绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 78
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 1556 条结果
[硕士论文] 钟越
微生物学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:为解决聚乙烯塑料在环境中难降解的问题,本研究筛选出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验和16SrDNA序列分析;将菌株先后接种于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw>100000)为唯一碳源的基础液体培养基中,28℃,180rpm培养;每24小时,用分光光度法测定菌体生长浓度和胞外蛋白含量;培养60天后,称取残留PE重量,用扫描电子显微镜观察膜片表观,用拉力测试机、水接触角测定仪以及红外光谱仪测定膜片性能。
  为进一步提高原始菌株对高分子量PE的降解能力,本研究对原始菌株进行了诱变处理。采用紫外辐照、微波热效应、LiCl、盐酸羟胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法对菌株进行诱变;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度筛选法,对诱变菌株进行筛选;通过诱变菌株在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中的菌体生长情况、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指标,选出降解性能最优的菌株,再将该菌株与原始菌株在相同培养条件下(以PE膜片为唯一碳源)培养60天,测定膜片力学性能。
  为找出降解PE的关键基因和代谢通路,我们将原始菌株在不同碳源培养条件下的(G组:以可溶性淀粉为唯一碳源;W组:以PE为唯一碳源)基因表达情况进行转录组测序分析,经RNA提取纯化、建库、测序、质控等过程,再进行GO、COG、KEGG数据库注释比对、聚类和富集分析;对两个处理组的基因表达量进行差异比较;最后随机选取差异基因进行RT-PCR表达量验证。
  结果表明,筛选出的菌株为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),命名为ZEL-1。该菌在分子量越低的聚乙烯培养液中,菌浓度、胞外蛋白含量、还原糖含量、聚乙烯失重率越高,菌液pH值下降得越快;电镜观察发现膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸强度降低74.15%,断裂伸长率减少84.90%,力学性能显著下降;水接触角从78.58±0.10°变小到41.25±0.16°,亲水性增大;红外光谱研究结果表明,膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。
  诱变育种结果表明,紫外辐照50s,微波诱变800Hz、120s,0.02%吖啶橙,0.7%LiCl,0.6%盐酸羟胺,为各方法的最优的诱变剂量。复合诱变采用紫外50s的突变菌株为出发菌株,再用0.02%吖啶橙诱变。PE培养基中菌体生长趋势,除盐酸羟胺组外,其他组均优于原始菌株组;紫外组胞外蛋白含量较原始组平均提高2.06倍,微波组平均提高1.24倍,吖啶组平均提高2.70倍,盐酸羟胺组平均提高1.60倍,复合诱变组平均提高3.30倍;盐酸羟胺组膜片失重率低于原始菌株组,其他组均高于原始菌株组,复合诱变组膜片失重率最大,高于原始组2.28倍;选择复合诱变组菌株UV-AO-1为优势菌株,PE降解60天后,UV-AO-1组水接触角比原始菌株组减小2.5°;拉伸强度减小3.37Mpa,断裂伸长率减少39.62%。
  转录组测序结果表明,此次共得到12372(63.24%)个非冗余Unigene,其中2095条Unigene富集于代谢过程组中;与COG数据库比对,有3328条Unigene与COG数据库中的基因具有同源性;涉及到代谢活动相关的Unigene占50.57%;发现差异表达基因423个,与G组相比,W组有293个基因表达上调,130个基因下调;AlkB基因差异表达最为显著。与KEGG Pathway数据库比对,有5776条转录本比对到KEGG数据库中,有92个代谢通路出现差异;碳代谢、氨基酸合成、丙酮酸代谢途径的差异基因表达上调数量较多,乙酰-CoA合成、脂肪酸代谢的相关基因表达差异上调显著,柠檬酸循环的差异基因下调明显。
  实时荧光定量PCR验证结果表明,荧光定量PCR得出的表达量与转录组测序结果的差异基因表达量上下调模式基本一致,证明此次转录组数据结果可信。
  综上所述,本研究菌株ZEL-1能够直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;诱变菌株UV-AO-1的降解性能优于原始菌株,具有更大的应用潜力。原始菌株在PE碳源的培养条件下,菌株代谢倾向于碳架构建,减少了糖类物质的合成和代谢;推测菌株ZEL-1对聚乙烯的降解始于Alk B基因编码的烷烃单加氧酶对聚乙烯的末端氧化断链作用,经由脂肪酸β氧化,完成PE的无机矿化。ZEL-1降解聚乙烯的基因表达差异,基本反映了不同碳源引起的代谢通路差异,为后期深入研究聚乙烯降解机理提供了理论依据。
[硕士论文] 崔登雪
生物工程 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是地球上最原始、储存量最大的天然化合物,是最珍贵且廉价的可再生资源。我国每年有超过一半以上的秸秆都被人为的就地点燃焚烧或直接丢弃在田间地头,造成极大的资源浪费,同时污染环境,危害人类健康。因而将废弃的农业资源变成有价值的物质,一直深受关注。根据大量的研究表明,采用酶法降解纤维素优势明显,如今纤维素酶在许多行业的应用研究已经产生了诸多成效,比如在食品、发酵工业及环境保护等的应用都取得了巨大效益。多年研究发现,生物界有许多生物都能产生纤维素酶,同时若要大量制备纤维素酶,最有效的方法是采用微生物发酵。其中芽胞杆菌属是可以形成孢子(内生孢子)的球状或杆状细菌,芽胞杆菌对外部有害因素有抗性,分布广泛,存在于土壤,水,空气和动物肠道等,具有较高的耐热性,更适合生产发酵的应用。在中国对于产纤维素酶微生物的研究,已经成为了一个重要的研究方向,并且方法技术都已相对成熟。本论文的研究目的是富集、筛选出能够产生纤维素酶、高效降解纤维素的芽胞杆菌,并对其分离、鉴定,对筛选到的高活性菌株的降解特性及发酵培养条件进行较为系统的研究。
  通过高温处理富集后,在只有CMC-Na做碳源的培养基中培养,30℃、48 h后,筛选得到20株产纤维素酶的芽胞杆菌。经形态学、生理生化、分子生物学鉴定,菌株JD2为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens、菌株JK1为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis、菌株JK5为杀线虫芽胞杆菌Bacillus nematocida、菌株JK7为枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、菌株JK9为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus。经初步比较酶活力,其中菌株JK7的酶活力最高,进一步对菌株JK7酶学性质进行研究,表明菌株JK7所产纤维素酶的最适温度为50℃,最适pH5.0,最适碳源为玉米秸秆(30 g/L),最适氮源为豆粕(10 g/L),且具有一定的热稳定性。
  在此基础上,为优化发酵产酶条件,得到更高的酶活性,初步研究影响发酵产酶的因素,确定其中影响较大的因素作为优化条件,分析各因素试验范围,采用Box-BehnkenDesign(BBD)方法设计响应面优化试验,找出菌株JK7优化培养条件组合。运用Design-Expert.8.0.5软件,将实验结果拟合绘制成响应面优化三维图,得到优化最佳发酵产酶条件:起始pH值6.91、转速237rpm、温度35.3℃。在最佳产酶发酵条件下培养,测得纤维素酶活最高可达12.16 U/mL,比最初酶活提高了6.85倍。
[硕士论文] 颜凯
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:抗肿瘤抗生素在临床中广泛使用,但存在药物毒副作用及肿瘤细胞多耐药性等问题,为了解决这一难题,寻找结构新颖的抗肿瘤化合物,本研究采用活性追踪的方法开展了抗肿瘤土壤放线菌筛选及对两株活性放线菌次级代谢产物的研究工作。
  以人肺癌细胞A549和人结肠癌细胞HCT-116为筛选模型,采用CCK-8方法从土壤放线菌中筛选出两株活性菌,经16S rRNA初步鉴定均为链霉菌,分别命名为Streptomyces sp.HS-NF-1006和Streptomyces sp.HS-NF-853。
  结合抗肿瘤模型筛选结果和菌株在不同培养基中的生长状况,最终选定葡萄糖1%,可溶性淀粉4%,酵母抽提物0.4%,麦芽提取物0.1%,CaCO30.2%,FeSO4·7H2O0.1%,MnCl2·4H2O0.1%为Streptomyces sp.HS-NF-1006的最适发酵培养基;选定葡萄糖1%,可溶性淀粉4%,酵母抽提物0.4%,麦芽糊精1%,0.1 ml/L(Fe SO4·7H2O0.1%,MnCl2·4H2O0.1%,ZnSO4·7H2O0.1%)为Streptomyces sp.HS-NF-853的最适发酵培养基。利用50 L发酵罐分别对两株活性菌进行放大发酵。
  所得发酵液经前处理后,利用硅胶、凝胶、HPLC等分离方法对两株活性菌的发酵产物进行分离,最终得到9个化合物,利用核磁共振和质谱等分析方法进行结构鉴定,从菌株HS-NF-1006提取到3个化合物1-3,均为蒽环类化合物,其中化合物1为新结构化合物,命名为13-oxy-13-decarbony-6"-cyano-6"-deoxy-TAN-1120;从菌株HS-NF-853提取到6个化合物4-9,其中化合物4是一个结构新颖度较高的四氢苯并呋喃酮化合物,命名为StrefuranoneA。
  对所得到化合物进行抗肿瘤活性评价,化合物1对结肠癌细胞HCT-116的IC50为0.0978μM,对人肺癌细胞A549的IC50为0.08μM,化合物2-9未表现抗肿瘤活性。
[硕士论文] 李慧真
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:蓝细菌中有一种能够捕捉光能的色素蛋白,与植物、细菌光敏色素具有很高的相似性,我们将这种蛋白称作蓝细菌光敏色素。存在于念珠藻PCC7120中的光敏色素AphB,具有PAS和GAF结构域,并且PAS结构域上第17位半胱氨酸的巯基(-SH)可以与发色团胆绿素A环上的C3原子形成硫醚键,使蛋白与BV共价结合;与此同时GAF结构域通过空间结构的作用将BV紧紧包裹在蛋白内部,使色素与脱辅基蛋白紧密结合。由于存在色素小分子,色素蛋白具有特征光谱,AphB重组BV的最大吸收峰在697nm,最大荧光峰在720nm,该光谱处于活体组织可视化光学成像范围(650-1100nm)内,因此AphB具有开发为近红外荧光生物探针的潜力。
  本文主要是将AphB与已报道的细菌光敏色素的PAS-GAF的氨基酸序列进行序列比对,总结得出保守的氨基酸位点,从而将AphB进行定向改造,进化出理化性质良好的诱变体,用于体内荧光探针的开发。在实验室研究的基础上,已知AphB(7-321/A288 V)对光稳定增强的突变体,根据得出的保守氨基酸位点,对AphB的207位天冬氨酸(Asp)进行定点突变,分别突变成丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe),研究该突变位点对蛋白活性的影响,筛选活性良好突变体。基于这些定点突变体,我们使用易错PCR和DNA shuffling的方法对蛋白进行改造,构建诱变体文库并使用高通量仪器Qpix420进行诱变体初筛,用多功能酶标仪和荧光光谱仪进行复筛,将筛选到的突变体在大肠杆菌中进行蛋白表达,光谱检测,分析突变体蛋白的理化性质。用SWISS-MODEL网站进行在线同源建模,模板为RpBphP2(PDB∶4E04),同时通过T-coffee软件在线比对分析突变氨基酸位点,并用Pymol软件标记了蛋白三维结构中的突变位点。筛选得到的9个诱变体中,最高的荧光量子产率提高了160%,最高的摩尔消光系数提高了130%,最大的相对分子亮度提高200%,对AphB的优化为之后蓝细菌光敏色素类荧光蛋白的改造提供参考。
  此外,有研究表明,除蓝细菌光敏色素外,藻蛋白类荧光蛋白如smURFP可以结合细胞内的胆绿素BV,并且具有很高的稳定性和较强的荧光亮度,这对于开发近红外荧光探针来说很重要。而念珠藻PCC7120藻胆蛋白中核膜连接蛋白ApcE(50-240/△77-153)可以结合藻胆色素PCB、PEB,但是并不能结合胆绿素BV,因此我们尝试筛选出可以结合BV的突变体用于近红外荧光探针的开发。首先对ApcE(50-240/△77-153)进行定点突变,找到活性更好的诱变体,然后以此诱变体作为模板,对蛋白进行随机突变,构建突变体文库,并用高通量仪器Qpix420进行诱变体初步筛选,将筛选得到的突变体在大肠杆菌中进行蛋白表达提纯,光谱检测,并分析其理化性质。目前我们得到能结合色素BV的突变体,但蛋白有待于进一步的优化。对ApcE的优化可以为之后藻胆蛋白类荧光蛋白的改造提供参考。
[硕士论文] 段静
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:甲壳素在自然界中的含量极其丰富,是仅次于纤维素的第二大多聚物,壳聚糖可由甲壳素制备而得。壳聚糖降解产物在医学、农业、工业等多个行业中都有着很高的应用价值,比如,壳寡糖可以显著提高鱼类的免疫力,是优良的水产饲料添加剂。由于壳聚糖的分子量大,溶解度低,使得其直接应用往往具有较大的局限性。因此,探索对壳聚糖进行高效降解具有重要的理论和生产意义。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是广泛存在于自然界中的芽孢杆菌属的成员。利用以壳聚糖为唯一碳源的选择性培养基,我们筛选到一株可以高效降解壳聚糖的解淀粉芽孢杆菌,并开展其壳聚糖酶活性的研究,得到如下结果:
  1、根据细菌的形态、生理生化特征,并结合16S rDNA和gyrA基因,鉴定该细菌为解淀粉芽孢杆菌,并对该菌株进行命名为HZ-1510。
  2、克隆了解淀粉芽孢杆菌HZ-1510的壳聚糖酶基因,通过生物信息学技术分析了该基因的结构,该壳聚糖酶基因开放读码框全长为837bp,可以编码279个氨基酸,分子量大小为31.45kDa。在其氨基末端具有信号肽,切割点位于第36位和37位氨基酸之间。氨基酸序列同源性分析结果显示该壳聚糖酶属于GH46家族,与解淀粉芽孢杆菌ABBD菌株和MBE1283菌株所编码的壳聚糖酶同源性最高。此外,Glu-55和Asp-71氨基酸为该壳聚糖酶的催化活性位点。
  3、构建谷胱甘肽转移酶(GST)-壳聚糖酶融合蛋白表达质粒pGEX-5X-1-Chi,在大肠杆菌BL21中表达,利用GST亲和层析柱纯化壳聚糖酶。
  4、研究了温度、pH和金属离子对重组壳聚糖酶的水解活力的影响,结果表明,该重组壳聚糖酶的最适反应温度约为55℃,最适pH为5.5。金属离子Mn2+、Ca2+和Mg2+对其活力起增强作用,但Fe3+、Ag+、Cu2+、Ba2+和K+对其水解活力都起抑制作用。低浓度的Zn2+对壳聚糖酶的活力起到了微弱的增强效果,但提高Zn2+的浓度会使壳聚糖酶的活力起抑制作用。
[硕士论文] 吴小丽
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:铁是生物体正常生长不可或缺的元素,而细胞内过量的铁离子会引起Fenton反应而产生ROS,从而导致细胞氧化损伤。已有研究表明生物体中,铁蛋白具有氧化胁迫抗性、调节细胞内铁离子浓度等作用。极端耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)抗氧化基因组序列分析,发现一个的类铁蛋白编码基因(drB0118),已有的研究表明该蛋白失活导致细胞对干燥胁迫敏感,但在调节细胞内铁离子浓度及氧化胁迫抗性的作用尚无报道。本研究通过生物信息学分析、基因突变和异源表达等方法对DrfE蛋白的抗氧化功能进行初步研究,主要取得如下研究结果:
  (1)利用生物信息学方法,对耐辐射异常球菌DrfE进行生物信息学分析,发现drfE位于耐辐射异常球菌基因组大质粒上,该蛋白由337个氨基酸组成,含有一个与铁蛋白类似保守结构域,属于铁蛋白2超家族。因此,将该蛋白命名为DrfE(Deinococcus radiodurans Ferritin,DrfE)。其氨基酸序列分析表明,该蛋白具有明显的跨膜结构和蛋白疏水区,是一类典型的跨膜蛋白。
  (2)为了研究耐辐射异常球菌 drfE的功能,本研究采用融合PCR和体内同源重组的方法成功构建了drfE基因的缺失突变株(ΔdrfE)和功能回补菌株(pdrfE::Δ)。胁迫冲击实验显示,drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌对氯化钠和过氧化氢敏感,80mM H2O2处理30min后,突变株比野生型菌株的生存力低4个数量级,5M NaCl处理6h导致突变株的生存力降低2个数量级,且回补株能够完全恢复突变株ΔdrfE的表型。
  (3)对野生型DR、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE::Δ中体内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定的结果表明,在正常培养条件下,drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌CAT和SOD活性下降(突变株的酶活分别下降28.36%和6.42%);而氧化胁迫(80mM H2O2处理30min)条件下,差异尤为显著(突变株酶活下降32.33%和41.30%)。进一步对胞内Fe2+含量进行测定,结果显示drfE基因缺失引起耐辐射异常球菌细胞中胞内Fe2+含量增加了26%,达293μmol/L。
  (4)将耐辐射异常球菌DrfE蛋白异源表达在大肠杆菌中,表型分析结果表明,DrfE蛋白明显增强了大肠杆菌对氯化钠和过氧化氢的胁迫抗性。在15mM H2O2处理10min条件下,DrfE蛋白异源表达的大肠杆菌生存力增加了2个数量级,1.5M NaCl处理6h条件下,其生存力增加1个数量级。
  总之,耐辐射异常球菌drfE基因在盐和氧化胁迫反应中发挥重要作用,能维持细胞CAT和SOD活性,有效降低胞内Fe2+含量,保护细胞免受氧化损伤,其分子作用机制有待于进一步研究。
[博士论文] 李英俊
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统广泛分布于古菌和细菌中,是一种抵御病毒和质粒等外源遗传物质的获得性免疫系统。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统已被分为两大类和六个亚型,其中主要的三个亚型(Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型)得到了广泛的研究。Ⅱ型CRISPR/Cas9系统目前已被广泛应用于不同的细菌和真核生物的基因组编辑;此外,Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR-Cas系统还被开发成抗菌剂来选择性消除特定的菌群。但是,迄今还没有利用Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统进行基因组编辑的报道。
  本研究在冰岛硫化叶菌中开发了一种基于其内源的Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统的基因组编辑方法。该方法只需要构建一个新型的基因组编辑质粒(pGE),该质粒携带一个提供能靶向干涉或沉默基因的成熟CRISPR RNA的人工mini-CRISPR簇以及一个含有非靶标序列的用于同源重组的供体DNA片段。将pGE质粒转化到宿主细胞之后,细胞将会有两种命运:野生型细胞因基因组DNA被靶向降解而死亡;而那些基因组与供体DNA发生了同源重组从而携带突变基因的细胞能免于干涉而成为转化子存活下来。利用该方法,本研究实现了不同类型的基因组编辑,包括缺失、插入和定点突变。我们相信该方法可以推广到其它含有能干涉DNA的CRISPR-Cas系统的细菌和古菌。
  研究不同CRISPR-Cas系统的分子机制是应用开发的基础,且已成为当前生物学研究的热门领域之一。已有研究表明,Ⅲ型CRISPR-Cas系统与其它类型有显著不同的核酸干涉活性,其既有RNA酶活性也有RNA激活的DNA酶活性。我们的前期研究已经揭示了冰岛硫化叶菌Ⅲ-B型Cmr-α系统在体内同时具有RNA干涉活性和依赖于转录的DNA干涉活性。为了更深入的解析相关机制,本研究用一个携带43nt SS1spacer(靶向lac基因上protospacer SS1)的人工mini-CRISPR质粒,从冰岛硫化叶菌中纯化出天然Cmr-α复合物,并对其进行了系统的体外研究。研究发现,Cmr-α复合物能切割与复合物中的crRNA互补配对的靶标RNA,同时该靶标RNA又能激活Cmr-α复合物的ssDNA切割活性,该活性需要靶标RNA的3'端侧翼序列与crRNA的5'端tag序列错配。此外,激活的Cmr-α复合物能够快速切割大量的ssDNA底物,这说明Cmr-α系统可以快速消灭复制中的病毒DNA。
  为了揭示Cmr2α蛋白在Cmr-α系统DNA干涉活性中的功能,本研究针对Cmr2α的HD和Palm两个结构域构建了四个突变株,分别命名为HD-M1(H14N和D15N),HD-M2(H14N, D15N,K19A和I23A), Palm-M1(G666K和D667K)和Palm-M2(662-IYlGGDDiLA-671—AAlAAAAiAS)。体内干涉质粒分析显示,其中3个多氨基酸突变株HD-M2、Palm-M1和Palm-M2都丧失了DNA干涉活性。而HD结构域的双氨基酸突变株HD-M1却只是消除了体外的DNA切割活性。这些结果表明,Cmr2α的HD和Palm两个结构域都是Cmr-α系统体内DNA干涉所必需的,而体外检测到的ssDNA切割活性可能只是HD结构域介导的。
  此外,Ⅲ型CRISPR-Cas系统的crRNA加工成熟和靶标核酸的结合机制仍然是不清楚的。本研究用携带不同长度spacer(14,20,28,40和76nt)的人工mini-CRISPR质粒分别纯化Cmr-α复合物。结果显示,无论spacer长短,Cmr-α系统都合成固定长度的crRNA(40nt和46 nt)。这说明mini-CRISPR簇下游的repeat元件可以在没有被加工情况下补充为crRNA序列。此外,一个仅含有上游repeat元件和40nt spacer的人工mini-CRISPR质粒也能合成一样固定长度的crRNA。这些结果表明,Cmr-α复合物的组装可能是从crRNA的5'端tag区域(经Cas6初加工产生)起始,而crRNA的3'端则由其它未知的RNase加工成熟,从而组装成两个固定大小的复合物。另外,对这些复合物的体外切割活性和结合靶标RNA能力的分析表明,随着复合物中crRNA的3'端区域和靶标RNA的5'端序列错配碱基数的增加,不能被复合物结合和切割的RNA底物的数量也随之增加。
  在Ⅲ-B型效应复合物的结构模型中,结合crRNA的3'端区域的是Cmr1亚基。本研究在冰岛硫化叶菌中构建了一个Cmr1α缺失突变株和两个关于Cmr1α的丙氨酸替换突变株,分别命名为△β△1α,△β1α-M1(W58A和F59A),△β1α-M2(I52A,G54A,R57A和R61A)。体内基于mini-CRISPR的报告基因法分析表明,△β1α-M1的RNA干涉活性相比野生型菌株大大降低,而△β△1α和△β1α-M2则基本丧失了RNA干涉活性。
  纯化Cmr1α三个突变株的Cmr-α复合物发现,突变株△β1α-M1 Cmr-α复合物的组分和野生型基本一样,而突变株△β1α-M2 Cmr-α复合物的组分却和△β△1α一样,都缺少Cmr1α蛋白。同时,体外RNA切割实验与体内的RNA干涉活性分析结果一致。在靶标RNA激活的DNA切割活性分析中,突变株△β△1α和△β1α-M2的复合物均基本丧失了DNA切割活性,突变株△β1α-M1的Cmr-α复合物也只检测到相比野生型复合物非常弱的DNA切割活性。此外,EMSA实验结果显示,△β△1α和△β1α-M1的Cmr-α复合物均很难与靶标RNA形成三元复合物(Cmr蛋白,crRNA和靶标RNA)。以上结果表明,Cmr1α在Cmr-α复合物与靶标RNA形成三元复合物过程中扮演关键角色。两个保守的疏水氨基酸(W58和F59)是Cmr-α复合物结合靶标RNA所必需的,另外四个氨基酸(I52,G54,R57和R61)可能主要介导Cmr1α与crRNA相互作用,从而形成完整的Cmr-α复合物。
[硕士论文] 黄一锋
生物工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:S-腺苷蛋氨酸(SAM)参与生物体细胞内转甲基、转硫基和聚胺合成等多种重要的反应,它在治疗肝病、抑郁症和关节炎等疾病中起着重要的作用,目前市场需求量巨大。生物体能直接利用L-甲硫氨酸合成SAM,但不能直接利用D-甲硫氨酸,势必造成了D-甲硫氨酸的浪费。本文对酿酒酵母模式菌株BY4741进行改造,实现在BY4741细胞内D-甲硫氨酸的积累,并将D-甲硫氨酸转化为L-甲硫氨酸,最终提高BY4741胞内SAM的产量。
  运用标记回收的基因敲除技术在BY4741中敲除hpa3,发现敲除hpa3有利于D-甲硫氨酸在BY4741中的积累。利用多片段重组技术将ENO2启动子、D-氨基酸氧化酶、ENO2终止子、TEF2启动子、L-苯丙氨酸脱氢酶、TEF2终止子以及多拷贝质粒p426的骨架重组成一个新质粒pR426,转入迸BY4741(△hpa3)中,通过蛋白电泳及粗酶液反应证明改造菌成功表达D-氨基酸氧化酶和L-苯丙氨酸脱氢酶,并且菌体表达的两个酶均有酶活。将改造菌株进行摇瓶发酵培养考察其生产SAM的能力,结果显示相比于出发菌,改造菌株的SAM产量提高了18.3%,最大SAM胞含量提高了31.2%。
  利用CRISPR/Cas9系统对BY4741中的hpa3和erg6基因进行编辑,研究BY4741中CRISPR/Cas9系统的工作效率。为以后利用CRISPR/Cas9系统调控酿酒酵母中SAM的代谢网络提供方法依据。
[硕士论文] 刘小利
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans,DR)因其具有对非生物胁迫超强的抵抗能力而备受关注。基因组学注释表明,耐辐射异常球菌中含有3个基因(dr1372、dr0105及dr1172),其编码产物与植物干燥抗性相关的胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)同源。D.radiodurans基因组中dr0105基因编码的蛋白具有高度亲水性,为LEA3家族蛋白,本研究将该蛋白命名为Dlp(Deinococcus radioduransLEA3 protein)。本研究通过生物信息学分析、转录分析及基因缺失突变、蛋白外源表达与纯化、体外酶活等生理生化指标的测定,对Dlp蛋白的非生物胁迫抗性进行了初步研究,主要取得如下进展:
  生物信息学分析显示,耐辐射异常球菌Dlp蛋白含有163个氨基酸,分子量为17.83kDa,富含丰富的亲水性氨基酸,α螺旋结构高达90.18%,是一类稳定的亲水性蛋白,属于LEA3家族蛋白。qRT-PCR结果显示dlp基因在D.radiodurans突变株ΔdrRRA中表达量显著下调,表明dlp基因可能受D.radiodurans反应调控蛋白DrRRA的调节。据此推测Dlp蛋白可能同大多数LEA3家族蛋白一样具有一定的非生物胁迫抗性,在D.radiodurans中可能参与由DrRRA介导的耐盐、抗氧化、耐辐射等非生物胁迫过程。
  为了研究Dlp蛋白的抗逆功能,本研究利用融合PCR方法构建了耐辐射异常球菌dlp基因缺失突变株(Δdlp),非生物胁迫实验结果显示,dlp基因的缺失导致细胞对高盐、强氧化胁迫极为敏感,UV辐照对其无影响;构建外源表达菌株E32a-dlp并对其进行非生物胁迫实验,结果表明,Dlp蛋白能够显著增强大肠杆菌耐盐、耐高渗及抗氧化胁迫的能力;体外逆境胁迫胁迫条件下(氧化、反复冻融)测定苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)酶活性,结果显示Dlp能够有效地MDH、LDH酶活性。
  综上所述,耐辐射异常球菌亲水蛋白Dlp对耐辐射异常球菌的UV抗性无贡献,但能增强耐辐射异常球菌及大肠杆菌耐盐、抗氧化等非生物胁迫抗性,还能起着分子伴侣的功能保护酶活性免受胁迫损伤。
[硕士论文] 梅森
生物工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:糖是细胞的碳和能量的最主要来源。活细胞能通过特异性的不同糖的运输系统,使糖穿过细胞膜进入细胞质,对细胞而言,这是细胞生命周期内,尤为重要生理功能。这些特异性的糖的运输系统的运行机制不尽相同,有系统机制是主动运输,而有些系统则是促进扩散机制。与糖运输类似,蛋白质运输也通过特定的通道,这是一个protein-conducting系统,多肽跨膜转移或者集成到细胞膜。在细菌和古生菌中,这个通道位于细胞膜上,由SecY复合体形成。有证据表明,SecY通道在其静息状态下,通过一个塞子域和一个氨基酸的孔隙环密封,起到防止细胞质内的小分子外泄作用。
  本项目以大肠杆菌非特异性跨内膜转运糖分子为目的,研究内容包括:利用栓塞结构域和氨基酸孔环的理性突变,解除SecY蛋白转位通道对水溶性物质的严格密封,削弱细胞内膜对糖分子的屏障作用;结合突变型SecY通道、SARS病毒外壳蛋白SCVE和糖类激酶,构建简单扩散跨膜系统及磷酸化辅助系统;以简单扩散跨膜系统替代木糖、阿拉伯糖、乳糖和纤维二糖转运系统;结合简单扩散跨膜系统和磷酸化辅助系统替代葡萄糖、果糖和甘露糖转运系统。此外,拟探讨简单扩散跨膜系统的设计、构建原理以及简单扩散跨膜系统和磷酸化辅助系统的适配机制,阐明简单扩散跨膜系统克服底物狭窄、“饱和现象”、抑制物敏感和“诱导物排斥”的实现机理和调控策略。本项目有望为大肠杆菌提供新的糖转运策略,研究成果有助于进一步拓展大肠杆菌在代谢工程和合成生物学中的应用前景。
[博士论文] 彭圣娟
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素生物质的生物降解研究具有重要的生物学和工业应用意义。对木质纤维素降解酶系进行组成优化和酶学性质改造,对促进木质纤维素生物转化生产生物燃料和大宗化产品具有重要价值。草酸青霉(Penicillium oxalicum)作为一种重要的产纤维素酶工业微生物,和里氏木霉相比具有酶系组成和比例更加合理、半纤维素酶活力更高的优点。目前已有的草酸青霉木质纤维素降解酶系在大规模工业化生产生物乙醇中仍然存在用量大、成本高的问题。找到能够促进纤维素降解的关键酶组分、降低生产成本是提高木质纤维素生物转化经济性的关键途径之一。
  本论文的主要研究结果如下:
  1.革酸青霉木质纤维素降解酶库的构建及其成员的酶学性质研究
  通过同源、异源方式表达了12种木质纤维素降解相关酶,构建成一个小型的草酸青霉木质纤维素降解酶库。其中纤维素酶有2种,半纤维素酶有8种,此外还有2个辅助酶。测定了部分酶库成员的比酶活、最适温度、最适pH、温度稳定性以及pH耐受性。外源添加β-葡萄糖苷酶能够显著提高草酸青霉高产菌株JU-A10-T酶系对工业废渣木糖渣的糖化能力,从而减少了达到同等水解效率时酶的用量。
  2.添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D等半纤维素酶对预处理木质纤维素底物降解的促进作用
  添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D和内切-β-1,4-甘露聚糖酶Man5A可以明显促进草酸青霉酶系降解水热法预处理的玉米芯和木糖渣时的葡萄糖产量。进一步探究Abf43D促进纤维素降解的机理发现,用Abf43D预处理能够提高底物的转化率,推测其能够通过除去底物中木聚糖侧链上的阿拉伯呋喃糖基,从而打破糖化中的抗降解屏障,与内切-β-1,4-木聚糖酶Xyn10A等协同促进半纤维素的降解,并有利于纤维素酶对纤维素的水解,最终提高了葡萄糖产量。此外Abf43D的添加能够缓解木聚糖水解液对纤维二糖水解酶活力的抑制作用。
  3.添加醛糖酸内酯酶AltA对木质纤维素糖化中β-葡萄糖苷酶活力和葡萄糖产量的影响
  D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力有强烈的抑制作用。添加AltA能缓解D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力的抑制。向糖化体系中添加AltA,不仅能提高草酸青霉和里氏木霉酶系的β-葡萄糖苷酶活力,还能促进纤维素的降解。通过HPLC-ESI-Q-TOF MS分析,证实了当AltA存在时糖化体系内的D-葡萄糖酸-1,5-内酯水平显著降低。当添加叠氮化钠和金属离子螯合剂EDTA抑制氧化还原酶类活性后,AltA的增效作用明显减小。
  4.裂解性多糖单加氧酶-醛糖酸内酯酶-β-葡萄糖苷酶(LPMO1-AltA-BGL1)协同体系降解木质纤维素研究及其组分配比的优化
  证实了LPMO1-AltA-BGL1体系能够协同降解磷酸膨胀纤维素,并可促进商业纤维素酶降解微晶纤维素和多种预处理的木质纤维素类底物。糖化体系中存在AltA时,内酯含量下降、β-葡萄糖苷酶活力上升,说明AltA缓解了可能由LPMO1产生的内酯对BGL1的抑制,从而使协同体系进一步发挥效果。利用DesignExpert软件设计了混料实验并预测了优化方案,得到LPMO1、AltA和BGL1的最优配比约是3∶8∶14。
[硕士论文] 房晓冉
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:生物表面活性剂是一种由微生物发酵生产的两亲性化合物,其分子内同时含有头部亲水基团与尾部疏水集团,具有润湿、乳化、起泡等物理化学特性,与化学合成的表面活性剂相比,具有低毒性、环境友好性以及生物可降解性等诸多优点,因而有希望在食品、化妆品、药品等行业中得到广泛应用。
  槐糖脂是目前产量最高的生物表面活性剂,应用前景最为广阔。天然槐糖脂是由一些非致病性酵母发酵产生的混合物,槐糖脂根据分子结构不同可分为酸型和内酯型两种,酸型槐糖脂的水溶性和发泡能力较好,内酯型槐糖脂则具有更好的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。槐糖脂的表面活性和生物活性会受到脂肪酸侧链的不同和槐糖部分乙酰化程度的影响。内酯型槐糖脂各组分中,又以C18∶1双乙酰化内酯型槐糖脂组分对食管癌细胞等肿瘤细胞的抑制效果最好。
  球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)是一类槐糖脂高产的酵母菌,由本实验室从污水中筛选分离得到。目前,在槐糖脂代谢和合成调控方面的研究尚处于起步阶段。研究槐糖脂合成相关的基因,有助于我们在基因水平上对球拟假丝酵母进行遗传改造,得到期望的特定槐糖脂组分,从而扩展槐糖脂的应用领域,并能开发在特定的工农业领域中的应用。
  本论文主要研究内容及结果如下:
  1.槐糖脂合成相关的胞外酸性蛋白酶基因的功能研究
  将球拟假丝酵母基因组信息与不同氮源条件下发酵的转录组数据分析结果相结合,我们发现,以硫酸铵为氮源进行发酵时,酸型胞外蛋白酶基因axp的转录量显著上调;敲除axp和其他三个同源蛋白基因后,将敲除株以硫酸铵为氮源进行发酵时,产物中酸型槐糖脂的产量明显提高。
  基于以上研究结果,对不同氮源条件下发酵液的蛋白质组进行分析,我们发现,在以硫酸铵为氮源的发酵液中,Axp蛋白的丰度呈现较高的水平;而在以酵母粉为氮源的发酵液中,检测不到Axp蛋白。我们构建了axp过表达菌株,在以酵母粉为氮源的发酵条件下,槐糖脂产量降低了15%。将axp在毕赤酵母GS115中进行异源表达,得到纯化的Axp蛋白液。将纯化的Axp蛋白用于外源添加实验,外源添加Axp蛋白液的球拟假丝酵母野生型菌株总槐糖脂产量降低了33%,内酯型槐糖脂的产量下降了41%,酸型槐糖脂的产量下降了23%。
  2.槐糖脂合成相关的长链脂肪酸去饱和酶基因的功能研究
  球拟假丝酵母发酵产生的槐糖脂,根据结构主要分为内酯型和酸型两种,其中又包括脂肪酸侧链长度、乙酰化程度和不饱和程度等差异。结构不同的槐糖脂组分间生理生化活性不同,其中C18∶1的双乙酰化内酯型槐糖脂(C18∶1 DLSL)是现有报道中抗肿瘤活性最好的组分。目前对槐糖脂合成方面的研究仅局限于合成通路中催化几步关键反应的酶,对合成通路中的去饱和酶未见报道。
  基于以上背景,我们研究了槐糖脂合成通路中的去饱和酶基因。我们在球拟假丝酵母基因组中,通过基因注释和比对分析,找到两个长链脂肪酸去饱和酶基因,并将其分别命名为desA1和desA2,通过氨基酸序列比对,确定基因组中无其他同源蛋白。对这两个基因分别进行了敲除和过表达。desA1无法被敲除,过表达菌株中desA1基因的表达水平上调程度也不显著,推测其为球拟假丝酵母生长必需基因。desA2的敲除株和过表达菌株均构建成功,C18∶2 DLSL与C18∶1DLSL的峰面积之比为1.22,而ΔdesA2菌株中C18∶2 DLSL与C18∶1 DLSL的峰面积之比为1.08,表明敲除株中的C18∶1 DLSL组分占总槐糖脂的比例增加。
[硕士论文] 李剑南
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:为了提高来自里氏木霉的纤维素酶降解木质纤维素的效率,我们在里氏木霉和毕赤酵母中使用异源表达技术表达并构建了复合型酶系。来自Clostridiumstercorarium的耐热纤维素内切酶Cel9a和经过热稳定性改造的里氏木霉胞内β-葡萄糖苷酶Cel1b-S在里氏木霉中分别使用XYNⅡ和CBHⅠ的启动子和信号肽序列进行了表达分泌。Cel1b-S同样在毕赤酵母GS115中得到了异源表达,经镍柱纯化后与里氏木霉纤维素酶混合,并以微晶纤维素和脱木素玉米芯等木质纤维素作为底物进行了糖化水解测试,对其纤维素降解能力进行了高效液相色谱(HPLC)测定。
  为了更深层次的理解丝状真菌降解木质纤维素的机理,我们尝试对里氏木霉的胞外纤维素酶多聚体进行了纯化。我们使用凝胶过滤色谱(GFC)、疏水作用色谱(HIC)及离子交换色谱(IEC)对分离浓缩后的里氏木霉T1胞外蛋白进行纯化,并对经过纯化后的蛋白样品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN PAGE)进行检测。我们将在接下来的工作中尝试使用冷冻电镜(Cryo-EM)对多聚体结构进行解析。
[硕士论文] 喻乐乐
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:自然界是丰富的生物质资源库。随着化石燃料的枯竭以及生态环境的不断恶化,世界各国的科学家们将目光投向自然界中的可再生资源。利用可再生资源转化获得生物乙醇和生物柴油被寄予厚望。目前,在可再生资源的利用中,酶解法因为温和的反应条件,不产生有毒物质等优点受到青睐。
  目前通过遗传操作改造单一酶组分活性来提高纤维素降解能力是一个有效的途径,但想大幅提高纤维素酶系的纤维素降解能力很难。研究纤维素酶系各组分酶学性质和功能,对于完善纤维素酶系的功能,重构适合不同底物的酶复合物具有重要意义。
  大部分纤维素酶基因为诱导表达基因,在非诱导条件下存在基础性表达。普遍接受的模型是,基础性表达的纤维素酶将外源纤维素降解为纤维寡糖,纤维寡糖进一步诱导纤维素酶基因的表达。除了诱导型基因外,还存在组成型表达的纤维素酶基因,在诱导前期,这些非诱导型纤维素酶与基础性表达纤维素酶一样——将纤维素降解为纤维寡糖,促进纤维素酶基因的诱导表达。鉴定这些纤维素酶的功能,对于纤维素酶基因诱导调控网络的完善具有重要意义。
  本论文的主要研究进展如下:
  1.内切纤维素酶在毕赤酵母中的表达
  设计Cel5B、Cel5D、Cel5E、Cel5F、Cel12A、Cel12B和Cel12C编码基因引物。将酶切位点加在引物的5’端,并在C端添加6-8个His标签。以114-2的cDNA为模板,扩增得到了其中的7个目的片段。通过限制性核酸内切酶处理目的片段和载体,连接构建重组载体。通过电转化的方法将线性化的重组载体转入毕赤酵母。甲醇诱导重组蛋白的表达,并通过SDS-PAGE进行分析,成功获得重组蛋白rCel5B、rCel5E、rCel12A、rCe112B和rCel12C。
  2.重组蛋白的获得和酶学性质测定
  通过亲和纯化获得重组酶蛋白rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCel5B和rCel5E。以刺槐豆胶、木聚糖、CMC-Na、pNPG、pNPX、水杨苷、蔗糖、果胶、淀粉和聚半乳糖醛酸10种底物测定重组蛋白的底物特异性。结果显示,它们均属于纤维素内切酶。rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCel5B和rCel5E降解CMC-Na的比活力分别为2.46 IU/mg、0.97 IU/mg、0.63 IU/mg、2.32 IU/mg和5.07 IU/mg。其中rCel5E降解CMC-Na的能力是rCel5B和rCel12A的2倍,是rCel12B的5.2倍、rCel12C的8.0倍。重组蛋白中,rCel12A的最适温度是50℃,其余4种重组蛋白的最适温度均为60℃。它们的最适pH处于4-6之间,其中rCel5B、rCel5E和rCel12B的最适pH为4,rCel12C的最适pH为5,rCel12A的最适pH则为6。热稳定性实验显示,rCel12A耐热性差,在50℃下保温30 min之后,活力仅为初始的25%。rCel12B在50℃下保温120 min后依然能保持50%的活力。在60℃下保温120 min后,rCel5B和rCel5E依然保持有最初活力的60%-70%,但在70℃下,所有重组内切酶均快速丧失活力。结果显示GH5家族的rCel5B和rCel5E的热稳定性要好于来自于GH12家族的rCel12A和rCel12B。重组内切酶水解再生无定形纤维素(RAC)的结果显示,产物主要为二糖和三糖。
  3.组成型纤维素酶的功能初探
  以草酸青霉114-2为出发菌株,通过同源重组的方式获得Δcel12C、Δcel5E、Δcel5F、Δcel61B和Δcel61C5个单基因敲除株,Δcel112CΔcel5E、Δcel5FΔcel5E、Δcel61BΔcel5E、Δcel61BΔcel5F、Δcel61CΔcel5E和Δcel61CΔcel5F6个双基因敲除菌株。各基因敲除株与野生菌株相比,在葡萄糖、PDA和纤维素培养条件下的表型以及孢子萌发水平未见明显差异。cel12C、cel5E、cel5F、cel61B和cel61C的生物学功能需要继续探索。
[博士论文] 王文爽
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)又称为粘多糖,是由重复单位组成的直链多糖。根据其二糖单位的不同,糖胺聚糖又被分为透明质酸(Hyaluronic Acid,HA),肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate,Hep/HS),硫酸软骨素/硫酸皮肤素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate,CS/DS),硫酸角质素(Keratan Sulfate,KS)。糖胺聚糖常常由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂,主要表现为D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸,糖链中不同部位羟基(-OH)和氨基(-NH2)的硫酸化,以及己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖结构的复杂性赋予其功能的多样性,不同的结构具有不同的功能。
  糖胺聚糖广泛存在于动物细胞表面和细胞基质中,常常通过与各种蛋白的相互作用参与了细胞的增殖分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程。糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子,在医药及功能食品中得到广泛应用,如肝素、硫酸软骨素、透明质酸等。但由于糖胺聚糖结构的不均一性,特别是硫酸化糖胺聚糖结构的高度复杂性,使不同来源和不同批次的同一种糖胺聚糖在活性上存在很大差异。近年来的大量研究表明,糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的,同一多糖链中存在不同结构的功能区,与不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能。因此通过运用底物特异性的糖胺聚糖内切酶选择性的部分降解糖胺聚糖多糖链,制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖;通过运用底物特异性糖胺聚糖硫酸酯酶可以对特性功能区寡糖进行改造和修饰;通过综合运用底物特异性糖胺聚糖内切酶和外切酶可以对特性功能区寡糖进行测序。这些具有特异性的糖胺聚糖工具酶不仅在糖胺聚糖构效关系研究和寡糖制备中具有重要作用,并且在神经系统损伤治疗中也有重要作用。但是目前可以利用的糖胺聚糖工具酶屈指可数,因此寻找新型糖胺聚糖工具酶对于糖胺聚糖构效关系研究具有重要作用。
  海洋作为生命的起源,存在大量的生命形式。海洋中存在大量的结构多样的糖胺聚糖,但是之前并没有相关糖胺聚糖降解酶的研究和报道。本论文以硫酸软骨素为唯一碳源,在海泥中筛选出一株高效降解糖胺聚糖的菌株并进行了基因测序。通过生物信息学分析发现了一系列新型糖胺聚糖工具酶基因,并对这些基因进行了深入研究。主要研究成果包括以下几个方面:
  (a)糖胺聚糖降解菌的筛选:以鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素CS-C为唯一碳源,从海泥中筛选得到15株多糖降解菌,其中编号为FC509的菌株表现为对褐藻胶、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、肝素等多种多糖的降解和利用活性。因此本论文重点对FC509菌株进行研究,通过对其进行全基因组测序和生物信息学分析,发现了一系列与糖胺聚糖降解利用相关的酶基因,并着重对其中的多个降解酶基因进行了深入研究。
  (b)内切型糖胺聚糖裂解酶HCLase的相关研究:将HCLase基因构建到大肠杆菌表达载体中异源表达,并利用镍柱进行纯化。底物降解实验表明:该酶具有高效降解HA和CS的活性,因此被命名为HCLase。基本酶学性质研究表明:HCLase与已报道的糖胺聚糖降解酶不同,其具有嗜盐特性,这与它来源于海洋细菌有关,切表现出良好的温度和pH稳定性。底物降解模式分析表明:HCLase是一个内切型糖胺聚糖裂解酶,最小底物是4糖,最小产物是2糖。同时我们对HCLase不能降解的四糖进行了序列测定,其结构为A4,5HexUAα1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S),这个结果揭示CS糖链中葡萄糖醛酸二位羟基的硫酸化会抑制HCLase对糖苷键的有效切割。HCLase的最大的优点是具有超高的酶活和良好的稳定性,这些特性使其成为具有巨大应用潜力的新型糖胺聚糖工具酶。
  (c)外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的相关研究:将HCDLase基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中异源表达,并运用亲和层析柱对异源表达的酶进行了纯化。酶学性质研究和底物降解模式分析表明:该酶具有典型的外切型酶活性,可以从糖链的还原端有效降解HA、CS和DS,但不能降解Hep和HS,因此被命名为HCDLase。进一步的研究表明:HCDLase可以降解还原端荧光标记的硫酸化CS寡糖并产生二糖,但是不能降解荧光标记的DS和HA寡糖,这说明糖苷键类型和硫酸化程度影响HCDLase的降解活性。最后我们运用这种酶成功的对系列硫酸软骨素六糖和八糖进行了测序。上述一系列研究结果表明:HCDLase作为一个新型的外切型糖胺聚糖裂解酶,在糖胺聚糖的构效关系研究,特别是复杂CS功能寡糖测序中具有重要的应用价值。
  (d)新型内切型糖胺聚糖硫酸酯酶4-O-Endosulfatase的相关研究:将该硫酸酯酶基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中,并进行诱导表达和分离纯化。基本酶学性质研究表明:该酶在最适反应条件(30℃,pH8.0)下具表现出强的CS和DS硫酸酯酶活性;底物降解模式分析表明:该酶与已报道的CS/DS硫酸酯酶不同,不仅可以高效去除糖链端基的GalNAc上4位硫酸基团,而且还可以有效去除多糖链内部的4位硫酸根。多底物降解分析显示:该酶可有效去除多种CS和DS多糖链中的4位硫酸根,去除率在17-65%之间,硫酸基团的去除率与糖链的硫酸化模式密切相关。作为第一个被深入研究的CS/DS内切型硫酸酯酶,4-O-Endosulfatase在CS/DS构效关系研究和糖链硫酸化修饰调节中具有重要应用价值。
[硕士论文] 易路
生物学;细胞生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:α-淀粉酶广泛的分布在动物、植物和微生物中,是当今工业化生产中不可或缺的酶制剂之一。在前期的工作中,本实验室从海洋宏基因文库中筛选到了一个与已知的α-淀粉酶的序列相似性低于20%的新型α-淀粉酶AmyP(归属新的糖苷水解酶亚家族GH13_37)。其与GH13其他亚家族的α-淀粉酶进行氨基酸序列对比发现AmyP的Domain B区域片段大小(26个氨基酸构成)仅为当前报道的GH13其他亚家族α-淀粉酶的Domain B区域的20%左右,序列太短,无法如常见的α-淀粉酶一样形成典型的Domain B结构,行使的功能与目前报道的功能也可能并不一样。因此,对这个特殊的Domain B区域的研究能够丰富人们对α-淀粉酶Domain B区域功能的认识,同时也对深入了解α-淀粉酶AmyP的催化机制提供新的信息。
  为了探索α-淀粉酶AmyP中DomainB区域的功能,我们首先设计了整段区域缺失突变和26个位点单点突变实验,发现缺失突变后AmyP淀粉酶丧失酶活,表明虽然Domain B区域很短但也是AmyP不可缺失的部分。归纳26个位点单点突变后检测的酶学性质,发现突变体对不同底物的酶学活性都整体下降。进一步检测突变体的酶学动力学常数(Km、kcat),发现突变降低了酶的酶学活性主要是因为突变降低了酶的催化反应速率(kcat值明显下降),但对酶的亲和力影响并不明显(Km值变化并不显著)。
  为了进一步探索酶的催化反应速率下降的原因,首先通过文献分析发现Domain B区域的氨基酸可能是通过影响酶的整体结构从而降低酶的催化反应速率。因此,设计了在野生型AmyP的激发光下检测完全变性的野生型AmyP、Domain B区域缺失突变体、多点同时突变突变体(酶学活性下降幅度大的9个位点)、单点突变突变体(酶学活性下降幅度大的9个位点)的散射光值的荧光光谱实验,发现随着对DomainB区域改变的减少,芳香族残基所处的环境变化就越不明显,酶的整体结构变化也就越不明显。因此,Domain B区域的氨基酸轻微的影响酶的整体结构。
  其次,通过文献分析也发现Domain B区域的氨基酸也可能影响酶的催化微环境(解离)从而降低酶的催化反应速率。因此,设计了检测突变体的最适 pH的实验(酶的电离发变化是通过酶的最适pH的变化展现出来),发现突变体的最适pH与野生型AmyP相比发生不同程度的碱性偏移,这表明突变体的酶活下降与酶的电离发生了变化有关。为了进一步验证DomainB区域的氨基酸变化确实影响了酶的电离,检测了突变体与野生型AmyP的电离常数pKa值,发现与野生型AmyP相比突变体的酸解离常数发生了碱性偏移,碱解离常数未发生明显变化,这表明Domain B区域的氨基酸改变确实影响了α-淀粉酶AmyP的电离,进而影响酶的催化反应速率的下降。
[硕士论文] 陈逸文
生物工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是地球上存量最为巨大的生物可再生资源,使用其生产能源物质对人类未来发展的可持续性具有重要意义。纤维素酶能够将纤维素催化水解转化成葡萄糖,可为后续生产生物燃料提供原料。产纤维素酶的生物具有广泛性和多样性,微生物、动物甚至植物都有能产生纤维素酶的种属。纤维素酶的应用十分广泛,在食品、畜牧、纺织、造纸等行业都有很好的应用。海洋环境的特殊性使得海洋微生物能够产生具有新特性的酶。对海洋微生物资源的开发与利用可以极大的丰富微生物酶资源库。
  本研究从舟山市桃花岛附近海域采集的样本中筛选出一株能够产纤维素酶的放线菌。根据菌落形态、生理生化特征和16S基因序列的比对确定该菌是密旋链霉菌Streptomyces pactum。
  对该菌的液体发酵产酶进行了优化研究。发现该菌发酵的最适碳源和氮源分别为麸皮和NH4NO3,然后对培养基组分进行显著性分析,发现麸皮、K2HPO4、吐温-80是影响产酶的显著因素。对这三个显著因素进行了响应面分析,根据分析结果确定了最佳的培养基成分。同时又结合遗传算法通过BP人工神经网络方法优化了培养基组分。最后基于最佳配比培养基研究确定的发酵条件为:发酵温度30℃,接种量5%,摇瓶装液量70 mL/150 mL,转速200 r/min,起始pH7,在168小时酶活达到最高值为0.455 U/mL,酶活提高了97.82%。
  对该菌液体发酵所得的酶液进行了浓缩、硫酸铵分级沉淀、脱盐处理后得到初步纯化的纤维素酶液。对该酶液的CMC酶活性质的研究表明显示,该酶最适反应温度为60℃,在pH6-7有最高的酶活性,一定浓度(≤0.6%)的NaCl对酶活有提高作用,在NaCl浓度为2%的情况下酶活比不含NaCl的情况下提高了1.19倍;50℃以下酶的稳定性良好;低浓度(5 mmol/L)的K+、Mg2+、Zn2+对酶活有促进作用,Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+有较强的抑制酶活作用,高浓度(10mmol/L)时K+、Mg2+对酶活有促进作用,Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+对酶有抑制作用,该酶具有良好的耐碱性、耐热性和耐盐性,在工业应用领域有一定的应用前景。
[硕士论文] 安翠英
微生物学 合肥工业大学 2017(学位年度)
摘要:大肠杆菌Nissle1917(EcN)是一种肠道益生菌,血清型为O6∶K5∶H1。在肠道中,EcN可以通过胞外的荚膜多糖抑制病原菌的定殖。此外,EcN荚膜多糖的主要成分是抗凝血药物肝素的前体物质,因此研究EcN荚膜多糖的合成途径具有重要的意义。
  本课题主要利用分子生物学技术,研究EcN菌株的荚膜多糖合成基因kfiA的功能,分析荚膜多糖的生物合成机理。提取、纯化EcN荚膜多糖,并通过1H核磁共振检测。确定了荚膜多糖的特征峰的化学位移约为2ppm。其次,通过λ-red重组系统成功构建kfiA突变株,对突变株的生长曲线进行测定发现kfiA基因的缺失并未明显影响菌体的生长。利用1H核磁共振检测EcN和EcN△kfiA的荚膜多糖,发现kfiA缺失株不能合成荚膜多糖。
  为了对该结论进行进一步验证,我们又对kfiA突变株进行基因回补。再次利用核磁共振检测EcN、EcN△kfiA、EcN△kfiAIntΦ80∷pAH162-KpsMP-kfiA以及EcN△kfiA IntΦ80∷pAH162的荚膜多糖,发现只有kfiA基因存在时,EcN菌株才能合成荚膜多糖。
[硕士论文] 刘雪娥
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)作为主要的生防真菌防治斜纹夜蛾等害虫具有明显优势因而受到人们的关注,但由于莱氏野村菌产孢条件苛刻,分生孢子抗逆性差、存储期短、防效不稳定等缺点限制了其大规模的生产和应用。研究证实微菌核可以替代分生孢子作为有效的活性成分,并且微菌核与分生孢子相比具有抗逆性强,耐储存等优点。前期研究发现高浓度的铁元素有利于微菌核的形成,因此研究莱氏野村菌的铁储存和代谢对于进一步明确莱氏野村菌微菌核形成的分子机理具有重要意义。
  本文首先克隆了莱氏野村菌中的液泡铁转运因子NrCccA和NrCccB的编码基因。在不同浓度铁离子存在条件下各基因的表达特征分析,发现微菌核形成过程中在100mg/L FeSO4中NrCccA和NrCccB基因的表达量最高。在高铁浓度诱导下,NrCccA基因短时间内大量表达。微菌核形成过程中表达谱分析发现 NrCccA和NrCccB基因随着微菌核的形成表达量逐渐上升。
  生物信息学分析发现NrCccA和NrCccB基因全长分别为819bp和828bp,两个基因无内含子,分别编码272和275个氨基酸;等电点分别为6.71、4.73;分别编码的多肽分子量为29.3KDa、29.5KDa,NrCccA蛋白含有4个跨膜结构域,且没有信号肽,NrCccB蛋白含有5个跨膜结构域,无信号肽。蛋白同源序列比对和蛋白保守结构域预测结果显示NrCccA和NrCccB蛋白均属于Ccc1-like家族,两者为同源序列,可能发挥相似的功能。蛋白系统进化树构建结果显示:NrCccA和NrCccB蛋白与绿僵菌属(Metarhizium anisopliae)和厚孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)亲缘关系较近。
  采用同源重组策略进行这两个基因的单敲除得到了NrCccA和NrCccB基因的敲除突变体。各敲除突变体的表型结果分析发现NrCccA敲除转化子铁离子耐受性降低。NrCccA和NrCccB突变菌株的刚果红抗逆性显著降低,对H2O2、高渗透压以及Mn2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+以及SDS、山梨醇抗逆性无影响。NrCccA和NrCccB敲除突变体的分生孢子萌发率显著下降。NrCccA和NrCccB突变菌株微菌核形成过程中生物量和微菌核形成数量稍有下降;但NrCccA和NrCccB敲除突变体微菌核干燥后吸水萌发速率以及产孢量显著降低。NrCccA和NrCccB敲除突变体无毒力变化。
  在微菌核形成过程以及高铁浓度诱导下,NrCccA基因缺乏,NrCccB基因的表达量稍有下调,NrCccB缺乏,NrCccA在微菌核形成过程中稍有下调,但在高铁浓度诱导下,NrCccA显著上调表达。NrCccA和NrCccB突变菌株中控制铁载体合成基因NrSidA和线粒体内利用铁离子相关基因NrMrs3的表达特征分析发现,NrCccA和NrCccB缺乏,引起NrSidA和NrMrs3基因的上调表达。
  综上所述,NrCccA和NrCccB基因在微菌核形成、抗逆性以及萌发方面发挥重要的作用,NrCccA能够应对高铁刺激,且与NrCccB协同作用。研究为液泡铁储存途径的研究提供一定的基础数据,但对铁调控途径需要进一步研究。
[硕士论文] 陈星
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:真菌细胞壁涉及细胞附着,形态建成等多种生理功能。细胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病过程中发挥着非常重要的作用。荧光增白剂高度敏感蛋白cwh具有维持细胞壁完整性的功能,这一现象仅在酿酒酵母中有报道,在致病真菌中尚无该类基因的研究和报道。昆虫病原真菌具有独特的体壁侵染方式,细胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病过程中发挥着十分重要的作用。本研究以蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)为实验材料,通过同源重组的方法构建该基因的敲除及回复菌株对该基因进行功能研究。获得了以下实验结果:
  1.Macwh1和Macwh2生物信息学分析
  根据蝗绿僵菌基因组序列设计引物,克隆得到Macwh1和Macwh2基因,生物信息学分析表明Macwh1与Macwh2编码的氨基酸序列无同源性。其中Macwh1登录号为XP_007815818,编码957个氨基酸,等电点为7.02,蛋白质分子量为107.02KDa,基因组含7个内含子。Macwh2登录号为XP_007808921,编码的氨基酸133个,等电点为9.48,蛋白质分子量为13.85KDa,基因组含2个内含子。
  2.Macwh单敲除及回复菌株、Macwh1-Macwh2双敲除菌株的获得
  为了研究蝗绿僵菌Macwh1和Macwh2的功能,利用同源重组的方法构建了各基因的敲除载体,并在此基础上构建了回复载体。利用农杆菌介导转化蝗绿僵菌,经抗性筛选PCR验证筛选及Southen杂交验证,得到正确的敲除菌株和回复菌株。
  3.Macwh的缺失导致蝗绿僵菌毒力降低
  以东亚飞蝗五龄虫为实验材料,对其进行体表点滴和体内注射接种实验。实验结果表明:体表点滴实验中敲除菌株的毒力都显著低于野生型回复菌株,并且蝗虫血液中虫菌体数量显著减少;而注射实验表明,各敲除菌株与野生型和回复菌株相比,毒力并无显著差异。对毒力机制研究的结果表明Macwh的缺失不影响蝗绿僵菌孢子在蝗虫后翅上萌发,而影响附着胞的形成率及其膨压。Macwh通过调控与体壁穿透相关基因的表达量进而影响毒力。
  5.Macwh影响细胞壁的完整性及抗逆性
  对细胞壁组分和结构分析发现,各敲除菌株中几丁质、甘露糖蛋白含量的显著低于野生型,而β-1,3-葡聚糖含量与野生型相比无显著差异;透射电镜表明,各敲除菌株细胞壁变薄。RT-PCR检测表明,与孢子细胞壁完整性相关基因中几丁质合成酶基因的表达显著下调,孢子疏水性测定实验表明,各敲除菌株孢子的疏水性降低,孢子表面疏水蛋白基因的表达量也显著下调。在加入了细胞壁破坏剂(CFW)的1/4SDA培养基上,敲除菌株的菌落显著小于野生型,表明对细胞壁破坏剂敏感;紫外照射处理后,敲除菌株与野生型相比孢子萌发率显著降低,通过qRT-PCR对紫外相关基因如phr1,uve-1等基因的转录水平进行检测发现,各敲除菌株中phr1,uve-1的表达量均显著下调。结果表明Macwh影响了细胞壁的完整性,Macwh通过影响与抗紫外相关基因的表达量,进而影响对紫外的耐受性。
  综上所述,Macwh在蝗绿僵菌侵染致病过程的侵染阶段及细胞壁完整性发面具有十分重要的作用。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部