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[硕士论文] 徐俊
外科学(普通外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究将探讨在脓毒症发生过程中Robo4基因表达对EPCs数量和功能的影响,及其诱导EPCs定向分化作用,为临床防治脓毒症探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。
  本研究共分为三个部分,首先通过基因敲除技术构建Robo4-/+、Robo4-/-小鼠,通过盲肠穿孔+腹腔注射内毒素(LPS)制造出创伤后基因敲除小鼠的脓毒症模型。然后动态观察创伤后脓毒症发展过程中EPCs内Robo4表达水平和内皮祖细胞数量变化。最后对三种不同基因表达小鼠骨髓来源的EPCs进行体外培养和功能鉴定。
  第一部分 多器官功能障碍小鼠模型的建立
  目的:建立基因敲除小鼠脓毒症模型,为研究Robo4影响内皮祖细胞增殖和分化提供实验基础。
  方法:将体重20-25g的Robo4-/+、Robo4-/-和WT三种基因类型的小鼠100只分为2组:实验组(M组)90只,施行腹腔内毒素注射+盲肠穿孔;对照组(C组),施行假手术。观察各组动物的症状、体征、生存率、脏器功能指标(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并观察主要脏器的大体及显微镜下病理改变。
  结果:实验组小鼠的症状、体征与功能指标均发生明显变化,肺、肝、心、肾及胃肠道等脏器病理改变严重。实验组和对照组MODS发生率为(82.2%,0),死亡率(75%,10%),显著高于对照组。
  结论:采用腹腔注射内毒素+盲肠穿孔的方法,可以成功地复制出小鼠脓毒症模型,且有较高的死亡率和可重复的稳定性,并可进一步发展成为MODS。
  第二部分 脓毒症进展过程中EPCs数量的变化及EPCs内Robo4表达水平变化
  目的:监测脓毒症各个阶段正常小鼠骨髓中内皮祖细胞的数量变化,检测EPCsRobo4的mRNA和蛋白水平变化,探讨Robo4表达水平与EPCs数量变化的相关性。
  方法:按照第一部分造模后,分别在正常状态下、注射内毒素2小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取骨髓,按照密度梯度离心法获得单个核细胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×105PMC/孔的密度种于铺有纤维连接蛋白(FN)的培养板中培养,培养48小时后收集未贴壁细胞,再按1×105PMC/孔的密度接种于FN包被的培养板中进行培养,培养72小时进行贴壁细胞的计数。取1×105细胞进行裂解,利用RealTime-PCR检测MODS各个阶段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平变化。
  结果:脓毒症发展过程中,Robo4表达水平逐渐升高,至T4达到峰值,随后逐渐下降;内皮祖细胞的数量先增加,在T5时达到峰值,随后出现明显下降。相关性分析表明,二者在脓毒症进展过程中的变化成正相关。
  结论:在LPS介导的小鼠脓毒症模型中,Robo4表达水平与骨髓中EPCs数量具有相关性,因此Robo4可能参与调控EPCs的增殖。
  第三部分 三种不同基因表型的小鼠骨髓来源EPCs培养鉴定和功能特征比较
  目的:对三种不同基因表表型小鼠骨髓来源的EPCs进行分离、培养、鉴定和功能比较。
  方法:从小鼠骨髓分离出单个核细胞,进行诱导分化培养,对培养至P6代的EPC进行细胞形态学特征、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管形成功能等方法进行鉴定,并对照分析。
  结果:三种不同基因表达的EPC鉴定如下:贴壁细胞均特异性摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,摄取率均超过80%。免疫组化:Robo4-/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4+/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式细胞仪技术鉴定:Robo4-/-组:CD133阳性率:17.25±6.43%;CD34阳性率:48.75±6.83%;CD31阳性率:72.53±12.38%;KDR阳性率:87.25±10.23%;Robo4+/-组:CD133阳性率:16.55±7.29%;CD34阳性率:46.65±7.23%;CD31阳性率:75.93±11.28%;KDR阳性率:89.25±11.33%;WT组:CD133阳性率:18.25±8.57%;CD34阳性率:47.15±5.72%;CD31阳性率:74.61±10.69%;KDR阳性率:88.25±11.35%。体外血管生成功能:Robo4-/+组:28.49±4.38个/HP;Robo4-/-组:25.82±3.62个/HP;WT组:42.32±3.92个/HP(P<0.05)。粘附功能:贴壁率(Robo4-/+组:42.7±3.1%;Robo4-/-组:39.5±1.7%;WT组:64.5±2.6%(P<0.05))。迁徙功能:迁徙率(Robo4-/+组:18.5±1.7%;Robo4-/-组:13.3±2.6%;WT组:27.5±1.8%(P<0.05))。增殖功能:Robo4-/+组:23.06±2.63×104;Robo4-/-组:19.24±2.65×104;WT组:40.33±3.65×104(P<0.05)。
  结论:Robo4+/-、Robo4-/-和WT三种基因来源的EPC的细胞形态和鉴定无明显差别。基因敲除小鼠EPCs的血管形成能力、迁徙功能、粘附功能和细胞增殖能力要劣于野生型组。
  小结:通过CLP+腹腔LPS注射建立复制小鼠脓毒症模型与临床脓毒症发生的常见诱因和实际过程相近。脓毒症发展过程中Robo4表达水平和内皮祖细胞数量呈上升趋势,而随着死亡的升高,二者逐渐下降。通过对三种基因表达小鼠诱导分离骨髓来源EPCs比较分析,发现Robo4基因敲除小鼠与野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鉴定、形态学特征、双吞噬功能基本一致。基因敲除小鼠在迁徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明显低于野生型小鼠。证实Robo4基因表型对EPCs的部分功能存在调控作用。
[博士论文] 罗益滨
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:颈椎病是临床多发病和常见病之一,广义的颈椎病是由颈椎间盘退变及继发病理改变导致周围解耦的变化,出现神经肌肉相关症状的一类疾病总称,又叫颈椎综合征。据粗略统计,我国颈椎病发病率在8.1%-19.1%之间。根据颈椎病的临床表现,颈椎病有多种分型,其中,伴交感神经症状颈椎病是较为特殊的一种。所谓伴交感神经症状颈椎病,是由于各种颈椎病损(如不稳、退变、间盘突出、炎症等)刺激颈部交感神经节,引起眩晕、视物模糊、头痛、失眠、胸闷、潮热甚至腹胀等交感神经症状的颈椎病。对该类型颈椎病形成的命名、分型、形成机制、发病过程、诊断标准、治疗规范,目前还存在较大的争议,其中机制研究是伴交感神经症状颈椎病的热点和难点之一。据已经发表的文献,主要有颈椎椎间不稳学说、体液因子学说、后纵韧带交感神经学说、关节周围本体感受器刺激学说、颈部Ruffini小体受激学说等。迄今没有一种假说能完美解释这种特殊类型颈椎病的发病机制。近年来,较为热门的是颈椎后纵韧带上交感神经纤维刺激学说。现有实验表明,刺激后纵韧带上交感神经纤维可以引起颈部交感神经节电位变化,并诱发相应交感神经症状。基于此学说,临床上选择术中切断后纵韧带,以对颈段脊髓充分减压、阻断交感神经反射通路,部分患者得到症状的缓解。还有学者围绕椎动脉、心脏等效应器对颈部交感纤维与交感症状之间的对应关系做了探索。但这一学说还有不完善和不成熟的地方,本研究拟对这种机制展开进一步研究。
  目的:
  1、在前人研究的基础上,通过形态学研究,进一步明确交感神经在后纵韧带上的节段性分布形态学规律,为后续的实验和其他类型的研究提供必要的证据。
  2、进一步明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维受激惹引起的相应交感神经症状。通过选取呼吸和血压两个效应器,明确颈部交感神经节→后纵韧带上交感神经纤维→效应器的传导关系,理清伴交感神经症状颈椎病的发病机制。
  3、通过上述实验,巩固伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究的其中一种学说:即颈后纵韧带上交感神经纤维致病机制。
  4、通过研究伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究,明确症状与病变部位的对应关系,为临床上精确定位和治疗伴交感神经症状颈椎病提供客观依据。
  方法:
  实验一:研究颈椎后纵韧带上交感神经纤维的分布情况。手术切取10只实验动物新西兰白兔的颈椎后纵韧带、交感神经节,通过不同染色方法进行形态学研究。将实验兔分为两组,每组5只,第一组进行颈椎交感神经节的切取,第二组进行颈椎后纵韧带的切取。将实验动物新西兰白兔进行耳缘静脉麻醉后,妥善安置于颈椎操作台,充分伸展颈椎,术区备皮消毒。切开皮肤,显露颈椎及周围附属结构,分别切取相应的组织。取出材料后,迅速放入中性甲醛溶液固定,进行HE、NPY以及S100的组织染色,并进行读片分析,以明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维存在的证据以及神经组织的来源。
  实验二:研究电刺激不同部位颈交感神经节时,观察效应器官(以呼吸频率为参数)的变化情况。取实验动物新西兰白兔35只,实验组(颈上、中、下交感神经节组)分为3组,每组10只;对照组5只。麻醉后捆绑胸部呼吸换能器。显露颈椎及周围附属结构,对不同部位颈部交感神经节进行电刺激,测量刺激前后呼吸频率变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录呼吸频率变化。以明确不同部位颈交感神经节和呼吸频率之间的关系。
  实验三:研究电刺激不同部位颈交感神经节,观察血压变化情况以及与神经节对应关系。取实验动物新西兰白兔35只,实验组分为3组(颈上、中、下交感神经节组),每组10只;对照组5只。进行耳缘静脉麻醉后,显露颈椎及周围附属结构,游离颈动脉,进行动脉置管及换能器连接。对不同部位颈部交感神经节进行电刺激(50mV),记录血压变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录血压变化。明确不同部位颈部交感神经节和血压之间的对应关系。统计学方法:实验中涉及的计量资料以均数±标准差(x±s)表示。应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析,组内采用配对t检验的方法。3个实验组(分别为颈部上、中、下交感神经节)与对照组(0mV电刺激组)刺激后的数据组间比较,采用Dunnett-t检验。设置检验水准a=0.05,当P<0.05认为差异有统计学意义。
  结果:
  实验一:通过形态学研究后纵韧带上交感神经纤维的分布及来源。结果发现,①通过观察染色后的切片,到颈椎后纵韧带表面神经染色呈阳性反应。②阳性反应的密度较低,提示交感神经纤维分布较少。③不是所有实验动物的后纵韧带都能检测出神经染色阳性反应,提示交感神经纤维在后纵韧带上分布不具有普遍性。④经过特异性NPY染色,观察到后纵韧带表面分布的神经纤维,和颈部交感神经节的来源相同。
  实验二:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察呼吸频率的相应改变。结果发现,颈上神经节刺激组于对照组刺激后相比,呼吸频率存在的统计学意义(P<0.05)。颈中、下神经节刺激后和对照组刺激后比,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  实验三:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察血压的相应改变。结果发现,颈上、中神经节刺激组可以观察到血压的改变,和对照组相比,变化存在统计学意义(P<0.05)。颈下神经节刺激后和对照组比较,血压不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,血压变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1、形态学研究证实了交感神经纤维存在于后纵韧带本研究从形态学上进一步证实了后纵韧带上分布的交感神经纤维。通过多项神经染色技术在光镜下仔细观察,确认交感神经纤维存在于颈椎后纵韧带表面。且交感神经纤维的来源与颈交感神经节同源,这是作为后纵韧带交感神经纤维致病机制的解剖学证据。
  2、通过效应器研究明确了不同部位交感神经节和症状对应关系实验证实,刺激不同节段颈交感神经节后,可引起相应交感神经症状(以呼吸频率和血压为对象)。通过药物阻滞后纵韧带上的神经纤维,不能再次触发相应症状。结合既往发现的颈交感神经节与后纵韧带表面交感神经纤维的对应关系,得出以下结论:颈椎病变刺激后纵韧带上不同节段的交感神经纤维,可以引起对应的不同症状。其中,颈4/5节段病变对应呼吸频率变化,颈5/6节段病变对应血压变化。证实了后纵韧带上交感神经纤维致病机制的合理性。
  3、本系列实验的结果对临床诊治具有一定的指导意义本实验发现了呼吸频率和血压与颈部交感神经节之间的对应关系。通过这一结果,可以由不同症状准确定位颈椎的病变节段。这一发现,为临床上对伴交感神经症状颈椎病的精准诊断和治疗带来了新的启发。
[博士论文] 杨明园
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  几年来,脊柱矢状面的参数及其平衡越来越受到人们的关注,包括脊柱参数和骨盆参数,如骨盆入射角(PI)、骨盆倾斜角(PT)、骶骨倾斜角(SS)、腰椎前凸(LL)及胸椎后凸(TK)等。现已经证实,脊柱骨盆参数之间存在明显的关联性,且相互之间通过代偿和调节参与维持脊柱整体的矢状面平衡。此外,脊柱的矢状面参数与患者的生存质量存在明显的关系。因此,相比较冠状面而言,在脊柱畸形及其他骨科手术中,越来越多的外科医生更关注于术后矢状面的恢复和重建。但是,大量的脊柱-骨盆参数及其之间复杂的联系使得脊柱矢状面平衡的研究趋于复杂化。现已经公认的矢状面的平衡调节机制包括三个部分:邻近节段进行代偿(主要是LL和TK之间的代偿)、通过骨盆旋转进行代偿(PT和SS之间的代偿)以及通过下肢的调节(膝关节屈曲等),但是很难能够明确的判断哪些因素是维持脊柱矢状面平衡的主要原因,哪些因素在其中只是起代偿的作用。LL和TK是维持脊柱平衡及脊柱形态的的两个重要弯曲,所以推测LL和TK在脊柱矢状面的维持中起到重要作用。虽然评估脊柱矢状面的参数的数量之多,但是没有一个参数能直接反映矢状面的代偿,且也没有研究去证实脊柱区域性的矢状面参数(LL和TK)是否在脊柱整体的矢状面调节中具有重要的作用。
  目的:
  本课题主要通过临床数据的随访和分析提出脊柱区域性参数(LL、TK)在正常人及青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)患者的矢状面平衡调节代偿中的作用;探索LL和TK是否能用来预测脊柱的整体的矢状面平衡。最后以LL、TK为主要参数,建立术中矢状面重建的预测公式,为患者术前制定精准化治疗方案。
  方法:
  1.正常人维持矢状面平衡的参数研究
  2014.1至2015.8,来本院体检中心体检的健康人群。纳入的研究对象均为无脊柱疾患的健康志愿者,每位志愿者者需拍摄全脊柱正侧位X线,收集志愿者的一般资料和影像学参数。一般资料包括:性别和年龄。影像学资料包括:T1倾斜角(T1上终板和水平线的夹角)、maxLL(最大腰椎前凸角,测量腰椎最大前凸的上下终板之间的夹角)、maxTk(最大胸椎后凸角,测量胸椎最大后凸的上下终板之间的夹角)、骶骨倾斜角(SS,S1的上终板与水平线的夹角)、骨盆入射角(Pelvic Incidence,S1上终板中点的垂线与S1上终板中点和股骨头中点之间连线的夹角)、骨盆倾斜角(Pelvic Tilt,S1上终板中点与股骨头中点连线与铅垂线之间的夹角)和SVA(Sagittal Vertical Axis,C7中点铅垂线与S1后上角垂线之间的距离)。将志愿者分为两组:第一组311名病例,用于探索维持正常人矢状面平衡的主要参数,并建立正常人矢状面平衡的预测公式。第二组29名病例,用于公式效度的检验。
  2.LL和TK之间的匹配(LL-TK)在老年非特异性腰痛人群中的矢状面平衡预测研究
  2012.01至2014.01间,纳入我科门诊129名非特异性腰痛的老年患者,排除腰椎骨折、腰椎管狭窄、骨肿瘤或感染等引起的腰背部的疼痛。每位患者需拍摄全脊柱正侧位X线,收集患者的影像学参数。包括:maxLL、maxTK、SS、PI、PT、SVA、LL-TK和PI-LL(PI-maxLL的差值)。疼痛评分利用Numeric rating scales量表(0-10分)。
  统计分析:
  ①对SVA及年龄、疼痛指数及其他影像学参数做相关性分析;
  ②对LL-TK及年龄、疼痛指数及其他影像学参数做相关性分析;
  ③根据患者的SVA的绝对值是否大于5cm,将患者分为两组:A组(SVA>5cm)和B组(SVA≤5cm);比较两组之间各个一般参数及影像学参数之间是否存在差异;
  ④利用LL-TK和PI-LL制作ROC曲线,求出Cutoff值作为SVA平衡的指标;
  ⑤利用LL-TK和PI-LL的Cutoff值,计算该参考值下,矢状面平衡的阳性率及阴性率,以判断LL-TK是否能用来准确预测矢状面的平衡。
  3.腰椎前凸和胸椎后凸差值在青少年特发性脊柱侧弯(Adolescent Idiopathic Scoliosis)患者术前及术后矢状面中的代偿作用
  纳入2010.01至2013.01,我科接受手术治疗的LenkeⅠ型和LenkeⅡ型患者。收集患者的一般资料,包括姓名、年龄、性别及Risser征。每位患者需在术前及术后拍摄全脊柱正侧位X片。测量收集影像学参数,包括TK、LL、SS、PI、PT、SVA和LL-TK(LL和TK的差值)。通过统计学分析,比较术前术后LL、TK及LL-TK是否发生变化,探讨LL和TK在AIS患者矢状面平衡中的作用。
  4.术中恢复理想矢状面的预测公式研究
  收集2014.01-2015.08,来本院体检中心体检的健康人群。纳入的研究对象均为无脊柱疾患的志愿者共311名,每位志愿者签署临床研究知情同意书。其中220名进行预测公式的建立,其余91名志愿者进行预测公式的检验。每位志愿者者需拍摄全脊柱正侧位X线,收集志愿者的一般资料和影像学参数。一般资料包括:性别和年龄。影像学资料包括:maxLL、maxTK、SS、PI和PT。通过相关统计学分析,建立能够预测术中理想腰弯的公式并进行检验。
  结果:
  1.统计学研究显示:在正常人中,T1倾斜角与maxTK、maxLL与SS、SS与PI、PT与PI之间存在非常密切的相关性(Very good correlation);maxTK与maxLL、maxLL与PI之间存在中等的相关性(Moderate correlation);年龄与T1倾斜角、年龄与maxTK、年龄与SS、年龄与PT、年龄与SVA、T1倾斜角与SVA、SVA与PT、SVA与PI存在弱相关性(Weak correlation);T1倾斜角与maxLL、maxLL与PT、SVA与maxLL、PT与SS存在较弱相关性(Very weak correlation)。多元线性回归分析显示:年龄、T1倾斜角、maxLL、PI和PT为维持正常人矢状面平衡(SVA)的主要因素。预测公式为:SVA=0.294*age+1.367*T1倾斜角-1.149*maxLL-0.704*PT+1.378*PI-34.164。利用另一部分病例,发现该公式具有良好的效度(P=0.307)。
  2.在非特异性腰背痛的老年患者中,矢状面平衡SVA与NRS疼痛指数、年龄、maxLL、PT、LL-TK和PI-LL明显相关。LL-TK与年龄、maxTK、maxLL、SS、PT、PI、SVA、NRS疼痛指数明显相关。根据患者矢状面是否平衡(SVA是否大于5cm),将患者分为2组,统计学研究发现:年龄、maxLL、PT、LL-TK、PI-LL、SVA及NRS疼痛指数存在明显差异。ROC曲线显示:矢状面平衡的LL-TK、PI-LL的cutoff值分别为:0°和13°。利用LL-TK、PI-LL的cutoff值,发现当LL-TK≥0°、PI-LL≤13°时,89%的患者矢状面处于平衡状态;当LL-TK<0°、PI-LL>13°时,87%的患者矢状面处于失平衡状态。LL-TK可以有效地预测非特异性腰背痛的老年群体的矢状面的平衡。
  3.在LenkeⅠ型和Ⅱ型的AIS患者中,术前及术后TK和LL均有显著的减少;术前及术后TK与LL之间均存在显著的相关性;LL与TK的差值(LL-TK)在术前及术后无显著改变;且TK和LL的改变量之间存在明显的相关性。证实了,TK与LL可能是AIS术后维持矢状面平衡的一个重要代偿作用。
  结论:
  1.年龄、T1倾斜角、maxLL、PT和PI是维持正常人矢状面平衡的主要参数。正常人矢状面平衡可以根据预测公式进行预测:SVA=0.294*age+1.367*T1倾斜角-1.149*maxLL-0.704*PT+1.378*PI-34.164。
  2.LL-TK与PI-LL相结合,是预测老年非特异性腰背痛患者矢状面平衡的良好指标。
  3.AIS患者术前术后,LL与TK发生了相同的改变;LL-TK在术前与术后无明显变化。LL与TK之间的匹配可能参与AIS术后矢状面平衡的维持。
  4.术中恢复矢状面的平衡主要通过恢复LL,而LL的恢复主要可能通过TK来恢复。
  5.基于正常成人失状位脊柱骨盆参数的预测模型,可以准确地预测正常人群中矢状面的平衡状态。此外,还可以指导术中腰弯的恢复程度,以恢复矢状面的平衡。
  6.脊柱区域性参数(LL和TK)参与调节脊柱矢状面的平衡,并且恢复LL和TK可以重建恢复矢状面的平衡。
[博士论文] 范晓明
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在创面愈合过程中,表皮细胞发挥着关键作用,其功能状态深刻影响着创面愈合的质量。而这其中,表皮细胞的增殖活性是影响创面愈合的重要机制之一。在表皮细胞的增殖过程中,诸多分子及信号通路参与了其增殖活性调控过程,其中链接黏附分子A(Junctional Adhesion Molecule A,JAM-A)近年来逐渐成为研究热点。
  JAM-A是一种跨膜蛋白,属于细胞间粘附分子家族,结构中包含PDZ结构域,同源二聚化后能够与胞内含PDZ结构域的分子结合,发挥信号转导功能。同时,JAM-A本身是粘附分子,与细胞的粘附、迁移功能密切相关,高表达于表皮细胞、内皮细胞、炎症细胞、间充质干细胞等多种细胞的膜表面,参与了上皮细胞屏障形成、调节免疫稳态和炎症、血管新生等过程。
  据最新的研究显示,除了调控细胞粘附、迁移以及信号转导外,JAM-A还能够正向调控肿瘤细胞的增殖活性,在骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、头颈部鳞癌等恶性肿瘤中,JAM-A的表达均显著提高,与癌细胞的增殖、侵袭、趋化等功能呈现出明显的正向相关关系。而我们前期通过预实验发现,干扰JAM-A表达后,表皮细胞增殖速度反而较高表达JAM-A的表皮细胞明显加快。显然,这与JAM-A在上述肿瘤组织中的功能是矛盾的,那JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控到底是正向还是负向?此外,在这些肿瘤研究中,JAM-A表现出来的功能多是由蛋白来发挥的,鲜有学者关注其长达3600bp、内有大量非编码RNA结合位点的3'UTR区域,那JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控是否依然是其蛋白分子发挥主要作用?
  由于microRNA主要通过与靶分子mRNA的3'UTR区结合发挥转录后抑制作用,所以我们猜想,JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控是否也是通过microRNA来实现的?我们通过检索文献发现,miR-21、miR-31、miR-203、miR-205、miR-210等多种microRNA,参与了创面形成后表皮细胞增殖功能的调控。但目前尚无文献报道microRNA通过与JAM-A的3'UTR区结合调控细胞增殖。这提示我们,或许可以挖掘到与JAM-A3'UTR区结合的新的miRNA。
  因此,根据以上JAM-A、microRNA与细胞增殖有关的研究进展,结合我们预实验结果,我们拟从非编码RNA角度切入,在表皮细胞中深入探索JAM-A是否通过microRNA机制发挥与其在肿瘤细胞中相反的调控作用。
  我们拟在确认预实验现象的基础上,进一步通过高通量测序筛选差异表达的非编码RNA,结合生物信息学分析筛选潜在的非编码RNA靶向识别结合的分子,探索JAM-A通过非编码RNA调控下游增殖关键调控分子,进而负向调控表皮细胞增殖功能的新机制。这将有助于更加深刻地理解创面愈合过程,为后续在糖尿病足、压力性溃疡等慢性难愈性创面中探索促愈合机制、寻找潜在的临床治疗靶向药物奠定基础。
  JAM-A影响表皮细胞增殖活性,过表达JAM-A抑制表皮细胞增殖,干扰JAM-A促进表皮细胞增殖
  据课题组前期研究显示,干扰JAM-A表达后表皮细胞增殖速度加快,这与文献报道的并不一致。为了明确JAM-A在表皮细胞中的对增殖活性的影响,我们用慢病毒作为载体,分别构建了过表达JAM-A、干扰JAM-A的人永生化表皮细胞HaCaT,通过CCK-8和ki67实验证明,过表达JAM-A后表皮细胞增殖减慢,干扰JAM-A后表皮细胞增殖加快,与我们预实验结果一致,与文献报道JAM-A在肿瘤细胞中正性调控增殖功能相矛盾。
  JAM-A通过其mRNA的3'UTR区结合miR-221/222cluster调控表皮细胞增殖功能的作用
  既往文献报道,JAM-A在肿瘤细胞的迁移、增殖中发挥作用,往往通过蛋白质-蛋白质相互作用的方式。我们通过PubMed网站Gene数据库,发现JAM-A mRNA的3'UTR区有大量的microRNA结合位点,并从miRNA数据库中预测JAM-A3'UTR区能够结合多条microRNA。因此,我们拟从microRN的角度切入,探索JAM-A调控表皮细胞增殖功能的可能分子机制。为验证科学假设,我们在干扰JAM-A表皮细胞的基础上,分别构建了过表达CDS区、过表达3'UTR区的表皮细胞,通过PCR证明JAM-A调节表皮细胞增殖活性是通过其3'UTR区。接下来,我们设计了Dicer酶敲除实验,进一步证明JAM-A是通过其3'UTR区与microRNA结合的方式来发挥调节表皮细胞增殖的功效。
  基于上述发现,我们将过表达JAM-A、干扰JAM-A的表皮细胞进行RNA-seq高通量测序,结合生物信息学分析和文献检索,依据(1)在过表达组表达量明显下调、(2)在干扰组明显上调、(3)在细胞内基础丰度2000TPM以上、(4)靶点与细胞增殖有关的microRNAs。经过初筛,miR-221和miR-222完美符合上述标准,不仅排名靠前,而且同属一簇。通过RT-PCR,我们验证了干扰JAM-A后miR-221/222表达上调,而过表达JAM-A3'UTR区后miR-221/222表达下调。通过体外细胞实验,我们也证明了miR-221/222的拟似物促进表皮细胞增殖,抑制物抑制增殖。据此,miR-221/222cluster确立为研究对象,JAM-A3'UTR负向调控miR-221/222。
  miR-221/222cluster同时靶向结合JAM-A、PTEN发挥转录后抑制作用
  目前研究显示,microRNA主要通过与靶基因mRNA的3'UTR区识别结合,导致靶基因mRNA降解或者干扰其正常表达,从而发挥转录后抑制作用。为进一步阐明miRC在表皮细胞中发挥抑制增殖功能的分子机制,我们拟寻找与其功能吻合、直接识别结合的下游靶分子。通过对miRC靶分子的预测分析(microRNA.org、targetscan、miRbase)以及检索PubMed和Web of Science等文献数据库,我们锁定了PTEN为miR-221/222潜在的下游靶分子,并通过双荧光素酶报告基因实验验证了我们的设想,此外双荧光素酶报告基因实验还进一步证明了miR-221/222能够同时靶向JAM-A和PTEN。接下来,通过细胞和分子实验,我们进一步验证了miR-221-3p、miR-222-5p的拟似物负向调控JAM-A和PTEN表达,抑制物正向调控JAM-A和PTEN表达,随后又通过rescue实验发现过表达miR-221-3p、miR-222-5p后能够降低过表达JAM-A3'UTR后PTEN的表达水平,进一步证明了JAM-A mRNA保护PTEN免于被miR-221-3p/222-5p降解。
  JAM-A3'UTR突变体对PTEN无调控作用,对表皮细胞增殖功能无抑制效果
  最后,我们探索了miR-221/222cluster在JAM-A3'UTR区具体的结合位点。由于miR-221在JAM-3'UTR区有3个结合位点,在PTEN有2个结合位点,故而重点选择miR-221-3p为主要研究对象。基于JAM-A3'UTR区序列和miR-221-3p的3个结合位点,我们分别构建了各个位点突变体和全突变体质粒,根据双荧光素酶报告基因实验的结果,证明miR-221-3p与JAM-A3'UTR区三个位点均可结合。因此,后续实验皆以全突变体为实验对象,分别通过RT-PCR和CCK-8实验验证了JAM-A3'UTR突变体对PTEN无调控作用,对表皮细胞增殖活性无抑制效果。
  综上所述,在本研究中,明确了JAM-A参与负向调控表皮细胞增殖活性,这种调控方式依赖于其mRNA的3'UTR区,而非传统的蛋白-蛋白间直接的相互作用,筛选得到了miR-221/222cluster,并进一步筛选得到miR-221/222的下游靶分子PTEN。随后的机制研究中,我们明确了miR-221/222能够同时靶向结合JAM-A和PTEN,阐明了miR-221/222具体的结合位点,勾勒出JAM-A、miR-221/222cluster、PTEN之间清晰的关系网络。本课题对于从microRNA角度理解表皮细胞增殖活性的调控机制进行了有益的探索,加深了对创面愈合过程中表皮细胞增殖功能的调控机制认知,有利于将来针对性开发促进创面愈合的新药。
[硕士论文] 郭玉
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症的定义为感染引发的宿主免疫系统失调导致的器官功能障碍,致死率高;脓毒性休克为脓毒症伴随严重的循环系统和细胞代谢功能障碍。脓毒症以高发病率和致命性受到广泛关注,根据最近的数据,美国的脓毒症病例数从1996年的3873301例上升到2011年的110万,预计2020年将达到200万,脓毒症导致的死亡率接近心脏病发作的死亡率,超过了中风死亡率;所以早期的干预治疗是非常必要的。尽管脓毒症治疗策略经过近二十多年的发展,液体复苏、抗生素治疗以及血液透析等技术已取得了巨大的进步,脓毒症预后改善仍不明显。
  中性粒细胞是数量最多的参与固有免疫应答的细胞。脓毒症早期即宿主受到病原体攻击时,骨髓内的中性粒细胞迅速动员,大量中性粒细胞在趋化因子的作用下迁移至病灶部位通过吞噬、脱颗粒作用以及形成胞外诱捕网发挥清除病原体作用。虽然中性粒细胞对病原体清除非常重要,但研究已证实中性粒细胞与器官功能损伤密切相关。脓毒症过程中中性粒细胞的凋亡延迟以及其激活后释放的大量炎症因子引发的级联反应可导致组织缺氧和器官功能障碍。
  程序性死亡蛋白-配体1(programmed cell death protein-ligand1,PD-L1)是免疫激活的标志,其与程序性死亡受体-1的相互作用可抑制抗原特异性免疫反应,导致T淋巴细胞功能障碍、活化的免疫细胞耗竭及免疫耐受。肿瘤或炎症环境可诱导PD-L1在抗原递呈细胞、肿瘤细胞上表达。有研究证实脓毒症时PD-L1也可表达于中性粒细胞上,并且PD-L1阳性的中性粒细胞可诱导淋巴细胞凋亡;同时有研究表明PD-L1与B7-1分子互为配体,可发挥抑制淋巴细胞增殖的作用。那么PD-L1作为传统的配体,是否可发挥类似于受体的胞内信号激活作用?此外利用丹麦科技大学(DTU)的NetPhos2.0Server程序做磷酸化位点分析发现PD-L1的蛋白序列分析具有类似YXXM结构域,而YXXM序列可与PI3K结合并活化p85亚基,PI3K/Akt信号通路在调控细胞凋亡中发挥着重要作用。那么PD-L1是否参与脓毒症时中性粒细胞凋亡延迟的调控?由此在本课题中着重探讨脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达与PI3K/Akt信号通路及自身凋亡的相关性。
  第一部分 脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的作用
  目的:
  探索脓毒症时中性粒细胞上PD-L1的表达水平与其凋亡的关系。
  方法:
  1、分离纯化健康志愿者静脉血的中性粒细胞,并将其分为3组:对照组(Con)、IFN-γ刺激组、IFN-γ+LPS共刺激组,刺激21小时后免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式细胞仪检测中性粒细胞的凋亡率。人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)具有诱导分化成类中性粒细胞的特性并且其表达PD-L1,将其分为对照组(Control)和维甲酸刺激组(RA组)进行刺激,21小时后流式检测免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式检测HL-60细胞的凋亡率。
  2、分离纯化脓毒症患者的中性粒细胞,流式技术检测培养24h后的凋亡率,同时收集细胞用免疫印迹法检测PD-L1的表达。
  3、siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21h后免疫印迹法检测siRNA的转染效率以及流式检测其凋亡率;利用IFN-γ和LPS刺激健康志愿者中性粒细胞PD-L1的表达,并利用siRNA干扰PD-L1的表达,21h后免疫蛋白印迹法检测PD-L1以及流式检测中性粒细胞的凋亡率。
  结果:
  1.共采集6例健康志愿者的中性粒细胞,经IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激后,中性粒细胞PD-L1表达上调,且培养21小时后凋亡率明显降低(P<0.01);RA刺激HL-60细胞系分化成中性粒细胞,与对照组相比,RA刺激组PD-L1表达下调,且其凋亡率明显增加(P<0.01);
  2.共收集了14例脓毒症患者中性粒细胞,培养24小时后的其凋亡率与PD-L1的表达水平呈负性线性关系(R2=0.4417,P=0.01)。
  3.siRNA转染脓毒症中性粒细胞,其凋亡率明显升高(P<0.01);PD-L1siRNA转染IFNγ+LPS刺激后的正常中性粒细胞的凋亡率与单纯IFNγ+LPS处理组相比,其凋亡率明显升高(P<0.01)。
  结论:
  PD-L1在中性粒细胞上的表达增加,而中性粒细胞的凋亡率下降,说明脓毒症时中性粒细胞PD-L1参与自身凋亡作用的调控。
  第二部分 PD-L1调控中性粒细胞凋亡作用的机制
  目的:探讨脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的可能机制
  方法:
  1.腺癌人肺泡基底上皮细胞细胞系(A549)具有易转染特性,常作为转染宿主;PD-L1全长质粒(PD-L1FL/GFP)转染A549细胞系,免疫荧光法检测已转染的A549细胞系内PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光的结合情况。
  2.人胚肾细胞系293 (HEK293)极少表达细胞外配体所需的内生受体,且易转染;利用PD-L1全长序列(PD-L1FL/GFP)和胞内段敲除(PD-L1TD/GFP)质粒转染HEK293细胞,免疫共沉淀检测PD-L1与p85的存在相互作用。
  3.利用siRNA干扰HL-60细胞系PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT的蛋白水平。
  4.利用siRNA干扰分离纯化的脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT蛋白水平。
  结果:
  1.携带GFP的PD-L1全长质粒和胞内段敲除质粒构建成功。免疫荧光双染法发现PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光可重合。
  2.PD-L1FL/GFP和PD-L1TD/GFP转染HEK294细胞系行免疫共沉淀后发现PD-L1可与P85相互作用,且与PD-L1胞内段无关。
  3.PD-L1 siRNA转染HL-60细胞后,其pAKT水平降低。
  4.PD-L1 siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞后,其pAK水平下调
  结论:
  脓毒症时PD-L1可调控中性粒细胞的凋亡作用,其调控机制可能与PI3K/AKT信号通路相关。
[博士论文] 李乐翔
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分:脱细胞骨软骨基质支架的制备及相关研究
  目的:制备多种兔脱细胞骨软骨支架,并对这些支架进行脱细胞效果、成份、结构与生物力学测试等研究,为组织工程构造骨软骨复合物建立基础。
  方法:利用物理、化学、酶类联合脱细胞方法,对兔股骨滑车关节和肋骨软骨整体进行脱细胞处理,获得整体骨软骨支架,将兔股骨滑车关节和肋两个部位骨软骨按照透明软骨、钙化软骨层、软骨下骨三层结构进行分离粉碎,对三层微粒进行脱细胞处理,重新交联制备关节和肋来源的分层骨软骨支架。对整体骨软骨支架进行组织学染色,荧光比色法对整体支架各分层微粒进行残留DNA含量测定,验证脱细胞程度。利用氨基酸分析仪和荧光比色法对三层微粒中氨基酸和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)进行定量分析,XRD衍射仪对羟基磷灰石进行定量分析,并与天然骨软骨进行对比。检测三种支架密度、孔隙率、孔径、吸水率等物理参数,拉扭复合力学测试机检测三种支架在干燥、湿润状态下的弹性极限、强度极限、弹性模量、脆性等力学机械性能,并和天然骨软骨进行对比。
  结果:本方法脱细胞程度较为彻底。相比天然骨软骨组织,脱细胞过程损失了约20~30%的氨基酸,损失了30~40%的GAG,但无机物并无损失。相比整体支架,分层支架的密度较小,孔隙率、孔径、吸水率更大。相比天然骨软骨组织,无论干燥或湿润状态,两种支架机械性能均差,且分层支架差距更大。
  结论:本研究联合脱细胞效果较为彻底,但有机成分有所损失。脱细胞整体支架与分层支架相比天然组织,机械性能均有不同程度下降,提示结构(尤其超微结构)和成份的完整性对生物力学性能影响至关重要。
  第二部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC的相关体外研究
  目的:分离提取兔髌下脂肪垫间充质干细胞(IPFP-SC)并对之鉴定,检测骨软骨支架的生物相容性、细胞毒性,研究骨软骨基质成份、结构对IPFP-SC向成骨、成软骨分化的影响。初步探讨利用脱细胞基质进行生物3D打印。
  方法:利用胶原酶消化法和贴壁培养法分离提取出IPFP-SC,根据细胞表面分子流式细胞分析(FACS)、免疫荧光(IF)鉴定表型,检测其成骨、成软骨、成脂分化能力。制作兔膝OA模型,比较健康与OA兔IPFP-SC在增殖、迁移、成软骨方面的区别。利用直接接种法、直接植入法、浸提液培养法验证多种脱细胞骨软骨支架的生物相容性与细胞毒性。检测支架骨、软骨的仿生结构和骨、软骨组织成份对IPFP-SC向成骨、成软骨方向诱导的作用。利用Micro-CT扫描和天狼星染色连续切面图像数字化方式,获得兔天然骨软骨的结构数据,制作STL格式文件,对利用脱细胞基质生物3D打印进行初步探讨。
  结果:所提取细胞,FACS及IF验证表达CD73+、CD90+、CD105+、CD 44+、CD34-、CD45-、HLADR-,可向成骨、成软骨、成脂分化。OA个体IPFP-SC相比健康个体,在增殖方面无显著差别,迁移及成软骨能力较弱。三种脱细胞支架生物相容性良好,无细胞毒性。骨软骨的结构、成份均可促进IPFP-SC向成骨、成软骨方向分化。得到的骨软骨结构STL文件可以较好的模拟打印出天然组织。
  结论:所提取细胞证实为间充质干细胞,OA个体IPFP-SC迁移及成软骨能力较弱可能是影响软骨修复的原因。脱细胞支架的仿生结构和组成成份均影响着IPFP-SC向成骨、成软骨分化,这为IPFP-SC体内诱导为目的细胞打下了基础
  第三部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC修复兔骨软骨缺损
  目的: 通过将负载IPFP-SC的三种脱细胞骨软骨支架复合体植入兔股骨滑车骨软骨缺损模型中,研究三种组织工程方法修复骨软骨缺损的效果。
  方法:制作42例标准兔股骨滑车关节骨软骨缺损模型。分别将脱细胞关节整体骨软骨支架、脱细胞关节分层骨软骨支架、脱细胞肋分层骨软骨支架三种支架分为3组,组内分为负载或不负载IPFP-SC的亚组,除空白组共6小组,随机分配植入骨缺损模型中。术后1个月、3个月、6个月处死实验兔取得标本,大体观察修复组织的软骨面及软骨下骨面,石蜡切片进行HE、天狼猩红、番红固绿、甲苯胺蓝染色,比较各种组织工程方法修复骨软骨损伤的效果。
  结果:总体修复效果,负载IPFP-SC组优于单纯支架组,空白组最差,软骨修复方面,分层支架组优于整体支架组,软骨下骨修复方面则相反。1月时,除空白组外,各组间差异不大,3月、6月时,包括空白组,各组差异最明显。
  结论:三种组织工程构造方式对骨软骨缺损均能起到一定的修复作用,其中分层支架修复软骨能力较强,整体支架修复软骨下骨能力较强。
[硕士论文] 王昌理
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征是多器官功能障碍综合征在肺部的重要临床表现。急性肺损伤的病因包括脓毒症、烧伤、重症肺炎或者严重创伤等。其病理生理特点是肺泡毛细血管内皮-上皮屏障受损,炎症细胞浸润,失控的炎症反应以及氧化应激损伤等。虽然研究人员对急性肺损伤的早期诊断和治疗策略进行了深入研究,但急性肺损伤的发病率和死亡率一直居高不下,这对公共卫生健康造成极大影响。哇巴因(Ouabain)是一种钠钾ATP酶抑制剂,曾用于治疗充血性心力衰竭。近年来,有较多研究发现哇巴因在器官损伤、免疫反应及肿瘤治疗中发挥重要作用。目前,哇巴因在急性肺损伤中是否具有保护作用还未见报道。本研究的目的是探讨哇巴因是否抑制脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤,并初步探寻其潜在机制。
  研究方法:
  8-12周雄性C57BL/6小鼠(20g-25g)随机分为三组:对照组(Control);肺损伤组(LPS);哇巴因组(LPS+OUB)。对照组和肺损伤组小鼠腹腔注射无菌PBS溶液,连续3天;哇巴因组小鼠腹腔注射哇巴因,连续3天。第3天腹腔注射哇巴因1h后,肺损伤组和哇巴因组小鼠在七氟醚麻醉下,经鼻吸入溶解于无菌PBS的LPS溶液,对照组小鼠吸入等体积PBS溶液。LPS吸入6h和24h后,使用二氧化碳吸入法处死小鼠,收集各组小鼠肺组织和肺泡灌洗液进行肺损伤相关指标检测。
  实验结果:
  1.LPS处理6h和24h后,肺组织H&E染色病理切片显示肺损伤组小鼠肺间质水肿、出血、肺间隔增厚或受损以及显著的炎细胞浸润;哇巴因组小鼠的肺组织H&E染色切片显示肺组织病变程度减轻。肺损伤病理评分也表明哇巴因组病理评分显著低于肺损伤组,这说明哇巴因可降低LPS造成的肺组织损伤。
  2.LPS显著增加小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平;而哇巴因可降低肺泡灌洗液中上述细胞因子的含量。qRT-PCR检测结果表明,LPS可致小鼠肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达升高,哇巴因可抑制上述细胞因子的mRNA水平。
  3.LPS处理后,小鼠肺组织湿/干比升高,哇巴因可改善ALI小鼠的湿/干比;LPS可显著增加小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量,而哇巴因可减少小鼠支气管肺泡灌洗液蛋白含量;Evans蓝尾静脉注射1h后,肺损伤组小鼠肺组织Evans蓝含量最高,而哇巴因可显著下调肺组织Evans蓝的含量。
  4.与对照组相比,肺损伤组小鼠肺泡灌洗液总细胞数、中性粒细胞和巨噬细胞比例显著增加,哇巴因可一定程度减少这些细胞浸润。此外,哇巴因也能降低小鼠肺组织MPO活性。
  5.肺损伤组小鼠肺组织NF-κB p65的磷酸化水平显著高于对照组,哇巴因可降低肺组织NF-κB p65的磷酸化水平;哇巴因组小鼠肺组织磷酸化的ERK、JNK和p38表达高于对照组,但低于肺损伤组。
  研究结论:
  哇巴因可改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤严重程度,其机制可能与哇巴因抑制ERK、JNK、p38和NF-κB p65磷酸化水平相关,从而调控TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子分泌并抑制炎性细胞浸润。
[硕士论文] 赵晨
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肝硬化是由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害,是各类肝脏疾病的终末阶段。目前肝硬化已成为全球第14大死因,在大多数发达国家肝硬化的主要病因为丙型病毒性肝炎(hepatitis C virus,HCV)、酗酒及越来越多的非酒精性肝病。而在撒哈拉以南的非洲国家及部分亚洲国家,尤其是中国,肝硬化的病因主要为乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus,HBV)[1]。肝硬化患者一旦出现腹水、肝性脑病、上消化道出血、自发性细菌性腹膜炎等并发症,进入临床失代偿期,则有效治疗方法少,死亡率高[2]。因此,寻找能准确反映肝硬化患者肝功能失代偿情况和预后的血清学指标有助于改善患者的临床诊治效果。
  脱-γ-羧基凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin,DCP)是一种异常的凝血酶原,其分子结构中γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域的一个或多个谷氨酸(Glu)残基没有被完全羧化为γ-羧基谷氨酸(Gla),因此完全丧失正常凝血酶原功能[3]。1968年Ganrot等人发现由于正常的凝血酶原在合成过程中需要维生素K的参与,而DCP合成过程中缺乏维生素K,因此DCP又被称为维生素K缺乏诱导的凝血酶原Ⅱ(Prothrombin induced by vitamin K absenceⅡ,PIVKAⅡ)[4]。在维生素K缺乏或服用维生素K拮抗剂(如华法林)后,凝血酶原的非羧化形式可以释放人血中[5]。自1984年Liebman等发现DCP在原发性肝癌中显著升高,近年来有大量研究证实DCP在肝癌,尤其是早期肝癌中有着很好的诊断价值[6,7,8,9]。新近国内学者回顾性研究证实DCP诊断早期肝癌的效能高于甲胎蛋白,且DCP表达升高与患者恶性临床表型和不良预后相关,DCP与甲胎蛋白联合诊断肝癌及判断肝癌患者预后的效能高于单用甲胎蛋白[10]。另一方面血清DCP对于肝癌患者接受治疗后的复发和死亡同样具有重要的预测价值[11,12]。然而,目前关于DCP在肝硬化患者肝功能程度判断及预后评估中的作用尚未见报道。因此,本研究拟检测肝硬化患者血清DCP表达,明确其与患者肝功能的相关性及其在患者预后评估中的作用。
  方法:
  选取2013年01月至2016年8月间在我科住院并留存血样的肝硬化病人。纳入标准:年龄18岁以上,各种原因导致的肝硬化。排除标准:酒精性肝病(包括酒精性肝硬化),原发性胆汁性胆管炎,胰腺疾病和各种胆管疾病,检测前一周内服用华法林、维生素K或头孢菌素类抗生素,原发性肝癌,急性肝功能衰竭,慢性肾功能不全,呼吸功能不全,心功能衰竭,其他研究者认为不适和纳入研究者。所有纳入患者均已签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会审核批准。
  所有入组病例入院后均于24小时之内清晨空腹抽取静脉血,血样送医院检验科检测PLT计数、白蛋白、ALT、AST、ALP、GGT、TBil、PT、血肌酐等生化指标,并完善腹部B超、CT、MRI等影像学检查。肝硬化患者由相关检查结果计算所得的Child-Pugh分级、MELD评分评估肝功能情况。所有受试者的血清样本送外院检验科进行DCP检测,检测方法为化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)(LUMIPULSEG1200,Fujirebio,Tokyo,Japan),DCP阳性判断标准参照试剂盒说明书。
  所有肝硬化患者均建立病例报告表,该表格经医院伦理委员会审核通过。随后,检索本院消化内科肝硬化随访数据库,并进一步通过医院病历系统、电话随访及来院复诊随访病人发生腹水、肝性脑病、自发性细菌性腹膜炎、上消化道出血、原发性肝癌等并发症的情况(包括并发症发生的种类、次数和严重程度)、是否接受肝移植和生存情况(若死亡,随访死亡原因)等。随访时间不小于6个月。
  本研究通过检测肝硬化病人血清DCP水平,探讨血清DCP水平与肝硬化患者肝功能情况、Child-Pugh分级、MELD评分及肝病相关死亡率之间的关系。分析DCP在肝硬化患者肝功能及预后评估中的作用。
  结果:
  本研究共纳入肝硬化患者137例。入组肝硬化患者中男性73例,女性64例,平均年龄56.80±11.76岁。肝功能Child-Pugh分级A、B、C级分别为55、52和30例,MELD评分均值为8.61±5.34。其中代偿期肝硬化患者55例,失代偿期肝硬化患者82例。完成随访的肝硬化患者共113例,男性60例,女性53例,平均年龄57.04±11.80。肝功能Child-Pugh分级A、B、C级分别为45、42和26例,MELD评分均值为8.74±5.54。其中代偿期肝硬化患者45例,失代偿期肝硬化患者68例。以临床DCP正常值40mAU/mL,将入组的137例患者分为两组,其中DCP阴性(≤40mAU/mL)118例,DCP阳性(>40mAU/mL)19例,两组患者在年龄、性别上无明显差异。
  对肝硬化患者进行Child-pugh分级,Child-PughA级患者DCP阳性率为1.82%(1/55),Child-PughB级患者DCP阳性率为21.15%(11/52),Child-PughC级患者DCP阳性率为23.33%(7/30)。Mann-Whitney U检验结果显示DCP阳性组患者与DCP阴性组患者相比,白蛋白水平较低,胆红素、凝血酶原时间和国际标准化比值较高,提示DCP水平与肝硬化患者肝功能成负相关;Spearman相关性分析结果显示在Child-PughB级和C级肝硬化患者中,DCP水平与MELD评分呈显著正相关(r=0.259,P=0.021)。
  进一步研究发现DCP阳性组患者(即DCP≥40mAU/mL)发生腹水(x2=5.744,P=0.022)和自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)(x2=97.636,P=0.019)的比例显著高于DCP阴性组(即DCP≤40mAU/mL)患者,提示DCP表达异常与肝硬化患者腹水和自发性腹膜炎的发生呈显著正相关。
  通过对肝硬化患者进行定期随访,结合患者血清DCP值,结果发现DCP表达与代偿期患者发生临床失代偿显著相关,并与肝硬化患者肝病相关死亡率显著相关。
  结论:
  1.血清DCP可作为反映肝硬化患者肝功能状况的指标;
  2.血清DCP水平与肝硬化相关并发症发生密切相关,可作为预判肝硬化并发症发生的指标;
  3.DCP可在一定程度上反映肝硬化患者病情严重程度,对评估肝硬化患者预后有一定临床意义。
[硕士论文] 魏凯
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  2015年《中国成人烟草调查报告》数据显示,中国成年吸烟者总数高达3.16亿,吸烟者每天平均吸烟15.2支,其中男性吸烟率为52.1%。此外,有7.4亿人遭受二手烟的危害。在临床中,为了减少术后呼吸系统并发症,吸烟病人在手术前,往往被要求戒烟1-2个星期。本文以临床尼古丁依赖戒断病人术后疼痛问题为切入点,重点研究尼古丁依赖戒断病人围术期痛阈改变的脑功能机制,并找到最佳治疗方案。既往一些临床回顾性研究和前瞻性队列研究发现,吸烟病人术后疼痛增加,镇痛药物需求量增多,阿片类药物的镇痛效果一般。前期课题组通过动物实验发现,尼古丁成瘾戒断大鼠痛阈降低,脑脊液中5羟色胺(5hydroxytryptamine,5-HT)含量减少,合成5-HT的主要脑区—延髓头端腹内侧核(Rostral Ventromedial Medulla,RVM)内色氨酸羟化酶2(Tryptophan Hydroxylase2,THP2)减少;脑内注射5-HT可以逆转这一现象。5-HT具有镇痛作用,比如曲马多是临床上广泛应用的镇痛药物,其镇痛药理除了部分激动阿片类受体外,还抑制突触前膜对5-HT和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NA)的重摄取,增加脑内5-HT和NA含量,因此推测曲马多可以通过抑制5-HT重摄取,增加突触间隙5-HT浓度,部分改善尼古丁依赖病人戒断引起的5-HT的减少,从而有效降低尼古丁依赖戒断病人术后镇痛药物的需求量。
  方法:
  为证实上述假说,先进行了一项2×2析因设计的临床研究,将是否吸烟(尼古丁非依赖组和尼古丁依赖戒断组)与术后镇痛药物(舒芬太尼组和曲马多组)作为两个平行因素,每个因素下有两个水平。通过统计术后镇痛药物需求量,来探索曲马多是否可以降低尼古丁依赖戒断病人术后镇痛药物的需求量。为探究相关机制,进行了观察性队列研究,利用静息态功能性磁共振成像(Resting State of Functional Magnetic Resonance Imaging,rs-fMRI)技术,采用局部一致性(regional homogeneity,ReHo)、低频振荡振幅(amplitude of low frequency fluctuation,ALFF)及低频振荡振幅比率(fractional amplitude of low-frequency fluctuation,fALFF)的多模式分析方法,观察尼古丁依赖戒断病人大脑功能的变化,同时利用Von Frey机械刺激和直流电刺激记录病人机械痛阈和电痛阈,分析痛阈与ReHo的相关性,从而探索脑功能改变的机制,为优化尼古丁依赖戒断患者术后镇痛方案提供理论依据。
  结果:
  3.1、2×2析因设计的临床研究结果
  3.1.1、采用析因设计方差分析是否吸烟与术后镇痛药物对额外镇痛药物需求量的交互作用,P=0.0005;即病人术后额外镇痛药物用量在舒芬太尼组和曲马多组中受到吸烟史因素的影响,也就是说,曲马多可以降低吸烟病人术后镇痛药物用量。
  3.1.2、采用重复测量的方差分析术后视觉模拟疼痛评分(visual analogue score,VAS),镇痛药物与时间对的交互作用P=0.037;即曲马多可以降低术后病人VAS评分。
  3.1.3、对术后恶心、呕吐、体温、镇静评分以及其他不良反应统计分析,均无统计学差异,即曲马多不影响术后恶心呕吐、术后发热以及其他术后不良反应。
  3.2、尼古丁依赖戒断病人脑核团功能变化研究结果
  3.2.1、行为学及问卷量表结果显示,与尼古丁非依赖病人相比,尼古丁依赖戒断病人疼痛敏感性得分降低,Von Frey机械痛阈与直流电痛阈降低,即尼古丁依赖戒断病人疼痛敏感性增加。
  3.2.2、rs-fMRI分析显示,相比尼古丁非依赖病人,尼古丁依赖戒断病人额内侧回、额下回、额上回、额中回、前扣带回、右侧海马旁回、右侧嗅皮层、岛叶、尾状核、直回等脑区的mReHo显著降低,额内侧回、眶部额上回、直回等脑区的mALFF显著降低,额内侧回、额上回、额中回、额下回、直回、嗅皮层、尾状核、岛叶、前扣带回、海马旁回等脑区的mfALFF显著降低。即尼古丁依赖戒断病人上述脑区局部功能紊乱,神经自发性活动降低。
  3.2.3、在尼古丁依赖戒断病人中,Von Frey机械痛阈与丘脑局部一致性呈正相关,即丘脑局部一致性越低,尼古丁依赖戒断病人机械痛阈越低。
  结论:
  尼古丁依赖戒断患者围术期痛觉敏化的可能机制为:尼古丁依赖戒断引起额叶皮层功能紊乱,影响5-HT系统及疼痛下行抑制通路功能,从而使病人术后疼痛增加,镇痛药物需求量增多。曲马多作为5-HT重摄取抑制剂,能够降低这类病人术后镇痛药物需求量,不影响术后恶心呕吐、体温升高等不良反应的发生率。因此推荐吸烟病人术后镇痛采用曲马多,可以有效治疗吸烟病人术后疼痛问题。
[博士论文] 苑旺
生物物理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:增生性瘢痕是机体组织受到创伤后异常修复的结果,是创伤修复过程中的一种必然产物。增生性瘢痕严重影响患者的生活质量,给患者带来疼痛、瘙痒等不良症状,严重可能带来功能障碍等。从生物学的角度来看,瘢痕的形成是由于胶原代谢紊乱形成的。瘢痕组织是由于细胞外基质过度沉积产生的,基质的主要成分包括胶原纤维、结构蛋白和蛋白多糖等,其中Ⅰ型胶原纤维占的比重较大。瘢痕的形成与胶原的合成与降解紧密相关,胶原的合成和降解失衡,会引起胶原纤维的代谢减少,进而形成瘢痕组织。
  研究显示,瘢痕的形成与多种细胞因子的异常表达紧密相关,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在这一过程中扮演着重要的角色。TGF-β一方面对血管生成和成纤维细胞的增殖具有促进作用,可以促进成纤维细胞合成胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白;另一方面TGF-β对基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase-1,MMP1)的表达和活性具有一定的抑制作用,并且促进金属蛋白酶组织抑制剂-1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP1)的表达,从而抑制胶原等细胞外基质的降解,因此,TGF-β被认为是影响创面愈合和瘢痕生长的重要因子之一。
  创面愈合和瘢痕形成的机制及治疗方法已经成为当下的研究热点,广泛受到分子生物学、生物物理学、生物医学工程、组织工程学和临床医学等学科的关注,越来越受到人们的重视。目前采取的治疗方法主要分为手术治疗和非手术治疗。
  5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的主要作用机制是干扰成纤维细胞DNA的复制和转录,进而抑制成纤维细胞的增殖和蛋白的过度表达,从而减轻瘢痕增生和胶原沉积。换言之,当5-FU进入瘢痕组织才能很好的发挥药效。前期的研究表明,驻极体是一种安全有效的物理促渗手段,可以促进药物透过皮肤致密的角质层结构,进入皮肤内部发挥药效。
  在众多瘢痕治疗方法中,物理疗法是目前比较常用的方法,其中电场(压)用于创面愈合和瘢痕治疗表现出巨大的潜力。将电刺激疗法用于创面愈合于2002在美国获得承认。驻极体是一类功能电介质材料,能够长期保持极化电荷和储存空间电荷。驻极体可以产生持续稳定的静电场和微电流,静电场和微电流作用于具有生物驻极态的组织和分子时,能起到良好的生物效应和促进组织康复的作用。
  在临床用药中,用于治疗增生性瘢痕的剂型以传统剂型为主,主要有注射剂、膏剂和霜剂等。但是传统剂型都有各自的局限性,因此本文选用透皮给药剂型,并选用对增生性瘢痕有确切效果的抗肿瘤药物5-FU为模型药物,联合驻极体研究其对增生性瘢痕的作用及机制。本文的主要内容包括:
  (一)5-FU贴剂的制备、处方优化及性质表征
  本文以5-FU为模型药物,Eudragit E100为基质,柠檬酸三丁酯为增塑剂,采用溶剂挥发法制备压敏胶贴剂。在贴剂的制备过程中,E100的质量、增塑剂与E100二者的比例可能影响贴剂的性质。通过单因素考察确定影响贴剂性质的变量,随后通过正交设计实验,以贴剂的初黏力、持黏力及自然释放度为考察指标,采用综合评分法对贴剂的处方进行优化,确定优化处方,并对贴剂进行性质表征。
  结果显示:E100质量、柠檬酸三丁酯与E100质量比对贴剂的性质均有影响,通过综合评分法确定在E100质量为0.30g,柠檬酸三丁酯比例55%的条件,5-FU贴剂的处方最优。并对上述方法制备的贴剂进行了表征,得到贴剂的性质如下:初黏力为(4.03±0.53)g,持黏力为(122.50±7.13)min。
  随后对贴剂的自然释放度进行了考量,并考察了不同极性、不同表面电位驻极体对贴剂自然释放度的影响,并对5-FU贴剂的自然释放进行了数学建模。
  结果显示:(1)5-FU贴剂释放规律符合Higuchi方程;(2)驻极体作用后贴剂的释放量有所增加,释药量随着驻极体表面电位的增大而增加,正、负极性驻极体组之间无显著性差异,释放规律同样满足Higuchi方程;(3)驻极体5-FU贴剂的释放规律满足如下方程:Q={(0.008V+0.0173√V+39.044)√t+(-0.0126V+0.694√V+73.591)V≥0(-0.0062V+0.1354√-V+39.341)√t+(0.017V+1.0179√-V+73.959)V<0注:Q为累计释放量,V为驻极体表面电位,t为时间
  (二)5-氟尿嘧啶贴剂动物实验给药方案的探究
  驻极体具有改善局部血液微循环的作用,可以改善上皮细胞的生长环境;另外驻极体产生的微电流可以刺激上皮细胞分化。而5-FU具有抑制细胞DNA和RNA复制的作用,抑制细胞的增殖。因此需要探索出适当的驻极体5-FU贴剂的给药方式。
  通过测定创面愈合率、创面皮肤厚度变化及HE染色法观察创面组织形态学改变,探究新的给药方案。结果显示:(1)驻极体可以促进创面的收缩,作用大小与驻极体表面电位显示出正相关,正负极性驻极体组之间无显著性差异;(2)5-FU贴剂组大鼠皮肤创面愈合缓慢,显示出5-FU对创面愈合具有抑制作用;(3)HE染色法观察创面皮肤组织形态学的改变,结果显示出与创面愈合率、创面皮肤厚度相同的结论。因此,确定了最终的给药方案,即创面形成0-14天,对患处施加驻极体;14-42天,在患处加以驻极体5-FU贴剂,进行后续研究。
  (三)通过动物学实验研究驻极体5-FU贴剂对大鼠皮肤增生性瘢痕生长的抑制作用
  在确定了5-FU贴剂的制备方法、以及给药方案后,进行了5-FU贴剂抑制瘢痕生长的动物学研究。分别于给药后1周、2周、3周、4周取样,测定瘢痕增生指数,并通过HE染色及免疫组化法考察5-FU贴剂对大鼠皮肤增生性瘢痕的抑制作用。
  瘢痕增生指数结果显示:(1)对照组大鼠瘢痕增生指数逐渐升高;(2)驻极体组大鼠皮肤瘢痕增生指数有降低的趋势;(3)5-FU贴剂组及驻极体5-FU贴剂组瘢痕增生指数降低,驻极体5-FU贴剂组效果更佳。
  HE染色结果显示:(1)对照组大鼠皮肤瘢痕组织持续增生,主要表现为表皮和真皮层增生。真皮层可见大量成纤维细胞,胶原纤维沉积明显、粗大、致密,排列无序。(2)5-FU贴剂组与对照组相比,大鼠瘢痕组织表皮层、真皮层均明显变薄,真皮层成纤维细胞量变少,胶原沉积现象得到明显缓解,抑制瘢痕增生作用效果显著;(3)不同极性、不同表面电位驻极体5-FU贴剂组与5-FU贴剂组相比,这一效果更加显著,随着驻极体表面电位的增加,抑制瘢痕增生的效果更显著,正、负极性驻极体组之间的差异并不显著。
  免疫组化结果显示:(1)5-FU贴剂组及驻极体5-FU贴剂组大鼠皮肤瘢痕组织中TGF-β表达量下降,Smad2、Smad3的表达量下降,Smad7的表达量有所上升,ColⅠ、ColⅢ的表达量下降;(2)驻极体5-FU贴剂组这一效果更加显著;(3)5-FU贴剂组及驻极体5-FU贴剂组大鼠皮肤瘢痕组织中TGF-β表达量下降,MMP1的表达量有所上升,MMP2、TIMP1、ColⅠ、ColⅢ的表达量下降,驻极体5-FU贴剂组作用更加明显;(4)驻极体5-FU贴剂对增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。
  (四)通过细胞学实验研究驻极体5-FU贴剂对大鼠皮肤增生性瘢痕生长的抑制作用
  动物学实验证明驻极体5-FU贴剂对增生性瘢痕生长的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。为了进一步探究和验证驻极体5-FU贴剂抑制瘢痕生长的机制。进行了细胞学实验,分别通过MTT法、PCR法和Western-Blot法进行考察。
  MTT实验结果显示:(1)驻极体可以促进细胞的增殖;(2)5-FU对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。
  PCR实验结果显示:(1)5-FU给药组及驻极体5-FU给药组TGF-β表达量下降,Smad2、Smad3的mRNA表达量下降,Smad7的mRNA表达量有所上升,ColⅠ、ColⅢ的表达量下降;(2)驻极体5-FU组这一效果更佳显著;(3)5-FU给药组及驻极体5-FU给药组MMP1的mRNA表达量有所上升,MMP2、TIMP1、ColⅠ、ColⅢ的表达量下降,驻极体5-FU组作用更加明显;(4)驻极体5-FU对增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。
  Western-Blot实验结果显示:(1)给药组TGF-β蛋白表达量下降,Smad2、Smad3的蛋白表达量下降,Smad7的表达量有所上升,ColⅠ、ColⅢ的表达量下降;(2)驻极体5-FU组这一效果更佳显著;(3)给药组MMP1的蛋白表达量有所上升,MMP2、TIMP1、ColⅠ、ColⅢ的表达量下降,驻极体5-FU组作用更加明显;(4)驻极体5-FU对增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。
  上述实验结果与动物学实验结果相一致,表明驻极体5-FU贴剂可以通过抑制增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路抑制瘢痕的生长。
  综上所述,本文通过动物学实验和细胞学实验对驻极体5-FU贴剂抑制增生性瘢痕生长的机制进行了探究,探索治疗增生性瘢痕的新方法与新途径。
[硕士论文] 赵玉玺
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:主动脉夹层这一危重疾病在中国发病率逐年上升,我国已成为发病率最高的国家之一。其腔内治疗相比开放手术具有简捷、微创、并发症率低的优势,发展至今已有十余年。如何进一步提高微创腔内治疗的安全性和有效性是目前的临床热点。平行支架技术(Parallel Stent Technique,PST),也称烟囱技术(Chimney Technique),应用于治疗围主动脉弓部夹层的腔内隔绝术,其优势是能适应各种主动脉弓形态和弓上分支开口位置和角度,无需定制支架,临床潜力巨大,其应用越来越广泛。但是术后内漏是阻碍其广泛应用的主要问题,给烟囱腔内隔绝术(Chimney Thoracic Endovascular Aortic Repair,CTEVAR)的预后带来诸多不确定性影响,制约了该术式安全性和有效性的进一步提高。如何预防以及目前针对主动脉弓部夹层特殊解剖学条件下,主体支架与烟囱支架、及其与管壁三者之间的空间结构和力学耦合一直缺乏深入研究。
  研究目的:
  结合临床对比分析,体外模拟实验和生物力学研究,提出针对不同解剖学形态特征主动脉弓夹层优化的主体支架构型和烟囱支架方案,以最大程度降低烟囱支架腔内隔绝术后内漏的风险,但同时又不增加对管壁的损伤导致再发夹层以及烟囱支架压闭等风险,为这一临床技术的优化、规范和推广提供科学的理论基础和实验数据支持。
  研究方法:
  1.分析临床资料,筛选烟囱支架腔内隔绝术后不良内漏的危险因素和关键特征,提出优化的方案和支架构型;
  2.结合有限元分析,体外模拟,力学测试和CT扫描,以管壁应力、影像学测量作为主要指标,进一步优化筛选出支架匹配方案和优化构型。
  研究结果:
  1.平均随访期为27个月(8-56个月)。所有的烟囱支架均顺利释放,且随访期未发生支架闭塞、移位等状况。随访期死亡率为1.7%(4/234)。3(3/234,1.3%)例患者在随访期发生了脑血管意外。75(75/234,32.1%)例患者在术后即时造影后提示I型内漏发生,其中27(27/75,36.0%)例在随访期中内漏消失。33(33/75,44.0%)例内漏患者假腔稳定,无增大趋势。15(15/75,20%)例患者在随访期中发现假腔有增大的趋势,并接受了栓塞封堵。当主动脉夹层的近端破口位于I区时,术后即时内漏发生率高于C、S、N2区(77.8%vs16.7%,p=0.041;77.8%vs33.3%,p=0.042;77.8%vs30.1%,p=0.009)。三烟囱技术相比于单烟囱和双烟囱,术后即时内漏发生率较高(60.0%vs26.9%,p<0.001;60.0%vs31.3%,p=0.012)。但在随访期差异均无统计学意义。
  2.有限元计算不同结构支架组合下的缝隙面积分别为45.58mm2(P),16.46mm2(P1),38.24mm2(P2),23.96mm2(P3),42.08mm2(P4)。支架对血管壁应力分析评估管壁破裂风险方面,支架P1与P2在支架贴附良好的同时不会增大管壁应力。体外模拟释放中发现,支架P1和P2展开与贴附均较好,支架P3与P4都不同程度出现了支架折叠及倾斜的现象。CT扫描结果为47.49±1.44mm2(p),19.55±0.98mm2(p1),40.05±1.05mm2(P2),27.77±0.90mm2(P3),50.99±1.47mm2(P4)。
  研究结论:
  1.三烟囱技术和近端破口位于I区具有较高的内漏发生率,需要更严格的随访。其他治疗模式及破口位置之间的随访内漏率无显著性差异。需要更大的样本和更长的随访来跟踪评估烟囱支架技术的耐用性和有效性。
  2.从缝隙面积有限元计算分析、支架对血管壁应力分析、体外模拟释放、CT扫描及制作可行性综合考虑,P1结构方案最优。体外模拟实验初步验证其可行性。
[硕士论文] 林恒之
外科学(泌尿外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  经会阴途径的前列腺穿刺因其检出效能高、减少感染率的优势获得广泛应用,但该术式目前为止并没有标准的局麻方式,在临床实践中我们发现了肛门前缘左右约2cm的2个相对固定的位点,在其附近进针注射局麻药物可获得显著的镇痛效果,我们认为其可能与阴部神经的分支会阴神经的阻滞相关,因此本研究首先通过解剖学和神经电刺激的实验证实这两个点位作为会阴神经阻滞进针点的可能性,并进一步通过随机对照试验观察通过这两个点位进行会阴神经阻滞应用于经会阴前列腺穿刺术时患者疼痛程度及不良事件的发生率,探索其作为经会阴前列腺穿刺术的一种新的局麻方式的有效性、便捷性及安全性。
  方法:
  (一)会阴神经解剖学基础研究:
  对5具成年男性尸体的会阴部进行初步的解剖研究,测量肛门前缘水平两侧会阴神经与中线的平均距离。
  (二)神经电刺激仪引导下验证会阴神经相对深度的研究
  对20例患者使用外周神经丛电刺激器验证阻滞点的相对固定位置并探测会阴神经的深度范围,同时在其引导下完成神经浸润麻醉并进行经会阴前列腺穿刺活检术,利用视觉模拟评分法(Visual Analogue Scale,VAS)(下均简称为VAS评分)评估并记录各阶段疼痛程度,记录手术时间,术中心率、血压的变化、术中术后的不良反应以及术后病理结果,使用SPSS22统计软件进行数据分析。
  (三)无神经刺激仪引导时,会阴神经阻滞行会阴前列腺穿刺术的随机对照研究
  将90例患者随机分为3组,组1为对照组,接受前列腺周围漫润麻醉(包括进针途径)。组2为对照组,接受“PAT”浸润麻醉,组3为观察组,接受会阴神经阻滞点神经阻滞,分别进行经会阴前列腺穿刺活检术,利用VAS评分评估并记录各阶段疼痛程度,记录手术时间,术中心率、血压的变化、术中术后的不良反应以及术后病理结果,使用SPSS22统计软件进行数据分析。
  结果:
  (一)会阴神经解剖学基础研究:
  肛门前缘水平,会阴神经浅支与中线的总平均距离为1.86±0.06cm,会阴神经深支与中线的平均距离为2.16±0.06cm,与我们发现的位点相符。
  (二)神经电刺激仪引导下验证会阴神经相对深度的研究
  完成左侧会阴神经阻滞所需进针深度为3.00cm至4.00cm,平均3.48±0.31cm,右侧会阴神经阻滞所需进针深度为3.00cm至4.00cm,平均3.49±0.33cm。
  (三)无神经刺激仪引导时,会阴神经阻滞行会阴前列腺穿刺术的随机对照研究
  三组患者年龄、身高、体重、BMI、前列腺体积、PSA及术后前列腺检出率的差异无统计学意义(P>0.05),组2和组3的手术时间和麻醉时间要长于组1(P<0.001)。三组患者在超声探头置入时、局麻注射时疼痛评分的差异无统计学意义(P>0.05),在穿刺皮肤、突破包膜、发针取样时出现疼痛的针数和最高疼痛评分(VAS)差异无统计学意义(P>0.05),穿刺针于皮下与前列腺进针过程中的疼痛针数在组3为2.20±1.61,显著低于组1(5.00±2.56)和组2(4.17±2.28),其最高疼痛评分(VAS)的平均值1.70±0.88也显著低于组1(2.27±0.58)和组2(2.17±0.83)。三组患者术中及术后相关并发症的差异均无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  解剖学、电生理研究及临床试验均证实了肛门前缘水平左右2cm的位点可以作为会阴神经的阻滞点,通过其进行会阴神经阻滞应用于经会阴前列腺穿刺是有效、安全、可重复的,同时其在减轻穿刺进针过程中的疼痛方面有着独特的优势。为了更便捷地记住这两个位点,我们将其命名位“经会阴前列腺穿刺局麻开关”(Transperineal Prostate biopsy local Anesthesia switch,TPA switch)。
[硕士论文] 费翔
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题利用长海医院心脏瓣膜数据库,对EuroSCOREⅡ及我国多中心瓣膜手术风险模型预测主动脉瓣置换术后死亡风险的能力进行评价,并分析影响成年患者主动脉瓣置换术后在院及中远期的死亡危险因素。
  方法:
  (一)EuroSCOREⅡ和我国多中心瓣膜手术风险模型对主动脉瓣置换术后死亡风险预测能力评价:
  1、按照EuroSCOREⅡ和我国多中心瓣膜手术风险预测模型定义要求,回顾性收集2000年至2014年间在我院行主动脉瓣置换术的1317例患者临床资料,排除既往心脏手术史、介入治疗史、术中同期二尖瓣置换、三尖瓣置换及主动脉置换的患者。
  2、利用EuroSCOREⅡ和我国多中心瓣膜手术风险预测模型所给出的回归方程分别计算出各模型预测的在院死亡率,并根据EuroSCOREⅡ中对于手术权重的定义,将患者分为手术权重1、权重2和权重3组。
  3、通过对实际死亡率与预测死亡率间的比较,以及模型校准度、区分度的分析来评价各风险模型对主动脉瓣置换患者全组及各手术权重组在院死亡率的预测能力。
  (二)主动脉瓣置换术后在院死亡危险因素分析:
  1、选择2000年至2014年行主动脉瓣置换手术的成年患者作为研究对象,排除既往心脏手术史、介入治疗史、术中同期二尖瓣置换、三尖瓣置换及主动脉置换的患者。以患者在院死亡作为终点事件。
  2、根据术后是否发生死亡将患者分为死亡组和非死亡组,通过单因素分析筛选出可能与术后死亡相关的危险因素。
  3、对单因素分析中有统计学差异的变量进行二元Logistic回归分析,筛选出术后在院死亡的独立危险因素。
  (三)主动脉瓣置换术后中远期死亡危险因素分析:
  1、连续入选2010年至2014年间在我院行主动脉瓣置换且术后康复出院的547例成年患者为研究对象;排除既往心脏手术史、介入治疗史、术中同期二尖瓣置换、三尖瓣置换及主动脉置换的患者。以患者中远期死亡及主要心脑血管事件为随访终点。
  2、参考既往文献,对临床资料中可能与术后中远期死亡相关的变量进行单因素的COX分析。
  3、对单因素COX分析中有显著统计学差异的变量进行多因素COX分析,筛选出中远期死亡的独立危险因素。
  结果:
  (一)EuroSCOREⅡ和我国多中心瓣膜手术风险模型对主动脉瓣置换术后死亡风险预测能力评价:
  1、1317例患者中,50例患者发生在院死亡,实际在院死亡率3.79%。EuroSCOREⅡ和我国多中心瓣膜风险预测模型预测的在院死亡率分别为2.13%、5.02%,实际观察值/预测值(O/E)分别为1.78和0.75,两模型H-L检验结果均为P<0.05。此结果提示我国多中心瓣膜风险预测模型总体上高估了实际在院死亡率,而EuroSCOREⅡ模型总体上低估患者实际在院的死亡率。
  2、每组实际死亡率为2.40%、6.14%、5.29%。发现EuroSCOREⅡ对于手术权重为3的患者具有较好的预测能力(O/E=0.999,拟合优度检验P>0.05),但对于权重为1和2的患者预测能力较差P均小于0.05。而我国多中心风险预测模型对于各手术权重的病人校准度均较差。
  3、EuroSCOREⅡ和我国多中心瓣膜风险预测模型对全组患者评分的ROC曲线下面积分别为0.753和0.787,对死亡预测有较好的区分能力。各组ROC曲线下面积提示,两个风险模型对于各手术权重的患者均有良好的区分度(AUC>0.7),尤其是对于手术权重为2的患者,两模型ROC曲线下面积均>0.8,具有很好的区分度。
  (二)主动脉瓣置换术后在院死亡危险因素分析:
  1、1317例主动脉瓣置换患者中,术后在院死亡50例,死亡率3.7%。心源性死亡人数占死亡总人数的56.0%。
  2、单因素分析结果显示死亡组与非死亡组两组间年龄、高血压、外周血管疾病、慢性肺部疾病、术前肌酐、术前危重状态、术前使用正性肌力药、心肌梗死、心房纤颤、冠脉病变、NYHA心功能分级、左室射血分数、短轴缩短率、左房容积、二尖瓣关闭不全、同期冠状动脉旁路移植术、同期二尖瓣成形、体外循环时间差异具有统计学意义。
  3、二元Logistic回归分析发现年龄、冠脉病变、体外循环时间、术前危重状态及EF值是主动脉瓣置换术后在院死亡的独立危险因素。
  (三)主动脉瓣置换术后中远期死亡危险因素分析:
  1、547例患者中失访61例,随访率为88.85%,平均随访时间64.47±23.23月。术后1年、3年、5年的生存率为98.9%、97.3%、96.0%。随访期间死亡23例,其中心源性死亡5人,脑卒中死亡9人,肿瘤死亡6人,猝死3人。发生主要心脑血管事件者49人,其中心源性死亡5人,因心衰再次入院8人,心脏再次手术10人,发生脑卒中26人。
  2、单因素COX分析结果提示年龄、BMI、慢性肺部疾病、术前肌酐、心房颤动、冠脉病变、NYHAⅢ-Ⅳ、左室重量、左房容积、右房容积、右室容积、二尖瓣关闭不全、同期CABG术、同期三尖瓣成形术、主动脉阻断时间、体外循环时间是潜在的危险因素。
  3、多因素COX回归分析,最终发现年龄、BMI、慢性肺部疾病、左室重量及冠脉病变是主动脉瓣置换术中远期死亡相关的危险因素。
  结论:
  1、EuroSCOREⅡ和我国多中心瓣膜风险预测模型对本组主动脉瓣置换患者手术死亡风险的预测均较差。现有的风险预测模型仅能作为手术前风险评估的参考。
  2、术前年龄较大、伴有冠脉病变、EF值较低、术前出现危重状态、术中体外循环时间较长将增加患者术后在院死亡的风险。
  3、主动脉瓣置换术后中远期预后较好,死亡相关危险因素可用于术前手术风险评估及预后的判断。
[博士论文] 齐恩博
外科学(神外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury, TBI)一直是一个困扰世界的医疗问题,TBI轻重程度往往决定患者的预后情况。重型TBI患者均可出现交感神经兴奋,主要表现为血压、心率和血浆儿荼酚胺水平升高,并引发严重的颅外器官功能障碍,给患者带来不良的临床结局和高昂的医疗支出。目前TBI后发生交感神经兴奋的病理生理学机制尚不清楚,为临床治疗带来极大困难。
  既往研究表明,下丘脑室旁核(The Hypothalamic Paraventricular Nucleus,PVN)是中枢神经系统内调节交感神经活动的关键部位。PVN内的促炎细胞因子水平升高与交感神经兴奋的发生有重要关系。Toll样受体4(Toll Like Receptor4,TLR4)是细胞表面的模式识别受体,能够通过与环境中的配体结合启动细胞内信号通路激活核因子-κB(Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer Of Activated B cells,NF-κB)。激活的NF-κB复合物进入细胞核可以调控TNF-α、IL1-β等多种促炎细胞因子的基因转录,刺激PVN神经元引起交感神经系统兴奋。研究表明,TBI会导致小胶质细胞活化,而中枢神经系统内TLR4主要表达在小胶质细胞上。
  因此本研究提出以下假设:(1)在颅脑损伤后,PVN内活化的小胶质细胞TLR4表达升高;(2) TLR4能够激活下游的NF-κB通路,产生大量TNF-α和IL-1β等炎症因子,改变了PVN内分子环境,导致交感神经兴奋的发生。
  为验证以上假设,本研究拟通过以下实验,(1)利用大鼠液压打击模型,明确血压、心率、心率变异性和血浆去甲肾上腺素的水平,并探索交感神经兴奋随时间的变化规律;(2)选取最佳时间点观察下丘脑PVN内小胶质细胞的活化以及TLR4在小胶质细胞上的共表达情况;并通过PCR、Western blot和免疫组化方法检测PVN内TLR4、NF-κB、TNFα和IL-1β的水平;(3)分别对TLR4进行抑制和激动,明确TLR4与TBI大鼠交感兴奋的关系。探索TBI后TLR4对交感神经兴奋性的调控作用,为TBI后交感兴奋的发病机制提供理论依据和新的治疗靶点。
  第一章 大鼠压液打击模型的建立与交感神经兴奋性检测
  目的:
  建立大鼠颅脑损伤模型,明确TBI后发生交感神经兴奋,并探索交感神经兴奋随时间的变化规律。
  方法:
  70只大鼠麻醉钻孔固定后,经液压打击仪2.1-2.3 ATM压力打击。存活的55只大鼠中,随机选取42只进入血浆去甲肾上腺素实验组,进行各时间点检测;随机选取6只进入心率、平均动脉压和心率变异率实验组,进行各时间点检测;随机选取6只进入脑组织HE染色实验组。随机选取18只平均分配作为各实验组的对照。
  结果:
  1.大鼠液压打击后,死亡率达21.4%神经反射出现不同程度下降或消失。平均呼吸暂停时间(18.62±2.82)s。
  2.液压打击后,颅骨钻孔处脑组织存在部分缺损。HE染色提示脑内各部位均有不同程度的神经元变性、死亡。白质内可见神经的轴突损伤,髓鞘断裂。损伤处大量的神经元死亡及小胶质细胞活化,形成格子细胞。血管与脑组织间隙增加,细胞体积增大。
  3.大鼠心率、平均动脉压、心率变异率及血浆去甲肾上腺素水平,在TBI后24小时开始呈现先升高后降低的变化规律,伤后第3天达到最高值,此时各组均存在统计学差异。
  结论:
  1.液压打击后大鼠的死亡主要原因是呼吸暂停。通过制作大鼠液压打击模型,造成大鼠神经功能下降、神经元变性坏死,创造了脑组织损伤条件。
  2.TBI造成了大鼠交感神经兴奋。TBI后大鼠心率、平均动脉压、心率变异率及血浆去甲肾上腺素等指标随时间变化呈现相似的规律和趋势。
  3.TBI后24小时内大鼠交感神经兴奋性出现升高,然后继续上升至损伤后第3天附近达到最大兴奋程度,随后交感神经兴奋性呈波动下降趋势。
  4.TBI后第3天是交感神经兴奋性研究的最佳时间点。
  第二章 TBI对PVN内小胶质细胞活化及TLR4—NF-κB通路的影响
  目的:
  明确TBI对PVN内小胶质细胞、TLR4、NF-κB和促炎细胞因子的表达影响。
  方法:
  随机选取经液压打击后存活的大鼠24只,作为实验组平均分配至四个亚组进行免疫荧光、免疫组化、Western blot和PCR检测,随机选取24只大鼠作为各亚组的对照。损伤后第72小时断头取脑,免疫荧光检测小胶质细胞Iba-1和TLR4在PVN内及PVN旁组织的共表达情况。PCR检测TLR4在PVN内及PVN旁组织的mRNA水平,以及PVN内TNFα和IL-1β的mRNA水平。Western blot检测NF-κBp65亚基、TNFα和IL-1β的蛋白水平。免疫组化方法检测PVN内及PVN旁组织的NF-κB水平。
  结果:
  1、TBI大鼠PVN内Iba-1、TLR4和NF-κB表达量较对照组增加,差异具有统计学意义。实验组和对照组大鼠的PVN旁组织内TLR4、NF-κB和Iba-1表达水平较低。
  2、TBI大鼠PVN内TNFα和IL-1β的mRNA和蛋白表达水平较对照组升高,差异具有统计学意义。
  结论:
  1、TBI后大鼠PVN内小胶质细胞活化伴随TLR4表达上调、NF-κB、TNF-α和IL1-β含量增加。
  2、大鼠下丘脑PVN是调控交感神经兴奋的关键部位,增加的炎症因子由PVN内产生。
  3、TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平与交感神经兴奋存在相关性。
  第三章 TLR4对TBI大鼠PVN内NF-κB通路及交感神经兴奋性的影响
  目的:
  明确TLR4对PVN内NF-κB促炎细胞因子和交感兴奋的调控作用。
  方法:
  随机选取经液压打击后存活的大鼠60只,TBI与TBI+TAK-242组各30只,每组平均分配至五个亚组进行生命体征、血浆NE、免疫组化、ELISA和PCR检测。随机选取大鼠60只,Control与LPS组各30只,每组平均分配至五个亚组进行生命体征、血浆NE、免疫组化、ELISA和PCR检测。损伤后第72小时断头取脑,处死前24小时分别给予LPS组和TBI+TAK-242组LPS、TAK-242注射。PCR检测TLR4在PVN内的mRNA水平。ELISA检测PVN内TNFα和IL-1β的水平。免疫组化方法检测PVN内的NF-κB水平。
  结果:
  1、应用LPS后,大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平较对照组均有明显升高,差异有统计学意义。TBI大鼠应用TAK-242后TBI大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平有所下降,差异有统计学意义。
  2、应用LPS后,大鼠HR、MAP和血浆NE水平较相应对照组均有明显升高,而SDNN、SDNN Index则明显下降,差异有统计学意义。TBI大鼠应用TAK-242后TBI大鼠HR和血浆NE水平有所下降,差异有统计学意义。
  结论:
  1、TLR4可以通过调控NF-κB和促炎细胞因子水平,调节交感神经兴奋程度。
  2、TBI可通过TLR4调节血压升高,但TLR4的表达可能不是维持血压升高的原因。
[博士论文] 周振宇
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  股神经损伤临床上并不少见,除继发于创伤或者某些自身疾病外,有相当一部分为医源性损伤。股神经损伤会导致同侧屈髋、伸膝障碍以及大腿内侧的感觉麻木,行走时步态不稳易跌倒,从椅子上站起、爬楼梯困难,给患者的生活带来极大的不便,应予以及时修复。而在各种损伤类型中,股神经长段缺损无疑是修复难度最大的。临床上的股神经长段缺损相对少见,病因多为医源性,比如腹膜后的神经鞘瘤切除术中常误切股神经。特殊的致伤原因使得股神经长段缺损具有以下特点:1、股神经缺损比较长,通常为Ⅳ度缺损;2、股神经比较粗,需要多股腓肠神经移植,很难行带血管的神经移植;3、缺损局部多经历创伤或手术史,瘢痕黏连重,血液循环差。因此,长段的股神经缺损临床治疗非常困难,是创伤外科医生所面临的严峻挑战之一。目前临床报道的股神经长段缺损的治疗主要有两种,一种是多股自体腓肠神经电缆式移植,一种是闭孔神经作为供体进行的神经转位。关于自体神经移植,顾玉东认为在大于10cm的长段周围神经干缺损者、神经移植床为瘢痕组织或无血供组织以及伴四肢主要血管损伤的神经缺损的情况应考虑用带血运的游离神经移植。但因为股神经与腓肠神经巨大的直径差异,通常需要三至四段腓肠神经移植于缺损处方能满足动力需求。即便用两根静脉动脉化的腓肠神经移植修复股神经动力也不足够。如果用多股腓肠神经移植修复,则移植神经仅靠组织液提供营养,建立自身血液循环的时间较长,会造成部分移植神经中心发生坏死,影响治疗效果。因此,有必要寻求更好的显微修复方式,为移植神经提供稳定的血供,使得移植神经尽早建立自身的血液循环,以促进神经更好的再生,获得良好的功能愈后。在神经移植间隔距离太大或者神经近断端无法利用的情况下,神经转位成为修复缺损的良好选择。但相较于上肢较多的神经转位术式,下肢神经损伤的神经转位应用的还很少。因为闭孔神经具有与股神经来源相同、解剖位置相近、包含运动纤维等优点,股神经损伤修复的转位神经研究主要集中于闭孔神经。而多项解剖学研究也都证实了闭孔神经转位修复股神经的可行性。与腓肠神经移植相比,闭孔神经移位修复股神经轴突再生只需要通过一个吻合口,轴突再生距离也更短,理论上可以得到更佳的恢复效果。但利用闭孔神经主干转位修复会损失内收的功能,利用前支转位又不能提供足够的轴突数量。所以有必要通过进一步的研究,寻求最佳的神经转位方法,让有限的转位神经得以充分利用,获得最佳的修复效果。
  第一部分 神经移植床对股神经长段缺损修复效果影响的实验研究
  目的:观察不同组织床上自体神经移植修复大鼠股神经长段缺损时移植神经的血运建立和神经再生情况,评价治疗效果。为临床自体神经移植修复股神经长段缺损提供实验依据。
  方法:建立成年大鼠股神经长段缺损实验动物模型,选择不同组织床进行自体神经移植修复:A组(肌肉组织床),人为构建肌肉组织床,将移植神经埋于血运丰富的肌肉组织中,由肌肉组织为移植神经提供营养支持;B组(空白组织床),不人为构建组织床,移植神经置于修复位置不做处理,依靠组织液为移植神经提供营养;C组(瘢痕组织床)将移植神经置于硅胶管中,模拟瘢痕组织,由组织液为移植神经提供营养支持。于术后的不同时间点(1周、2周、4周、12周)分别取材,对移植神经和股四头肌行组织学检查、神经电生理检查以及透射电镜观察,观察移植神经血运建立、神经再生及肌肉功能恢复情况,对三组结果进行分析评估。
  结果:肌肉组织床组移植神经血液循环建立的时间较其他两组明显缩短,而大鼠的BBB运动功能评分、运动单位电位波幅、肌重恢复率、肌细胞截面积恢复率以及有髓神经纤维通过率都要高于空白组织床组和瘢痕组织床组。两相比较,空白组织床组的各项指标又要优于瘢痕组织床组。
  结论:肌肉组织床可以为移植神经提供良好的血供和稳定的生长环境,大大缩短了移植神经建立血液循环的时间,较早进入轴突生长与髓鞘形成期,从而获得良好的神经再生效果。在进行长段神经移植时人为构建肌肉组织床进行修复,这既是神经移植方法的创新,也是理论的创新。该方法不仅适用于股神经长段缺损的修复,也同样适用于其他周围神经缺损的修复。
  第二部分 股神经长段缺损的显微修复临床研究
  目的:在临床治疗两例股神经长段缺损的病例中,人为构建肌肉组织床,将移植神经埋入肌肉,观察分析患者预后,为临床上自体神经移植修复股神经长段缺损提供指导。
  方法:为两位股神经长段缺损患者施行腓肠神经移植手术,术中构建肌肉组织床,将移植神经埋入肌肉,术后观察患者的运动功能恢复情况,并对患者进行肌电图、超声及磁共振检查,综合分析手术疗效。
  结果:患者股四头肌功能恢复满意,伸膝肌力恢复至M4+,步态接近正常。
  结论:在腓肠神经移植治疗股神经长段缺损的过程中,人为构建肌肉组织床,将移植神经埋入肌肉组织,可以促进移植神经再生,能够取得良好的临床疗效,可以在股神经及其他周围神经长段缺损的治疗中推广应用。
  第三部分 股神经各肌支神经转位修复方案的研究
  目的:评估股神经各肌支的重要性,分析不同肌支组合的修复效果,为临床上神经转位至股神经各肌支治疗股神经长段缺损提供优选方案。
  方法:动物实验研究分为两步。第一步,将20只大鼠随机分为四组,每组仅保留一支股神经肌支,通过观察大鼠的膝关节功能变化来分析各肌支的重要性。第二步,将20只大鼠随机分为两组,一组保留股内侧肌支和股直肌支,另一组保留股内侧肌支和股外侧肌支,通过观察大鼠的膝关节功能变化对两种组合方式进行评估。结合动物实验研究的结果和临床病例以及文献资料来分析评估各种肌支修复组合。
  结果:股四头肌各肌支重要性依次为股内侧肌支、股外侧肌支、股直肌支和股中间肌支。保留股内侧肌支和股直肌支的功能要低于保留股内侧肌支和股外侧肌支,
  结论:动力足够的话可以选择修复三个肌支,其中的最佳组合是股外侧肌支+股直肌支+股内侧肌支;如果只能修复两个肌支,最佳修复方案是股内侧肌支+股外侧肌支,其次是股内侧肌支+股直肌支;如果只能修复一个肌支,则选择股内侧肌支。
[硕士论文] 王晓民
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:颈动脉内膜斑块切除术(Carotid endarterectomy CEA)后的高血压与神经系统及心血管系统并发症相关。研究外翻式颈动脉内膜斑块切除术(Eversion carotid endarterectomy eCEA)和补片式颈动脉内膜斑块切除术(Carotid endarterectomy with patch pCEA)围手术期血压变化情况,评估两种不同术式对术后血压变化的影响,明确两种动脉内膜斑块切除术围手术期血压的变化规律。
  方法:自2016年1月至2017年1月选择60名具有手术指征的颈动脉狭窄患者纳入一项前瞻性随机对照研究,分别采用两种不同的术式对两组患者进行手术治疗(eCEA[30]/pCEA[30])。通过对术中、术后血压及用药情况的分析来评估患者血压变化情况以及相关性,并对患者一般资料、用药情况、心率变化、并发症情况等进行统计分析。
  结果:两组患者的一般资料相似,无统计学差异。围术期并发症发生率无统计学意义。两组患者术后均存在血压的波动,需要给予额外的降压药物控制术后血压。eCEA组患者较pCEA组患者降压药物的使用量更大、持续时间更久。在eCEA组中,患者术后降压药物使用量在术后第一天达到高峰,此后呈缓慢下降趋势;相比之下pCEA组中,患者术后降压药的使用呈持续性下降趋势,术后第三天已基本不需要使用额外降压药物控制血压,血压基本恢复至术前水平,而eCEA组中仍有部分患者需要使用更多的降压药物控制血压。
  结论:eCEA和pCEA均是治疗颅外段颈动脉狭窄安全有效的手术方式,两者在围术期并发症发生率方面未见明显差异。两种术式术后均存在着明显的血压的波动。eCEA术后的高血压较pCEA术后更为常见,但血压波动的情况在术后短期内多能恢复。
[硕士论文] 李唐波
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:高位颈髓损伤患者,呼吸功能丧失,死亡率极高,为了降低此类患者的死亡率,重建其自主呼吸功能尤为重要。本课题组在国家自然基金的资助下,采用副神经移位膈神经的方法成功重建了高位颈髓损伤大鼠的呼吸功能,建立了动物模型。本研究旨在通过腺相关病毒、伪狂犬病毒逆行示踪及免疫组织化学染色的方法进一步揭示副神经移位膈神经重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能的中枢机制,为进一步将该方法学运用于临床提供更为殷实的理论依据。
  方法:本实验以成年雄性SD大鼠为实验动物。利用腺相关病毒AAV-Retro-GFP注射副神经、膈神经,进行跨单突触逆行追踪支配正常SD大鼠副神经和膈神经的运动神经元。利用伪狂犬病毒PRV-CMV-EGFP注射副神经、膈神经,进行跨多级突触逆行追踪支配正常SD大鼠副神经和膈神经的前运动神经元及其相关神经核团。利用免疫组织化学染色的方法,对病毒标记核团进行特异性双标,进一步确证病毒标记的神经核团。相同方法,利用腺相关病毒AAV-Retro-GFP、伪狂犬病毒PRV-CMV-EGFP注射吻合神经吻合处远端,进行逆行追踪副神经移位膈神经6个月后支配SD大鼠膈肌运动的运动神经元、前运动神经元及其相关神经核团。并利用特异性抗体对病毒标记核团进行双标,进一步确证病毒标记神经核团。最后,通过对比支配正常SD大鼠的膈神经、副神经及神经移位后SD大鼠的吻合神经的运动神经元、前运动神经元及其相关神经核团的变化,初步揭示神经移位重建高位颈髓损伤SD大鼠呼吸功能的中枢机制变化。
  结果:(1)正常SD大鼠:支配副神经斜方肌支的运动神经元主要集中在延髓网状核。支配副神经的前运动神经元主要集中在孤束核、延髓中缝、面神经核。支配膈神经的运动神经元主要集中在颈髓C4-C6的脊髓前角。支配膈神经的前运动神经元主要集中在腹侧呼吸群、延髓孤束核、延髓中缝、上橄榄核。(2)神经移位后SD大鼠:支配吻合神经的运动神经元主要集中在延髓网状核。支配吻合神经的前运动神经元主要集中在孤束核、延髓中缝、面神经核。
  结论:神经移位6个月后,SD大鼠的副神经核和(或)上级神经元发生了重塑,形成了与腹侧呼吸群神经元相同或相似的突触,从而建立了副神经核→副神经→膈神经→膈肌的神经支配通路。最终由副神经核神经元产生节律性电冲动,通过吻合后神经支配膈肌,重建高位颈髓损伤后大鼠的呼吸功能。
[硕士论文] 汪琳
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  衰老作为一个全身性的事件,不仅以孤立的方式影响着某个组织或器官,其对骨骼系统也产生不利的影响。骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨量减低,骨结构破坏导致骨脆性增加因而易发生骨折的全身性疾病。原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、老年骨质疏松症和特发性骨质疏松症。和衰老相关的骨质疏松症主要指老年性骨质疏松症。抗衰老治疗能够增加小鼠骨小梁量及骨组织生物机械特性,因此,我们有理由相信,抗衰老是治疗老年性骨质疏松症的一种有效方法。
  长久以来,人们一直在研究延缓衰老以达到长生不老的方法。有研究报道:年轻个体的血液、血浆及他们的衍生物能够促进干细胞功能及组织的再生和修复,因此其能够对抗衰老过程。而通过联体共生/血浆注射实现两只动物的血液交换对于衰老/抗衰老的研究具有十分重要的作用。研究表明,异时联体共生/年轻血浆注射能够对抗衰老的不利影响,对于对抗老年性骨质疏松症具有积极的作用;反之,异时联体共生/老年血浆注射能够对年轻动物的组织产生不利的影响。
  因此,我们推测,在动物体内是否存在某种/某些关键的因子,其随着年龄的增长而改变,通过调节这种或这些因子能够影响骨质疏松症的发生发展进程。本课题旨在探讨老年血浆是否能够影响小鼠的骨骼“衰老”,进一步研究其中关键的分子及其对于骨质疏松症的意义。
  方法:
  本研究分三部分进行:
  第一部分 观察异时联体共生/老年血浆注射对年轻小鼠的骨量影响。联体共生实验共分为三个组,分别为年轻小鼠与年轻小鼠共生组,年轻小鼠与老年小鼠共生组,假共生组,在共生模型建立后4周,于一只小鼠尾静脉注射Evan染液,通过观察Evan染液向与其共生小鼠渗透情况,确认联体共生模型是否成功;共生后正常饲养3个月。血浆注射实验分为三个组,分别为注射年轻血浆组,注射老年血浆组,注射生理盐水组,提取18月老年雄性及3月年轻雄性C57小鼠血液、常规离心后收集血浆,将血浆对3月龄年轻C57小鼠进行尾静脉注射,每周2次,每次0.2ml,共注射8周,另外设置一组即对3月龄年轻C57小鼠尾静脉注射生理盐水,每周2次,每次0.2ml。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失及成骨和破骨情况。
  第二部分 筛选影响骨质丢失的关键分子。通过定制蛋白芯片分析联体共生/老年血浆注射两种模型,分别筛选各自的关键分子,交叉得到CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5四种关键分子。然后进行验证实验,实验分为五组:注射老年血浆组、注射老年血浆+CCL11抗体组、注射老年血浆+CXCL1抗体组、注射老年血浆+IL-13抗体组、注射老年血浆+CCL5抗体组,每周注射2次,每次0.2ml老年血浆,抗体注入时,每周1次,每次0.1ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色的方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失的情况。最后得出CCL11效果最强的初步结论。
  第三部分 探讨CCL11与年轻和老年小鼠骨量丢失的关系。本实验分为六组:年轻小鼠组、年轻小鼠注射CCL11组、年轻小鼠注射CCL11+CCL11抗体组、老年小鼠组、老年小鼠注射CCL11组、老年小鼠注射CCL11+CCL11抗体组,每周2次,每次0.1ml CCL11重构体,CCL11抗体注入时,每周2次,每次0.1ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失及成骨和破骨情况。
  结果:
  第一部分:在联体共生模型中,年轻与老年小鼠共生组年轻小鼠在BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.area上明显低于其余两组(年轻小鼠与年轻小鼠共生组,假共生组);N.ob/B.Pm及P1NP(骨形成指标)较其余两组减低;N.Oc/B.Pm及CTX(骨吸收指标)较其余两组增高。在血浆注射模型中我们观察到注射老年血浆的年轻小鼠在BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area上明显低于其余两组(注射年轻血浆的年轻小鼠,注射生理盐水的年轻小鼠),且N.ob/B.Pm及P1NP较其余两组减低,而N.Oc/B.Pm及CTX较其余两组增高。这些结果提示:老年血液和血浆确实可加速小鼠骨质和骨量的丢失。
  第二部分:我们发现,注射老年血浆+CCL11抗体的年轻小鼠BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area比注射老年血浆组明显增高;而注射老年血浆+CXCL1抗体组、注射老年血浆+IL-13抗体组、注射老年血浆+CCL5抗体组比注射老年血浆组在上述指标上无明显差异。
  结果提示:CCL11可能是老年血浆可以加速年轻小鼠骨质和骨量丢失的关键。
  第三部分:我们发现,对于年轻小鼠来说,CCL11注射组在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area较年轻小鼠组和年轻小鼠注射CCL11+CCL11抗体组两组均明显减低,N.ob/B.Pm、P1NP均明显减低,而N.Oc/B.Pm,CTX指标明显增高;同样对于老年小鼠,CCL11注射组较其余两组(老年小鼠组和老年小鼠注射CCL11+CCL11抗体组)在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area明显减低,在N.ob/B.Pm、P1NP明显减低,而在N.Oc/B.Pm和CTX上,三组间无明显差异。
  结果提示:CCL11确实可以加速年轻和老年小鼠的骨质和骨量的丢失,成骨细胞功能下降可能是关键原因之一。
  结论:
  1、在异时联体共生模型中,年轻小鼠和同种属老年小鼠共生后,导致年轻小鼠骨量丢失;在血浆注射模型中,对年轻小鼠注射老年血浆后促进年轻小鼠的骨量丢失。
  2、在联体共生模型和血浆注射模型中共同升高的因子为CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5;而其中CCL11为影响骨量丢失的关键因子。
  3、CCL11注射后能引起年轻小鼠和老年小鼠的骨量丢失,且CCL11被CCL11抗体抑制后这种加速骨量丢失的效应消失。
  总之,老年血浆能够加速年轻小鼠的骨量丢失,这种作用可能是通过血浆中高浓度的CCL11实现的。
[硕士论文] 张昊
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  经导管主动脉瓣膜置换术(TAVR)已经成为治疗重度主动脉瓣狭窄的标准方案。目前TAVR术前评估主要依靠CTA检查,但是由于检查技术本身及操作流程的局限,只能通过工作站找到合适的平面进行观察和测量,无法完全反映立体结构;无法评估移植物置入后的情况,例如钙化灶与瓣环的相对运动情况,冠状动脉开口方向和高度的改变,从而引起术中及术后并发症。3D打印可以展示个性化的解剖结构,我们通过移植物在模型中体外释放,与术中实际情况对比,寻找更适合的术前评估方法,进一步构建以3D打印技术为中心的评估体系。
  方法:
  1、构建3D打印模型
  (1)了解瓣环相关解剖结构
  选取2具经福尔马林固定的正常人完整心脏标本,经心尖沿心脏纵轴切开至瓣膜纤维环下缘,暴露左心室,观察主动脉瓣瓣膜形状、瓣环及周围相关结构,测量主动脉根部血管壁及瓣叶厚度。
  (2)入组患者
  课题选择本中心2011年6月至2017年6月行TAVR手术且留存术前CTA的患者入组,共20例。其中死亡患者4例,男性2例,女性2例,死亡原因分别为冠状动脉堵塞及瓣环撕裂;手术成功患者16例,男性10例,女性6例。
  (3)3D打印模板选择
  用于TAVR手术术前评估的3D打印模型主要是针对“围主动脉瓣”区域解剖结构,其基本范围包括:主动脉瓣膜、升主动脉起始部、左室流出道、冠脉起始部等手术相关区域。
  本课题患者CTA,均使用TOSHIBA Aquilion ONE型CT机320排扫描,图像层厚为1mm,间距1mm。截取R-R间期的25%-35%中瓣口开放最大的序列作为3D打印的模版。
  (4)制作3D打印模型
  将选取的CTA资料的DICOM格式文件导入Materialise Mimics和3-matic软件,按照CT值的赋值不同及点选操作,选取主动脉根部及瓣环区域血管内增强的“血液”部分,在这段“血液”的外缘赋予相应血管厚度,再应用软件反选赋值生成的血管,删除其中“血液”部分,转换成可“打印”的标准镶嵌语言(STL)。通过激光扫描液态原料成型技术,选择合适的材料进行。
  本课题采用Heart Print Flex材料完成打印。该材料的特点在于杨氏模量及膨胀性与主动脉根部的真实结构无明显差异,模型的形变可以模拟实际血管、瓣环等结构的形变,因此基于Heart Print Flex制作的3D打印模型不仅可以精确反映相关术区的解剖结构,还可以模拟真实术区结构的材料学特质。
  2、3D打印模型的应用
  (1)模型的测量
  使用游标卡尺对TAVR手术需要掌握的指标进行实体测量,包括:瓣环尺寸(长径、短径等)、冠脉开口高度、瓣叶长度、窦管结合部尺寸(长径、短径等)等。最终测量值取3名临床医生独立测量值的平均值。
  (2)模型体外释放
  制作与术中使用爱德华Edwards Sapien XT valve尺寸及径向支撑力一致的无瓣膜支架模型。使用035超硬导丝由升主动脉侧穿过主动脉瓣膜进入左室流出道,选择与瓣环尺寸相适应的预扩球囊经导丝置入,使球囊中部位于瓣环水平。使用压力泵向预扩球囊注入与术中相同体积注射用水,观察瓣膜及瓣环情况。经输送系统将支架模型送至瓣环水平,压力泵向球囊注入与术中相同体积注射用水,释放支架模型于瓣环水平,观察置入瓣膜后的瓣环及瓣叶情况。
  3、CTA与3D打印对于TAVR术前评估的比较
  将术中实际情况作为金标准,比较CTA和3D打印对于TAVR术前评估的特异度和敏感度。
  结果:
  1、模型测量
  3D打印模型的测量比CTA更加直观,相对容易确定瓣环平面。3D打印模型测量计算得到的移植物尺寸,死亡患者16得到的结果比CTA测量计算的结果偏小,其余患者经3D模型及CTA测量结果无明显差异。
  2、体外释放
  (1)死亡患者12和患者15的3D打印模型测量结果显示,左冠开口高度与CTA测量数值并无明显差异,但体外释放出现遮蔽冠脉开口导致急性冠脉闭塞,造成急性心肌缺血、心肌梗死,与术中实际情况一致。
  死亡患者16和患者18均为二叶瓣畸形。患者16,使用3D打印模型进行瓣环结构评估,得到的结果提示:移植物尺寸选择小于CTA结果。患者18,3D打印模型进行移植物尺寸选择的结果与CTA结果一致,但underfill小于CTA结果,提示移植物尺寸略大。瓣膜移植物选择尺寸过大会引起瓣环撕裂,与术中实际情况一致。
  (2)手术成功患者中出现1例瓣环撕裂,呈现假阳性。
  3、特异度和敏感度
  与CTA相比,3D打印对于TAVR的风险评估的敏感度更高,其特异度较低。
  结论:
  CTA对于瓣环及冠脉开口的测量,只能在平面进行,无法准确反映复杂的立体结构。在移植物置入瓣环后,由于结构本身及钙化灶的影响,冠脉开口的位置与瓣环平面发生相对位移,无法通过术前CTA进行评估。
  3D打印模型可以反映瓣环及瓣叶的立体结构,结合体外释放可以模拟真实术中情况,还原移植物置入后瓣环与冠脉开口位置、钙化灶等结构的相对移动,预测术中及术后并发症。
[硕士论文] 单婵娟
社会医学与卫生事业管理 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)是严重危害人类生命健康的慢性疾病,是世界公认的公共卫生问题,具有患病率高、知晓率低和医疗费用高等特点,给个人、家庭及社会带来巨大的疾病负担。在许多国家,慢性肾脏病的发病率高达200例每百万人/年。美国肾脏病数据系统(USRDS)2016年数据年报统计显示,成人普通人群CKD的患病率为14.8%。在中国,不同地区CKD患病率约为9%-13%,且仍呈现上升趋势。截止2015年年末,中国成人慢性病的患病总数高达1.3亿人,但知晓率只有12.5%。如果能够提早发现、提早预防,可有效延缓疾病发展进程,防止终末期肾病的发生。因此,尽快筛查并了解上海市不同年龄、性别及区域人群的患病情况及其高危因素,成为制定合理的公共卫生政策和有效干预手段的急切需要。
  本研究紧密结合国家健康发展战略和三级诊疗制度,在充分分析人口、经济及卫生资源三要素的情况下,通过选取静安区和闵行区常住户籍人口,对其进行CKD筛查,探索研究上海市慢性肾脏病不同年龄、性别及区域的患病情况及影响因素,为上海市制定慢性肾脏病防治策略提供可靠依据,同时充分发挥示范作用,为全国其他省市的慢性肾脏病调查提供思路和借鉴。
  方法:
  采用整群随机抽样法,截取2015年1月1日至2017年1月在静安区和闵行区共27家社区卫生服务中心年龄大于18岁且自愿参加CKD筛查工作的上海市常住户籍人口。筛查内容包括问卷调查、体格检查和实验室检查数据。问卷调查涉及一般人口学特征、疾病史、家族史;体格检查涉及身高、体重和血压;实验室检查包括尿常规和血肌酐等检测。诊断标准采用美国肾脏病基金会制定的K/DOQI指南,当肾损害>3个月,或有肾小球滤过率下降(GFR<60ml/min/1.73m2)>3个月,诊断为慢性肾脏病。主要诊断指标为尿蛋白、尿红细胞、尿ACR和eGFR。年龄分组标准为:18-39岁为青年组;40-64岁为中年组;65岁及以上为老年组。
  利用SPSS21.0软件对研究对象的基本情况、病史情况、实验室检查和患病情况进行统计分析。采用描述性分析、卡方检验、Mann-Whitney U检验和Kruskal.WaillisH检验法对不同年龄、性别、区域的研究对象进行分析,在研究各因素与是否患慢性肾脏病的关系时,采用了单因素分析和Logistic逐步回归分析法。P<0.05认为具有统计学意义。
  结果:
  1.基本情况
  在研究对象中,男性21343例,占40.51%,平均年龄(70.37±8.98)岁;女性31342例,占研究对象的59.49%,平均年龄(69.78±9.16)岁。从区域分布上看,静安区18554例,占研究对象的35.22%,闵行区34131例,占64.78%。从年龄分布上看,77%的调查对象集中分布在60-80岁之间,年龄跨度大,最小18岁,最大102岁。按照青年(18-34岁)、中年(35-64岁)和老年(65岁及以上)分组标准,则青年组513人,占0.97%;中间组13867人,占26.32%;老年组38305人,占72.71%。
  2.疾病史
  52685例研究对象中,高血压患者29912例(56.78%),糖尿病共检出19078例(36.21%),高尿酸血症1284例(2.44%),遗传性肾脏病史65例(0.12%),慢性肾炎家族史97例(0.18%),肾小管病变史950例(1.80%),肾脏超声异常383例(0.73%),肾穿刺活检术史23例(0.04%),肾移植病史12例(0.02%)。
  3.CKD患病情况
  CKD检出人数为13569例,患病检出率为25.75%。女性检出率为27.29%,男性检出率为23.50%,男女间差异无统计学意义(P=0.569);老年组检出率高于中年组,中年组检出率高于青年组,其中65岁及以上老年组检出率为77.31%,与青年组间差异有统计学意义(P=0.037),与中年组间差异无统计学意义(P=0.411)。静安区检出率为35.32%,高于闵行区(18.32%),且两区间差异有统计学意义(P=0.006),这可能与静安区发达的区域经济和宏大的人口规模有着密不可分的关系。
  4.CKD分期与危险分层
  分期:3252例处于CKD1期(23.97%),5667例处于CKD2期(41.76%),6826例处于CKD3期(50.31%),756例处于CKD4期(5.57%),484例处于CKD5期(3.57%)。危险分层:低危患者4830例(35.60%),中危患者6089例(44.87%),高危患者1670例(12.31%),极高危患者980例(7.22%)。
  5.CKD影响因素
  慢性肾脏病影响因素包括地域、年龄、BMI、高血压史、糖尿病史、高尿酸血史和遗传性肾脏病史这7大因素(P<0.05),得到的回归方程为Y=-1.257+0.377X1-0.77X2-0.177X3+0.135X4+0.108X5+0.208X6-0.729X7。纳入标准为α=0.05,模型的正确预测率66.1%。
  结论:
  青年组、中年组与老年组的慢性肾脏病患者分别集中于CKD前三期,这提醒要积极应对、提早防治,以延缓CKD进程,减少家庭和社会的经济、心理和疾病负担。应加强CKD初期患者的健康宣传教育,提醒其定期复查以延缓进一步发展进程;定期随访CKD中期患者,严格按照三级转诊制度对实行治疗。
  整体上来看,应因地制宜,强化年龄分层管理,首先,应着重加强中老年CKD患者的管理,降低高血压、糖尿病的患病率,从源头上阻止一部分高血压和糖尿病患者转化为慢性肾脏病患者。其次,广泛开展中低危患者定期筛查和中末期患者的定期随访工作,在未实行CKD筛查的地区广泛推广筛查工作,对已开展CKD筛查的地区提倡定期随访,以达到早发现、早治疗的目的。再次,在思想上应重视CKD流行病学调查研究,及时掌握CKD患病情况、分布特征和影响因素,为卫生政策的制定和决策做基础,重视不同区域CKD流行病学调查,控制关键危险因素。最后,政府应积极开展健康宣教活动,提高居民的CKD认知水平,使患者在CKD初期症状轻微时及时就诊。
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