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[硕士论文] 姜晓娜
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎附植期是猪早期妊娠胚胎丢失最敏感时期之一,受很多因子调控,但目前对猪胚胎附植的相关因子研究较少。在本实验室先前的转录组和蛋白的测序数据分析发现ANXA8基因在猪的胚胎附植期差异表达。ANXA8基因是膜联蛋白家族的成员之一,编码抗凝血蛋白参与凝血级联并作为一种间接性的凝血酶特异性复合物。然而,目前在猪的胚胎附植以及猪的子宫内膜细胞中ANXA8基因的功能均未见报道。为了了解ANXA8基因在猪的子宫内膜中以及可能对猪胚胎附植产生的作用,本研究先检测了猪妊娠早期的子宫内膜组织中ANXA8基因的相对表达;然后将构建的真核超表达载体pcDNA3.1(+)-ANXA8和ANXA8基因的干涉片段转染到猪子宫内膜细胞中,通过免疫荧光、实时荧光定量PCR、流式细胞术和western blot等技术研究ANXA8基因在猪子宫内膜细胞中的调控作用;通过小鼠子宫角注射方法确定ANXA8基因对胚胎附植的影响。主要研究结果:
  1.实时荧光定量PCR技术检测猪妊娠9-15d和18d的子宫内膜组织中ANXA8基因的表达情况,发现该基因在妊娠12d的相对表达量最高。通过免疫荧光方法确定了ANXA8蛋白在猪子宫内膜细胞中的表达位置,发现ANXA8蛋白在细胞质中有表达。
  2.实时荧光定量PCR测定表明ANXA8基因显著上调LIF和EGF基因在猪子宫内膜细胞的表达量。
  3.流式细胞术确定ANXA8基因促进猪的子宫内膜细胞的细胞周期的S期细胞增加。免疫荧光技术和western blot技术确定超表达ANXA8基因可以通过促进细胞中增殖标志蛋白PCNA的表达来促进猪子宫内膜细胞的增殖。
  4.Western blot技术确定超表达ANXA8基因在不影响猪子宫内膜细胞中AKT总蛋白的情况下促进细胞中p-AKT蛋白的表达,进而调控细胞中AKT信号通路。免疫荧光技术和western blot检测证实ANXA8基因通过AKT信号通路来调控猪子宫内膜细胞的增殖,其中免疫荧光技术结果发现超表达ANXA8并添加AKT磷酸化抑制剂(Perifosine)后,细胞中PCNA蛋白含量与对照组无显著差别,且其含量低于只超表达ANXA8组中细胞内PCNA蛋白的含量,其次western blot结果发现AKT磷酸化抑制剂对细胞内ANXA8蛋白含量无影响。实时荧光定量PCR技术确定超表达ANXA8可以上调AKT下游mTOR基因在猪子宫内膜细胞中的表达。
  5.在小鼠子宫角注射实验发现注射干涉片段ANXA8的小鼠的胚胎附植数明显少于对照组。
  6.实时荧光定量PCR技术结果发现干涉ANXA8基因可以降低同家族ANXA4基因在子宫内膜细胞中的表达。
  以上主要结果表明ANXA8基因可以通过AKT信号通路促进猪子宫内膜细胞的增殖。此外还发现ANXA8基因也影响猪子宫内膜细胞中胚胎附植标志LIF和EGF基因的表达;ANXA8基因也会影响小鼠的胚胎附植数目。
[博士论文] 王晓艳
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:干扰素-τ(Interferon-τ,IFN-τ)是反刍动物在妊娠早期由胚胎滋养层细胞分泌的一类Ⅰ型干扰素,被视作妊娠识别信号,具有抗黄体溶解、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能。其在调节胚胎着床时期子宫容受态和子宫免疫环境等方面的作用对于胚胎的顺利着床尤为重要。IFN-τ在奶牛妊娠早期,即胚胎植入窗口期,通过对牛白细胞Ⅰ类抗原(Bovine leukocyte antigen,BoLA-Ⅰ)及其他妊娠相关分子的调节,提高母体对胎儿的容受性,增加胚胎植入的成功率。BoLA-Ⅰ,是牛的主要组织相容性Ⅰ类(Major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)蛋白,在牛的胚胎滋养层和子宫内膜上皮细胞中均有表达,与妊娠早期母体对胎儿免疫耐受密切相关。IFN-τ也可以调节分离培养的奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达miRNAs。miRNAs普遍存在于真核生物,通过对靶基因的调节,参与机体各种生理和病理过程,在妊娠免疫和重塑子宫内环境等方面也有重要作用。
  本实验室前期的研究表明,IFN-τ在奶牛妊娠早期可上调BoLA-Ⅰ的表达,并可调节奶牛子宫内膜上皮细胞中miRNAs的表达谱。通过高通量测序和分析,发现一些差异表达显著的miRNAs可能与IFN-τ调节奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达BoLA-Ⅰ类蛋白有关。为进一步验证其相关性,也为进一步研究奶牛妊娠免疫和子宫容受性的调节机制提供实验依据,探索IFN-τ在奶牛妊娠早期协助胚胎免疫逃逸,为胚胎植入提供可能的潜在机制,本研究从验证miRNAs/miRNAs靶基因入手,展开了深入的研究,主要研究内容和结果如下:
  (1)从高通量测序的结果中筛选到bta-miR-145和bta-miR-204在IFN-τ作用下的奶牛子宫内膜上皮细胞中的表达明显降低。选取空怀和妊娠早期奶牛子宫内膜组织进行在体验证。RT-qPCR和Western blot检测结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织相较于空怀奶牛而言,其bta-miR-145和bta-miR-204的mRNA水平显著降低,MHC-Ⅰ类相关链(MHC classⅠ-relatedchain,MIC1)基因和Ⅰ类MHC重链(Major histocompatibility complex,classⅠ-A,BoLA)基因的mRNA水平却显著上调,且BoLA-Ⅰ蛋白水平也明显升高。
  (2)分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)进行体外验证,结果显示,在IFN-τ(200ng/mL)作用下,和对照组相比,bEECs中bta-miR-145与bta-miR-204的mRNA水平同样下降明显,MIC1和BoLA的转录水平上升明显,BoLA--Ⅰ蛋白表达水平升高显著。
  (3)利用生物信息学技术对bta-miR-145与MIC13'UTR,bta-miR-204与BoLA3'UTR靶序列的碱基配对情况,结合形成RNA双链的二级结构和自由能等主要生物信息学指标进行了归纳分析,初步确定MIC1为bta-miR-145的靶基因,BoLA为bta-miR-204的靶基因。通过双荧光素酶报告检测分析,发现,bta-miR-145显著抑制MIC13'UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性,而bta-miR-204也能显著抑制BoLA YUTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性。确证MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (4)bta-miR-145、bta-miR-204的过表达和抑制实验表明,在bEECs中转染bta-miR-145模拟物能显著抑制MIC1基因mRNA的表达;而转染bta-miR-145抑制剂后,MIC1基因mRNA的表达则显著上调。而在bEECs中转染bta-miR-204模拟物则能显著抑制BoLA基因mRNA的表达;而转染bta-miR-204抑制剂后,BoLA基因rnRNA的表达则显著上升。在IFN-τ的作用下,bEECs中MIC1和BoLA的mRNA水平显著增加,BoLA-Ⅰ的蛋白表达水平也明显上调。进一步证实了MIC1是bta-miR-145的直接靶基因,而BoLA是bta-miR-204的直接靶基因。结果证明,IFN-τ可以通过对bta-miR-145和bta-miR-204的负调节作用,提高MIC1和BoLA的表达。
  (5)为了验证IFN-τ在胚胎植入期对细胞外基质和免疫微环境的影响,采用RT-qPCR分析了未孕和妊娠早期奶牛子宫内膜组织中崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白10(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10,ADAM10),崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白17(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein17,ADAM17),程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death-ligand1,PD-L1)和程序性细胞死亡配体2(Progammed cell death-ligand2,PD-L2)的mRNA水平。结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织中的ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的mRNA水平都有不同程度的升高。而在IFN-τ的作用下,bEECs中ADAM10,ADAM17,PD-L1与PD-L2的mRNA水平都有明显的增加。
  (6)为了验证IFN-τ是否通过对MIC1和BoLA的调节来影响ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的表达,采用siRNA干扰技术在bEECs中进行体外验证。结果表明,siRNA干扰MIC1的表达后,ADAM10和ADAM17mRNA水平明显下降;在bEECs中转染BoLA siRNA后,PD-L1与PD-L2的mRNA水平也显著下调。结果提示,IFN-τ通过bta-miR-145对MIC1的调节影响ADAM10和ADAM17的表达;同时可通过bta-miR-204对BoLA的调节作用,来调节PD-L1与PD-L2的表达,从而对细胞外基质和免疫耐受等多方面的调节来影响胚胎植入。
  (7)进一步验证IFN-τ对胚胎植入的影响,建立了LPS诱导的小鼠胚胎植入障碍模型,进行在体验证。实验结果表明,IFN-τ能提高LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量,同时FN-τ也能抑制LPS诱导的炎性因子IL-1β和TNF-α的表达,并上调抗炎因子IL-10的表达。
  结论:
  (1)MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (2)IFN-τ通过抑制bta-miR-145上调MIC1的表达来增加ADAM10和ADAM17的表达,以影响细胞外基质,促进胚胎黏着、侵袭等过程。
  (3)IFN-τ通过抑制bta-miR-204上调BoLA的表达来提高PD-L1与PD-L2的表达,以此影响母胎界面的免疫微环境,促进胎儿免疫逃逸。
  (4)IFN-τ通过下调bta-miR-145/204的表达来调节BoLA-Ⅰ类相关分子的表达和功能,以增加胚胎植入的成功率。
  (5)IFN-τ通过对免疫平衡的调节来增加LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量。
[硕士论文] 陈文娟
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:清平猪具有妊娠期短和产仔数多等优良繁殖性状,利用标记辅助选择对繁殖、生长和胴体性状进行选育能有效加快清平猪杂交品系的育种进程。本试验选择了9个候选基因:ESR、FSHβ、PRLR、MC4R、GH、IGF1、NR6A1、FUT1和MUC13,分别对清平猪杂交群体(F1和F2)的繁殖、生长和胴体性状进行关联性分析,以期为生产实践中对清平猪杂交品系的选育提供一些理论依据。本试验的研究结果如下:
  1.F1群体和F2群体的平均妊娠期分别为112.89d和113.36d,总产仔数分别为12.42头和9.98头,清平猪的杂交后代(F1和F2)均具有妊娠期短的优良特性。
  2.FSHβ基因、ESR基因、PRLR基因、IGF1基因和MUC13基因与清平猪杂交后代的关联性:
  (1)两个群体中FSHβ不同等位基因的优势均不明显,不同基因型对F1群体的产活仔数以及F2群体的总产仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重等重要繁殖性状均有显著影响(P<0.05),其对繁殖性状的有利基因型为BB型。
  (2)两个群体中ESR的优势基因均为B等位基因,三种基因型对妊娠期的影响趋势均为AB<AA<BB,对F2群体的妊娠期和木乃伊性状有显著影响(P<0.05)。ESR基因的AB型个体可能具有较短的妊娠期,A等位基因可能会增加每胎木乃伊的数量。
  (3)F1和F2群体中PRLR的优势基因均为C等位基因,不同基因型对F1群体的妊娠期和乳头数(左和右)均有极显著影响(P<0.01),对总产仔数、断奶仔猪数、70日龄存活数和70日龄重均有显著影响(P<0.05),对F2群体的弱仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重均有显著影响(P<0.05),其有利基因为T等位基因。
  (4)F2群体中IGF1-1位点和IGF1-2位点的优势基因分别为G基因和A基因,两个位点对繁殖性状的有利基因型可能均为AA型。
  (5)MUC13基因的G等位基因在F2群体中优势明显,AG和GG型对背膘厚的影响接近显著水平,对妊娠期、断奶仔猪重和3周龄重的影响均显著(P<0.05),其有利基因型为GG型。
  3.MC4R、GH和NR6A1对F2群体生长和胴体性状的影响:
  (1)MC4R的优势基因为G等位基因,不同基因型对背膘厚差异显著(P<0.05),AA型个体的平均日增重与AG型个体差异显著(P<0.05),与GG型个体差异极显著(P<0.01),其有利基因型为GG型。
  (2)GH的G等位基因优势明显,不同基因型对平均日增重的影响接近显著性水平(P≈0.08),对达100kg日龄的影响差异极显著(P<0.01),其有利基因为G等位基因。
  (3)NR6A1的优势基因为A等位基因,不同基因型对背膘厚的影响差异极显著(P<0.01),其对胴体和生长性状的有利基因分别为A和G等位基因。
  4.F2样本中的FUT1基因暂未检测到TT抗性基因型,呈极端单态分布。其对妊娠期、总产仔数、初生重、断奶仔猪数和3周龄重等繁殖性状的影响趋势均为CT>CC,对达100kg日龄的影响接近显著性水平,其有利基因为T等位基因。
[硕士论文] 李梓芃
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:为探究影响水牛奶中体细胞数(SCC)的因素和外源褪黑素对杂交水牛卵泡发育及奶中体细胞数降低的作用,本研究根据DHI记录,分析月份和胎次对水牛奶中体细胞的影响,并对乳中体细胞数较高的杂交水牛用不同浓度的褪黑素处理,分析血液中各种生理生化指标和乳中体细胞数,检测卵泡发育情况等,旨在为开发降低夏季水牛奶中体细胞数、提高杂交奶水牛繁殖性能的新技术奠定基础。
  1.月份和胎次对水牛奶中体细胞数的影响
  收集2012~2017年奶水牛的DHI数据,分析胎次和泌乳月份对水牛奶中体细胞数的影响。由于体细胞数的分布频率呈偏态性,因此将体细胞数换算成体细胞评分(SCS)进行分析。
  结果表明:泌乳月份对SCS具有显著影响(p<0.05)。SCS值表现为8月份最高、5月份最低。此外,SCC>40万个/mL的牛群占总体样本量的比例,6~8月最多,其次是冬季。乳中SCS值在胎次(1~3胎)间也有显著差异(p<0.05),随着胎次的升高,奶中体细胞数升高。
  2.皮下注射褪黑素对奶中体细胞评分和血中抗氧化及免疫指标的影响
  选择水牛奶中体细胞数高于50万个/mL的泌乳奶水牛20头,随机分为两组(各10头)。低和高剂量组分别连续4天注射4.68mg和20mg褪黑素,并检测奶样中体细胞数和血浆中抗氧化及免疫指标。
  结果表明:皮下注射褪黑素后,高剂量组奶中体细胞评分显著性低于注射前体细胞评分(p<0.05),但是两种剂量组之间没有显著性差异(p>0.05)。此外,通过观察治疗后第11天的治愈奶水牛数,发现高剂量组恢复亚健康(SCC≤50万个/ml)的杂交奶水牛数比低剂量组高10%。褪黑素处理后能够显著提高血液中MT、SOD和IgM含量(p<0.05)。因此,夏季连续4天皮下注射褪黑素能够显著降低奶中体细胞数,作用机制是通过提高血液中SOD和IgM浓度来增强奶水牛免疫和抗氧化能力。
  3.皮下注射褪黑素对奶水牛卵泡发育的影响
  选择30头奶水牛分成3组,每组10头。T1组每天皮下注射60mg/500kg褪黑素,连续注射3天;T2组一次性皮下注射180mg/500kg褪黑素,对照组注射生理盐水。以第1次注射褪黑素当天为第0天,在第4天注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg,第11天注射氯前列腺素(PGF2α)0.5mg,第13天再次注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg,分别于第二次注射GnRH后进行人工授精。一天两次用B超检测记录卵泡发育情况,且于配种后45天进行妊娠诊断。
  结果表明:在注射褪黑素后,处理组血液中SOD、MT和IgM浓度显著高于对照组(p<0.05)。在注射PGF2α以后,皮下注射褪黑素组的优势卵泡半数生存期(有且只有50%的优势卵泡存活的时间)、卵泡平均发育速率(1.Smm/d和0.7mm/d)大卵泡直径显著大于对照组(p<0.05)。此外,单次注射褪黑素组的排卵卵泡直径、排卵率、大卵泡数量以及受胎率都显著性高于其他组(p<0.05)。因此,用褪黑素皮下注射经产水牛后,均能够产生较高的SOD和IgM水平,两组处理方式结合Ovsynch同期发情方案(GPG)均能促进卵泡的发育和排卵,但单次注射组更能显著性增加排卵卵泡的数量和直径,且提高杂交奶水牛在非繁殖季节的发情、排卵和受胎比例。
[博士论文] 李俊
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:我国水牛种质资源丰富,既有沼泽型,又有河流型,主要用于耕地和产肉。近年来,随着水牛向乳用方向改良,奶水牛产业得到快速发展。水牛奶营养丰富全面、消化吸收率高,将水牛奶深加工成乳制品,如“乳豆腐”、“奶饼”、“双皮奶”等,深受消费者喜爱,具有广阔的市场前景。然而,尽管我国水牛存栏量多,但水牛产奶量和繁殖力低,目前为止还没有专门的乳用型水牛品种,从而影响奶水牛产业的进一步发展。
  水牛的繁殖性状和泌乳性状均是重要的经济性状,为典型的数量性状。由于遗传力低和影响因素多,通过传统方法选育高繁殖力和高产奶量奶水牛进展缓慢。目前,全基因组关联分析和转录组测序对研究数量性状提供了新的方向。因此,本研究利用全基因组关联分析和转录组测序方法对影响水牛繁殖性能和产奶性能的候选基因进行筛选与鉴定。本研究的目的旨在揭示奶水牛泌乳性能和繁殖性能的分子遗传基础,为提高奶水牛的产奶性能和繁殖性能以及遗传改良提供理论基础。
  1水牛繁殖性状候选基因分析
  本试验分为三个部分。首先利用商业化水牛90K基因芯片(Affymetrix Axiom(@))对462头意大利地中海水牛的头胎产犊日龄、第二胎产犊日龄、第三胎产犊日龄、受精所需输精次数、空怀天数、产犊间隔6个繁殖性状进行全基因组关联分析。繁殖性状原始数据来自于意大利水牛育种评估中心。通过GWAS分析寻找影响水牛繁殖性状的SNP、基因组区域和候选基因。其次利用二代测序技术对四个时期(卵泡直径<5mm,5~8mm,8~12mm和>12mm)的水牛有腔卵泡颗粒细胞进行转录组测序,并进行定性和定量分析。根据GO和KEGG富集分析,寻找影响卵泡发育的候选基因。最后通过整合GWAS结果和转录组测序结果,鉴别影响水牛繁殖性能的关键候选基因,并利用RNAi技术对候选基因IGFBP7在水牛颗粒细胞中进行验证。主要结果如下:
  (1)全基因组关联分析鉴别到与繁殖性状相关的40个SNP和28个候选基因。
  (2)单倍型分析发现在5号染色体的2.3~2.7Mb区域存在一个与水牛繁殖性能相关的QTL区,其中多个SNP主要位于TRHDE基因内和附近的序列上。
  (3)对水牛卵泡颗粒细胞的转录组分析鉴别出17700个基因,其中1076个基因在卵泡发育的不同时期差异表达显著,30个基因在卵泡发育的四个时期有差异表达。差异表达基因数最多的是卵泡发育的最后两个时期。
  (4)差异表达基因在卵泡发育末期主要富集在免疫相关信号通路,提示该时期卵泡为排卵做准备。
  (5)整合GWAS分析结果和转录组测序结果,发现与繁殖性状相关的28个候选基因中有25个基因在卵泡发育不同时期有表达,提示这些基因可能直接参与水牛卵泡发育的调控,从而影响水牛繁殖性能。
  (6)IGFBP7基因在卵泡发育的4个阶段均有较高的表达量。水牛颗粒细胞用RNAi敲低IGFBP7后,增值和凋亡以及雌激素和孕激素的分泌均发生显著的变化。
  2水牛泌乳性状候选基因分析
  本试验分为两个部分。首先对1002头水牛的16个体型外貌指标与产奶量进行回归分析,筛选出与产奶量显著相关的体型外貌指标,并用地中海水牛群体对该指标进行验证。其次,根据获得的体型外貌指标,利用90K Affymetrix Axiom(@)Buffalo SNP Array对176头意大利地中海水牛进行基因分型,质控后,分别与关键体型外貌指标进行全基因组关联分析,寻找与体型外貌指标相关的SNP、候选基因和QTL。主要结果如下:
  (1)通过体型外貌指标与泌乳量的分析,发现乳房性状与产奶量显著相关,乳房性状可做为水牛产奶量的直接或间接指标。
  (2)对水牛前乳头长、后乳头长、前乳头间距、后乳头间距和前后乳距5个乳房性状的全基因组关联分析,共获得10个与乳房性状相关的SNP和5个候选基因,分别是PTPN11、ZNF385B、LRP2、COX18和DTHD1。
  (3)单倍型分析发现一个位于候选基因LRP2内的QTL显著影响水牛的乳房性状。对LRP2进行表达谱分析,发现LRP2在乳腺组织中高表达,推测该基因可能参与调控乳腺的发育以及在泌乳调控过程中参与乳蛋白和乳脂肪的重吸收。
[硕士论文] 蔡安乐
动物营养与饲料科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在哺乳动物妊娠期,胎盘是调节宫内环境和保障胎儿发育的重要媒介,其中胎盘的血管网发挥了关键作用。有研究发现提高妊娠期日粮中蛋氨酸水平能够提高仔猪初生窝重和仔猪初生个体重,然而蛋氨酸调控胎盘血管发育的作用及其调控机理尚不清楚。本研究以猪血管内皮细胞为研究对象,构建了猪胎盘滋养层细胞与血管内皮细胞共培养模型,研究了蛋氨酸对猪血管内皮细胞血管生成的调控规律:并进一步从关键基因表达调控角度,研究蛋氨酸调控内皮细胞血管生成关键基因的关键机制。主要研究内容和结果如下:
  1.提高蛋氨酸水平对猪血管内皮细胞血管生成的影响。通过建立猪血管内皮细胞与猪滋养层细胞体外共培养模型,研究在猪血管内皮细胞单独培养和与猪胎盘滋养层细胞共培养条件下,将蛋氨酸从生理浓度(0.05mmol/L)提高到0.2和0.5mmol/L对猪血管内皮细胞血管生成的影响。结果显示,在单独培养或者共培养条件下,提高蛋氨酸的水平都显著促进了内皮细胞的成管(P<0.05),但是蛋氨酸与培养条件不存在交互作用,说明了蛋氨酸促进内皮细胞血管生成不依赖于滋养层细胞。
  2.提高蛋氨酸水平影响猪血管内皮细胞血管生成的主要事件。提高蛋氨酸水平后内皮细胞形成管腔数、总的分支长度和总的节点数显著增加(P<0.05)。通过MTT法和流式细胞术,检测不同浓度蛋氨酸处理对细胞增殖的影响,结果表明,随着蛋氨酸浓度的增加,细胞活力显著增加(P<0.05),但是对细胞周期没有影响。细胞划痕和Transwell小室迁移法检测提高蛋氨酸水平对细胞迁移能力的影响,结果发现随着蛋氨酸浓度增加,细胞的迁移能力显著增加(P<0.05),说明了提高蛋氨酸水平主要影响了内皮细胞血管生成中的细胞迁移事件。
  3.蛋氨酸对内皮细胞血管生成关键基因的调控。对细胞迁移基因和血管生成相关基因mRNA表达变化检测发现,增加蛋氨酸水平(0.05mmol/L Vs0.5mmol/L)对MM2的mRNA表达没有影响,但是显著增加了MMP9、VEGF-A、VEGF120、VEGF164.、VEGFR-1的mRNA水平(P<0.05),血管生成负调节基因sVEGFR-1的表达量也显著增加(P<0.05)。在0.5mmol/L蛋氨酸处理条件下,检测蛋氨酸不同处理时间对猪血管内皮细胞细胞VEGF-A的mRNA表达的变化,结果表明随着蛋氨酸处理时间的增加,VEG F-A的mRNA表达水平逐渐增加,当处理时间达到24h时,显著促进了VEGF-A mRNA的表达(P<0.05)。此外,蛋氨酸不同处理时间或不同浓度蛋氨酸对猪胎盘滋养层细胞VEGF-A的mRNA表达没有影响。
  4.VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。本试验利用VEGF-A抑制剂Bevacizumab对细胞进行处理,研究了VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。结果表明,与高浓度蛋氨酸处理组相比,添加Bevacizumab处理后的细胞迁移能力显著降低(P<0.05),而与生理浓度蛋氨酸相比没有显著性差异。在血管生成试验中,添加Bevacizumab处理后形成管腔数、总的分支长度和总的节点数与高浓度蛋氨酸处理组相比显著降低(P<0.05);与生理浓度蛋氨酸相比,总的分支长度仍显著增加(P<0.05),总的节点数无显著差异。说明了在猪血管内皮细胞中,VEGF-A在介导蛋氨酸促进内皮细胞的血管生成中发挥了关键作用。
  5.蛋氨酸调控VEGF-A基因表达机制的研究。VEGF-A的mRNA水平增加涉及到转录水平和转录后水平的调控。本试验通过染色质免疫共沉淀技术来探究蛋氨酸对RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因CDS区的结合能力的影响。结果表明,在高蛋氨酸水平下,RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因启动子结合没有显著变化。利用放线菌素D进行处理,当处理时间增加到30和60min时,高蛋氨酸处理组VEGF-A的mRNA稳定性显著高于低蛋氨酸处理组(P<0.05)。说明了,提高蛋氨酸不影响VEGF-A转录水平,而是通过提高VEGF-A mRNA转录后的稳定性来调节的。
  综上所述,本研究的结论是:
  1.提高蛋氨酸水平促进了猪血管内皮细胞的迁移和血管生成,但该作用不依赖于滋养层细胞。
  2.蛋氨酸促进猪血管内皮细胞迁移和血管生成是通过提高VEGF-A基因表达来实现的。
  3.蛋氨酸通过影响了VEGF-A mRNA转录后的稳定性提高了VEGF-A的mRNA水平。
[硕士论文] 牛红丹
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:应激反应导致机体内应激激素大量分泌,其中以皮质醇为主,它是影响肉质的一个较为重要的因素。课题组前期研究表明,在动物日粮饲喂过程中添加皮质醇会导致仔猪背最长肌肌肉组织受损严重,肌纤维间隙增大,凋亡细胞数增多。但目前关于应激激素是如何影响肉质以及通过何种方式导致肉质发生变化的机制并不完全清楚。现今研究表明糖皮质激素(glucocorticoid,GC)主要通过细胞膜与体内糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)结合发挥一系列调控作用。在这些基础上,本课题以GRα为主要研究对象,探究GRα对猪原代骨骼肌细胞(pig skeletal muscle cells,PSC)生长的影响以及在猪劣质肉产生过程中的作用,并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:
  1.地塞米松引起猪肌细胞氧化应激
  地塞米松(dexamethasone,DEX)处理PSC细胞后发现其对肌细胞有明显的毒性,且与对照组相比DEX组细胞内的活性氧自由基大量上升,造成细胞氧化应激;等浓度米非司酮(mifepristone,RU486)处理后细胞内的活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)明显下降。通过MTT法检测DEX对PSC细胞增殖的影响,实验结果表明:DEX抑制PSC细胞增殖。通过qPCR和Western blot检测DEX对细胞应激的影响,结果表明:DEX能促进PSC细胞中HSP90的表达;等浓度RU486处理后能抑制PSC细胞中HSP90的表达。
  2.GRa对PSC细胞功能的影响
  通过构建GRα超表达载体和合成siRNA来超表达和抑制GRα的表达。通过流式细胞仪和MTT法检测GRα对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达GRα可以促进PSC细胞凋亡,抑制PSC细胞增殖。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR检测GRα对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达GRa能促进PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和GPX2的表达;同样,干扰GRα能抑制HSP90、CAST和GPX2的表达。超表达GRα和干扰GRα后检测谷胱甘肽过氧化物酶活性,实验结果表明:超表达GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高,干扰GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。可能是机体应激水平过高,并通过提高谷胱甘肽过氧化物酶活性以维持机体稳定。
  3.GRα靶基因的筛选
  干扰GRα后根据表达差异筛选GRα的靶基因,定量结果显示,干扰GRa后极显著下调Tβ10的表达,下调HSP90和HSP7的表达;且超表达GRα后Tβ10的表达显著升高,上调HSP90和HSP27的表达,且在网站上预测出GRα与Tβ10的结合位点。因此推测Tβ10可能是GRα的靶基因,双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀等试验初步验证,结果表明Tβ10可能是GRα潜在的靶基因。构建Tβ10超表达载体后通过流式细胞仪检测Tβ10对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达Tβ10可以促进PSC细胞凋亡。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR实验检测Tβ10对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达Tβ10能促进PSC细胞中BAX、HSP90、HSP27和CAST的表达。
  4.APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激
  与GRα组相比添加不同浓度的(0.1mg/mL,1mg/mL,10mg/mL和100mg/mL)黄芪多糖(astragalus Polysacharin,APS)后可缓解细胞应激,并通过检测ROS含量找出最适浓度为10mg/mL。添加10mg/mL APS后机体的ROS水平显著降低,且与对照组趋于一致。通过MTT法检测APS对PSC细胞增殖的影响,结果表明:APS可显著缓解超表达GRα后抑制PSC细胞增殖的作用。且添加APS后与GRα组相比谷胱甘肽过氧化物酶活显著降低,从而维持机体稳定。通过QPCR和Western blot检测APS对PSC细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果显示:与GRα组相比添加APS可抑制PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和Tβ10的表达。表明APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激。
[硕士论文] 李明杨
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:母猪的繁殖力很大程度上决定了猪场的经济效益,而繁殖性状是由微效多基因控制的数量形状,遗传力较低,采用常规育种手段很难在较短时间内得到明显进展。目前国内外育种研究者将分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)与常规育种方法相结合来进行选育,能够促进猪繁殖性状的遗传改良进程。因此鉴定影响繁殖性状的候选基因或分子标记可为猪育种工作提供重要的理论依据。本实验在大白猪群体中,基于GWAS以及基因功能研究结果鉴定了HBEGF、KPNA7、FOXA2和PTGS2等四个候选基因,利用PCR-RFLP和Sequenom质谱等方法进行了SNP检测,并研究了SNP与繁殖性状之间的关联。主要研究结果如下:
  (1)在法系大白猪HBEGF基因第一、三内含子上共发现并验证了三个新SNP,分别为rs81218760、rs81218761和rs333992579。在法系大白经产母猪中,rs81218760位点AC基因型个体的初生窝重显著高于AA型个体(P<0.05),CC基因型个体的弱仔数显著低于AC基因型和AA基因型个体(P<0.05);在法系大白猪初产和经产母猪中,rs81218761位点CC基因型个体的弱仔数均显著低于TT基因型个体(P<0.05);在法系大白初产和经产母猪中,rs333992579位点TC基因型个体的初生窝重均显著高于TT型个体,另外在经产母猪中,TC基因型个体的健仔数显著高于TT基因型个体(P<0.05),而其弱仔数显著低于TT基因型个体(P<0.05)。
  (2)在法系大白猪KPNA7基因第一、三外显子区域,第一、三内含子区域以及5'UTR区域中发现并验证了六个新SNP,分别为rs81308652、rs321312903、rs327848277、rs334590006、rs336259402和rs339249916。在法系大白初产母猪中,rs81308652位点CT基因型个体的总产仔数显著高于TT基因型个体(P<0.05),而在经产母猪中TT基因型个体的弱仔数显著低于CC基因型个体;在法系大白初产母猪中,rs327848277位点GG基因型个体的初生窝重和健仔数均显著高于GT基因型个体(P<0.05),在经产母猪中,GG基因型个体的弱仔数要显著低于GT基因型个体;另外四个位点的多态性与法系大白猪繁殖性状之间的关联性均没有达到显著水平。
  (3)在法系大白猪FOXA2基因3'UTR区域检测到一个新SNP(rs328630446),该位点的GG和CG基因型个体的弱仔数均显著低于CC基因型个体(P<0.05)。
  (4)在美系和法系大白猪PTGS2基因第九外显子上检测到一个新SNP(rs322152513),在美系大白初产母猪中,该位点AA基因型个体显著低于AG基因型个体,而在经产母猪中,AA基因型个体的初生窝重显著高于AG基因型个体(P<0.05);在法系大自初产和经产母猪中,rs322152513位点多态性与繁殖性状之间的关联性并不显著。
  综上所述,本研究发现了HBEGF、KP NA7、FOXA2以及PTGS2基因内部的SNP与猪繁殖性状之间存在关联,为猪繁殖性状的遗传改良提供了理论基础。
[博士论文] 刘会敬
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪是肉类蛋白的主要来源,同时,也可作为研究人类健康问题的重要医学模型。骨骼肌是动物体内最丰富的组织,因此研究猪骨骼肌的生长发育对肉质生产科学和人类医学都具有重大意义。本研究以生长速度和肉质性状存在显著差异的约克夏猪和通城猪作为研究对象,采用RNA-seq技术,探索了妊娠期40,55,63,70和90天两猪种胚胎背最长肌差异表达基因不同的时序性表达规律,推测了两猪种间肌纤维发育差异的时间拐点,在此基础上探究中外猪种在妊娠时期胚胎骨骼肌发育的分子调控机理;使用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术,检测了妊娠期55天两猪种胚胎背最长肌的差异甲基化图谱,分析了两猪种差异DNA甲基化对肌纤维发育的调控;并对转录组测序数据和全基因组重亚硫酸盐测序数据进行了联合分析,分析了DNA甲基化对两猪种肌纤维发育过程中差异表达基因的调控作用,主要研究内容和结果如下;
  1.利用RNA-seq技术获得了通城猪和约克夏猪妊娠5个时期的胚胎背最长肌的转录组表达谱,并利用荧光定量PCR验证了测序结果的可靠性。在通城猪和约克夏猪分别筛选到1317个和691个差异表达基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分别对上述通城猪和约克夏猪的发育依赖的DEGs进行时序性分析,发现了在两个猪种中都显著富集到的表达模式0,39,20和21,表达模式10,11,13和25只在通城猪中显著富集,表达模式14和15只在约克夏猪中显著富集。分别对通城猪和约克夏猪的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,结果发现两猪种共同表达模式39显著富集的GO条目中均发现了多个与肌肉生长发育相关的GO条目;共同表达模式0显著富集的GO条目中均发现了多个与细胞周期相关的GO条目。通路富集分析结果显示,通城猪和约克夏猪差异表达基因富集的前10条通路中有8条是两猪种共同富集到的,但富集程度不同。这些结果说明妊娠时期胚胎的背最长肌的发育机制在两猪种中有相似之处,又存在一定的差异。
  2.对两个猪种分别在5个时期的基因表达进行差异比较分析,总共获得了1677个差异表达基因。5个比较组中,妊娠55天的差异表达基因最多。对两个猪种间的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,发现黏着斑(Focal adhesion),细胞外基质受体互作(ECM-receptor interaction),氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8条显著富集的通路。然后,对两猪种间差异表达基因进行蛋白互作网络分析,发现PTEN,EP300,MYO9A,CDK14,IRS1,PPP1CC和一些核糖体蛋白基因可能对揭示两猪种胚胎肌肉发育差异有重要作用。
  3.通过ASprofile软件分析,发现第一个外显子可变剪切(TSS)和最后一个外显子可变剪切(TTS)事件是两猪种中最主要的可变剪切类型。
  4.本研究通过WGBS技术构建了通城猪和约克夏猪在妊娠55天时胚胎背最长肌全基因组DNA甲基化图谱,并揭示了其DNA甲基化特征;CG双核苷酸甲基化是两猪种基因组DNA甲基化的主要方式,只有极少部分DNA甲基化发生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中,CG位点甲基化水平在内含子和3,UTR中的DNA甲基化水平较高,而非CG位点甲基化水平在CGI区域最高。
  5.通过WGBS技术,通城猪和约克夏猪之间获得了211822个差异甲基化区域(DMR),涉及到了12261个差异甲基化基因(DMG),其中在通城猪中差异高甲基化的有36582个DMR,涉及到DMG个数为5301;在约克夏猪中差异高甲基化的DMR为175240个,涉及到DMG为11746个。对两猪种的DMGs进行GO和KEGG通路功能注释和富集分析,发现在CG、CHG、GHH三种不同序列环境下的DMGs都显著富集到多个GO条目;KEGG通路富集分析发现非CG序列环境下的DMGs均显著富集到多条通路,而CG序列环境下的DMGs只显著富集到磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidyhnositol signaling system)。通过WGBS技术,鉴定到启动子区域的DMR为5946个,涉及到DMG为4578个。对启动子区DMGs进行GO和KEGG通路富集分析,发现只有CHH序列背景下的DMGs显著富集到了GO条目,但是在三种序列背景下的DMGs主要富集到的GO条目中有一些与肌肉发育相关GO条目;在三种序列背景下的DMGs都没有显著富集到通路,但主要富集的通路中都有核糖体(Ribosome),这表明核糖体通路中基因启动子甲基化可能会调控肌肉的发育。
  6.对转录组测序数据与全基因组甲基化测序数据进行联合分析,通过在整体水平上分析DNA甲基化水平与基因表达水平的相关性,发现两猪种在基因转录起始位点上游2kb及基因本体靠近转录起始位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈负相关;基因本体靠近转录终止位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈正相关。检测到同时是DMG又是DEG的基因个数616个,对其进行通路富集分析发现,主要富集的通路中黏着斑,Wnt信号通路(Wnt signahng pathway),凋亡(Apoptosis-multiple species),细胞外基质受体相互作用和TGF-beta信号通路(TGF-beta signahng pathway)在肌肉生长发育中发挥着重要作用。
  7.构建候选基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并筛选到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫荧光技术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,肌管形态的变化,发现两个干涉组的肌管数目都明显低于对照组,且RPL6干涉组的肌管明显变粗。使用流式细胞术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,对C2C12细胞周期进程的影响,发现RPL6基因参与了细胞周期的调节,干涉RPL6后会使滞留于G1期的细胞比例显著高于对照组,滞留于S期和G2期的细胞比例显著低于对照组;发现干涉TPPP3后,细胞周期各阶段的细胞比例与对照组相比皆无明显差异。通过免疫荧光技术鉴定到超表达基因RPL6可以增加细胞中增殖细胞核抗原(PCNA:增殖标志基因)蛋白的表达。
[硕士论文] 屈文萍
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:骨骼肌卫星细胞是一类位于肌纤维膜表面与基底膜之间的细胞,在肌肉的发育和再生过程中发挥着重要的作用。长非编码RNA(Long non coding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt,具有低蛋白编码潜力的RNA分子。lncRNA能够调控基因表达、参与表观遗传修饰,影响细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动的进程。本研究以体外分离的猪骨骼肌卫星细胞为材料,研究一个新的lncRNA-AK394747在细胞增殖和分化过程发挥的功能及可能存在的机制。主要研究结果如下:
  1.利用两步酶消化法成功分离出活性较高、有一定增殖能力的猪原代骨髂肌卫星细胞,经差速贴壁纯化后,用Pax7基因对分离的细胞进行鉴定,免疫荧光结果显示细胞阳性率高达95%。同时,对分离的细胞进行分化诱导培养,能形成肌管,且稳定表达MyoD、MyoG和MyHc这三个成肌标志基因。
  2.通过RACE和测序验证了猪AK394747全长为1586bp,生物信息学分析发现该lncRNA不具有编码蛋白的能力,主要存在于细胞质中,时空表达谱分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉组织中高表达,且随着猪骨骼肌细胞的分化表达量上升。
  3.在猪骨骼肌细胞中利用干扰和超表达实验研究了AK394747对细胞增殖和分化的影响,EdU、RTCA以及细胞周期检测等实验结果发现该lncRNA对骨骼肌细胞的增殖过程无显著影响,并且增殖相关基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表达变化不显著;而干扰AK394747后,利用Q-PCR、Westren Blotting以及免疫荧光技术检测发现肌细胞分化标志基因MyoD、myoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表达显著下降,表明AK394747促进了猪骨骼肌细胞分化。
  4通过生物信息学筛选了4个潜在的与AK394747结合的miRNA—ssc-miR-32,ssc-miR-218,ssc-miR-218-3p,ssc-miR-301。在干扰AK394747后,其中ssc-miR-32及其pri-RNA表达降低。通过在线软件预测发现AK394747基因与NICD蛋白可能相互结合,同时利用Q-PCR技术检测发现干扰AK394747后NICD(Notch1胞内片段)基因的表达显著升高。
  本实验研究了猪lncRNA-AK394747的基本性质,验证了其促进骨骼肌细胞分化的基因功能,初步预测了其可能发挥作用的方式,为研究AK394747在骨骼肌细胞发育过程中的作用机制奠定了基础,同时也为研究猪骨骼肌生长发育调控机制提供了新的思路。
[博士论文] 王永亮
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:猪肉是我国人民主要消费的肉食品,然而随着生活水平的提高,人们已经不满足于温饱,而是更倾向于高品质肉类的消费,对肉类的口感等提出了更高的要求。现代分子生物学技术为寻找提高肌肉品质的重要基因或能够改善肉质的靶标提供了有力支持。
  成纤维生长因子21(FGF21)是一种肽类激素,由多个器官合成并参与调节能量代谢。令人兴奋的是众多研究表明FGF21具有对代谢有益的作用,这包括降低体重和改善血糖。在肝脏中,FGF21对调节禁食、高脂饲喂状态下脂肪酸氧化发挥很重要的作用。在白色脂肪组织中,FGF21参与糖代谢,并促进白色脂肪组织的棕色化。但是关于FGF21对猪肉的肌内脂肪的影响,以及对提高肌内脂肪含量的饲料添加剂的研究却鲜有报道。AdipoRon是一种脂联素受体激动剂,参与机体脂质代谢和能量代谢,提高机体胰岛素敏感性,是治疗胰岛素抵抗相关疾病的一个候选药物。本文重点研究了FGF21和小分子合成药物AdipoRon对猪和小鼠模型中脂代谢的调控,主要结果如下:
  1.为了了解FGF21对肌内脂肪沉积的作用,我们利用“差速贴壁法”成功分离了猪原代肌内脂肪(intramucular fat,IMF)细胞,该细胞呈现长梭形,与成纤维细胞形状类似。细胞状态良好,细胞质内未发现肉眼可见的脂肪滴。
  2.向生长状态良好,并达到80%汇合的IMF细胞完全培养基中加入IBMX、DEX和胰岛素,处理8天后前体脂肪细胞将逐步分化为成熟脂肪细胞。油红O染色结果显示大量细胞出现脂滴,并在油红O的作用下呈现橘红色,说明IMF细胞已成功分离。
  3.对原代肌内脂肪细胞实施稳定转染,并经过脂质体转染和G418筛选,逐步出现了FGF21稳定单克隆(FM),实时定量PCR结果显示稳定转染组细胞FGF21的mRNA水平显著高于对照组,并且Western blot也表明稳定转染组细胞中FGF21的蛋白水平显著提高。
  4.通过对两组分化处理后的细胞进行成脂分化处理,并对分化八天的细胞做油红O染色。染色结果显示经过八天分化后对照组细胞细胞质内出现大量细小的脂肪滴,然而FM组细胞中脂肪滴明显比对照组少。
  5.为了研究成脂分化相关基因在FM组和对照组之间的表达差异,我们制备了这两个组的cDNA文库和细胞总蛋白。实时定量PCR结果显示表达PPARγ基因的mRNA水平显著低于对照组,并且对PPARγ表达起到关键作用的CEBPα和CEBPδmRNA水平显著低于对照组;同时我们还检测到了PPARγ和CEBPα的蛋白表达量显著低于对照组。CEBPδ的mRNA水平并无差异,但是蛋白表达量明显低于对照组。同时参与PPARG mRNA表达的KLF2、SIRT1、SIRT2和FOXO1基因的mRNA水平无明显差异,调控CEBPα表达的COUP-TFⅡmRNA无明显变化。然而实验组中KLF3的mRNA水平显著高于对照组,而KLF5的mRNA表达水平显著低于对照组。FAS和HSL之间的比值下调了,但未达到显著水平,并且AGPAT和visfatin表达无差异。
  6.FABP4和PLIN1的mRNA表达在FGF21超表达组显著降低,但是并没有检测到GLUT4和ADIPOQ mRNA的改变。Western Blot的结果证实了FABP4和ADIPOQ的蛋白显著降低。然而FGF21对经典Wnt/β-catenin信号通路无显著影响。而且FGF21也没有改变CEBPα启动子靠近转录起始位点区域(-172-+2bp)的甲基化水平(FM:control=1.1%:1.5%)。但是我们发现成脂分化相关转录因子CEBPβ通过结合到FGF21启动子区域,抑制FGF21基因的转录。
  7.与此同时,我们应用小鼠模型进一步研究脂联素受体激动剂模拟物AdipoRon如何参与PPARα信号进而调控FGF21提高机体胰岛素敏感性。数据表明低脂饲料饲养的C57BL/6小鼠在接受每天10mg/kg AdipoRon药物处理10天后,体内脂肪的总体含量没有变化,并且脂肪分解蛋白表达无差异。然而高脂饲料饲喂的C57BL/6小鼠在接受每天10mg/kg AdipoRon药物处理10天后,白色脂肪组织中脂肪分解相关蛋白的表达受到抑制,降低了血液中棕榈酸和甘油的周转速率。同时由于肝脏中来自脂肪酸β氧化的乙酰辅酶A含量的减少,降低了对丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)的激活作用,从而减少内源性葡萄糖的产量。
  8.通过提取两组肝脏组织总蛋白,运用Western blot技术检测蛋白表达水平,数据显示AdipoRon激活了肝脏内PPARα信号通路,进而促进肝脏内FGF21的表达与分泌,上调血液浓度中FGF21浓度至1.36倍,从而导致白色脂肪组织中脂质分解作用的抑制。
  综上所述,我们主要研究了FGF21在对肌内脂肪中脂质代谢的调控,并且进一步探究了AdipoRon如何调控肝脏内FGF21表达,以此调控机体脂肪代谢,并影响脂质在体内的分布,这对高肌内脂肪含量猪的选育工作具有重要的借鉴意义。
[博士论文] 朱明飞
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:NDRG4(N-Myc downstream-regulated gene4)作为分析芯片数据(GDS586和GDS4924)时发现的一个表达差异基因,其在骨骼肌成肌分化过程中随着分化表达显著增加,在骨骼肌损伤再生过程中表达也显著增加,NDRG4在肌肉发育过程中可能发挥着重要作用,但它在骨骼肌发育中的功能未见报道。基于此,本研究探讨了NDRG4在肌细胞分化过程中的功能及其调控机制,并分析了该基因内SNP与猪生长育肥性状的关系,主要研究结果如下:
  1.通过多序列比对结果,发现NDRG4蛋白在不同物种间具有很高的保守性,氨基酸序列相似性达87%以上,并且具有多段保守的氨基酸序列区域。在C2C12细胞和猪骨骼肌卫星细胞中检测发现NDRG4在成肌分化过程中分化期表达量显著高于细胞增殖期;在利用心脏毒素构建小鼠骨骼肌损伤再生模型中发现NDRG4在未损伤的小鼠后肢肌肉中表达量较低,损伤后2-5天NDRG4的表达量迅速增加。
  2.通过构建NDRG4的超表达载体和RNA干涉片段,RTCAxCELLigence细胞增殖检测系统和流式细胞仪检测发现NDRG4不影响C2C12细胞增殖;Western blotting和细胞免疫荧光技术的结果表明,NDRG4能促进MyoD、MyoG和MyHC的表达,从而促进成肌分化。
  3.免疫共沉淀和亚细胞共定位实验证明了NDRG4通过与pAkt竞争性结合CTMP蛋白,从而激活Akt/CREB通路;pcDNA3.1-NDRG4和CREB干涉片段或CREB磷酸化抑制剂(H89)的共处理实验证明了NDRG4通过CREB蛋白调控成肌分化,并且磷酸化的CREB(pCREB)在促进成肌分化中发挥主要作用;转录因子结合位点分析和ChIP实验证明了NDRG4通过提高pCREB在MyoD和MyoG启动子的结合活性来促进成肌分化。因此,NDRG4通过Akt/CREB通路促进骨骼肌细胞成肌分化。
  4.通过PCR技术扫描猪NDRG4基因前3个外显子、前3个内含子和第20个外显子序列,鉴定出4个潜在的SNP位点。其中,rs342827092位点发生A→G转换突变,我们建立了该位点的Hinfl-RFLP分型方法。在大白猪和杜洛克猪群体中进行了标记与生长性状的关联分析,发现该SNP与杜洛克猪的100Kg体重日龄存在显著的关联性,AA基因型个体达100Kg体重日龄低于AG和GG型个体,且AA基因型和GG基因型个体间差异显著(P<0.05)。利用Sequenom SNP分型技术检测rs322396417、rs81499361和rs325739056三个位点的基因多态性,并分析基因多态性和性状之间的关联性。rs322396417位点多态性与法系大白猪的左右乳头数存在显著关联。CG型个体的左乳头数显著多于GG型个体,CC型个体的右乳头数显著多于GG型个体。rs81499361位点多态性对法系大白猪相关性状均没有显著影响。rs325739056位点多态性与法系大白猪的背膘厚存在极显著相关。AG型个体的背膘厚极显著大于GG型个体。
  综上所述,本研究结果阐明了NDR G4对促进骨骼肌细胞C2C12分化的分子机制及NDRG4基因多态性与猪生长与繁殖性状间的关联,为NDRG4基因在猪育种中的应用奠定了理论基础。
[硕士论文] 张昊
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:雌性动物的主要生殖器官是卵巢,卵泡是卵巢的主要功能单位,每一个卵泡腔内含有一个卵母细胞以及数量巨大的卵泡颗粒细胞,而卵泡颗粒细胞在维持生殖功能方面有着重要的地位。卵母细胞在排卵前一直被卵泡液包裹,卵泡液的主要组成部分是卵泡颗粒细胞的分泌物和卵泡膜血管渗出液。颗粒细胞分泌的FSH、LH、类固醇等激素,为卵母细胞的生长创造了良好的环境,对卵母细胞的生长有着重要的促进作用,同时也精确的调控着卵母细胞的生长发育。卵泡颗粒细胞成为研究动物生殖生理的一种理想细胞模型。
  本研究在前期转录组测序基础上,筛选到可能与山羊卵母细胞增殖相关的关键基因CPEB1。以江苏南通本地白山羊为研究对象,构建该基因的过表达载体pcDNA3.1-CPEB1和小分子RNA干扰载体siCPEB1。探究其在山羊卵巢颗粒细胞增殖过程中的生物学功能。
  主要研究结果如下:
  1.山羊CPEB1的克隆、以及构建该基因的真核表达pcDNA3.1-CPEB1载体和小分子RNA干扰载体siCPEB1:利用PCR成功克隆出CPEB1的CDS区,并将其成功克隆至pcDNA3.1载体上,成功构建真核表达载体pcDNA3.1-CPEB1,并且通过酶切及测序鉴定无误;成功合成CPEB1的siRNA片段siCPEB1-1、siCPEB1-2、siCPEB1-3和siCPEB1-NC,其中siCPEB1-3对成年母羊和幼龄母羊卵巢颗粒细胞中CPEB1的干扰活性达到80%以上。
  2.分别过表达和敲低该基因在山羊卵巢颗粒细胞中的mRNA表达水平,通过qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达水平和使用Western Blot检测相关基因的蛋白表达水平:
  (1)转染真核表达载体pcDNA3.1-CPEB1进入卵泡颗粒细胞后,CPEB1在成年母羊组mRNA表达水平提高20倍,在幼龄母羊组mRNA表达水平提高16倍。同时,成年母羊组的细胞增殖相关基因CYCLINB1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别上调10、17、10倍;幼龄母羊组的细胞增殖相关基因CYCLIN B1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别上调11、12、7倍。CPEB1在成年母羊组蛋白表达水平提高1.7倍,CPEB1在幼龄母羊组蛋白表达水平提高2倍,而成年母羊组的增殖相关基因CYCLIN B1,CDK1的蛋白表达水平分别上调1.7,1.6倍;幼龄母羊组的增殖相关基因CYCLIN B1,CDK1的蛋白表达水平分别上调2,1.5倍。说明过表达CPEB1能够上调增殖相关的CDK1、CYCLIN B1和C-MOS,能有效促进山羊卵巢颗粒细胞的增殖。
  (2)转染小分子RNA干扰载体siCPEB1进入卵泡颗粒细胞后,CPEB1在成年母羊组mRNA表达水平降低约80%,在幼龄母羊组mRNA表达水平降低约80%。同时,成年母羊组的增殖相关基因CYCLINB1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别下调50%、50%、65%左右;幼龄母羊组的增殖相关基因CYCLINB1、CDK1、C-MOS的mRNA表达水平分别下调40%、80%、40%倍。CPEB1在成年母羊组蛋白表达水平降低55%,CPEB1在幼龄母羊组蛋白表达水平下降65%,而成年母羊组的增殖相关基因CYCLIN B1,CDK1的蛋白表达水平分别下调35%,40%;幼龄母羊组的增殖相关基因CYCLIN B1,CDK1的蛋白表达水平分别下调60%,35%倍。敲低CPEB1能够下调增殖相关的CDK1、CYCLIN B1和C-MOS,能够有效抑制山羊卵巢颗粒细胞的增殖。
[博士论文] 李华伟
动物营养与饲料科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:肌内脂肪含量是评定羊肉品质的关键指标,探索肌内脂肪营养调控技术和沉积机制成为目前生产和科研关注的重点。肌内脂肪沉积,是肉羊生长、体脂分配、血液脂质代谢、脂肪酸组成、脂肪代谢关键基因及转录调控因子等综合作用的结果。胆碱在调控单胃动物脂肪分配方面发挥重要作用,但是其对肉羊生长及各部位脂肪组织中脂肪酸代谢变化的调控作用及机制缺乏研究。本研究采用过瘤胃胆碱(Rumen Protected choline,RPC)作为营养调控剂,借助动物饲养试验、代谢组学、分子生物学技术以及生物信息学分析技术,研究胆碱对肉羊脂肪代谢和肌内脂肪形成的调控作用及分子机制。全文分为4个部分进行。
  试验一、RPC对肉羊生长性能及体脂肪分配的影响
  试验选取3-5月龄和10-12月龄杜泊羊×湖羊杂交F1代公羔开展两期试验,每期试验选用24只,随机分成4组(6头/组,组间体重差异不显著(P>0.05)),分别为对照组、0.25% RPC、0.50% RPC和0.75% RPC添加组,每期试验60d,试验结果如下:
  3-5月龄肉羊阶段,添加RPC有提高肉羊采食量、日增重、料肉比的作用(P<0.05)。RPC对3-5月龄肉羊血液甘油三酯、总胆固醇、HDL和LDL均无显著影响(P>0.05)。RPC有降低3-5月龄肉羊血液FFA含量的作用(P<0.01),对血清皮质醇、瘦素、脂联素和胰岛素无显著影响(P>0.05)。RPC对屠宰率、眼肌面积、肋肉厚度、皮下脂肪厚度无显著影响(P>0.05),试验组腹脂率、肾脂率和盆脂率较对照组有所降低,但并不显著(P>0.05)。添加RPC有提高肾、脾脏、胃、小肠重量的作用,但差异并不显著(P>0.05);对背最长肌脂肪含量无显著影响(P>0.05);对背最长肌、前腿肌pH具有显著的升高作用(P<0.05)。RPC降低3-5月龄肉羊前腿肌、后腿肌失水率(P<0.05),对背最长肌失水率调控效果不显著(P>0.05); RPC有提高背最长肌、前腿肌、后腿肌嫩度的潜在作用,但差异并不显著(P>0.05)。
  10-12月龄肉羊阶段,添加RPC对肉羊采食量、日增重、饲料利用率无显著影响(P>0.05)。RPC对10-12月龄肉羊血液甘油三酯、胆固醇、HDL、LDL含量无显著影响(P>0.05)。RPC对10-12月龄肉羊血液FAA有先升高后降低作用,但差异并不显著(P>0.05),RPC显著降低胰岛素水平(P<0.05);对抵抗素、脂联素有趋势性降低效果,但差异不显著(P>0.05)。RPC对10-12月龄肉羊的屠宰率无显著影响(P>0.05),降低腹脂率、肾脂率和盆脂率,对眼肌面积和皮下脂肪厚度有提高作用,增加肝、肾、胃和大肠重量,但差异均不显著(P>0.05);显著增加脾脏和小肠重量(P<0.05)。PPC对10-12月龄肉羊背最长肌脂肪含量略有降低,但差异并不显著(P=0.73),对调节背最长肌、前腿肌和后腿肌pH值无显著影响(P>0.05),降低背最长肌、前腿肌和后腿肌失水率、剪切力,但差异并不显著(P>0.05);对肉色调控无显著效果(P>0.05)。RPC能够提高10-12月龄肉羊皮下脂肪和背最长肌中PUFA含量,但差异并不显著(P>0.05),提高n-3、n-6脂肪酸含量,降低背最长肌中SFA含量,但均无显著影响(P>0.05),RPC对背最长肌中C18∶0、C18∶1trans、C18∶1cis、C18∶2cis含量略有提升,但差异并不显著(P>0.05)。
  添加RPC能够降低10-12月龄肉羊皮下脂肪、腹脂、肾周脂肪和盆腔脂肪组织的细胞直径(P<0.01),对各部位脂肪细胞降脂调控效果依次是肾脂>腹脂>盆腔脂肪>皮下脂肪,细胞直径分别较对照组降低33.52%、18.23%、17.47%、5.10%。
  试验二、RPC对肉羊尿液代谢组的影响
  试验选用体重相近的杜泊羊×湖羊杂交F1代公羔36头,随机分成3组,每组12头,组间体重差异不显著(P>0.05)。在基础日粮中分别添加0%、0.25%和0.75% RPC水平,饲养管理相同,预饲期10天,正试期5天,在第3-5天收集试验羊尿样,测定不同RPC添加水平对肉羊尿样代谢组的影响,分别采用PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析。结果表明:0.25%和0.75% RPC添加水平显著改变肉羊的尿样代谢组,差异代谢物主要有丙酮酸、氧化三甲胺、对甲酚、苯乙酰甘氨酸和马尿酸。RPC添加组较对照组尿液中丙酮酸含量减少,尿样中氧化三甲胺、对甲酚、苯乙酰甘氨酸和马尿酸含量有所提高。这些差异代谢物参与的生物反应过程主要有能量代谢、脂肪、蛋白质和AA代谢以及肠道微生物代谢。RPC能够改变肉羊机体脂肪和能量代谢,主要相关代谢物是丙酮酸和PAG。
  试验三、RPC对肉羊脂肪代谢关键基因表达的影响
  3-5月龄肉羊采集对照组、0.25% RPC和0.75% RPC试验组样品,10-12月龄肉羊采集对照组和0.25% RPC试验组样品,测定各组织样品中脂肪代谢关键基因mRNA相对表达量。结果发现:
  对于3-5月龄肉羊,RPC促进背最长肌中LPL、CD36、ACC、FASN、AGPAT1和ACADVLmRNA表达(P<0.05),对DGAT1、DGAT2、ATGL、HSL、MGLL和CPT-1β mRNA表达无显著影响(P>0.05)。RPC通过促进脂肪酸摄入、合成、酯化和氧化关键基因表达,,促进肉羊背最长肌脂肪酸沉积。
  RPC抑制3-5月龄肉羊盆腔脂肪中LPL、FASN和AGPAT1 mRNA表达(P<0.05),促进CD36、GPAT1和CPT-1β mRNA表达(P<0.05),对DGAT1、DGAT2、ATGL、HSL、MGLL和ACADVL mRNA表达无显著影响(P>0.05)。RPC主要通过降低3-5月龄肉羊盆脂脂肪酸摄入、合成和酯化关键基因mRNA表达,加强脂肪酸氧化关键基因表达,整体降低肉羊盆脂沉积。
  RPC降低3-5月龄肉羊肾周脂肪中的LPL、FASN、GPAT1、AGPAT1 mRNA表达(P<0.01),提高脂肪酸氧化关键基因CPT-1β和ACADVL mRNA表达(P<0.01),对CD36、ACC、DGAT1、DGAT2、ATGL、HSL和MGLL mRNA表达无显著影响(P>0.05)。RPC主要通过降低脂肪酸摄入、合成和酯化关键基因表达,加强脂肪酸氧化关键基因表达,降低肾周脂肪沉积。
  RPC降低3-5月龄肉羊皮下脂肪中CD36、ACC、GPAT1和ACADVL mRNA表达(P<0.05),提高LPL、FASN、AGPAT1、DGAT1、ATGL和CPT-1β mRNA表达(P<0.05),RPC通过降低摄入、合成、酯化和氧化关键基因表达,促进脂肪酸水解关键基因表达,整体降低皮下脂肪沉积。
  RPC降低3-5月龄肉羊腹脂CD36、ACC、FASN、GPAT1、DGAT2和ACADVL mRNA表达(P<0.05),促进LPL、AGPAT1、DGAT1和CPT-1β mRNA表达(P<0.01),RPC通过降低脂肪酸摄入、合成、酯化和氧化关键基因表达,整体降低腹脂沉积。
  对于10-12月龄肉羊,RPC降低0.25% RPC试验组肉羊背最长肌LPL和CD36 mRNA表达(P<0.01),促进HSL、MGLL和CPT-1β的mRNA表达(P<0.01),对ACC、FASN、GPAT1、AGPAT1、DGAT1、DGAT2、ATGL和 ACADVL mRNA表达均无显著影响(P>0.05)。RPC通过降低脂肪酸摄入关键基因表达,加强脂肪酸水解和氧化关键基因表达,整体降低10-12月龄肉羊背最长肌脂肪沉积。
  RPC抑制10-12月龄肉羊盆腔脂肪中LPL、ACC和FASN mRNA表达(P<0.01),促进CD36、GPAT1、AGPAT1、ATGL和ACADVL mRNA表达(P<0.05),对ATGL、DGAT1、DGAT2、HSL和CPT-1β mRNA表达无显著影响(P>0.05),RPC通过降低中脂肪酸摄入、合成关键基因表达,促进酯化、水解和氧化关键基因的表达,整体降低10-12月龄肉羊盆腔脂肪沉积。
  RPC降低10-12月龄肉羊肾周脂肪中LPL、ACC、FASN、GPAT1、AGPAT1、DGAT2、ATGL和ACADVL mRNA表达(P<0.05),促进MGLL mRNA表达(P<0.05),RPC通过降低脂肪酸摄入、合成、酯化和水解关键基因表达,整体降低肾周脂肪沉积。
  RPC降低10-12月龄肉羊皮下脂肪组织CD36、GPAT1和ACADVL mRNA表达水平(P<0.05),促进FASN和ATGL mRNA的表达(P<0.05)。RPC通过降低脂肪酸摄入、合成、酯化和氧化关键基因表达,加强脂肪酸水解关键基因表达,整体降低10-12月龄肉羊皮下脂肪沉积。
  RPC降低10-12月龄肉羊腹脂CD36、ACC、FASN、GPAT1、DGAT2、ATGL和ACADVLmRNA表达(P<0.05),增加LPL、DGAT1和MGLL mRNA表达水平(P<0.05)。RPC通过降低脂肪酸摄入、合成、酯化、水解和氧化关键基因表达,整体降低10-12月龄肉羊腹脂沉积。
  试验四、RPC对肉羊肌内脂肪沉积调控的分子机制
  添加RPC对3-5月龄肉羊背最长肌中LXRα、LXRβ mRNA表达无显著影响(P>0.05),对PPARα转录有上调作用,但差异并不显著(P>0.05),说明RPC对3-5月龄肉羊肌内脂肪沉积的调控机制主要通过维持LXRα和促进PPARαmRNA表达,进而上调脂肪代谢关键基因,促进肉羊背最长肌脂肪沉积的效果。添加RPC对10-12月龄肉羊背最长肌中LXRα和PPARα mRNA表达均产生抑制效果,整体降低脂肪沉积。
[博士论文] 吴正常
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:腹泻是导致断奶仔猪死亡的重要传染性疾病,对养猪业造成了巨大的经济损失,F18大肠杆菌(E.coli F18)菌株是引起断奶仔猪细菌性腹泻的主要病原菌之一。为了进一步揭示中国地方猪品种断奶仔猪抗E.coli F18的遗传基础和调控机制,本研究以地方品种一梅山猪为研究对象,利用不同血清型F18大肠杆菌F18ab和F18ac菌株口服攻毒试验,并结合仔猪肠道E.coli F18细菌检测、细菌计数以及小肠上皮细胞黏附等一系列试验验证,筛选出确证的梅山猪F18大肠杆菌抗性与敏感型断奶仔猪个体,进一步利用RNA-seq转录组和长链非编码RNA(lncRNA)测序对梅山猪F18大肠杆菌抗性相关调控通路、功能基因以及lncRNA进行了系统筛选,并从mRNA、蛋白质以及细胞水平分别对重要调控通路、关键基因以及lncRNA进行系统的功能验证,以期揭示功能基因及lncRNA在梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性过程中的调控作用及其分子机制,为解决国内地方猪种E.coli F18抗性育种关键科学问题提供一定的理论参考。此外,本研究同时以培育品种—苏太猪(杜洛克×梅山猪)为研究对象,基于课题组前期建立的苏太猪F18大肠杆菌抗性与敏感型资源群体,利用高通量测序分析了苏太猪F18大肠杆菌抗性相关的调控通路以及候选基因,结合关于外来猪品种F18大肠杆菌抗性基因的文献挖掘结果,进一步探讨和验证外来猪品种F18大肠杆菌抗性相关的调控通路以及候选基因,以期揭示中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控遗传基础的差异性。
  主要研究结果如下:
  1.梅山断奶仔猪E.coli F18敏感和抗性型个体间十二指肠转录组分析
  (1)梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性与敏感型个体间筛选出198个差异表达基因DGEs,其中抗性组上调基因125个,大部分DGEs涉及到免疫系统“Immune System”和感染性疾病“Infectious Diseases”通路,其中筛选出一个富集程度较高的免疫通路—Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)以及通路中关键的基因CD14。
  (2)脂多糖(LPS)诱导小肠上皮细胞IPEC-J2后,qPCR和western blot检测发现Toll样受体信号通路中大部分基因(CD14、TLR4、IL-1β、ERK、IFN-α、JNK、p38、NFkB和TNF-α)表达水平均表现出明显的上调,表明Toll样受体信号通路在调控F18大肠杆菌感染过程中确实发挥重要的作用。
  (3)免疫组化IHC结果表明,CD14在肠道组织中广泛分布,并且抗性组中表达水平明显高于敏感组;利用RNAi沉默CD14基因后,F18ab菌毛与IPEC-J2黏附能力极显著上升(P<0.01),而F18ac菌毛与IPEC-J2黏附能力上升但不显著(P>0.05);通路中IL-1、IFN-α、TLR4和TNF-α基因表达水平均发生显著下调(P<0.05),而MyD88基因表达水平下调但不显著(P>0.05);白细胞介素(IL-6和IL-12)因子表达水平显著下降(P<0.05),而IL-8、MIP-1α和MIP-1β表达量降低但未达到显著水平(P>0.05)。以上结果表明CD14表达水平上调有利于提高F18大肠杆菌抗性。
  2.苏太断奶仔猪E.coli F18敏感和抗性型个体间十二指肠转录组分析
  (1)苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性与敏感型个体间筛选出238个差异表达基因DGEs,其中抗性组上调基因112个,DGEs涉及到免疫相关通路如抗原加工与呈递(Antigenprocessing and presentation)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway),其中包括TAP2、TLR5、IL1β基因;以及鞘糖脂合成通路(Glycosphingolipid biosynthesis-lactoand neolacto series),其中包括具有重要生物学功能的FUT2基因。
  (2) LPS诱导以及不同血清型F18大肠杆菌F18ac、F18ab分别刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后,qPCR和Western blot检测FUT2、TAP2、IL-1β和TLR5表达水平均表现为明显的上调;组织表达谱检测表明,FUT2基因在肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、淋巴结、胸腺、十二指肠和空肠等组织中均有表达,其中肠道组织尤其是十二指肠表达量相对较高,qPCR和western blot检测表明,敏感组个体十二指肠和空肠组织中FUT2基因表达水平均极显著高于抗性组(P<0.01);利用RNAi沉默FUT2基因后,IPEC-J2细胞对大肠杆菌F18ab和F18ac的黏附能力均显著下降(P<0.05),以上结果表明FUT2基因表达水平下调有利于提高F18大肠杆菌抗性。
  (3) FUT2启动子区甲基化分析表明,22个CpG位点存在不同程度的甲基化,mC-6和mC-22位点甲基化水平与mRNA表达存在显著负相关(P<0.05),其中mC-22位于Sp1转录因子结合位点上;凝胶迁移EMSA试验表明,十二指肠组织中核蛋白与FUT2野生型非甲基化探针结合,加入Sp1抗体后,非甲基化野生型探针出现了超迁移(supershift)现象,表明核蛋白中Sp1转录因子可以特异性结合FUT2野生型非甲基化探针,以上结果表明,FUT2启动子区mC-22位点甲基化修饰抑制了Sp1转录因子与启动子DNA结合,降低了FUT2基因表达水平,进而提升了F18大肠杆菌抗性。
  3.梅山与苏太断奶仔猪E.coli F18敏感和抗性型个体间十二指肠长链非编码RNA分析
  (1)lncRNA测序结合生物信息学分析在梅山猪和苏太猪中共获得2056个候选lncRNA分子,根据p-value<0.05原则,梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体之间存在24个差异表达lncRNA,其中抗性组中上调21个;苏太猪存在23个差异表达lncRNA,其中抗性组中上调7个。基于cis和trans机制进行靶基因预测发现,cis机制预测出梅山猪所有差异表达lncRNA上下游共存在59个可能靶基因,而苏太猪所有差异表达lncRNA上下游存在67个可能靶基因;trans机制预测出梅山猪RNA-seq中存在517个基因与差异lncRNA存在显著的表达相关性,而苏太猪RNA-seq中存在96个基因与差异lncRNA存在显著的表达相关性。靶基因参与GO功能以及KEGG通路分析表明,靶基因涉及到信号传导通路(如NF-kappa B signaling pathway)、免疫相关通路(如Toll-like receptor signalingpathway)、疾病感染通路(如Salmonella infection)、糖脂类合成相关通路(如Glycosaminoglycan biosynthesis-KS)等。
  (2)梅山猪与苏太猪抗性与敏感型个体十二指肠间存在3个共同差异表达lncRNA:TCONS_00183659、TCONS_00352975、TCONS_00053650;结合靶基因预测及其功能分析,筛选出一个与F18大肠杆菌抗性相关的重要lncRNA—TCONS_00183659,其序列100 kb范围内发现一个可能靶基因FUT3。TCONS_00183659位于猪2号染色体,长度为5831 bp,具有两个exon(5746 bp和85 bp),是不连续的,属于基因间的lncRNA。
  (3) qPCR检测结果表明,TCONS_00183659在梅山猪和苏太猪F18抗性组个体十二指肠组织中表达水平极显著高于敏感组个体(P<0.01);荧光原位杂交技术FISH分析表明,TCONS_00183659在细胞核和细胞质中均有分布;成功建立沉默TCONS_00183659猪小肠上皮细胞IPEC-J2系,干扰效率达到69.58%; RNApull down结合western blot验证表明,TCONS_00183659与Histone H4存在相互作用;TCONS_00183659干扰前后IPEC-J2蛋白组学结合western blot验证分析表明,干扰TCONS_00053650后Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表达升高。以上结果表明,TCONS_00183659可能通过与组蛋白Histone H4结合,从而调控Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表达。
  结合前期国内外相关研究结果,本研究进一步揭示了中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控的遗传基础确实存在差异,Toll样受体信号通路及其CD14基因在梅山猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中发挥着免疫调控作用,其中CD14基因表达上调有利于提高仔猪对E.coliF18感染抗性;而鞘糖脂合成通路及其FUT2基因可能在外来猪品种F18大肠杆菌受体形成过程中起关键作用,其中FUT2基因表达下调有利于提高仔猪对E.coli F18感染抗性。此外,本研究系统揭示了长链非编码RNA在断奶仔猪F18大肠杆菌抗性过程中的调控机制,筛选出1个关键lncRNA:TCONS_00183659,并且推测该lncRNA可能通过与组蛋白Histone H4结合,从而调控Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表达,今后需要进一步验证TCONS_00183659调控作用是否与Histone H4表观遗传修饰有关。
[硕士论文] 鲁伟
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,随着H7N9流感的侵袭以及消费者对公共卫生与食品安全意识的加强,我国黄羽肉鸡—优质鸡的活禽市场日趋萎缩,代之为经过屠宰初加工的冰鲜型优质黄鸡—“冰鲜黄鸡”。但是,迄今为止尚无冰鲜黄鸡的产品评价标准,无法鉴别冰鲜黄鸡品质、保存和已销售时间,消费者对冰鲜黄鸡的认可度和接受度不高。为帮助消费者更好地接受冰鲜黄鸡,本研究以冰鲜黄鸡(冰鲜型雪山黄鸡)为试验材料,首先对其屠体外观和肉品质进行研究,判断是否适合冰鲜销售;其次,测定4℃保存期间冰鲜黄鸡肉中微生物含量,找到含量变化的关键转折点;最后,通过测定4℃保质期间冰鲜黄鸡的感官和理化指标,同时结合电子鼻和电子舌技术,对冰鲜黄鸡新鲜度进行等级划分。
  1.冰鲜黄鸡屠体外观与肉品质测定
  以冰鲜黄鸡为研究对象,测定其背、腹部的毛孔密度;胸肌和腿肌的pH值、肉色、失水率、嫩度、肉成分(水分、蛋白、脂肪、胶原)。结果表明,背部毛孔密度显著高于腹部(P<0.05),母鸡毛孔密度高于公鸡,屠体美观。肉品质方面,胸肌的pH值、红度、嫩度、胶原和脂肪含量低于腿肌,而亮度、失水率和蛋白含量高于腿肌,说明胸肌肉质细嫩、蛋白含量高;腿肌肉色更加红亮,胶原脂肪含量高。雪山黄鸡屠体与肉品质良好,适合冰鲜加工。
  2.冰鲜黄鸡保存期间微生物含量变化
  对4℃保存期间冰鲜黄鸡肉中细菌总数进行测定,结果表明,细菌总数随保存时间延长,呈上升趋势。其中,保存前3天细菌总数增长快速,且差异显著(P<0.05),可作为冰鲜黄鸡肉新鲜度下降的一个关键转折点,保存5天时所有样品的细菌总数均超过107 cfu/g,冰鲜黄鸡肉腐败变质,可将其作为第二个关键转折点。另外,鸡肉新鲜度在不同性别与部位之间存在差异,公鸡较母鸡变质快,腿肌较胸肌变质快。
  3.冰鲜黄鸡新鲜度的测定与等级划分
  对冰鲜黄鸡肉产品的感官指标、pH、ATP、IMP含量进行测定,同时结合电子鼻和电子舌技术,对冰鲜黄鸡新鲜度进行评价与等级划分。结果显示:感官指标、pH值、ATP、IMP含量均在3-5天出现较大转折,电子鼻检测结果显示所有样品均在保存4天时传感器特征值降至最低,判别分析发现保存4天样品与保存3、5天样品气味差别明显,电子舌的LDA分析结果表明保存3天和5天是鸡肉新鲜度变换的两个关键转折点。结合微生物含量变化,将冰鲜黄鸡新鲜度划分为三个等级:保存3天以内为一级鲜,保存3-5天为二级鲜,保存5天以上为不新鲜。综上,建议冰鲜黄鸡销售时间控制在3-4天之内,即“黄金72小时”原则。
[硕士论文] 王文强
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:本研究以南方黄牛云岭牛和文山牛的背最长肌组织为实验材料,以西门塔尔牛的背最长肌组织为对照,比较不同牛品种的肉品质的差异,利用甲基化修饰依赖性内切酶测序法(MethylRAD-seq)和亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)技术分析比较不同品种牛背最长肌的甲基化图谱,分析甲基化对不同品种牛肌肉肉质的调控影响。结合MethylRAD-seq和实验室已有的RNA-seq的数据,分析甲基化对不同牛种肉质基因的表达调控,进一步研究甲基化对牛背最长肌的调控机制。
  背最长肌肉品质测定结果表明,牛肉中pH值和失水率在云岭牛、文山牛和西门塔尔牛之间差异不显著(P>0.05),云岭牛和文山牛的脂肪百分含量显著高于西门塔尔牛(P<0.05),西门塔尔牛的蛋白质含量显著高于文山牛(P<0.05)。本次实验测定的4种常见脂肪酸(肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸)在云岭牛,文山牛和西门塔尔牛之间的含量差异不显著(P>0.05)。
  MethylRAD-seq分析结果表明,云岭牛、文山牛和西门塔尔牛分别有7027017(57.74%),6405515(56.37%),6734119(58.12%),6092960(54.82%),5510367(56.94%),7204540(62.06%),6829702(61.38%),6759345(54.58%),6901684(57.14%)个reads可以比对上牛参考基因组的唯一位置,这三种牛基因组中主要的甲基化模式是CpG型。唯一比对上的reads主要分布在gene和mRNA上。不同牛品种之间比较,以西门塔尔牛为对照组,在云岭牛肌肉组织中共检测到39个甲基化差异基因,在文山牛肌肉组织中共检测到123个甲基化差异基因,以文山牛为对照组,云岭牛肌肉组织中共检测到104个甲基化差异基因,只有一个差异基因(ALDH3A1)在西门塔尔牛、文山牛和云岭牛之间甲基化水平均显著差异(P<0.05)。KEGG pathway分析表明,这些甲基化差异基因显著富集的信号通路主要是氨基酸代谢,Ras信号通路、α-亚麻酸代谢、血管平滑肌收缩、脂肪消化吸收、醚类脂质代谢等(P<0.05)。
  MethylRAD-seq和实验室已有的RNA-seq结果的联合分析表明,西门塔尔牛和文山牛之间有21个基因甲基化程度和表达量均差异,西门塔尔牛和云岭牛之间有24个差异甲基化和表达基因,文山牛和云岭牛之间有80个差异甲基化和表达基因。
  本研究利用亚硫酸氢盐测序技术(BSP)检测3个候选基因(ACAD11,FADS6,FASN)启动子区甲基化程度,并分析基因表达量与启动子区甲基化程度之间的关系。结果表明,FADS6和FASN整体的DNA甲基化程度与表达量呈现负相关,西门塔尔牛FASN的DNA甲基化程度显著高于云岭牛和文山牛(P<0.05),FADS6的DNA甲基化程度在三个品种的牛之间差异不显著,FADS6的CpG4位点的甲基化程度西门塔尔牛品种显著高于云岭牛品种,CpG7位点的甲基化程度西门塔尔牛和云岭牛品种显著高于文山牛品种,除了CpG7、CpG9、CpG19、CpG14、CpG15位点以外,其余位点的甲基化水平和表达量之间的关系为负相关。FASN的CpG1、CpG2、CpG3、CpG5、CpG7、CpG10位点甲基化水平和表达量之间的关系为负相关。
[硕士论文] 吕晓阳
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:前期在湖羊羔皮毛囊中利用基因芯片技术筛选出不同花纹间差异表达基因BMP7,结合湖羊羔皮毛囊组织学特性关联分析,确定BMP7作为候选基因,BMP7蛋白是TGF-β超家族中最大的分泌型信号传导分子之一,BMP7除了与骨形成发生有关,还被发现与羽毛胚芽的大小和空间分布有关,在毛囊的发育与毛发生的生长中起着重要作用,但本身的调控机制并不清楚。为此,本研究对BMP7的转录调控机制进行初步研究,首先对湖羊不同组织进行BMP7表达水平分析,其次克隆BMP7近端启动子进行生物信息学分析,接着根据生物信息学分析结果与近端启动子序列构建系列缺失载体双荧光素活性检测,最后对转录因子结合位点定点突变和转录因子过表达验证,从而揭开BMP7启动子区的转录调控机制,为后续的研究提供依据。本研究主要通过以下几个方面研究BMP7的转录调控机制:
  (1)利用RT-qPCR对BMP7在湖羊的各个组织表达情况进行分析,发现在羔皮毛囊组织中高表达。
  (2)通过NCBI数据库得到BMP7转录起始点上游大约2000bp下游500bp的调控序列,以2500bp的序列为基础进行近端启动子克隆,获得了1757bp的序列。对BMP7近端启动子上游转录调控区域进行了生物信息学预测分析,发现在BMP7近端启动子上游调控区存在-1216bp—-1166bp与-632bp—-582bp两个转录起始位点;对CpG岛分布情况分析,发现-549bp—+295bp处富含CpG岛,进行转录因子结合位点预测,发现有SP1、EGR1、NRF1、TFAP2B等转录因子结合位点。
  (3)根据BMP7近端启动子序列设计启动子系列缺失片段,将各个缺失片段构建到双荧光素酶报告基因载体上,转染293T细胞进行双荧光酶检测不同缺失片段活性并进行显著性比较,寻找双荧光素酶活性最高的序列片段,发现核心区域-758bp—-545bp之间活性较高,对其进行生物信息学预测,发现存在转录因子SP1、EGR1可能结合位点,对BMP7启动子转录调控起着一定作用。
  (4)为了进一步鉴定BMP7近端启动子上游转录调控区域的转录因子结合位点,根据生物信息学结果筛选出EGR1和SP1,对其转录因子结合位点进行定点突变,同时构建BMP7的转录因子EGR1进行过表达载体进一步验证。结果显示,突变后的BMP7近端启动子上游调控区的活性呈显著性降低;过表达EGR1转录因子,BMP7上游调控区活性呈显著性上升,初步推断EGR1与SP1对BMP7转录调控具有重要的作用。
[硕士论文] 左晓昕
动物营养与饲料科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:质子转运载体15家族(Solute carrier15 family,SLC15)又被称为小肽转运载体家族,主要位于细胞膜上,能够利用电化学梯度将短链肽和拟肽类物质转运进入细胞内。SLC15家族成员主要包括SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4,目前鲜有报道能够全面地研究这些小肽转运载体在成年奶牛上的表达差异。小肽转运载体能够转运肠道中的营养物质,它也受这些营养物质调控。丙氨酰谷氨酰胺二肽(alanyl-glutamine,Ala-Gln)作为小肠的主要能源物质,它对肠道中小肽转运载体的调控也鲜有研究。因此本试验研究SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛组织器官中的表达情况以及Ala-Gln对奶牛小肠上皮细胞(Bovine intestinal epithelial cells,BIECs)中小肽转运载体的调控作用,为SLC15家族在成年奶牛中的生物学功能以及Ala-Gln对BIECs的调控机制提供科学依据。
  试验一、小肽转运载体在成年奶牛组织器官中的表达
  试验选取3头健康的成年荷斯坦奶牛进行屠宰,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠。试验采用实时荧光定量PCR法对器官组织中的SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4mRNA进行分析;采用Western Blot方法对器官组织中的SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白进行分析。试验结果发现SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA在器官组织中均能表达,但是在回肠中没有发现SLC15A2 mRNA的表达。SLC15A1在成年奶牛的肺脏、肾脏和空肠的表达极显著高于其它器官组织(P<0.01); SLC15A2在肾脏组织中的表达量均极显著高于其它器官组织(P<0.01);SLC15A3 mRNA在瘤胃、脾脏、结肠和肺脏中的表达极显著高于其它器官组织(P<0.01); SLC15A4在脾脏,肾脏,肝脏,盲肠,结肠和肺脏中均有较高的表达水平。
  试验二、奶牛小肠上皮细胞原代培养及其小肽转运载体的表达
  在无菌条件下分离奶牛小肠上皮组织,用胰酶消化获得BIECs并纯化,免疫荧光和琼脂糖凝胶电泳鉴定BIECs,实时荧光定量PCR检测细胞内SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA表达;Western Blot检测细胞中SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白表达。结果表明,BIECs的细胞质中均含有细胞角蛋白18荧光,在细胞中检测到绒毛蛋白、上皮细胞钙粘蛋白和小肠脂肪酸结合蛋白基因的表达证实细胞为纯化的BIECs。细胞中SLC15A1 mRNA的表达量极显著高于SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA(P<0.01)。SLC15A1蛋白的表达量最高,极显著高于SLC15A2和SLC15A4(P<0.01)。
  试验三、Ala-Gln对奶牛小肠上皮细胞中小肽转运载体表达的影响
  不同时间和浓度的Ala-Gln培养BIECs,确定最佳培养时间和浓度。用实时荧光定量PCR检测Ala-Gln、丙氨酸(L-alanine,Ala)和谷氨酰胺(L-glutamine,Gln)对BIECs中小肽转运载体及其相关基因mRNA的影响,Western Blot检测Ala-Gln、Ala和Gln对BIECs中SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白的影响。结果发现,Ala-Gln能够促进BIECs增殖,其中1 mM Ala-Gln在4h时极显著促进细胞增殖(P<0.01),并且该组中SLC15A1mRNA、SLC15A2 mRNA、SLC15A3mRNA和SLC15A4 mRNA的表达量极显著高于其它各组(P<0.01),显著促进SLC15A1蛋白的表达(P<0.05)。Cdx2和PPAR-α mRNA的提高能够上调SLC15A1mRNA的表达量。Ala-Gln培养BIECs后发现磷脂酰肌醇3激酶(pho sphatidylinositol3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路关键基因的表达都显著升高(P<0.05)。
  综上,SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛中广泛表达,但是它们在器官组织中的表达水平存在较大差异。SLC15A1 mRNA在BIECs中表达量最高,主要是通过Cdx2和PPAR-α基因调控的。Ala-Gln能够上调小肽转运载体的表达,并且能上调PI3K/AKT传导信号中关键基因的表达。
[硕士论文] 程国虎
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:卵泡颗粒细胞是卵泡的一种重要组成单位,环绕于卵母细胞周围。随着卵泡的发育,卵泡颗粒细胞会发生相应的变化,其增殖分泌的多种激素及生长因子与卵母细胞的生长和成熟有着极为重要的作用。
  本研究前期发现,幼龄母羊与成年母羊的卵母细胞在体外成熟过程中,成熟率有着显著性差异,并且幼龄母羊的卵母细胞经体外成熟受精后发育至四细胞的比例也显著性低于成年母羊。试验中发现,幼龄母羊与成年母羊的卵泡颗粒细胞有着很大的不同点,无论是数量,还是环绕卵母细胞的形态。
  另一个发现就是细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C基因在幼龄母羊卵母细胞与成年母羊卵母细胞中的表达有显著性差异,这个基因具有调控细胞分裂周期作用,可调节真核生物细胞有丝分裂,是细胞周期进入M期的关键因子之一。
  综合上述两种发现,本实验决定从卵泡颗粒细胞的角度验证CDC25C基因功能,尝试解开不同年龄阶段卵母细胞成熟率差异的原因。本实验以江苏南通当地白山羊为研究对象,采集1.5年龄以上的成年母羊与2月龄羔羊的卵巢并使用0.01M PBS带回实验室。体外分离卵泡颗粒细胞经培养转染后,对成年母羊与羔羊的卵泡颗粒细胞进行了CDC25C、CDK1、WEE1相关基因,雌激素和孕激素,转染后细胞周期等相关检测,结果如下:
  1.山羊CDC25C基因的克隆
  根据NCBI提供的CDC25C基因序列,设计引物克隆CDC25C基因的CDS区,随后构建该基因的pCMV-HA-CDC25C载体和小分子干扰载体siCDC25C。测序结果表明pCMV-HA-CDC25C载体构建正确,与此同时小分子干扰载体siCDC25C在预实验中被证实有效,皆可用于后续试验。
  2.原代分离细胞的鉴定
  依据酶联免疫原理,山羊卵泡颗粒细胞表面拥有特异性FSH受体,试验采用RabbitAnti-FSHR多克隆抗体作为一抗,SA1074-兔IgG为二抗,经过酶联免疫检测后认定,本实验分离的细胞绝大部分都是所需要的卵泡颗粒细胞,可继续后续试验。
  3.CDC25C基因对卵泡颗粒细胞的影响
  构建pCMV-HA-CDC25C载体和小分子干扰载体siCDC25C,转染成年山羊和幼龄山羊卵泡颗粒细胞后,利用实时荧光定量PCR技术对CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量进行检测,利用酶联免疫方式检测了PROG和E2两种激素分泌情况,利用切片技术比较了成年山羊与幼龄山羊卵巢的区别,利用细胞周期检测技术比较了两种山羊卵泡颗粒细胞转染重组载体和干扰载体后的细胞周期区别。
  (1)转染pCMV-HA-CDC25C载体后,成年山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量都得到了显著性提升;PROG和E2两种激素的分泌量也有所上升,且与空白组比较差异显著;成年山羊卵巢上的卵泡较少,但发育程度更好;细胞中分裂期占间期的比例得到显著性上升。转染pCMV-HA-CDC25C载体后,幼龄山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C基因的相对表达量得到上升,但是CDK1、WEE1基因的相对表达量却出现了下降;PROG和E2两种激素的分泌量也有所上升;幼龄山羊卵巢上的卵泡更多,但发育程度不好;细胞中分裂期占间期的比例得到显著性上升。
  (2)转染小分子干扰载体siCDC25C后,成年山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量都有所下降;PROG和E2两种激素的分泌量有一定上升;细胞中分裂期占间期的比例有显著性下降。幼龄山羊的卵泡颗粒细胞的CDC25C、CDK1、WEE1基因的相对表达量均有所下降;PROG和E2两种激素的分泌量有一定上升;细胞中分裂期占间期的比例有显著性下降。
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