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[硕士论文] 吴岱津
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是大部分心脑血管疾病的重要危险因素,动脉粥样硬化因理想的动物模型缺乏在一定程度上限制对其药物干预治疗和发病机制的研究,而兔子因其独有的特点使之成为研究动脉粥样硬化和高脂血症的最适合模型之一。据报道LDLR功能缺陷是引起高胆固醇血症及AS的主要原因之一,本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑对新西兰大白兔基因组中与动脉粥样相关基因进行基因编辑,对低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)的基因外显子上的主要结构域进行了敲除,从而破坏了其功能。
  研究针对LDLR基因的第二外显子和第七外显子的启动子分别构建了两对CRISPR/Cas9表达质粒,通过加帽(ARCA)和加尾修饰后的sgRNA和Cas9mRNA配对用来显微注射制备转基因兔。本研究一共超排34只供体兔子,获得了804枚受精卵。其中注射LDLR靶位点Cas9mRNA和sgRNA第二外显子(E2)的胚胎数目为116枚,移植胚胎110枚,胚胎存活率94.83%;新西兰兔受体移植6只,兔怀孕顺利分娩2只,怀孕率33.33%;共出生4只仔兔,全部死亡,成活率为0%。注射Cas9mRNA和sgRNA第七外显子(E7)的胚胎数目为209枚,移植胚胎202枚,胚胎存活率96.65%;新西兰兔受体移植12只,兔怀孕顺利分娩6只,怀孕率50%;共出生14只仔兔,成活仔兔11只,成活率为78.5%。同时在E2和E7位点上注射Cas9mRNA和sgRNA的胚胎数目为442枚,移植胚胎373枚,胚胎存活率84.39%;新西兰兔受体移植19只,兔怀孕顺利分娩11只,怀孕率57.90%;共出生19只仔兔,成活仔兔8只,成活率为42.11%。在饲养过程中因为温度、疾病等因素,活到成年并继续血脂检测实验转基因兔16只。
  本研究获得的16只仔兔基因组PCR产物测序结果显示LDLR的2个位点均出现不同程度的突变,T载体克隆检测结果表明第七外显子突变(E7)共获得的8只仔兔全部双等位基因突变,双等位基因突变率为100%.其中3只LDLR基因突变兔两条染色体突变状况完全相同,确定为纯合子,纯合子率为37.5%。送检检测结果表明第二外显子(E2)和第七外显子(E7)2个靶位点共同突变的活转基因兔8只,1只未突变,突变率为87.50%,剩余7只LDLR基因突变兔均为双等位基因突变。
  LDLR敲除兔子分别在第5周,10周,15周抽血,使用全自动生化分析仪检测兔血清CHOL、TG、LDL、HDL水平,通过SPSS软件数据分析发现CHOL含量突变组是正常组的17倍,LDL含量突变组是正常组的12倍,TG含量突变组是正常组的3倍,HDL突变组是正常组的2倍,CHOL和LDL2个指标与正常组比较P<0.01差异极显著,TG和HDL与正常组比较P<0.05差异显著,表明利用CRISPR/Cas9系统可成功构建高血脂模型。
  在表型分析血脂脂蛋白的分布情况,结果显示与野生型兔相比LDLR-/-兔Beta区染色较深,说明该样本中富集低密度脂蛋白。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)主要成分是血清载脂蛋白B,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)中主要成分是载脂蛋白AI,Western bloting实验结果显示LDLR-/-apoB的含量远大于野生型。LDLR-/-兔血脂蛋白中apoAl的含量比野生型低,其两者的比值可反映出致动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化脂质颗粒的平衡。ApoB和ApoAⅠ含量从侧面也体现了LDL-C和HDL-C的水平。
  苏丹红Ⅳ脂质沉积图片软件测量正常组兔子整条血管面积24812,斑块面积413,斑块占血管面积比例1.66%。测量模型组兔子整条血管面积23701,斑块面积15604,斑块占血管面积比例65.83%。可见动脉粥样硬化病变区有大量红染脂滴,并且主要集中在增生的内膜,结果显示模型组LDLR-/-斑块形成明显。
  主动脉切片结果表明LDLR-/-兔的主动脉出现管腔狭窄,管腔内膜增厚,表面覆盖脂质斑块和大量的泡沫细胞,发生血管壁增厚现象。测量结果取均值得出突变兔血管梗塞比例73.48%。正常兔血管梗塞比例37.65%。研究表明模型突变兔斑块内阳性细胞积分光密度(IOD)值28498.0098及Area面积242558,计算得出MOD值0.1174894。测量正常变兔斑块内阳性细胞积分光密度(IOD)值6824.50049及Area面积217538,计算得出MOD值0.0314,突变组的巨噬细胞阳性率明显大于正常组(P<0.01)。
  综上所述,本课题研究利用Cas9基因编辑技术和sgRNA显微胞质注射兔受精卵,成功获得典型动脉粥样LDLR基因敲除兔。目前还未有获得LDLR基因敲除兔个体的相关报道。通过各个表型分析数据表明本研究制备的兔模型可产生明显的动脉粥样病理变化。同时本课题为以后血栓疾病的治疗和研究打下基础。
[博士论文] 刘吉宏
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:微渗透泵(Mini Osmotic Pump)利用渗透压提供药物释放的驱动力,不仅能将药物持续、定量、定点地缓释到给药部位,还能在恒定状态下持续观察注射药物在动物体内的作用情况。与传统给药方法相比,微渗透泵给药有明显的优点,已广泛用于实验动物造模及药理学研究,其中许多应用已成为经典的实验动物模型。不同规格微渗透泵的载药量、释药速率和有效时间均有不同,因此具体使用时需要进行优化调整,才能满足不同科研的需要。
  Alzet微渗透泵可在动物清醒状态下进行连续给药,单泵持续时间可长达6周。本研究比较了该类微渗透泵与机械注射泵的体内释药速率,释药3h、8h和24h后的血浆药物浓度无明显差异,两种释药方法均可达到恒速水平。因此确定了该研究的应用基础
  本研究选择2001D、2001、2002、2004、2006等6种型号在大鼠上进行测试,微渗透泵的体外释药速度分别达到7.7±0.3ul/h和23.6±1.6、11.7±0.8、5.9±0.4、3.7±0.2ul/day,达到说明书要求。体外测试发现正确的药物填充和适当的孵育时间对微渗透泵达到理想释药速率至关重要,延长孵育启动时间有助于微渗透泵恒速释药。
  为了评价微渗透泵植入对大鼠的影响,本研究比较了微渗透泵皮下植入与口服给药的动物体重和摄食量的变化。微渗透泵皮下植入组术后第一天体重和摄食量下降极显著,第二天体重不再下降;摄食量下降极显著,术后第三天基本恢复正常,与比口服给药组相比体重恢复速度显著加快。
  本研究优化了手术方案,优化了大鼠颈静脉插管和髓鞘插管模型,术后三天动物体重恢复正常,可以进行相应的测试和实验。
  用5%福尔马林成功建立了大鼠福尔马林急性模型,两阶段疼痛期明显,不同性质的镇痛药都可缓解福尔马林引起的疼痛,极显著降低二期持续疼痛时长。5mg/kg吗啡可显著抑制大鼠福尔马林模型1期急性疼痛,极显著抑制二期持续疼痛;100mg/kg加巴喷丁和布洛芬可极显著抑制大鼠福尔马林模型1期急性疼痛,极显著抑制二期持续疼痛;不同浓度瑞普巴林对大鼠福尔马林急性模型1期急性疼痛没有显著抑制作用;10mg/kg和30mg/kg瑞普巴林可极显著抑制二期持续疼痛,3mg/kg不能显著抑制二期疼痛期疼痛。通过比较发现人工观察和疼痛自动检测仪都可记录福尔马林造成的急性疼痛,人工观察的精度相对较高,自动检测仪的通量较大,根据实验需要可以采用不同的监测方法。
  测试药物原生物毒素Ⅱ(ProTx-Ⅱ)是Nav1.7钠离子通道选择性抑制剂。稳定性研究结果显示,生理盐水不适合作为ProTx-Ⅱ的溶剂,4小时内药物浓度即下降50%。吐温80可维持ProTx-Ⅱ的稳定性,最低有效浓度为0.025%。微渗透泵颈静脉释药可安全地将大鼠血液ProTx-Ⅱ浓度提高到125±18nM,能显著抑制福尔马林急性模型30%二期持续疼痛期的疼痛,并可延迟二期持续疼痛期的发生。大鼠单次静脉注射ProTx-Ⅱ的最大耐受量为0.1mg/kg,不能抑制一期急性疼痛期和二期持续疼痛。微渗透泵髓鞘内释药可直接将ProTx-Ⅱ释放入大鼠中枢系统,25ng/hr和7.5ng/hr剂量组的福尔马林急性疼痛显著抑制,没有明显的药物剂量依赖性。
  微渗透泵在实验动物中的释药技术已相对成熟,大鼠的福尔马林急性疼痛模型也被广泛的应用于止痛药物的测试中,本文创新的结合两个技术,使用微渗透泵缓释的方式测试大鼠的福尔马林急性疼痛模型,与常规长期给药方式相比不需要更多的人为操作,对动物应激显著减少,能避免起始血药浓度过高导致的毒副作用,平缓持久的药物浓度具有更好的治疗效果,可以作为大鼠药理学研究的理想工具。
[硕士论文] 金玉凤
中西医结合临床 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过本实验探讨朝医方“香附子八物汤”对肝郁脾虚证的作用机制,为临床用药提供动物实验依据,也为治疗肝郁脾虚证提供朝医有效方剂。
  方法:选取SD大鼠为实验对象,采用夹尾激怒法、饮食失节法、大黄灌胃苦寒泻下法致大鼠肝郁脾虚,制备大鼠实验性肝郁脾虚模型。按照完全随机设计法分为四组:正常对照组12只、肝郁脾虚模型组12只、阳性对照组(逍遥散治疗组)12只、香附子八物汤治疗组12只,平均雌雄各半;造模16天后,肝郁脾虚模型组每日灌胃生理盐水,阳性对照组和药物治疗组每日给予灌胃逍遥散、香附子八物汤浓缩煎汤。观察各组大鼠的一般状态,记录每组大鼠的饮水量、进食量以及体重的变化。灌胃治疗14日后,每组大鼠给予乌拉坦肌肉注射进行麻醉,摘取眼球,眼底静脉采血后拖颈处死。采用ELISA方法,测定各组大鼠血清中MTL、GAS、胃蛋白酶疗效指标的变化。剖腹摘取整胃,切取损伤较严重的胃黏膜组织一块,于10%甲醛溶液固定24h,包埋切片贴片,HE染色,封片。在不同倍数光镜下,观察大鼠胃黏膜组织的病理形态改变,各组相互比较,从而探析香附子八物汤对肝郁脾虚证的作用机制。
  结果:整个实验过程中,各组大鼠的饮水量差距不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。各组进食量在造模结束后,除了正常组以外,均较前减少,模型组、逍遥散组、香附子八物汤组与正常组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。经药物治疗后,逍遥散组和香附子八物汤组的进食量均有显著增加,与模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。造摸结束后,模型组、逍遥散对照组、香附子八物汤组的大鼠体重较正常组相比显著下降(P<0.05);经药物治疗后,逍遥散组和香附子八物汤组的体重明显增加,与模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),逍遥散组与香附子八物汤组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
  模型组大鼠血清中的MTL、GAS、PEPSIN指标,与正常组比较明显降低,具有显著性差异(P<0.05);香附子八物汤治疗组、逍遥散阳性对照组的大鼠血清中MTL、GAS、胃蛋白酶的含量明显高于模型组,具有显著性差异(P<0.05);模型组大鼠的胃黏膜上皮细胞出现明显的脱落,腺体排列紊乱疏松,粘液分泌增加,并存在间质性水肿,粘膜血管扩张、充血的改变。逍遥散组的腺体排列与正常组比较相对疏松些,上皮细胞的脱落明显减少。香附子八物汤组仍有少量脱落细胞,也有少量粘液分泌,但腺体排列程度与模型组比较明显转为规则整齐。两组经药物治疗后,组织间质水肿、充血等病理变化明显改善。
  结论:香附子八物汤可显著提高肝郁脾虚模型大鼠血清的胃泌素、胃动素浓度,显著增加血清胃蛋白酶含量,与阳性对照药物逍遥散相比,无显著性差异。通过调节胃肠激素和胃蛋白酶,可促进胃肠蠕动,促进消化功能,改善肝郁脾虚的症状。香附子八物汤还能改善因肝郁脾虚而出现的大鼠胃肠粘膜组织的病理变化,可修复已受损的胃粘膜组织,进而改善胃肠功能的紊乱。
[硕士论文] 刘馨宇
兽医学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:蒲公英甾醇(Taraxasterol)是一种从传统中药蒲公英中提取出来的五环三萜类的化合物,它有广泛的药理活性。本试验通过建立ConA和乙醇诱导的小鼠肝损模型,来探究蒲公英甾醇对小鼠免疫性和酒精性肝损伤的保肝作用及其机制,为蒲公英甾醇应用于临床提供理论基础。
  小鼠酒精性肝损伤模型:将小鼠分为6组,即空白组、EtOH组、硫普罗宁组(TPN组)、蒲公英甾醇组(10、5、2.5 mg/kg)。各组小鼠每日灌胃相应剂量的药物和50%的乙醇,各1次/d,连续15d。末次口服乙醇12h后,取血和肝脏。计算小鼠肝脏指数;测定小鼠血清中AST、ALT、TG、ADH和LDH的含量、小鼠肝脏中TG、MDA、GSH、SOD的活性和ROS的含量;ELISA法测定小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量;通过免疫组化和Western blot法来检测小鼠肝脏中含有的CYP2E1蛋白的表达;通过Western blot法检测小鼠肝脏中Nrf2、HO-1、Iκβα和p65的蛋白表达。小鼠免疫性肝损伤模型:将小鼠随机分为6组,即空白组、ConA组、联苯双酯组(Bif组)、蒲公英甾醇组(10、5、2.5 mg/kg)。除空白组和ConA组外,其他各组每日口服相应剂量药物,1次/d,连续7d。末次给药1h后,小鼠尾静脉注射18 mg/kg的ConA溶液,8h后,取血和肝脏。计算小鼠肝脏和脾脏指数;测定小鼠血清中AST、ALT的含量、肝脏中MDA、GSH、SOD的活性;ELISA法测定小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ和IL-4的含量;利用TUNEL法来检测肝脏细胞的凋亡情况;通过Western blot法检测小鼠肝组织中TLR2、TLR4、p65、Bax和Bcl-2的蛋白表达,计算Bax/Bcl-2的比值。
  与EtOH组相比,蒲公英甾醇能显著或极显著降低酒精肝小鼠肝脏指数、血清中ALT、AST、TG、ADH、LDH的含量、小鼠肝组织中TG、MDA和ROS的含量(P<0.05或P<0.01)、增强小鼠肝组织中GSH和SOD的活性(P<0.05或P<0.01);蒲公英甾醇能显著或极显著抑制小鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌(P<0.05或P<0.01);蒲公英甾醇能显著或极显著下调小鼠肝组织中CYP2E1和p65蛋白的表达、显著或极显著抑制IκBα蛋白的降解,显著或极显著上调肝脏中Nrf2和HO-1蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。与ConA组相比,蒲公英甾醇能显著或极显著降低小鼠肝脏和脾脏指数、小鼠血清中ALT、AST的含量、小鼠肝组织中MDA的含量(P<0.05或P<0.01)、增强小鼠肝组织中GSH和SOD的活性(P<0.05或P<0.01);蒲公英甾醇能显著或极显著抑制血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ和IL-4的分泌(P<0.05或P<0.01);蒲公英甾醇能显著或极显著下调小鼠肝组织中TLR2、TLR4和p65蛋白的表达,降低Bax/Bcl-2的比值(P<0.05或P<0.01)。
  结论:上述结果表明,蒲公英甾醇通过降低机小鼠血清中ALT、AST等酶类的活性,增加抗氧化酶的活性,减少脂质过氧化的发生,调控NF-κB通路中关键因子IκBα和p65蛋白的表达,上调Nrf2和抗氧化酶HO-1来抑制氧化应激的产生,对乙醇诱导的小鼠肝损伤起到保护作用;蒲公英甾醇通过抑制细胞因子的分泌,下调NF-κB p65蛋白和Bax蛋白的表达、上调Bcl-2蛋白的表达,降低ConA对肝细胞造成的损害和凋亡,从而对ConA所致的肝损伤起到保护作用。
[硕士论文] 徐洪全
人体解剖与组织胚胎学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:观察细胞凋亡与PI3K-AKT-mTOR及AMPK-mTOR通路在糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞中的变化,探讨其在糖尿病大鼠胃轻瘫发生过程中的意义。
  方法:制备糖尿病大鼠模型,实验分为正常对照组(NC)组、模型2W(DM2W)组、模型4W(DM4W)组和模型6W(DM6W)组,通过观察模型大鼠胃内色素残留率确定糖尿病胃轻瘫模型建立;利用流式细胞技术检测各模型组大鼠胃平滑肌细胞凋亡率;利用Western blotting法检测各组胃平滑肌PI3K、p-AKT、p-AMPK、p-TSC-2、p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1蛋白的表达。
  结果:胃内色素残留率NC组402&2.15,DM2W组4282±319,DM4W组4472±3.10,DM6W组50.65±3.31,呈现随病程延长逐渐增加趋势,且NC组与DM6W组比较(P<0.05);细胞凋亡率DM2W组1.54±0.46、DM4W组2.75±0.54与DM6W组7.48±0.36,呈现随病程逐渐增加趋势,其中DM4W组与DM6W组比较(P<0.01);PI3K-AKT-mTOR通路关键蛋白PI3K相对表达量,NC组0.44±0.03,DM2W组0.65±0.03,DM4W组0.54±0.06,DM6W组0.35±0.05,其中,与NC组比较,DM2W组与DM4W组表达量增高(p<0.01,p<0.05),DM6W组表达量降低(p<0.05),DM6W组与DM4W组比较表达量降低(p<0.01);p-AKT相对表达量,NC组0.53±0.02,DM2W组0.75±0.02,DM4W组0.73±0.03,DM6W组0.44±0.02,其中,与NC组比较,DM2W组与DM4W组表达量增高(p<0.01,p<0.01),DM6W组表达量降低(p<0.05),DM6W组与DM4W组比较表达量降低(p<0.01);AMPK-mTOR通路关键蛋白p-AMPK相对表达量,NC组0.34±0.04,DM2W组0.58±0.05,DM4W组0.70±0.05,DM6W组0.69±0.05,其中,与NC组比较,DM2W组、DM4W组与DM6W组表达量增高(p<0.01,p<0.01,p<0.01),与DM2W组比较,DM4W组与DM6W组表达量均增高(p<0.05);p-TCS-2相对表达量,NC组0.33±0.02,DM2W组0.60±0.03,DM4W组0.72±0.02,DM6W组0.73±0.04,其中,与NC组比较,DM2W组、DM4W组与DM6W组表达量增高(p<0.01,p<0.01,p<0.01),与DM2W组比较,DM4W组表达量增高(p<0.05);p-mTOR相对表达量,NC组0.48±0.03,DM2W组0.67±0.04,DM4W组0.68±0.03,DM6W组0.45±0.02,其中,与NC组比较,DM2W组与DM4W组表达量增高(p<0.01,p<0.01),与DM4W组比较,DM6W组表达量降低(p<0.01);p-p70S6K相对表达量,NC组0.37±0.04,DM2W组0.53±0.02,DM4W组0.52±0.02,DM6W组0.34±0.02,其中,与NC组比较,DM2W组与DM4W组表达量增高(p<0.01,p<0.01),与DM4W组比较,DM6W组表达量降低(p<0.01);p-4E-BP1相对表达量,NC组0.36±0.05,DM2W组0.57±0.03,DM4W组0.54±0.04,DM6W组0.35±0.02,其中,与NC组比较,DM2W组与DM4W组表达量增高(p<0.01,p<0.01),与DM4W组比较,DM6W组表达量降低(p<0.01)。
  结论:(1)细胞凋亡参与了糖尿病胃轻瘫的发生,并发挥了重要作用。(2)在糖尿病胃轻瘫发生过程中PI3K-AKT-mTOR及AMPK-mTOR通路被激活,可能参与调控细胞凋亡。(3)在糖尿病胃轻瘫发生过程中mTOR活性先增高后抑制,且参与细胞凋亡的调控,但不处于主导地位。
[硕士论文] 刘甜甜
公共卫生 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  随机化(randomization)是保证临床试验质量的基石,然而实践中并未引起与其重要性相称的关注。尽管近十几年来涌现出一些新的随机化方法,但其在临床试验中真正应用的情形并不多见。究其原因,一方面是因为有关随机化方法学的研究尚存争议,并未形成很好的学术共识;另一方面,很大程度上是因为还缺少与之对应的实用操作规程和实现工具。本研究将努力在对不同随机化方法进行综合性能比较的基础上优化方法的选择,形成推荐建议,并试图通过实现工具的开发促进随机化的优化应用。
  研究方法:
  本研究通过文献复习对各种常见的随机化方法进行总结讨论,选择几种常见的限制性随机化方法,借助随机模拟方法,分别从随机性和均衡性两个方面进行综合性能评价。随机性评价指标采用固定分配(deterministic assignment,DA)概率和猜对分配(correct guess,CG)概率;均衡性评价指标采用分配过程中组间受试者例数差的最大值(the maximum absolute imbalance in the randomization sequence,MI)、组间例数差的均数(the mean of the difference in treatment group sizes,Dn)、组间例数分配相等的频率(the probability of achieving exact balance in the randomization sequence,EB)。首先对传统的区组随机化方法,包括固定区组设计(permuted block design,PBD)和变化区组设计(varied permuted block design,VBPD)进行比较;然后对近些年提出的几种以最大允许不均衡性(maximal tolerated imbalance,MTI)为限制条件的随机化方法进行综合性能比较。本研究选择的MTI随机化方法主要包括大棒法(the big stick design,BSD)、陈氏偏币法(Chen's biased coin design with imbalance tolerance,BCDWIT)、区组瓮法(the block urn design,BUD)。我们分别编制了随机化实现的SAS宏程序,制作研发了能较好实现随机分配隐蔽的随机分配薄技术,开发了基于手机客户端的随机化App工具,并对随机化方法应用的规范报告进行了改进性建议。
  研究结果:
  研究发现,与固定区组随机化方法相比,当变化区组随机化方法采用的区组长度包括小于固定区组长度的区组时,未必能提高其综合统计性能;而当采用的区组长度均大于或等于固定区组长度的变化方式时,其综合统计性能是提高的。对多种基于MTI限制条件的随机化方法的比较结果显示,对于两处理组平衡试验来说,其综合统计性能依次为BSD、BUD、BCDWIT方法,而且均优于PBD。由于BCDWIT方法除了设置MTI参数外,还需预定调整概率,相比之下,BSD和BUD方法就显得更为简便高效。对开发的随机分配簿技术实际应用效果的调查结果显示,该技术原理简单、操作方便,能较好实现随机分配隐蔽。与此同时,本研究开发的一款基于手机客户端的随机化App工具“金陵鼠”,其功能丰富,不受时间、地点和工作环境等因素的影响,能满足多数临床试验随机化的需求。本研究还创新性提出了保证组间例数均衡的尾端控制法和最优随机分配序列的挑选法,并尝试改进了随机化方法规范报告的条目。
  研究结论:
  本研究针对两组平衡的开放性试验,在限制性随机化的框架内从随机化的方法选择、性能比较、实现工具研发及随机化方法规范报告等几个方面进行了渐进式探索。在临床试验随机方法选择时,应积极推荐BSD、BUD、BCDWIT等新型方法,如采用区组随机化方法,需注意区组长度的设计。本研究开发的随机分配簿技术及基于手机客户端的随机化App为这些随机化方法的实现提供了切实可行的工具,以及尝试提出的随机化方法报告条目等,均为临床试验随机化应用提供了有力参考。
[博士论文] 崔红凯
影像医学与核医学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:背景和目的:
  脑动脉瘤是临床上最常见的脑血管病之一,发病率位居第三位。目前,颅内动脉瘤的研究方向是血管重建术,以真正达到动脉瘤的解剖治愈,Pipeline低网隙支架和Willis覆膜支架是基于血管重建技术所取得的重大临床成果。但由于是金属支架,需要永久且易致管腔再狭窄,这已成为血管内治疗领域函待解决的世界性难题和限制支架植入术继续发展的“瓶颈”。可降解支架被认为是血管内治疗领域继球囊扩张血管成形、金属裸支架、药物洗脱支架后的第4次革新,镁合金支架是目前可降解支架的研发热点。可降解镁合金支架植入后可为血管重塑提供支撑作用,之后自行逐渐降解,对血管无长期刺激作用,患者也无需终身服用抗血小板药物,是理想的血管内支架,未来可能取代传统的金属支架。鉴于此,本研究将分为三个部分对镁合金支架进行研究:
  第一部分 兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型制作的改进
  目的:
  对兔颈总动脉侧壁动脉瘤模型进行改进,以评价其模型的成功率及术后颈总动脉的通畅率。
  方法:
  40只新西兰大白兔随机分为两组:左颈总动脉结扎组(A组,n=20)与不结扎组(B组,n=20)。初次与一月后颈部3.0T MRA检查时测量兔子体重、右颈总动脉及双侧椎动脉中段直径。采用间断式外翻缝合法用6-0显微缝线将静脉囊与颈总动脉吻合,建立侧壁型动脉瘤,血管造影检查在2周后进行。
  结果:
  A组中20只新西兰大白兔皆顺畅行左侧CCA结扎。17只兔右CCA一月后查MRA示增粗,而双侧椎动脉未见明显增粗;B组在一月后MRA检查示右侧颈总动脉及双侧椎动脉均略增粗。A组兔子的右颈总动脉中段直径与双侧椎动脉中段直径在初次MRA检查时与B组比较均无显著统计学差异(P>0.05),但A组兔子的右颈总动脉中段直径与双侧椎动脉中段直径在1月后的MRA检查时均大于B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。建立兔颈部囊状动脉瘤模型35只(A组17只,B组18只),术后均健康成活。术后2周血管造影示A组所有囊状动脉瘤均清晰显示,右颈总动脉畅通。4个动脉瘤腔内有少许血栓形成。B组有14只显示囊状侧壁动脉瘤,4只发生了自发性右颈总动脉彻底闭塞,10只有明显的血栓形成,且其中5只伴有动脉瘤远端的颈总动脉变细。A组中动脉瘤模型的成功率大于B组(P<0.05),且A组中动脉瘤中血栓的发生率及自发性右颈总动脉闭塞率均明显低于B组,也具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型制作的改进能明显提高动脉瘤模型的成功率并降低自发性颈总动脉的闭塞率及动脉瘤内血栓的形成。
  第二部分 镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型的可行性和可降解性研究
  目的:
  活体评价可降解镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁动脉瘤模型的可行性和可降解性能。
  方法:
  8只右颈总动脉侧壁动脉瘤模型随机分为两组:可降解镁合金覆膜支架植入组(A组,n=4)与Willis覆膜支架植入组(B组,n=4)。覆膜支架在DSA下植入。所有的兔子随访至术后12月。可降解镁合金覆膜支架治疗兔CCA侧壁动脉瘤模型的可行性和长期疗效通过血管造影随访来观察;活体可降解镁合金覆膜支架的可降解性能通过MRA和钼靶来研究。右颈总动脉支架植入处血管直径通过放置的标尺或在Photoshop8.0上测量。支架植入处的右颈总动脉分为近段、中部和远段,各段直径由三人分别独立测量,最终取三人的平均值。
  结果:
  所有的支架均放植成功,没有与手术相关的并发症发生。随访结果显示所有的颈总动脉侧壁动脉瘤均完全闭塞,无内瘘产生。A组可降解镁合金覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显大于即刻植入时的血管直径,差异具有显著性意义(P<0.05)。而可降解镁合金覆膜支架植入处的血管直径在6个月与12个月的血管造影比较无显著性差异(P>0.05)。B组Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显小于即刻植入时的血管直径,差异具有显著性意义(P<0.05)。而Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月与12个月的血管造影比较无显著性差异(P>0.05)。另外,A组支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访时比较均大于B组,差异具有显著性(P<0.05)。
  磁共振下镁合金支架植入处的血管形态在支架植入后1天呈信号缺失,就像严重的血管狭窄,在支架植入后5-6周,随着镁合金支架表面的镍降解,血管的形态基本上恢复正常。在钼靶下镁合金支架随着时间的延长而逐渐降解。镁合金支架的形态结构从完整清晰到逐渐断裂、解体,最后变得模糊不清。而Willis支架始终保持植入时的原有形态。
  结论:
  可降解镁合金覆膜支架治疗兔CCA侧壁型动脉瘤模型是可行性的。可降解镁合金覆膜支架放置处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显较植入时增大,说明可降解镁合金覆膜支架在镁合金裸支架降解后不影响植入处血管的生长;而Willis覆膜支架恰恰相反,Willis覆膜支架植入处的血管直径在6个月和12个月随访血管造影时明显较植入时变细,且时间越长植入处的血管直径越细。另外,在钼靶下是可以活体观察镁合金支架降解的。
  第三部分 镁合金覆膜支架治疗兔颈总动脉侧壁型动脉瘤模型的血管内超声研究
  目的:
  利用血管内超声(Intravascular Ultrasound,IVUS)评价可降解解镁合覆膜支架植入后植入段血管及管腔的变化和血管重构情况。
  方法:
  8只右颈总动脉侧壁动脉瘤模型随机分为两组:可降解镁合金覆膜支架植入组(A组,n=4)与Willis覆膜支架植入组(B组,n=4)。覆膜支架在DSA下植入。所有的兔子随访至覆膜支架植入后12月。在可降解镁合金和Willis覆膜支架植入后即刻、6和12个月行血管内超声检查。用血管内超声来定量分析支架植入处的平均血管面积、支架面积、血管管腔面积,并计算血管管腔狭窄率。重构指数等于支架植入处的血管面积与近远端参考血管面积的平均值之比。
  结果:
  所有的兔子完成了即刻、6和12个月随访时的血管内超声检查。与即刻支架植入相比较,A组可降解镁合金覆膜支架植入处的平均血管面积、平均支架面积与平均血管管腔面积在6个月和12个月随访血管造影时较即刻植入时明显增大,差异具有显著性意义(P<0.05)。尽管,B组Willis覆膜支架植入处的颈总动脉平均血管面积在6个月和12个月随访血管造影时较即刻植入时明显增大,差异具有显著性(P<0.05),但B组支架植入处的平均血管管腔面积在6个月和12个月随访血管造影时与即刻支架植入时比较明显缩小,差异具有显著性意义(P<0.05)。另外,尽管A组的血管管腔面积在即刻植入时小于B组(P<0.05),但在6个月和12个月随访血管内超声上,A组支架植入段的血管管腔面积要明显大于B组,差异具有显著性(P<0.05)。血管内超声显示A组所有镁合金覆膜支架植入段的颈总动脉血管管腔表现为无重构,重构指数intermediate remodeling(IR)为1.024±0.018(范围:1.01-1.05,95%可信区间:0.994-1.053);而B组所有Willis覆膜支架植入段的颈总动脉血管管腔表现为负重构,重构指数0.62±0.083(范围:0.58-0.74,95%可信区间:0.487-0.752)。
  结论:
  可降解镁合金覆膜支架在镁合金裸支架降解后植入处的血管管腔可以随着血管生长而生长;而Willis覆膜支架植入处的血管管腔由于支架的束缚而随着时间的延长而逐渐变小。A组所有镁合金覆膜支架植入段的颈总动脉血管表现为无重构,而B组所有Willis覆膜支架植入段的颈总动脉血管表现为负重构。
[硕士论文] 陈珏
中西医结合 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过观察利心冲剂对大鼠心力衰竭(心衰)模型心肌细胞沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(PGC-1α)蛋白表达的影响,研究利心冲剂改善心肌能量代谢的作用及其机制。
  方法:采用腹主动脉缩窄法建立大鼠心衰模型,将大鼠随机分为正常对照(假手术)组、空白对照(模型)组、利心冲剂低剂量治疗(低剂量)组、利心冲剂高剂量治疗(高剂量)组。正常喂养,低剂量和和高剂量组连续给服利心冲剂3个月,实验过程中观察各组大鼠精神、活动、食欲、皮毛等一般情况。末次给药后处死4组大鼠,取左心室心肌组织,采用酶联免疫法(ELISA法)检测磷酸肌酸(PCr)含量,蛋白免疫印迹技术(Westernblot)测定Sirt1及PGC-1α蛋白表达。
  结果:1.与模型组大鼠比较,利心冲剂低剂量、高剂量组大鼠精神、活动、食欲等有改善,说明利心冲剂能一定程度改善慢性心力衰竭的临床症状。2.与假手术组相比,模型组、利心冲剂低剂量及高剂量组PCr含量均显著降低(P<0.05),组间差异显著;与模型组比较,假手术组与利心冲剂高剂量组PCr明显升高(P<0.05),组间差异显著。3.与假手术组比较,模型组、利心冲剂治疗组中Sirt1蛋白表达明显降低(P<0.05),组间差异明显;与模型组比较,利心冲剂低剂量组与高剂量组中Sirt1蛋白表达明显增多(P<0.05)。4.与假手术组比较,模型组、利心冲剂治疗组中PGC-1α蛋白表达明显降低(P<0.05),组间差异显著;与模型组比较,利心冲剂治疗组PGC-1α水平有不同程度的升高,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:1.大鼠心衰模型存在心肌能量代谢异常;2.利心冲剂改善大鼠心衰模型心肌细胞的能量代谢;3.调控Sirt1/PGC-1α蛋白表达途径可能是利心冲剂改善心肌能量代谢的机制之一。
生物化学与分子生物学 新疆医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨异常黑胆质成熟剂(Abnormal Savda Munziq ASMq)对异常黑胆质型肝癌病证大鼠模型候选基因表达水平的影响及其抗肝癌作用。
  方法:(1)选取清洁雄性Wistar大鼠90只,随机分为实验组和对照组。实验组大鼠分为异常黑胆质型肝癌病证模型组(异黑肝癌组)和异常黑胆质型肝癌病证模型ASMq干预组(ASMq高剂量给药组,ASMq中剂量给药组,ASMq低剂量给药组)。对照组分为正常对照组和对照肝癌组。按照维吾尔医学理论,在干寒环境采用干寒属性饲料并引用间断足底电刺激,游泳,制动,夹尾等多因素复合作用,并使用二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine DEN)诱导建立异常黑胆质型肝癌病证载体大鼠模型,并用ASMq高(6.0 g/kg),中(3.0 g/kg),低(1.5 g/kg)不同剂量对模型组全程干预20周,观察肝脏组织形态学变化;(2)通过全基因组表达谱研究筛选差异表达候选基因;(3)选择候选基因,设计mRNA序列特异性引物,应用RT-qPCR分析方法对六组大鼠肝脏组织 mRNA表达水平进行分析;(4)免疫组织化学和Western-blotting实验分析STAT3,CyclinD1基因蛋白含量变化和STAT3蛋白的磷酸化程度。
  结果:(1)观察肝脏组织形态学变化显示,异常黑胆质型肝癌病证模型组成功率明显高于对照肝癌组,ASMq干预组成功率明显低于异常黑胆质型肝癌病证模型组。(2)全基因组表达谱结果显示,与正常对照组比较,对照肝癌组上调表达基因1964个,下调表达基因359个;与对照肝癌组比较,异黑肝癌组上调表达基因438个,表达下调基因451个;与异黑肝癌组比较ASMq高剂量组上调基因251个,下调表达基因396个;与异黑肝癌组比较ASMq中剂量组上调基因417个,下调表达基因386个;与异黑肝癌组比较ASMq低剂量组上调基因201个,下调表达基因343个;异黑肝癌模型候选差异表达基因与ASMq作用相关候选差异表达基因相比较,有11种共性候选基因,其表达水平变化趋势正好相反。因此,选择STAT3(信号转导与转录激活因子3),CyclinD1(细胞周期蛋白D1),EGLN3(脯氨酸羟化酶3),EMP1(上皮膜蛋白1),NEFL(神经丝轻链多肽),IGFALS(胰岛素样生长因子酸不稳定亚基)等6种候选共性基因。其中STAT3,CyclinD1, EGLN3,EMP1,NEFL基因表达上调,IGFALS基因表达下调。(3)通过RT-qPCR分析,验证了上述基因芯片结果数据的准确度和特异性。正常对照组与异黑肝癌组相比较,肿瘤组织内STAT3,CyclinD1,EGLN3等基因的转录表达水平明显升高(P<0.05),EMP1,NEFL,IGFALS等基因表达水平明显降低(P<0.05)。与异黑肝癌组相比较ASMq药物干预组STAT3,CyclinD1,EGLN3等基因的转录表达水平明显降低(P<0.05),而EMP1,NEFL,IGFALS等基因表达水平明显升高(P<0.05)。(4)免疫组织化学和Western-blotting结果证实,STAT3,CyclinD1蛋白质表达水平变化与mRNA水平一致,而且STAT3磷酸化水平在正常对照组中最低,在异黑肝癌组中最高(P<0.05),在ASMq干预组中随着ASMq剂量增加而相应降低(P<0.05),表现为剂量依赖性。
  结论:(1)动物模型肝脏组织病理切片结果显示,异常黑胆质证可促进异常黑胆质型肝癌的形成,ASMq延缓或抑制异常黑胆质证引起的肿瘤发生和发展;实现疗效。(2)异常黑胆质型肝癌形成与STAT3,CyclinD1,EGLN3,EMP1,NEFL,IGFALS等6种基因表达调控异常存在密切关系,而ASMq可能纠正或逆转。异黑肝癌引起的基因表达调控改变,其中包括信号转到水平的调节。
生物化学与分子生物学 新疆医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过检测维医异常黑胆质型肝癌病证模型大鼠肝脏组织中5种候选基因的表达水平,探讨异常黑胆质成熟剂的抗肝癌作用;
  方法:根据维吾尔医学理论体系,采用干寒饲养环境,干寒属性饲料,间断足底电刺激,强迫游泳,夹尾等多因素复合作用3周建立异常黑胆质证载体大鼠模型后,经二乙基亚硝胺(DEN)诱导20周建立维医异常黑胆质型肝癌病证大鼠模型,同时用异常黑胆质成熟剂按高、中和低(6.0、3.0和1.5 g/kg)剂量全程干预。应用光镜观察肝脏标本形态学变化确定动物模型是否成功,利用基因表达谱芯片技术筛选大鼠肝脏差异表达的p53、p21、Id4、ANG、G6PC等候选基因,通过RT-qPCR方法进行验证,免疫组织化学方法检测p53和p21基因的蛋白表达水平;
  结果:RT-qPCR结果显示,与正常组相比对照肝癌组p53基因mRNA表达水平上调(P<0.01);与对照肝癌组相比,异黑肝癌组p53基因mRNA表达水平上调(P<0.01);与异黑肝癌组相比,成熟剂三个剂量组p53基因mRNA表达水平均下调,其中高剂量组和中剂量组差异有统计学意义(P<0.05);与正常组比,对照肝癌组p21基因表达上调(P<0.01);与对照肝癌组比较,异黑肝癌组p21基因表达上调(P<0.05);与异黑肝癌组相比,成熟剂3个不同剂量组肝组织p21基因表达均下调,其中成熟剂中、低剂量组下降明显(P<0.01);与正常组比较对照肝癌组Id4基因表达下调(P<0.01);与对照肝癌组比较,异黑肝癌组Id4基因表达下调(P<0.01);与异黑肝癌组相比,成熟剂3个不同剂量组肝组织Id4基因表达均上调,其中成熟剂高、中剂量组升高显著(P<0.01);与正常组比较对照肝癌组ANG基因表达下调(P<0.05);与对照肝癌组比较,异黑肝癌组ANG基因表达下调(P<0.05);与异黑肝癌组相比,成熟剂3个不同剂量组ANG基因表达均上调(P<0.05);与正常组比,对照肝癌组G6PC基因表达下调(P<0.01);与对照肝癌组比较,异黑肝癌组G6PC基因表达下调(P<0.05);与异黑肝癌组相比,成熟剂3个不同剂量组肝组织G6PC基因表达均上调,其中成熟剂高和中剂量组上调明显(P<0.05,P<0.01);免疫组织化学结果显示,与正常组相比对照肝癌组P53蛋白表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.01)。异常黑胆质型肝癌病证模型组与对照肝癌组相比P53蛋白表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05)。异常黑胆质成熟剂高,中,低三个剂量组与异常黑胆质型肝癌病证模型组相比,P53蛋白水平均下调表达,其中成熟剂中剂量组和低剂量组下调明显(P<0.01);与正常组相比对照肝癌组P21蛋白表达水平上调显著,差异有统计学意义(P<0.01)。异常黑胆质型肝癌病证模型组与肝癌对照组相比P21蛋白表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05)。异常黑胆质成熟剂高,中,低三个剂量组P21蛋白表达水平与异常黑胆质型肝癌病证模型组相比均下调,差异有统计学意义(P<0.05);
  结论(1)异常黑胆质型肝癌的发生与p53、p21,Id4、ANG、G6PC等基因的表达调控异常有关,异常黑胆质成熟剂通过影响上述基因的表达使其以不同程度地逆转。(2)在该动物模型肝脏组织中,异常黑胆质成熟剂通过影响p53、p21、ANG基因的表达而可能改变多种癌基因的重要转录因子c-myc基因的表达起抗肝癌作用。(3)Warburg效应是肿瘤中物质代谢的特点之一,而葡萄糖-6-磷酸酶是糖异生中的最后一个关键酶,因此,我们认为异常黑胆质型肝癌组中G6PC的表达下调有利于糖异生的中间产物用于肿瘤不可控生长所需物质的生物合成。
[博士论文] 葛安乐
生物医学工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:秀丽隐杆线虫作为一种重要的模式生物,主要用于研究遗传、发育、神经、行为生理学等的基本机制。尽管线虫具有多样化的行为模型、简单的神经系统、短暂的生命周期和强大的遗传工具的可用性等独特优势,但一直缺乏自动化操纵系统和集成化定量分析研究方法。微流控芯片因具有良好的透明度、生物相容性和高通量等优点,尤其是其微通道与线虫的尺寸完美匹配,近年来逐渐发展成为线虫研究中重要的技术平台。“线虫芯片”已经成功用于线虫表型和发育时期筛选、神经系统成像、行为学、显微手术和显微注射等。目前,微流控芯片在线虫培养、发育和成像等方面也显示出巨大的潜力。本文针对线虫的培养和刺激设计了一系列新型微流控芯片,主要研究内容如下:
  1、设计可生成指数浓度梯度的芯片,用于研究线虫的寿命和发育过程。该芯片能够在通道网络中自动形成连续稀释的具有四个数量级的细菌食物补充物,同时,能够实现线虫的长期培养以及线虫的固定与实时成像监测。该芯片能够以高通量的方式来评估细菌浓度对线虫寿命的影响;通过芯片平台,我们考察了线虫的生长与细胞内DAF-16核定位如何响应不同浓度的细菌食物,研究了食物限制对线虫寿命的影响机制。
  2、提出一种快速、可靠的微流控芯片方法用于定量分析线虫的趋流性行为。在液体环境下,线虫对流体方向的感知十分重要,趋流性在线虫生命周期中的作用举足轻重,使它们能够在环境中导航,并维持它们的位置。为了研究线虫对不同流速的选择性,本文构建了包含六个螺旋样微通道芯片,用于产生六个不同的流速。利用该芯片,成功地对线虫的流速偏好性进行定量分析,并结合突变体,分析其潜在的作用机理。
  3、发展了一种用于线虫固定和电刺激肠细胞的芯片,研究线虫肠细胞对电刺激的响应及钙信号转导机理。该芯片系统利用可编程的电磁阀来精确控制刺激时间,能够对线虫特定肠部进行精确刺激从而诱发钙信号。通过使用该装置,发现线虫肠部细胞钙信号可以通过持续或瞬时电刺激来启动。此外,芯片内线虫会因高电压的刺激而破裂,导致体内的组织暴露出来,该技术可用于线虫解剖学以及体外标记。
  4、探索了一种新型光流控芯片,应用于线虫光遗传分析。线虫的神经系统由302个神经元构成。然而,对神经回路的功能组成在很大程度上是未知的。近年来,光遗传学成功应用于推断神经元的功能。本文构建了光流控芯片系统,利用3D打印技术打印出与光纤结合的通道,以LED激光作为光源,通过光纤对芯片内表达光敏感蛋白ChR-2的神经元进行光激活,并同步利用显微镜光学系统对传递到下游神经元的神经信号以及相应的行为变化进行功能成像。因此,该便携式芯片装置可以实现线虫光刺激与神经元动态响应、行为反应观测的同步化,可用于研究线虫神经回路的发生与功能组成,具有种简单、快速、成本低等优势。
  综上所述,本文以线虫为对象,结合微流控芯片,建立可以用于线虫培养和刺激的技术平台,设计出可用于研究线虫食物限制、趋流性、电刺激、光遗传分析的微流控芯片。本文建立的多种微流控芯片有望被广泛用于线虫发育、遗传、神经和行为学的研究。
[博士论文] 宋江波
生理学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:实验动物是现代生命科学研究的重要基础和强力支撑。随着科学技术的发展,越来越多的实验动物被应用到生命科学研究中。长久以来,益寿延年一直是人类追求的梦想,因此,衰老和寿命决定机制研究一直是生命科学领域的热点。
  目前应用于寿命研究的无脊椎动物模型主要包括秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇,脊椎动物模型主要包括小鼠和猴子。由于衰老和寿命调控机制的复杂性,模式生物在该领域研究中的利用至关重要。其中,身体构造简单而器官分化却相对完整的无脊椎实验动物受到广大研究者的青睐。至今,少数的无脊椎动物模型并不能完全满足复杂的寿命机制研究的需要,新型实验动物的开发利用十分必要。
  数千年的驯养和蚕业发展赋予了家蚕独特的生物学特点及文化内涵。长达一个世纪收集和研究积淀了丰富的突变资源,以及率先开展了基因组和功能基因组研究,为家蚕的拓展利用提供了良好的基础。同时,家蚕也具备诸多作为寿命研究的实验动物的特征,如生命周期和个体大小适中、繁殖力强、发育阶段界限清晰、外源注射所导致的物理损伤较小、寿命可塑性较强及不存在伦理问题等。有鉴于此,本研究选择家蚕作为实验动物,鉴定重要寿命基因及分析基因调控家蚕寿命的机制,为寿命决定分子机制的阐释提供新的认知。主要获得了如下研究结果:
  1.家蚕寿命与BmFoxO基因表达量间的关系
  家蚕各品系的发育时长不同,寿命也存在差异。从家蚕基因库中选取一组品系进行寿命统计,并对其中的三个代表性品系(夏芳、Dazao-N、N4)进行寿命相关基因表达模式的调查,结果显示:夏芳的平均寿命和最大寿命均较长,Dazao-N次之,N4品系的平均寿命和最大寿命较短。鉴于FoxO在多个物种中被报道是调控寿命的关键因子,我们调查了这些品系中BmFoxO在不同发育时期的表达水平,发现在蛹10天(可能决定成虫寿命的时间点),BmFoxO的表达量为夏芳显著高于Dazao-N和N4,并且N4显著低于Dazao-N。同时,在被调查的其他发育时期,BmFoxO表达趋势与相应品系的寿命也呈现出高度一致。通过控制家蚕饮食摄入量,成功构建了家蚕饮食限制实验模型;寿命统计结果表明饮食限制组寿命明显长于对照组,并且BmFoxO表达量显著高于对照组。鉴于BmFoxO的表达与寿命显著相关,所以推测该基因发挥了调控家蚕寿命的功能。
  2.家蚕Fox基因家族的鉴定与进化分析
  Fox基因编码的是一个转录因子家族,包含23个亚家族(FoxA-FoxS)。在家蚕中利用隐马尔可夫模型对Fox基因家族成员进行全基因组的分析鉴定,结果发现家蚕中含有17个Fox家族成员。通过系统发生分析,将这17个Fox家族基因归类于13个Fox亚家族。对其所属的染色体位置进行分析发现这些成员分布于13条不同的染色体上。利用相同的隐马尔可夫模型识别红带袖蝶、帝王蝶、果蝇、小鼠和人类中的Fox基因家族成员,并利用这些序列构建系统发生树,结果表明不同物种中的直系同源基因间序列高度保守。同时,对家蚕中 Fox家族基因的结构和蛋白质结构域特征分析,表明家蚕中 Fox基因大多属于单外显子基因,蛋白均包含有保守的Fork head结构域。家蚕中Fox家族基因的GO注释表明,其编码产物除未参与核孔复合体的生物合成过程外,参与了生物体内的诸多其他生物学过程。对家蚕中的Fox家族成员进行选择压力分析,结果表明Fox家族蛋白的结构域受到强烈的纯化选择。在系统发生分析中,依据参考序列对家蚕Fox基因家族中的每个成员进行了命名;同时发现FoxK亚家族在家蚕中特异性缺失。
  3.BmFoxO在调控寿命中的功能探究
  为了探索BmFoxO基因在寿命调控过程中的作用,进行了BmFoxO的干涉实验。鉴于BmFoxO在家蚕羽化1天的血淋巴中表达量较高,选择此时期的血淋巴作为BmFoxO干涉的组织,设计并合成特异的BmFoxO双链RNA干涉片段(BmFoxO-dsRNA)。由于双链干涉发挥效应需要一定时间,利用家蚕外源注射技术将BmFoxO-dsRNA通过家蚕气孔注入家蚕蛹10天的血淋巴中。结果表明,BmFoxO-dsRNA能够显著降低BmFoxO的表达水平,进而显著缩短家蚕成虫期的寿命。为了探测 BmFoxO的过表达能否延长家蚕成虫期寿命,构建了piggyBac-IE1-BmFoxO-SV40过表达载体并将其导入蛹10天家蚕血淋巴中,BmFoxO的表达水平检测发现其在注射后42h被显著上调。寿命统计结果表明,与对照组相比,过表达BmFoxO能够显著延长家蚕成虫期的平均寿命和最大寿命。利用Crispr-Cas9技术对BmFoxO进行敲除,分子检测表明G1代家蚕中BmFoxO的基因组序列确实发生了编辑。后续研究需要确定其能否对G2代家蚕的寿命产生影响。
  4.BmFoxO的靶基因筛选及其对寿命的影响
  BmFoxO表达水平的升高能够显著延长家蚕个体寿命已经得到了证实,然而其延长寿命的分子机制仍需要进一步研究。由于BmFoxO属于转录因子,其在执行功能过程中需要通过调节下游靶基因的转录活性来实现,因此FoxO下游靶基因的筛查和鉴定将为FoxO调控寿命的机制解析提供清晰的方向。构建BmFoxO组成型过表达和干涉载体,转染家蚕BmN-SWU1细胞,经抗生素筛选后,获得了较为稳定的BmFoxO组成型过表达和干涉的细胞系。免疫荧光和western实验检测发现,BmFoxO组成型过表达载体转染后表达的蛋白位于细胞核中,能够发挥调控靶基因的功能。定量检测确认组成型过表达和干涉细胞系中BmFoxO的表达水平,相比于对照组确实被上调和下调。就BmFoxO组成型过表达和干涉的细胞系取材提取RNA,进行表达谱测序。结合本小组唐冬梅对表达谱测序结果的分析所发现的符合正调控或负调控的差异表达基因共212个;我们结合果蝇FoxO靶基因的对比分析和多层筛选,最终选出家蚕和果蝇靶基因中共有的基因2个和家蚕中特有的基因5个。对筛选到的这7个基因的上游调控序列进行克隆,成功构建其中5个基因的双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告结果显示,5个筛选到的基因均受到BmFoxO的调控,其中 BGIBMGA002356基因受到的调控最为强烈。为了探测BGIBMGA002356基因是否参与家蚕寿命的调控过程,在家蚕蛹10天对其进行了基因的双链干涉实验。结果表明干涉BGIBMGA002356基因后,其在羽化后12h的表达水平被显著下调,同时家蚕成虫期寿命被显著缩短。
  综上所述,我们证明了BmFoxO基因能够调控家蚕寿命,同时鉴定到FoxO下游的一个新的靶基因BGIBMGA002356,并通过实验证明了该靶基因受到BmFoxO的直接调控,且能够调控家蚕寿命。我们推测BGIBMGA002356可能参与了BmFoxO调控家蚕寿命的过程,这极有可能是FoxO调控寿命的一条新的路径。本研究不仅进一步丰富了我们对FoxO调控寿命机制的理解,同时也为利用家蚕作为寿命研究的实验动物提供了重要依据。
[硕士论文] 薛文璞
兽医 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:阿尔茨海默症,是一种严重危害人体健康的慢性神经退化性疾病。其神经病理学变化主要以神经元发生病理变化为主,如神经元丢失导致的神经纤维结节、β淀粉样蛋白和各种新陈代谢失调的功能性缺失等,同时带来不可逆性的神经突触功能障碍和神经退行性变化,最后造成患者智力和器官功能衰退直至死亡。由于阿尔茨海默症病理变化的多面性,以及对它疾病机理的认识远远不足,现有的国内外医学手段很难治愈此病。其中关键点在于,没有一个可以很好模仿阿尔茨海默症患者病理特点的动物模型。尤其是由基因突变所致的、自发的、与人类相似的非人灵长类阿尔茨海默症模型。根据文献研究报道,淀粉样前体蛋白基因翻译形成的蛋白多量积累,是诱导阿尔茨海默症成因的重要因素。APP基因的第16和17外显子过量表达可能会诱导患者出现阿尔茨海默症特征性病理样变(又称为APP695),神经元周围出现淀粉样沉淀。
  本研究首先对淀粉样前体蛋白基因第16和17外显子的确立过表达基因序列。筛选并构建灵长类神经元特异性启动子Syn为启动子,GFP为标记分子的过表达淀粉样前体蛋白基因的特殊序列的载体PGMLV质粒,在293T细胞中包装出相应的APP慢病毒载体。通过QPCR测定慢病毒滴度。将得到的APP慢病毒载体感染SH-SY5Y细胞,猴成纤维细胞,293T细胞,分别在感染24 h和48h后通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。其中,只有 SH-SY5Y细胞成功被感染,并且有绿色荧光蛋白表达。下一步使用流式细胞仪来检测慢病毒感染效率。其次针对过表达APP是否造成细胞毒性进行进一步检测,使用 CCK-8法来检测细胞活性。最后,利用APP慢病毒载体感染食蟹猴胚胎,检测基因整合情况,并进行胚胎移植实验。结果表明,本研究成功构建了可在食蟹猴的神经细胞中进行特异性过表达的APP695基因的慢病毒载体。经过实验验证,本慢病毒载体具有良好的食蟹猴神经细胞特异性。相对于慢病毒空载体组,转染过表达APP695基因的神经细胞更容易造成细胞衰亡。APP695基因的慢病毒载体也成功嵌入感染食蟹猴胚胎,相应的胚胎进行了3例胚胎移植。其中怀孕1只。上述APP载体体系将为建立合适的阿尔茨海默症动物模型提供些许思路和研究方法。
[硕士论文] 胡敏
内科学(心血管) 安徽医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:褪黑素(melatonin,MEL)及其代谢产物具有很强的自由基清除能力,在哺乳动物各组织器官的缺血再灌注损伤过程中具备潜在的治疗作用。挤压综合征(crush syndrome,CS)是指各种重力创伤使肢体骨骼肌遭受持续性挤压,当这种持续性挤压解除后相应肢体骨骼肌出现的缺血及再灌注损伤,并引起横纹肌溶解、高钾血症、代谢性酸中毒、急性肾损伤等临床症状。挤压综合征多发生在战争灾害、恐怖袭击、地震、山体滑坡等灾害性事件中。缺血再灌注损伤是挤压综合征病理生理改变的使动环节。缺血再灌注过程中大量形成的氧自由基、炎症因子释放不仅影响局部组织活性及功能,还会引起全身炎症反应综合征(Systemic inflammation reaction syndrome,SIRS),因而会继发心脏、肾脏、肺等远隔器官的损伤。该实验应用止血带挤压大鼠双下肢构建挤压综合动物模型,通过外源性褪黑素干预处理,一方面观察其对挤压综合征模型大鼠酸碱平衡紊乱、氧化应激损伤、横纹肌溶解及存活率等方面的影响,另一方面观察其对动物模型心肌酶、心肌氧化应激损伤、炎性细胞因子、心肌损伤病理改变等的影响。实验分为两部分,一、褪黑素对挤压综合征动物模型骨骼肌缺血再灌注损伤疗效评估。二、褪黑素对挤压综合征动物模型继发心肌损伤的保护作用。
  方法:第一部分:将 Isamu Murata等挤压综合征造模方法加以利用改进,利用5%的戊巴比妥钠溶液以50mg/kg剂量腹腔麻醉大鼠,利用卡式止血带挤压大鼠后肢根部,止血带拉力等同于3kg重物的压力,5小时后撤除止血带恢复挤压肢体血流灌注。将wistar雄性大鼠按照保证在再灌注6小时后各组存活10只造模大鼠的原则,随机分为四组:空白组(SHAM组)、模型组(CS组)、扩容组(NS组)及褪黑素组(MEL组),检测大鼠后肢再灌注6小时血清中钾离子(K+)、肌酸激酶同工酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性及丙二醛(MDA)含量,再灌注6小时检查动脉血气,同时观察各组大鼠腓肠肌光镜下苏木精伊红(Hematoxylin eosin,HE)染色病理改变;另外将81只大鼠分为SHAM组(n=10)、CS组(n=30)、NS组(n=25)、MEL组(n=16),观察再灌注48小时各组大鼠死亡的时间点以进行生存曲线分析。第二部分:根据第一部分造模及分组方法,同样以保证在再灌注12小时后存活10只造模大鼠的原则,将雄性wistar大鼠随机分为四组:SHAM组、CS组、NS组及MEL组,检测各组大鼠后肢再灌注12小时血清肌钙蛋白I(TnI),肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶、丙二醛水平,炎性细胞因子 TNF-α、IL-1β水平,观察各组大鼠心肌组织光镜下HE染色病理改变。
  结果:再灌注6小时,CS组动脉血气提示明显的代谢性酸中毒,而MEL组酸碱平衡紊乱较CS组明显改善。与SHAM组比较,CS组血清中K+、CK、LDH的含量显著上升,GSH-Px、SOD、CAT的活性显著升高;与CS组比较,MEL组血清中CK、LDH、K+的含量显著降低,GSH-Px、SOD、CAT的活性显著下降。CS组中血清中MDA的含量较SHAM组显著升高;而MEL组血清中MDA含量较CS组显著降低。SHAM组腓肠肌纤维间未见水肿及炎症细胞浸润,肌肉纤维正常分布;CS组、NS组腓肠肌纤维间质水肿明显,肌纤维结构严重破坏,骨骼肌横纹紊乱;MEL组肌肉纤维间可见轻度水肿,纤维组织稍紊乱,其形态结构明显好于CS组与NS组。SHAM组大鼠的生存率为100%,CS组大鼠的生存率为20%,NS组大鼠的生存率29.2%,MEL组大鼠的生存率为56.3%。
  再灌注12小时,CS组血清中TnI,CK-MB含量显著升高,褪黑素干预后的MEL组血清中TnI,CK-MB较CS组明显降低;CS组血清及心肌SOD活性较SHAM组显著降低,血清及心肌MDA、TNF-α、IL-1β水平显著升高,MEL组血清及心肌SOD活性较CS组显著升高,血清及心肌MDA、TNF-α、IL-1β水平显著降低。通过HE染色评估心肌损伤病理改变,SHAM组心肌细胞结构完整、心肌横纹清晰可见;CS组心肌坏死和炎性细胞浸润明显,心肌横纹消失;MEL组心肌组织损伤较CS有所减轻。
  结论:利用卡式止血带能成功建立挤压综合征动物模型,在下肢恢复血流灌注前利用褪黑素早期干预,对挤压综合征模型骨骼肌缺血再灌注损伤具有保护作用;褪黑素能有效的抑制缺血再灌注过程中氧化应激损伤,减轻横纹肌溶解;并能提高挤压综合征模型大鼠生存率,改善缺血再灌注腓肠肌损伤。同时挤压综合征模型能引起心肌损伤,褪黑素通过其对心肌酶、内源性抗氧化酶活性、炎性细胞因子、心肌组织的改变发挥对心肌组织的保护作用,减轻挤压综合征模型的心肌损伤。
[硕士论文] 温琦涛
口腔临床医学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis,OSF)是一种以上皮萎缩,黏膜固有层、黏膜下层胶原堆积和微血管病变为主要病理特征的,具有癌变倾向的口腔黏膜疾病,但是其发病机制尚不明确,且关于OSF动物模型研究的报道极少。在本研究中,我们利用槟榔碱饮水法构建与人OSF发生发展相似的Balb/c小鼠OSF模型,并观察在小鼠OSF发生、发展过程中胶原堆积和血管生成变化的情况。
  方法:1.40只Balb/c小鼠随机平均分成实验组和对照组。实验组采用槟榔碱(Arecoline)1000mg/L饮水喂养20周,对照组仅给予自来水喂养。每天观察小鼠精神状况、活动度、进食、饮水量、饮药量等情况,每周记录小鼠饮水量,饮药量及体重变化。每两周进行张口度检测。喂养8周后,每隔4周随机取各组4只小鼠,麻醉后进行口腔黏膜大体观察,随后处死,取材口腔组织行苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin staining,HE)、Masson和V.G(Van Gieson)特殊染色显微结构观察。20周剩余小鼠全部处死。
  2.在建模过程中,采用免疫组织化学(immunohistocheory,IHC)CD34染色计数上皮下血管数量,采用免疫组织化学观察固有层Ⅰ型胶原蛋白(Collagen typeⅠ,ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(Collagen typeⅢ,ColⅢ)堆积情况,并采用实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)技术检测ColⅠ和ColⅢmRNA表达变化差异。
  结果:1.从8周开始,实验组的舌粘膜观察到上皮萎缩,胶原累积和胶原病变在固有层和粘膜下层,颊粘膜和腭粘膜于第12周开始出现上述改变,OSF病变程度随给药时间的延长逐渐加重;至20周,舌、腭部组织可以观察到结缔组织的晚期玻璃样变,颊部组织仍然处于OSF中期病变阶段;对照组未发现异常。
  2.随给药时间的延长,实验组小鼠舌黏膜OSF病变区域上皮下血管生成出现先增加后减少的趋势,在12周和20周与对照组相比,分别表现出增加和减少的显著性差异;颊、腭组织也可观察到类似改变。
  3.实验组小鼠OSF病变区域,固有层ColⅠ的mRNA表达与对照组相比明显增加,有显著性差异,并随给药时间的延长,变化越加明显,ColⅢ的mRNA表达与对照组相比,改变不明显。
  结论:1.采用槟榔碱饮水法可快速诱导出Balb/c小鼠典型、稳定的OSF模型,具有较高的成功率,该模型可能为研究OSF发病的机制和治疗手段提供一个平台。
  2.小鼠OSF的血管变化主要以萎缩、减少为主,提示人OSF后期血管增加考虑为OSF恶变可能;小鼠OSF以成熟型的Ⅰ型胶原增加为主,辅以幼稚型的Ⅲ型胶原增加,提示人OSF的形成可能主要由降解胶原不足引起,胶原合成的增加为次要因素。
[硕士论文] 秦闫燕
免疫学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:手足口病是由多种微小RNA肠道病毒引起的急性传染病,多发生于三岁以下儿童,其表现主要是轻度流感样症状和手、足、口腔等部位的皮疹和疱疹,通常具有自限性,但传染性极强,常常在幼儿园和托儿所流行。一般预后良好,但是个别重症患者可出现严重的神经系统并发症,甚至死亡。
  引起手足口病的病原体属于微小RNA病毒科肠道病毒属,主要包括:柯萨奇病毒 A组4、5、7、9、10、16型;柯萨奇病毒 B组2、5型;埃可病毒以及肠道病毒71(EV71)型,其中CA16和EV71为主要病原体。自1969年首次从美国一名患有脑膜炎的手足口病患儿中分离出EV71型病毒以来,手足口病在世界各国出现多次爆发和流行,尤其是亚太地区,中国大陆2008年到2012年报道有7,200,092例手足口病患者,死亡2457例。2008年台湾报道387例由EV71导致的重症病例,其中14例死亡。
  目前肠道病毒感染除了脊髓灰质炎病毒有疫苗外,其余肠道病毒感染包括EV71病毒感染并没有特殊的治疗药物,其中一个很重要的原因就是缺少稳定的动物模型来有效地评估疫苗。目前最常用的模型有猿猴模型和乳鼠模型,猿猴模型虽然早期被认为是较好的动物模型,但是由于价格昂贵,并且缺乏心力衰竭和肺水肿的表现,而这些表现常常是人类手足口病重要的死亡原因,所以限制了其应用。乳鼠模型由于价格低廉,制备简单,神经系统感染表现与人类疾病相似,因此适用于了解EV71致病机制、评价疫苗效价。现阶段,我国手足口病爆发流行的病毒株亚型主要是C4亚型,而在以往的研究中,大多数动物模型对C4亚型的EV71病毒株不敏感,导致感染后不能出现典型的手足口病的症状,尤其是神经系统感染症状。
  本研究对来自江苏省疾病预防控制中心4株EV71临床分离株进行了小鼠攻毒实验,筛选出1株能引起小鼠后肢瘫痪的临床毒株。对该株进行了细胞培养、传代、克隆,建立了稳定的G03 EV71病毒株,并对该毒株进行了全基因序列的测定和分析,结果表明该病毒株为C4亚型的EV71病毒株。用分离的G03 EV71病毒株通过颅内途径感染1日龄ICR小鼠制备动物模型,每天观察动物的临床表现,了解EV71感染的规律和致病特点,同时定期处死动物,采集各器官组织进行动物体内病毒半定量分析、病理形态学观察、免疫组织化学分析及利用Western blot鉴定病毒蛋白的表达等。
  病理学观察发现,在感染G03后小鼠的心肌、肺组织、骨骼肌、小肠、脑组织等器官出现特定的病理变化,比如出血、炎症细胞浸润等。免疫组化显示感染后所取小鼠的上述五种组织都有EV71病毒特异性分布。Western blot分析发现EV71 VP1蛋白在小鼠五种组织都有表达,以上结果都显示成功建立了EV71感染小鼠模型,为下一步体内干预实验研究奠定了良好的基础。
  综上所述,本研究通过筛选EV71临床敏感株实验,筛选出合适的临床毒株,并对其进行了培养,同时利用此毒株建立了一日龄乳鼠模型,也建立了相应的检测方法,为EV71发病机制、病毒疫苗的研制等研究提供了实验工具。
[博士论文] 张纬
病理与病理生理学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分应用CRISPR/Cas9技术构建C3基因敲除猪模型
  研究背景:
  补体系统是免疫系统中重要的组成部分,它包含了30多种可溶性蛋白和膜蛋白,其活化过程为一系列的级联酶解反应。补体系统参与机体的特异性和非特异性免疫机制,主要生理作用为:溶解细胞、细菌和病毒的细胞毒作用;调理作用;引起炎症反应;清除免疫复合物和凋亡细胞。它主要包含了三条途径:经典途径、旁路激活途径和甘露糖结合凝集素途径。补体蛋白C3是三条途径的交汇点,它主要由肝脏细胞合成,除此之外,还由巨噬细胞、树突细胞、白细胞、近端肾小管上皮细胞、成纤维细胞、子宫上皮细胞、肺细胞和激活的T细胞等合成,表明C3在机体中发挥着重要的作用。据文献报道,C3与很多疾病相关,如肾小球疾病、溶血性尿毒综合症、胃癌以及风湿性关节炎等。目前为止,C3基因缺失的小鼠、豚鼠等啮齿类动物模型已有报道,但是这些动物模型由于它们的生理学和表观遗传学与人类有很大差异而受限制,大动物C3基因缺失模型却没有报道过。而猪在解剖结构及生理、免疫特性上与人类比较相近,且用猪作为动物模型不存在伦理上的障碍。
  最近,CRISPR/Cas9基因编辑技术大大提高了基因编辑效率,并且广泛应用于小鼠、兔子、山羊和猪等动物身上。在本实验中,我们运用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术构建C3基因敲除猪模型。
  研究目的:
  构建C3基因敲除、补体缺失的免疫缺陷猪模型。
  研究方法:
  1.从基因库里找到猪的C3基因,根据CRISPR/Cas9的构建原则,在第26个外显子上设计两个CRISPR/Cas9打靶位点,然后进行质粒构建。选择一个效率高的质粒进行核转染,筛选单克隆细胞,并进行测序鉴定。
  2.用双等位基因敲除的C3单克隆细胞作为体细胞核移植的供体,以去核的卵母细胞作为受体,借助体细胞核移植的方法获得重构囊胚,在体外培养至桑椹胚期移植到同期发情的代孕母猪子宫内,最终获得C3基因敲除小猪。
  3.将获得的新生克隆小猪的耳部组织提取基因组进行靶点位置PCR扩增,然后用PCR产物连接T载体送测序的方式进行基因型鉴定;采用Western Blot、ELISA和免疫组织化学的方法检测C3蛋白表达情况;用脂质体免疫测定法检测血清中补体活性(CH50);用补体依赖性的毒性试验方法检测C3敲除小猪血清对人293T细胞的杀伤力。
  实验结果:
  1.根据猪的C3基因序列,设计并构建2个CRISPR/Cas9打靶质粒,然后进行转染猪原代成纤维细胞,最终得到C3双等位基因敲除的细胞系。借助体细胞核移植技术,进行两批克隆实验。第一批共移植受体猪6头,怀孕1头且自然生产6头新生小猪。第二批移植受体猪共3头,其中怀孕2头,一头自然生产10头新生猪仔,取耳部组织培养原代成纤维细胞;另外一头自然分娩出3头新生猪仔,两批克隆总共生产了19头克隆小猪。
  2.两批克隆出生的小猪基因型鉴定结果均为C3基因靶点位置双等位基因敲突变,且都与相应的供体细胞基因型相对应;Western Blot和ELISA试验结果显示,克隆小猪的血清中几乎没有C3蛋白的表达;免疫组织化学的试验结果显示,C3敲除小猪的肝脏、脾脏、肾脏和肺组织等均没有C3蛋白的表达;通过检测血清中CH50的值,结果显示克隆小猪体内没有检测出补体活性;补体依赖性细胞毒性试验结果表明,C3敲除小猪的血清对人293T细胞没有杀伤作用,相反,野生型小猪血清对人的293T细胞有很大的杀伤作用。
  结论:
  利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,结合体细胞核移植(SCNT)技术可以成功获得健康的C3双等位基因敲除、补体系统缺失的免疫缺陷猪模型。我们是世界首例C3基因敲除猪模型。我们的结果不仅再次证实了CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效构建猪的基因缺陷模型,而且还为进一步研究补体系统在人机体的作用打下了基础。
  第二部分稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立
  研究背景:
  人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)是具有自我更新和多向分化潜能的多能性干细胞,它可在体外诱导分化形成多种细胞和组织。1998年,人胚胎干细胞的建立、研究和应用是干细胞研究领域的一项革命性进展。遗传修饰揭示了hESCs重要的生物学特性,对hESCs自我复制、定向分化、体内动态追踪具有重要的作用。但由于hESCs培养困难,缺乏有效的转染方法,外源基因表达困难等,制约了hESCs的遗传修饰研究。
  Nucleo fector技术直接将DNA转染到细胞核内,大大提高了转染效率。早在2005年,有人利用该技术转染hESCs效率高达20%-65%。转染细胞时因启动子的敏感性,转染后药物筛选过程中易使基因沉默,Jennifer等使用EF1a启动子驱动胚胎干细胞表达红色荧光蛋白,成功获得了能够稳定表达红色荧光蛋白连续传10代的胚胎干细胞。
  胚胎干细胞被分为原始态多能性(na(i)ve)和始发态多能性(primed),来源于小鼠内细胞团(inner cell mass,ICM)的干细胞被认为是na(i)ve状态,来源于上胚层的干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs)被认为是primed状态。研究发现,人胚胎干细胞与上胚层干细胞比较相似,因此也被认为是primed状态。始发态多能性是一种更易进行分化的状态,它不具有发育的全能性。胚胎干细胞的研究可以使人们更好的理解胚胎发育过程及其分子机制,更重要的是胚胎干细胞的临床应用将成为器官再生、基因治疗等的有效工具。
  基于以上的研究,我们利用核转染技术将带有pEF1alpha启动子的红色荧光蛋白质粒转染进入胚胎干细胞内以获得稳定表达的细胞系。并对该细胞系进行多能性功能的分析,为再生医学和疾病模型提供重要的材料。
  研究目的:
  建立稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系,并对该细胞系进行诱导分化的研究。
  研究方法:
  1.用核转染的方法将红色荧光表达质粒pEF1α-DsRed-Express2转染进入胚胎干细胞内,并用G418药物筛选单克隆;
  2.用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和RT-PCR方法检测转染红色荧光蛋白的胚胎干细胞(RFP-hESCs)多能性基因的表达;
  3.在体外对RFP-hESCs进行诱导分化鉴定其分化潜能;
  4.Primed状态的RFP-hESCs向Na(i)ve状态逆转诱导。
  实验结果:
  1.成功获得了稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系;并且经过鉴定RFP-hESCs仍然具有干细胞的特性,并且Oct4、Sox2、Klf4、Nanog基因的表达与hESCs为出现明显差异;
  2.将RFP-hESCs诱导分化生成类胚体,并且有三胚层特异性基因的表达;进一步诱导分化生成定型内胚层细胞,qRT-PCR结果显示,定型内胚层细胞特异性基因有表达,干细胞特异性因子几乎不表达;
  3.得到Na(i)ve-like的细胞,但是该细胞不能继续传代。
  结论:
  成功建立稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系,并且没有影响该细胞系的干细胞特性,能够继续诱导分化生成其他类型的细胞,可用于后续实验的研究。
[硕士论文] 邓兰
内科学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究紫外线照射对成人原代肝细胞活率及膜电位的影响,通过混合淋巴细胞-肝细胞培养,探讨紫外线照射降低成人原代肝细胞的免疫原性的可行性及稳定性。
  方法:收集我院肝胆外科切除肝组织手术标本,诊断为肝脏良性病变(肝血管瘤、肝内胆管结石等),采用灌注法获得肝细胞;将实验肝细胞分为5个组,1个对照组(0 J/m2)及4个不同照射强度组(分别为200、350、550和750J/m2)。紫外灯功率固定,照射强度由照射时间调控,5组照射强度所对应的照射时间分别为0、2、4、6和8分钟。各组分别于处理后培养的第1、3、5天进行相关检测:台盼蓝拒染法和CCK-8法检测细胞活率;荧光显微镜和多功能酶标仪检测细胞膜电位变化;通过混合淋巴细胞-肝细胞培养(MLHC)检测受体T细胞增值情况;收集实验组和处理组的培养上清液,离心后全自动生化分析仪检测白蛋白、LDH的分泌量。
  结果:⑴改良的两步胶原酶灌注获得的肝细胞透亮,呈圆形或球形,胞质均匀,肝细胞总数可达109个以上,活率大于90%。⑵UVB照射新鲜分离的肝细胞,在照射强度相同的条件下,随着照射后培养时间的延长,成人原代肝细胞活率呈现下降趋势。照射后第1天活率最好,随着培养时间的延长,活率下降,到第五天,活率下降1/2;在照射后培养时间相同的情况下,随着照射强度的增加,肝细胞活率呈先上升后降低。照射2min后的肝细胞活率最高,较未照射组高,但差异不明显,活率明显高于4min、6min组,是照射8min组的2倍。⑶不同的UVB照射强度和UVB照射后不同培养时间之间,成人原代肝细胞的膜电位均有明显差异。UVB照射2min组的膜电位在照射后的各个时间点均比UVB照射肝细胞0min、4min、6min、8min组的膜电位高。⑷肝细胞在接受不同强度紫外线照射后,与淋巴细胞混合培养,照射后的肝细胞免疫原性下降,表现为共培养的淋巴细胞增值能力下降。2min组与对照组无明显区别,但明显低于4min、6min、8min组。⑸检测不同照射强度、培养时间的白蛋白、LDH分泌量,接受2min紫外线照射的肝细胞分泌功能最好,随着照射强度的增大和培养时间的延长,肝细胞合成和分泌功能下降。
  结论:混合淋巴细胞-肝细胞培养可以用来检测受体淋巴细胞对供体肝细胞反应的指标,照射2min时共培养的T细胞增值能力最低,提示此时肝细胞的免疫原性最小。
[硕士论文] 刘博
内科学(消化系病) 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:乙型肝炎病毒(hepatitisB virus,HBV)感染是影响人类健康的重要问题,据WHO报道,全球约20亿人曾感染HBV,其中2.4亿人为慢性HBV感染者。我国作为乙肝的高流行区,2006年全国乙型肝炎流行病学调查显示我国一般人群HBsAg携带率为7.18%,乙肝病毒携带者约有9000万人。慢性HBV感染可伴有肝纤维化发生,进而可发展为肝硬化、肝癌。目前尚没有特异的药物可以根治乙肝,动物模型对于了解HBV感染的病理生理学、病毒复制的相关机制以及该过程中发生的肝细胞损伤、肝纤维化,药物疗效评价等有重要意义。肝纤维化的动物模型主要有化学法、胆总管结扎、免疫法、尾静脉注射转基因质粒等,但这些模型无法模拟HBV感染的自然史。HBV具有严格的宿主特异性,故目前尚缺乏合适的HBV动物模型。AAV8作为一种嗜肝性病毒,其本身不具有致病性,可作为病毒载体携带HBV进入大鼠肝脏,本研究通过对大鼠注射rAAV8-1.3HBV,观察HBV在大鼠体内的复制以及引起的肝脏病变,旨在探索建立一种新型HBV感染动物模型,为进一步研究HBV复制、致病机制、肝纤维化进展等提供可能。
  方法:本研究分别对0日龄乳鼠于0、2、4周腹腔注射rAAV8-1.3HBV以及对6周龄成年大鼠尾静脉注射rAAV8-1.3HBV建模。注射rAAV8-1.3HBV后于多个时间节点进行尾静脉采血100~200ul,分离血清,检测大鼠血清中HBsAg、HBeAg、ALT及HBVDNA。12周末处死大鼠,取肝脏。做病理切片,行HE染色及Masson染色,免疫组化检测HBsAg、HBcAg、TGF-β1、α-SMA表达情况,评估肝脏损伤及纤维化情况。
  结果:乳鼠腹腔注射rAAV8-1.3HBV2周后血中HBsAg和HBeAg均为强阳性,感染率100%,除1只大鼠偏低外,HBsAg平均2686.31±804.39 IU/ml,HBeAg平均63.60±31.60 NCU/ml,4周时HBsAg和HBeAg较前呈下降趋势,8周和12周时仍有部分大鼠HBsAg和HBeAg保持阳性。对照组HBsAg、HBeAg12周内均为阴性。4周时实验组血中HBVDNA为1.39×105~1.06×107 IU/ml,随时间延长,至12周时血中仍可检测到较高拷贝的HBVDNA,表现为4.79×102~3.31×105IU/ml。肝脏中HBVDNA高于血清中HBVDNA。成年大鼠尾静脉注射rAAV8-1.3HBV后3天血中即可检测出HBsAg阳性,1周时HBsAg较前明显上升,2周后开始下降,至12周基本变为阴性。HBeAg结果与HBsAg表现不同,在注射后3天,rAAV8-1.3HBV组大鼠血中均未检测到HBeAg,第2周时,HBeAg均为阳性,并保持稳定至12周。
  对照组HBsAg、HBeAg12周内均为阴性。注射rAAV8-1.3HBV8h后,血中可检测到极高拷贝数的HBVDNA,数值在3.47×1010~4.5×1010 IU/ml之间,24h时血中HBVDNA仍维持在1010数量级,从3天开始血中HBVDNA较前下降,但此时血中HBVDNA仍可保持很高的拷贝数,4周时血中HBVDNA为2.20×103~1.12×105 IU/ml,之后维持稳定至12周时。病理可见肝脏充血,部分肝细胞水肿,体积变大,排列紊乱,肝窦受压变窄,可见嗜酸性变及散在点状坏死,汇管区略增厚,可见淋巴细胞浸润。免疫组化可见HBsAg、HBcAg阳性肝细胞,α-SMA、TGF-β1明显阳性,提示肝星状细胞活化,纤维化发生。
  结论:通过注射rAAV8-1.3HBV,HBV可在大鼠肝脏中持续复制并表达,并可引起肝脏损伤及纤维化的发生,该模型有助于了解HBV感染的病理生理学、病毒复制以及研究该过程中发生的肝细胞损伤、肝纤维化的相关机制。
[硕士论文] 李亚法
口腔颌面外科 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:目的:建立一种适合临床研究的、简单、易行、可靠的三叉神经痛动物模型。
  方法:实验一选取Wistar雄性大鼠20只,随机分为两组,一组在眶下神经孔周围注射30﹪滑石粉混悬液0.3ml,另一组注射同等剂量的生理盐水,于术前3天以及术后3天、1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周进行机械痛阈行为学测定。观察大鼠眶下神经支配区域对机械刺激的疼痛反应阈值及疼痛行为学表现。
  实验二选取Wistar雄性大鼠20只,随机分为两组,一组在眶下神经孔周围注射30﹪滑石粉混悬液0.3ml,另一组注射同等剂量的生理盐水,于术前3天以及术后3天、1周、2周、4周进行视频行为学测定。摄像机放置在笼子前面1米处观察大鼠探究行为、静止行为、抓脸行为、摇头行为、舔后肢行为和舔身体行为的次数和时间。
  实验三选取Wistar大鼠20只,分为滑石粉注射组和对照组,每组各10只。按照实验1的方法制作滑石粉三叉神经痛模型。分别于术后3天、4周、8周、12周取大鼠眶下神经、延髓组织作组织病理学观察及脱髓鞘染色,应用免疫组化的方法检测眶下区组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)以及延髓中疼痛物质(p物质、内啡肽等)的表达。
  结果:实验一实验组大鼠于术后3天出现眶下神经支配区域机械痛反应阈值与术前及对照组相比明显降低(P<0.01),大鼠易激惹,具有搔抓面部或攻击行为。机械痛阈值降低持续至术后12周。
  实验二视频显示:实验组大鼠于术后3天出现探究行为、静止行为、抓脸行为、摇头行为的变化,与术前及对照组相比上述行为变化有统计学意义(P<0.01),舔后肢、舔身体行为无明显变化。大鼠术后1周、2周、4周的探究行为、静止行为、抓脸行为、摇头行为变化进一步明显,与术前及对照组相比上述行为变化均有统计学意义(P<0.01)。舔后肢、舔身体行为与术前及对照组相比上述行为变化无统计学意义。
  实验三实验组术后3天组织病理学观察:主要是炎症表现,炎性因子表达少.术后1周炎症更剧烈免疫组化出现炎性因子表达.术后4周炎性因子表达最高,4-12周炎性反应逐渐减轻,局部瘢痕加重,可见压迫眶下神经,脱髓鞘染色可见脱髓鞘表现;延髓组织中疼痛物质的表达于3天-3周无明显变化,术后4-12周出现疼痛物质表达增加并出现脱髓鞘表现。
  结论:1、眶下神经干注射滑石粉可致眶下神经支配区域出现痛觉超敏现象,自发性疼痛以及相关行为学改变;
  2、组织病理学及免疫组化检查显示该动物模型早期为炎性因子引起疼痛,晚期为眶下神经压迫致病。
  3、该动物模型可早期诱导疼痛且持续时间长,简单易行,为目前较理想的三叉神经痛动物模型。
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