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[博士论文] 杨立为
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:血液接触材料广泛应用于生物医学材料领域。材料与血液接触后会引起一系列生物反应,如血小板和白细胞在材料表面的粘附,不仅造成血栓和炎症等不良后果,同时也影响生物材料的功能。目前设计抗血小板和白细胞粘附材料主要有两种策略:1)利用具有防污效应的亲水高分子构建生物惰性表面;2)利用抑制细胞粘附的生物分子构建生物活性表面。上述方法存在的主要问题是:生物惰性表面的构建需要复杂的化学合成和表面修饰步骤;生物活性分子的引入不仅增加了材料的成本,还容易出现变性和降解等问题。由于天然多酚类化合物含有抗血小板激活和抗炎症等优异的生物活性,且能通过螯合自组装作用简单快速地对材料表面进行修饰。基于此,本论文提出在材料表面修饰自组装多酚涂层而实现抗血小板和抗白细胞粘附的研究思路。论文首先研究了构建稳定自组装多酚涂层的技术和方法,进一步将构建的多酚涂层应用于抗血小板粘附研究,最后探讨了该涂层抗白细胞粘附的效果以及在循环肿瘤细胞捕获中的应用。
  论文首先研究了自组装多酚涂层的成膜过程和稳定性。以单宁酸(TA)为模型多酚分子,利用TA与Fe3+的螯合作用在材料表面自组装成膜(TA-FeⅢ)。重点考察了关键影响因素即反应物的投料顺序、成膜溶液pH值和基底材料的亲疏水性对涂层厚度和稳定性的影响。结果表明,以先加入Fe3+后加入TA的投料顺序能促进多酚涂层厚度的逐级稳定增长,经过五次修饰后可得到稳定的、厚度约为85nm的多酚涂层;在pH为3的环境下成膜后,将溶液pH值调节至8,可促进配位键Fe-O的形成,有利于形成更加致密的TA-FeⅢ骨架,进而提高多酚涂层的稳定性;与亲水的基底材料相比,疏水基底材料表面更有利于稳定多酚涂层的形成。
  论文进一步研究了自组装多酚涂层的抗血小板粘附能力。重点考察了涂层的厚度、在自然状态下的存放时间、多酚分子类型、不同基底材料等因素对涂层抗血小板粘附效果的影响。研究结果表明:五次修饰、厚度约为85nm的TA-FeⅢ多酚涂层表面几乎观察不到血小板粘附;存放21天后,多酚涂层抗血小板粘附能力未见明显降低,效果显著优于对照组聚乙二醇(PEG)修饰的抗血小板粘附材料;利用表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)制备的EGCG-FeⅢ和ECG-FeⅢ多酚涂层同样表现出优异的抗血小板粘附能力;在聚醚砜膜材料、聚碳酸酯板材和硅胶管表面修饰TA-FeⅢ多酚涂层,均实现了抗血小板粘附的效果。
  论文随后对TA-FeⅢ多酚涂层抗血小板粘附的机理进行了深入探讨。基于TA-FeⅢ多酚涂层表面与蛋白相互作用的基团为没食子酰基(galloyl),因此推测galloyl在抗血小板粘附中起了重要作用。由于纤维蛋白原(Fgn)是介导材料表面粘附血小板的关键蛋白,首先构建了含有不同galloyl基团数量的多酚涂层,考察涂层表面galloyl基团数量对吸附Fgn质量以及吸附Fgn构象的影响,并建立与抗血小板粘附之间的关系。结果表明,多酚涂层表面galloyl基团数量对吸附Fgn质量的影响不大,但对吸附Fgn构象的影响较大,其中,表面吸附Fgn的γ链暴露程度与血小板粘附的数量呈正相关。随着涂层表面galloyl基团数量的增加,吸附Fgn的γ链暴露程度降低,血小板粘附的数量减少。推测含有大量galloyl基团的TA-FeⅢ多酚涂层能与Fgn产生强氢键作用,阻止吸附的Fgn发生构象改变,使得Fgn的γ链上血小板粘附受体隐藏,因而TA-FeⅢ多酚涂层能够有效地排斥血小板粘附。
  最后,论文探索了TA-FeⅢ多酚涂层在循环肿瘤细胞(CTCs)捕获中的应用。由于材料表面的白细胞粘附严重干扰材料对CTCs的捕获,因此首先考察了TA-FeⅢ多酚涂层抗白细胞的粘附能力。研究发现基底材料经TA-FeⅢ涂层修饰后,外周血单核细胞(PBMCs)粘附的数量从~74个/mm2降为~11个/mm2,同时显著降低了PBMCs释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)促炎症因子的水平。进一步将TA-FeⅢ涂层应用于对CTCs的捕获,考察了该涂层对多种癌细胞系(MCF-7、A431、HeLa和A549)的CTCs捕获效果。结果表明,TA-FeⅢ涂层能实现对多种癌细胞的高效捕获,捕获率均达到76%以上,且不依赖于细胞表面表达的蛋白。同时TA-FeⅢ涂层还具有良好的细胞相容性,捕获的癌细胞表现出90%以上的存活率,有利于对捕获的癌细胞进行再培养。
  综上所述,自组装多酚涂层提供了一种简单高效的抗血小板和抗白细胞粘附的策略,在血液接触材料领域具有潜在的应用前景。此外,该涂层还提供了一种无需抗体标记的CTCs捕获方法。与传统方法相比,该方法无需引入微纳米基质、复杂的微流控芯片和生物识别分子,为开发CTCs捕获装置而用于癌症早期诊断提供了新的设计思路。
[硕士论文] 单彩龙
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)都属于奈瑟氏菌科细菌,均已成为严重的全球公共卫生问题。鲍曼不动杆菌常引起肺炎、菌血症、脑膜炎、伤口感染等疾病,死亡率高。淋病奈瑟菌感染引起的淋病是全球第二大性传播疾病,可导致不孕不育等严重后果。两种病原菌耐药形势日趋严峻,由于耐药问题导致治疗失败的病例不断有报道。
  细菌获得耐药性可能导致其毒力发生改变,鲍曼不动杆菌耐药株往往形成生物膜的能力更强,但也有相反结论的报道,其他毒力与耐药性之间的相关性未见报道。本研究第一部分旨在研究鲍曼不动杆菌耐药性与毒力之间的相关性,为有效防治耐药鲍曼不动杆菌引起的感染提供有效依据。
  细菌中存在大量非编码RNA(sRNA),sRNA参与调控细菌耐药性的作用已被广泛证明,但淋病奈瑟菌中尚未有调控耐药性sRNA的相关报道。本研究第二部分旨在发现淋病奈瑟菌中调控头孢曲松耐药性的sRNA,为解决其耐药性问题提供一个新的思路。
  一、鲍曼不动杆菌耐药性与毒力相关性研究
  为研究鲍曼不动杆菌耐药性与毒力的相关性,对课题组收集的36株临床分离株进行16S rRNA基因鉴定,确认为鲍曼不动杆菌的菌株用纸片扩散法和微量液体稀释法检测其对9类21种抗生素的耐药性;为检测血清抗性,用10%菌液与90%正常人血清(热灭活人血清作对照)混匀后置于37℃培养箱中共孵育1-3h后检测存活细菌数(CFU),当实验组CFU小于对照组CFU且存在显著统计学差异时认为该菌株血清抗性弱,无显著差异的为强血清抗性菌株;粘附试验中以感染复数(MOI)为100将菌液与人肺上皮细胞混匀后置于37℃培养箱中孵育1h,用PBS洗去未粘附在细胞表面的细菌,裂解细胞后通过细菌计数检测粘附于细胞的细菌数,计算得到粘附于每个细胞的细菌数表示该菌株的粘附能力;菌株体内毒力检测时用气管插管法构建小鼠肺炎模型,选择5株耐药性不同的菌株进行感染,统计小鼠7天内死亡率。统计学分析鲍曼不动杆菌耐药性与上述3种毒力的相关性。结果显示,36株细菌中的34株为鲍曼不动杆菌,其中多重耐药株和广泛耐药株比例高达97.06%;血清抗性检测发现26株强血清抗性菌,9株弱血清抗性菌,耐药株具有更强的血清抗性;鲍曼不动杆菌耐药株粘附A549细胞的能力相对非耐药株更强;小鼠感染广泛耐药鲍曼不动杆菌7天内死亡率更高。上述结果提示鲍曼不动杆菌耐药形势非常严峻,耐药株具有更强的毒力,耐药性与毒力之间呈正相关。
  二、淋病奈瑟菌头孢曲松耐药相关sRNA筛查
  为筛选淋病奈瑟菌WHO-A株中调控头孢曲松耐药性的sRNA,首先提取WHO-A株总RNA进行转录组测序,然后通过梯度剂量诱导淋病奈瑟菌头孢曲松耐药株,生物信息学方法筛选并荧光定量PCR验证候选sRNA表达水平,反转录PCR验证耐药相关sRNA在淋病奈瑟菌临床分离株中的分布。结果显示经诱导WHO-A株产生MIC=1μg/ml的耐药变异株,野生型WHO-A株存在1051条sRNAs,其中80条与penA、porB、mtrR等8个耐药相关基因间存在互补关系,检测发现10条表达水平随耐药性增高而降低的sRNAs,并且其中6条sRNAs在3株淋病奈瑟菌临床分离株中检测到转录产物。提示部分sRNAs参与淋病奈瑟菌头孢曲松耐药性调控,并广泛分布于淋病奈瑟菌中。
[硕士论文] 夏静
临床医学(生殖) 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究旨在探索miRNA-194-5p能否通过Stra8来调控精子发生。通过对出生后第11天的Stra8基因敲除(Stra8-/-)及野生型雄性小鼠睾丸组织进行RNA测序分析,筛选Stra8缺失时差异表达的miRNAs。验证其中差异表达的miRNAs与Stra8之间的关系,并进一步探索miRNA-194-5p是如何通过Stra8来影响精原细胞增殖分化过程的。
  方法:
  1、饲养并收集不同周龄的野生型和Stra8-/-小鼠,用HE染色法分析其睾丸组织结构。选取出生后11天的野生型及Stra8-/-小鼠睾丸进行RNA-seq检测,筛选出差异表达的miRNAs。应用实时定量PCR法验证miRNAs在两种小鼠睾丸组织中的表达水平,并检测它们在小鼠不同组织中的表达情况。
  2、构建pGL3-Basic-Stra83'UTR重组质粒及pMSCV-PIG-miR-194-5p/miR-205-3p/miR-3544-3p重组质粒。利用双荧光素酶报告基因实验探索它们之间有无转录调控关系。应用TargetScan数据库分析miR-194-5p与Stra8之间的结合位点,并突变其结合位点,再次应用双荧光素酶报告基因实验验证两者之间的关系。
  3、在293T细胞中用PEI法包装pMSCV-PIG-miR-194-5p慢病毒,用此病毒感染P19细胞并经嘌呤霉素筛选,获得过表达miR-194-5p的P19细胞株。并利用实时定量PCR法进行验证。
  4、将不同状态下的P19细胞株用RA处理,利用Western Blot及细胞免疫荧光检测miR-194-5p是否能通过Stra8来影响P19细胞向生精细胞分化的进程。
  结果:
  1、与野生型小鼠相比,出生后第7天的Stra8-/-小鼠睾丸生精小管内的支持细胞和精原细胞并未出现明显的形态学差异。出生后第14天的Stra8-/-小鼠睾丸生精小管内精母细胞明显减少,有些精原细胞核出现异常深染。出生后第21、28、35、56天的Stra8-/-小鼠睾丸生精小管内大部份生精细胞消失,部分生精小管内呈现多个生精细胞具有浓缩细胞核的初级精母细胞。
  2、应用RNA-seq法比较了出生后11天的野生型和Stra8-/-小鼠睾丸,发现了6个差异表达的miRNAs:miR-194-5p、miR-205-3p、miR-3544-3p、miR-1a-3p、miR-337-3p、miR-30c-1-3p。经QRT-PCR检测证实前5个miRNAs表达趋势与RNA-seq结果相一致。多组织表达分析发现:miR-194-5p在睾丸组织中相对表达量较高,miR-205-3p相对表达量一般,而miR-3544-3p在睾丸中的相对表达量较其它组织高。
  3、双荧光素酶报告实验表明miR-194-5p能显著降低Stra83'UTR的荧光素酶活性,miR-205-3p和miR-3544-3p不能降低Stra83'UTR荧光素酶活性。同时miR-194-5p不能降低Stra83'UTR-mut的荧光素酶活性。
  4、利用PEI转染法制备了pMSCV-PIG-miR-194-5p慢病毒,且成功感染P19细胞株并经嘌呤霉素筛选。QRT-PCR结果提示:与空载体对照组比较,miR-194-5p在感染慢病毒的P19细胞内表达水平明显提高,具有显著性统计学意义(P<0.05)。
  5、RA诱导pMSCV-PIG-miR-194-5p-慢病毒感染的P19细胞株后,发现Stra8mRNA及蛋白水平均明显下调,而一些参与干细胞分化相关基因Oct4、Plzf、Nanos3、Vasa的表达均发生改变,说明miR-194-5p可能直接或间接通过Stra8调控P19细胞向生殖细胞方向分化。
  结论:
  发现了6个与Stra8相关的miRNA,其中miR-194-5p具有与Stra83'UTR结合的位点,能够显著抑制其荧光素酶活性,其过表达并能够抑制P19细胞中Stra8的mRNA及蛋白的表达水平。同时,其过表达后能够影响多种精原细胞增殖及分化相关蛋白的表达水平。上述结果表明:Stra8是miR-194-5p的直接靶基因,miR-194-5p通过靶向调控Stra8的表达来调节生精细胞的增殖与分化。
[硕士论文] 申雪沂
人体解剖与组织胚胎学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:Stra8(stimulated by retinoic acid gene8,Stra8),是视黄酸(retinoic acid,RA)诱导基因之一,对于减数分裂启动和男性生殖发育具有重要作用。Stra8在正在分化的精原细胞到前细线期精母细胞表达。而且Stra8在细胞核与细胞质均具有定位,并根据发挥功能的不同在核质之间穿梭。Stra8敲除小鼠不育,但其在精子发生中的作用及机制尚未阐明。本课题通过以下两个部分研究Stra8在精子发生中的作用与机制:第一,Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。第二,体外研究Stra8与Setd8的相互作用。该研究为揭示Stra8在精子发生中的作用奠定了基础。
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。
  (一)通过体内和体外实验,发现并鉴定Stra8在精子发生中具有抑制细胞凋亡的作用。在Stra8KO小鼠模型、维生素A缺乏小鼠(VAD)及VAD恢复小鼠(VAR)中发现Stra8具有抑制凋亡的作用。我们选择11dpp的StraSKO小鼠睾丸进行TUNEL实验并计数凋亡细胞,结果发现:与WT小鼠相比,Stra8KO小鼠生精细胞管内凋亡细胞数量明显增加。其次,构建维生素A缺乏和VAD恢复小鼠模型(VAD and VAR)。通过TUNEL实验发现在45天和61天的VAD小鼠模型中,凋亡细胞明显增加,进一步验证Stra8具有抑制凋亡作用。最后,在Stra8过表达精原细胞验证了Stra8抑制凋亡的作用,应用TUNEL实验和流式细胞术对凋亡细胞进行计数,也发现在Stra8过表达精原细胞内凋亡细胞数量明显减少。
  (二)通过基因微阵列分析,探索Stra8抑制细胞凋亡的机制及相关通路。通过基因微阵列分析,我们发现了5个上调基因和4个下调基因与细胞凋亡相关。通过qRT-QCR验证与文献查阅发现,在这些DEGs中,PDK1(AKT重要上游因子)、ANG2(BCL2抑制因子)、USP33、TCF4、GSTP1(MAPK相关因子)、OSGIN1(P53相关因子)和Caspase3与AKT信号通路相关,同时BCL2、P53、ERK(MAPK1/3)、JNK(MAPK8/9)和P38(MAPK14)是AKT信号通路的关键因子。
  (三)Stra8在精子发生中抑制凋亡作用的潜在通路绘制。我们进一步在mRNA和蛋白水平检测发现,与对照组相比,Stra8过表达精原细胞内PDK1、AKT、BCL2和ERK的表达水平均明显升高,P53mRNA表达水平显著降低,但其蛋白表达没有明显差别。同时,通过检测发现,与对照组相比,Stra8过表达精原细胞内Caspase3在mRNA和蛋白水平均表达降低。因此,Stra8可能通过AKT通路直接或间接抑制P53或激活BCL2家族基因,与MAPK通路相互作用,进而抑制caspases家族基因,发挥抑制凋亡作用。
  第二部分 体外研究Stra8与Setd8的相互作用。
  (一)Stra8过表达精原细胞和P19细胞中Stra8、Setd8和H4K20me1的表达。应用WB检测Stra8过表达精原细胞内Setd8和H4K20me1的表达发现,与对照组相比,在Stra8过表达精原细胞中,Set8表达降低,而H4K20me1表达增高,提示三者之间可能具有相互调控关系。之后,我们应用4μM RA诱导P19细胞36-48hr,使其瞬时过表达Stra8,然后检测诱导后P19细胞内Set8和H4K20me1的表达,结果发现,与未诱导P19相比,RA诱导P19细胞分化后,Set8表达水平降低,而H4K20me1表达增高,与在Stra8过表达精原细胞的表型一致,进一步验证三者之间具有相互调控关系。
  (二)Stra8过表达细胞株的细胞周期同步化方法的建立。由于Stra8、Setd8和H4K20me1的表达与细胞周期相关。因此我们参照Hela细胞的细胞周期同步化方法,将Stra8过表达精原细胞同步化至细胞周期的不同阶段。首先,应用血清剥夺法同步化Stra8过表达精原细胞至G1期,分别血清剥夺培养细胞24,36,48,60,72,84,96hr,发现血清剥夺培养72hr后,细胞周期同步化至G1期效率最高,达60-70%。其次,应用“二次胸苷(2.5mM)阻滞法”同步化Stra8-GC1至S期,第二次释放时间分别为0,3,6,9hr,发现二次释放时间3hr后细胞的S期同步化效率最好,达60-70%。最后,应用100ng/ml诺考达唑分别处理4,8,12hr,发现处理8hr后细胞的M期同步化效率最好,达90%以上。
  (三)Stra8,Setd8和H4K20mel在Stra8过表达细胞株在细胞周期不同阶段的表达。我们应用细胞免疫荧光和Western Bloting法检测Stra8过表达精原细胞细胞周期不同阶段Stra8,Setd8和H4K20me1的表达,发现在Stra8-GC1内,Stra8表达在G1期低,S期达到高峰,信号核质均有,在G2/M期表达降低;Setd8表达在G1期无表达,在S期后期开始表达,信号主要在细胞核,在G2/M期表达水平达高峰;H4K20me1表达模式与Setd8表达相似。经过表型分析与文献查阅我们猜测在细胞周期S期中,Stra8抑制E3泛素连接酶相关基因表达,CRL4Cdt2,SCFSkp2等,减弱其对Set8的降解作用,导致Setd8总体表达下降;而由于H4K20me1提前表达,反而导致H4K20me1总体表达水平提高。
[硕士论文] 单一波
外科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:气管病变可由外伤、肿瘤、气管软化等原因引起,切除病变气管并行端-端吻合被普遍认为是最有效的手术方式。当气管环切长度超过成人总长的1/2或婴幼儿的1/3时,由于张力等原因需行气管替代治疗。组织工程将种子细胞、支架材料和细胞因子有效结合,从而修复相关组织缺损,进行器官重建。3D打印技术仿生制造的器官、组织具有较好的生物力学特性和细胞相容性,弥补了传统组织工程的缺点与不足。随着对可吸收生物材料的研究深入,其开发应用已成为当前组织工程和生物医用材料的研究重点。近年来,聚已内酯(PCL)材料在3D打印气管中备受瞩目。但PCL表面疏水性极大地影响了细胞与材料的相互作用,进而影响细胞在材料表面的粘附、增殖等行为。表面修饰可以在不影响材料原有性能的同时,提高表面亲细胞性。材料的多孔结构可以为种子细胞提供更好的营养输送,加强细胞间的交流,进而提高种子细胞的存活率。本研究旨在通过3D打印技术制备PCL多孔气管支架,评价其生物力学性能;遴选适宜的孔径大小及表面修饰方法,探讨其对细胞粘附、增殖行为的影响;通过体内埋植实验,评估所构建材料的生物相容性及免疫排斥反应,从而为体内气管移植寻求更合适的支架材料。
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 3D打印气管的制备及生物力学性能检测
  目的:
  利用3D打印技术制备PCL多孔气管支架并评价其生物力学性能。
  方法;
  1.利用3D打印技术制备PCL多孔气管支架;
  2.采用纵向拉伸、径向压缩和三点弯曲试验评价PCL气管的生物力学性能。
  结果:
  1.3D打印PCL气管支架具有与兔新鲜气管相似的形态结构;
  2.3D打印PCL气管支架的生物力学性能明显优于新鲜气管,且与孔径大小成反比。
  结论:
  1.3D打印技术可成功制备PCL多孔气管支架;
  2.3D打印PCL气管支架具有良好的生物力学性能。
  第二部分 3D打印气管的孔径大小遴选与表面修饰
  目的:
  遴选3D打印气管适宜的孔径大小和表面修饰方法。
  方法:
  1.通过水解、胺化和纳米二氧化硅修饰对支架材料进行表面改性;
  2.通过能谱分析、电镜扫描等物理性能测定评价其表面修饰效果;
  3.通过CCK-8检测不同孔径和修饰方法对细胞粘附、增殖行为的影响;
  4.通过电镜扫描观察细胞与支架共培养的微观结构。
  结果:
  1.气管支架孔径大小为200μm更适合细胞的粘附与增殖;
  2.与水解、氨化的修饰方法相比,纳米二氧化硅修饰后的支架表面更加光滑,修饰效果更佳;
  3.纳米二氧化硅修饰后气管支架的亲细胞性明显改善,更利于细胞粘附与增殖。
  结论:
  1.3D打印PCL多孔气管支架管壁适宜孔径大小为200μm;
  2.纳米二氧化硅修饰为适宜的表面修饰方法。
  第三部分 3D打印气管的生物相容性与免疫排斥反应评价
  目的:
  评价孔径为200μm的3D打印气管经纳米二氧化硅修饰后的生物相容性及免疫排斥反应。
  方法:
  1.体外细胞毒性试验检测修饰后3D打印气管的生物相容性;
  2.动态监测受体体内血常规和血清免疫球蛋白的变化;
  3.对埋植物行组织学分析;
  4.免疫组织化学染色检测埋植物CD68及MHC-Ⅰ、Ⅱ抗体的表达量。
  结果:
  1.体外细胞毒性试验显示,修饰后的气管支架周围BMSCs生长良好,具有良好的生物相容性;
  2.实验动物的白细胞在术后一周左右达到高峰,随后消退;IgM峰值出现早于IgG,符合体液免疫应答抗体产生的规律;
  3.新鲜气管埋植术后30d的HE染色显示,软骨基质结构扭曲、紊乱,软骨陷凹内空虚,外壁可见大量深染的炎细胞浸润,而内壁可见致密排列的纤维,有出血坏死及炎症细胞;而PCL多孔气管支架在30d时炎症反应较15d时明显消退,肉芽组织内纤维排列较前疏松,有核细胞数量显著减少;
  4.新鲜气管埋植术后30d的免疫组化染色显示,新鲜组气管基质折叠断裂,软骨陷凹内的细胞核消失,管腔内侧炎症细胞数量较前增多,局部有出血坏死表现;管腔的结缔组织外侧也可见CD68及MHC-Ⅰ、Ⅱ抗原表达阳性的细胞分布,细胞膜呈棕色;术后30d,PCL多孔气管支架以排列规则的梭形细胞核为主,阳性细胞数较15d时显著减少,肉芽组织内可见新生血管形成,血管内皮细胞核呈类圆形排列。
  结论:
  孔径为200μm的3D打印气管经纳米二氧化硅修饰后具有良好的生物相容性和低免疫原性。
[硕士论文] 李雪丽
妇产科学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在辅助生殖技术促排卵过程中,卵巢低反应患者常常出现获卵率低、卵母细胞质量差及妊娠结局不良,目前有很多的治疗措施被建议用于提高卵巢低反应患者的IVF-ET妊娠结局,促排卵方案中适时添加生长激素是其中之一。本研究通过探讨生长激素对卵巢低反应患者IVF-ET胚胎质量及妊娠结局的影响,进一步明确生长激素对不同年龄卵巢低反应患者卵巢反应的影响及应用价值,为卵巢低反应患者的治疗方案提供相应的理论依据。
  方法:
  1、选择2015年01月至2016年12月在本院生殖中心行IVF/ICSI-ET助孕的并确诊为卵巢低反应的共72个新鲜周期为研究对象,将促排卵方案中加用生长激素的为实验组(32个周期),同样的促排卵方案中未加用生长激素的为对照组(40个周期),比较两组卵巢低反应患者的基本情况、卵母细胞质量、胚胎质量及妊娠结局。
  2、按年龄将纳入患者分为<35岁和≥35岁两组,每组中都包括生长激素组和对照组,分别比较不同年龄组中生长激素组和对照组患者的基本情况、卵母细胞质量、胚胎质量及妊娠结局,探讨生长激素对卵巢早衰患者IVF-ET周期中卵巢反应的影响及其应用价值。
  结果:
  1、GH组和对照组比较,两组间的年龄、BMI、不孕年限、不孕类型、基础激素水平、窦卵泡数、Gn天数、Gn总量、HCG日子宫内膜厚度、移植胚胎数及受精方式均无明显统计学差异(P>0.05),但HCG日E2水平(P=0.010)生长激素组较对照组显著增高,有显著统计学差异。
  2、GH组和对照组比较,两组的卵子成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎着床率、临床妊娠率及活产率均无显著统计学差异(P>0.05),而获卵数(P=0.002)和MⅡ卵数(P=0.015)在GH组较对照组明显增高,有显著统计学差异。
  3、年龄<35岁的生长激素组和对照组,两组间的年龄、BMI、不孕年限、基础激素水平、窦卵泡数、Gn天数、Gn总量、HCG日子宫内膜厚度及HCG日E2水平均无明显统计学差异(P>0.05);年龄≥35岁的生长激素组和对照组,两组间的年龄、BMI、不孕年限、基础激素水平、窦卵泡数、Gn天数、Gn总量及HCG日子宫内膜厚度均无显著统计学差异(P>0.05),但HCG日E2水平(P=0.005)GH组明显高于对照组,有显著统计学差异。
  4、年龄<35岁的生长激素组和对照组,两组间的获卵数、MⅡ卵数、卵子成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率及临床妊娠率均无统计学差异(P>0.05);年龄≥35岁的生长激素组和对照组,两组间的卵子成熟率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、着床率及临床妊娠率也均无统计学差异(P>0.05),但GH组获卵数(P=0.001)及MⅡ卵数(P=0.013)明显高于对照组,有显著统计学差异。
  结论:
  1、添加生长激素对卵巢低反应患者IVF-ET的临床妊娠率没有影响,但能显著提高≥35岁患者HCG日E2水平、获卵数及MⅡ卵数;
  2、高龄卵巢低反应患者IVF-ET促排卵方案中添加生长激素可能对患者受益更大。
[硕士论文] 孔苏伟
遗传学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,Li)作为李斯特菌属中唯一致病的两个种深受研究者的关注,其中Li主要感染羊、牛等反刍动物,极少引起人类的感染和发病;而Lm除感染动物外还能感染人类,引起人侵袭性和胃肠炎性李斯特菌病。Lm是兼性胞内寄生的病原体,能侵袭宿主的多种细胞(包括吞噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等)进行增殖,并扩散到毗邻的细胞中。Lm能够突破宿主的三道屏障(胃肠道、胎盘和血脑屏障),引起的李斯特菌病致死率约为20-30%。虽然目前已经发现70多种毒力因子参与该病原菌的粘附、侵入和胞内增殖,但其与宿主互作与致病的分子机制尚未完全阐明,有待通过高通量的组学技术进行深入研究。
  本研究在前期对强毒株Lm XYSN全基因组测序的基础上,对Lm XYSN中新发现的伊氏李斯特菌来源的基因smcL及其功能进行研究,并初步探讨了其表达产物与李斯特菌溶血素O(listeriolysion O,LLO)之间的关系;此外,还利用动物模型从Lm XYSN的转座子突变文库中筛选出与Lm XYSN的高致病力相关的新毒力因子。Lm XYSN中的毒力相关基因的挖掘及功能解析,有助于揭示该菌株高毒力的分子致病机制,为李斯特菌病的预防和控制提供科学的依据。
  1、自然重组单核细胞增生李斯特菌中smcL基因的功能研究
  将Lm XYSN smcL的基因序列与数据库进行比对,发现smcL的基因和与Li来源的基因序列同源性为97%,而迄今为止未见Lm中携带smcL基因的报道,因此这是首次在Lm中发现smcL基因。smcL基因编码的鞘磷脂酶C(SmcL)能特异性地作用于鞘磷脂,且具有一定的溶血活性,为Li的重要毒力因子,由此提示,SmcL蛋白的表达很可能在增强Lm XYSN毒力中发挥重要作用。
  为了深入研究Li来源的smcL基因的功能,成功构建了Lm XYSNΔhly、Lm XYSNΔsmcL、Lm XYSNΔhly-ΔsmcL缺失突变株,以及能表达SmcL蛋白的Lm EGDe∷pIMK2-smcL和Lm NTSN∷pIMK2-smcL菌株。与马红球菌(Rhodococcus equi,R.equi)的协同溶血试验表明,只有当Lm中smcL基因得到表达时,才会与R.equi形成铲形的溶血现象。通过测定突变株和重组菌株的溶血效价,发现smcL基因的缺失会导致LmXYSN溶血能力下降2倍,而其在Lm EGDe中的表达,则使重组菌株的溶血能力提高了4倍,提示smcL基因显著增强了Lm XYSN的溶血能力,很有可能有利于其在体内的感染和致病。对结肠腺癌上皮细胞系Caco-2BBE进行的体外感染试验显示,smcL基因能显著提高Lm对该细胞系的粘附、侵袭和增殖能力。接下来以口服感染动物模型对smcL基因的功能进行了体内实验,结果表明,在感染72h以后,smcL和hly基因双缺失的突变株与hly基因单缺失的菌株相比,其在肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏中的定殖能力显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。非常重要的是,smcL基因在NTSN中的重组表达显著增强了其在回肠和肠系膜淋巴结中的定殖能力(P<0.01,P<0.001)。总之,以上结果证明smcL基因作为Lm的独有基因,对其宿主体内的生存和内脏组织中的定殖中发挥重要作用,因此该基因是XYSN毒力增强的关键毒力因子之一。
  2、基于转座突变文库技术筛选的李斯特菌新毒力基因LMxysn_0620的功能研究
  以BALB/c小鼠口服感染动物模型,筛选Lm XYSN的转座子突变文库。从突变文库中随机挑取500个突变菌株进行口服感染实验,最后获得13株毒力下降100倍以上的突变株。通过反向PCR和基因测序后的比对分析,发现7株突变株的转座子插入位点基因与细胞生长代谢相关(xysn_1358、ysn_1979、xysn_2165、ysn_2795、ysn_1812、ysn_2865、xysn_2030),3个基因分别与DNA的转录(xysn_0972)、蛋白质的修饰(xysn_1491、xysn_1284)相关,还有2个基因的功能是未知的(xysn_2490、xysn_0620)。利用小鼠口服感染突变株来测定LD50,xysn_0620∷Tn的毒力(LD50=107.85CFU)比Lm XYSN(LD50=105.08CFU)降低了588倍,表明xysn_0620参与Lm XYSN感染小鼠的过程。
  构建xysn_0620基因的缺失突变株Lm XYSNΔ0620,对Lm XYSNΔ0620在不同培养条件下的生长能力进行测定,结果发现缺失突变株与亲本株在BHI培养基和在含有1%Triton的BHI培养基中的生长速率并无差异。在不同培养时间和温度下,对缺失株和野生株的生物被膜形成能力进行测定,结果表明,Lm XYSNΔ0620在42℃形成生物被膜的能力均显著下降(P<0.05,P<0.01)。药敏试验发现xysn_0620基因缺失使细菌对克林霉素(Clindamycin,DA)的抗性由耐受变为中度敏感。以上结果提示,具有跨膜结构的xysn_0620基因编码产物可能为Lm XYSN的细胞结构成分。此外,体外细胞感染实验发现,xysn_0620基因的缺失会引起Lm XYSN对Caco-2BBE细胞黏附、侵袭、增殖的能力均显著性降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。最后对Lm XYSNΔ0620缺失株在体内的感染动态进行测定,发现Lm XYSNΔ0620在小鼠脾脏中定殖的时间晚于野生菌株,在感染后的48h和72h,在脾脏中的定殖能力(P<0.01,P<0.001)和肝脏中的定殖能力(P<0.05,P<0.001)显著弱于野生菌株,提示其在脾脏和肝脏中的定殖能力显著弱于野生菌株。总之,XYSN_0620作为一跨膜蛋白,在Lm抗胁迫应答及对宿主内的侵袭、定植等致病过程中发挥着极其重要的作用。
[硕士论文] 强斌
生物学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:在世界范围内,由肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis,S.Enteritidis)导致的沙门菌病是一种重要的食源性传染病。肠炎沙门菌能够导致禽类的发病及死亡,在感染种鸡后,常表现为隐性带菌而不发病,该菌能够感染人类和其他多种动物,是一种重要且危害严重的人兽共患病原菌。抗菌药物的使用是防治肠炎沙门菌感染的重要手段之一,而肠炎沙门菌耐药性的产生和传播则极大地制约了抗菌药物的使用效果。耐药基因的产生和传播是肠炎沙门菌耐药性的重要分子机制之一,高通量测序技术的发展和突破为研究耐药性的分子机制提供了极大的便利。本研究通过对190株肠炎沙门菌的全基因组重测序研究,探讨高通量测序技术在肠炎沙门菌耐药性研究中的应用,分析我国肠炎沙门菌的分子耐药机制和演化规律。
  一、肠炎沙门菌的生物辨识
  利用生物信息学技术对190株分离菌株的全基因组测序raw reads进行质量控制与拼接,得到组装长序列,将最终assembly文件作为全基因组数据材料进行后续分析。首先使用MicrobeTrakr在线工具鉴定种属,190株测序菌株均为沙门菌属。然后使用sistr_cmd软件鉴定测序菌株血清型,均为肠炎沙门菌。最后使用PubMLST工具鉴定其ST型,除SAL0000131和SAL0000132两株为新型以外,其余均为ST11,符合肠炎沙门菌的ST型特征,而SAL0000131和SAL0000132的aroC基因的突变是导致该两株菌株表现为新ST型的原因。
  二、肠炎沙门菌的耐药基因与耐药性
  对190株肠炎沙门菌进行耐药表型测定,肠炎沙门菌对NAL的耐药率最高,为83.7%,对AMP和AMC的耐药性分别达到62.6%和62.1%,对CFZ(41.6%)、STR(45.8%)、SXT(29.5%)和TET(21.6%)的耐药菌株也较多,其他药物的耐药菌株数量较少,AMK甚至没有任何菌株表现为耐药。在不同宿主中,43株人源肠炎沙门菌不仅有非常宽的耐药谱,其耐药水平也相当高,整体耐药情况最复杂,多重耐药率达到65.1%,且多重耐药菌株的耐药谱非常宽,其中NAL耐药率最高,达到81.4%;对AMP、AMC和CFZ的耐药率均超过50%,分别达到62.8%、65.1%和53.5%;对ATM和STR的耐药率较高,分别达到23.3%和37.2%;对KAN、GEN、TET、SXT、CHL和OLA的耐药率较低,分别达到16.3%、16.3%、16.3%、11.6%、11.6%和9.3%;CIP和ENR的耐药率仅有2.3%和4.7%;对MEM、AMK和NIT无耐药菌株。鸡源肠炎沙门菌耐药谱较宽,耐药率较高,耐药水平较高,整体耐药情况较为复杂,其中NAL耐药率最高,为94.3%,MIC50达到512μg/ml;其次为AMP、AMC、CFZ和STR,耐药率分别达到69.9%、68.3%、42.3%和52.0%;SXT和TET的耐药率较高,分别为31.7%和25.6%;其余药物的耐药率则较低,均不超过10%;AMK没有任何耐药菌株。其余宿主肠炎沙门菌数量较少,其耐药率远低于人源与鸡源肠炎沙门菌。
  使用blast软件将组装序列与ResFinder数据库比对,共检测到50种耐药相关基因,分别为aadA1、aadA2、aadA5、aadA16、aadA22、aac(6')Ⅰb-cr、aac(3)-Ⅰva、aac(3)-Ⅱd、aph(3')-Ⅱa、aph(3')-Ⅰa、aph(3')-Ⅰc、aph(4)-Ⅰa、aph(3)-Ⅰva、arr-3、blaTEM-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaOXA-1、blaNDM-5、blaMIR-2、blaMIr-6、blaCMY-2、catA1、catB、catB3、cmlA1、dfrA1、dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27、ermB、fosA、floR、lnuF、mEFB、mphA、oqxA、oqxB、qnrA7、strA、strB、sul2、sul1、sul3、tetA、tetB和tetC。去除相似度低于80%和覆盖度低于70%的基因,得到与表型试验相关的耐药基因共计35种,分别为β-内酰胺类耐药相关基因7种(blaTEM-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaOXA-1和blaCMY-2),氨基糖苷类耐药相关基因13种(strA、strB、aadA1、aadA2、aadA5、aadA16、aadA22、aac(3)-Ⅱd、aph(3')-Ⅱa、aph(3')-Ⅰa、aph(4)-Ⅰa、aph(3)-Ⅰva和aac(6')Ⅰb-cr),喹诺酮类耐药相关基因3种(qnrA7、oqxA、oqxB),四环素类耐药相关基因2种(tetA和tetC),磺胺类耐药相关基因3种(sul1、sul2和sul3),三甲氧苄二氨嘧啶类相关耐药基因3种(dfrA1、dfrA17和dfrA27)以及酰胺醇类耐药相关基因4种(catB3、catB、floR和cmlA1)。基因型与表型对应关系良好,blaTEM-1基因与青霉素类药物AMP和AMC的对应率达到96.1%和95.1%,strA基因和strB基因与氨基糖苷类药物STR的对应率达到90.9%,tetA基因与四环素类药物四环素对应率达到82.9%,dfrA17基因与磺胺类药物复方新诺明的对应率达到88.9%,catB3、catB、floR和cmlA1与酰胺醇类药物CHL对应性达到了100%,均表现出优良的对应性,但仍然存在表型与基因型不对应的情况,说明仍然有未知的耐药机制在发挥作用。
  基因的点突变研究显示,基因点突变确实能够影响耐药表型。blaTEM-1基因的A120C突变在6株肠炎沙门菌中被检测到,该6株菌株中的5株表现出头孢唑林的高耐药表型(MIC≥512μg/ml)。strA中检测到2种非共有点突变(C295T和G445C),未发现其对表型存在显著影响。strB检测到11种非共有点突变(A139G、T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C、G364C、T535G、G592T和G574T),其中T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C和G364C在基因序列上的位置相当接近。tetA基因中共检测到10中非共有点突变,其中发生A124G突变的YZU0232和YZU0266的四环素耐药表型均为不耐药,该突变可能对tetA基因功能有减弱作用,发生G250A(SAL0000212和YZU0228)和G277A(YZU0254)的菌株表现出的MIC水平达到耐药突破点的8倍,该两种点突变可能对耐药性有提高作用。喹诺酮类药物的耐药性产生与QRDR的点突变具有关联,并且由于各基因之间、各点突变之间的相互配合导致不同的耐药表型和水平。
  在质粒检测分析中发现IncX1型质粒携带有众多耐药基因,可能与肠炎沙门菌的耐药流行有密切关联。对不同质粒所携带的耐药基因进行检测,我们发现95个IncX1型质粒携带了77个strA基因中的76个、77个strB基因中的76个、77个sul2基因中的76个、35个tetA基因中的31个和103个blaTEM-1基因中的95个,IncX1型质粒主要携带的基因为strA、strB、sul2、tetA和blaTEM-1,与氨基糖苷类、磺胺类、四环素类和β-内酰胺类抗生素的耐药性相关,而其余质粒均不携带耐药基因,显示IncX1型是肠炎沙门菌耐药基因流行的关键性可移动元件。
  三、肠炎沙门菌的进化与耐药性研究
  使用Parsnp软件对190株肠炎沙门菌作核心基因组进化树,并与背景信息对应分析。MIC表型、耐药基因型和质粒分型在进化关系上呈现出明显的谱系差异,核心基因组进化树的构建所产生的不同分支能够与耐药相关背景信息较为准确清晰的对应。使用Parsnp软件对国内外共计208株肠炎沙门菌进行核心基因组进化树构建,结果显示国内菌株与美国、加拿大、韩国、莫斯科、丹麦和巴西的菌株在进化树上可以明显区分,国外菌株处于独立分支且能够按照宿主和年代来源形成较为明确的谱系。国内肠炎沙门菌的流行则由两部分组成,其一为国内流行的肠炎沙门菌,其二可能是来自于美国和加拿大等北美国家的肠炎沙门菌。根据国内外菌株的进化关系对比分析,国内肠炎沙门菌的进化结构比国外菌株更为复杂,国内各宿主、地区的肠炎沙门菌在进化关系上非常接近,而非国外菌株所表现出的不同谱系,可能意味着国内肠炎沙门菌的流行范围更大,宿主间的菌株交流更频繁。基于全基因组重测序的进化分析在一定程度上能够对肠炎沙门菌耐药性作出预测和指导。
[硕士论文] 周明娟
通信与信息系统 兰州交通大学 2018(学位年度)
摘要:表面肌电信号(sEMG)发源于脊髓中的运动神经元,是一种常见的生物电信号,也是产生肌肉力的电信号根源,它可以通过表面电极的引导来获得,反映了神经肌肉的功能状态,蕴含了有关肌肉活动的各种信息,因此它的检测及分析对神经肌肉诊断、运动医学等方面都具有重要意义。本文旨在研究设计一整套具有良好抗噪声性能的表面肌电信号采集装置,并通过实验测试其可靠性和有效性。
  (1)对肌电信号的产生机理、数学模型等进行了阐述,为后续采集装置的研究和设计奠定了理论基础。
  (2)在了解表面肌电信号自身特征的基础上,充分考虑采集过程中可能面临的各种噪声干扰,针对以上问题,确定采集装置的设计方案。包括采集信号检测部分、前置信号放大部分、带通滤波部分、工频陷波部分、信号二级放大部分和显示终端。本论文所设计的装置采用低阻抗差分电极形式,从源头上降低了信号的损耗,抑制了共模干扰。对信号的放大采用分级放大方案,一方面降低了对芯片、元件的性能要求,节约成本,另一方面也有助于防止在信号被滤波前内含的直流分量被过分放大造成微弱的肌电信号被淹没,同时也便于放大增益的灵活调节。此外,采用10阶Sallen-Key带通滤波器,阻带衰减速度极快,能够对环境噪声以及其它干扰信号有很强的衰减能力。实验结果表明,所设计的采集装置,具有较好的抗干扰性能,采集效果显著。
  (3)设计表面肌电信号采集实验。通过物理运动、理疗仪刺激及直流电刺激三种方式进行表面肌电信号的采集,在时域分析的基础上,运用MATLAB对信号进行频域分析,并加以结果比对,以验证所设计装置的可靠性和有效性。
[硕士论文] 王航
动物学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)为革兰氏阳性菌胞内寄生菌,广泛存在于生鲜食品和环境中。单增李斯特菌可穿过肠屏障,通过血流传播并到达肝脏,脾脏,中枢神经系统和胎儿,最终引起人败血症、脑炎、脑膜炎和胃肠炎及孕妇流产,死亡率可达30%,是最严重的人类食源性感染之一。单增李斯特菌在感染过程中,需要表达多种毒力蛋白来完成对宿主细胞的感染。单增李斯特菌将毒力因子分泌到胞外,需要不同的分泌系统参与,目前已知主要是Sec分泌系统和Tat分泌系统承担分泌功能,而鞭毛分泌系统是否也参与了特殊因子的分泌目前还未有报道。因此,本研究主要阐明了:1.单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的体外酶学功能及其在细菌感染过程中的生物学作用。2.单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB的生物学功能。
  1.单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的酶学特征与参与细菌感染
  我们通过生物信息学分析预测Lmo1711属于氨基肽酶M29家族,氨基肽酶Ⅱ型,可以水解氨基酸N端残基对蛋白进行修饰。酶活分析显示,Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性,针对不同底物的结合和催化能力差异较大。在单肽对硝基苯胺底物中,Lmo1711与亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)、精氨酸对硝基苯胺(Arg-pNA)和赖氨酸对硝基苯胺(Lys-pNA)反应对应的Kcat/Km分别为3.149×105min-1M-1、1.536×105min-1M-1和1.035×104min-1M-1,由此可见Lmo1711对Leu-pNA的催化效率最高,即对亮氨酸残基的亲和程度最高;对多肽对硝基苯胺切割能力较弱。Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性,Co2+、Cd2+、Zn2+等多种金属离子均能显著增强其活性,其中Co2+的激活效应最显著。酶学分析表明,Lmo1711保守的关键氨基酸活性位点(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380)决定了Lmo1711的催化活性。生物学功能研究发现,缺失lmo1711后细菌生长能力不受影响,但缺失株感染Caco-2细胞后其侵袭和增殖能力显著低于野生株。此外,缺失该基因后细菌在L929细胞中的迁移能力亦显著降低。本研究首次发现并证实,单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员,具有较强的催化活性,且对金属离子具有不同程度的依赖性,并且在一定程度上参与了细菌在细胞中的感染。
  2.单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB生物学功能研究
  本研究发现单增李斯特菌鞭毛结构蛋白FlhB(由lmo0679基因编码)参与了细菌的鞭毛合成与运动。缺失flhB后李斯特菌不形成鞭毛,运动能力完全丧失,并导致motA、flaA、fliN、fliI、fliK、flgC等多种鞭毛相关基因的转录水平和FliM、FliY和FlaA等鞭毛蛋白的表达水平降低。基于细菌鞭毛与Ⅲ型分泌系统的亲缘性,本研究以单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB为主要研究对象,进一步探索了李斯特菌鞭毛结构与蛋白分泌功能之间的关联。我们利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)方法分别对flhB和fliS的基因缺失株中分泌蛋白进行了差异蛋白质谱分析。iTRAQ结果显示,李斯特菌缺失flhB和fliS后大量的鞭毛与非鞭毛相关蛋白分泌量下降。具体来看,在37℃条件下,缺失flhB后有38种蛋白分泌量上调,39种蛋白分泌量下调;缺失fliS后有25种蛋白分泌量上调,25种蛋白分泌量下调。在30℃条件下,缺失flhB后有29种蛋白分泌量上调,62种蛋白分泌量下调;缺失fliS后有23种蛋白分泌量上调,57种蛋白分泌量下调。可以看出,在30℃条件下,flhB和fliS缺失后下调的蛋白数量明显多于在37℃。COG(Cluster of orthologous group)功能分类显示,这些差异蛋白主要参与翻译,核糖体结构与生物发生以及糖转运与代谢等过程;GO(Gene ontology)分析鉴定发现,差异蛋白主要是细胞组分(27.74%),巨分子复合物(12.19%)和细胞器(12.01%)。经过查询Uniprot等蛋白信息网站与相关文献,我们从中选取了鞭毛钩调节蛋白FliK、鞭毛丝组件蛋白FlaA和细胞分裂调控蛋白DivIVA等李斯特菌中报道较少的蛋白进行Western blot验证。WB结果显示,在30℃条件下,flhB缺失后,DivIVA,FliK和FlaA分泌量显著下降;fliS缺失后FliK和FlaA分泌量显著下降。其中DivIVA与细菌的分裂增殖相关。本研究首次发现并证实单增李斯特菌FlhB参与了细菌运动,鞭毛合成,鞭毛与非鞭毛蛋白分泌等过程,为进一步探索单增李斯特的非经典分泌机制与致病机制提供了初步试验基础。
  综上,本研究:(1)首次探索并证实了单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711属于金属离子依赖的M29氨基肽酶家族成员,并参与了细菌在细胞中的感染和迁移,与细菌毒力相关。研究结果对于深入完善和挖掘李斯特菌新的毒力因子及致病机制具有重要意义。(2)首次探索了单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB的生物学功能和介导的分泌作用,为后续进一步研究革兰氏阳性菌鞭毛T3SS及新的分泌型蛋白的生物学功能奠定了关键基础。
[硕士论文] 杜志锋
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:对于成年女性而言,其生育力随年龄增长而下降。其中卵巢衰老,包括卵泡在数量上的减少和功能上的衰退等,成为生育力下降的重要原因。挽救衰老的卵巢,是提高女性生殖力的一个重要策略。藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,PC)是一种具有抗氧化、抗炎症、增强免疫力的钝顶螺旋藻类蛋白质,在医学和生物领域具有广泛应用价值。
  我们的前期研究利用D-半乳糖(D-Galactose,D-gal)致衰小鼠模型,表明PC可通过抑制活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)途径改善致衰小鼠卵巢功能;进一步又通过转录组测序(RNA-Sequencing,RNA-Seq)技术筛选到致衰组和致衰改善组差异表达基因提高生殖力的富集通路。但在自然衰老小鼠模型中,PC能否改善雌性生殖力,以及PC的作用功效和机制尚未得知。
  本研究取6周龄小鼠为年轻组(Young),8.5月龄小鼠为自然衰老组(Aged),灌胃PC的8.5月龄小鼠为处理组(Aged+PC),小鼠品系均为ICR。经45天灌胃处理后,利用RNA-Seq技术,分析卵巢在转录组水平表达变化,得到以下结论:
  (1)高通量二代测序获得Young组、Aged组、Aged+PC组三组卵巢转录组的数据,数据过滤后总共得到约58.14G数据量,平均有92.85%比对到基因组上,9个样品Q30指数均在93.20%以上,说明测序质量高,后续分析结果可靠。
  (2)构建了自然衰老小鼠卵巢表达谱,鉴定了597个差异基因,其中上调基因数为252,下调基因数为345。根据GO分析,差异表达基因在生物学过程中主要富集在循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答、补体激活经典通路、B细胞介导的免疫等;在细胞组分中主要富集在血液微粒、免疫球蛋白复合物循环、染色体浓缩运动等;在分子功能中主要富集在抗原结合、免疫球蛋白受体结合等方面。根据KEGG分析,差异表达基因在细胞周期、细胞粘附分子方面发生显著富集。
  (3)同Aged组相比,Young组与Aged+PC组鉴定了13个共同差异表达基因,根据GO分析,共同差异表达基因在生物学过程中主要富集在细胞对干扰素-β的反应、细胞因子应答、先天免疫应答、对原生动物的防御反应等;在细胞组分中主要富集在液泡膜共生体、宿主细胞质、宿主细胞内部分等方面。
  (4)基于Young组与Aged组差异表达基因,并结合RT-qPCR结果表明,在Aged+PC组中,Aurka、Gdf9、Mest、Rad5等基因出现上调,其中Gdf9和Rad51为显著上调;另外Cd74、Cxcl10、Nlrc5、Zbp1等基因出现显著下调,这与RNA-Seq结果相符。上调基因涉及卵母细胞微管形成、卵泡发育、促进生长、DNA修复等过程,下调基因涉及到炎症反应、低甲基化参与的衰老调控等作用。推测灌胃PC有助于提高卵巢功能,延缓衰老,为PC抵抗卵巢衰老、提高生殖力提供理论依据。
[硕士论文] 郭叔瑾
软件工程 兰州交通大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着医院开始重视医疗信息化,以及国家对全民医保的重视和投入,来医院就诊的病人逐渐增加,产生的医疗数据越来越多。此外,由于医院购置了各种大型的高科技医疗设施,当广泛的将其投入使用时也会产生海量的医疗数据。针对海量的医疗数据,如何把数据中潜在的、有价值的信息挖掘出来,如何通过数据挖掘的方法了解某种疾病发生的危险性因素,提前预防或提前就诊来降低发病率已经成为一个问题。目前,国内外的研究者针对医疗数据挖掘的研究已经取得了一些进展,但是目前的研究主要集中在对随机森林、神经网络、支持向量机等传统分类算法的改进及使用上,虽然分类准确度较高,但是并不能发现一些影响疾病发生的特征。而关联分类算法可以挖掘出和某种疾病相关的特征,它是数据挖掘领域中主要的研究课题之一。
  专家系统对医学应用中提取可以提供结果解释的if-then规则很感兴趣。为了有效地从数据中挖掘知识,提出了各种规则归纳算法,它们可以结合分类方法,形成以规则为基础的分类算法。然而,大多数以规则为基础的分类算法不能直接处理数值型数据。而离散化数据预处理可以将数值型数据转变成分类格式。但是现有的离散化算法没有考虑到数据集中数值变量的分布,这可能会降低以规则为基础的分类器的性能。针对现有离散化算法不能保持原始数据的分布这一问题,本文提出了一种基于高斯混合模型的离散化算法(Discretization Algorithm based on Gaussian Mixture Mode,DAGMM),该算法通过考虑数值变量的分布以保留原始数据的最频繁模式。DAGMM算法的有效性是使用四个公开可用的医疗数据集进行验证的。根据实验结果,在产生的规则数和关联分类算法的分类准确度方面,DAGMM算法优于其它六个静态离散化方法。因此,在临床专家系统中运用DAGMM算法,可以提高以规则为基础的分类器的性能。
  由于许多学者利用关联分类技术来准确地帮助医师预测乳腺癌疾病,并且应用关联规则可以加强分类过程。所以接下来将DAGMM算法和常见的关联分类算法结合,用于对乳腺癌疾病的分类和预测。然而,大多数关联分类算法都受到规则评估过程中使用的估计方法以及属性级别使用的优先级技术的影响。在本文中,提出了一个基于统计调和平均值的特征加权关联分类算法(Feature Weight Association Classification algorithmbased on based on statistical harmonic mean,FWAC)。通过统计测量技术进行剪枝,生成更准确的关联规则,以提高关联分类器的准确度。将FWAC与五个著名的关联分类算法在UCI机器学习数据库中的两个乳腺癌数据集上进行比较。实验结果显示,在大多数情况下,FWAC在本案例研究中优于其他关联分类算法。此外,FWAC生成的规则更准确。本文的研究成果对于乳腺癌的预防和诊断具有很好的作用。
[博士论文] 杨宏波
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:肺炎链球菌是链球菌属革兰氏阳性菌,也是一种常见的引起高发病率、高致死率疾病的致病菌。除肺炎外,它还可以引发脑膜炎、胸膜炎、中耳炎、败血症等全身性疾病。我们通常使用青霉素等抗生素对肺炎链球菌引起的疾病进行治疗。由于抗生素的广泛使用,目前已发现多种能够抵抗抗生素的肺炎链球菌菌株。
  多抗药外排泵是一种将外来物质泵出细胞的转运系统,它是细菌抵抗抗生素的一种重要途径。Spr0693-0694-0695是肺炎链球菌中可以转运人类上皮细胞抗菌肽LL-37的抗药外排系统。其中Spr0694-0695具有ABC转运蛋白的特征,Spr0694具有核苷酸结合结构域,可以结合并水解ATP,而Spr0695为跨膜结构域。
  在本课题中,我们首先对Spr0693和Spr0694-0695分别进行了X-射线晶体学研究,解析了3.0(A)的Spr0693和3.3(A)的Spr0694-Spr0695的晶体结构。通过结构分析,我们发现Spr0693是一个定位于细胞膜上的膜融合蛋白,6个Spr0693围成桶状结构,形成一个底物排出的通道;而Spr0694-0695是一个非经典的ABC transporter,它有一个很大的胞外结构域,但仅有8股跨膜螺旋,且跨膜区中央不存在底物进出的通道。经过与大肠杆菌MacAB的结构比对,我们找到了一条侧向的转运通道。通过脂质体上的ATPase酶活实验和抗生素敏感性实验,我们推测这条通道的开闭由Spr0695胞外区上的一个螺旋所控制。最后,我们预测了这种新型的多抗药外排泵可能的转运机制。
[博士论文] 张智涛
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)引起的结核病(TB)是一种全球性传染性疾病。随着抗结核药物的不规范使用以及M.tb基因突变等情况的出现,TB出现了多种不同类型的耐药情况,从耐单药到耐多药(Multidrug-resistant, MDR)以及更加棘手的泛耐药(extensively drug-resistant,XDR)。面对TB的卷土重来,M.tb药敏的快速准确鉴定对于治疗TB有重要的意义。针对已有药敏检测(drugsusceptibility testing,DST)耗时长、准确率低等不足,本研究创新性的构建了2种基于不同传感原理的M.tb药敏检测体系,其结果如下:
  1)基于氧电极的微生物传感体系:该体系由氧电极及固定在其表面的M.tb构成,可以监测到经过抗结核药物处理的M.tb被甘油刺激后引起的溶解氧消耗的变化。药物处理4天后,耐药M.tb菌株和和药敏M.tb菌株构建的传感系统所引起的响应出现了差异,进而分析药敏性。采用该传感体系对H37Ra及其耐药突变株和另外35株临床菌株进行了利福平(rifampin,RIF)、异烟肼(isoniazid,INH)、硫酸链霉素(streptomycin, STR)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、左氧氟沙星(levofloxacin,LVX)和对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid, PAS)这6种抗结核药物的药敏检测。药敏检测的结果表明该传感体系的准确率达97.1%,且将整个检测时间缩短到了11天。
  2)创新性的发展了一种可用于M.tb药敏检测的阻抗传感体系:通过在阻抗传感器的电极芯片上固定M.tb特异性抗体,实时检测M.tb增殖引起的阻抗变化。在该体系中加入抗结核药物,该传感系统可以实现M.tb的药敏检测。采用该传感体系对H37Ra及其耐药突变株,35株临床菌株进行了6种抗结核药物(RIF, INH,STR,EMB,LVX,PAS)的药敏检测。其结果表明:该体系在2天内实时监测M.tb增殖引起的阻抗变化,体系对这6种药物的药敏检测结果与金标准(LJ比例法)相比其准确率达到了84.8%,且完成整个药敏检测仅需9天。
  本研究发展的新方法还可以用于其他细菌(如大肠杆菌,耻垢分枝杆菌)的药敏检测。以上2种传感体系操作便捷、具有检测时间短、准确率高等优点。特别是阻抗传感方法,还可以实现高通量检测。两种检测体系不仅为结核病的药敏检测提供了新的技术平台,更有望形成产品,广泛应用于临床检测,为结核病的临床用药提供关键性指导。
[博士论文] 李春宏
流行病与卫生统计学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  人类的长寿与衰老受遗传因素影响,长寿家族人群相对于非长寿家族人群、老龄群体相对于年轻群体,其基因表达水平有差异,拟从转录组学层面挖掘长寿与衰老差异表达基因,探讨基因表达与长寿和衰老的关系。DNA甲基化是表观遗传学修饰方式之一,它易受环境因素的影响而发生动态改变,与人类长寿、衰老、疾病的发生、发展均有关联。基于以上的研究线索,以广西巴马地区人群为研究对象,筛查长寿相关的DNA差异甲基化位点和基因,并在人群中检测长寿高甲基化基因NFATC1基因的甲基化水平,从表观遗传学对基因调控的角度探索DNA甲基化与人群长寿的关系。
  方法:
  (1)运用WGCNA分析GEO数据库中的长寿人群数据集GSE16717的二代测序数据(RNA-seq),以获取长寿与衰老差异表达基因。在人群中随机抽取不同年龄段的个体、抽取其外周静脉血、提取RNA,用于检测特异性衰老差异表达基因CCR6和ID3的表达水平。
  (2)在广西巴马地区的长寿家族和非长寿家族中抽取个体,分别组成长寿家族组和非长寿家族组,抽取研究对象的外周静脉血、提取DNA,用于甲基化芯片检测以获取长寿差异甲基化位点和基因。另建立由长寿老人、长寿老人后代组和非长寿家族人群组成的病例对照研究,检测长寿高甲基化基因NFATC1的甲基化水平。
  结果:
  (1)获得296个长寿差异表达基因,表达水平与寿命负相关,主要涉及GO:0005634~nucleus、T cell receptor signaling pathway等生物学功能和通路。排名前10的是CAMK4、SLC16A10、EPHA4、TAMM41、MAN1C1、DPH1、SIT1、GMPS、PRRC2B、DEXI等;获得46个衰老差异表达基因,表达水平与年龄负相关,主要涉及GO:0042113~B cell activation and hsa04662:B cell receptor signaling pathways等生物学功能和通路。排名前10的是CR2、VREB3、ID3、MS4A1、TCL1A、CCR6、OSBPL10、USPL1、HS3ST1、SPIB等。
  (2)特异性衰老差异表达基因CCR6和ID3在不同年龄段人群中表达水平有差异(74岁以下组>75岁及以上组),基因表达水平与年龄呈负相关关系。
  (3)NFATC1、SHC2、ULBP1、CD37、IL11等基因在长寿家族组人群中高甲基化,而MAPK3、PIK3R5、CORO1A、AKT1和PRKCZ等基因发生了低甲基化。
  (4)NFATC1基因启动子区域chr77157891位点的甲基化水平差异有统计学意义(长寿老人组>非长寿家族组,长寿老人后代组>非长寿家族组)。77157909位点甲基化水平差异也有统计学意义(长寿老人组<长寿老人后代组,长寿老人组<非长寿家族组),且在长寿家族后代组与非长寿家族组的男女间比较,该位点的甲基化水平差异有统计学意义(女<男,p=0.014)。
  (5)H19、PFKFB4、SFTPA1基因在长寿家族人群中低表达、高甲基化。
  结论:
  (1)人类的长寿和衰老均与基因差异表达有关,长寿差异表达基因主要参与细胞免疫;衰老差异表达基因主要参与体液免疫,基因表达水平与年龄呈中度相关关系。
  (2)衰老差异表达基因CCR6和ID3表达水平随着年龄的增加而下降。
  (3)分别获得了长寿高甲基化与低甲基化基因,长寿高甲基化基因NFATC1基因启动子区域部分位点的甲基化水平可能与广西巴马地区人群的长寿相关。
  (4)H19、PFKFB4、SFTPA1既是长寿相关低表达基因,也是长寿相关高甲基化基因。
[硕士论文] 李彬酉
兽医公共卫生与食品安全 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一类特殊的人兽共患和食源性病原菌,它存在于正常的肠道菌群中,但却能够导致机体其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生儿脑膜炎等,严重威胁着人和动物的健康。有效疫苗的缺乏、耐药性的增加和生物被膜的形成给ExPEC防控带来了巨大的困难。
  生物被膜(Biofilm)是细菌的一种特殊生存形式。与浮游菌不同,生物被膜能够抵御机体的免疫清除作用,导致抗生素和消毒剂的作用效果下降,引起机体感染的反复发生。在食品加工设备和食品原料表面的生物被膜给食品安全造成严重危害。因此,研究生物被膜形成机制和控制对策具有重要意义。
  外膜蛋白TolC是构成革兰氏阴性菌外排泵的重要的成分,是细菌对多种抗菌药的抗性的重要原因。本实验室前期研究表明TolC蛋白缺失会造成ExEPC在M9高渗培养基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,转录组学分析发现TolC缺失后会引起Cpx双组份系统周质间隙蛋白CpxP编码基因的上调表达。Cpx双组份系统可响应细菌对高渗信号的识别,激活后能够抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系统可能在tolC缺失后影响ExPEC生物被膜形成中发挥作用。本研究通过对ΔtolC菌株中Cpx双组份系统感应蛋白CpxA和效应蛋白CpxR进行突变,探究其在ΔtolC菌株影响生物被膜形成中的作用。主要研究内容和结果如下:
  1.基因缺失菌株的构建
  设计引物以ExEPC PPECC42基因组为模板扩增cpxA上下游同源臂,并通过Overlap PCR方法连接,将同源臂插入自杀性载体pRE112,转化大肠杆菌x7213感受态细胞构建x7213-pRE-ΔcpxA。并以此为供体菌,分别以ExEPC PPECC42野生株及ΔtolC株为受体菌进行同源重组,利用Cm和SacB筛选得到ΔcpxA基因缺失株和ΔtolCΔcpxA双基因缺失株。利用同样方法,构建ΔcpxR基因缺失株和ΔtolCΔcpxR双基因缺失株。
  2.回补菌株和CpxA磷酸化位点定点突变菌株的构建
  以PPECC42基因组为模板,设计引物扩增cpxA基因全长,并插入pHSG396质粒,构建pHSG-cpxA表达载体,电转化至ΔtolCΔcpxA菌株中,构建回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA。运用同样的方法构建出Cm-R-ΔtolCΔcpxR。
  通过预测和翻译分析,找出CpxA磷酸化位点对应的核酸序列位点,设计点突变引物以pHSG-cpxA质粒为模板扩增出突变的质粒,测序鉴定后电转化ΔtolCΔcpxA菌株中,以构建CpxA磷酸化位点突变菌株M-A-ΔtolCcpxA。
  3.实验菌株的部分生物学特性研究
  首先测定试验菌株的生长情况,在M9和1/2M9培养基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失对ExPEC的生长速率无影响,试验菌株在8h后可以达到稳定期。
  其次使用7种抗菌药测定了试验菌株的MIC,结果表明ΔtolC和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR菌株对氯霉素和环丙沙星的敏感性显著升高,而cpxA和cpxR单缺失对这7种抗菌药的敏感性并未发生明显变化。
  4.试验菌株生物被膜形成能力分析
  使用结晶紫染色法测定试验菌株生物被膜形成能力,发现在M9高渗培养基中与WT相比ΔtolC菌株生物被膜形成能力显著下降;双基因缺失株ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR与WT相当;回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA和Cm-R-ΔtolCΔcpxR生物被膜形成能力恢复到ΔtolC的水平;M-A-ΔtolCΔcpxA生物被膜形成能力与WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培养基中均无差异。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培养基中试验菌株的生物被膜形成能力与M9中类似。
  5.扫描电子显微镜观察生物被膜细菌微观形态
  使用扫描电镜观察试验菌株生物被膜细菌微观形态发现在1/2M9+0.06mol/LNaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高渗培养基中ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈现与WT相似大量黏附于玻片表面,且菌体之间存在大量黏连,但ΔtolC菌株在玻片上黏附较少,细菌菌体之间黏连情况也较少。
  6.Curli菌毛合成能力分析
  刚果红平板试验表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培养基中,ΔcpxA和ΔcpxR单基因缺失突变株和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR双基因缺失株能够形成与野生型菌株WT类似的rdar菌落形态,而Cm-A-ΔtolCΔcpxA、Cm-R-ΔtolCΔcpxR的菌落形态与ΔtolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA则可以形成与WT类似的菌落。在1/2M9-CR平板上试验菌株的菌落形态均与WT相似。这表明Cpx双组份系统确实在高渗条件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的过程中发挥了作用,而且是通过抑制Curli菌毛合成而影响的。
[硕士论文] 徐海峰
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:H5亚型禽流感病毒大多数都是高致病性的病原,一旦发生感染可造成家禽的大规模死亡,使养殖户蒙受巨大的损失,同时H5亚型禽流感病毒也能感染人,甚至造成人员死亡。我国鸡群中存在的H5亚型禽流感病毒,按照HA基因的亲缘关系划分,主要是Clade2.3.2、Clade7.2和Clade2.3.4.4分支的病毒。禽流感病毒一直不断的发生基因变异,2015年零星发现Clade2.3.2分支出现新的小分支Clade2.3.2.1e,2016年在我国多个省份大范围监测到Clade2.3.2.1e分支,H5亚型不同分支之间抗原差异较大,并且随着时间的推移,差异性越来越大,原来以单抗为基础的检测方法逐渐出现更大的偏差和漏检现象,因此,需要不断的更新单抗来修订。为此,本研究用H5亚型高致病性禽流感Clade7.2、Clade2.3.4.4分支和C1ade2.3.2.1e分支的疫苗株,纯化后作为免疫原,结合单抗制备技术制备和筛选覆盖面较广的H5亚型禽流感单抗,进一步建立了以单抗为基础的免疫胶体金试纸条和渗透卡检测方法。
  本研究利用将Clade7.2分支疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7),Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(HSNl)(Re-10)作为免疫原,混合免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫之后,无菌取其脾细胞,将其与骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下进行细胞融合,经过间接ELISA方法及HI方法筛选得到6株能稳定分泌抗血凝素蛋白HA的单抗杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能与当前流行的分支反应,具有较好的广谱性。
  选用两株反应性较好的单抗2A10和2C8,用20nm大小的胶体金颗粒对2A10抗体进行标记,10000转离心纯化,得到金标抗体,以1∶8倍稀释喷涂于试纸条加样孔附近的玻璃纤维上;2C8以1.5mg/mL的浓度喷涂于检测线;羊抗鼠二抗以1mg/mL的浓度喷涂于质控线,组装成胶体金试纸条。利用免疫层析技术(GICA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现该胶体金试纸条能检出我国流行的H5亚型禽流感病毒,广谱性较好,对其他亚型不反应,特异性较好,最小检出的病毒量为24。为了进一步提高它的敏感性,我们将2C8单抗和羊抗鼠二抗点到渗透卡中,制备斑点金免疫渗滤卡,利用斑点金免疫渗滤法(DIGFA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现其最小检出的病毒量为22,敏感性得到提高。
  总之,本研究通过杂交瘤技术筛选出6株1B10、2A10、2C8、H2B1、3E6和4G9抗HA单抗;以单抗为基础材料,初步建立H5亚型禽流感病毒胶体金试纸条检测方法和H5亚型禽流感病毒斑点金免疫渗滤卡检测方法,渗透卡比胶体金试纸条灵敏性有所提高。
[硕士论文] 赵建岚
生物化学与分子生物学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:冠状病毒是一类广泛存在且对人类和家畜具有严重危害的RNA病毒,其基因组全长在30Kb左右,是所有RNA病毒中基因组最大的病毒。2012年首次发现于沙特的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)能使患者出现严重的呼吸道疾病,其临床表现为急性呼吸窘迫综合征,并可能导致肾功能衰竭甚至死亡,因此MERS已经成为严重危害人类健康和生命安全的新型冠状病毒,但迄今为止,对于MERS-CoV的起源、进化及其宿主还未研究清楚。本研究通过对MERS-CoV和其它冠状病毒的S、M、E、N四个结构蛋白构建进化树,来研究该病毒的系统发育关系;将190株MERS-CoV毒株按照分离地域分成39类,并挑选出代表性毒株并对其全基因组序列构建系统发育树来探究该病毒的起源及其进化;运用RDP软件包对MERS-CoV进行种间重组分析,并在此基础上分析该病毒结构蛋白基因的进化模式;对MERS-CoV原型株的9条基因进行密码子偏爱性分析,来探究病毒密码子使用模式及其与宿主的关系;比较MERS-CoV与冠状病毒属其它病毒密码子使用模式的差异,来研究冠状病毒属病毒密码子使用的变异情况。本文主要研究结果如下:
  1.运用MEGA软件,对MERS-CoV和其他19种冠状病毒进行了系统发育分析。确定MERS-CoV是不同于已知冠状病毒的一种新型冠状病毒,它既不属于现有的三个类群,也不同于SARS冠状病毒,而独立成为一支,因此我们将MERS-CoV划分为第五组冠状病毒。同时对筛选出的39株MERS-CoV全基因组序列进行内部系统发育分析,结果表明:MERS-CoV的进化与该病毒爆发时间及其分布地域密切相关:爆发时间及分布地域距离越近病毒亲缘关系越近,相似程度越高,此外病毒进化与其宿主也有一定的关系。结合系统发育树和病人旅行史及一些文献资料,进一步推测得到病毒起初可能是从比沙堡传播到利雅得,然后由这两个地方开始散布到沙特其他的城市。中国流行的毒株很可能溯源于沙特的吉达地区。
  2.使用RDP软件包对MERS-CoV病毒进行重组分析,结果发现:MERS-CoV与其近源蝙蝠毒株的S基因片段之间存在着重组信号,结合文献资料我们推测该病毒起源于蝙蝠,并通过单峰骆驼最终感染人类。通过对病毒结构蛋白基因的进化模式研究,结果表明S蛋白和N蛋白基因经历负选择作用,而E蛋白和M蛋白基因先经历正选择的进化后经历负选择的进化,我们推测这两个基因在病毒适应宿主的进化过程中起着重要作用。
  3.对MERS-CoV进行密码子偏爱性分析,结果表明该病毒密码子偏爱性较弱且偏爱使用的密码子大多以A、U碱基结尾,最终确定了19个密码子为MERS-CoV的最优密码子。中性绘图和ENC绘图分析表明密码子的偏爱性主要受到自然选择作用的影响。通过和其它五种生物密码子使用频率进行比较,结果发现在其宿主系统中,该病毒的密码子使用频率与人的更为接近,这可能是该病毒容易感染人的一个原因。在其外源表达系统中,该病毒密码子使用模式与酵母相差最小,因此真核系统如酵母可能比较适合作为MERS-CoV外源表达载体。
  4.将MERS-CoV密码子用法与冠状病毒属其它病毒密码子用法进行比较,结果发现冠状病毒属的病毒在密码子的使用上具有较强的特异性,进一步表明这一家族的病毒在长期进化过程中具有严格的保守性。通过聚类分析我们发现密码子的使用不能反映物种的真实进化系统,可能会追溯与物种进化方式不同的进化路径。
[硕士论文] 崔宁一
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:日本乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)简称乙脑,是由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus,JEV)引起的一种人畜共患的传染病。乙脑病毒是一种典型的嗜神经病毒,主要经蚊媒传播。乙脑病毒穿越血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)进入中枢神经系统(CNS)是日本乙型脑炎发生的关键环节,同时也是引发宿主临床症状的决定性因素。虽然对黄病毒家族其它成员的神经入侵途径已有报道,但是乙脑病毒通过何种途径进入中枢神经系统还不清楚。由于乙脑病毒对人类健康所产生的巨大危害,但是目前还没有针对乙型脑炎的特异性药物。因此,探究乙脑致病机制,尤其是乙脑病毒神经入侵的途径,对该病的临床防治具有重要作用。
  本研究主要是探讨乙脑病毒入侵中枢神经的途径。首先,以乙脑病毒感染C57BL/6小鼠,并且于感染后的每天分离小鼠的脑、嗅球和脊髓。RT-PCR和免疫荧光荧光检测这些组织中的病毒。结果显示,脑中检测到病毒的时间点早于嗅球和脊髓。用乙脑病毒处理CD3+T细胞、CD19+B细胞和Ly6c+单核细胞,而后再把这些细胞回输到健康小鼠脑组织内。RT-PCR和免疫荧光检测回输组小鼠脑中的病毒载量。结果表明回输组小鼠脑组织中都能检测到乙脑病毒。流式细胞术检测免疫细胞表面趋化因子受体的表达,发现单核细胞和T细胞上部分趋化因子受体的表达上调。此外,内皮细胞对T细胞和单核细胞的粘附试验证实了脑血管内皮细胞对单核细胞的粘附增加,同时内皮细胞和单核细胞表面与迁移相关的粘附分子及其配体的表达增加。
  以上结果显示:乙脑病毒主要通过血源性途径入侵中枢神经系统;乙脑病毒可以感染CD3+T细胞、CD19+B细胞、Ly6c+单核细胞等多种免疫细胞;乙脑病毒感染促进了脑血管内皮细胞对单核细胞的粘附,使单核细胞更容易穿越血脑屏障进入中枢神经系统。综上所述,乙脑病毒可以由单核细胞携带进入中枢神经系统。
[硕士论文] 翟文君
发育生物学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:糖尿病是一种慢性内分泌代谢疾病,其病因是胰岛β细胞受损伤或者胰岛素拮抗引发的高血糖症,它目前已经成为世界性的致死疾病,严重危害着人类的健康。通过胚胎干细胞或胰腺干细胞等诱导分化成为胰岛β细胞是糖尿病治疗的新兴方案,它优于胰岛素注射、胰岛移植等传统疗法,现已取得快速发展。但是由于干细胞增殖和分化都受到复杂的调控,仍需要对胰腺祖细胞进行更进一步的深入研究,才能早日应用于临床,为糖尿病提供良好的治疗方法
  胰腺祖细胞的增殖受到多种因子的调控,其中包括microRNA(miRNA)。miRNA是高度保守的非编码微小RNA,通过结合到其靶基因mRNA的3'UTR,在转录后水平调控基因的表达,参与调节生命体的各个过程,包括细胞分化、细胞增殖、器官发育和肿瘤的发生等。miR-19b是miR-17-92基因簇cluster的重要成员之一,在肿瘤和干细胞中起着重要的调控作用。本实验室发现miR-19b可以通过靶向NeuroD1抑制小鼠胰腺β细胞中insulin的表达,这说明miR-19b参与调控胰腺的发育过程;而另一部分实验结果显示miR-19b对胰腺祖细胞的增殖可能会有影响。
  本研究在胰腺祖细胞中过表达或抑制miR-19b,发现过表达miR-19b可以通过靶向抑制其靶基因PTEN促进PI3K/AKT信号通路,从而显著促进胰腺祖细胞增殖,miR-19b不影响PTEN的mRNA,但明显下调其蛋白水平;在胰腺祖细胞中抑制miR-19b虽然可以促进PTEN的表达,但是对细胞增殖并没有明显的影响。此外,miR-19b还促进了ERK信号通路的激活,但并不影响STAT3信号通路的活性。miR-19b也促进了Wnt信号通路关键蛋白β-catenin的mRNA和蛋白水平;该miRNA还上调了Hippo信号通路效应因子YAP的mRNA和蛋白水平,YAP的主要下游靶基因CCNE1的水平也显著升高,这说明miR-19b也激活了Wnt和Hippo这两个通路。本实验室此前发现miR-18a可以显著抑制胰腺祖细胞的增殖。在本研究发现miR-19b与miR-18a共同过表达可以逆转并回复miR-18a对胰腺祖细胞增殖的抑制作用,且miR-18a靶向抑制的四个基因水平也发生了逆转和上调,这说明在胰腺祖细胞中miR-19b与miR-18a有着相互拮抗的作用,但是其中的分子机制尚不明确,有待进一步研究探讨。
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