到一种独特的相互关联的具有动态特征的内涵体管状结构(endosomal tubules),这些结构对于包括hTAC,GLUT1和DAF-4等在内的一些CIE途径货物分子在肠细胞基底侧循环转运过程是必需的。SEC-10是八亚基蛋白复合物exocyst的一个亚基。SEC-10和其它一些exocyst亚基的功能缺失会破坏这种内涵体小管,使它们变成不同大小的圈状结构。
  进一步研究表明,这些内涵体小管对Rab GTP酶RAB-10的失活敏感。RAB-10在新生小管的出芽、生长延伸直到与临近小管最终融合的过程中始终处在小管的顶端。并且,常激活型RAB-10突变(GTP-locked Q68L突变体)产生了更多的管状结构,显示出在小管顶端更强的点状分布。显性负相常失活型RAB-10突变体(GDP-locked T23N突变体)在细胞质中弥散分布,且导致分布有hTAC-GFP的大空泡的产生。在rab-10突变虫系或RAB-10(T23N)转基因虫系中很难观察到hTAC小管,说明了RAB-10GTP酶是从基底侧早期内涵体(BEE)出来的内涵体小管的出芽和生成所必需的。在sec-10突变虫系中,我们观察到内涵体小管延伸事件明显减少。虽然仍有RAB-10处在新生小管的顶端,但我们发现sec-10突变虫系中剩余的这些管状延伸事件的栓系/融合成功率下降了大约5倍。
  另外,我们还发现微管骨架是hTAC小管稳定和RAB-10结构动力学所必需的,这说明了微管骨架在基底侧内涵体小管的形成中的重要性。
  总之,我们阐述了Rab GTP酶RAB-10,exocyst亚基SEC-10和微管骨架通过协同作用,参与形成一种内涵体管状网络结构。我们认为RAB-10引导小管的生长,而SEC-10负责小管间的栓系/融合。我们的研究结果为CIE途径的调节过程提供了新的见解。
  除了肠细胞,在线虫中进行膜结构转运研究的其它系统还有卵母细胞和早期胚胎。在sec-10突变虫系中,卵黄蛋白受体RME-2的胞吞后循环转运过程受阻,从而影响了卵母细胞对由肠细胞分泌的卵母蛋白YP170A的吸收。另外,我们发现SEC-10或exocyst复合物是受精后CAV-1小泡/皮质颗粒分泌所必需的,同时也是早期胚胎形成渗透性和通透性屏障所必需的。
[硕士论文] 谭红梅
生物物理学 浙江大学 2014(学位年度)
摘要:耐辐射球菌是一种极端细菌,它能够耐受致死剂量的电离辐射。耐辐射球菌具有高效的DNA修复能力、快速DNA损伤响应能力以及多种抗氧化机制,这些特性对耐辐射球菌的极端抗性做出了巨大的贡献,但是其具体的抗逆性机制目前仍尚不清楚。
  蛋白质乙酰化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰类型。随着蛋白质组学技术的发展,我们发现蛋白乙酰化现象广泛存在于生物体中。先进的蛋白质组学研究极大地扩展了我们在蛋白赖氨酸乙酰化修饰方面的知识。已知,赖氨酸蛋白质乙酰化在细胞生命活动中起着重要作用,比如细胞调控和代谢等。但迄今为止,很少有研究关注于各种胁迫下(如电离辐射),蛋白质组乙酰化修饰的变化。
  本文围绕耐辐射球菌辐照后蛋白质组乙酰化修饰的变化进行研究。我们通过Western blotting技术发现耐辐射奇球菌的蛋白质组乙酰化修饰在辐照后修复(PIR)期间发生了显著变化。为了进一步研究辐照后乙酰化修饰发生的改变,我们利用赖氨酸抗体富集辐照和未辐照耐辐射球菌中的乙酰化多肽,LC/MS/MS分析鉴定乙酰化蛋白和修饰位点。结果,我们在未辐照DR菌中鉴定出了21个乙酰化蛋白和31个修饰位点,辐照的DR菌中鉴定出了14个乙酰化蛋白和19个修饰位点。这些乙酰化蛋白似乎在不同的途径中起作用,包括转录,翻译,应激反应和代谢。且有趣的是,鉴定出来的未辐照和辐照DR菌的乙酰化蛋白大部分都是不相同的。本文的研究数据表明了,耐辐射球菌辐照后会发生乙酰化和去乙酰化事件,且乙酰化和去乙酰化可能在辐照后修复过程中起作用。
[博士论文] 李铭峰
生物物理学 浙江大学 2013(学位年度)
摘要:DNA分子存在于生物所生存的大部分环境中,这些DNA分子可以被降解做为营养物质为生物生长所利用,也可以做为片段进入细胞内通过改变基因组信息推动物种进化。胞外核酸酶对于调节胞外DNA分子起到重要的作用。耐辐射球菌Deinococcus radiodurans对于电离辐射、紫外、过氧化氢、干燥和其他一些化学诱变剂具有很强的抗性,是研究DNA损伤修复的一种理想模式生物。研究发现D.radiodurans在γ电离辐射后会释放出体内受损伤的DNA片段(~1 kb),这些片段会被胞外核酸酶DRB0067蛋白迅速降解掉,以避免被重新吸收利用后影响基因组的稳定性。本文重点围绕胞外DNA分子和其被降解的产物dNMPs对D.radiodurans生长和抗性影响方面开展研究,阐释了胞外核酸酶DRB0067蛋白一些新的功能和生物学意义。主要实验结果如下:
   1.高浓度的胞外DNA片段可以抑制耐辐射球菌属D.radiodurans和D.radiopugnans的生长,对其他五种生物如E.coli等生长的影响则比较小;等质量浓度的dNMPs对D.radiodurans和E.coli的生长基本上也没有影响,这说明体外高浓度DNA分子的存在对D.radiodurans和D.radiopugnans的生长是一种威胁,需要被尽快降解掉。
   2.胞外dGMP可以提高D.radiodurans抗氧化的能力,比如H2O2和γ电离辐射,对E.coil则没有这一效果;而等质量浓度的胞外DNA片段对D.radiodurans和E.coli的抗性都没有影响。进一步的研究发现胞外dGMP可以提高D.radiodurans中过氧化氢酶基因katA(dr1998)的转录水平和对应的蛋白活性,此外还可以调控其他一些重要基因的转录水平。
   3.胞外核酸酶DRB0067蛋白做为D.radiodurans所分泌的唯一核酸酶,具有核酸内切酶和3`→5`核酸外切酶活性,可以切割质粒、ssDNA和dsDNA等。研究发现该蛋白是通过Sec途经分泌到细胞外的,其分泌受γ电离辐射的影响,这说明了DRB0067蛋白在D.radiodurans电离辐射抗性方面起着一定作用。
   4.我们成功构建了drb0067基因突变株△drb0067,并发现相比较于D.radiodurans野生型,△drb0067在生长方面对胞外DNA分子更加敏感,其质粒转化率也有所提高;此外,△drb0067对H2O2和γ电离辐射变得比较敏感。胞外dGMP和Oligo(dG)50对突变株△drb0067的H2O2抗性实验表明D.radiodurans可以利用DRB0067蛋白降解产物中的dGMP来提高自身的抗氧化能力。
   综上所述,胞外核酸酶DRB0067蛋白对于D.radiodurans是非常重要的,既可以避免胞外DNA分子对自身细胞生长的抑制,又可以将DNA分子降解成小分子做为营养物质重新吸收利用,同时避免受损伤的DNA片段重新吸收进入细胞内影响基因组的稳定性,最后还可以利用降解产物中的dGMP来增强细胞自身对氧化损伤因子的抗性。
[博士论文] 汪虎
生物物理学 浙江大学 2012(学位年度)
摘要:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,简称DR)是一种能够忍受强烈电离辐射、强氧化压力、干旱等极端环境的微生物,它能够在10 kGy以上的辐射条件下生存。但其强大的抗辐射抗氧化性机制还有待阐明。
   EbfC家族是一类有DNA结合能力的核蛋白因子。本文系统地研究了EbfC家族同源基因在DR菌中的作用,结果如下:
   1.通过蛋白质氨基酸的同源性分析,我们预测DR0199基因是一个在耐辐射球菌中编码EbfC同源物的基因。
   2.首次运用同源重组的方法构建了突变株△DR0119。根据UV,电离辐射和H2O2氧化压力下突变株生存率结果表明,DR0119是一个对耐辐射球菌保持极端抗性的重要基因。
   3.应用大肠杆菌表达系统表达了DRO119蛋白,纯化并检测了该蛋白的各种生化活性。应用体内定位方法,进一步证明了耐辐射球菌的EbfC是一个类核蛋白。
   4.探索了△DRO199全基因组转录水平。在DRO199敲除以后,全基因组转录谱中约有7%的基因表达水平发生了2倍以上的改变,如核酸合成途径,抗氧化相关基因和细胞分裂相关基因。
   另外,首次在D.geothermalis中应用SDS-PAGE和shotgun质谱联用的方法鉴定了野生株中的膜蛋白。该部分工作有助于后期研究该菌的耐热耐辐射机制。
   综上,耐辐射球菌中的EbfC基因行使着多项重要的功能,它能够维持耐辐射球菌基因组的稳定性,调控体内基因的表达,是贡献于耐辐射球菌超强修复能力的重要基因。
[博士论文] 赵烨
生物物理学 浙江大学 2012(学位年度)
摘要:由于太阳光的持续照射,生物体中的DNA很容易被紫外交联而形成嘧啶二聚体(CPDs)。这种嘧啶二聚体对于大多数DNA聚合酶的复制过程来说是一个拦路石,但人类DNA聚合酶η却能够特异性的复制通过该类型的损伤位点。人类DNA聚合酶η属于Y家族DNA聚合酶,该基因的缺陷或者突变将会产生一种被称为着色型干皮症变异型的疾病(XPV)。XPV患者对于紫外照射异常敏感且较常人来说极易获得皮肤癌。在迄今为止发现的总共15种人类DNA聚合酶中,只有该基因的缺失直接与癌症相关联。与其他Y家族DNA聚合酶例如Rev1,聚合酶ι以及κ等相比,人类DNA聚合酶η对于CPD交联的DNA具有极强的结合及跨损伤合成能力,其效率甚至要高于非损伤DNA。
   从结构上来看,顺铂交联的DNA产物Pt-GG与CPD具有一定的相似性,都是通过交联相邻的两个碱基而形成二聚体。在已知许多的DNA聚合酶中,人类DNA聚合酶η被认为是跨Pt-GG损伤合成效率最高的一种DNA聚合酶。其在体内表达量的提高将会使细胞对于顺铂类药物产生很强的抗药性,因此也被认为是拮抗剂的一种。同时,该DNA聚合酶也被认为直接参与了B细胞中体细胞超突变过程,其在WA位点上具有极高的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸错误插入能力。为了更好的了解该聚合酶参与这三项重要的生理活动的分子机制,我们利用分子生物学,生物化学以及结构生物学方法成功解析了人类DNA聚合酶η-DNA-dNTP三元复合物的分子结构。结合酶动力学实验,具体阐述了该聚合酶的工作机制,为抗癌药物的研发提供了新的思路,同时也对其如何直接起始D-loop的复制提供了一种可能的解释。具体结果如下:
   1.成功的表达,纯化,共结晶了DNA聚合酶η-DNA-dNTP的三元复合物。
   2.晶体衍射至1.7(A)并使用分子置换法及MAD成功的进行了结构解析。
   3.分子结构显示人类DNA聚合酶η以“分子夹板”的形式稳定损伤DNA,从而使其保持垂直的B型DNA构象。其具有一个较大的能够完美容纳CPD分子的活性中心,为聚合酶双金属催化化学反应提供了完美的几何学支持。两个保守的残基Q38以及R61能够稳定CPD分子,同时帮助催化聚合酶反应。从结构上解释了该蛋白8个突变位点造成XPV疾病的分子机制。
   4.晶体结构及生化实验解释了人类DNA聚合酶η对于Pt-GG合成后延伸具有非常低的效率的原因,这也意味着另外一个DNA聚合酶将会接手并完成最终的跨损伤合成过程。新发现的抑制剂结合疏水口袋给抗癌药物的研发提供了新的思路。
   5.对于体细胞超突变来说,酶动力学实验表明WA基序确实是一个突变热点且具有与遗传学实验一致的序列偏好性。人类DNA聚合酶η能够通过氢键网络在活性中心稳定T-G的碱基错误配对。
[博士论文] 沈绍传
生物物理学 浙江大学 2011(学位年度)
摘要:耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是地球上最耐辐射的生物之一,对各种极端压力具有超强的抗性,成为研究极端环境生物适应机理的模式生物之一。D.radiodurans所具有的超强抗氧化特性对其极端抗性起重要作用,而抗氧化相关酶及其催化合成的产物在保健食品、医药等人类健康相关领域具有广阔的应用前景。本实验室之前开展的研究证明D.radiodurans体内合成的类胡萝卜素Deinoxanthin具有超强的抗氧化能力,并且已经鉴定了该类胡萝卜素合成途径的多个关键基因(酶)。已有文献根据同源序列分析,推断D.radiodurans体内存在编码催化合成类胡萝卜素关键前体的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)的可能同源基因CrtE,但相关的实验研究工作包括功能鉴定和酶的分离等一直没有展开。
   本论文通过生物信息学分析和分子生物学手段鉴定D.radiodurans体内CrtE基因编码GGPPS。通过序列分析,D.radiodurans体内可能存在2个编码GGPPS相关的基因dr1395和dr0932;从进化亲缘关系上看,dr1395与已经鉴定的T.thermophilus的GGPPS基因P74906_THETH更接近。进一步通过构建突变株、补偿突变株、表达质粒以及与pRK-BI共转化大肠杆菌的类胡萝卜素产物HPLC分析等过程和方法,鉴定了D.radiodurans CrtE基因具有编码GGPPS的功能。进一步,利用新型金属螯合晶胶层析技术,从带His-tag的CrtE表达菌株破胞液中直接分离获得高纯度的GGPPS。一步分离所得的GGPPS纯度达91.4%。对所用的金属螯合晶胶,即Cu2+-IDA-晶胶,在用于分离GGPPS之前进行了结合实验和毛细管模型的性能表征,模型分析结果与实验数据吻合良好,说明该模型适用于相关材料的性能表征。
   类胡萝卜素和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是D.radiodurans体内的2种主要抗氧化物质。由于它们具有广阔的市场应用前景,本论文还就如何高效低成本获得这些产物的进行了研究。对于类胡萝卜素,主要考察了光照和金属离子这2类因素对其诱导合成的影响。发现较低剂量的光照可以有效诱导类胡萝卜素的高效合成,在光强度100-150μmol·m-2·S-1下,0.5 hr的光照和2hr的诱导后培养对色素合成较为有利。而过高的光照可能会起抑制。金属离子Fe3+、Zn2+和Cu2+对类胡萝卜素的合成具有诱导作用,而Fe2+和Mn2+对类胡萝卜素的合成具有抑制作用。一般情况下,D.radiodurans体内主要存在Mn-SOD,本论文通过添加Mn2+诱导Mn-SOD的大量合成,并尝试利用通过金属螯合晶胶分离技术高效获得较高纯度的Mn-SOD。
   本论文在鉴定D.radiodurans类胡萝卜素合成关键基因CrtE的基础上,利用金属螯合晶胶层析技术高效分离其表达蛋白GGPPS,并研究了光照和金属离子对类胡萝卜素的诱导合成作用。此外,进行了利用金属螯合晶胶直接分离Mn2+诱导的D.radiodurans Mn-SOD的初步研究。
[硕士论文] 张锐军
生物物理 河北工业大学 2011(学位年度)
摘要:随着微生物基因组测序计划的快速发展,大量微生物基因组序列已被测定。分析基因结构,挖掘这些序列所包含的生物学信息,提取特征参量,设计识别基因算法,识别基因,对基因组进行注释是生物信息学的重要课题。本论文的主要任务就是分析原核生物基因翻译起始位点附近序列特征、设计参量、建立算法,识别原核生物基因翻译起始位点,并将其应用于原核生物基因组注释。
  本文的内容由六部分组成:
  第一章介绍生物信息学的发展背景和主要的研究内容以及本文的研究成果及创新点。
  第二章介绍与本论文原核生物基因翻译起始位点识别相关的一些生物学知识,包括原核生物基因组结构特点,原核生物蛋白质翻译过程等,简单叙述了蛋白质在细胞中的位置,介绍信号肽结构。
  第三章介绍原核生物基因识别的发展状况,主要介绍了原核生物基因识别算法的两个方面:原核生物蛋白质编码区识别和翻译起始位点识别。
  第四章介绍Fisher识别算法、评价指标和Jack-Knife检验方法,及信号肽预测SignalP3.0软件。
  第五章是本论文的主要工作,介绍识别原核生物基因翻译起始位点的特征参量、识别过程以及识别结果。
  本论文识别算法的创新点是按基因相应的蛋白质N端结构,把原核生物基因分为信号肽基因和非信号肽基因,按其翻译起始位点具有不同的特征,分别对两类基因提取各自的参量,分别训练算法识别信号肽基因和非信号肽基因,识别结果具有很高的精度,尤其是在识别短基因方面。此外,还与其它算法进行了比较。
  第六章是文章的结论部分,首先对上述工作的简单概述总结,然后讨论了基因识别领域一些尚未完全解决的问题,最后提出本文识别过程主要的三个创新点。
[博士论文] 孙红星
生物化学和分子生物学 浙江大学 2011(学位年度)
摘要:细菌细胞内的金属离子动态平衡与细胞的生理生长具有密切关系,许多过渡价态金属离子,包括Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ca(Ⅱ)等,不但可以作为蛋白的辅因子参与细胞的多种氧化还原反应,还可以作为信号因子参与基因组转录调控,影响细胞的毒性以及极端抗性等。因此细胞内金属离子的调控对于细菌维持正常生理活动至关重要,而关于细菌细胞内金属离子调控的研究也一直是微生物领域的热点。
   作为极端微生物家族的重要成员,耐辐射球菌对于电离辐射、紫外线、化学诱变剂、干燥等具有极强抗性,而越来越多的研究表明,耐辐射球菌对于极端环境的适应能力得益于其超强的抗氧化能力,其细胞内积累的超高锰离子水平一直被认为是其最重要的抗氧化机制之一,因此耐辐射球菌是极好的研究细菌细胞锰离子代谢调控的模式生物,通过研究其锰离子调控机制,不但可以进一步了解耐辐射球菌的极端抗性机制,而且对于拓展细菌细胞金属离子调控机制也具有重要意义。本文主要通过细胞吸收及外排两个方面,研究了耐辐射球菌的细胞内锰离子动态调控机制,研究结果如下:
   1.我们首次鉴定得到耐辐射球菌锰离子外排蛋白(Dr1236)。在构建了Dr1236的基因缺失突变株后,我们发现突变株对于锰离子的抗性下降,而且细胞内的锰离子水平显著升高,说明Dr1236在耐辐射球菌锰离子抗性及细胞内锰离子动态调控机制中,发挥了重要的作用。进一步的研究发现,突变株细胞内锰离子浓度升高以后,其电离辐射、紫外、过氧化氢抗性都明显增强,表明细胞内锰离子确实参与了细胞的极端抗性,而这种保护作用很可能是通过降低自由基对蛋白的攻击实现的。然而,虽然突变株细胞在积累了高水平锰离子之后,极端抗性有了不同程度的增加,但是细胞的生长周期却远远短于野生株,表明锰离子的过高积累对细胞的整体机能造成了损伤,这也从侧面反映出锰离子外排蛋白对于细胞的重要作用。
   2.dr0865编码了耐辐射球菌唯一一个Fur同源蛋白,Fur蛋白在其它细菌中参与了锰离子吸收通道蛋白的转录调控,因此我们利用大肠杆菌表达系统体外表达了dr0865,并研究了其生化性质。生物信息学研究表明,Dr0865很可能包含了结合三个金属离子的结构,这种结构可能赋予了其独特的生物学功能。DNA结合活性实验表明,Dr0865可以与dr2283、dr2284、dr2524的启动子结合,而且结合活性与金属离子的浓度成正比,另一方面却不能与dr1709的启动子结合;β-半乳糖甘酶活性实验表明Dr0865与dr2283、dr2284、dr2523的启动子的结合可能促进了其转录,考虑到Dr0865的DNA结合活性依赖于金属离子的浓度,及Dr0865突变株的过氧化氢抗性增强,因此我们推测dr2283、dr2284、dr2523很可能编码了一种铁离子外排通道蛋白,而其具体调控机制还需要进一步研究。
   3.dr2539编码耐辐射球菌的DtxR/MntR家族蛋白,这类蛋白家族对于细胞锰离子或铁离子调控至关重要,通过在Dr2539 N-端融合表达助溶片段IF,我们成功得到Dr2539蛋白。DNA结合活性实验表明,Dr2539只能与dr1709的启动子结合,而且EMSA和β-半乳糖甘酶活性实验表明,蛋白的结合活性受到锰离子和铁离子的调控,表明Dr2539与此前所报道的MntR蛋白结构上可能存在很大差异,因此我们构建了Dr2539突变体,并将突变体补偿Dr2539突变株,包括C-D11M、C-H98Y、C-E101D、C-Tru,通过检测补偿株对于锰离子的抗性,发现C—D11M及C—Tru锰离子抗性相对于野生Dr2539补偿株明显下降,而C-E101D的抗性并没有明显变化;惊奇的是,H98Y补偿株对6-7Mm Mn(Ⅱ)极度敏感,这与此前所报道的DtxR激活模型一致,因此我们推测,dr2539所编码的MntR蛋白很可能利用一种类似于DtxR的激活模式,而且可能参与了细胞内锰离子与铁离子动态平衡的调控。
   综上所述,在研究了耐辐射球菌细胞内锰离子外排和吸收系统后,我们的结果表明锰离子的确参与了耐辐射球菌的极端抗性机制,此外,金属离子调控蛋白Dr0865和Dr2539的生化活性表明,耐辐射球菌的金属离子调控机制与目前发现的细菌调控机制存在很大差异,而这种差异可能与其极端环境生存能力有关。我们的研究为下一步深入研究耐辐射球菌金属离子调控蛋白Dr0865和Dr2539结构奠定了基础。
[硕士论文] 李新娜
微生物学 中国农业科学院 2011(学位年度)
摘要:冷激蛋白(cold shock protein,Csp)通常在冷环境下大量合成,普遍存在于动物、植物和真细菌中。这类蛋白含有结合RNA和ssDNA的特异冷激结构域,具有RNA分子伴侣或转录增强子的功能,在生物冷胁迫适应反应中起着重要的调节作用。耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)R1含有1个csp-like基因,其突变导致细胞对电离辐射敏感,但该基因是否具有冷激蛋白功能尚不清楚。本论文通过基因突变、Biolog技术和转录组学分析等对csp-like基因的功能及其调节作用进行了深入研究,取得如下研究进展:
   csp—like基因编码一个10kDa的蛋白,包含86个氨基酸残基。序列分析发现,它与Bacillussubtilis的CspB一致性为50%,含有结合RNA和ssDNA的特异冷激结构域。实时定量PCR分析显示,csp-like基因15℃冷激2 h上调1.87倍,其表达具有冷激诱导特性。△csp突变株较野生型R1菌株在最适温度时生长缓慢,15℃低温生长停滞。研究结果表明,该基因产物是一个典型的冷激蛋白。
   Biolog分析发现,△csp突变株较野生型R1菌株的碳源利用水平显著改变,csp缺失造成细胞对葡萄糖等8种碳源利用显著下降,3种碳源利用提高。凝胶阻滞实验结果表明,D.radioduransCsp结合富含胸腺嘧啶的ssDNA,也结合Y-box(ATTGG)序列或其反向互补序列,结合序列分析推测,Csp可能通过结合其启动子上游Y-box反向互补序列增强自身表达。
   为了进一步研究csp基因对细胞代谢的调控作用,本论文开展了正常生长条件下野生型R1菌株和△csp突变株的转录组学分析。结果表明,csp突变导致466个基因表达上调,322个基因表达下调,表达差异基因产物与细胞壁/细胞膜/细胞包膜生物合成、翻译/核糖体结构和生物合成、复制重组和修复、信号转导机制、能量产生和转换、氨基酸运输和代谢、脂类运输和代谢以及次级代谢产物的合成运输和分解代谢等有关。实时定量验证了该结果。其中,类胡萝卜素合成相关基因整体表达增强,其合成关键基因crtI上调2.8倍。细胞形态观察和色素含量测定发现csp突变株培养物及菌落颜色加深,胞内及胞外类胡萝卜素含量显著增加,表明csp基因参与了细胞色素合成的调控。ddrB、ddrI、recd、pprA和irrE等DNA应答反应和损伤修复蛋白多数被诱导表达,氧化抗性蛋白基因表达下调,推测csp导致氧化抗性蛋白下降是造成突变株对UV辐射敏感的主要原因。肽聚糖合成相关基因和细胞包膜S层蛋白基因表达上调,细胞超微结构的电子显微镜观察显示,突变株细胞壁最外层物质增多呈泡状溢出甚至脱落;ABC转运子相关基因的表达显著变化,显影质谱分析显示,突变株细胞多肽或脂多肽类物质分布改变,表明csp影响了细胞包膜的正常形态建成和物质运输。
   本研究表明,耐辐射异常球菌冷激蛋白Csp通过直接或间接的调控作用,影响了细胞的多种生理胁迫反应,包括细胞的抗氧化保护、DNA损伤修复及色素合成等过程,为进一步揭示耐辐射异常球菌极端环境的适应机制奠定了理论基础。
[硕士论文] 卢国伟
生物化学与分子生物学 河南科技大学 2011(学位年度)
摘要:极低频电磁场(Extremely low frequency electromagnetic fields,ELF-EMFs)是指频率在300Hz以下的交变电磁场,它在日常生活和工作环境中广泛存在,并同生物体发生相互作用。目前,对于ELF-EMF生物学的研究已经成为热点,但对ELF-EMF效应的观察尚不够系统,其作用的机理也不够清楚,这在一定程度制约了ELF-EMF生物效应的开发利用。针对低强度(1~5 mT范围内)ELF-EMF生物学效应的研究更少,这对制定ELF-EMF暴露限值极为不利。因此,深入开展ELF-EMF与生物体相互作用的研究,探究ELF-EMF生物学作用的一般特征和规律,揭示ELF-EMF生物学效应的作用途径及分子机制有重要现实意义。本文研究了50Hz,1~5mT下ELF-EMF对E.coli等微生物的生长抑制、细胞毒性和基因毒性作用,分析ELF-EMF与其他环境因子间的协同效应,并探讨ELF-EMF生物学效应的可能作用机制。
  本研究主要内容包括:⑴ELF-EMF的生物学效应与暴露强度、暴露时间存在非线性关系,甚至在某些特定区域出现饱和现象。另一方面,当细胞接受总刺激剂量相同,而刺激方式不同的ELF-EMF暴露时都表现出明显的生长抑制效应,并且连续刺激模式下的生长抑制作用高于间歇刺激模式。⑵ELF-EMF的生物学效应与E.coli细胞的生理状态密切相关,对数生长期的E.coli细胞对ELF-EMF作用最为敏感,而处于延迟期和衰亡期的E.coli细胞对ELF-EMF生物学作用表现相对较弱。不同微生物对ELF-EMF暴露的敏感性也有差别,就敏感而言,E.coli>Salmonella typhimurium>Yeast。⑶ELF-EMF暴露对微生物有潜在的细胞毒性和遗传毒性,长时间暴露于ELF-EMF中可诱导Salmonella typhimurium的DNA产生损伤,这种损伤与暴露时间有关,Salmonella typhimuriumTA1535在50Hz,3mT下连续暴露18h通过SOS/umu检测能观察到DNA的损伤,当暴露时间达到24h以上时,这种遗传毒性更显著。此外,50Hz,3mT的ELF-EMF可对E.coli产生细胞毒性,当E.coli在ELF-EMF中暴露14h时可以初步观察到细胞毒性,当暴露时间达到18 h时,这种细胞毒性更明显;而当暴露时间达到24h或以上时,ELF-EMF将表现出显著的细胞毒性,ELF-EMF的细胞毒性与暴露时间存在剂量依赖性。另一方面,ELF-EMF暴露也将引起蛋白质表达水平发生改变,尤其是一些小分子蛋白。当E.coli暴露在ELF-EMF下24h以上时,可明显观察到一条分子量约为60kDa的蛋白质谱的出现,推测其可能是应激相关蛋白。⑷ELF-EMF与Pb2+、苯酚间存在明显的协同效应,ELF-EMF可明显降低引起 E.coli毒害的铅离子和苯酚的浓度阈值。而 ELF-EMF与UV互作时,先施加UV后进行ELF-EMF刺激时,E.coli存活率明显低于先进行ELF-EMF暴露后实施UV刺激的实验组。
[博士论文] 周正富
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2011(学位年度)
摘要:耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)具有极强氧化胁迫抗性和电离辐射抗性。该菌中发现的IrrE是异常球菌属特异的全局调控因子,在DNA损伤修复、胁迫应答以及保护途径起到一个中心调控作用,并能显著增强模式生物大肠杆菌和烟草的耐盐能力。然而,IrrE在异源生物中的作用机制尚不清楚。本论文将IrrE导入大肠杆菌中,研究其对受体细胞氧化、高温和盐胁迫抗性的影响,并进行了蛋白质组和转录组分析。取得主要研究成果如下:
   1.在正常生长条件下,IrrE蛋白能够延长大肠杆菌生长对数期,提高细胞生物量,表明IrrE能增强大肠杆菌一般胁迫抗性。BioLog95底物利用分析表明,与对照菌株相比,重组菌株对22种碳源的利用能力显著降低,相反对山梨醇的利用能力显著提高。蛋白质组和转录组分析结果显示,IrrE重组大肠杆菌中参与海藻糖的合成、核苷酸合成、碳源利用、氨基酸利用、酸抗性等途径的基因表达差异显著。一系列具有调节功能的基因表达差异显著,其中evgA、appY、gadE、gadW、gadX、yhiF和asnC上调,purR、betI、cynR、mhpR、prpR、tdcA和kdgR下调。表明异源表达的IrrE可能通过转录级联放大反应在宿主细胞中发挥全局调控的作用。
   2.不同盐浓度冲击1 h后,IrrE能够提高大肠杆菌的存活能力;在1.0 M盐浓度下培养24 h,IrrE能提高大肠杆菌的生长能力;在高温和过氧化氢处理条件下,IrrE能提高大肠杆菌的存活能力。上述结果表明,IrrE在大肠杆菌中异源表达增强其胁迫抗性。为了研究IrrE提高大肠杆菌耐盐抗性的全局调控机制,本论文分析了1.0 M盐冲击下重组大肠杆菌与对照菌的蛋白图谱。结果表明,高浓度盐冲击下,重组菌株中126个蛋白表达显著上调,110个蛋白表达显著下调。其中包括一系列环境胁迫诱导蛋白,如胁迫反应转录因子RpoS、胁迫反应调控蛋白Dps、分子伴侣DnaK、热激蛋白HslU、渗透胁迫诱导蛋白OsmY、噬菌体诱导蛋白PspA、过氧化氢酶KatE、一般胁迫反应蛋白YhbO、分子伴侣Tig和胁迫条件诱导蛋白酶Lon等表达量显著提高。此外,盐冲击条件下细胞内甘油降解途径相关酶蛋白表达下调,同时甘油含量测定结果表明,重组菌株胞内甘油含量明显提高。表明IrrE引起胞内甘油积累,是重组大肠杆菌增强盐胁迫抗性的策略之一。
   3.迄今发现的4个IrrE均来自异常球菌属,其蛋白一级结构相对保守。N-端结构域的氨基酸序列有较大差异,但均含有一个锌依赖型多肽酶结构。为研究N-端结构域的生物学功能,对耐辐射异常球菌IrrE的N-端进行了截短分析,回补耐辐射异常球菌IrrE突变株发现,N-端的18、26、43个氨基酸残基缺失的IrrE突变体能恢复突变菌株的紫外和电离辐射抗性,但N-端的160个氨基酸残基缺失不能恢复其抗性。
   本研究将为揭示微生物的环境适应进化和盐胁迫抗性机制,并进一步开展IrrE基因改良植物与微生物性状等研究奠定工作基础。
[硕士论文] 李科伟
生物化学与分子生物学 河南科技大学 2011(学位年度)
摘要:可听声波是一种重要的环境因子,在自然界中广泛存在并同生物体发生相互作用。目前,对于可听声波的生物学作用研究在国际范围内尚不够普遍,对其效应的实验观察尚不够系统,其作用的分子机理也不够清楚,这在一定程度上,制约了声生物效应的开发利用。因此,深入开展可听声波与生物体相互作用的研究,探究可听声波生物学作用的一般特征和规律,揭示该频段声波在传播过程中生物学效应的作用途径及分子机制,必将为可听声波的合理开发和利用、建立基于单细胞生物的声波暴露风险评估体系及开展可听声波危害的有效规避与防范奠定理论基础。本文以单细胞模式生物大肠杆菌为研究对象,以自行研制的声频发生装置为实验平台,研究了可听声波刺激对E.coli生长特性、生理生化特性及细胞膜结构和功能等的影响,并对Ca2+在可听声波刺激大肠杆菌细胞生长中的作用及机理进行了探讨。
  本研究主要内容包括:⑴研究了正常条件和环境胁迫下可听声波刺激对大肠杆菌生长的影响,结果表明:正常培养条件下,不同频率和强度的可听声波刺激对 E.coli的生长具有促进或抑制效应;当频率1000 Hz,强度为100 dB时可听声波能显著地促进大肠杆菌细胞的生长,超出一定范围时可听声波刺激对其生长的促进作用减弱,甚至有抑制作用。但在渗透胁迫条件下,可听声波刺激却明显增强了由渗透胁迫引起的生长抑制效应,而在盐胁迫下适当强度的可听声波刺激却可从一定程度上减轻盐胁迫对E.coli生长的影响,一些可能的机制卷入了上述效应过程。⑵探讨了可听声波刺激对E.coli生理代谢活动的影响,研究发现在一定强度和频率的可听声波刺激下,大肠杆菌胞内蛋白质含量显著高于对照组,比对照组平均增加了59.5%;SOD酶活性相比对照组平均提高了68.56%;CAT酶活性相比对照组提高了331.22%,表明适宜强度和频率的可听声波刺激可增强细胞的代谢活性。⑶对可听声波刺激下大肠杆菌细胞膜结构和功能变化的研究表明,适宜强度的可听声波刺激可在一定范围内不损伤菌体的情况下增加大肠杆菌胞内溢出的核酸和蛋白质的量,增强细菌质膜的通透性。通过傅里叶变换红外光谱方法测定可听声波刺激对质膜蛋白酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带及酰胺Ⅲ带的影响发现,可听声波刺激下,质膜蛋白的二级结构发生了改变。⑷研究了Ca2+在大肠杆菌对可听声波应激响应过程中的作用,结果表明,当培养基中游离钙被螯合以后,可听声波刺激对E.coli细胞生长的促进效应将被完全消除,且适宜强度的可听声波可使E.coli胞内总Ca2+含量显著增加。
[硕士论文] 王媛
生物物理学 浙江大学 2011(学位年度)
摘要:耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是奇球菌属(Deinococcaceae)的代表菌种,是至今发现的抗辐射能力最强的生物之一。DNA损伤很易阻断复制叉的前进,而电离辐射会诱导产生各种形式的DNA结构损伤,这会导致各种致命的染色体畸变,从而使细胞死亡。损伤DNA的修复以及接下来停止复制叉的重启动过程对细胞生存极为重要。耐辐射球菌具有高效的DNA损伤修复机制,能够准确无误地修复由辐射引起的几百个双链DNA碎片,不造成任何突变和死亡。然而,细胞还需要一些能够重启动停止的复制叉的方式,这类方式不依赖于基因重组,而是在损伤的下游重启动复制。但是关于耐辐射球菌中停止复制叉的重启动机制还未有研究报道。
   依赖于PriA的复制重启动机制是细菌复制重启动的主要途径。在大肠杆菌中,PriA与PriB,DnaT,PriC,DnaB和DnaC等引发体蛋白共同完成停止复制叉上引发体的装载过程。根据比较基因组学的结果,发现耐辐射球菌中存在编码priA的基因,其编号为dr2606。但是耐辐射球菌在序列上不存在编码priB,priC,dnaT和dnaC的同源基因。
   为了了解priA类似基因dr2606在耐辐射球菌中的作用,我们用生物信息学的方法对dr2606基因与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中的同源物进行了序列比对。我们还通过用卡纳抗性基因代替了dr2606阅读框,构建了dr2606缺失突变株。Dr2606的突变导致菌体生长缓慢,细胞生存率急剧下降。为了检测Dr2606在DNA修复中的作用,我们对突变株进行UV和丝裂霉素处理。意外的是,耐辐射球菌的DNA修复能力没有削弱。但是,突变株的转化效率大大削弱了。这些数据表明,在耐辐射球菌中priA类似基因dr2606对停止复制叉的重启动过程并不是必需的。耐辐射球菌的不依赖于原点的复制重启动过程可能与其它细菌不同。
[硕士论文] 王维
生物物理 山东理工大学 2010(学位年度)
摘要:地球上的生命具有强大的适应能力。大部分生物的生存温度范围在20℃~50℃,还有很多生物可以在50℃以上的高温或者20℃以下的低温环境中生长。生长温度在+46℃以上的被称为嗜热微生物。嗜热微生物的热适应机制一直都是人们非常关注的问题。得益于微生物基因组序列数据的积累以及生物信息学的发展,我们可以从基因组和蛋白质组的角度来探讨嗜热微生物的热稳定和热适应机制。
  前人对于微生物嗜热机制的研究多局限于对某一种蛋白家族的序列或结构的分析。但是到目前为止,已经积累了大量的微生物基因组序列信息。因此,我们决定从微生物全基因组和全蛋白质组的角度,来综合地分析蛋白质和氨基酸对嗜热微生物热稳定和热适应的影响,以及嗜热微生物蛋白功能的演化。本论文首先选取了526个细菌的全蛋白质组序列,利用双向比对的方法找出全部的同源蛋白,从蛋白的序列组成方面入手分析热稳定和热适应的机理。结果表明嗜热微生物在蛋白质的氨基酸组成上存在偏好性。通过对蛋白的功能和COG分析发现,嗜热微生物中特有的一些蛋白质,更多地参与细胞生物信息的存储与处理过程。最后还对这些蛋白的结构做了分析。
  此外,本论文还研究了氨基酸的稳定性在嗜热微生物热稳定和热适应方面的贡献。通过考察297个原核微生物基因组中氨基酸含量与最适生长温度(OGT)之间的相关性来衡量氨基酸稳定性在生物热适应中所起到的作用。我们的研究发现除了DNA和蛋白质稳定性对热适应的作用之外,氨基酸的稳定性也是嗜热微生物热适应的决定因素之一。这些发现不仅为前人提出的假设提供了进一步的证据支持,而且也表明了氨基酸的稳定性对嗜热菌中氨基酸残基的选择有重要影响。通过考察Top-90中同源蛋白的氨基酸含量,进一步说明氨基酸的稳定性对蛋白质的残基组成有贡献。
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