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[硕士论文] 刘雅欣
细胞生物学 山东师范大学 2017(学位年度)
摘要:猪瘟(Classical swine fever,CSF),别名猪霍乱,俗称“烂肠瘟”,是猪的一种高感染性的疾病,致死率高达90%以上,是威胁养猪业的主要传染病之一。猪瘟的爆发会导致严重的经济损失,被世界动物卫生组织列为A类传染病,受到了各个国家的高度重视,成为了各个国家研究的热点。猪瘟的病原猪瘟病毒是一种包膜病毒,大小约40-60nm,它的基因组大小约12.3kb,是单股正链RNA,包含了一个大的开放阅读框(ORF),一个5'非编码区(5'UTR)和一个3'非编码区(3'UTR)。ORF能够编码大约3900个氨基酸的多聚蛋白,然后在信号肽酶等作用下产生12个成熟蛋白,顺序依次为Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4 A-NS4B-NS5A-NS5B。其中,C、Erns、E1、E2为4个结构蛋白,Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NA4B、NS5A、NS5B为8个非结构蛋白。
  本研究分为两个部分:第一部分根据实验室已构建的猪瘟病毒感染性的cDNA,通过插入CMV启动子和锤头状核酶构建了重组质粒 pMC18-CMV-HM-CSFV,并用于猪瘟病毒的拯救。为了验证锤头状核酶的功能,我们构建了pGL2.0-CMV、pGL2.0-CMV-HM、pGL2.0-C MV-HM'和 pGL2.0-CMV-HM-5'UTR四个质粒。通过双荧光素酶报告基因检测系统和实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting Syste m,QPCR)检测发现,重组质粒转染进细胞后,锤头状核酶能够发挥约62%的剪切作用。经过QPCR检测后发现,改造后的质粒 pMC18-CMV-HM-CSFV通过转染进细胞成功拯救出了病毒。本研究为猪瘟疫苗的发展奠定了基础。第二部分探究了猪瘟病毒C蛋白与5'UTR的关系。在实验室的前期研究中发现,猪瘟病毒的C蛋白对3'UTR具有调节作用。为了确定C蛋白与5'UTR之间是否存在相互作用关系,我们分别构建了双荧光素酶表达质粒pMIR-5'UTR-RLUC和pMIR-RLUC。通过双荧光素酶报告基因检测系统检测证明,pMIR-5'UTR-RLUC转染进细胞后,5'UTR能够发挥相应的作用。将猪瘟病毒C蛋白的真核表达载体pCMV-C与5’UTR 的真核表达载体pMIR-5'UTR-RLUC共转染至PK-15细胞,然后通过western blotting检测、实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System)和双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)证明,C蛋白与5'UTR之间不存在相互作用关系。本部分研究为探究猪瘟病毒蛋白对5'UTR功能的影响奠定了基础。
[硕士论文] 马磊
兽医 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:细小病毒科(Parvoviridae)分为细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓核病毒亚科(Densovirinae)。人博卡病毒1型(Human bocavirus1,HBoV1)属于细小病毒亚科博卡病毒属,该病毒可引起6~24个月婴幼儿下呼吸道感染,它是在细小病毒B19之后的第二种对人类致病的细小病毒。VP3是HBoV1的主要衣壳蛋白,在缺少核酸的情况下能够自组装形成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),可应用于HBoV1的致病机理、流行病学检测、疫苗以及基因载体等方面的研究。本文以HBoV1 WHL-1(NCBI登录号:GU139423)的基因序列设计引物,用实验室前期构建的pWHL-1质粒为模板,通过PCR扩增获得VP3目的基因,并将其分别克隆到原核表达载体(pET-28a、pMAL-c2X、pGEX-KG)和毕赤酵母表达载体(pPICZαA)上,诱导融合蛋白表达,纯化后得到了目的蛋白 VP3,并探索其组装成VLPs的条件。
  本研究主要内容包括:⑴将VP3基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-VP3,然后将其转化 DE3(BL21)感受态中,经 IPTG诱导表达融合蛋白,大小在70kDa,最佳诱导表达条件为20℃、IPTG诱导浓度0.6mmol/L、诱导时间为20h,用超声破碎得到表达产物融合蛋白在沉淀中,为包涵体。⑵将VP3基因克隆到原核表达载体pMAL-c2X,得到重组质粒pMAL-c2X-VP3,最佳诱导表达条件为28℃、IPTG诱导浓度0.8mmol/L、诱导时间24h,表达产物融合蛋白大小在100kDa,表达产物为可溶性蛋白。使用MBP标签的亲和层析树脂,纯化后得到融合蛋白浓度为1mg/mL,用Factor Xa蛋白酶酶切得到了42kDa的MBP标签蛋白和30kDa的目的蛋白,并用Western Blot检测得到的目的蛋白为阳性,但大小不符。⑶将VP3基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,得到重组质粒pGEX-KG-VP3,最佳诱导表达条件为28℃、IPTG浓度0.6mmol/L、诱导20h,诱导表达的融合蛋白大小在86kDa,超声破碎得到融合蛋白为可溶性蛋白。使用GST标签的亲和层析树脂,用牛凝血酶柱上酶切,纯化后得到浓度为0.5mg/mL的目的蛋白,大小60kDa,并用Western Blot检测得到的蛋白为阳性。取纯化过的目的蛋白进行超滤透析制备VLPs,用超高速离心机离心后取样,负染后用透射电镜观察 VLPs为球形颗粒,大小约20nm。⑷将VP3基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA-VP3,将其转化到酵母感受态X-33后,经1%终浓度的甲醇诱导4d后表达目的蛋白,蛋白并没有被分泌到胞外,取沉淀离心收集,用PBS重悬,超声破碎,目的蛋白表达在上清中,经Western Blot检测,得到的目的蛋白为阳性,大小在70kDa,蛋白分子量变大。
[硕士论文] 易灵娴
基础兽医学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:mcr-1基因是迄今为止国际上首次发现的质粒介导的黏菌素耐药基因,可介导肠杆菌科细菌对多粘菌素类药物产生耐药,并可通过质粒或其他可移动原件在不同来源菌种间快速、广泛地传播,严重威胁人类健康和公共安全。本研究对食品动物中mcr-1阳性沙门菌进行研究,研究mcr-1基因在动物源沙门菌中的传播机制。本文对2013~2014年分离自5个屠宰场的142株动物源沙门菌采用PCR方法检测mcr-1基因,结果显示21株(14.8%)沙门菌携带有mcr-1基因,包括19株鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)、1株德尔卑沙门菌(Salmonella Derby)和1株伦敦沙门菌(Salmonella London)。采用琼脂稀释法和微量稀释法测定21株mcr-1阳性沙门菌株对13种抗菌药物的敏感性。结果显示 mcr-1阳性沙门菌的黏菌素最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)值介于1~2 mg/L之间,80%以上的mcr-1阳性菌对复方新诺明、氨苄西林、庆大霉素、链霉素、氟苯尼考和四环素耐药,对环丙沙星的耐药率为76.2%,所有阳性菌株都呈现不同程度的多重耐药现象。采用PCR方法检测21株沙门菌中的其它耐药基因。结果显示,分别有20和19株沙门菌携带floR和oqxAB基因。
  本研究主要内容包括:⑴采用多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)对mcr-1阳性菌株间进行亲缘性分析。结果显示大部分菌株存在克隆传播关系,其中19株鼠伤寒沙门菌均为ST34型。由于多次接合转移试验失败,最终通过化学转化试验获得3株转化子,采用 PCR方法检测转化子中其他耐药基因的携带情况,发现3株转化子同时携带oqxAB和floR耐药基因。采用PCR-mapping方法对mcr-1基因上下游侧翼序列进行分析,发现21株沙门菌中 mcr-1基因的上游均检测到插入序列ISApl1。⑵对21株mcr-1阳性沙门菌及3株转化子进行S1-PFGE和Southern杂交,除一株菌外,mcr-1基因多定位于一~180 kb的质粒上。通过高通量测序分析SH138(ST34鼠伤寒沙门菌代表株)全基因组DNA、SH36(海德堡沙门菌)和HNZ319S(伦敦沙门菌)转化子中的mcr-1阳性质粒序列,结果显示三株沙门菌中mcr-1均位于一IncH I2-F4:A-:B5质粒,具有典型的IncHI2型质粒骨架和部分 IncF型质粒骨架,且质粒多重耐药区中包含有多种耐药基因,包括oqxAB、floR、sul1、cmlA和aadA2。
[硕士论文] 邓英华
兽医 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:获得性免疫缺陷综合征又称为艾滋病,是一种由免疫缺陷病毒引起的严重致死性的免疫系统的疾病。由于该病复杂的发病机制等因素无法获得相关的动物模型。许多研究表明APOBEC3G是重要的抑制逆转录病毒感染的限制因子。载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like protein3 protein G, APOBEC3G)具有胞嘧啶脱氨酶活性。在逆转录反应中,APOBEC3G通过催化病毒负链cDNA中的胞嘧啶脱氨尿嘧啶,引发基因组大量碱基超突变进而发挥抗病毒作用。而HIV-1编码的VIF蛋白可经泛素-蛋白酶体的降解途径来拮抗APOBEC3G的抗病毒活性。CRISPR/Cas9经过修饰后成为了可高效特异性识别和切割的基因组编辑工具。当外源体入侵机体时,机体会识别外源片段同时CRISPR序列会记忆RNA,当噬菌体等入侵第二次时机体会自动识别,CRISPR系统的Cas酶就在识别处切割基因组,从而达到编辑作用。而这种技术在人为修改后被用于目的基因的靶向切割,起到修饰基因改变蛋白表达的作用。
  本研究主要内容包括:⑴在APOBEC3G上构建有效的sgRNA。首先,培养了两批野生株食蟹猴胚胎成纤维细胞,设计引物进而获得它们第六外显子的序列,再将两者多次反复进行比较得到第六外显子SNP。再与NCBI上的进行比较,最终得到第六外显子确切序列,运用CHOPCHOP等软件设计多个sgRNA,在体外验证设计靶位点的活性。发现sgRNA1和sgRNA3的体外靶位点活性较强,合成相应的质粒。⑵在食蟹猴胚胎成纤维细胞上验证敲除。使用合成的质粒和lopi3000转染进行细胞上的转染,并且进行抗性筛选后增殖细胞数量,得到的应该均为转染进去的细胞,提取基因组片段扩增后进行酶切检验后送测序。发现转染后的细胞有荧光并且酶切检验的时候看到明显的酶切片段,送测序后对比发现在设计的靶位点sgRNA1和sgRNA3附近均发生敲除。⑶在食蟹猴胚胎上验证基因敲除。结合靶位点的活性和细胞敲除的情况,选定了sgRNA3作为在胚胎上验证的靶点序列。体外合成sgRNA3和Cas9的mRNA混合后,运用胚胎注射技术注射17枚胚胎,培养后检验敲除的情况。发现sgRNA3在胚胎上同样发生敲除。
[硕士论文] 黄建蓉
水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:运城盐湖是一个古老而又典型的内陆咸水湖,富含丰富的芒硝(主要成分硫酸钠)资源,是研究嗜盐细菌多样性的理想对象。嗜盐细菌作为一类极具基础研究价值和应用前景的微生物资源,凭借其特殊的生理结构、代谢机制、种群类群、遗传基因和独特的代谢产物受到国内外学者的广泛关注。本研究通过免培养和纯培养技术相结合的方式,探究适合运城盐湖嗜盐细菌的分离技术,系统地开展该生境嗜盐细菌的分离鉴定、物种多样性研究,并从中筛选出具有纤维素酶和木聚糖酶活性的功能菌株。Biolog ECO法是一种以微孔板碳源利用为基础的定量分析方法,可简单、快速地描述微生物群落代谢特征。通过AWCD曲线、底物代谢差异、多样性指数以及主成分分析,对运城盐湖环境10个代表性样点微生物群落多样性和代谢特征进行了研究。结果表明,运城盐湖10个样点微生物群落可分为三种代谢类型。同时也预测出用于运城盐湖环境微生物分离的“有效分离底物类型”:糖类和酯类为底物碳源的分离培养基;氨基酸类和胺类为底物碳源的分离培养基。
  本研究采用高通量测序技术对运城盐湖嗜盐细菌多样性进行了分析,24个样品共得到原始序列705,689条,注释到16,877个OTU,平均长度在396 bp左右。通过QIIME平台分析可注释得到30个门,其中主要包括:厚壁菌门(Firmicutes,47.6%),变形菌门(Proteobacteria,35.6%),拟杆菌门(Bacteroidetes,3.7%),放线菌门(Actinobacteria,3.6%)和Bacteria Other(2.9%)。PCoA分析、CCA分析结果表明,这24个样品中的嗜盐细菌可分为3大类群,其中影响微生物类群差异的理化因子主要是Ca2+和Fe2+。比较同一个盐湖不同盐浓度样点的嗜盐细菌群落组成变化,发现靠近盐湖中心的两个样点中存在的嗜盐细菌群落组成较为相似,而远离盐湖中心的两个样点的嗜盐细菌群落组成较为相似。同时在运城盐湖中也检测到了大量的经典嗜盐类群、极端微生物类群和具有特定功能的微生物类群信息。综合群落代谢特征、理化参数等结果,设计出五类10种分离培养基用于分离运城盐湖10个样点环境中的嗜盐细菌。结果表明,共分离出1,033株嗜盐细菌,形态去重复后,测序得到605株嗜盐细菌信息。经鉴定这些菌株分属于放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的7个纲,18个目,41个科,82个属以及52个潜在新分类单元。分析表明,分离培养基的营养成分、添加的盐浓度以及不同的样点对微生物的分离有着显著的影响。通过形态学、生理生化特征、化学组成和系统发育分析等研究,对2个新物种(Halomonas haloduranssp.nov.和Paracoccus halotolerans sp.nov.)开展多相分类鉴定,确定了这2株候选新物种的分类地位。纤维素类和半纤维素类物质是地球上产量巨大而又未得到充分利用的可再生资源。通过刚果红染色法对分离得到的1,033株嗜盐细菌进行纤维素酶和木聚糖酶活性菌株筛选,分别获得32株具有纤维素酶活性和49株具有木聚糖酶活性的菌株,活性菌株筛选阳性率为3.1%和4.7%,其中12株菌兼具纤维素酶活性和木聚糖酶活性。在分离培养基中添加功能底物可以增加功能菌株的获得。
[硕士论文] 张晓杰
生物学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:稻瘟病菌侵染以水稻为主的众多重要农作物,同时也是研究丝状真菌的生长、发育和发病机理的重要模式生物。内吞途径对稻瘟病菌致病性的影响逐渐被证明,在真核生物中,从真菌到植物和动物, HOPS复合体(Vps11、Vps16、Vps18、Vps33、Vps39和Vps41)对同型液泡融合、液泡生成和胞吐运输具有重要作用。然而,它在稻瘟病菌中的功能尚未被研究。
  本研究搜索到酵母Vps41在稻瘟病菌中的同源蛋白,并对该基因(MGG_03313.7)进行敲除,实验结果证明它是稻瘟病菌液泡分选蛋白41(MoVps41),也是HOPS复合体的一个亚基。MoVps41蛋白的缺失导致稻瘟病菌的有性生殖和无性生殖受阻,生长速率减慢,对水稻叶片、大麦叶片和水稻根部丧失了致病性;MoVps41蛋白缺失导致液泡碎片化,丧失了对胞内过量金属离子的解毒作用;胞外抑制剂测试试验表明MoVps41蛋白的缺失对细胞壁的敏感性、细胞膜的渗透压和囊泡运输造成了严重的影响。
[硕士论文] 李育霖
兽医 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:尼帕病毒(Nipah Virus, NIV)是一种新型人兽共患病毒,以其独特的基因组结构、较强的致病性、广泛的宿主范围等特点区别于副粘病毒科其他成员。2011年2月,国际病毒分类委员会将NIV列为副粘病毒科新成员,与亨德拉病毒共同组成副粘病毒亚科,即亨尼病毒属。该病毒经蝙蝠传播,引起人和多种动物发病,具有较强的致病力和致死性,美国疾病预防控制中心将其定为生物安全四级(BSL-4)病原体。F蛋白和G蛋白是NIV的囊膜结构蛋白,二者相互作用共同介导病毒与细胞发生融合,是病毒发挥毒力作用的关键蛋白,但其相互作用机制尚未被完全揭示。此外,两蛋白都具有良好的抗原表位暴露性,可刺激机体产生相应的中和抗体。本文以F、G蛋白为研究对象,通过构建重组原核表达质粒,短时高效的表达重组 F、G蛋白,并以此作为免疫原分别免疫 BALB/c小鼠,利用单克隆抗体技术制备针对F蛋白和G蛋白的单克隆抗体。同时,用原核表达的重组F、G蛋白免疫兔子,制备兔源多克隆抗体。最后,以兔多抗为拟阻断剂,通过阻断ELISA方法检测所得单克隆抗体的阻断活性,为建立NIV的诊断方法奠定基础。
  本研究主要内容包括:⑴通过生物软件分析预测,分别截取并克隆 F、G基因的特定序列,进一步完成重组表达质粒p28a-F、p28a-G的构建,将其转化于大肠杆菌BL-21中,并经IPTG诱导后成功表达出重组蛋白p28a-F和p28a-G。⑵将成功表达并纯化后的F、G重组蛋白与弗氏完全(不完全)佐剂等体积混合,充分搅拌后通过皮下注射的途径免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、HAT选择培养、细胞亚克隆及间接ELISA方法筛选出能稳定分泌针对F、G蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。最后得到两株可稳定分泌抗NIV-F蛋白的单克隆抗体,分别命名为:A8、C12;得到三株可稳定分泌抗NIV-G蛋白的单克隆抗体,分别命名为:14-G6、15-D9、15-D11。经鉴定,以上五株单克隆抗体均具有良好的特异性和敏感性。⑶以兔多抗为拟阻断剂,通过阻断ELISA检测方法进一步筛选具有阻断活性的单克隆抗体。最后筛出一株具有阻断活性且能稳定分泌针对NIV-G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为15-D11。
[硕士论文] 刘朝霞
兽医 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)引起的急性人畜共患传染病。JEV主要有三种免疫保护性抗原,包括prM、E和NS1,能够诱导保护性免疫,其中NS1蛋白是病毒的非结构蛋白,在病毒生命周期和致病中起重要作用,NS1蛋白单克隆抗体可以通过Fc片段激活补体途径产生保护力,因而不会引起抗体依赖性增强作用,具有更高的安全性。本研究利用杆状病毒表达系统表达出NS1蛋白并制备了抗NS1蛋白的单克隆抗体,采用攻毒保护实验确定2F6 Mab对感染小鼠产生部分保护作用。为进一步研究JEV NS1保护性单克隆抗体的靶向表位及其抗黄病毒免疫中的功能和开发JEV新型疫苗研究奠定了基础。
  本研究主要内容包括:⑴以本实验室保存的JEV P3毒株反转录为cDNA,并以此为模板,经PCR方法扩增出NS1基因片段,成功构建了表达NS1蛋白的重组杆状病毒,SDS-PAGE分析结果显示重组的NS1蛋白在杆状病毒表达系统中得到大量表达,并部分以可溶形式存在。之后利用Ni-NTA亲和层析法对该蛋白进行了纯化,将纯化蛋白免疫BALB/C小鼠,通过细胞融合和间接ELISA及亚克隆技术,筛选杂交瘤细胞株,得到8株可稳定分泌抗JEV NS1蛋白的特异性单克隆抗体。通过IFA验证和Western Blot分析,结果表明获得的8株单抗均与NS1蛋白产生良好的反应。⑵腹腔注射绝对致死剂量的JEV P3组织毒,攻毒后第2天进行尾静脉单抗注射,观察并记录各组小鼠存活情况,结果显示,攻毒第4天小鼠开始出现精神萎靡,生长停止,被毛杂乱无光泽,个别出现明显的神经症状。第5天开始其他单抗组及对照组均出现明显的神经症状,部分小鼠开始出现死亡,第6-9天为小鼠死亡高峰期,最终结果显示,2F6单抗组存活率为40%,5H2单抗组小鼠存活率为20%,其他各单抗组及PBS组小鼠存活率为0%,表明所筛单抗2F6和5H2能对感染小鼠产生部分保护作用。⑶在已获得JEV NS1保护性单抗的基础上,通过设计特异性引物扩增抗NS1单克隆抗体可变区基因,对可变区序列进行分析,经重叠PCR法将扩增正确的轻链可变区与重链可变区进行连接,然后将其转入大肠杆菌表达系统,成功表达出scFV蛋白,SDS-PAGE和Western Blot验证表达的单链抗体分子量为27KDa。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性scFV蛋白表达产物进行纯化,成功获得目的蛋白,采用间接ELISA对其活性检测,结果显示该scFv能够与NS1蛋白特异性结合,但其活性比单克隆抗体结合能力低。
[硕士论文] 熊洁
药物分析学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:化学发光法(Chemiluminescence,CL)和荧光法(Fluorescence,FL)都属于分子发光分析法。CL不需要激发光源,因此具有设备简单,背景信号低,灵敏度高和线性范围宽等优点。FL仪器的激发光源和检测器不在一条直线上,所以具有信噪比高、检测限低等优点。CL和FL结合分子识别试剂偶联磁性微粒可以有效地简化前处理过程和消除基质干扰,还可以进一步提高检测灵敏度和准确度,非常适用于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)的检测。本文利用分子识别试剂免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)和噬菌体肽(Phage-displayed peptide,PDP)对金黄色葡萄球菌的特异性识别作用,结合磁分离技术分别建立了金黄色葡萄球菌的竞争化学发光检测法和夹心荧光检测法。
  本研究主要内容包括:⑴基于SPA与IgG结合作用,构建竞争式 CL,直接检测金黄色葡萄球菌。SPA可以与IgG的Fc片段结合。SPA存在于大多数的金黄色葡萄球菌的表面,而在其它细菌的表面不存在或是存在的量非常少,使得金黄色葡萄球菌与 IgG的结合具有一定的特异性。表面偶联SPA的磁珠与金黄色葡萄球菌两者共同竞争辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的IgG(HRP-tagged IgG)。磁分离之后,在固相中加入共反应试剂鲁米诺和过氧化氢,测定化学发光信号。实验结果表明在最优条件下,金黄色葡萄球菌的浓度在1.0×101-1.0×109 cfu mL-1范围内与化学发光强度呈现良好的线性关系,检测限是6.0 cfu mL-1(信噪比为3)。该方法具有快速检测、特异性好、灵敏度高、价格低廉、易于操作等优点,有望应用于临床检测、药品安全、食品安全和环境监测等领域。⑵利用两种多肽构建夹心FL,直接特异性检测金黄色葡萄球菌。我们选用噬菌体肽作为目标菌的特异性识别试剂,并用异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)修饰的抗菌肽magainin I(FITC-tagged magainin I)制备高灵敏的荧光探针。同时,利用噬菌体肽偶联磁性微粒从样品中分离、捕获和富集金黄色葡萄球菌,从而减少基质对荧光检测的干扰并且提高检测灵敏度。与噬菌体、抗体相比,噬菌体肽和抗菌肽具有性状稳定、价格低廉、易于合成和修饰等优点。实验结果表明金黄色葡萄球菌的浓度在1.0×101-1.0×105 cfu mL-1范围内与荧光信号呈现良好的线性关系,检测限为9.0 cfu mL-1(信噪比为3)。该方法可以通过替换特异性噬菌体肽,实现对其它病原菌的检测。
[硕士论文] 李成功
生物学;细胞生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)已知包括五种亚型,其中四种会导致人类和其它哺乳类发生严重致死的出血热疾病,被称为埃博拉病毒病。该病毒于1976年首次被发现。2013-2015年,西非爆发了最新一次的埃博拉病毒疫情,截止到2017年2月,全球已确认感染埃博拉病毒28616人,造成11310人死亡,死亡率达39.5%。人类感染病毒后,病毒可在全身各组织器官中分布,造成多部位出血以及器官坏死,严重者导致患者死亡。由于其感染性强,传播速度快,致死率高,世界卫生组织(WHO)将其列为“第四级病毒”。EBOV是一种非节段性的单股负链RNA病毒,基因组大小约19kb,顺序为3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’,编码包膜蛋白(GP)、N蛋白(NP)、L蛋白(L)、病毒蛋白(VP30、VP35)和基质蛋白(VP40、VP24)以及非结构蛋白sGP、ssGP等。目前已经发现埃博拉病毒蛋白可与多种宿主蛋白相互作用进而阻断干扰素应答,抗原呈递,RNAi抗病毒应答,体液免疫,T细胞依赖的B细胞应答,细胞免疫等多种过程。但其具体入侵、复制及致病致死机制尚不明确。酵母双杂交系统(Yeast Two-Hybrid System)是Fields和Song等于1989年首次提出的。该方法运用真核生物转录因子GAL4的DNA结合结构域(DNAbinding domain,BD)和转录激活结构域(DNA transcription activation domain,AD)分别标记病毒蛋白和宿主蛋白,当二者存在相互作用时启动下游报告基因表达,进而筛选出相互作用对。
  本研究运用酵母双杂交技术从人肝cDNA文库中筛选出与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,用于研究GP、VP30、NP、L蛋白在埃博拉病毒感染和致病过程中发挥的作用,为进一步解释埃博拉病毒的致病机理提供依据。以本实验室保存的埃博拉病毒RNA为模板,反转录成cDNA。用重组PCR技术构建诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L。诱饵质粒转化至酵母感受态细胞Y2HGOLD中,进行毒性检测以及自活化试验。阳性对照质粒和阴性对照质粒进行对照实验,确保酵母双杂交系统可用。文库滴度测定,保证人肝cDNA文库符合酵母双杂交的滴度要求。将诱饵菌株与人肝 cDNA文库菌株进行杂交,在DDO/X/A筛选平板上初次筛选,然后将筛选到的阳性克隆在QDO/UA筛选平板进一步筛选,对筛选到的阳性克隆进行DNA测序和生物信息学分析。利用酵母回复性实验进一步验证,排除假阳性结果。共筛选出6个可能与GP、VP30、NP、L蛋白有相互作用的宿主蛋白,分别是铜代谢结构域蛋白1(COMMD1)、白蛋白(ALB)、脂蛋白-a-Ⅱ(APOA2)、蛋白酶调解因子8(PSMD8)、结合珠蛋白(HP)、细胞色素P4502E1(CYP2E1)。酵母回复性实验进一步说明了COMMD1和APOA2与NP蛋白可能存在相互作用。通过酵母双杂交系统筛选出了6个可能与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,分别是COMMD1、ALB、APOA2、PSMD8、HP、CYP2E1。为进一步研究埃博拉病毒的致病机理提供了参考。
[硕士论文] 景凤霞
微生物学 河北大学 2017(学位年度)
摘要:本论文共包括两部分研究内容,第一部分对本实验室分离自菊三七属植物的菌株HBUM179779T、HBUM179663T和分离自污泥的菌株3-BNT进行多相分类研究;第二部分通过在VL55基础培养基中添加6种不同的营养因子,利用常规稀释和大量稀释对土壤中的微生物新物种进行分离。获得以下成果:
  菌株HBUM179779T属于噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)的一个新属,革兰氏阴性,细胞呈短杆状,具有周生鞭毛,大小为0.2-0.4μm×1.4-1.6μm。根据16S rRNA基因序列同源性比对,菌株 HBUM179779T与根际假黄杆菌( Pseudoflavitalea rhizosphaerae) T16R-265T的亲缘关系最近,序列相似性为94.46%。基因组DNA(G+C)mol%含量为47.1%。甲基萘醌种类为MK-7。主要脂肪酸类型为iso-C15:1 G、iso-C15:0和iso-C17:03-OH。主要磷酸类脂有PE和两个未鉴定脂类。
  菌株HBUM179663T属于草药菌属(Herbiconiux)的一个新种,革兰氏阳性,细胞呈短杆状,无芽胞,无鞭毛,无运动性,大小为0.4-0.5μm×1.4-1.6μm。根据16S rRNA基因序列同源性比对,菌株 HBUM179663T与马铃薯草药菌(Herbiconiux Solani)K134/01T的亲缘关系最近,序列相似性为96.65%。基因组DNA(G+C)mol%含量为75.7%。甲基萘醌种类为MK-11。主要脂肪酸是anteiso-C15:0、anteiso-C17:0和C16:0。主要磷酸类脂有PLS、PME、PE和DPG。
  菌株3-BNT属于伯克氏菌科(Burkholderiaceae)的一个新属,革兰氏阴性,细胞呈杆状,无芽孢,单端生鞭毛,大小为0.4-0.6μm×1.8-2.1μm。根据16S rRNA基因序列同源性比对,菌株3-BNT与乌汶伯克霍尔德氏菌( Burkholderia ubonensis)CIP107078T的亲缘关系最近,序列相似性为92.83%。基因组DNA(G+C)mol%含量为42.4%。泛醌种类为UQ5、UQ6和UQ8。主要脂肪酸是C16:0、C18:1ω7c和cyclo C17:0。主要磷酸类脂有DPG、PE和PG。
  本实验通过在VL55培养基中添加6种不同的营养因子,利用常规稀释和大量稀释对采自河北、青海和云南三个地区的3份土壤样品进行微生物新物种的分离,共分离得到415株纯培养物。河北土样通过常规稀释分离得到的72株菌归属于14个属,大量稀释分离得到的52株菌归属于22个属;青海土样通过常规稀释分离得到的37株菌归属于9个属,大量稀释分离得到的50株菌归属于17个属;云南土样通过常规稀释分离得到的71株菌归属于23个属,通过大量稀释法分离得到的133株菌归属于15个属。其中,菌株HBUM200206是通过大量稀释从青海土样中分离得到的一株菌,与运动东菌(Dongia mobilis)LM22T的亲缘关系最近,序列相似性为94.58%,因此菌株HBUM200206可能是红螺菌科( Rhodospirillaceae)的一个潜在新属。菌株HBUM200161、HBUM200202、HBUM200239、HBUM200240、HBUM200352、HBUM200424、HBUM200427、HBUM200448、HBUM200452、HBUM200488、HBUM200497和HBUM200503与亲缘关系最近的模式菌株的16S rRNA基因序列相似性均小于98.65%,可能为潜在的新种。
[硕士论文] 莫平
化学 湖南科技大学 2017(学位年度)
摘要:放线菌属于革兰氏阳性的一类原核微生物,它们分布于各种各样的环境。由于产生有益的代谢物,它们在医药、食品、工农业等多个领域上具有巨大的应用价值和潜力,因而其研究得到了研究人员的广泛关注,尤其是链霉菌。据报道,至2010年微生物产生的活性物质已有超过30000种被发现,其中由放线菌产生的具有生物活性的次级代谢产物达到13000多种,链霉菌产生的物质约7600种。本研究从湘潭锰矿污染区(N27°53'-28°03', E112°45'-112°55')及周边环境的土壤分离得到1200多株放线菌,通过结合菌落的培养特征和16SrRNA基因序列,最终得到51株菌落形态、特征不同的链霉菌。由此可知:湘潭锰污染土壤中存在丰富多样的链霉菌。结果表明:菌株LUSFXJ, MKLv, MK44, MK45和 MK47可能为潜在的链霉菌新物种。
  本研究主要内容包括:⑴菌株LUSFXJ,分离自锰矿污染区或周边环境的土壤,16SrRNA基因序列以及孢子形态、结构特征和培养特征均表明:菌株 LUSFXJ属于链霉菌。甲基萘醌包含 MK-9(H6), MK-9(H8), MK-9(H2)和 MK-8(H8)。磷脂类型包括双磷脂酰甘油(DPG)和一个未鉴定的极性脂。脂肪酸主要成分为 iso-C15:0,anteiso-C15:0, iso-C16:0,C16:0和 summed Feature3。菌株 LUSFXJ的细胞壁含有 meso-DAP,细胞水解产物含有核糖,甘露糖和葡萄糖。菌株 LUSFXJ与进化关系最近的参照菌株的杂交率远远低于70%。根据形态特征、生理生化特征以及DNA的分子杂交结果,确定菌株 LUSFXJ是链霉菌的一个新种,并将其命名为 Streptomyces xiangtanensis sp. nov.(=GDMCC4.133T=KCTC39829T)。⑵菌株MK44,分离自锰矿污染区的土壤。根据菌落的形态、培养特征、生理生化特征的比较和16S rRNA基因序列分析,我们可以得出:菌株 MK44属于链霉属,同时明显区别于同源性>97%有效发表的种。其与选择的菌株S. speciali JCM16611T和 S. mayteni JCM16957T的杂交值分别为30.90±0.28%和29.86±3.51%远远低于 Wayne et al(1987年)提出的70%作为新种的界限。因此可以判断该菌为链霉菌的潜在新种,并将其命名为鹤岭链霉菌 Streptomyces helingensis sp. nov.(=GDMCC4.137T=KCTC39920T)。
[硕士论文] 车玉兰
化学工程 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:食源性致病菌易通过食品流通环节感染人群,致病菌的高效检测是食品安全重要保证。此外,细菌感染治疗中耐药菌的出现使新型抗菌药物的需求日益迫切。面对食源性致病菌检测中背景基质复杂、检测时间长、细菌含量少的特点,以及新型抗细菌感染药物研究中药物作用效果检测方法耗时、操作复杂,不能快速筛选等问题。本文基于荧光标记检测灵敏度高、选择性好等优势,提出了样本基质干扰小、不受多余标记试剂影响的结合磁分离富集与荧光标记的细菌荧光检测法和集磁捕获、荧光标记和检测一体的快速细菌微流控芯片检测法。在对细菌荧光探针和标记模式研究基础上,将荧光标记检测技术用于细菌感染细胞作用研究,实现群体感应抑制剂作用效果快速、高效检测。相关研究为复杂食品样本中低含量细菌的快速检测提供新方法,为新型抗菌药物筛选研究提供新途径和新思路,对食品安全及致病菌的监管和感染治疗有重要研究价值和应用潜力。
  本研究主要内容包括:①将纳米磁珠富集和聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)凝胶层析分离结合,采用荧光标记的检测模式,建立了一种食品中致病菌的快速灵敏分析方法。采用Fe3O4@SiO2-NH2通过静电作用捕获大肠杆菌,减少食品样本带来的复杂基质干扰,对大肠杆菌进行富集;荧光产率高、标记快速的吖啶橙标记后,利用PEG凝胶层析,有效去除其中残余纳米磁珠及多余荧光试剂;通过对PEG分离管底部浓缩的纳米磁珠及目标细菌复合物的目视观测,即可对含菌量高于100 cfumL-1的样本进行半定量初判,进一步检测分离物的荧光信号,对目标细菌含量进行定量分析。以大肠杆菌为例,检测的线性范围102-106cfumL-1,检测限为100cfumL-1,检测时间80min。对超市取样的熟肉制品样本测试,本方法结果与传统的平板计数法结果吻合。②基于多通道微流控芯片建立了细菌磁捕获富集和原位荧光定量检测新方法。设计的芯片集成含混合区和检测区的6条微通道,磁标记的细菌在混合区与吖啶橙充分混合进行标记,检测区通过外置磁铁进行细菌的捕获富集,采用搭建的小型荧光仪对检测区捕获的细菌进行荧光强度检测。该方法对大肠杆菌的检测限为100 cfumL-1,检测时间50 min,荧光信号与菌液浓度在102-106 cfumL-1范围有良好的线性关系,可同时进行6个样本测试。③设计制备了多功能的适配体修饰的磁性碳量子点,同时实现对沙门氏菌的特异性磁分离捕获和荧光标记检测,建立了选择性好、背景干扰小的沙门氏菌快速荧光检测方法。将碳量子点共价结合到的Fe3O4@SiO2-NH2表面制备磁性碳量子点Fe3O4@CQDs,在其表面修饰适配体制备Fe3O4@CQDs-Apt以实现目标菌特异性标记,Fe3O4@CQDs-Apt标记沙门氏菌后发生团聚导致荧光强度降低,荧光强度的变化值与沙门氏菌在103~106 cfumL-1浓度范围呈现良好的线性关系,在牛奶和鸡肉的沙门氏菌合成样本中检出限为103 cfumL-1,检测时间60 min,可用于复杂背景基质的样本中目标菌的分离捕获及快速荧光检测。④采用碳量子点标记的细菌与细胞相互作用,建立细菌群体感应抑制剂对细菌感染细胞作用效果荧光检测方法,对药物作用进行快速判断和评估。以公认群体感应抑制剂呋喃酮 C30为阳性对照物,对单宁酸、厚朴酚、山奈酚对沙门氏菌感染 HT-29细胞作用效果进行荧光检测。结果显示:药物对沙门氏菌黏附 HT-29细胞的抑制作用呋喃酮 C30>厚朴酚>单宁酸>山奈酚,侵染抑制作用呋喃酮 C30>单宁酸>厚朴酚>山奈酚。此外,对几种药物的群体感应抑制作用进行分析,几种药物均对AHL调控的群体感应有抑制。细菌运动性结果显示几种药物均能抑制沙门氏菌的 Swarming,厚朴酚能抑制 Swimming,表明药物通过抑制沙门氏菌群体感应及运动性抑制其对细胞的感染,建立的荧光检测方为新型细菌感染药物筛选研究提供新途径。
[硕士论文] 任韶霞
微生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷,对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用,是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷以及许多抗病毒性药物的重要中间体。目前在工业上主要以糖质为原料发酵进行生产。但国内腺苷的生产效率仍有较大的提高空间,可通过诱变育种以及基因工程的方法来改造菌种,优化发酵条件来改善和提高产量、降低成本;同时在生产过程中还存在生产菌株遗传性状和产量不稳等问题。本实验室保藏的一株能够积累腺苷的菌株Bacillus subtilis DI4-24,经过连续传代培养,菌种退化现象严重,其遗传性状组氨酸缺陷极易发生丢失,不利于腺苷的工业化生产。本研究以分离纯化后的退化菌株B.subtilis DI4-24R为出发菌株,利用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变处理,重新获得了增加组氨酸缺陷型菌株,进行遗传性状稳定性和高产腺苷的选育,并通过基因敲除技术定向改造菌株,来使生产菌株的稳定性能增强的研究。
  本研究主要内容包括:⑴通过对高产腺苷菌株B.subtilis DI4-24分离纯化和遗传表型分析,得到菌落形态和遗传标记都发生改变的退化菌株B.subtilisDI4-24R,其产苷性能退化的原因为组氨酸缺陷型高频率地发生回复突变所致,退化菌菌株产量大幅度降低至4.34 g/L。⑵以B.subtilis DI4-24R为出发菌株,进行ARTP诱变处理,经过初筛选到his-恢复的突变株。实验表明,ARTP诱变放电照射10s诱变效果最佳,正变率高。经过复筛得到了一株高稳产腺苷菌株B.subtilis AR-27,传代6次该菌株依然保持相当高的产腺苷能力,摇瓶发酵产苷量达到15.84g/L,比出发菌株产量提升了近3倍,his-回变率大幅下降至9.3×10-8,其产苷性能和遗传稳定性得到显著提高。⑶对突变菌株B.subtilis AR-27进行了摇瓶发酵培养基的优化试验,通过生长因子、葡萄糖、以及氮源物质的单因子实验和多因素正交试验,确定了最佳培养基配方为:葡萄糖11g/L、豆粕80mL/L、玉米浆60mL/L、酵母精粉12 g/L、氯化铵15g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.02g/L、硫酸锰0.02g/L、氯化钙5g/L、碳酸钙20g/L、亮氨酸0.02g/L、谷氨酸0.02g/L、组氨酸50 mg/L。在优化的培养基中产苷水平达16.12 g/L,产苷能力提高了10%。⑷在NCBI上检索出枯草芽孢杆菌hisC基因序列,以此为根据分别设计上下游引物,PCR扩增DI4-24R细胞基因组,得到上游(TF)与下游(TB)的同源序列,将上下游同源序列融合连接,片段大小为1000bp左右,将目的片段与T载体连接,构建成重组质粒T-H。⑸提取穿梭质粒载体pMAD和重组质粒,分别用限制性内切酶BamH、BglⅡ酶切后,采用新技术in-fusion处理后,转化到DH5α细胞,筛选得到hisC基因缺失的同源重组质粒pMAD-H。将同源重组质粒pMAD-H电转化导入受体细胞DI4-24R中,用抗性平板筛选克隆子,得到B.subtilis DI4-24R(pMAD-H)转化菌株,为后续的同源重组工程菌的筛选奠定了基础。
[博士论文] 周航宇
化学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:大自然是我们最好的老师,在数以亿年计的时间里,自然界的生物进化出了具有多种多样结构和功能的材料,这其中,生物通过有机分子调控无机矿物的生长和排列,从而合成功能性矿物材料是目前研究的热点之一,如动物的骨骼,牙齿,一些海洋生物的外壳等都是生物通过有机分子调控合成无机矿物的典范,然而近年来,随着显微镜的飞速发展,人们对于微观世界的探索越来越深入。除了我们宏观看到的生物矿物,在微观世界里,同样充满着功能各异的生物矿物,例如硅藻的外层具有一层二氧化硅外壳,能够很好的保护硅藻免受外界的侵袭,此外,人们还发现在一些趋磁的细菌里面有着成串的氧化铁纳米颗粒,这些颗粒能够指引这些趋磁细菌趋利避害找到适宜的生存环境。
  本研究分为四个部分:第一章介绍了病毒、疫苗以及目前病毒和疫苗在生物材料合成中修饰方法及应用。随后,我们综述了自然界中的生物矿物的存在形式,这些生物矿物的功能,并重点对碳酸钙、磷酸钙以及磁性氧化铁生物矿物进行了总结,然后归纳了目前仿生生物矿化的策略和方法并对目前仿生生物矿化的发展现状进行了总结,最后提出了本论文的研究思路和目标等。第二章针对目前禽流感跨种传播的现状进行思考,结合我们对于生物矿化和病毒的理解,提出了自然界中可能存在着矿化形式的病毒的假说,并模拟了自然界中禽流感病毒在禽类中的生存环境,探究在这一条件下得到的病毒的化学和生物学性质,并对其可能对生物造成的影响进行了初步的评估。结果显示在流感病毒在禽类中可能是以一种矿化的形式存在的,这种形式的流感病毒相较于普通的流感病毒,具有更高的热稳定性和更强的感染能力,需要人们对其保持警惕。第三章使用一些功能性材料对疫苗进行包裹,使其能够具有特定的功能,对于疫苗而言,最重要的两点分别是疫苗的热稳定性和免疫原性,因此,在这一章中,我们选用氧化铝作为包裹材料,将病毒颗粒包裹在纳米氧化铝簇中,一方面使病毒获得了较好的热稳定性,另一方面则也使疫苗具有了更为优良的免疫原性,甚至能够增强机体的细胞免疫。第四章引入了基因工程来对病毒进行基因改造,为病毒的表面插入一些我们通过理性设计的连接位点,使病毒能够更为容易的与功能性材料结合,从而实现疫苗的功能化,在本章中,我们主要以磁性氧化铁为例,突出展示了具有磁性的病毒能够较为精确的被外加磁场所控制,此外,通过这种方法我们还能够非常简单的将量子点与病毒相连。
[硕士论文] 高培丽
生物学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物在生长过程中分泌到周围环境中的由多种单糖组成的大分子物质,具有来源广、易与菌体分离等优点。极地微生物的胞外多糖具有许多不同的生物活性和新颖的化学结构,在医药、食品加工、化工等领域具有广阔的应用前景。本文采用苯酚硫酸法和醇沉法从10种不同的南极泥沙沉积物样品中共筛选到132株产不同胞外多糖量的菌株,其中(A)产量低于20 mg/L的有7株,占产EPS菌株的5.3%;(B)产量在20-60 mg/L的有25株,占产EPS菌株的18.94%;(C)产量在60-100 mg/L的有79株,占产EPS菌株的59.85%;(D)产量高于100 mg/L的有21株,占产EPS菌株的15.91%。其中来自不同筛选样品、不同筛选批次产EPS量相对较高菌株W38-8、W29-21、W32-2、W13-13、W38-16、W32-3、W14-6、W18-3和W20-15,产量最高的三株菌分别为W38-8、W29-21、W32-2,对应的EPS产量分别为144.22 mg/L、125.61 mg/L、109.56 mg/L。经过16S rDNA基因序列比对鉴定,这9株菌分别是Loktanella salsilacus,Rheinheimera soli,Shewanella frigidimarina,Planococcus halocryophilus,Marinobacter sp., Shewanella sp.,Pseudomonas stutzeri,Planococcus halocryophilus, Flavobacterium sp。
  本研究主要内容包括:⑴针对培养条件较稳定的W32-2菌株(Shewanella frigidimarina,EPS产量为109.56 mg/L),从多糖理化性质及体外抗氧化活性、多糖对彩虹鲷非特异性免疫活性影响及EPS生产的发酵工艺等三个方面开展深入研究。⑵采用Sevage法除蛋白后,考马斯亮蓝测定结果表明,W32-2粗多糖的蛋白含量仅为0.5%;硫酸咔唑法测得W32-2胞外多糖的糖醛酸含量为8.46%;明胶比浊法测得EPS的硫酸基含量为83.35%,为酸性多糖。DPPH和超氧阴离子清除实验结果显示,W32-2产生的EPS对DPPH有一定的清除能力,当质量浓度为0.5 mg/mL时,抗氧化能力最强,对DPPH的清除能力达60.43%,对超氧阴离子的清除率达70.03%。⑶菌株W32-2所产EPS对彩虹鲷血液的非特异性免疫酶活初步实验结果表明,该EPS在一定程度上可以提高彩虹鲷非特异性免疫酶活。实验条件为:a)EPS浓度为3 mg/mL,b)EPS浓度为5 mg/mL, c)pH7.4的1×PBS,注射剂量均为0.1mL,分别在注射后第3 d、5 d、7 d、14d、21d和28d测其血清酶活。测试数据表明,注射EPS浓度为3 mg/L实验组的免疫增强效果较好。在整个实验期间,AKP活性最高是对照组的2.29倍,且在第三天达到最大;在实验第7 d时ACP酶活比对照组提高了51.18%,且SOD活力达最大值;在第14 d时,实验组比对照酶活提高了33.25%;在第3 d时,实验组的CAT酶活比对照提高了57.64%。该结果表明,菌株W32-2产生的 EPS具有作为免疫添加剂的潜力。⑷通过单因子变量实验,确定W32-2产EPS的最佳碳源为果糖,最佳添加量为4%;最佳氮源为酵母提取物,最佳添加量为2%;最佳培养基初始pH值为9;最佳发酵温度为10℃;最佳装液量为150/500 mL;最佳接种量为3%。
[硕士论文] 陈埔
生物学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:水稻是目前世界人口最重要的粮食作物之一,但是,水稻因为各种各样的病虫害导致的产量下降却屡见不鲜,其中包括严重影响我国水稻产量的一种单链RNA病毒----水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)。文献报道发现,水稻条纹病毒主要侵染水稻、烟草、甚至玉米等的叶片,使叶片出现枯色条纹状病变。关于水稻条纹病毒如何作用于宿主植物,包括,病毒蛋白如何通过宿主发挥其毒害作用的机制还不清楚。因此,开展关于水稻条纹病毒蛋白与宿主水稻蛋白之间的互作关系的研究具有十分重要的意义。研究发现,水稻条纹病毒的第四条RNA链正向控制编码的一种致病特异蛋白(disease-specific protein,SP)可能是参与病毒侵染植物,发挥其致病作用的一种关键蛋白。
  本研究以该蛋白为重点,以期解析其结构;通过寻找该蛋白作用于宿主水稻的靶标蛋白,解析互作复合体的结构,从而分析其可能的致病机理。首先,论文采用大肠杆菌表达系统,体外表达SP蛋白,利用亲和纯化的方法,纯化获得该蛋白,并以期得到该蛋白的晶体,然后优化出最佳衍射数据的晶体,从而解析该蛋白的分子结构,分析其可能与宿主靶标蛋白互作的结构域或蛋白序列。其次,以新鲜的水稻叶片为材料,进行叶片全蛋白的提取,并将SP蛋白与MBP标签和GST标签融合表达。最后,利用pull-down技术,将纯化好的含有不同标签的SP蛋白与水稻叶片全蛋白进行孵育后,除去非特异性结合的杂蛋白,进行SDS-PAGE检测,银染显色,核磁鉴定互作蛋白的序列,并以期获得二者互作的晶体结构,分析互作的关键位点。结果显示:体外表达获得了大量的纯度较高的SP蛋白;戊二醛交联实验标明该蛋白可能存在通过自身互作形成三聚体;报道称发现SP可与水稻叶绿体光合作用复合体Ⅱ中的PsbP蛋白互作,但根据等温滴定量热法(ITC)测定二者互作关系,未显示其可明显发生互作;有报道标明,SP可能与某些短肽互作,但ITC结果未发现有明显的互作关系;目前还未得到该蛋白的晶体衍射数据;该蛋白与水稻叶片全蛋白的pull-down结果还未发现特异的互作蛋白。
[硕士论文] 陆美林
化学 长春理工大学 2017(学位年度)
摘要:本研究通过了解上海地区蚊、蠓携带虫媒病毒的情况,为上海地区虫媒疾病的预防和控制提供理论依据。通过细胞分离法对采集的蚊虫样品进行病毒分离,得到5株病毒,并对其中的两株乙型脑炎病毒进行生物学特性和分子特征分析,同时建立一步TaqMan探针法鉴定乙型脑炎强弱毒株的方法。结果表明分离的五株病毒两株为乙型脑炎病毒,三株为版纳病毒。两株乙型脑炎病毒在E蛋白氨基酸残基位点上与已发现的病毒株存在差异,脑内注射可使小鼠致病,并成功建立了一步TaqMan探针法鉴定乙型脑炎强弱毒株的方法。
[博士论文] 张雁
生态学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是一株从甾体药物制药厂排污池土壤中分离得到的放线菌。该菌株能在多种甾醇类化合物(包括薯蓣皂素、雌二醇、去氧皮质酮、胆固醇、麦角固醇等)为唯一碳源的培养基上进行生长,并且能通过次级代谢产生多种新的甾醇类化合物。为系统阐明该菌株CPY在复杂的次级代谢过程中的功能与机理,实验室已对S.virginiae IBL14进行了全基因组测序,并利用GO、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG等数据库对获得的全基因组数据进行了基因分析与功能注释。本研究主要内容包括:
  ⑴S.virginiae IBL14全基因组的生物信息学分析发现:该菌株含有31个CYP450基因,其中:svh001、svu001、svu003、svu004、svu005为CYP105家族基因,svh001、svu003、svu004具有极高的同源性,其二级结构基本相同,推测三个基因在结构和功能上是极其保守的,可能具有类似的功能。svu005基因和svh001、svu003、svu004具有一定的二级结构差异。svu001其氨基酸和其它CYP105同源性较低,但在二维结构上,和其他CYP105家族基因没有明显区别,均含有13个α超螺旋结构;svu001和其它CYP105家族基因二维结构主要的区别在于其α螺旋均比同家族基因长,导致其蛋白总长高达499个AA(一般为400个左右)。在CYP105家族基因的五个基因中,均发现了K-helix和Heme bindingmotif保守基序。svh001、svu003、svu004、svu005的Heme binding motif极为保守,尤其是svu003、svu004的Heme binding motif完全一致;但与svu001的Hemebinding motif有极大的差异。这五个基因的K-helix基序基本一致。而所有CYP家族中被认为是一个保守的I-helix基序,却未在svu001发现。通过基因注释、序列比对和系统进化树的分析,我们确定svh001、svu003、svu004为CYP105C1; svu005为CYP105D1;svu001因具有不同寻常的特征,认为其为CYP105家族中的一个新的亚家族或者是一个新的家族基因。
  ⑵全基因组的生物信息学分析还发现:S.virginiae IBL14基因组存在着一个CRISPR-Cas基因编辑系统。对该系统Cas蛋白的组成及排列结构分析,我们将其命名其为I-B-svi型CRISPR-Cas系统。实验证明该系统能高效的对自身基因组中的基因进行编辑;特别是应用该系统开发的基因编辑工具可对其它生物进行有效的基因编辑,具有替代目前商用的Cas9基因编辑系统的潜力。
  ⑶设计并构建了包含编辑模板片段(templet DNA/t-DNA)和靶向基因片段(guide DNA/g-DNA)的基因编辑质粒(gene editing plasmid),并将其转化到S.virginiae IBL14原生质体中,筛选得到上述5个CYP105家族基因敲除的转化子。结合唯一碳源生长、生理形态分析、生物信息学分析等方法研究了CYP105家族基因对S.virginiae IBL14生理功能的影响,结果表明:1)I-B-svi型CRISPR-Cas系统可以成功对该基因组内源基因进行编辑,其操作简单、耗时短、效率高;2)CYP105家族基因的单敲除不致死,但会明显影响菌体的生长和生理变化,其中IBL14△svu004在液体和固体培养时大量产生胞内色素,并且在液体培养时不形成菌丝球;3)S.virginiae IBL14复杂的次级代谢产物可以有效地抑制细菌和真菌的生长;4)CYP105基因的敲除通过影响聚酮的代谢途径显著影响IBL14的抗生素和抗真菌素的生产。
  ⑷实验将CYP105家族基因在大肠杆菌中成功地进行了克隆,优化了发酵条件,实现了可溶性的外源表达。并以多种甾醇类化合物作为底物,进行了生物转化功能分析。试验表明:(1) svh001具有多种甾醇类物质生物转化功能:羟化雌二醇生成雌三醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3,羟化16,17环氧黄体酮生成新的羟化产物。(2) svu001可以羟化雌二醇生成雌三醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3,其所在基因簇与精氨酸代谢途径相关,可以羟化精氨酸为N-ω-羟基-L-精氨酸。(3) svu003可以羟化雌二醇生成雌三醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3。(4) svu004可以羟化雌二醇生成雌三醇和2-羟基-雌二醇,羟化维生素D3生成25-羟基-维生素D3,羟化16,17环氧黄体酮生成新的羟化产物(不同于svh001)。(5) svu005可以羟化雌二醇生成雌三醇,羟化雄烯二酮生成9位羟基化产物,以及将二苯甲酮羟化为4-羟基二苯甲酮。(6) CYP105家族的三个C家族基因的表达蛋白在多种底物代谢中表现出一定的共性,但D家族的svu005基因表达蛋白具有相对独立的底物域。
  ⑸本研究揭示维吉尼亚链霉菌IBL14的CYP105基因的亚家族定位与进化关系,探索了CYP105家族基因的底物域,加深了羟化反应的分子机理的理解。本研究的结果有助于改造、合成新的羟化酶,提高酶的反应活力与环境适应能力;在甾醇类物质的特定位点、特定立体构象引入羟基,生产全新的甾体药物及药物中间体;促进对甾体污染物的转化与降解。
[硕士论文] 谭刘刚
预防兽医学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:禽流感(Avian influenza AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus type A)引起的一种传染性疾病,根据致病性的强弱可以分为高致病性禽流感(HPAIV)和低致病性禽流感(LPAIV)。流感病毒基因由8个片段组成,其中血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是病毒的主要囊膜糖蛋白。流感病毒感染宿主始于HA蛋白和宿主细胞上的受体结合,HA蛋白主要结合两种形式唾液酸即:α-2,3唾液酸乳糖和α-2,6唾液酸乳糖。不同宿主的唾液酸的类型不同在一定程度上决定了流感病毒感染宿主的不同。迄今为止,已经发现H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽类,也可以可感染哺乳动物包括小鼠、豚鼠、雪貂、灵长类。血清学调查发现我国养殖从业人员血清中H9N2流感病毒抗体的阳性率达2.3%-13.7%,这表明H9N2亚型禽流感病毒已经获得跨越种间屏障感染哺乳动物甚至是人的能力,因而具有引发新的流感大流行的潜在威胁。H9N2亚型AIV可以为新发流感病毒提供供体,如1997年香港流行的H5N1亚型流感病毒,其内部基因可能来源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分离株。2013年流行的H7N9亚型AIV的内部基因有6个来自H9N2亚型AIV。因此,加强对H9N2亚型AIV对人源受体亲和性变化的检测以及病毒对哺乳动物致病机制研究具有重要的公共卫生意义。
  本研究对2001-2013间分离的12株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析发现:12株AIV尽管都属于Y-280这一大分支,但是又可以分为4个小的分支,这表明H9N2亚型禽流感病毒也在发生变异,尽管变异速度没有H5亚型禽流感那么快速。固相结合试验结果表明:不同的分离年代H9N2亚型AIV对α-2,6唾液酸受体的亲和能力存在差异,总的趋势是:随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和能力逐渐增强,其中2013年分离株(A/Chicken/Shandong/903,简称CK/SD/903)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最强,2006年分离株(A/Chicken/Shandong/274,简称 CK/SD/274)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最弱。通过对CK/SD/903和CK/SD/274这两个模型毒株的HA蛋白糖基化位点进行比较发现:CK/SD/903的血凝素蛋白分别在200和295位比CK/SD/274多了两个N-糖基化位点,为了验证这两个位点糖基化是否影响病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性,我们构建了CK/SD/903的8质粒反向遗传操作系统,并且对CK/SD/903的血凝素蛋白的200和295位氨基酸进行突变,得到2个突变病毒。固相结合试验结果表明HA N200Q(200位由N变为Q),而HA N295Q(295位由N变为Q)可以减弱病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性。为了进一步验证这两个位点的糖基化是否影响病毒对哺乳动物致病性,分别用106EID50的野毒和突变病毒(CK/SD/903(HA N200Q),CK/SD/903和CK/SD/903)攻毒6周龄小白鼠。攻毒试验结果表明:HAN200Q(200位由N变为Q)后,尽管突变病毒对小鼠的体重没有明显影响,但是可以提高病毒在小白鼠肾脏等器官复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的936.32倍);HA N295Q(295位由N变为Q)突变后,可以提高病毒在小白鼠肝脏等器官的复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的56倍)。本研究系统的研究了2001-2013年间的12株H9N2亚型禽流感病毒HA基因进化和病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性,结果表明:H9N2亚型流感禽流感病毒存在一定程度变异,尽管不如 H5亚型流感那么明显;随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性逐渐增强。利用反向遗传操作技术验证了903毒株HA蛋白200和295位糖基化影响病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性变化,并且这两个位点糖基化能够影响病毒对小白鼠组织嗜性。这为阐明H9N2亚型流感病毒跨种间传播的分子遗传机制提供重要的理论和实验依据,并且能够为H9N2亚型流感病毒感染哺乳动物或者人提供预警,因此本研究具有重要的兽医指导意义和公共卫生意义。
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