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[硕士论文] 何淋
中医内科学 福建中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题目的是探讨脓毒症血瘀证患者血小板参数与降钙素原(PCT)、APACHEⅡ评分的相关性。
  方法:
  1.根据纳入标准,收集我院急诊科、ICU诊断为脓毒症患者的病例,其中血瘀证组患者55例、非血瘀证组患者54例。
  2.入院当天对符合诊断的患者记录血小板计数(PLT)、血小板平均容积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、大血小板比率(P-LCR)、降钙素原(PCT)的各项数值,并进行APACHEⅡ评分,收集相关数据。
  3.记录第28天血瘀证组与非血瘀证组患者的PLT、MPV、PDW、P-LCR,PCT,APACHEⅡ评分,收集数据。
  4.观察脓毒症血瘀证患者的PLT、MPV、PDW、P-LCR与PCT、APACHEⅡ评分相关性。
  结果:
  1.血瘀证组、非血瘀证组在年龄、性别方面均无统计学差异(P>0.05)。
  2.血瘀证组的PCT值、APACHEⅡ评分高于非血瘀证组的PCT值、APACHEⅡ评分,有显著统计学差异(P<0.01),提示血瘀证组患者病情较非血瘀证组病情重。
  3.血瘀证组:PLT值与PCT值、APACHEⅡ评分呈负相关(相关系数分别是r=-0.632、-0.547);MPV、PDW、P-LCR值与PCT值、APACHEⅡ评分呈正相关(与PCT值相关系数分别是r=0.688、0.936、0.851,与APACHEⅡ评分相关系数分别是r=0.664、0.791、0.768);均具有显著统计学差异(P<0.01),提示随着PCT值、APACHEⅡ评分升高,血瘀证组患者的病情加重,PLT值降低,MPV、PDW、P-LCR值升高;随着PCT值、APACHEⅡ评分降低,血瘀证组患者的病情好转,PLT值升高,MPV、PDW、P-LCR值降低;由此可见,PLT、MPV、PDW、P-LCR值与脓毒症血瘀证病情密切相关。
  4.观察患者28d死亡率:血瘀证组患者死亡人数17例,约占30.9%;非血瘀证组死亡人数8例,约占14.8%;两组之间具有显著统计学差异(P<0.01),提示血瘀证组患者死亡率大于非血瘀证组患者的死亡率,进一步证实了血瘀证患者病情较非血瘀证病情重,死亡率高。
  5.死亡组与存活组比较:死亡组的MPV、PDW、P-LCR值,APACHEⅡ评分,PCT值均高于存活组,死亡组的PLT值低于存活组,均显著统计学差异(P<0.01),进一步证实了PLT、MPV、PDW、P-LCR值与脓毒症血瘀证病情密切相关。
  结论:
  1.脓毒症血瘀证患者的病情较非血瘀证患者的病情重,死亡率高。
  2.PLT值可以反映脓毒症血瘀证患者的病情严重程度。即:PLT值降低,病情加重;PLT值升高,病情好转。
  3.MPV、PDW、P-LCR值可以反映脓毒症血瘀证患者的病情严重程度。即:MPV、PDW、P-LCR值升高,病情加重;MPV、PDW、P-LCR值降低,病情好转;
  4.动态检测血小板计数、血小板平均容积、平均血小板宽度、大血小板比率可以为脓毒症血瘀证患者的病情提供客观依据。
[硕士论文] 徐俊
外科学(普通外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究将探讨在脓毒症发生过程中Robo4基因表达对EPCs数量和功能的影响,及其诱导EPCs定向分化作用,为临床防治脓毒症探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。
  本研究共分为三个部分,首先通过基因敲除技术构建Robo4-/+、Robo4-/-小鼠,通过盲肠穿孔+腹腔注射内毒素(LPS)制造出创伤后基因敲除小鼠的脓毒症模型。然后动态观察创伤后脓毒症发展过程中EPCs内Robo4表达水平和内皮祖细胞数量变化。最后对三种不同基因表达小鼠骨髓来源的EPCs进行体外培养和功能鉴定。
  第一部分 多器官功能障碍小鼠模型的建立
  目的:建立基因敲除小鼠脓毒症模型,为研究Robo4影响内皮祖细胞增殖和分化提供实验基础。
  方法:将体重20-25g的Robo4-/+、Robo4-/-和WT三种基因类型的小鼠100只分为2组:实验组(M组)90只,施行腹腔内毒素注射+盲肠穿孔;对照组(C组),施行假手术。观察各组动物的症状、体征、生存率、脏器功能指标(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并观察主要脏器的大体及显微镜下病理改变。
  结果:实验组小鼠的症状、体征与功能指标均发生明显变化,肺、肝、心、肾及胃肠道等脏器病理改变严重。实验组和对照组MODS发生率为(82.2%,0),死亡率(75%,10%),显著高于对照组。
  结论:采用腹腔注射内毒素+盲肠穿孔的方法,可以成功地复制出小鼠脓毒症模型,且有较高的死亡率和可重复的稳定性,并可进一步发展成为MODS。
  第二部分 脓毒症进展过程中EPCs数量的变化及EPCs内Robo4表达水平变化
  目的:监测脓毒症各个阶段正常小鼠骨髓中内皮祖细胞的数量变化,检测EPCsRobo4的mRNA和蛋白水平变化,探讨Robo4表达水平与EPCs数量变化的相关性。
  方法:按照第一部分造模后,分别在正常状态下、注射内毒素2小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取骨髓,按照密度梯度离心法获得单个核细胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×105PMC/孔的密度种于铺有纤维连接蛋白(FN)的培养板中培养,培养48小时后收集未贴壁细胞,再按1×105PMC/孔的密度接种于FN包被的培养板中进行培养,培养72小时进行贴壁细胞的计数。取1×105细胞进行裂解,利用RealTime-PCR检测MODS各个阶段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平变化。
  结果:脓毒症发展过程中,Robo4表达水平逐渐升高,至T4达到峰值,随后逐渐下降;内皮祖细胞的数量先增加,在T5时达到峰值,随后出现明显下降。相关性分析表明,二者在脓毒症进展过程中的变化成正相关。
  结论:在LPS介导的小鼠脓毒症模型中,Robo4表达水平与骨髓中EPCs数量具有相关性,因此Robo4可能参与调控EPCs的增殖。
  第三部分 三种不同基因表型的小鼠骨髓来源EPCs培养鉴定和功能特征比较
  目的:对三种不同基因表表型小鼠骨髓来源的EPCs进行分离、培养、鉴定和功能比较。
  方法:从小鼠骨髓分离出单个核细胞,进行诱导分化培养,对培养至P6代的EPC进行细胞形态学特征、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管形成功能等方法进行鉴定,并对照分析。
  结果:三种不同基因表达的EPC鉴定如下:贴壁细胞均特异性摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,摄取率均超过80%。免疫组化:Robo4-/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4+/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式细胞仪技术鉴定:Robo4-/-组:CD133阳性率:17.25±6.43%;CD34阳性率:48.75±6.83%;CD31阳性率:72.53±12.38%;KDR阳性率:87.25±10.23%;Robo4+/-组:CD133阳性率:16.55±7.29%;CD34阳性率:46.65±7.23%;CD31阳性率:75.93±11.28%;KDR阳性率:89.25±11.33%;WT组:CD133阳性率:18.25±8.57%;CD34阳性率:47.15±5.72%;CD31阳性率:74.61±10.69%;KDR阳性率:88.25±11.35%。体外血管生成功能:Robo4-/+组:28.49±4.38个/HP;Robo4-/-组:25.82±3.62个/HP;WT组:42.32±3.92个/HP(P<0.05)。粘附功能:贴壁率(Robo4-/+组:42.7±3.1%;Robo4-/-组:39.5±1.7%;WT组:64.5±2.6%(P<0.05))。迁徙功能:迁徙率(Robo4-/+组:18.5±1.7%;Robo4-/-组:13.3±2.6%;WT组:27.5±1.8%(P<0.05))。增殖功能:Robo4-/+组:23.06±2.63×104;Robo4-/-组:19.24±2.65×104;WT组:40.33±3.65×104(P<0.05)。
  结论:Robo4+/-、Robo4-/-和WT三种基因来源的EPC的细胞形态和鉴定无明显差别。基因敲除小鼠EPCs的血管形成能力、迁徙功能、粘附功能和细胞增殖能力要劣于野生型组。
  小结:通过CLP+腹腔LPS注射建立复制小鼠脓毒症模型与临床脓毒症发生的常见诱因和实际过程相近。脓毒症发展过程中Robo4表达水平和内皮祖细胞数量呈上升趋势,而随着死亡的升高,二者逐渐下降。通过对三种基因表达小鼠诱导分离骨髓来源EPCs比较分析,发现Robo4基因敲除小鼠与野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鉴定、形态学特征、双吞噬功能基本一致。基因敲除小鼠在迁徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明显低于野生型小鼠。证实Robo4基因表型对EPCs的部分功能存在调控作用。
[硕士论文] 姜岩
中西医结合重症医学 黑龙江中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:观察化纤胶囊对脓毒症大鼠外周血T细胞CD69、CD4+CD25+Treg表达的影响,为化纤胶囊改善脓毒症免疫功能障碍提供理论依据和相关实验室指标。
  方法:健康SD雄性大鼠135只,随机分为两部分:预实验部分:盲肠半结扎组15只,假手术组15只。实验部分:假手术组15只;模型组45只(24h、48h、72h三个时间点上每组各15只);化纤胶囊治疗组45只(24h、48h、72h三个时间点上每组各15只)。(1)动物模型的建立:各组大鼠术前禁食(不禁水)24h后,使用10%水合氯醛(0.4ml/100g)进行腹腔注射麻醉。麻醉起效后,将大鼠固定于操作台上,呈仰卧位,腹部备皮后进行常规消毒。沿腹部正中线切开腹部皮肤2cm左右;①盲肠半结扎术:开腹找到盲肠后,距离盲肠盲端1-2cm处结扎1/2盲肠,同时使用14号穿刺针对盲肠进行贯通穿刺2-3次,挤出少量粪便后,将盲肠还纳腹腔关腹;②假手术组:仅对盲肠远端与肠系膜进行分离,不进行结扎。实验部分模型组与治疗组均采用盲肠半结扎法制作脓毒症动物模型。(2)处理因素:治疗组给予化纤胶囊200mg/kg灌胃(首次给药时间为术后2h,术后12h给予第二剂,每12h一次)。假手术组和模型组给予同体积生理盐水(首次给药时间为术后2h,术后12h给予第二剂,每12h一次)。(3)实验标本的采集和检测:①预实验部分:观察盲肠半结扎组和假手术组大鼠的一般状态,24h各组大鼠采尾血进行血培养,并对各组大鼠进行活杀解剖;②实验部分:假手术组于24h对大鼠进行活杀,留取血液标本进行检测;模型组、治疗组在各研究时间点上(24h、36h、72h),对大鼠进行活杀采血,应用流式细胞仪检测外周血中T细胞CD69、CD4+CD25+Treg。
  结果:1.预实验部分:盲肠半结扎组24h血细菌培养结果为阳性,解剖后腹腔可见积液,盲肠坏死发黑;假手术组血培养结果为阴性,腹腔无积液,肠管无坏死。假手术组和盲肠半结扎组24h均无死亡大鼠出现。
  2.实验部分:
  T细胞CD69:在24h、48h、72h时间点上模型组和治疗组与假手术组的差异具有显著统计学意义(P<0.01);组内比较:模型组24h、48h、72h三个时间点上的差异具有显著统计学意义(P<0.01);治疗组24h、48h、72h三个时间点上的差异有统计学意义但不显著(P<0.05)。组间比较:模型组与治疗组在72h的差异具有统计学意义(P<0.05)。
  CD4+CD25+Treg:在24h、48h、72h时间点上模型组和治疗组与假手术组的差异具有显著统计学意义(P<0.01);组内比较:模型组24h、48h、72h三个时间点上的差异具有显著统计学意义(P<0.01);治疗组24h、48h、72h三个时间点上的差异有统计学意义但不显著(P<0.05)。组间比较:模型组与治疗组在72h的差异具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:1.预实验部分:证明通过盲肠半结扎术可以成功诱导脓毒症大鼠模型;假手术组说明分离远端盲肠与肠系膜不会导致脓毒症的发生,盲肠半结扎是诱导脓毒症模型的关键。
  2.实验部分:
  T细胞CD69:72h治疗组和模型组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),在72h化纤胶囊能够改善脓毒症大鼠T细胞CD69的表达;
  CD4+CD25+Treg:72h治疗组和模型组之间的差异具有统计学意义(P<0.05),在72h化纤胶囊能够降低脓毒症大鼠CD4+CD25+Treg的表达。
[硕士论文] 高雪
药学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(sepsis)为感染、烧伤、创伤以及休克等危重病人的严重并发症,更是一种足够威胁生命的疾病,同时脓毒症亦是导致重症监护室(Intensive Care Unit,ICU)病人死亡的极其重要的原因。2016年2月在美国举办的第45届急危重病医学会上公布了脓毒症的3.0定义:脓毒症为是针对细菌感染而引发的机体反应失调从而引发的足够危及生命的多种器官功能障碍。基于脓毒症3.0定义,脓毒症休克病人的死亡率高于40%。激素的不合理应用、器官移植、人体免疫缺陷病毒(HIV)感染、结核病人、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、人工假体介入等治疗手段,滥用抗生素的治疗和高龄以及癌症等全部属于脓毒症的易感染因素。目前针对脓毒症的治疗方法有很多,但都存在着一定程度的局限性,疗效并不尽如人意。
  抗生素治疗策略一直是目前脓毒症最主要的治疗方法。但是,大量研究表明,抗生素虽然能有效的杀灭细菌,但G菌死亡溶溃后其外膜上的LPS释放,会导致更加严重的脓毒症临床症状。目前尚无针对抗生素治疗后LPS释放问题的有效方法。
  环糊精(Cyclodextrin,CDs)是一种环状低聚糖物质,CDs主要被应用在环保、农药、食品和医药等领域,一般被用作药用辅料。研究发现,CDs拥有疏水性空腔,而LPS是同时拥有亲水区阴离子以及疏水区的一种两亲性物质,在自然状态下,LPS会发生自组装。本课题探讨利用CDs的疏水空腔可以包合LPS类脂A(Lipid A)的特性,以阻断LPS与巨噬细胞结合、促进LPS从体内消除以发挥防治脓毒症作用的可行性。
  本研究取得的结果以及结论主要有:
  1.CDs对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7活性的影响
  采用MTT法考察了包括α-CD、β-CD、γ-CD和HP-β-CD四种CDs对RAW264.7细胞活性的影响。结果表明,在各CDs5mM和10mM浓度下,RAW264.7细胞活性均接近于100%,这表明了CDs基本没有细胞毒性;但是随CDs浓度的增高,四种CDs的细胞毒性均逐渐增强;在50mM浓度下,γ-CD和HP-β-CD组细胞存活率是51.3%和55.9%,二者的细胞毒性较α-CD和β-CD显著降低(P值均小于0.05)。
  2.CDs抑制LPS与巨噬细胞RAW264.7结合及其与LPS的包合作用研究
  2.1CDs对LPS与巨噬细胞RAW264.7结合的影响
  采用激光共聚焦荧光显微技术检测了α-CD和β-CD、γ-CD、HP-β-CD及β-CD-聚合物对LPS与巨噬细胞RAW264.7结合的影响。结果表明,5mM浓度下,所考察的五种CDs均能显著抑制LPS进入巨噬细胞内,且抑制作用由强到弱的顺序为HP-β-CD>γ-CD≈α-CD>β-CD聚合物≈β3-CD。
  2.2CDs与LPS的相互作用
  利用LPS能够和6-对甲苯胺基萘-2-萘磺酸钠(TNS)竞争与CDs疏水性空腔相结合的特点,通过荧光分光光度法检测了α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD及β-CD-聚合物与LPS的体外相互作用。在LPS不存在的情况下,TNS与五种CDs相结合,荧光强度最大。在TNS和各CDs的混合溶液中加入LPS以后,含有HP-β-CD以及γ-CD的溶液中相对荧光强度降低幅度最大,五种CDs与LPS相互作用强度为γ-CD>HPβ-CD>其他三种CDs。这进一步表明,γ-CD和HP-β-CD与LPS具有更强的相互作用。
  根据以上实验结果,选用细胞毒性较小,与LPS结合作用较大的的γ-CD和HP-β-CD用于进一步体内活性研究。
  3.γ-CD、HP-β-CD和抗生素联合用药对脓毒症小鼠的治疗作用
  选用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)建立脓毒症小鼠模型,观察γ-CD和HP-β-CD分别与抗生素亚胺培南联合用药以及亚胺培南单独用药对CLP脓毒症小鼠7天内生存率的影响。结果发现,与CLP模型组相比,亚胺培南单独用药组和两种CDs联合亚胺培南用药组都能够明显提升脓毒症小鼠生存率(P<0.05);与亚胺培南组相比,γ-CD和HP-β-CD分别联合亚胺培南给药组有进一步显著提高脓毒症小鼠生存率的作用(P值均小于0.05),其生存率的提高幅度分别为20%和30%。
  4.CDs对脓毒症小鼠血浆中炎症细胞因子水平的影响及对肺脏的保护作用研究
  腹腔注射LPS建立小鼠脓毒症的损伤模型。利用HP-β-CD和γ-CD进行干预,通过测定小鼠血液中细胞外组蛋白H4、炎症细胞因子(TNF-α、IL-6)的水平,考察内脏的病理学改变以及NF-κB在肺脏的表达,来观察HPβ-CD、γ-CD对脓毒症小鼠的保护作用。
  4.1CDs对脓毒症小鼠外周血中细胞外组蛋白H4水平的影响
  结果发现,与正常对照组比较,LPS复制的脓毒症模型组小鼠,其外周血中细胞外组蛋白H4的含量在6h明显增高(P<0.05),12h仍是上升趋势,在24h恢复至正常;与脓毒症模型组相比,γ-CD给药组以及HP-β-CD给药组小鼠在给药后6h,外周血中H4水平明显降低(P<0.05);12hγ-CD给药组以及HP-β-CD给药组外周血中H4水平与脓毒症模型组之间虽无明显差异,但较模型组呈现明显下降的趋势;24h时,LPS模型组小鼠血浆中H4水平下降,但是γ-CD用药组和LPS对照组比较血浆中H4水平仍明显降低(P<0.05),而HP-β-CD用药组和LPS对照组比较则无明显差异。这表明,γ-CD和HP-β-CD在脓毒症早期(6h)均有明显降低血浆中细胞外组蛋白的作用。
  4.2小鼠血浆中TNF-α水平的测定
  结果发现,与正常组比较,LPS模型组在所考察的三个时间点小鼠血浆中TNF-α的水平明显增高(P<0.01);与LPS对照组相比,在所考察的三个时间点6h、12h与24h,γ-CD给药组以及HP-β-CD给药组小鼠血浆中TNF-α水平均明显降低(P<0.01);另外,在12h,γ-CD给药组与HPβ-CD给药组比较,小鼠血浆中TNF-α水平明显降低(P<0.05)。这表明,γ-CD和HP-β-CD均有明显减少血浆中TNF-α水平的作用,且γ-CD较HP-β-CD作用更显著。
  4.3小鼠血浆中IL-6水平的测定
  结果发现,与正常组比较,LPS模型组小鼠血浆中IL-6的浓度在6h无明显变化,在12h及24h显著性增高(P<0.05);与LPS模型组相比,6h时,γ-CD给药组及HP-β-CD给药组均无明显差异;12h,γ-CD给药组血浆中IL-6的浓度明显降低(P<0.05);24h,γ-CD给药组以及HP-β-CD给药组和LPS模型组相比IL-6水平均明显降低(P<0.05);γ-CD给药组较HP-β-CD给药组有更显著地降低IL-6水平的作用(P<0.05)。以上结果表明,γ-CD和HP-β-CD均有明显降低血浆中IL-6水平的作用,而且,γ-CD降低血浆中IL-6水平的作用较HP-β-CD组更显著。
  4.4脓毒症小鼠组织病理学检测
  HE染色结果表明,LPS模型组小鼠在12h时肺泡壁大量血管充血、单核巨噬细胞增生等病变现象最为明显,表明其在12h病变最为严重,但该组小鼠肝脏和脾脏无明显病变,这表明本实验所复制的脓毒症小鼠组织损伤主要表现在肺。在造模后6h、12h、24h三个时间点,γ-CD与HP-β-CD均能有效的减轻脓毒症小鼠肺泡壁增厚、肺泡壁血管充血及单核巨噬细胞增生等病理改变。γ-CD与HP-β-CD在12h时对脓毒症小鼠肺部损伤的治疗效果更加明显,而且,γ-CD的改善作用更显著。
  小鼠肺部免疫组化结果发现,正常对照组也有NF-κB的阳性表达,LPS模型组和两种CDs给药组NF-κB的表达水平无明显差异。上述实验表明,LPS模型组TNF-α水平显著升高,说明TNF-α的大量释放加重了炎症反应,导致小鼠肺脏发生了肺水肿等严重病变,但是同时导致了肺泡上皮细胞的大量凋亡,因此LPS组小鼠NF-κB的阳性表达减少。
  这部分实验结果显示,LPS所致的脓毒症小鼠血浆中H4、TNF-α和IL-6的水平明显升高,γ-CD和HP-β-CD均能有效降低这些炎性成分的水平,并减轻脓毒症小鼠的肺部损伤。
[博士论文] 王杰艳
病理学与病理生理学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  脓毒症是感染反应失调引起的威胁生命的器官功能障碍,是一种由感染引起的生理、病理和生物化学异常综合征,是公共卫生领域的一个主要问题,脓毒症被称为隐藏的公共卫生灾难。长链非编码RNA是长度超过200nt,无蛋白编码能力的转录本。环状RNA(circRNA)能够形成共价闭合环,是非编码RNA的一种。与lncRNA相似,circRNA可以作为microRNA(miRNA)“海绵”来调控基因表达。到目前为止,还没有对脓毒血症中小鼠肝组织中的lncRNA和circRNA丰度和表达谱进行系统的研究。
  目的:
  鉴定LPS诱导小鼠脓毒症不同阶段肝脏特异lncRNA,并初步探讨其功能。
  方法:
  采用百迈客云对LPS(20mg/kg b.w)诱导小鼠脓毒症不同时间点(0h、2h、8h和24h)的肝脏polyA尾RNA富集转录组测序数据进行polyA尾lncRNA挖掘分析,挑选在脓毒症早期特异升高的lncRNA906,构建其敲除小鼠,探讨lncRNA906对LPS致小鼠死亡的影响,并筛选其潜在靶基因。
  结果:
  1.对LPS诱导小鼠脓毒症不同时间点的肝脏转录组数据进行polyA尾lncRNA挖掘分析。鉴定得到3,056个lncRNA,其中差异表达lncRNA共499个。
  2.lncRNA906位于小鼠基因组第15号染色体103095188-103100906,基因组跨度为5719bp,由3个外显子组成,转录本长度为2982nt,二级结构都比较复杂,且没有编码潜能。
  3.LPS刺激2h后,小鼠肝脏中lncRNA906显著升高。而在心、肾、大肠中lncRNA906是下调的,脑、脾、胃、小肠、阑尾表达没显著变化。lncRNA906在肺脏中无表达。
  4.LPS诱导lncRNA906表达依赖于TLR4受体。
  5.成功构建lncRNA906敲除(KO906)小鼠。并验证lncRNA906敲除小鼠免疫系统发育正常。
  6.WT与KO906小鼠腹腔注射LPS4h肝脏全转录组分析结果:以变化倍数大于2倍,P小于0.05为标准,和WT组对比,KO906组差异表达的lncRNA上调的有3个,下调的lncRNA有2个;差异表达的mRNA上调有23个,下调有20个;差异表达的TUCP上调有5个,下调有1个。差异表达circRNA上调28个,下调16个。差异表达miRNA有2个,均是下调的。
  7.lncRNA906缺失可以降低内毒素休克小鼠存活时间。
  结论:
  1.LPS诱导小鼠脓毒症不同时间点的肝脏组织通过polyA尾RNA富集的方法也能够分析得到差异表达的polyA尾lncRNA,但其差异的数量与表达丰度不如差异的mRNA。
  2.鉴定了LPS诱导小鼠脓毒症早期特异高表达的lncRNA906。在没有LPS刺激的时候,lncRNA906几乎检测不到,当给予LPS刺激后,细胞核和细胞质中都有分布。其表达依赖于TLR4受体。
  3.lncRNA906敲除对小鼠免疫系统发育没有影响。
  4.lncRNA906敲除对LPS诱导小鼠脓毒症4h的肝脏转录组带来了一定的影响,其中43个差异表达mRNA可能是lncRNA906的潜在靶基因。
  5.lncRNA906敲除减少了LPS诱导小鼠脓毒症的存活时间,提示lncRNA906在脓毒症早期的特异升高对内毒素休克小鼠具有一定的保护效应。
[硕士论文] 赵棋锋
流行病与卫生统计学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  分析成人脓毒血症的临床特点、病原菌分布及药敏信息,为临床经验性用药提供参考;探究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)与降钙素原(procalcitonin,PCT)在成人脓毒血症诊断中的临床价值;初步评价基于实时PCR的多重探针熔解曲线分析体系(multiplex probes melting curve analysisbased onreal-time PCR,PCR/MCA)对引起脓毒血症的病原菌早期的诊断价值。
  方法:
  1、收集厦门大学附属中山医院收治的住院患者资料,血培养阳性住院患者455例,其中脓毒血症352例,非脓毒血症103例;疑似感染并且血培养阴性的住院患者1609例,其中脓毒血症287例,非感染全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)518例,局部感染804例。收集患者年龄、性别、入院途径、入院情况、CRP、PCT及白细胞(leukocyte,white blood cell,WBC)水平。统计分析组内各因素之间的差异,绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线),获得CRP与PCT的最佳截断值及其曲线下面积(AUC),比较CRP、PCT与CRP+PCT串联对脓毒血症早期诊断的灵敏度、特异度。
  2、收集厦门大学附属中山医院检验科病原学检查的血培养瓶中的血液样本491份,其中血培养阳性血液样本362份,血培养阴性血液样本129份。采用盲法对样本进行PCR/MCA分析,以临床血培养后的质谱分析结果作为金标准,评估PCR/MCA对引起脓毒血症的病原菌早期的诊断价值。
  结果:
  1、脓毒血症患者血培养分离得到387株病原菌,革兰阴性菌占71.06%,革兰阳性菌占26.87%,真菌占2.07%。构成比位于前三位的病原菌分别为:大肠埃希菌占34.63%,肺炎克雷伯菌占20.41%,金黄色葡萄球菌占10.34%。
  2、革兰阳性菌中,金黄色葡萄球菌对青霉素耐药率为87.5%,对万古霉素、呋喃妥因和替考拉宁均敏感;其他类型的葡萄球菌对青霉素、苯唑青霉素和红霉素耐药率均相对较高,对利福平、利奈唑胺、万古霉素、呋喃妥因和替考拉宁均敏感;链球菌属对红霉素及克林霉素耐药率高达80%以上,对青霉素、头孢噻肟、利奈唑胺、万古霉素耐药率较低,药物敏感率超过90%。革兰阴性菌中,大肠埃希菌对哌拉西林耐药率为73.1%,对呋洛培南完全敏感(100%),对亚胺培南、阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦敏感率达95%以上;肺炎克雷伯菌对哌拉西林耐药率为24.1%,对阿米卡星相对最为敏感,敏感率为96.2%;铜绿假单胞菌对阿米卡星及庆大霉素完全敏感(100%),并且对抗菌药物的耐药率均相对较低;鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率均相对较高,对阿米卡星敏感率为53.3%。
  3、在血培养阳性患者中,脓毒血症组的CRP与PCT水平显著高于非脓毒血症组,两组之间存在统计学差异(P<0.001)。ROC曲线分析提示CRP、PCT以及CRP+PCT串联诊断脓毒血症AUC分别为0.85(95%CI,0.80~0.89)、0.90(95%CI,0.88~0.94)和0.92(95%CI,0.89~0.95)。CRP在截断值取97.05mg/L时,其灵敏度、特异度分别为77.8%、80.7%;PCT在截断值取1.34ng/mL时,其灵敏度、特异度分别为86.5%、79.5%;CRP+PCT串联诊断的灵敏度和特异度分别为84.3%与87.5%。ROC曲线成对比较结果表明PCT诊断价值大于CRP(P=0.016)。严重脓毒血症/脓毒性休克组CRP与PCT水平显著高于脓毒症组,CRP与PCT分别取197.01mg/L与28.55ng/mL时,AUC分别为0.67(95%CI,0.62~0.73)和0.98(95%CI,0.96~1.00),CRP的诊断灵敏度与特异度分别为50.5%与79.7%,PCT的诊断灵敏度与特异度分别92.8%与96.1%。
  4、在血培养阴性患者中,脓毒血症组的CRP与PCT水平均显著高于非感染SIRS组,两组之间存在统计学差异(P<0.001)。ROC曲线分析提示CRP、PCT以及CRP+PCT串联诊断脓毒血症AUC分别为0.76(95%CI,0.73~0.79)、0.97(95%CI,0.96~0.98)和0.96(95%CI,0.96~0.98)。CRP在截断值取130.70mg/L时,其灵敏度和特异度分别为64.1%和73.2%;PCT在截断值取1.51ng/mL时,其灵敏度和特异度分别为93.7%和88.6%;CRP+PCT串联诊断的灵敏度和特异度分别为91.3%和91.5%。
  5、在362份阳性血液样本中总共培养得到370株病原菌,对491份血液样本进行临床检测与PCR/MCA体系检测对比目前的分析结果表明,课题组构建的病原菌PCR/MCA体系与临床血培养鉴定的大肠埃希菌的阳性一致率为95.9%(117/122),肺炎克雷伯菌为93.4%(57/61),葡萄球菌属为94.4%(51/54),链球菌属为100%(22/22),真菌为93.8%(15/16),鲍曼不动杆菌为86.7%(13/15),肠球菌属为100%(12/12),铜绿假单胞菌为100%(11/11),特异度为100%,两种检测方法一致性较好。
  结论:
  1、CRP与PCT对脓毒血症患者的诊断以及脓毒血症患者感染程度的判定具有较好的参考价值,尤其是PCT对脓毒血症的诊断价值更高。
  2、PCR/MCA体系与临床血培养后的质谱鉴定一致性很好,符合高通量,准确性高,低成本的要求,并能快速准确地检测出血流感染中的病原菌,缩短了病原菌诊断时间。
[硕士论文] 林秀娇
护理学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1.描述重症脑卒中住院患者院内获得性压疮患病情况,探讨重症脑卒中患者压疮发生的危险因素。
  2.通过多准则决策分析法优化适用于临床的集束化干预策略,并应用于临床患者中,探讨其应用效果。
  方法:
  1.病例对照研究:选取2014年1月~2017年2月在福建医科大学附属第二医院神经内科、神经外科、ICU住院发生院内获得性压疮的全部患者为病例组,共292例,随机抽样法选取同期住院未发生院内获得性压疮的292例重症脑卒中患者为对照组。由研究者通过查阅科室上报护理部的压疮上报表,并查阅电子病历收集病人的基本资料及住院资料情况,填写重症脑卒中患者临床资料收集表,采用单因素及多因素Logistic回归分析确定重症脑卒中患者压疮的危险因素。
  2.应用多准则决策分析法优化集束化干预策略。收集国内外预防压疮指南中的推荐措施,与前期研究得出的可有效降低院内压疮发生率的措施汇总,确定集束化干预策略初稿。采用多准则决策分析法设计专家函询问卷进行专家咨询,形成集束化干预策略,并制定相应的实施细则和集束化干预策略核查表。
  3.前瞻性研究:选取2017年08月~2018年2月在福建医科大学附属第二医院神经内科住院的重症脑卒中患者。使用抽签法进行随机化分配。根据随机化分配结果,神经内科A区的患者为试验组,神经内科B区的患者为对照组。当患者入院时研究者到床旁查看患者,评估是否符合纳入标准,若符合则与患者或家属签署知情同意书,纳入研究,根据分组给予患者相应的干预方案。
  结果:
  1.重症脑卒中患者压疮患病率为24.08%,院内压疮患病率为10.30%;除1期外其他分期压疮患病率为11.11%,除1期外其他分期院内压疮压疮患病率为4.76%。压疮发生部位骶尾部最多,其次为臀部。
  2.重症脑卒中患者压疮发生的危险因素分析结果显示,高龄(年龄>75岁)、空腹血糖偏高、白细胞计数升高、住院时间长、瘫痪、大小便失禁、留置管道是影响重症脑卒中患者压疮发生的独立危险因素,而Braden评分高、营养支持、支撑面、预防性敷料是重症脑卒中患者压疮的保护因素。
  3.多准则决策分析结果显示,适合纳入集束化干预策略的项目有6项,包括:风险评估;预防性敷料;支撑面;皮肤护理;体位变换与早期活动;预防医疗器械相关性压疮。
  4.将优化后的预防压疮集束化干预策略应用到重症脑卒中患者中,集束化干预策略的执行率为94.12%,试验组压疮发生率为0%,对照组发生率为11.11%。结果表明,实施预防压疮集束化干预策略可提高护士的执行力,降低压疮的发生风险。
  结论:
  1.重症脑卒中患者压疮患病率高于普通住院患者压疮患病率的调查结果,低于国内针对手术、脊髓损伤、老年人等卧床人群压疮患病率、除1期外其他分期压疮患病率的相关报道。压疮分期以1期为主,占53.77%,压疮发生部位骶尾部最多,其次为臀部。
  2.影响重症脑卒中患者压疮发生的因素多源且复杂。在临床中,护士对预防压疮各项措施的执行力参差不齐,通过多准则决策法优化集束化干预策略用于预防压疮的发生,将有利于提高护士的执行力,降低压疮的发生风险。
[硕士论文] 魏亚萍
病理学与病理生理学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身性炎症反应,表现为宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。脓毒症的病情凶险,临床致死率高,近几年,尽管抗感染治疗技术和器官功能支持治疗有一定的发展,但脓毒症总的病死率仍达30%以上。目前脓毒症的治疗主要针对免疫调控和抗感染,但由于脓毒症患者免疫炎症反应的复杂性和明显的个体差异性,以往针对抗炎治疗的临床试验均未能显示对临床预后有明显的改善作用。因此,寻找有效治疗和预防脓毒症发生发展的新靶点具有重要意义。毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)是内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激的诱导物。以往的研究表明,用TG预适应对各种应激损伤具有保护作用。迄今为止,还没有关于TG预适应对脓毒症影响的报道。
  目的:
  毒胡萝卜素在脓毒症的发展过程中可能是既有损伤作用又有保护作用的双刃剑。以往研究发现毒胡萝卜素适度预适应性干预能够在不同的疾病模型中起到保护作用。本课题拟研究毒胡萝卜素适度预适应性干预是否能减轻脓毒症造成的损伤。
  方法:
  在整体水平,分别使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠脓毒症模型和腹腔盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)方式诱导脓毒症模型,预适应性应用毒胡萝卜素于LPS处理前15小时腹腔注射,观察毒胡萝卜素预适应对生存率和器官功能的影响。用western blot、real-time PCR、ELISA在整体水平和细胞水平研究内质网应激预适应对炎症反应的影响及调节炎症反应的生物学机制。
  结果:
  毒胡萝卜素预适应性干预在昆明小鼠脓毒症模型和C57/BL6J小鼠脓毒症模型中能明显改善生存率。与对照比,在C57/BL6J小鼠脓毒症模型中经预适应处理的小鼠注射LPS后肺脏病理损伤明显减轻,血清谷草转氨酶,谷丙转氨酶以及乳酸脱氢酶水平明显降低。同样,与脓毒症组相比,毒胡萝卜素预适应降低血清中interleukin(IL)-6和interleukin(IL)-1β水平。而肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)的水平没有被TG预适应性干预改变。不仅如此,毒胡萝卜素预适应降低脓毒症小鼠血清NO含量、血清中氧化应激的标志物8-iso-prostaglandinF2α水平及脾脏iNOS水平。
  而使用内质网应激抑制剂4-phenylbutyrate(4-PBA)阻断内质网应激后,毒胡萝卜素预适应保护作用依然存在。使用另一种ER应激诱导剂衣霉素预适应性干预后,尽管有较弱的保护作用,但是没有统计学意义。这提示毒胡萝卜素的保护作用不是通过内质网应激介导的。
  在体外培养的巨噬细胞RAW264.7中,毒胡萝卜素预适应处理对LPS引起的细胞炎症因子IL-6、IL-1β的蛋白表达水平有明显抑制作用,而对炎症因子的mRNA水平作用不明显。毒胡萝卜素预适应处理对LPS刺激引起的nuclear factor(NF)-κB(NF-κB)和c-Jun N-terminal kinase(JNK)通路激活没有明显抑制作用,提示毒胡萝卜素预适应发挥的抗炎症作用不是通过影响LPS受体下游信号通路的功能实现的。另外,我们发现毒胡萝卜素预适应处理降低炎症因子的翻译效率。TG改变炎症因子翻译不是通过调节因子eIF2α的磷酸化水平,毒胡萝卜素对炎症因子翻译效率的作用可能与mTOR通路有关。
  结论:
  结果提示毒胡萝卜素预适应性干预对脓毒症损伤有保护作用,毒胡萝卜素预适应性干预能够减轻脓毒症所致的炎症反应,其作用机制可能是通过影响炎症因子的蛋白质翻译过程。
[硕士论文] 温菲
临床医学(麻醉学) 山东大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  凝血功能障碍是脓毒症的基本的病理改变。脓毒症凝血功能障碍,特别是高凝状态下大量微血栓形成是多器官功能障碍综合征(MODS)的主导因素,也是脓毒症患者死亡的重要原因。研究表明,以外源性凝血级联反应中关键蛋白酶为治疗靶点的抗凝药如肝素有导致重要器官出血、增加患者死亡率的风险。而近期的基础研究显示,FXⅠ、FXⅡ抑制剂处理或者基因敲除在发挥抗凝作用的同时并不增加出血量。这提示,以内源性系统为靶点的药物用于凝血异常性疾病如脓毒症的治疗可能更有优势。本研究拟通过与对照组的比较,观察内源性凝血接触系统因子FXⅠ、FXⅡ、PK、HK在脓毒症患者的变化,并对血浆FXⅠ、FXⅡ、PK、HK与脓毒症严重程度(SOFA评分)进行相关性分析,以探讨内源性凝血在脓毒症中的作用,为脓毒症的临床治疗提供新思路。
  研究方法:
  本研究方案已获山东大学齐鲁医院医学伦理委员会批准。入组患者均已签署知情同意书。患者资料取自于2017年5月至2017年8月山东大学齐鲁医院重症监护病房收治的已确诊脓毒症患者65例,另选取25例同期入院患者作为对照。
  本次入选的脓毒症组患者同时满足以下两个条件:①全身炎症反应综合征(SIRS);②器官功能障碍,SOFA评分≥4分。对照组患者入选标准:ASA分级Ⅰ级患者。排除标准包括:①年龄<18岁;②近期输血治疗者;③妊娠或哺乳;④住院期间放弃治疗者;⑤拒绝签署知情同意书者。
  采集并记录患者的一般信息,包括性别、年龄、主诉、基础疾病、症状、临床诊断。记录入组患者24小时内的生命体征包括:体温、心率、血压、呼吸次数。记录24小时内的实验室检查指标包括:白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、纤维蛋白原(FIB)、酸碱度(PH)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、碳酸氢根(HCO3-)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、国际标准化比值(INR)、D-二聚体,并按照SOFA评分系统计算患者入组24h内SOFA值。
  入组24小时内抽取入组患者外周静脉血6毫升,分别置于以柠檬酸钠和乙二胺四乙酸为抗凝剂的采血管内,离心取上清,并分装于EP管中,-80℃冰箱保存备用。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆PK、HK、TF的浓度。凝固法测定FXⅠ、FXⅡ浓度百分比。
  研究结果:
  1.脓毒症组和对照组在年龄、性别方面比较差异无统计学意义。
  2.与对照组比较,脓毒症组患者白细胞计数显著增高((11.56±5.50)vs(5.75±1.46)×109/l,P=0.000),PH增高((7.44±0.06)vs(7.42±0.02),P=0.036),而PaCO2、HCO3-组间比较差异无统计学意义。
  3.脓毒症组患者PT(20.50±5.59)s、APTT(38.35±11.99)s、TT(17.28±3.90)s较对照组延长,PLT(143.66±83.27)×109/l较对照组减少,D-二聚体(3.23±2.91)μg/ml、FIB(4.28±2.05)g/l较对照组升高。
  4.与对照组比较,脓毒症组患者血浆TF(364.03±114.95)pg/ml升高,而FXⅠ(74.19±28.97)%、FXⅡ(28.95±16.26)%、PK(89.82±58.17)ng/ml、HK(38.02±11.32)μg/ml较对照组FXⅠ、FXⅡ、PK、HK浓度减少。
  5.相关性分析显示,脓毒症组的INR、APTT、FIB、PLT、TF与脓毒症严重程度SOFA评分相关(P<0.05);FXⅠ、FXⅡ、PK与SOFA评分亦相关(P<0.05)。
  研究结论:
  1.本次所收集的脓毒症患者存在凝血功能障碍,常规凝血指标PT、APTT、TT延长,PLT减少,D-二聚体和FIB升高。
  2.本次所收集的脓毒症患者在外源性和内源性凝血途径均有激活,但表现不尽相同。外源性凝血因子TF浓度升高,而FXⅠ、FXⅡ、PK、HK等内源性凝血接触系统因子浓度因凝血系统启动不断消耗凝血因子而降低。
  3.脓毒症患者FXⅠ、FXⅡ、PK、HK降低。FXⅠ、FXⅡ、PK与脓毒症严重程度SOFA评分相关。
[硕士论文] 邵向阳
免疫学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:感染性疾病是临床上的常见病,发病率呈逐渐上升的趋势,严重的感染患者会发生感染性休克。不同类型的感染性疾病的治疗方案也不同,细菌感染需要及时采用抗生素进行治疗,非细菌性感染则应慎用抗生素治疗。脓毒血症是一种死亡率较高的疾病,是非心脏内科ICU病人死亡的主要原因,我国估计约300万例/年,死亡率40%-50%。不能接受有效的抗生素治疗,患者的死亡风险逐渐上升,每推迟一小时,死亡率将增加7.6%。因此对这些感染性疾病进行早期的鉴别诊断,选择合适的治疗方案显得非常重要。降钙素原(procalcitonin,PCT)作为脓毒血症、炎症的一个良好血清学标志物,有助于临床感染性疾病的鉴别诊断及其预后评估,指导抗生素使用。目前PCT的检测方法主要有定量法(化学发光法、酶联免疫发光分析法)和半定量法(胶体金法)。化学发光法、酶联免疫发光分析法能准确定量,化学发光法需要大型专用仪器、费用昂贵、使用不便,酶联免疫发光分析法操作繁琐,准确性影响因素较多等缺点,限制了使用范围。胶体金法快速简便,但是不能精确的定量。PCT的动态监测和早期检测在临床上的价值意义重大,因此需要建立一种能快速、简便、准确对PCT定量的方法。
  目的:
  建立一种适用于床旁检测(Point of care testing,POCT)又称为“即时检验”的快速定量检测方法以助于PCT的及时检测和动态监测。本研究采用时间分辨结合免疫层析技术,建立一种快速定量检测PCT的方法。
  方法:
  1.将购买的两对PCT特异性单克隆行标记和包被抗体配对组合,用时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA,Time-resolved fluoroimmunoassay)进行筛选,获取最佳的标记及包被抗体。
  2.应用双抗体夹心法,建立基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原(PCT)试剂的方法。对各项试剂参数进行优化包括:硝酸纤维膜(NC膜)的筛选、检测线(T)和质控线(C)包被抗体量、最佳的划线量、标记抗体最佳用量、最佳反应时间确定。
  3.对试剂性能指标评估,进行以下实验:标准曲线、分析灵敏度、准确度、精密度、特异性、临床考核实验。
  结果:
  1.通过TRFIA法,综合剂量-反应曲线相关系数(r)、信噪比、背景等,筛选最优的标记原料(M J03);包被原料(16B5)。
  2.确立基于免疫层析技术与时间分辨技术反应模式;最佳的硝酸纤维膜HF135膜;检测线(T)16B5最佳包被用量2.0mg/mL;质控线(C)山羊抗兔IgG最佳包被用量1.0mg/mL;最优划线喷速0.08μL/mm;标记抗体MJG03最佳用量为0.1mg/mL;兔IgG最佳用量为0.1mg/mL;最佳反应时间为15min。
  3.试剂性能指标评估:标准曲线回归方程:log(y)=1.1143+0.8529log(x),r=0.9994;分析灵敏度为0.08ng/mL;准确度(回收率)在93%~105%之间;分析、分析间精密度CV在5.4%~13.4%;检测样本时不受人降钙素、CRP、人抗钙素、IL-6干扰物质的影响;234例临床样本考核实验等效性对比研究表明,自制试剂盒和商品化试剂盒(Roche Elecsys BRAHMS PCT Kit)具有很好的一致性(Kappa=0.875)和相关性[r=0.977,(P<0.01)]。
  结论:
  本研究成功研制了基于时间分辨荧光免疫层析技术快速定量检测PCT的试剂,试剂各项参数、性能指标良好,均符合体外诊断试剂的要求。能很好的满足临床对PCT快速定量检测的需求。
[硕士论文] 王丽娜
急诊医学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究脓毒症、脓毒症休克患者外周血中T淋巴细胞亚群、Treg细胞、促炎因子IL-6和TNF-α、抑炎因子IL-10和TGF-β的动态变化情况及临床意义,丰富对脓毒症患者免疫紊乱的认识。
  方法:收集2017年2月-2018年2月大连医科大学附属第一医院急诊ICU收治的患者44例(脓毒症休克患者15例,脓毒症患者11例,非脓毒症患者18例),在确诊为脓毒症或脓毒症休克的当日,进行外周血淋巴细胞亚群分析,评价脓毒症患者的免疫状况,同时将非脓毒症患者18例纳入对照组。分别用Elisa检测脓毒症患者确诊为脓毒症后(对照组为入院后)的当天、第3天、第7天患者外周血血清中的IL-6、IL-10、TGF-β、TNF-α等炎症因子的表达的量以及相应的SOFA评分,同时用流式细胞技术检测患者在确诊为脓毒症或脓毒症休克后的第3天、第7天外周血中Treg细胞表达的量。对入组的患者进行入院当日的APACHEⅡ评分,研究APACHEⅡ评分、SOFA评分与炎症因子表达量及Treg细胞表达量的的相关性,比较脓毒症休克组、脓毒症组、非脓毒症组促炎因子、抗炎因子、Treg细胞变化趋势及差异性,探索促炎因子、抗炎因子、Treg细胞变化趋势与患者预后的关系。
  结果:1.按病情严重程度分组:本实验在确诊为脓毒症休克,脓毒症的当天进行淋巴细胞亚群分析,结果显示除CD4+T细胞(Th)比例脓毒症组低于非脓毒症组有统计学意义外,淋巴细胞占比、CD8+T细胞比(TS)、Th/Ts在三组之间均无统计学差异;确诊的当天,促炎介质IL-6和TNF-α就显示出脓毒症休克组最高,脓毒症组其次,非脓毒症组最低的趋势,而抗炎介质IL-10也显示出脓毒症休克组显著大于非脓毒症组的现象,这种组与组之间的差别与说明疾病严重程度的APACHEⅡ评分和SOFA评分是一致的;CD4+T细胞占有核细胞的比值随病情的严重程度增高而减少,但Treg占CD4+T细胞的比值却是增加的,差异有统计学意义(P<0.05);
  2.按生存和死亡分组:IL-6死亡组在确诊当天、3天、7天逐步升高,并在第7天显著高于生存组,差异有统计学意义。同样的,死亡组的TNF-α也呈现逐渐增高的趋势,并在第7天显著高于生存组,差异有统计学意义。另外TGF-β在死亡组也是逐渐升高的,第7天显著高于确诊当天;CD4+T细胞的比值在死亡组比生存组低,而Treg占比却在死亡组比生存组高。对有意义的指标进行脓毒症预后的二元Logistic回归分析发现,只有APACHEⅡ可作为脓毒症预后的危险因素,而由于脓毒症患者病情复杂,治疗过程中炎症因子及免疫状态不断变化,且患者炎症反应呈现出多样性、复杂性,炎症因子又具有多效性、网络性、重叠性等特点,本课题研究尚未发现其他有意义的指标可作为脓毒症预后的独立危险因素。
  结论:1.在脓毒症早期,患者就出现免疫功能降低,但免疫功能降低得并不明显。
  2.脓毒症早期就有IL-6、TNF-α等炎症因子的大量释放,但并非只有促炎介质的释放,抗炎介质如IL-10、TGF-β也随之增高,说明脓毒症早期并出现抗/促炎反应的失衡。促炎介质与反应病情严重程度的APACHEⅡ评分和SOFA评分存在明显的正相关关系,且促炎介质之间存在正相关关系,持续增高的炎症反应可能导致更差的临床预后。
  3.脓毒症发展过程中出现CD4+T细胞占比的下降,而调节性T细胞(Treg)占CD4+T细胞的比却反而增高,病情越严重这种变化越明显,并且这种变化可能与不良预后有关,说明病情越重的患者免疫抑制越明显,免疫抑制可能导致更差的预后。
[硕士论文] 王念武
中西医结合临床 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过手术方法制备大鼠创伤性皮肤溃疡模型,应用溃愈灵膏外敷的治疗方式,观察对创面愈合率及创面愈合过程中相关因子的影响,探究溃愈灵膏促进大鼠创伤性皮肤溃疡愈合的作用机制。
  方法:72只清洁级SD雄性大鼠手术形成创伤性皮肤溃疡模型,造模完成后随机分为对照组、美宝组、溃愈灵组,每组24只。于治疗第3、7、14天,测量创面面积并计算溃疡创面愈合率,HE染色观察创面肉芽组织及毛细血管生长情况,免疫组化法检测创面Ang-1、Ang-2和Tie-2蛋白定位表达情况并计算阳性细胞表达率,Western Blotting法检测Ang-1、Ang-2和Tie-2蛋白表达水平,酶联免疫吸附法测定大鼠血清中IL-1β的含量。
  结果:1、创面愈合率:治疗第3天,各组大鼠创面愈合率相当,差异无统计学意义(P>0.05);治疗第7、14天,美宝组、溃愈灵组创面愈合率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),美宝组与溃愈灵组比较愈合率相当,差异无统计学意义(P>0.05)。2、HE染色结果:治疗第3天,显微镜下观察,各组均可见明显炎性反应及红细胞渗出表现,与对照组比较,美宝组、溃愈灵组红细胞渗出较轻,可见少量新生小血管。第7天,对照组仍可见红细胞渗出,大量中性粒细胞浸润,美宝组、溃愈灵组与对照组比较,新生小血管生长更明显,成纤维细胞生长活跃,溃愈灵组较美宝组肉芽组织生长更旺盛。第14天,各组肉芽组织丰富,美宝组和溃愈灵组较对照组肉芽组织排列更为紧密有序,新生血管逐渐转化为小动/静脉。3、免疫组化法标记Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白定位表达及阳性细胞率:Ang-1定位表达于血管周围,呈棕黄色至褐色;Ang-2阳性表达于组织间隙当中,颜色呈棕褐色;Tie-2表达于血管内皮细胞中呈棕色或棕黄色。Ang-1阳性表达率在第3、7、14天对照组低于美宝组、溃愈灵组,差异有统计学意义(P<0.01),美宝组低于溃愈灵组(P<0.01)。Ang-2阳性表达率在第3、7、14天对照组高于美宝组、溃愈灵组,差异有统计学意义(P<0.05),第3天美宝组高于溃愈灵组,差异有统计学意义(P<0.01)。Tie-2阳性表达率在第3、14天对照组低于美宝、溃愈灵组,差异均有统计学意义(P<0.05),美宝组低于溃愈灵组(P<0.05);第7天对照组、美宝组均低于溃愈灵组,差异有统计学意义(P<0.05)。4、Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白表达水平:Ang-1在第3、7、14天蛋白表达水平溃愈灵组高于美宝组、对照组,差异均有统计学意义(P<0.01),美宝组高于对照组(P<0.01);Ang-2蛋白表达水平在笫3天对照组高于溃愈灵组、美宝组,差异均有显著统计学意义(P<0.01),溃愈灵组高于美宝组(P<0.01)。第7天对照组高于美宝组、溃愈灵组(P<0.01),美宝组高于溃愈灵组,差异有统计学意义(P<0.01)。第14天,对照组高于美宝组、溃愈灵组,差异均有统计学意义(P<0.01),美宝组高于溃愈灵组,差异有统计学意义(P<0.01);Tie-2在第3、7、14天蛋白表达水平对照组高于美宝组、溃愈灵组(P<0.01),美宝组高于溃愈灵组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。5、血清IL-1β含量.IL-1β在治疗第1天各组血清含量相当(P>0.05);治疗第3、7天溃愈灵组、美宝组血清IL-1β含量均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),溃愈灵组低于美宝组(P>0.05);第14天溃愈灵组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。溃愈灵组低于美宝组,美宝组低于对照组,差异均无统计学意义(P>0.05)。
  结论:1、溃愈灵膏对皮肤溃疡大鼠创面内肉芽组织中毛细血管的生长有明显促进作用,使肉芽组织生长良好,提高创面愈合率。2、溃愈灵膏可减轻皮肤溃疡创面炎症反应,为创面愈合创造有利条件,其作用机制可能和降低血清中IL-1β含量有关。3、溃愈灵膏可增加Ang-1和Tie-2蛋白在细胞中表达水平,降低Ang-2表达水平,从而促进血管内皮细胞新生及新生血管生长,加快创面愈合速度。
[硕士论文] 郭玉
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症的定义为感染引发的宿主免疫系统失调导致的器官功能障碍,致死率高;脓毒性休克为脓毒症伴随严重的循环系统和细胞代谢功能障碍。脓毒症以高发病率和致命性受到广泛关注,根据最近的数据,美国的脓毒症病例数从1996年的3873301例上升到2011年的110万,预计2020年将达到200万,脓毒症导致的死亡率接近心脏病发作的死亡率,超过了中风死亡率;所以早期的干预治疗是非常必要的。尽管脓毒症治疗策略经过近二十多年的发展,液体复苏、抗生素治疗以及血液透析等技术已取得了巨大的进步,脓毒症预后改善仍不明显。
  中性粒细胞是数量最多的参与固有免疫应答的细胞。脓毒症早期即宿主受到病原体攻击时,骨髓内的中性粒细胞迅速动员,大量中性粒细胞在趋化因子的作用下迁移至病灶部位通过吞噬、脱颗粒作用以及形成胞外诱捕网发挥清除病原体作用。虽然中性粒细胞对病原体清除非常重要,但研究已证实中性粒细胞与器官功能损伤密切相关。脓毒症过程中中性粒细胞的凋亡延迟以及其激活后释放的大量炎症因子引发的级联反应可导致组织缺氧和器官功能障碍。
  程序性死亡蛋白-配体1(programmed cell death protein-ligand1,PD-L1)是免疫激活的标志,其与程序性死亡受体-1的相互作用可抑制抗原特异性免疫反应,导致T淋巴细胞功能障碍、活化的免疫细胞耗竭及免疫耐受。肿瘤或炎症环境可诱导PD-L1在抗原递呈细胞、肿瘤细胞上表达。有研究证实脓毒症时PD-L1也可表达于中性粒细胞上,并且PD-L1阳性的中性粒细胞可诱导淋巴细胞凋亡;同时有研究表明PD-L1与B7-1分子互为配体,可发挥抑制淋巴细胞增殖的作用。那么PD-L1作为传统的配体,是否可发挥类似于受体的胞内信号激活作用?此外利用丹麦科技大学(DTU)的NetPhos2.0Server程序做磷酸化位点分析发现PD-L1的蛋白序列分析具有类似YXXM结构域,而YXXM序列可与PI3K结合并活化p85亚基,PI3K/Akt信号通路在调控细胞凋亡中发挥着重要作用。那么PD-L1是否参与脓毒症时中性粒细胞凋亡延迟的调控?由此在本课题中着重探讨脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达与PI3K/Akt信号通路及自身凋亡的相关性。
  第一部分 脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的作用
  目的:
  探索脓毒症时中性粒细胞上PD-L1的表达水平与其凋亡的关系。
  方法:
  1、分离纯化健康志愿者静脉血的中性粒细胞,并将其分为3组:对照组(Con)、IFN-γ刺激组、IFN-γ+LPS共刺激组,刺激21小时后免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式细胞仪检测中性粒细胞的凋亡率。人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)具有诱导分化成类中性粒细胞的特性并且其表达PD-L1,将其分为对照组(Control)和维甲酸刺激组(RA组)进行刺激,21小时后流式检测免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式检测HL-60细胞的凋亡率。
  2、分离纯化脓毒症患者的中性粒细胞,流式技术检测培养24h后的凋亡率,同时收集细胞用免疫印迹法检测PD-L1的表达。
  3、siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21h后免疫印迹法检测siRNA的转染效率以及流式检测其凋亡率;利用IFN-γ和LPS刺激健康志愿者中性粒细胞PD-L1的表达,并利用siRNA干扰PD-L1的表达,21h后免疫蛋白印迹法检测PD-L1以及流式检测中性粒细胞的凋亡率。
  结果:
  1.共采集6例健康志愿者的中性粒细胞,经IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激后,中性粒细胞PD-L1表达上调,且培养21小时后凋亡率明显降低(P<0.01);RA刺激HL-60细胞系分化成中性粒细胞,与对照组相比,RA刺激组PD-L1表达下调,且其凋亡率明显增加(P<0.01);
  2.共收集了14例脓毒症患者中性粒细胞,培养24小时后的其凋亡率与PD-L1的表达水平呈负性线性关系(R2=0.4417,P=0.01)。
  3.siRNA转染脓毒症中性粒细胞,其凋亡率明显升高(P<0.01);PD-L1siRNA转染IFNγ+LPS刺激后的正常中性粒细胞的凋亡率与单纯IFNγ+LPS处理组相比,其凋亡率明显升高(P<0.01)。
  结论:
  PD-L1在中性粒细胞上的表达增加,而中性粒细胞的凋亡率下降,说明脓毒症时中性粒细胞PD-L1参与自身凋亡作用的调控。
  第二部分 PD-L1调控中性粒细胞凋亡作用的机制
  目的:探讨脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的可能机制
  方法:
  1.腺癌人肺泡基底上皮细胞细胞系(A549)具有易转染特性,常作为转染宿主;PD-L1全长质粒(PD-L1FL/GFP)转染A549细胞系,免疫荧光法检测已转染的A549细胞系内PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光的结合情况。
  2.人胚肾细胞系293 (HEK293)极少表达细胞外配体所需的内生受体,且易转染;利用PD-L1全长序列(PD-L1FL/GFP)和胞内段敲除(PD-L1TD/GFP)质粒转染HEK293细胞,免疫共沉淀检测PD-L1与p85的存在相互作用。
  3.利用siRNA干扰HL-60细胞系PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT的蛋白水平。
  4.利用siRNA干扰分离纯化的脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT蛋白水平。
  结果:
  1.携带GFP的PD-L1全长质粒和胞内段敲除质粒构建成功。免疫荧光双染法发现PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光可重合。
  2.PD-L1FL/GFP和PD-L1TD/GFP转染HEK294细胞系行免疫共沉淀后发现PD-L1可与P85相互作用,且与PD-L1胞内段无关。
  3.PD-L1 siRNA转染HL-60细胞后,其pAKT水平降低。
  4.PD-L1 siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞后,其pAK水平下调
  结论:
  脓毒症时PD-L1可调控中性粒细胞的凋亡作用,其调控机制可能与PI3K/AKT信号通路相关。
[硕士论文] 周吉秋
结直肠肛门外科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:课题组前期的实验成果表明补充外源性瓜氨酸可以保护大鼠脓毒症时期的肝脏、心脏、肾脏,并且能有效抑制早期炎症因子的释放。本课题基于此研究成果,进一步探讨瓜氨酸对大鼠脓毒症时期肠道结构的保护作用以及影响晚期炎症因子高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放水平的能力,以进一步探讨瓜氨酸在脓毒症发生发展过程中可能发挥的作用。
  方法:使用脓毒症动物模型制作的金标准——盲肠结扎穿孔术(CLP)造成SD大鼠发生脓毒症,以制作大鼠脓毒症模型。将大鼠分成未进行特殊处理的正常对照组(Normal组)、单纯生理盐水灌胃组(NS组)、单纯瓜氨酸溶液灌胃组(Cit组)、假手术组(sham组)、脓毒症组(CLP)、瓜氨酸治疗组(CLP+Cit)。Normal组大鼠不做任何特殊处理;NS组大鼠需连续使用生理盐水按每只每天5ml的量灌胃1w;Cit组大鼠需使用瓜氨酸按每只200mg kg-1·d-1的剂量持续分别灌胃给药1w;Sham组大鼠行假手术,即腹腔注射水合氯醛麻醉后打开大鼠腹腔,轻微翻动盲肠附近肠管后立刻缝合切口,不行CLP术;CLP组大鼠进行CLP手术;CLP+Cit组大鼠需在CLP手术前应用L-瓜氨酸按每只每天200mg/kg的剂量连续灌胃1w。
  设定CLP造模后大鼠取样时间点为6h、12h、24h和48h。在取样时间点上记录大鼠生存情况,并在取样前观察大鼠一般状态与腹腔内病变情况。采集大鼠腹主动脉血分离出血清,使用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中HMGB1水平。收集各组大鼠未坏死结肠组织一段,石蜡包埋后切片,再采用HE染色法高倍镜下观察结肠组织的病理变化情况。使用SPSS21.0进行统计学分析,以双侧P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:6h与12h时打开CLP组与CLP+Cit组两组大鼠腹腔可观察到腹腔内有一定脏器病变情况但两组间差异不大,24h及48h时CLP组大鼠腹腔内脓毒症症状较CLP+Cit组更严重,以24h时更为明显。结肠组织病理切片HE染色镜下可见CLP+Cit组大鼠结肠组织炎症细胞浸润情况较CLP组轻。比较CLP组与CLP+Cit组两组48h以内四个时间点的生存率,得到两组大鼠在48h时间点上生存率之间有统计学差异(P≤0.05),可以认为补充外源性瓜氨酸可以有效提高脓毒症大鼠48h时的存活率。CLP组和CLP+Cit组的大鼠血清HMGB1水平均在24h前逐渐升高,24h时测到最高值,并在48h时大幅下降;在四个取样时间点上,CLP+Cit组测得的HMGB1平均水平均低于CLP组,且在12h、24h、48h三个时点CLP+Cit组显著低于CLP组(P<0.05)。
  结论:补充外源性瓜氨酸可以有效缓解脓毒症大鼠腹腔内炎症情况、可能可以提升脓毒症大鼠远期生存率、减轻脓毒症大鼠结肠组织炎症反应、保护结肠组织,还可以抑制脓毒症大鼠血清HMGB1的释放。
[博士论文] 张文平
内科学(呼吸病学) 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分展开论述:
  第一部分
  目的:
  筛选肺炎和肺炎继发脓毒症患者血浆中差异表达的miRNA。
  方法:
  纳入我院住院诊治的肺炎及肺炎继发脓毒症患者各5例,其中脓毒症的诊断采用Sepsis3.0的诊断标准。在诊断明确24小时之内采血,离心后将血浆冻存于-80℃冰箱保存。提取血浆中的总RNA,采用Agilent miRNA芯片技术进行高通量筛选。筛选标准为p<0.05或者fold change>=2或<0.5,或拷贝数大于50。
  结果:
  实验所采用的血浆样本质控合格,芯片检测进行3次生物学重复,数据稳定。血浆miRNA芯片的检出率较低,本实验患者血浆中miRNA芯片的检出率6.31±2.98%,组间比较无统计学差异。结果显示共有15个miRNAs符合p<0.05或者fold change>=2或<0.5,或拷贝数大于50的筛选条件。其中5个在脓毒症组表达下调,分别为miR-144-3p、miR-19b-3p、miR-4767、miR-486-5p、miR-940。10个在脓毒症组表达上调,分别为miR-4644、miR-4778-5p、miR-4800-5p、miR-6510-5p、miR-6739-5p、miR-6740-5p、miR-6809-5p、miR-6867-5p、miR-7110-5p、miR-765。符合p<0.01或者fold change>=2或<0.5,或拷贝数大于50的筛选条件的共有6个。分别为miR-4800-5p、miR-6510-5p、miR-6740-5p、miR-7110-5p、miR-765、miR-940,其中miR-940在脓毒症组表达下调。符合p<0.001或者fold change>=2或<0.5,或拷贝数大于50的筛选条件的共有2个。分别为miR-6740-5p、miR-7110-5p,在脓毒症组表达均上调。
  结论:
  血浆miRNA芯片的检出率总体较低。肺炎和肺炎继发脓毒症患者血浆中miRNA的表达存在差异。符合p<0.001或者fold change>=2或<0.5,或拷贝数大于50的筛选条件的共有2个。分别为miR-6740-5p、miR-7110-5p,在脓毒症组表达均上调。
  第二部分
  目的:
  采用荧光定量PCR方法验证基因芯片所筛选出的在肺炎和肺炎继发脓毒症患者血浆中差异表达的miRNA,以及文献报道的脓毒症相关miRNA。并对miRNA进行生物学信息分析。
  方法:
  拟纳入我院住院诊治的肺炎及肺炎继发脓毒症患者各50例,脓毒症的诊断采用Sepsis3.0的诊断标准。提取患者血浆中的总RNA,采用荧光定量PCR技术检测miRNA水平。
  结果:
  共52例普通肺炎患者入组,其中男性31名(59.6%),女性21名(40.4%),平均年龄52.10±16.15y。Sepsis3.0标准诊断肺炎继发脓毒症患者共44例,其中男性34名(77.3%),女性10名(22.7%),平均年龄63.72±19.83。肺炎继发脓毒症患者的SOFA评分为6.47±3.11。选择符合p<0.01或者fold change>=2或<0.5,或拷贝数大于50的筛选条件的6个miRNAs,分别为miR-4800-5p、miR-6510-5p、miR-6740-5p、miR-7110-5p、miR-765、miR-940,另外纳入文献报道miR-146a、miR-150、miR-223-3p、miR-25、miR-133a,以miR-16为内参基因,共计11个miRNAs为待测目的基因。荧光定量PCR技术检测结果提示,miR-7110-5p、miR-223-3p在肺炎和肺炎继发脓毒症患者循环血中表达存在差异,且两者在肺炎继发脓毒症组患者血浆中的表达均上调。生物学信息分析提示,差异表达的miRNA靶基因涉及干细胞分化调控、神经递质的调节、细胞形态的正向调节参与分化、突触囊泡定位、突触小泡的定位、突触囊泡运输、突触囊泡的胞吐作用等。相关的信号通路包括Wnt信号通路、甲状腺激素信号通路、TGF-beta信号通路、逆行内源性大麻素信号、Hippo信号通路、GABA能突触信号通路、酪氨酸激酶抑制剂抵抗性信号通路、多巴胺能神经突触信号通路、AGE-RAGE信号通路等。
  结论:
  miR-7110-5p、miR-223-3p在肺炎继发脓毒症患者循环血中表达存在上调。
  第三部分
  目的:
  以Sepsis3.0诊断标准为金标准评价miRNAs诊断肺炎继发脓毒症的敏感性和特异性,并分析肺炎继发脓毒症组死亡的危险因素。
  方法:
  2016年8月至2017年1月共44例肺炎继发脓毒症患者,52例肺炎患者,22例正常对照。荧光定量PCR检测miR-7110-5p和miR-223-3p在三组研究对象血浆中的水平。采集一般信息及肺炎继发脓毒症患者的合并基础疾病、SOFA评分、最终预后、ICU住院天数等。采用SPSS22.0统计软件完成相关数据的统计分析。单因素分析中,正态分布计量资料用平均数±标准差描述进行T检验,非正态分布采用Mann-Whitney检验,计数资料用x2检验,P值<0.05存在统计学差异。多因素采用Logstic回归分析。miRNA诊断脓毒症的特异性和灵敏性通过ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线下面积和选定的cut off值进行计算。相关分析采用Logistic回归分析。
  结果:
  MiR-7110-5p在肺炎组、肺炎继发脓毒症组和健康对照组的△CT分别为4.15±2.52、2.27±2.64、5.73±1.35,有显著统计学差异(p=0.000).同时,MiR-7110-5p的△CT值在健康对照组和肺炎组存在统计学差异(p=0.000),在健康对照和脓毒症组也存在统计学差异(p=0.000),在肺炎和肺炎继发脓毒症组同样存在统计学差异(p=0.001)。MiR-7110-5p在肺炎组、肺炎继发脓毒症组和健康对照组的相对表达量分别为0.084(0.012,0.28)、0.133(0.054,0.963)、0.022(0.011,0.033),有显著统计学差异(p=0.000)。同时,MiR-7110-5p的相对表达量在健康对照组和肺炎组存在显著统计学差异(p=0.015),在健康对照和肺炎继发脓毒症组也存在显著统计学差异(p=0.000),在肺炎组合肺炎继发脓毒症组同样存在显著统计学差异(p=0.006).MiR-223-3p-3p在肺炎组、肺炎继发脓毒症组和健康对照组的△CT分别为2.39±1.36、1.44±1.43、4.58±0.91,有显著统计学差异(p=0.000)。MiR-223-3p的△CT值在健康对照组和肺炎组存在显著统计学差异(p=0.000),在健康对照和脓毒症组也存在显著统计学差异(p=0.000),在肺炎和肺炎继发脓毒症组同样存在显著统计学差异(p=0.002)。MiR-223-3p在肺炎组、肺炎继发脓毒症组和健康对照组的相对表达量分别为0.189(0.107,0.367),0.361(0.221,0.735),and0.044(0.022,0.061),有显著统计学差异(p=0.000)。同时,MiR-223-3p的相对表达量在健康对照组和肺炎组存在显著统计学差异(p=0.000),在健康对照和肺炎继发脓毒症组也存在显著统计学差异(p=0.000),在肺炎组合肺炎继发脓毒症组同样存在显著统计学差异(p=0.004)。
  MiR-7110-5p△CT值预测肺炎继发脓毒症的AUC为0.883,取临界值为4.41时,miR-7110-5p诊断肺炎继发脓毒症的敏感度为84.2%,特异度为90.5%。MiR-223-3p△CT值预测肺炎继发脓毒症的AUC为0.964,取临界值为2.759时,miR-223-3p诊断肺炎继发脓毒症的敏感度为82.9%,特异度为100%。44例脓毒症患者中,存活23例(52.3%),死亡21例(47.7%)。在SOFA评分≤6的脓毒症患者中,miR-223-3p的△CT值为1.763±1.401。SOFA评分>6的脓毒症患者中,miR-223-3p的△CT值为0.762±1.308,两者有显著差异(p<0.05)。单因素分析显示在脓毒症死亡组和存活组患者中,两组的SOFA评分、氧合指数和是否合并意识障碍有显著差异(p<0.05)。
  结论:
  miR-7110-5p及miR-223-3p预测肺炎继发脓毒症均具有较高的准确性。MiR-7110-5p△CT值预测肺炎继发脓毒症的AUC为0.883,取临界值为4.41时,miR-7110-5p诊断肺炎继发脓毒症的敏感度为84.2.3%,特异度为90.5%。MiR-223-3p△CT值预测肺炎继发脓毒症的AUC为0.964,取临界值为2.759时,miR-223-3p诊断肺炎继发脓毒症的敏感度为82.9%,特异度为100%。肺炎继发脓毒症患者存活组及死亡组比较,年龄、SOFA评分、SOFA评分(氧合指数)、是否存在意识障碍4个因素在两组间存在显著统计学差异。
[硕士论文] 王海清
急诊医学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:1.验证生物信息学方法可用于脓毒症发生、发展机制的研究;2.应用生物信息学方法筛选出调控脓毒症发生、发展的关键基因,为临床治疗脓毒症提供新思路。
  方法:1.在GCBI在线分析平台的“样本”选项中,以“sepsis”为关键词找到与之链接的GEO数据库中脓毒症的基因芯片数据集:GSE28750,将该基因芯片数据集发送至GCBI分析实验室后分为脓毒症组及健康对照组,应用GCBI在线分析平台对基因芯片数据进行差异分析以筛选出脓毒症组与健康对照组之间的差异表达基因,将筛选出的差异表达基因进行GO分析以了解富集差异基因的生物学功能、途径或者细胞定位,将差异表达基因进行pathway分析以了解实验条件下显著改变的代谢通路,将差异表达基因进行基因信号网络分析以发现网络中核心的基因(即调控疾病发生、发展的关键基因),将差异表达基因进行共表达网络分析以筛选出共表达网络中的核心基因(即调控脓毒症发生、发展的关键基因);2.在RAW264.7细胞的培养基中加入100ng/mL的脂多糖以对其进行刺激,选择不同的时间节点并综合运用形态学观察、ELISA法和RT-qPCR法对相关指标进行检测并分析,以判断脓毒症细胞模型是否建立成功;3.应用RT-qPCR法检测脓毒症组和空白对照组细胞内筛选出的关键基因的相对表达量,应用SPSS19.0对实验结果进行统计学分析以判定这些关键基因在脓毒症组和空白对照组之间的含量是否具有差异及差异是否具有统计学意义。
  结果:1.通过将脓毒症组与空白对照组之间的差异表达基因进行基因信号网络分析及共表达网络分析,推测GNAI3、PIK3CB、MAPK14、GYG1、SAMSN1和ATP11B为脓毒症发生、发展过程中的关键基因;2.在RAW264.7细胞的培养基中加入100ng/mL的脂多糖并继续培养4小时即可简便、快捷的建立与人类脓毒症发生、发展高度拟合的脓毒症细胞模型;3.通过应用RT-qPCR法对筛选出的脓毒症关键基因的相对表达量进行检测并使用t检验进行统计学分析后可知,GNAI3、PIK3CB、MAPK14、GYG1和SAMSN1在脓毒症组和空白对照组中的相对表达量具有差异,且差异具有统计学意义,推测GNAI3、PIK3CB、MAPK14、GYG1和SAMSN1是脓毒症发生、发展过程中的关键基因;ATP11B在脓毒症组和空白对照组中的相对表达量具有差异,但差异没有统计学意义,推测ATP11B不是调控脓毒症发生、发展的关键基因。
  结论:1.通过脂多糖刺激RAW264.7细胞成功建立了脓毒症细胞模型;2.可以应用生物信息学的方法筛选调控脓毒症发生、发展的关键基因,但需要进一步的生物学实验对其准确性进行验证;3.通过应用生物信息学方法筛选及进一步的生物学实验验证,推测GNAI3、PIK3CB、MAPK14、GYG1及SAMSN1是调控脓毒症发生、发展的关键基因,为临床治疗脓毒症提供了新思路。
[硕士论文] 王慧芳
急诊医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(sepsis)是机体对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。它是感染、创伤、休克、烧伤以及术后常见的并发症,也是导致多器官功能障碍综合征的重要原因。据流行病学统计,美国每年大概有751000人被诊断为脓毒症,其中215000人因治疗无效死亡。脓毒症不仅病理机制复杂而且具有发病迅速、病情进展快的特点,是危重患者死亡的重要原因。在脓毒症患者中,免疫功能抑制普遍存在,多种机制参与了脓毒症患者的免疫抑制,免疫细胞凋亡在其中发挥了重要的作用。巨噬细胞是重要的固有免疫组成细胞,同时也是重要的抗原提呈细胞,在协调固有免疫和获得性免疫中发挥了重要作用。研究显示在脓毒症的发生发展过程中除T细胞大量凋亡外,巨噬细胞也出现大量凋亡。动物实验中同样观察到在脓毒症早期阶段即出现巨噬细胞的大量凋亡。此外,脓毒症时大量炎症介质释放并激活相关的信号通路加剧炎症反应并导致细胞凋亡,其中早期细胞因子TNF-α和晚期细胞因子高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1protein,HMGB1)均参与了细胞凋亡。姚咏明课题组发现HMGB1可使Caspase-3活性明显增高,并可导致巨噬细胞凋亡。目前学术界已经明确指出固有免疫系统中的巨噬细胞在启动以及维持机体免疫反应方面发挥重要作用,免疫细胞的大量凋亡进一步加重了机体免疫系统紊乱,诱发脓毒症休克以及多器官功能障碍综合征。
  组蛋白(histone)是染色体的重要组成部分,正常生理状态下循环中组蛋白含量极少很难被检测到,而在临床工作中却在脓毒症患者中检测到大量组蛋白。细胞外大量的组蛋白不仅可以诱导炎症因子释放、发挥细胞毒性作用,而且可以损伤线粒体造成细胞功能障碍、胞内钙超载,进而诱发细胞凋亡。大量免疫细胞凋亡后机体进入免疫抑制/免疫麻痹状态,免疫系统的崩溃导致机体难以对抗残存病原体,诱发二重感染或脓毒症休克以及多器官功能障碍,最终导致患者死亡。因此,细胞外组蛋白在脓毒症的发生发展中占有重要地位,被认为是导致脓毒症患者死亡的关键物质。细胞凋亡是一种由基因调控的程序性死亡。在细胞凋亡过程中调控凋亡的促凋亡基因与抑凋亡基因相互影响,并通过外源性凋亡信号通路、细胞内线粒体通路以及内质网信号通路介导细胞凋亡。细胞内Ca2+超载、线粒体损伤、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase蛋白酶)以及活性氧(ROS)等也参与细胞凋亡过程。钙离子作为机体常见的信号因子,参与不同阶段的细胞凋亡过程。因此,钙离子是另一种重要的诱导细胞凋亡的物质。
  目前已明确在脓毒症发生发展过程中存在巨噬细胞大量凋亡,但是细胞外组蛋白是否介导了巨噬细胞凋亡以及其具体凋亡机制尚不清楚。依据既往文献报道,我们推测脓毒症时细胞外组蛋白可能通过Ca2+内流后损伤线粒体,激活线粒体通路导致巨噬细胞凋亡。本实验通过使用小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞深入探究细胞外组蛋白对巨噬细胞凋亡的作用及其机制,明确细胞外组蛋白与细胞Ca2+内流、线粒体损伤、细胞凋亡之间关系。
  目的:
  1、明确组蛋白是否可以引起Ca+内流;
  2、探讨组蛋白是否通过Ca2+内流损伤线粒体;
  3、探讨组蛋白是否通过线粒体损伤介导Raw264.7细胞凋亡;
  4、明确组蛋白诱导Raw264.7细胞凋亡的信号通路。
  方法:
  1、采用Fluo3-AM荧光染色法染色Raw264.7细胞并结合流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度;
  2、采用Rhodamin123染色法染色Raw264.7细胞并结合流式细胞仪检测其线粒体膜电位变化;
  3、采用Annexin V FITC/PI双染法染色Raw264.7细胞并结合流式细胞仪检测组蛋白对细胞凋亡的影响;
  4、通过Western Blot检测Bcl-2、胞浆细胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)以及Cleaved Caspase-3的表达;
  数据分析方法
  所有实验结果使用SPSS19.0进行统计学分析,结果以均数±标准差(X±S)表示。应用2-tailed unpairedt检验比较各组间之间的差异;P值小于0.05表示结果存在统计学差异。
  结果:
  1、组蛋白可以诱导Raw264.7细胞Ca+内流,并且这种作用具有时间依赖性和浓度依赖性特征;MgSO4可以抑制组蛋白诱导Raw264.7细胞的Ca2+内流。
  2、组蛋白通过促进Ca2+内流介导巨噬细胞的线粒体损伤。
  3、组蛋白通过促进Ca+内流诱导Raw264.7细胞凋亡。
  4、组蛋白通过线粒体损伤介导巨噬细胞凋亡。
  结论:
  细胞外组蛋白通过Ca2+内流造成线粒体损伤,致使线粒体膜通透性改变,Cyt-C释放至胞浆内,并介导Caspase-3活化,最终引起Raw264.7细胞的凋亡。
[硕士论文] 左文
急诊医学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过构建RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞)的细胞脓毒症模型,探讨Hippo信号通路在脓毒症中的作用机制。
  方法:1.运用脂多糖(内毒素(lipopolysaccharide,LPS))刺激RAW264.7细胞构建细胞脓毒症模型,将未用LPS刺激的RAW264.7细胞分为正常组(normal),将LPS刺激的RAW264.7细胞分为脓毒症组(sepsis)。通过细胞计数检测normal组与sepsis组细胞增殖情况,免疫荧光染色(Immunofluorescence technique,IF)后,运用共聚焦显微镜对Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)及磷酸化的Yes相关蛋白(Phosphorylated Yes-associated protein,p-YAP)进行定位观察,蛋白印迹法(Western blot)检测normal组与sepsis组YAP及p-YAP的表达情况。用逆转录荧光定量聚合酶链锁反应(RT-qPCR)法检测normal组与sepsis组TAZ、CD206、NOS2、IL-6、IL-1β及TNF-α基因的表达情况。2.用慢病毒构建YAP蛋白RNA干扰载体,慢病毒转染RAW264.7细胞,将转染后的细胞分为干扰组25(RNAi25)、干扰组26(RNAi26)、干扰组27(RANi27)及空载组(negaive)组,通过荧光显微镜观察,判断细胞转染效率。用western blot检测转染后YAP蛋白的表达情况,筛选出有效的转染组,然后用western blot检测有效转染组、空载组、正常组中YAP蛋白表达情况。3.用LPS刺激慢病毒转染后RAW264.7细胞,并将其分为YAP干扰组(RNAi),用LPS刺激未转染的RAW264.7细胞,将其分脓毒症组(sepsis)。用免疫荧光染色检测YAP蛋白的表达情况,用RT-qPCR检测sepsis组与RNAi组NOS2、TAZ、CD206、LI-6、IL-1β及TNF-α基因的表达情况,运用CCK-8检测sepsis组与RNAi组细胞的增殖情况,运用流式细胞仪中的Annexin V/7-AAD染色检测sepsis组与RNAi组细胞的凋亡指数。
  结果:1.LPS能刺激RAW264.7细胞增殖,YAP蛋白主要表达于细胞核中,p-YAP主要表达于细胞质中,且YAP蛋白在sepsis组中表达高于normal组,p-YAP在sepsis组中表达低于normal组,TAZ和CD206基因在sepsis组表达低于normal组,NOS2、LI-6、IL-1β和TNF-α在sepsis组表达高于normal组。2.慢病毒干扰载体能转染RAW264.7细胞,转染效率能达80%以上,RAW264.7细胞被慢病毒转染后能抑制YAP蛋白的表达,空载的慢病毒转染后的RAW264.7细胞与未被转染RAW264.7细胞中YAP蛋白表达无明显差异。3.TAZ、CD206、NOS2及LI-6基因在RNAi组表达高于sepsis组,IL-1β和TNF-α基因在RNAi组表达低于sepsis组。通过流式细胞仪检测发现RAW264.7细胞在RNAi组中凋亡指数比sepsis组低。通过CCK-8法发现RNAi组与sepsis组中细胞增殖无影响。
  结论:1.LPS能刺激RAW264.7细胞构建细胞脓毒症模型,YAP蛋白主要表达于细胞核中,而p-YAP表达于细胞质中,YAP可能是通过去磷酸化参与脓毒症的发生。脓毒症时,促炎细胞因子基因IL-6、IL-1β及TNF-α高表达,hippo通路中的TAZ基因低表达,M1型巨噬细胞标志物NOS2基因高表达,M2型巨噬细胞标志物CD206基因低表达。2.慢病毒介导的YAP干扰载体能抑制RAW264.7细胞中YAP的表达,慢病毒载体不能影响YAP的表达。3.YAP经RNAi的干扰后,在脓毒症是促进细胞凋亡,而不是促进细胞增殖,能抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,参与促炎因子IL-1β、TNF-α的释放,可能参与IL-6的释放。
[硕士论文] 王洁
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨脓毒症患者外周血TOLL样受体4(TLR4)基因(rs56101219,rs5030722)位点多态性和基因表达,同时探讨其与炎症因子TREM-1、IL-6、IL-2、MCP-1表达的相关性。
  方法:针对24例正常人与24例脓毒症患者进行静脉采血得到全基因组DNA后,使用聚合酶链式反应克隆TLR4基因的(rs56101219,rs5030722)位点并测序比对分析基因多态性;提取外周血的单核细胞,运用实时荧光定量PCR检测TLR4的mRNA表达水平。酶联免疫吸附法检测TREM-1、IL-6、IL-2、MCP-1等炎症因子表达。应用ROC曲线分析TLR4与TREM-1、IL-6、IL-2、MCP-1之间相关性,并探讨其对脓毒症患者诊断的预测价值。
  结果:在脓毒症患者中均未检测到TLR4基因(rs56101219,rs5030722)位点上存在多态性;脓毒症患者外周血液中的TLR4表达水平显著高于健康组,同时脓毒症患者外周血液中炎症因子TREM-1、IL-6、IL-2、MCP-1表达均显著高于正常组,并与TLR4表达成正相关。
  结论:脓毒症患者外周血TOLL样受体4(TLR4)基因的(rs56101219,rs5030722)位点上不存在多态性;脓毒症患者外周血中TLR4的表达与TREM-1、IL-6、IL-2、MCP-1等炎症因子升高具有显著相关性,可作为脓毒症病症预警和诊断指标。
[硕士论文] 王成博
细胞生物学 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(Spesis)是严重烧伤、创伤及外科大手术后常见并发症,现已成为危重患者死亡的主要原因之一。临床上由细菌感染引发的脓毒症占到了95%以上,而细菌感染引起的内毒素脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的释放是导致脓毒症的主要因素。当LPS入侵机体时,首先发挥作用的便是单核-巨噬细胞系统,巨噬细胞表面的Toll样受体4识别LPS并激活巨噬细胞胞内信号传导,产生大量的促炎性细胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等,细胞因子通过血液循环或旁分泌到达远端靶器官或靶细胞并发挥生物学效应,引起全身炎症反应,导致脓毒症的发生。鉴于巨噬细胞在LPS诱发的脓毒症的发生发展中发挥着关键性的始动作用,因此,寻找并鉴定新的巨噬细胞炎症反应的调控分子对于全面认识了解脓毒症具有重要的意义。
  蛋白4.1R是蛋白4.1家族的成员,此家族还包括蛋白4.1B、蛋白4.1N、蛋白4.1G。蛋白4.1家族的成员拥有4个保守的结构域:FERM结构域,FERM相邻的调节结构域、血影蛋白-肌动蛋白结合结构域和C-末端结构域。蛋白4.1R作为膜骨架蛋白,衔接多种跨膜蛋白与细胞骨架蛋白,能够维持细胞正常形态;介导细胞运动和粘附;调节细胞生长、分化。近年来,蛋白4.1R因在免疫细胞中发挥重要的调节作用而受到广泛的关注,CD4+T细胞中,蛋白4.1R通过结合T细胞活化连接蛋白(Linker for activation of T cells,LAT)并抑制ZAP-70对LAT的磷酸化从而负调控CD4+T细胞增殖及分化。最近的研究报道表明,同样拥有FERM结构域的膜突蛋白能够参与巨噬细胞中的TLR4/NFκB信号通路,研究结果提示蛋白4.1R可能在LPS诱导巨噬细胞炎症反应中发挥作用,从而可能会参与脓毒症的发生发展。
  研究目的:
  本课题利用野生型(4.1R+/+)和4.1R基因缺陷型(4.1R-/-)C57BL/6小鼠腹腔接种LPS建立小鼠脓毒症模型,研究蛋白4.1R在脓毒症中的作用;进而利用4.1R+/+小鼠和4.1R-/-小鼠骨髓诱导的巨噬细胞,体外探讨蛋白4.1R在LPS诱导巨噬细胞炎症反应中的调控作用,从而为深入阐明脓毒症的发病机制提供研究基础,并为治疗脓毒症提供新的思路。
  研究方法:
  1.4.1R+/+和4.1R-/-C57BL/6小鼠腹腔接种LPS建立脓毒症模型,监测小鼠的生存期。
  2.ELISA检测4.1R+/+和4.1R-/-脓毒症小鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的分泌。
  3.取4.1R+/+和4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织做组织切片、H&E染色以及巨噬细胞免疫组化。
  4.荧光定量PCR检测4.1R+/+和4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的表达。
  5.体外诱导4.1R+/+和4.1R-/-C57BL/6小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),流式检测4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞纯度。
  6.PCR技术和Western blotting印记鉴定4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞中4.1R的表达,并绘制BMDM细胞中4.1R基因的外显子图谱。
  7.荧光定量PCR和ELISA分别检测LPS刺激4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞后促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12以及趋化因子MCP-1的表达与分泌。
  8.Western blotting印记检测LPS刺激4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞后MAPKs信号通路的活化。
  研究结果:
  1.建立小鼠脓毒症模型后,4.1R-/-小鼠表现为发病更早,死亡率更高。
  2.4.1R-/-脓毒症小鼠血清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的分泌显著高于4.1R+/+脓毒症小鼠。
  3.4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织水肿及损伤更严重,并且4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织浸润的巨噬细胞数量更多。
  4.4.1R-/-脓毒症小鼠肝组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及趋化因子MCP-1的表达显著高于4.1R+/+脓毒症小鼠。
  5.流式检测4.1R+/+BMDM和4.1R-/-BMDM细胞纯度分别为94.7%和94.0%,可用于后续实验。
  6.PCR技术和Western blotting印记分别从基因水平和蛋白水平证实了4.1R-/-BMDM细胞中4.1R的表达缺失;4.1R基因的外显子图谱分析表明BMDM细胞中4.1R基因缺失了外显子14、15、16。
  7.LPS刺激后,4.1R-/-BMDM细胞中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12以及趋化因子MCP-1的表达和分泌显著高于4.1R+/+BMDM细胞。
  8.LPS刺激后,4.1R-/-BMDM细胞MAPK信号通路中p-JNK蛋白和p-ERK蛋白的表达显著高于4.1R+/+BMDM。
  研究结论:
  蛋白4.1R能够抑制LPS刺激巨噬细胞后促炎性细胞因子的产生,从而在LPS诱导的脓毒症中发挥重要的负调控的作用。
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