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[硕士论文] 田永杰
卫生毒理学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:随着工农业社会的发展,各种化学物通过各种途径排入环境中,通过大气循环、水循环和食物链等方式进入人体。但是,当前关于致突变的安全性评价的相关研究课题大多是聚焦于对单一化合物的评价,如何评价两种或两种以上化学物致突变效果,目前研究少。不可回避的问题是在自然环境中是多种污染物共存的,各化学物在生物体内彼此影响,作用方式复杂,产生多种联合作用效应。本研究通过建立一种双信号重组酵母细胞模型,借助响应面分析法对有关实验参数进行回归拟合,结合响应面曲线和等高线的描述分析,可直观的得出各化学诱变原的交互作用结果。
  1.RAD54启动子的选择
  将2种不同长度RAD54启动子调控的yEGFP报告载体(pR1558-yEGFP,pR406-yEGFP)分别转入W303-1A酵母细胞中,构建成2种启动子调控的发光酵母细胞,分别命名为W303-1A/R1558-yEGFP和W303-1A/R406-yEGFP。用不同化学诱变原作用后,用流式细胞仪和多功能发光仪测酵母的发光强度,结果发现2种启动子调控的酵母细胞发光强度均与化学诱变原(甲磺酸甲脂、4-硝基-N氧化喹啉和5-氟尿嘧啶)有明显的剂量效应关系,但是W303-1A/R1558-yEGFP剂量效应关系较为明显,产生的最大诱导倍数(5.96、2.19和2.71)明显高于W303-1A/R406-yEGFP所产生的最大诱导倍数(2.53、1.79和1.91),同时发现流式细胞仪测定效果明显优于发光仪。所以用RAD54全启动子调控重组发光酵母细胞进行联合基因毒性研究。
  2.RAD54全启动区调控的双信号发光酵母细胞的构建
  由于细胞的发光除与诱变原的诱导有关外,还受细胞数量和细胞“状态”的影响,利用DsRed-Express2(红色荧光蛋白)作为第二信号,建立R1558启动子调控的红、绿荧光蛋白基因发光酵母细胞。当化学诱变原作用于该重组酵母细胞时,yEGFP/DsRed-Express2(相对发光度)与化学诱变原间具有明显的剂量效应关系。
  3.响应面联合致突变分析方法的建立
  (1)首先对化学诱变原进行单因素基因毒性研究
  首先用化学诱变原对重组基因双信号发光酵母细胞进行单因素实验研究,用多功能发光分析仪分别测yEGFP和DsRed-Express2的发光强度,求其相对发光度。参照Ames实验判断的标准,即受试物作用于重组细胞后产生的相对发光度为对照1.5倍以上,并具有明显的剂量效应关系,则判断为阳性。根据剂量效应关系确定各化学诱变原作用闽浓度。
  (2)选用MMS、瘤可宁和顺铂进行联合基因毒性研究发现,三者交互作用参数(β123,P=0.011)有统计学意义,说明化学物间存在交互作用。进一步分析发现MMS与瘤可宁(β12,P=0.113)、瘤可宁和顺铂(β23,P=0.613)无统计学意义,而MMS和顺铂(β13,P<0.005)交互作用明显。再通过响应面等高线图分析可以看出MMS和顺铂之间不呈线性关系,随着浓度的升高曲线先呈弓弧线向内,再呈现弓弧线向外的趋势,说明两者之间在低浓度时有拮抗作用,高浓度时表现出协同作用。
  (3)选用5-氟尿嘧啶、喜树碱和羟基脲进行联合基因毒性研究发现,三者交互作用参数(β123,P<0.001)有统计学意义,说明三者之间存在交互作用。经过进一步分析发现5-氟尿嘧啶与喜树碱(β12,P=0.008)、5-氟尿嘧啶与羟基脲(β13,P=0.006)、喜树碱与羟基脲(β23,P=0.006),两两间存在不同程度的交互作用。从响应面曲线等高线图中可以看出喜树碱和5-Fu之间不呈线性关系,随着浓度的升高曲线呈现弓弧线向外的趋势,可见两者之间表现出协同作用。
[硕士论文] 张艳
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨亚硫酸钠是否通过脂肪细胞来影响肝脏细胞内甘油三酯(TG)与胆固醇含量,为研究亚硫酸钠的肝毒性作用机制提供参考。
  方法:
  将3T3-L1前脂肪细胞进行诱导分化,成为成熟脂肪细胞,并用油红O染色验证;用不同浓度(0.02、0.1、0.5、2.5 mmol/L)Na2SO3和1 mmol/L油酸(OA)染毒脂肪细胞12 h,收集脂肪细胞上清,再分别用上述收集的各组脂肪细胞上清染毒HepG2细胞24 h,即共培养组。另外再用同上述相同浓度(0.02、0.1、0.5、2.5 mmol/L)Na2SO3和1 mmol/L油酸单独培养HepG2细胞24 h,即单独培养组;采用游离脂肪酸(FFA)检测试剂盒测定脂肪细胞上清中FFA含量;采用ELISA法测定脂肪细胞上清中脂联素的含量;采用GPO-POD酶法测定脂肪细胞培养上清中的TG含量;采用有机抽提法提取肝细胞内TG、总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC),再用POD酶法测定其含量;采用western blot法检测Na2SO3对单独培养组和共培养组肝细胞内TG代谢相关蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(AMPKα)、P-AMPKα、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、P-ACC、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FASN)、肉碱酯酰转移酶1(CPT-1)和胆固醇代谢相关蛋白3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)的相对表达水平。
  结果:
  1、与阴性对照相比Na2SO3各处理组脂肪细胞培养上清中FFA和脂联素的含量都明显减少(P<0.05),TG含量无明显变化(P>0.05)。
  2、Na2SO3处理后,单独培养细胞内TG含量无明显变化(P>0.05)。但是2.5 mmol/L亚硫酸钠可引起共培养HepG2细胞内TG的增加(P<0.05)。
  3、Western blot结果显示,Na2SO3处理后,单独培养肝细胞内SREBP-1c、AMPKα、P-ACC、CPT-1无明显变化(P>0.05);2.5 mmol/L Na2SO3组和OA组FASN蛋白表达增高(P<0.05);ACC除0.5 mmol/L Na2SO3变化不明显外,其余各组都升高(P<0.05)。共培养组,P-ACC、SREBP-1c、FASN、CPT-1无明显变化(P>0.05);未检测到P-AMPKα;AMPKα和ACC的蛋白表达均增高(P<0.05)。
  4、Na2SO3处理后,单独培养肝细胞内TC和FC含量的变化不明显(P>0.05);0.5 mmol/L Na2SO3、2.5 mmol/L Na2SO3和1 mmol/L OA可引起共培养组肝脏细胞内TC降低(P<0.05);而2.5 mmol/L Na2SO3和1 mmol/L OA可引起共培养组肝脏细胞内FC含量增加(P<0.05)。
  5、Western blot结果显示,Na2SO3处理后,单独培养组肝细胞内HMGCR表达无明显变化(P>0.05);ACAT蛋白表达水平均增高(P<0.05);2.5 mmol/L Na2SO3使LDLR表达升高(P<0.05)。共培养组,HMGCR和LDLR蛋白表达无明显变化(P>0.05);ACAT蛋白表达增高(P<0.05)。
  结论:
  暴露在较低剂量的Na2SO3环境下时,不会引起肝脏TG和胆固醇的增加。但暴露于2.5 mmol/L较高浓度的Na2SO3环境下,机体不能代谢解毒Na2SO3,则可能通过脂肪细胞的作用使肝脏中TG和FC明显升高,TC的含量降低,对肝脏脂代谢产生影响。
[硕士论文] 王盼
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  以HepG2细胞作为模型,研究甲醛对肝细胞脂质代谢的影响,包括SREBP-1c-FAS通路(甘油三酯代谢相关)及Insig-1-SCAP-SREBPs通路(胆固醇代谢相关)的影响,从而为甲醛所引起的肝细胞脂质代谢紊乱提供依据。
  方法:
  分别以0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 mmol/L的甲醛(formaldehyde,FA)、完全培养基组(阴性对照)、1 mmol/L油酸(oleic acid,OA)及2.5μg/mL布雷德菌素A(Brefeldin A,BFA)处理人肝癌HepG2细胞24 h和48 h,采用MTT法检测细胞活性。分别以0.004、0.02、0.1 mmol/L的FA处理人肝癌HepG2细胞24 h和48 h,用POD酶法来测定细胞内和培养上清中甘油三酯(TG)、游离胆固醇(FC)的含量;采用Western blot法检测甘油三酯代谢相关腺苷酸活化蛋白激酶?(AMPKα)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶?(p-AMPKα)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC1)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC1)、脂肪酸合酶(FASN)、二酰甘油酰基转移酶1/2(DGAT1/2)、甘油三酯水解酶(CES3)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)以及胆固醇代谢相关固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胆固醇酰基转移酶(ACAT)、胰岛素诱导基因1(Insig-1)、裂解激活蛋白(SCAP)、低密度脂蛋白受体(LDLR)的蛋白表达水平;采用ELISA法分别检测细胞内极低密度脂蛋白(VLDL)、载脂蛋白B100(apoB100)、位点1蛋白酶(S1P)及位点2蛋白酶(S2P)的表达水平。
  结果:
  1、甲醛染毒24 h和48 h后,与对照组相比,0.5~12.5 mmol/L FA染毒均可明显降低HepG2细胞活性(P﹤0.05)。
  2、甲醛染毒24 h后,上清中TG水平增加;SREBP-1c、ACC1和FASN蛋白表达在24 h处理后显著增加。DGAT1蛋白表达在0.1 mmol/LFA处理24 h后显著增加,但在其他组表达减少;24 h处理后,CES3蛋白表达显著升高。
  3、甲醛染毒48 h后,细胞内甘油三酯含量明显降低;p-AMPKα蛋白在0.1 mmol/L FA组表达显著增加;SREBP-1c、ACC1和FASN蛋白表达均没有明显的变化;DGAT1蛋白表达降低;ATGL蛋白表达0.004mmol/L FA组表达明显减少。
  4、细胞在染毒处理24 h后,细胞内的游离胆固醇含量升高;HMGCR蛋白在各个处理组表达均明显增加;ACAT蛋白表达在各个处理组均明显降低;SREBP-2蛋白表达在0.1 mmol/LFA及OA组明显降低;Insig-1蛋白在染毒在0.004 mmol/LFA组表达降低,而在其余组表达均明显增加;LDLR蛋白表达在BFA组除外的处理组均明显降低。
  5、细胞在染毒处理48 h后,细胞内游离胆固醇含量明显增加;上清中的游离胆固醇含量在0.004、0.02 mmol/LFA组明显降低;HMGCR蛋白在各个处理组表达均明显增加;ACAT蛋白表达在0.02、0.1 mmol/LFA组有明显的降低;Insig-1蛋白表达水平在0.02、0.1 mmol/LFA组明显降低;LDLR蛋白表达水平在各个处理组均明显降低。
  结论:
  1、高浓度甲醛可明显抑制肝细胞的活性。
  2、甲醛接触可能通过SREBP-1c-FAS通路影响肝细胞甘油三酯的合成及分泌外排。
  3、甲醛接触可能通过Insig-1-SCAP-SREBPs通路影响肝细胞胆固醇的代谢。
  本课题为山西省回国留学人员科研资助项目“亚硫酸盐致肝细胞程序性坏死研究(编号:2014-034)”及山西省留学回国人员科技活动择优资助项目“甲醛对肝脏脂肪代谢的影响及其可能机制(编号:2014-376)”。
[硕士论文] 杨墨
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1、探讨纳米级炭黑颗粒的小鼠亚急性吸入毒性效应,并为纳米级炭黑颗粒的危险性评价提供毒理学数据;
  2、探讨吸入纳米级炭黑气溶胶致小鼠肺组织细胞凋亡损伤机制研究。
  方法:
  1、96只8周龄雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为低剂量组(15mg/m3)、高剂量组(30 mg/m3)和阴性对照组(滤过的洁净空气)。利用气溶胶发生器将纳米级炭黑气溶胶吹入各染毒柜中,每天染毒6 h,连续28 d。染毒期间,实时动态监测染毒柜内炭黑颗粒的粒径分布、空间分布及浓度变化,每周检测一次各组小鼠饲料、水的消耗量及体重的变化情况。末次染毒后24 h,取小鼠静脉血进行血液学及临床生化检查;解剖收集肺、心、肾、脾、肝等脏器,称重计算其脏器系数,并行组织病理学检查;检测肺组织纤维蛋白和细胞凋亡的水平,并应用透射电镜(TEM)观察肺组织的超微结构;支气管肺泡灌洗后,镜下对灌洗液中细胞进行分类计数并测定总蛋白浓度。
  2、15只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为低剂量组(15mg/m3)、高剂量组(30 mg/m3)和对照组,采用全身暴露动式吸入染毒模型连续染毒28 d。末次染毒后24 h,解剖收集小鼠肺脏。肺组织解剖取材后立即剪下适当大小肺组织块,制备成肺组织单细胞悬液,采用DCFH-DA探针标记法检测小鼠肺组织单细胞悬液中活性氧(ROS)的活性;解冻小鼠肺组织后将其制备成10%肺组织匀浆,并在一周内采用酶联免疫吸附法(ELISA)法分别检测肺组织匀浆中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性;分别采用TRIZOL法和RIPA裂解法从小鼠肺组织中提取总mRNA和蛋白,并用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)、免疫印迹(Westen Blot)、及免疫组织化学(IHC)、三种方法检测小鼠肺组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、PARP-1、Fas等凋亡相关蛋白的表达水平。
  结果:
  1、连续染毒28 d后,低剂量组炭黑气溶胶浓度约为(15.31±3.30)mg/m3,高剂量组浓度约为(30.05±14.20)mg/m3。染毒期间各组小鼠饲料、水的消耗量及体重变化均无显著差异。与对照组相比,染毒组小鼠血生化指标未见明显变化,血常规指标中只有红细胞计数、血红蛋白浓度和红细胞比容在染毒组中稍有增加。高剂量组小鼠肺脏器系数明显高于低剂量组和对照组(P=0.016),各剂量组心、肾脏器系数明显降低(P=0.001,P<0.001)。各剂量组小鼠肺组织呈灰黑色,支气管腔、肺泡腔内均可见炭黑颗粒物沉积,肺间质可见吞噬炭黑颗粒的巨噬细胞,且高剂量组炭黑颗粒沉积更多,肺组织纤毛被破坏、肺泡壁结构紊乱、肺间隔增厚、可见充血、炎细胞浸润等病理改变;低、高剂量小鼠肺组织损伤病理评分分别为6.63±1.13和9.8±0.38,明显高于对照组1.66±0.55。高剂量组小鼠脾淋巴细胞略有增多,其余脏器未发现明显异常;纤维蛋白染色可见高剂量组肺间质及支气管外周沉积了大量的纤维蛋白; Tunel细胞凋亡结果可见,各剂量组小鼠肺间质、肺泡腔及支气管腔内均可见棕黄色阳性细胞,高剂量组阳性细胞表达数目更多;透射电镜结果显示,对照组肺组织视野清晰,细胞器完整;低、高剂量组肺组织巨噬细胞内可见吞噬大量炭黑颗粒的囊状物,且初、次级溶酶体增多,肺II型上皮细胞体积增大,线粒体增多。低、高剂量组肺泡灌洗液中总细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数也明显多于对照组。
  2、低、高剂量组肺组织细胞中ROS活性分别是对照组的2.12和3.69倍(P<0.01),而肺组织CAT活性分别比对照组降低了33.66%和30.94%(P<0.01);高剂量组肺组织SOD活性和GSH-px活性明显高于对照组和低剂量组(P<0.05)。小鼠吸入暴露炭黑颗粒28 d后,染毒组小鼠肺组织Bax mRNA的表达水平明显高于对照组(P<0.05),高剂量组Caspase-3、Caspase-7、PARP-1 mRNA的表达水平明显高于对照组和低剂量染毒组(P<0.05),Caspase-8和Caspase-9 mRNA明显高于对照组(P<0.05),各组小鼠Bcl-2和Fas mRNA的表达没有显著差异;各组小鼠肺组织Bax、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP-1蛋白的表达随染毒剂量的增加而呈上升趋势,且染毒组明显高于对照组(P<0.05),Bcl-2蛋白在各组小鼠中的表达无明显变化;免疫组化染色结果显示,各蛋白在染毒组内均有大量阳性细胞表达,明显多于对照组,且多集中在炭黑颗粒沉积的部位。
  结论:
  1、28 d连续吸入染毒纳米级炭黑气溶胶主要引发肺组织损伤,为后续开展纳米级炭黑颗粒肺毒性研究提供较为理想的模型和可靠的分析手段。
  2、长期吸入纳米级炭黑可引起小鼠肺组织氧化损伤和细胞凋亡,氧化应激反应可能是炭黑诱导肺细胞凋亡损伤的机制。内源性线粒体凋亡通路在炭黑颗粒引起的细胞凋亡损伤中扮演着重要的角色。
  本课题为国家自然科学基金“职业暴露柴油机尾气致健康损害生物标志物及其机制研究(编号:81130050)”和“自噬在纳米级碳黑致肺损伤过程中的作用及其机制研究(编号:81502845)”。
[硕士论文] 续志斌
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  检测氯乙烯对大鼠DNA损伤作用,测定大鼠的全基因组DNA甲基化水平,检测癌基因KRAS,损伤修复基因CDKN2A、RASSF1A,DNA烷化损伤修复基因MGMT,抑癌基因SYK基因启动子区甲基化水平及mRNA的表达量改变,探讨氯乙烯致癌在遗传机制和表观遗传机制的关系。
  方法:
  选取96只健康大鼠,按体重随机分成4组,每组24只,分别为阴性对照组和低剂量(5mg/kg)、中剂量(25mg/kg)、高剂量(125mg/kg)三个氯乙烯染毒剂量组;腹腔注射,隔日染毒,每周三次。每组大鼠分别于6、8、12周随机处死8只,取其肝脏,应用彗星实验评价肝细胞DNA损伤水平,DNA甲基化定量检测试剂盒(比色法)检测大鼠肝细胞全基因组甲基化水平,选用甲基化特异性PCR(QMSP)和实时荧光定量PCR(QPCR)分别检测上述基因启动子区甲基化水平及mRNA的表达量。采用SPSS22.0对实验数据进行统计分析,本次实验数据符合正态或近似正态分布,采用单因素方差分析ANOVA进行组间比较,两两比较采用LSD法;相关性分析采用双变量相关分析,选用Pearson相关系数,显著性水平为α=0.05。
  结果:
  1、氯乙烯可诱发大鼠肝脏组织肝细胞坏死,肝脂肪变性,肝硬化等组织病理变化,大鼠肝细胞DNA损伤水平随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长而升高,肝细胞全基因组甲基化水平在染毒组中明显均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.大鼠肝细胞5种基因启动子区甲基化水平的改变:
  2.1.各组别之间比较:氯乙烯染毒6周时,各染毒组大鼠肝细胞MGMT基因启动子区甲基化水平均高于对照组(P<0.05),mRNA的表达量随着剂量的增加而升高;染毒8周时,染毒组KRAS、SYK甲基化水平随着染毒剂量的增加而下降,SYK mRNA的表达量随着染毒剂量的增加而升高;染毒12周时,RASSF1A、MGMT甲基化水平随着染毒剂量的增加而明显升高,RASSF1A mRNA表达量随着染毒剂量的增加而下降。
  2.2.各染毒时间之间比较:对照组中,KRAS、CDKN2A、RASSF1A、MGMT、SYK基因启动子区甲基化水平及mRNA表达量在各染毒时间差异无统计学意义(P>0.05);低剂量组中,MGMT、SYK甲基化水平随着染毒时间的延长而下降,MGMT mRNA表达量随着染毒时间的延长而升高;中剂量组中,KRAS、MGMT、SYK甲基化水平在8周和12周时低于6周(P<0.05),mRNA表达量随着染毒时间的延长而升高;高剂量组中,CDKN2A、RASSF1A基因甲基化水平在6周和8周时低于12周(P<0.05),RASSF1A mRNA表达量在6周和8周明显高于12周(P<0.05)。
  3.大鼠肝细胞DNA损伤和相关基因甲基化相关性分析:大鼠肝细胞DNA损伤与RASSF1A、MGMT基因启动子区甲基化水平呈正相关关系(P<0.05)。
  结论:
  1.氯乙烯可引起大鼠肝细胞DNA损伤增加,全基因组甲基化水平升高。
  2.氯乙烯可引起KRAS和SYK基因启动子区甲基化水平的下降,CDKN2A、MGMT甲基化水平的升高。在短期、低剂量下,氯乙烯可引起RASSF1A启动子区甲基化水平下降,mRNA表达量增加;但当染毒时间延长,染毒剂量增加时,RASS1A启动子区甲基化水平升高,mRNA表达量下降。
  3.氯乙烯引起RASSF1A、MGMT基因启动子区甲基化水平的升高可能影响大鼠肝细胞DNA损伤的修复,使大鼠肝细胞DNA损伤增加。
  本课题为山西省基础研究计划项目(编号:2013011059-1),山西省回国留学人员科研资助项目(编号:2016-056)两项课题资助。
[硕士论文] 石磊
卫生毒理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  采用核磁共振技术,研究苯并(a)芘、大气PM2.5染毒大鼠肝和脑的代谢组学变化,分析其所涉及的代谢通路,探讨苯并(a)芘、PM2.5暴露对大鼠肝和脑损伤的可能机制,为寻找可能的早期生物学标志物,有效防控苯并(a)芘与PM2.5对人体的损害提供新的理论依据。
  方法:
  第一部分:选取24只健康雄性 SD大鼠,体重约为180-200g,随机将其分为4组,分别为溶剂对照组(橄榄油)、低剂量组(1mg/kg)、中剂量组(2.5mg/kg)、高剂量组(6.25mg/kg),每组6只;溶剂对照组腹腔注射橄榄油,低、中、高3个剂量组腹腔注射苯并(a)芘,每天1次,每周连续注射5天,染毒3周。腹主动脉采血,取肝和脑做病理检测和代谢组学检测。
  第二部分:利用 TH-1000CⅡ型大流量空气颗粒物采样器进行采样,采暖期将其放置在车流量较大的交通路口,获取大气 PM2.5颗粒物。选取健康雄性 SD大鼠36只,随机分为对照组(生理盐水1.5ml/kg体质量)、PM2.5低剂量组(1.5mg/kg体质量)、PM2.5中剂量组(6mg/kg体质量)、 PM2.5高剂量组(24mg/kg体质量)、PM2.5水溶性成分组(24 mg/kg体质量)和 PM2.5非水溶性成分组(24 mg/kg体质量),每组6只。采用大鼠气溶胶肺部给药套装,经气管雾化隔天染毒共5次。另选取健康雄性 SD大鼠36只,随机分为0天、1天、3天、5天、7天、9天染毒组,每组6只。采用大鼠气溶胶肺部给药套装,经气管雾化隔天染毒,染毒剂量为24mg/kg体质量。腹主动脉采血,取肝和脑进行病理学和代谢组学检测。
  采用 BRUKER AVANCEⅢ核磁共振(氢谱1H)检测平台,对各次所得的肝和脑组织进行代谢组学检测。运用 MestReNova软件、SIMCA-P11.0软件以及SPSS17.0软件进行分析,找出差异代谢物质。采用 MetaboAnalyst3.0(http://metaboanalyst.ca)并结合HMDB(Human Metabolome Database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等数据库对涉及的相关代谢通路进行初步分析。
  结果:
  第一部分:苯并(a)芘染毒大鼠肝和脑代谢组学研究
  病理学结果:中剂量组肝细胞脂肪样变,高剂量组肝细胞脂肪样变,汇管区淋巴细胞浸润;各组未见脑组织出现明显病理学改变。
  肝代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为26、28、24种。其中有亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、乳酸、甘油磷酸胆碱、精氨酸、糖蛋白随着剂量的升高而升高的趋势,有谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中亮氨酸/异亮氨酸、丙氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸、缬氨酸、精氨酸、3-羟基丁酸显著升高,谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐、乙酰乙酸显著降低(P<0.05);中剂量组中亮氨酸/异亮氨酸、丙氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸、缬氨酸、甘油磷酸胆碱、肌酸、乳酸、甘油三酯、糖蛋白显著升高,谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐、乙酰乙酸显著降低(P<0.05);高剂量组中亮氨酸/异亮氨酸、丙氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸、精氨酸、甘油磷酸胆碱显著升高,谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐、乙酰乙酸显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示苯并(a)芘暴露可导致大鼠肝的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,酮体的合成和降解,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的变化。
  脑代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为18、21、19种。其中有2-氨基乙二酸、苹果酸随着剂量的升高而升高的趋势,有亮氨酸/异亮氨酸、乳酸、N-乙酰糖蛋白、糖蛋白、脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、肌酸、磷酸胆碱、甜菜碱、肌醇、牛磺酸、甘油、谷氨酰胺/谷氨酸盐、赖氨酸、琥珀酸随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中丙氨酸显著升高,脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、甜菜碱、赖氨酸、甘油磷酰胆碱显著降低(P<0.05);中剂量组中苹果酸、N-乙酰天冬氨酸显著升高,脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、甜菜碱、赖氨酸、N-乙酰糖蛋白、糖蛋白、肌酸、磷酸胆碱、肌醇、甘油、谷氨酰胺/谷氨酸盐、琥珀酸、亮氨酸/异亮氨酸显著降低(P<0.05);高剂量组中2-氨基乙二酸显著升高,脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、甜菜碱、赖氨酸、N-乙酰糖蛋白、糖蛋白、肌酸、磷酸胆碱、肌醇、甘油、谷氨酰胺/谷氨酸盐、琥珀酸、乳酸、牛磺酸、甘油三酯显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示苯并(a)芘暴露可导致大鼠脑的丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖异生,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的变化。
  第二部分:大气PM2.5染毒大鼠肝和脑代谢组学研究
  病理学结果:低剂量组汇管区淋巴细胞浸润,中剂量组肝细胞脂肪样变,高剂量组肝细胞脂肪样变,炎性渗出,水溶性成分组肝细胞脂肪样变,非水溶性成分组汇管区淋巴细胞浸润,肝细胞脂肪样变;各组未见脑组织出现明显病理学改变。
  肝代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为23、25、27种。其中有LDL/VLDL、3-羟基丁酸、醋酸盐、肌酸、甘氨酸、甘油磷酰胆碱随着剂量的升高而升高的趋势,有缬氨酸、谷氨酰胺/谷氨酸盐、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中甘氨酸、乳酸显著升高,糖原、蛋氨酸、甘油、乙酰乙酸、琥珀酸显著降低(P<0.05);中剂量组中甘氨酸、乳酸、LDL/VLDL、3-羟基丁酸显著升高,糖原、蛋氨酸、甘油、乙酰乙酸、琥珀酸、谷氨酰胺/谷氨酸盐、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、β-葡萄糖、赖氨酸、谷胱甘肽、天冬氨酸、缬氨酸显著降低(P<0.05);高剂量组中LDL/VLDL、3-羟基丁酸、醋酸盐、肌酸、甘油磷酰胆碱显著升高,糖原、蛋氨酸、甘油、乙酰乙酸、LDL/VLDL、3-羟基丁酸显著升高,谷氨酰胺/谷氨酸盐、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、β-葡萄糖、赖氨酸、谷胱甘肽、天冬氨酸、α-葡萄糖显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化。
  时效关系结果,1、3、5、7、9天组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为25、24、19、21、27种。与0天组相对含量相比,有3-羟基丁酸、磷酸胆碱、亮氨酸/异亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、醋酸盐、丙氨酸、乙酰乙酸、马尿酸盐、肌醇、肌酸显著升高,牛磺酸、甜菜碱、胆碱、谷胱甘肽、天冬氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、糖原、乙酰乙酸、蛋氨酸、甘油、谷氨酸盐、乳酸、缬氨酸、琥珀酸、马尿酸盐、氧化谷胱甘肽、肌醇显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化。
  不同组分结果,水溶性成分组、非水溶性成分组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为23、25种。与对照组相对含量相比,水溶性成分组中肌醇显著升高,甜菜碱、牛磺酸、甘油、谷氨酸盐、谷胱甘肽、天冬氨酸、α-葡萄糖、乳酸、β-葡萄糖显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示水溶性成分可导致大鼠肝的丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化;非水溶性成分组中肌醇、亮氨酸/异亮氨酸、3-羟基丁酸、磷酸胆碱、甘氨酸显著升高,甜菜碱、牛磺酸、甘油、谷氨酸盐、谷胱甘肽、天冬氨酸、α-葡萄糖、乙酰乙酸、蛋氨酸、糖原显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示非水溶性成分可导致大鼠肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化。
  脑代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为16、16、13种。其中有乳酸、γ-氨基丁酸、柠檬酸、磷酸胆碱、甜菜碱、肌醇、牛磺酸随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中γ-氨基丁酸、牛磺酸、N-乙酰基-糖蛋白显著降低(P<0.05);中剂量组中γ-氨基丁酸、牛磺酸、乳酸、磷酸胆碱、甜菜碱、肌醇显著降低(P<0.05);高剂量组中γ-氨基丁酸、牛磺酸、N-乙酰基-糖蛋白、乳酸、柠檬酸显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的变化。
  时效关系结果,1、3、5、7、9天组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为14、17、18、17、16种。与0天组相对含量相比,有乳酸、谷氨酸盐、γ-氨基丁酸、丙酮酸、柠檬酸、赖氨酸、甜菜碱、牛磺酸、甘油三酯、肌酸显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的变化。
  不同组分结果,水溶性成分组、非水溶性成分组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为20、18种。与对照组相对含量相比,水溶性成分组中甜菜碱、γ-氨基丁酸显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示水溶性成分可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的变化;非水溶性成分组中甜菜碱、3-羟基丁酸、乳酸、N-乙酰基-糖蛋白、糖蛋白、氧化谷胱甘肽、脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、肌酸、甘油磷酰胆碱、牛磺酸、赖氨酸、琥珀酸、甘油三酯显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示非水溶性成分可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环这些代谢通路的变化。
  结论:
  1.B(a)P、大气PM2.5短期染毒大鼠后肝和脑出现了小分子代谢谱的改变。
  2.B(a)P短期染毒可引起肝的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,酮体的合成和降解,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的改变,反应了B(a)P引起肝的氨基酸代谢、脂代谢、氧化应激的紊乱;B(a)P短期染毒可引起脑的丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖异生,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的改变,反应了B(a)P引起脑的能量代谢、脂代谢、氧化应激的紊乱。这些紊乱可能与大鼠肝、脑损伤的机制有关。
  3.大气PM2.5短期染毒可引起肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的改变,反应了PM2.5引起肝的氨基酸代谢、氧化应激的紊乱,水溶性成分、非水溶性成分可引起肝的丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的改变,非水溶性成分还可以引起肝的酮体的合成和降解代谢通路的改变,不同组分亦引起氨基酸代谢、氧化应激的紊乱;大气PM2.5短期染毒可引起脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的改变,反应了PM2.5引起脑的脂代谢、能量代谢的紊乱,水溶性成分、非水溶性成分可引起脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环这些代谢通路的改变,水溶性成分还可以引起脑的糖酵解或糖原异生代谢通路的改变,不同组分亦引起脂代谢、能量代谢的紊乱。这些紊乱可能与大鼠肝、脑损伤的机制有关。
[硕士论文] 康静
卫生毒理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.研究己烯雌酚(DES)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、丙基硫脲嘧啶(PTU)三种类型内分泌干扰物对GT1-7神经细胞增殖的剂量效应关系;
  2.研究DES、DBP、PTU对GT1-7神经细胞分泌GnRH的影响及其联合作用;
  3.研究DES、DBP、PTU联合暴露对GT1-7神经细胞分泌GnRH的可能机制。
  方法:
  1.采用永生化的下丘脑GT1-7神经细胞模型,将三种受试物暴露24h后进行相关实验。选择的受试物及其浓度为:DES为0.1、1、10、100、1000μmol/L, DBP为0.01、1、10、100、1000μmol/L,PTU为0.0001、0.01、1、100、1000μmol/L,联合作用的浓度设计为 DES0.1-1000μmol/L, DBP0.01μmol/L, PTU0.0001μmol/L。
  2. CCK-8法检测三种物质单独暴露和联合暴露的GT1-7细胞存活率。
  3. GnRH放免试剂盒检测单独暴露组及联合暴露组细胞培养液中GnRH的分泌量。
  4. Western Blot检测联合暴露组PLC、GPR54、PKC、GnRH蛋白表达量。
  5. RT-PCR检测暴露组PLC、GPR54、PKC、GnRH基因表达量。
  结果:
  1. GT1-7细胞单独暴露于DES时,各染毒组细胞存活率由110%降至4%左右,暴露于DBP时各组细胞存活率由130%降至60%左右,均表现为随浓度的增大细胞存活率呈现先增加后降低的趋势。细胞单独暴露于PTU时,各组的细胞存活率相比对照组有所增加,但基本维持在一定水平120%-135%左右。DES、DBP、PTU单独作用时,其浓度分别低于10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L时GT1-7细胞存活率在90%以上。而GT1-7细胞单独暴露于此三种物质时对GnRH的分泌量的影响则表现为随DES浓度的增大呈现先增加后降低趋势,对照组2.36μg/ml,染毒组由6.26μg/ml降至2.19μg/ml;随DBP浓度的增大呈降低趋势,由对照组2.60μg/ml降至染毒组1.66μg/ml、1.95μg/ml;随PTU浓度的增大呈先增后降趋势,对照组2.3μg/ml,染毒组由3.01μg/ml降至1.46μg/ml。
  2. DES与PTU、DBP与PTU联合暴露时,细胞存活率随浓度增加表现为先增加后降低。相比DES单独作用体系,0.01μmol/L DBP和0.0001μmol/L PTU同时加入到0-10μmol/L DES后细胞存活率显著增加,约为126%-160%,具有统计学差异。0.01μmol/L DBP和0.0001μmol/L PTU加入DES中后,GnRH的分泌量随DES浓度的增加呈降低趋势,表现为对照组4.23μg/ml,染毒组0.75μg/ml和1.50μg/ml。
  3.联合暴露时,Kisspeptins/GPR54信号通路上的各浓度组PKC蛋白表达量为1.8和1.3,各浓度组PLC蛋白表达量为1.11和1.14,及DES为0.1μmol/L的GPR54组蛋白表达量为1.1,上述这些蛋白表达量相比对照组都有所增加;而各浓度组GnRH蛋白表达量为0.9和0.8,及DES为1μmol/L的GPR54组蛋白表达量为0.7,上述蛋白表达量相比对照组减少。而各浓度PKC基因表达量为3.9和2.8,GPR54基因表达量为2.2和1.0,PLC基因表达量为2.1和1.7,上述基因表达量相比对照组都有所增加,GnRH基因表达量0.8和0.6,相比对照组减少。GPR54、PKC、PLC蛋白和基因表达量基本呈增大趋势,细胞内GnRH蛋白及其基因表达量的变化趋势与培养液内GnRH分泌量的变化趋势基本一致,呈降低趋势,这与信号通路上几种主要蛋白表达量的变化呈相反趋势。
  结论:
  1. DES、DBP、PTU在一定浓度下共同暴露对GT1-7细胞增殖呈现联合作用,根据 DES浓度的不同表现为协同和拮抗效应。当0.01μmol/LDBP、0.0001μmol/L PTU和0-10μmol/L DES联合暴露对GT1-7细胞的增殖表现为协同作用,0.01μmol/L DBP、0.0001μmol/L PTU和100μmol/L DES联合暴露则对GT1-7细胞的增殖表现为协同或相加效应。
  2. DES、DBP、PTU在一定浓度下共同暴露对GT1-7细胞培养液中的GnRH分泌呈现联合作用,表现为拮抗效应。
  3. DES、DBP、PTU联合暴露时可能促进Kisspeptins/GPR54信号通路上GPR54、PKC、PLC蛋白和基因的表达而抑制 GnRH蛋白和基因的表达,表明Kisspeptins/GPR54信号通路虽然参与了调控GnRH分泌的过程,但仍可能还有其他信号通路参与并发挥主要作用,具体调控机制以及其他未知的相关机制还有待于进一步研究。
  本课题为国家自然科学基金“食品中不同类型内分泌干扰物联合作用模式与累积风险评估方法学研究(编号:81273081)”。
[硕士论文] 陈彦融
免疫学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  环境污染物对人体的危害主要体现在重要靶器官如肝肾等器官的损害,目前国内外的有关报道也证实一些重金属的环境暴露与动物的转氨酶的变化有一定的相关性。广东贵屿镇是“世界电子垃圾终点站”之一,有着三十多年的电子垃圾作坊拆解历史。我们以往的研究发现贵屿地区儿童血铅、镉等水平明显高于周围其它地区。但迄今为止,电子垃圾回收拆解区人群血液中重金属水平及其肝脏健康效应的相关研究还较少。环境中铅、镉这两种重金属对暴露人群的危害不容小觑,它们对人体的许多器官产生一定的毒性作用,尤其对肝脏代谢等功能产生干扰。铅主要通过消化道,其次是呼吸道及皮肤接触进入人体,可引起肝损害,如肝肿大、黄疸甚至肝硬化或肝坏死。铅可直接损害肝功能;肝内小动脉痉挛引起局部缺血。镉通过富集作用经过消化道进入人体内最后沉积在肝脏和肾脏中,对器官造成严重的损伤。随着铅、镉含量在人体内的蓄积,加剧肝脏细胞受损的程度,因此我们开展本研究来探讨人体内的血铅、血镉水平和血液中肝功能指标的关系。研究目的:通过对电子垃圾拆解区住院患者血铅、镉暴露水平与谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)的活性以及总胆红素(TBIL)等肝功能指标间的相关分析,探讨电子垃圾拆解区铅、镉暴露对当地人群肝功能的影响,为人体肝脏健康提供了科学依据。
  方法:
  于2015年1月至2015年3月,募集267名住院病人,其中暴露组为汕头地区贵屿镇158人(男86人,女72人,平均年龄43.7±21.3岁),参照组为汕头市金平区109人(男61人,女48人,平均年龄47.5±19.4岁);采集肘静脉血2 mL(EDTA-K2抗凝真空采血管),静脉血3mL(无添加剂干燥管)。采用Jena Zeenit650型原子吸收分光光度计,检测外周血中铅、镉的水平;美国贝克曼AU5800全自动生化分析仪,检测肝功能指标;统计学软件SPSS19.0进行分析,显著性水平设为双侧0.05。
  结果:
  1.暴露组一般患者血铅水平高于参照地区(中位数9.7μg/dLvs7.0μg/dL;P<0.01);2.暴露组肝炎患者的血铅水平高于非肝炎患者(中位数10.8μg/dLvs8.1μg/dL;P<0.05);3.两组患者谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转移酶、乳酸脱氢酶和总胆红素进行两两比较,发现暴露组血清γ-谷氨酰转移酶活性高于参照地区(中位数68.0 U/L vs26.0 U/L, P<0.005),暴露组患者总胆红素高于参照地区(中位数15.4μmol/L vs13.3μmol/L,P<0.001)。4. Spearman两因素相关分析发现,暴露组患者外周血铅水平与谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转移酶均呈正相关,血镉水平与谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转移酶均呈正相关。
  结论:
  铅、镉暴露对肝脏功能指标具有一定的毒性效应,可能是危害或加重肝炎患者肝功能紊乱的有害因素。
[硕士论文] 杨天
免疫学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  红细胞表面表达多种黏附分子,包括CD44、CD58。红细胞黏附分子CD44参与淋巴细胞的活化、再循环以及归巢,造血,肿瘤细胞转移和炎症细胞趋化等作用。CD44与配体结合增强T细胞与单核细胞的黏附作用,诱导单核细胞表达IL-1β,促使T细胞活化并释放IL-2。红细胞黏附分子CD58与淋巴细胞表面的CD2结合能促进淋巴细胞合成分泌IL-8,并间接促进T细胞的增殖和分化,改变细胞周期,从而间接调控免疫应答。CD58能刺激单核细胞分泌IL-2,支持T细胞的生长、分化,并广泛参与对免疫应答水平的调节。红细胞CD44和CD58在免疫细胞功能的发挥中起着重要作用。研究表明,铅、镉和持久性有机污染物暴露均对机体免疫系统产生毒性作用。铅暴露通过抑制免疫细胞的活化、增殖和免疫分子的表达,铅中毒后,使红细胞中的氨基乙酰丙酸脱水酶减少,而尿液中5-氨基酮戊酸增多,从而使氧化产生的自由基增多,引起DNA损伤。镉暴露能引起细胞周期阻滞、基因突变和基因组的不稳定性,从而引起细胞凋亡和细胞癌变。研究表明肿瘤患者红细胞免疫黏附肿瘤细胞的能力显著下降,红细胞黏附分子CD44、CD58水平变化与肿瘤的转移和恶化程度有关。本课题组通过对电子垃圾拆解区新生儿脐带血、胎盘组织、儿童外周血中的铅和学龄前儿童尿液中镉的检测显示,血铅和尿镉浓度处于较高水平,学龄前儿童外周血中T细胞水平显著低于参照组,且外周血清中细胞因子的表达水平也存在差异。这提示电子垃圾拆解区儿童的免疫细胞和免疫分子受到了影响,而这些影响可能与红细胞免疫功能的变化有关。因此,研究非正式电子垃圾拆解区铅、镉暴露儿童外周血红细胞CD44、CD58的表达和相关功能,以明确铅镉暴露对当地儿童红细胞的免疫毒性影响具有重要的现实意义。
  目的:
  通过检测儿童血铅和尿镉水平,并检测儿童红细胞CD44、CD58的表达水平及淋巴细胞、单核细胞水平和相关细胞因子浓度,分析重金属铅、镉对红细胞免疫功能的影响,探讨重金属铅镉暴露与红细胞免疫之间的关系。
  方法:
  于2015年11月,募集267名2~7岁学龄前儿童,其中暴露组132名(男性78名,女性54名,平均年龄4.53±0.93岁),参照组135名(男性83名,女性52名,平均年龄4.21±1.09岁)。采用流行病学问卷调查方式收集相关人口学特征、健康信息、儿童体格指标,以及暴露相关因素;采集儿童肘静脉血6 mL,收集儿童空腹晨尿;石墨炉原子分光光度计检测血铅浓度和尿镉水平;采用碱性苦味酸法检测尿肌酐含量;流式细胞术检测红细胞CD44、CD58表达水平;全自动血细胞分析仪检测淋巴细胞、单核细胞数目;Luminex MAGPIX多功能流式点阵仪检测血清中细胞因子的水平。运用 SPSS22.0统计软件,进行两独立样本和配对样本的t检验,两变量间相关性用Spearman法分析,变量间相互依赖的定量关系用线性回归分析;采用GraphPad Prism5.0软件制图。
  结果:
  暴露组儿童红细胞CD44和CD58表达水平低于参照组(68.08±10.73%vs.76.15±9.45%,P<0.01;40.77±7.07%vs.46.32±7.26%,P<0.01)。暴露组儿童的血铅水平明显高于参照组(中位数:6.51μg/dL vs.4.41μg/dL,P<0.01);两组儿童尿肌酐校正前后的尿镉水平差异均无统计学意义。暴露组儿童的LMR比值低于参照组(8.08±3.00 vs.9.02±2.80,P<0.01)。红细胞CD44和CD58表达水平与血铅水平都呈负相关,LMR比值也与血铅水平呈负相关;红细胞CD44和CD58与校正后的尿镉水平都无显著相关性。暴露组儿童血清中IL-1β和IL-8水平高于参照组(中位数:0.49 pg/mL vs.0.25 pg/mL,P<0.01;中位数:3.41 pg/mL vs.2.63 pg/mL,P<0.01),而IL-2水平低于参照组(中位数:4.82 pg/mL vs.8.16 pg/mL,P<0.01)。
  结论:
  环境重金属铅暴露对儿童红细胞 CD44、CD58的表达水平及相关功能产生影响,干扰儿童红细胞免疫功能的发挥,造成儿童免疫功能的损伤。
[硕士论文] 刘云
微生物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:群体感应(Quorum Sensing,QS)是细菌自诱导分子(AI)介导的信号系统。是细菌之间特定的交流方式,即细菌产生信号分子,并将信号分子释放到环境中去,当这些分子的浓度达到与高细胞密度或群体相一致的临界值时,该细菌群体便开始一些特定基因的协调表达,从而使细菌在群体规模上展现出新的行为特征,如生物发光功能、毒力因子的分泌调控、芽孢的形成或生物被膜的形成。关于群体感应系统,以前的研究集中在细菌分泌的信号分子对自身或其他种类细菌的调控,本研究则进一步瞄准在细菌群体信号分子对宿主细胞的影响。旨在通过研究细菌群体感应信号分子3OC12-HSL对宿主细胞的直接作用,进一步揭示群体感应系统在细菌与宿主细胞互作中的功能。本研究选用仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2作为模型细胞进行了如下研究:
  1.基于RNA-Seq筛选细菌群体感应信号分子3OC12-HSL刺激仔猪小肠上皮细胞差异表达基因
  细菌通过群体感应信号分子的合成与吸收,在种群规模进行特定交流,从而调控多种生物学功能;为进一步探寻细菌群体感应信号分子是否不仅作用于细菌,而对宿主真核细胞同样存在直接刺激功能,本研究选用仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2,采用终浓度为100μM的Autoinducer-2(AI-2)、N-Hexanoyl-Homoserine Lactone(C6-HSL),和N-3-oxododecanoylhomoserine lactone(3OC12-HSL)三种来源于不同细菌的重要群体感应信号分子对细胞进行刺激,并以高通量RNA-Seq技术筛选肠道细胞经细菌群体感应分子刺激后的差异表达基因;AI-2组上调1个、下调7个基因;C6-HSL组上调2个、下调8个基因;3OC12-HSL组上调20个、下调15个基因。3OC12-HSL组差异表达基因数最多,故后续分析集中在3OC12-HSL组展开。对差异表达基因进行生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析,3OC12-HSL组的GO功能分类结果显示,这些基因主要涉及到免疫系统、结构分子活性及细胞连接等功能;KEGG分析表明这些差异表达基因参与细胞骨架、致病性大肠杆菌感染、细胞粘附分子(CAM)、细胞外基质外受体的相互作用等信号通路。选择8个差异表达基因(其中7个与细胞骨架/细胞连接相关)进行荧光定量PCR验证,各基因的表达变化趋势与转录组学测序结果一致。本研究为进一步研究细菌群体感应分子在病原菌与宿主互作、直接刺激宿主肠道细胞的作用及其相关机制研究奠定了基础。
  2.细菌群体感应分子3OC12-HSL对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2的影响
  肠道上皮细胞间通过细胞连接的交流调控细胞内稳态,并维持肠上皮细胞防御能力。群体感应系统信号分子不仅可调控细菌毒力,同时参与调控宿主细胞,协助病原菌致病机制,整个过程即跨种间信号传导(interkingdom signaling)。3OC12-HSL对IPEC-J2细胞形态具有明显影响; MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)结果显示,3OC12-HSL对IPEC-J2细胞活性无影响,显示细胞形态变化并非来自与信号分子毒性;利用不同浓度的3OC12-HSL作用IPEC-J2不同时间,结果显示细胞形态变化与浓度及作用时间正相关;低至25μM即可引起细胞形态的明显变化,验证了细胞对与群体信号分子的敏感性;细菌黏附试验结果显示,3OC12-HSL能增强肠致病性大肠杆菌对宿主细胞IPEC-J2的黏附;而细菌侵袭试验结果显示F18ab大肠杆菌对宿主细胞侵袭下降;荧光定量PCR与Western blot结果揭示紧密连接、而不是间隙连接,与群体信号刺激肠上皮细胞机制有关,紧密连接ZO-1蛋白的表达显著增加。
[硕士论文] 张海莉
兽医学;临床兽医学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:汞(Hg)是全球范围内的重金属污染物之一,可在环境中逐步累积,直接或间接地引发动物和人的各种疾病。Hg毒性从50年代在日本和70年代在伊拉克大范围爆发后,直到现在仍是一个全球性的问题。每年约有100吨有机汞和无机汞排放到自然界中,其主要来源包括:农业中的杀虫剂、工业冶炼、汽车尾气的排放和化妆品等。Hg是一种高毒性的金属物质,可在生物体内生物转化为高毒性代谢物,从而引起生化改变和氧化应激。肝脏是主要的“解毒器官”,受到的损伤尤为严重。木犀草素(Luteolin,Lut)是一种天然黄酮类化合物,存在于多种植物中,拥有抗氧化、抗炎和抗凋亡等功能。本研究旨在探讨在大鼠体内Lut对HgCl2诱导的肝损伤的生物学效应。
  在体内实验中,选用6-8周龄、体重在110-130g之间的Wistar大鼠28只,随机平均分为4组,Control组,Lut参照组,HgCl2中毒组和HgCl2+Lut解毒组(每组7只),实验周期共为30天。Control组大鼠自由饮水,每天灌服用于溶解Lut的1% DMSO(1 mL/kg); Lut组大鼠自由饮水,每天灌服80mg/kg Lut溶液;HgCl2组大鼠饮水中添加80 mg/L HgCl2,每天灌服1% DMSO; HgCl2+Lut组大鼠饮水中添加80 mg/L HgCl2,每天灌服1% DMSO,最后两周每天灌服80 mg/kgLut溶液。饲养结束后,对实验动物的血液和组织进行样品的采集。肝损伤指标:丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(Aspartatetransaminase,AST)的活性,丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量,肝脏组织的病理学变化,使用原位末端标记(Terminal Deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick-End Labeling,TUNEL)的方法,检测了肝脏中细胞凋亡率。此外,运用基因检测(RT-PCR)和蛋白检测(Western blot)技术对Nrf2/NF-κB/P53通路及其相关因子进行检测。
  在体外实验中,开展了肝脏细胞的原代培养,分别进行HgCl2和Lut添加,分组如下:Control组、Lut组(20μM)、HgCl2组(5μM)和HgCl2(5μM)+Lut(20μM)组,首先添加Lut孵育2h后再加入HgCl2孵育24 h。然后严格遵照说明书提供的方法,对肝细胞进行了检测,其中包括:反映肝细胞活率的CCK-8试验和反映肝细胞活性氧水平的试验。
  结果表明:(1) Lut能够降低Hg在体内的蓄积。(2)血液指标中,HgCl2组红细胞和血小板减少、白细胞增多;肝酶AST和ALT检测中,HgCl2组均升高;病理切片井镜下观察,HgCl2组肝脏组织发生明显的病变,这些均表明HgCl2引起了严重的肝损伤,而在HgCl2+Lut组,这些改变均得到了明显的缓解,表明Lut能够减轻HgCl2诱导的肝损伤。(3) HgCl2+Lut组,MDA、ROS和TUNEL降低,GSH、GSH/GSSG和CCK-8升高,这些结果表明Lut减弱了HgCl2诱导的氧化应激和细胞凋亡。(4) HgCl2+Lut组Nrf2通路相关蛋白Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达显著高于HgCl2组。与HgCl2组比较,Lut降低了Bax、NF-κB、P53的蛋白表达,且增加了Bcl-xl、Bcl-2蛋白表达。
  综上所述,减少氧化应激是Lut减轻HgCl2诱导的肝损伤的重要机制。Lut通过调节Nrf2/NF-κB/P53信号通路在大鼠中具有预防或治疗无机汞诱导的肝损伤的功效。
[硕士论文] 罗旖旎
卫生毒理学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:[目的]研究锰对大鼠原代小胶质细胞氧化损伤和炎症因子白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、前列腺素2(PGE2)表达的影响,探讨对氨基水杨酸钠(PAS-Na)对锰导致的小胶质细胞损伤的干预作用。
  [方法]
  (1)原代培养的小胶质细胞经过分离提纯和鉴定后,①锰毒性试验:种于96孔板中的细胞分别给予0、200、300、400、500μmol/L浓度MnCl2处理24h。②PAS-Na无毒筛选试验:孔接种于96孔板中的细胞分别给予0、50、150、450μmol/L浓度PAS-Na处理24h。③PAS-Na干预试验:小胶质细胞被随机分为对照组、染锰组、PAS对照组、50、150、450-PAS干预组,其中对照组、染锰组、PAS对照组给予正常DMEM完全培养基,50、150、450-PAS干预组给予400μmol/L浓度MnCl2处理24h后,对照组给予正常DMEM完全培养基换液,染锰组给予400μmol/L浓度MnCl2处理24h,PAS对照组给予450μmol/L浓度PAS-Na处理24h,50、150、450-PAS干预组分别加入50、150、450μmol/L浓度PAS-Na处理24h。
  (2)用MTT试剂测定小胶质细胞存活率,DCFH-DA探针标记小胶质细胞氧化损伤情况,酶联免疫吸附法测定细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2炎症因子含量,荧光定量PCR检测小胶质细胞IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达。
  [结果]细胞存活率检测:低浓度的MnCl2能刺激原代小胶质细胞的增殖存活率增加,高浓度MnCl2对小胶质细胞有一定的细胞毒性,MnCl2处理24h后小胶质细胞存活率在400μmol/L和500μmol/L组比对照组低。PAS-Na处理24h后,与对照组比较,各剂量处理组细胞形态和存活率没有明显变化。染Mn24h,50、150、450μmol/L浓度PAS干预24h后,染Mn组细胞存活率比对照组低。与染Mn组比较,50、150、450-PAS干预组小胶质细胞存活率升高,差异有统计学差异。细胞内活性氧DCFH-DA标记检验:发现Mn处理可以显著增加细胞活性氧的生成,50、150、450-PAS干预组细胞活性氧生成比染Mn组少。细胞上清炎症因子:与对照组相比,MnCl2使小胶质细胞上清液中IL-1、TNFα分泌增加,差异有统计学意义。50、150、450-PAS干预组细胞TNFα表达低于染Mn组。小胶质细胞IL-1β、TNF-α mRNA表达:与对照组相比,染Mn组IL-1β、TNFα mRNA表达量增加,差异有统计学意义。50、150、450-PAS干预组小胶质细胞IL-1β mRNA表达低于染Mn组。150、450-PAS干预组小胶质细胞TNF-α mRNA表达低于染Mn组。
  [结论]
  (1)过量锰暴露会对原代小胶质细胞造成损伤,导致细胞内活性氧生成,IL-1β、TNF-α mRNA表达量升高,其对应的炎症因子IL-1β、TNF-α分泌增加。
  (2) PAS-Na对锰导致的小胶质细胞损伤具有一定的干预作用,这可能与PAS-Na的抗氧化和抗炎作用有关。
[硕士论文] 熊枫
卫生毒理学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:检测原代海马神经元经不同浓度锰染毒后其lncRNA及mRNA的表达情况,通过生物信息学的方法分析、预测并初步验证由哪些基因、lncRNA以及microRNA可能形成ceRNA调控模型通路,为进一步研究lncRNA在锰致神经毒性中的可能作用提供线索。
  方法:培养SD大鼠的原代海马神经元随机分成4组,至第4天分别以0、100、400、800μ M浓度的氯化锰溶液染毒24小时,芯片检测海马神经元中lncRNA以及mRNA的表达情况,使用从聚法分析不同浓度染锰后原代海马神经元中mRNA和lncRNA的总体表达谱;火山图用于表示筛选出统计学差异大于等于2倍和p小于等于0.05的mRNA和lncRNA差异表达情况;GO分析用于将差异表达的mRNA进行功能归类注释;Pathway分析用于研究差异表达mRNA的代谢通路;交叉分析用于找出锰暴露后海马神经元中共同上调或下调的mRNA和lncRNA;利用lncRNA与mRNA的共表达网络并通过target scan、blast比对等工具预测可能的ceRNA通路,并通过Q-PCR检测相应基因、lncRNA及microRNA在不同浓度染锰后的大鼠神经元中的表达水平。
  结果:
  (1)芯片测试结果表明,100μ M组与0μM组相比,表达差异的mRNA共1848个,其中972个上调,876个下调;表达差异的lncRNA共566个,其中337个上调,229个下调(差异均大于2倍且P<0.05)。400μ M组与0μ M组相比,表达差异的mRNA共3328个,其中1435个上调,1793个下调;表达差异的lncRNA共1161个,其中589个上调,572个下调(差异均大于2倍且P<0.05)。800μM组与0μM组相比,表达差异的mRNA共4022个,其中1828个上调,2194个下调;表达差异的lncRNA共1474个,其中839个上调,635个下调(差异均大于2倍且P<0.05)。
  (2) GO分析结果表明,差异表达的mRNA参与到生物途径、细胞定位以及分子功能中;pathway分析结果表明,100μ M组与0μM组相比,最富集的信号通路是胰岛素分泌和细胞周期;400μ M组与0μ M组相比,最富集的信号通路是类风湿性关节炎和DNA复制;800μ M组与0μ M组相比,最富集的信号通路是胰岛素分泌和DNA复制。
  (3)交叉分析结果表明,和0μM组相比,100、400、800μM组海马神经元中共同上调的有135个lncRNA和373个mRNA,共同下调的有150个lncRNA和560个mRNA。
  (4) lncRNA与mRNA共表达分析结果表明,Pearson相关系数达98%以上的共表达相关组合共9个,选取基因Arsi并使用target scan检索到与其一致性分值最高的microRNA-125b,通过blast比对及预测工具发现基因Arsi,microRNA-125b,lncRNA-BC089928三者可能形成ceRNA调控通路。
  (5) Q-PCR验证结果表明,随着染锰浓度的升高,基因Arsi与lncRNA-BC089928的表达显著下调,而microRNA-125b的表达则显著上调,三者很可能形成ceRNA调控模型。
  结论:不同浓度染锰后的海马神经元中存在不同数量表达差异的mRNA和lncRNA,并存在一定数量共同上调或下调的mRNA和lncRNA,且lncRNA-BC089928可能通过与microRNA-125b共同调控基因Arsi形成ceRNA调控通路,提示lncRNA可能在锰致海马神经元神经毒性中发挥了重要作用。
[硕士论文] 陈易斯
劳动卫生与环境卫生学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)是工业生产中广泛使用的有机磷化合物。人类暴露TOCP可导致一种迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN)的发生,到目前为止其确切发生机制尚不清楚。以前的研究显示OPIDN中神经轴突的病理变化与物理截断引起的轴突wallerian变性相似,即神经轴突自末端向胞体进行性地变性、解体。自噬是真核细胞中负责蛋白质和细胞器清除的主要机制,对于神经元维持自身稳态具有重要作用。众多研究证明神经元自噬异常和轴突变性有关。在本研究中,我们利用自噬相关基因Atg7敲除的自噬缺陷N2a细胞建立中毒模型,研究自噬在TOCP诱导的Neuro-2a(N2a)轴突损伤中的作用,探索TOCP诱导迟发性神经病的发生机制。
  方法:
  1.细胞毒性实验:CCK8方法测试不同浓度TOCP对N2a细胞增殖的影响,确定OPIDN细胞模型中TOCP染毒剂量。
  2.细胞分化实验:培养野生型和Atg7基因敲除的自噬缺陷型N2a细胞,分别使用低血清和视黄酸(Retinoic acid, RA)两种方法诱导野生型N2a细胞(Atg7+/+N2a)和自噬缺陷N2a细胞(Atg7-/-N2a),分化24h、48h,直至呈现典型的神经元形态。
  3.细胞分化能力和轴突损伤情况检测实验:利用0、1.25、2.5、5、10、20μMTOCP处理Atg7+/+N2a细胞,观察毒物对细胞分化能力的影响。在此基础上,以0、5、10μM浓度的TOCP染毒低血清和视黄酸两种方法诱导分化的Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞,观察比较两种N2a细胞轴突变化情况。
  4.细胞免疫荧光实验:使用免疫荧光法检测0、5、10μM TOCP处理后的Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞中轴突转运蛋白dynaction和自噬标志蛋白LC3B的变化水平。
  5.蛋白免疫印迹实验:Western blotting检测Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞中LC3、p62、p-p62、beclin-1、Ub、k48-Ub、k63-Ub等自噬相关蛋白,kinesin、dynactin等轴浆运输马达蛋白,以及促进轴突损伤相关蛋白SARM1的表达和MAPK信号通路关键分子的磷酸化水平的变化。
  6.实时荧光PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)实验:使用Q-PCR检测细胞自噬相关基因LC3B、beclin1和转录因子EB的mRNA表达情况,以及轴突变性相关的关键分子calpain-1、calpain-2、nmnat-2、sarm1、DLK和scg10等基因的mRNA表达水平。
  结果:
  1.CCK8法检测结果显示,TOCP染毒剂量超过20μM后,随着剂量的增加,对细胞增殖抑制作用越来越明显,直至超过1000μM后细胞活性为零。
  2.低血清和RA两种方法诱导48h之后均可使两种N2a细胞分化成功,即突起长度超过胞体两倍。其中,RA诱导分化的细胞轴突分化长度更明显。
  3.①Atg7+/+N2a细胞染毒TOCP之后,明显影响了其分化能力,且随着剂量的增加,抑制分化能力越明显。②使用TOCP染毒后,两种细胞轴突长度明显缩短,且随着TOCP染毒剂量增加,轴突损伤逐渐加重。同一剂量下,Atg7-/-N2a细胞轴突缩短程度相较于野生型的小。
  4.免疫荧光结果显示,随着TOCP染毒剂量的增加,两种细胞中轴突微管马达蛋白Dynactin表达下降,标记自噬泡绿色荧光亮点增多。两种细胞间无显著性差异。
  5.Western blotting实验结果显示:Atg7+/+N2a细胞中beclin-1含量减少,LC3-Ⅱ含量明显增加,Atg7-/-N2a细胞中beclin-1同样呈现下降趋势,LC3-Ⅱ不表达。两种细胞中p-p62水平上调,Atg7-/-N2a细胞中p-p62表达量更高。高剂量组两种细胞中轴突运输马达蛋白dynactin和kinesin表达均减少。两种细胞中K48-位点泛素蛋白水平增加,Atg7-/-N2a细胞表达量更高。Atg7+/+N2a细胞中对轴突损伤具有促进性作用的激酶p-p38、p-p42/p44磷酸化水平上升,p-jnk表达下调,蛋白SARM1表达增加,而Atg7-/-N2a细胞中除激酶p-p38呈现上升趋势外,其余均无显著性差异,p-p42/p44在两种细胞间变化具有统计学差异,Atg7+/+N2a细胞磷酸化水平更高。
  6.荧光定量PCR检测发现:自噬相关基因LC3B、beclin1、转录因子EB的mRNA水平在两种细胞中随着药物剂量的增加而逐步上升。calpain-1在高剂量染毒的Atg7+/+N2a细胞中激活,而在Atg7-/-N2a细胞中calpain-1、 calpain-2均被激活。对轴突损伤起保护作用nmnat2基因表达情况是:Atg7+/+N2a细胞逐步上升,而Atg7-/-N2a细胞呈下降趋势,0、5μMTOCP处理组中Atg7-/-N2a细胞表达量更高。同轴突损伤相关的sarm1在高剂量染毒的两种细胞中显著性增加。高剂量组Atg7+/+N2a细胞中DLK含量上升,而Atg7-/-N2a细胞却呈现相反趋势。
  结论:
  1.TOCP染毒影响了Atg7+/+N2a和Atg7-/-N2a细胞的分化能力,并能引起已分化的N2a细胞的轴突损伤,其中Atg7+/+N2a细胞的损伤程度比Atg7-/-N2a细胞更加严重。
  2.TOCP染毒引起N2a细胞自噬激活,而Atg7-/-N2a基因敲除导致细胞自噬活性丧失,同时影响了细胞中促轴突存活和促细胞死亡信号关键因子NMNAT2、Sarm1、DLK和MAPK激酶等。
  3.自噬基因Atg7敲除能减轻三邻甲苯磷酸酯对Neuro-2a细胞轴突的损伤。
[硕士论文] 李丽
营养与食品卫生学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)作为一种新型环境有机污染物受到了研究者的广泛关注,其生产量和使用量一直处于较高水平且呈现逐年增加的趋势。TDCIPP作为添加剂应用于纺织、家具、电子产品、婴幼儿产品等各行各业中,可经过一系列的转化过程逐渐渗入到环境介质中。环境及生物监测研究发现,在水、室内外空气、土壤、灰尘等环境介质中,甚至鱼类、鸟类等生物体内均检测到不同浓度范围的TDCIPP,有些样本中的含量甚至超越了溴代联苯醚的水平。人类可通过摄食、吸入及皮肤吸收等多种途径暴露TDCIPP,目前已经在人类的尿液、乳汁以及胎盘中都检测到TDCIPP及其代谢产物的存在。因此,评价TDCIPP潜在的毒性以及对环境健康的影响已经刻不容缓。已有研究表明,TDCIPP能够对哺乳类动物产生甲状腺内分泌干扰毒性以及潜在的神经毒性。本研究以多巴胺能神经元模型(PC12细胞)为受试对象,初步探讨TDCIPP的毒性效应以及可能的分子机制。
  目的:
  建立有机磷酸酯阻燃剂TDCIPP致PC12细胞损伤模型,并观察TDCIPP暴露产生的毒性效应;应用数字基因表达谱(DGE)测序技术筛选TDCIPP暴露致PC12细胞损伤的差异表达基因并加以验证,进而探讨TDCIPP致PC12细胞损伤的毒性作用机制。为评价TDCIPP毒理学机制提供数据支持。
  方法
  1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:
  1.1、实验分组及处理:分化的 PC12细胞分为5组:
  ①正常对照组(Control组):含有细胞的培养液;
  ②TDCIPP暴露组,暴露剂量为7.5,15,30,60μM,共4组。每组设置3-6个复孔。
  1.2、TDCIPP对PC12细胞生存率的影响:培养PC12细胞并刺激分化为多巴胺能神经元细胞,按实验分组分别暴露TDCIPP24 h和72 h,采用CCK-8法检测TDCIPP暴露对PC12细胞生存率的影响,并确定TDCIPP的暴露时间;
  1.3、TDCIPP对PC12细胞氧化应激的影响:分化的PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP72 h,采用分子探针DCFH-DA试剂盒,以流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)的含量;采用酶联免疫吸附法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。
  1.4、TDCIPP对 PC12细胞凋亡的影响:分化的 PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP72 h,采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒,以流式细胞仪检测细胞凋亡率;并利用Western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达量。
  2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:
  2.1、实验分组及处理:用于DGE测序分析的实验分组为:正常对照组(C组)以及60?M TDCIPP暴露组(H组);用于qRT-PCR以及Western blot检测的实验分组同1.1小节;暴露时间均为72 h,每个实验均设置3个复孔。
  2.2、分化的PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP后,运用DGE测序技术检测PC12细胞mRNA表达情况,筛选出差异表达的基因,并通过GO富集和KEGG富集寻找可能的代谢通路产生的影响;
  2.3、分化的PC12细胞按实验分组进行TDCIPP暴露处理,选取6个显著表达的差异基因(Myc、p21、Lamb3, col1a1,THBS和CREB),运用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证DGE测序数据的准确性;
  2.4、分化的PC12细胞按实验分组进行TDCIPP暴露处理,采用Western blot技术检测PC12细胞中磷酸化PI3K/Akt及非磷酸化PI3K/Akt/Myc/p21蛋白的表达量。
  结果:
  1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:
  1.1、TDCIPP对PC12细胞生存率的影响:不同剂量的TDCIPP暴露PC12细胞24 h、72 h后,细胞的生存率均随暴露剂量的升高而降低,呈现剂量效应关系;在相同的暴露剂量下,72 h暴露所致细胞生存率的降低程度高于24 h暴露;当TDCIPP剂量为60μM、暴露72 h时,细胞存活率为(58.15±0.78)%,接近半数致死浓度,故选取72 h作为暴露时间;
  1.2、TDCIPP对PC12细胞氧化应激的影响:与对照组相比,TDCIPP暴露组细胞内ROS的含量呈上升趋势,且在30,60μM剂量时具有显著性差异(P<0.01);SOD与GSH的含量随TDCIPP暴露剂量的升高而降低;MDA含量则呈现升高的趋势;
  1.3、TDCIPP对PC12细胞凋亡的影响:与对照组相比,TDCIPP暴露组细胞凋亡率明显升高,呈现剂量依赖的关系,在15,30,60μM暴露组所致细胞凋亡率的增加具有统计学意义(P<0.01),且在最高暴露剂量60μM时,细胞的凋亡率增加了5.7倍;抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,而促凋亡蛋白Bax表达升高,Bcl-2/Bax的相对比值则随着TDCIPP暴露浓度的增加呈现下降的趋势,且各暴露组与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。
  2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:
  2.1、DGE测序数据显示:每个样本的数据量均大于3.27G,满足生物信息分析的需要;每个样本的数据与参考基因比对结果均在85%以上,说明测序深度和广度很好;共筛选出161个差异表达的基因,其中49个基因上调,112个基因下调。GO富集和KEGG富集分析结果显示,TDCIPP暴露于PC12细胞后,差异基因多涉及羧酸代谢、氨基酸代谢、PI3K/Akt信号通路及细胞外基质受体等调控通路;
  2.2、所选取的6个基因的mRNA相对表达量,与DGE测序结果变化趋势相一致;将选取的6个基因的qRT-PCR结果与DGE测序结果进行皮尔逊相关性检验以及简单线性回归分析,结果显示:皮尔逊相关系数为0.801,且P值小于0.01,两者结果呈现显著的正相关性;决定系数R2=0.642,这表明DGE测序结果能较好的代表qRT-PCR检测结果。以上结果表明DGE测序得到的差异表达基因结果可信,能够很好的体现TDCIPP暴露后,对PC12细胞基因的变化情况,以及随之可能引起的毒性效应;
  2.3、TDCIPP暴露PC12细胞后,PI3K/Akt的磷酸化水平呈现浓度依赖性的降低,非磷酸化水平在各剂量的暴露下均无统计学改变;Myc mRNA与蛋白表达水平降低;p21 mRNA与蛋白表达水平呈现剂量依赖性的上调表达。
  结论:
  1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:TDCIPP暴露能够降低PC12细胞的生存率;破坏氧化、抗氧化系统的稳定性,使PC12细胞产生氧化应激反应,ROS含量增多,SOD和GSH的含量降低,脂质过氧化产物增多;促使PC12细胞凋亡的产生,从而造成细胞的损伤。
  2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:利用DGE技术发现,TDCIPP暴露致使PC12细胞产生毒性效应可能归因于抑制了PI3K/Akt信号通路的激活,PI3K/Akt的磷酸化水平降低;Myc mRNA与蛋白水平降低,p21 mRNA与蛋白水平呈现剂量依赖性的上调表达,从而引起PC12细胞凋亡率的增加,造成细胞的损伤。
[硕士论文] 孔正桥
卫生检验学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:[研究目的]:
  反式脂肪酸(trans-fatty acids,TFA)是在反式构型中具有至少一个非共轭双键的不饱和脂肪酸[1]。因可长期保存及其理化性质的稳定性和半溶性,反式脂肪酸被广泛应用于食品加工行业,如各类油炸食品,甜点等。大量研究证实,反式脂肪酸的过量摄入会影响人体的生长发育;此外,反式脂肪酸的过量摄入与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、冠心病(coronary heart disease,CHD)、2型糖尿病及癌症等疾病相关。有研究表明,反式脂肪酸具有一定的神经毒性,可穿过血脑屏障,在额叶皮层、海马、纹状体等处的神经细胞内沉积,并与以渐进性记忆障碍、认知功能障碍为特征的阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)表现出一定的相关性。然而,反式脂肪酸是否导致认知功能障碍及其相关机制并不明确。
  因此,我们采用反式脂肪酸灌胃12周,通过Morris水迷宫实验,观察反式脂肪酸对小鼠学习记忆的影响;通过苏木素-伊红染色观察反式脂肪酸对小鼠海马形态学的影响;采用生物化学实验检测反式脂肪酸染毒小鼠大脑皮层超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase, CAT)的活力以及脂质过氧化蛋白加合物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量变化;检测反式脂肪酸染毒小鼠脑组织Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶、乙酰胆碱酯酶(acetylocholinesterase,AchE)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的活力值;采用高效液相色谱法检测氨基酸类神经递质:谷氨酸(glutamic acid,Glu)、甘氨酸(glycine,Gly)、天门冬氨酸(aspartic acid,Asp)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)及牛磺酸(taurine,Tau)的含量。探讨反式脂肪酸对小鼠认知功能的影响,及其与大脑氧化应激和氨基酸类神经递质的关系。
  [研究方法]:
  1.实验动物分组及处理:选取SPF级雄性昆明小鼠56只,体重(18-22)g,分笼饲养,进食饮水自由。适应性饲养1周后,随机分为4组并均衡体重,分别为对照组和低、中、高剂量反式脂肪酸染毒组,每组14只。各剂量反式脂肪酸染毒组动物分别给予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg反式脂肪酸,对照组给予等体积的玉米油。所有实验动物均采用灌胃方式进行染毒,染毒容量均为0.1 ml/10g,每周6次,连续染毒12周。每周称量并记录小鼠体重,以调整灌胃剂量。
  2.小鼠认知功能测定:反式脂肪酸灌胃结束后,每组随机选取12只小鼠进行连续6天的Morris水迷宫测试(第一天为训练,不记录数据)。通过定位航行实验和空间探索实验对小鼠的认知功能进行综合评价。其中,定位航行实验通过测定小鼠的逃避潜伏期和游泳总路程反应实验小鼠的学习能力;空间探索实验通过测定穿越平台次数反映小鼠的记忆能力。
  3.小鼠脑组织损伤病理形态学观察:制备小鼠大脑的石蜡切片,采用苏木素-伊红(H&E)染色法检测小鼠海马的形态学变化。
  4.小鼠大脑氧化应激指标检测:按照相关试剂盒的说明测定脑组织中SOD、GSH-Px、CAT的活力值以及MDA的含量。
  5.小鼠脑组织ATP酶活力检测:按照相关试剂盒说明检测Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力值。
  6.小鼠脑组织AchE、NOS活力检测:制备小鼠大脑组织匀浆,按照相关试剂盒说明,检测小鼠脑组织AchE和NOS活力值的变化。
  7.小鼠脑组织氨基酸类神经递质检测:采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测小鼠脑组织中Glu、Gly、Asp、GABA、Tau的含量。
  [结果]:
  1.反式脂肪酸染毒对小鼠一般生长发育的影响
  对照组及各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠一般状况良好,小鼠体重随实验进行缓慢增加,各组体重增量差异无统计学意义(p>0.05)。
  2.反式脂肪酸对小鼠学习记忆功能的影响
  Morris水迷宫数据显示:随训练时间的延长,各实验组小鼠逃避潜伏期及游泳总路程均呈下降趋势,各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠与对照组相比逃避潜伏期、游泳总路程、平均游泳速度、穿越平台次数等各指标差异均无统计学意义(p>0.05)。
  3.反式脂肪酸染毒对小鼠海马结构影响的形态学观察
  海马形态学观察显示:与对照组相比,各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠海马组织中,组成海马外形的神经细胞线变得细且模糊。高倍镜显示,海马CA2、CA3区神经细胞数不同程度减少,排列疏松。
  4.反式脂肪酸染毒对小鼠大脑皮层SOD、GSH-Px、CAT活力及脂质过氧化蛋白加合物MDA含量的影响
  与对照组相比,各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活力均降低(p<0.05),而脂质过氧化蛋白加合物MDA含量明显升高(p<0.05)。反式脂肪酸各剂量组间各酶活力及MDA含量差异无统计学意义(p>0.05)。
  5.反式脂肪酸染毒对小鼠脑组织Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力值的影响
  与对照组相比,低、中、高剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织Na+/K+-ATP和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力值降低(p<0.05)。
  6.反式脂肪酸对小鼠脑组织AchE和NOS活力值的影响
  与对照组相比,低、中剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织AchE活力值降低(p<0.05)。
  小鼠脑组织中,高剂量反式脂肪酸染毒组NOS活力值与对照组相比显著升高(p<0.05)。低、中剂量反式脂肪酸染毒组NOS活力值与对照组相比呈增高趋势,但无统计学差异(p>0.05)。
  7.反式脂肪酸对小鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的影响
  与对照组相比,低、中剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中Glu,Gly,Asp,GABA,Tau含量升高(p<0.05);高剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中Glu,Gly,Asp,GABA,Tau含量也呈升高趋势(p>0.05)。
  与对照组相比,低、中剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中谷氨酸与γ-氨基丁酸的比值增加(p<0.05);高剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中谷氨酸与γ-氨基丁酸的比值增加(p>0.05)。
  [结论]:
  1.大脑是反式脂肪酸毒作用的敏感靶器官,反式脂肪酸暴露可导致小鼠海马形态发生变化。
  2.反式脂肪酸可导致小鼠脑组织抗氧化系统损伤。
  3.反式脂肪酸可以影响小鼠脑组织AchE和NOS活力。
  4.反式脂肪酸具有兴奋性神经毒性,并且能够影响ATP酶。
[博士论文] 王硕
卫生毒理学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  正己烷(n-Hexane)是工业生产中一种常用的有机溶剂,主要用作粘合剂、油漆的生产原料,植物油的提取剂以及电子产业中的清洁剂。研究显示长期低浓度的正己烷暴露可导致职业中毒的发生,以感觉运动型周围神经损伤为主要临床特征。早期表现为肢体远端发麻、刺痛、蚁走感,手足发凉多汗、触觉减退,多成对称性分布,进一步发展可表现为肌力减退、下肢行走困难,严重了造成肌肉萎缩和瘫痪。1957年意大利报道了首例制鞋工人正己烷神经中毒的案例,随后日本、美国、加拿大、韩国、巴西等国家也相继出现了集体性正己烷职业病中毒的报道。中国从上世纪70-80年代开始发生正己烷中毒,随后逐年不断增加。正己烷导致神经病变的发生主要通过其代谢产物2,5-己二酮(2,5-HD)介导,但其分子机制至今尚不明确且无特效药物治疗。经对症治疗,一般需半年至一年才能恢复健康,部分严重中毒病例不能完全恢复。由于正己烷慢性中毒患者以中青年居多,不仅严重损害了患者本人的身心健康,同时也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此,开发安全有效正己烷中毒防治药物,既有利于其治疗,又可进一步阐明其中毒机制,具有非常重要的理论和现实意义。
  二烯丙基三硫(DATS)是大蒜的一种重要活性成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗动脉粥样硬化等多重功效,还能够对多种P450酶起到调节作用。实验室之前的研究表明大蒜油对正己烷中毒具有保护作用,其机制与影响正己烷代谢和抵抗氧化应激有关,而大蒜油中DATS的含量占到50%以上,因此DATS有可能是大蒜油发挥拮抗正己烷毒性的活性成分。综合DATS多重功效及其对代谢的调节作用,我们认为其可能是大蒜油拮抗正己烷中毒的活性成分。
  胱胺是一种具有神经保护作用的氨基二硫化物,对帕金森氏症(PD)、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)等多种神经退行性疾病具有很好的预防和治疗作用。胱胺不但能够促进神经营养因子的分泌,而且具有抗氧化、抑制神经细胞凋亡、抵抗神经系统的炎症反应等多重功效但是至今为止尚没有关于胱胺预防和治疗外源化学物引起的周围神经病变的报道。
  因此,本研究为了探讨DATS和胱胺对正己烷神经损伤的保护作用,分别通过正己烷和2,5-HD经口灌胃染毒建立正己烷周围神经损伤模型,给予DATS和胱胺干预,通过相关行为学指标评价其干预效果;并进一步分别从代谢和分子生物学角度对DATS和胱胺发挥作用的机制进行了探讨。最后,通过DATS和胱胺的联合给药,评价其共同拮抗正己烷中毒性周围神经病的效果。
  研究方法:
  1.DATS对慢性正己烷神经损伤的保护作用
  Wistar大鼠72只,随机分为6组,即对照组、模型组、DATS对照组、低中高剂量DATS干预组。DATS对照组(30 mg/kg)和低中高剂量DATS组(10,20,30 mg/kg)动物每天经口给予DATS,其余动物给予等体积玉米油;2h后,除对照组和DATS对照组外,其余动物经口给予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天,连续染毒8周至模型组动物出现明显瘫痪症状。每两周测定一次四肢抓力,最后进行步态评分对DATS的干预效果进行评价。
  在染毒结束前一周,从模型组和DATS干预组中每组随机选取6只大鼠,于正己烷暴露后每2h经颈静脉取血分离血清,连续10次,每次0.4 ml。通过气相色谱法和埃利希反应测定血清中的游离2,5-HD和吡咯加合物水平,采用DAS3.0对其毒代动力学参数进行分析。动物处死后,取肝、肾、脑、脊髓和坐骨神经测定其中吡咯加合物的水平。
  取肝脏组织,利用RIPA裂解液匀浆后,离心取上清Western Blot检测肝脏中正己烷代谢相关的CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的蛋白含量。肝脏经TMS缓冲液匀浆后超速离心制备微粒体,测定CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1和CYP2E1的活性。
  2.胱胺对慢性正己烷神经损伤的保护作用
  Wistar大鼠50只,随机分为5组,即对照组、模型组、胱胺对照组、低高剂量胱胺干预组。胱胺对照组(60 mg/kg)、低高剂量胱胺组(30 mg/kg、60 mg/kg)动物经腹腔注射给予胱胺,其余动物给予等体积生理盐水;2h后,除对照组和胱胺对照组外,其余动物经口给予2,5-HD(300 mg/kg)。每周染毒6天,连续染毒6周至模型组动物出现明显瘫痪症状。每周采用步态评分和加速转棒试验对胱胺的干预效果进行评价。
  病理学检查:大鼠经麻醉后心脏灌注固定,制备坐骨神经石蜡切片,行固蓝染色观察病理改变。
  分别采用Elisa法检测血清中BDNF的含量,实时荧光定量PCR检测脊髓中BDNF mRNA的含量,Westem blot检测脊髓中BDNF、PI3K/Akt、Hsp-70蛋白的表达。
  3.DATS和胱胺联合作用对正己烷神经损伤的保护效果
  Wistar大鼠40只,随机分为4组,即正己烷模型组、胱胺干预组、DATS干预组、DATS胱胺联合干预组。胱胺干预组、DATS胱胺联合干预组动物经腹腔注射给予胱胺(60 mg/kg); DATS干预组、DATS胱胺联合干预组经口灌胃给予DATS(30 mg/kg);其余动物给予等体积溶剂。2h后,各组动物均经口给予正己烷(3 g/kg)。每周染毒7天,连续染毒8周至模型组动物出现明显瘫痪症状,每两周进行一次加速转棒试验和鼠尾电生理测试评价DATS和胱胺联合作用对正己烷神经损伤的保护效果。
  研究结果:
  1.DATS对慢性正己烷神经损伤的保护作用
  1.1 DATS对正己烷染毒大鼠行为学的影响
  四肢抓力:与对照组相比,正己烷染毒大鼠自6周起开始出现明显下降。染毒结束时,与模型组相比低、中、高剂量DATS干预使得大鼠四肢抓力分别提升了7.9%,41.6%和63.1%(P<0.05);
  步态评分:染毒结束时,模型组大鼠步态出现明显异常,步态评分升至3.25±0.87;10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预组步态评分改善为3.17±0.83,2.33±1.07(P<0.05),1.67±0.49(P<0.01)。
  1.2 DATS对正己烷染毒大鼠血清中2,5-HD和吡咯加合物毒代动力学的影响与模型组大鼠相比,10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预组2,5-HD曲线下面积(AUC0-t)分别下降了3.3%,17.1%和37.4%(P<0.05),而吡咯加合物曲线下面积下降了6.9%,7.0%和26.5%(P<0.05);血清中2,5-HD的最大浓度(Cmax)下降了11.7%,17.4%和30.3%,而吡咯加合物最大浓度(Cmax)下降了9.4%,9.4%和25.8%(P<0.05)。
  1.3 DATS对正己烷染毒大鼠组织中吡咯加合物蓄积的影响
  与模型组相比,DATS干预使得各组织脏器中蓄积的吡咯加合物出现了不同程度的下降:10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预组大鼠肝脏中吡咯加合物下降了2.0%,5.6%和16.1%;肾脏中吡咯加合物下降了8.O%,21.6%和29.2%;大脑中吡咯加合物下降了9.9%,21.3%和22.3%;脊髓中吡咯加合物下降了19.7%,24.4%和41.5%;坐骨神经中吡咯加合物下降了10.0%,15.3%和27.1%。20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预组大鼠肾脏、大脑、脊髓和坐骨神经中吡咯加合物的下降均较模型组具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。
  1.4 DATS对正己烷染毒大鼠肝脏中相关代谢酶含量的影响
  与模型组相比,DATS干预使得CYP1A1的表达增加,CYP1A2、CYP2B1/2和CYP2E1的表达降低。10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg DATS干预使肝脏中CYP1A1分别增加了0.3%、9.2%和54.2%(P<0.05); CYP1A2降低了12.8%、24.5%和23.2%; CYP2B1/2降低了-6.9%、15.1%和27.4%(P<0.01);CYP2E1降低了27.9%(P<0.05)、32.1%(P<0.05)和43.5%(P<0.01)。
  1.5 DATS对正己烷染毒大鼠肝脏中相关代谢酶活性的影响
  与模型组相比,DATS干预使得CYP1A1活性增强,CYP2B1和CYP2E1的活性减弱。其中20 mg/kg和30 mg/kg DATS干预使肝脏中CYP1A1活性增加了23.4%(P<0.05)和29.5%(P<0.01),差异具有统计学意义;30 mg/kg DATS干预使得CYP2B1活性降低了23.1%(P<0.01);10 mg/kg、20 mg/kg和30 mg/kgDATS干预使得CYP2E1分别降低了25.6%、30.4%和39.9%,差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01)。
  2.胱胺对慢性正己烷神经损伤的保护作用
  2.1胱胺对2,5-HD染毒大鼠行为学的影响
  步态评分:60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干预组分别自第二周和第三周开始与模型组表现出统计学差异(P<0.05)。染毒结束时,模型组7/10的大鼠完全瘫痪,30 mg/kg干预组1/10的大鼠完全瘫痪,60 mg/kg干预组未有完全瘫痪的大鼠;30 mg/kg和60 mg/kg干预组大鼠的步态评分结果较模型组分别下降了24.3%(P<0.01)和37.8%(P<O.01)。
  加速转棒试验:与模型组相比,60 mg/kg和30 mg/kg胱胺干预组分别自第3周和第5周开始与2,5-HD模型组表现出统计学差异(P<0.05)。染毒结束时,模型组大鼠基本上不能在转棒上停留,30 mg/kg和60 mg/kg干预组大鼠的潜伏期分别较模型组提升了216.8%(P<0.05)和325.7%(P<0.01)。
  2.2血清和脊髓组织中BDNF蛋白含量以及脊髓组织中BDNF mRNA含量的改变
  与对照组相比,模型组血清中BDNF的含量降低了31.4%(P<0.01),脊髓中mature-BDNF的含量下降了37.6%(P<0.01),脊髓中BDNF mRNA的含量降低了52.1%(P<0.05)。与模型组相比,30 mg/kg和60mg/kg胱胺干预组血清中BDNF的含量分别提高了18.1%(P<0.05)和38.9%(P<0.01),脊髓组织中precursor-BDNF的含量较模型组提高了8.2%和29.3%(P<0.01),mature-BDNF提高了107.2%(P<0.01)和300.5%(P<0.01),脊髓组织中BDNF mRNA含量约为模型组的2,1倍和2.7倍。
  2.3脊髓组织中PI3K/Akt信号通路及Hsp-70蛋白含量的改变
  与模型组相比,30 mg/kg、60 mg/kg胱胺干预使得脊髓中p-PI3K/PI3K比率提升了110.6%和179.6%, p-Akt/Akt比率提升了112.7%,均具有统计学差异(P<0.01);脊髓中Hsp-70的表达分别提高了21.1%和39.7(P<0.05)。
  3.DATS和胱胺联合作用对正己烷神经损伤的保护效果
  加速转棒试验:胱胺干预组、DATS胱胺联合干预组自第4周开始与模型组存在统计学差异;DATS干预组自第6周开始与模型组存在统计学差异;DATS胱胺联合干预组分别自第4周、第6周与DATS干预组、胱胺干预组存在统计学差异。至染毒结束时,DATS干预组、胱胺干预组和DATS胱胺联合干预组潜伏期分别提升至模型组的2.7倍、3.3倍和5.2倍;DATS胱胺联合干预组潜伏期较DATS干预组组提高了95.2%,较胱胺干预组提高了60.0%。
  鼠尾电生理:DATS干预组、胱胺干预组和DATS胱胺联合干预组分别自第6周、第6周和第4周开始与模型组出现统计学差异;DATS胱胺联合干预组自第4周与DATS干预组、胱胺干预组出现统计学差异。染毒结束时DATS干预组、胱胺干预组和DATS胱胺联合干预组NCV分别较模型组提升了19.8%、23.5%和51.3%; DATS胱胺联合干预组潜伏期较DATS干预组组提高了26.3%,较胱胺干预组提高了22.5%。
  结论:
  1.DATS可有效拮抗慢性正己烷中毒所致的周围神经损伤,可能与其抑制正己烷代谢活化,促进其代谢解毒,降低2,5-HD的量有关。
  2.胱胺可以拮抗大鼠正己烷中毒模型的神经损伤,其机制可能是与抑制2,5-HD引起的BDNF含量下降、激活PI3K/Akt信号通路以及上调Hsp-70的表达有关。
  3.DATS和胱胺联合作用可以更有效的拮抗正己烷所致的周围神经损伤。
[硕士论文] 陈婧祎
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP)是一种挥发性有机溶剂,其半衰期短,对臭氧层破坏作用小,是氟氯烃类等臭氧层破坏物质的替代剂,广泛用于精密仪器清洗,目前也常替代有潜在致癌危险的干洗剂用于干洗行业。随着1-BP使用量和生产量的日益增多,暴露人群逐渐扩大,近年来国内外不断有1-BP神经中毒的病例报道,中毒病人一般首先表现出中枢神经系统(central nervous system,CNS)受损症状如头疼、头晕、记忆障碍、焦虑或抑郁等,并逐渐出现周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)损伤症状如四肢麻木、下肢振动觉减弱,严重者表现为共济失调,甚至瘫痪。1-BP的神经毒性与其他有机溶剂神经中毒表现出明显不同,中毒病例和动物实验观察到1-BP引起的CNS损伤表现明显。由于1-BP神经毒性的确切机制尚不明确,临床上目前也无特异有效的治疗措施。先前的研究显示1-BP的神经毒性与其导致大脑的氧化应激和炎性反应密切相关。依达拉奉(edaravone,EDA)为3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,因其具有较强的清除自由基和抗炎作用,自2001年起在临床上用于缺血性脑血管病再灌注引起的氧化损伤治疗。因此,在本实验中,采用1-BP诱导1-BP中枢神经毒性,并给予不同剂量的EDA进行干预,通过Morris水迷宫实验检测实验动物认知功能变化,检测大脑线粒体活性,以及大脑氧化应激和炎性状态,观察了1-BP的CNS毒性和EDA的保护作用,探讨1-BP的神经毒性机制和寻找有效干预靶点。
  研究方法:
  1.实验动物分组和处理: SPF级雄性Wistar大鼠适应性喂养3d后,随机分为正常对照组、1-BP模型组、1-BP+1 mg/kg.bwEDA组、1-BP+3 mg/kg.bw EDA组、1-BP+5mg/kg.bw EDA组和5 mg/kg.bw EDA对照组,每组12只。1-BP采用玉米油稀释,经灌胃途径给予,剂量均为800mg/kg.bw。EDA均在1-BP染毒后4h经腹腔注射给予。对照组分别按1-BP和EDA给予方式给予等体积的溶剂。
  2.Morris水迷宫试验:实验第7d采用Morris水迷宫进行连续5d的定位航行实验和1d的空间探索实验,分别评价实验动物的学习能力和空间记忆能力。
  3.大脑组织尼氏体染色:采用冷冻切片机以冠状方向对全脑组织进行连续切片。每组选取位置相同的前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)和海马(hippocampus,HPC)区域,采用硫堇染液染色后,置于显微镜下观察神经元内尼氏体的变化情况。
  4.大脑组织免疫组化检测:采用大脑冷冻切片,每组选取位置相同的前额叶皮质和HPC区域,分别采用抗神经元和小胶质细胞特异的标记蛋白抗体进行免疫组化染色,光镜下观察神经元丢失和小胶质细胞活化情况,并采用Image J软件进行细胞计数。
  5.线粒体复合体Ⅰ~Ⅳ酶活性测定:断头处死动物,制作组织匀浆,分别检测大脑皮层线粒体复合体Ⅰ~Ⅳ酶活性变化。
  6.炎性因子和氧化抗氧化指标的检测:采用ELISA法检测大脑组织TNF-α含量,生化法分别大脑组织一氧化氮(nitric oxide,NO)、GSH、GSSG含量,并计算GSH/GSSG比值。
  结果:
  1.Morris水迷宫实验结果显示,1-BP模型组动物给予800 mg/kg.bw1-BP染毒后,水迷宫实验中第2~5d的逃避潜伏期分别比对照组增加了60.8%,81.9%,124.0%和323.3%,游泳总距离增加了47.0%,66.4%,106.0%和277.6%,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。空间探索实验中,1-BP模型组动物穿越平台次数也较正常对照组明显减少(P<0.01);给予1-BP同时给了不同剂量的EDA,其中1-BP+EDA5mg/kg。组大鼠第4d和第5d的逃避潜伏期分别比BP组减少了38.4%和44.3%(P<0.01),游泳总距离减少了34.5%和43.3%(P<0.05,P<0.01)。
  2.病理形态学观察到1-BP模型组大鼠大脑PFC小胶质细胞激活明显,神经元丢失,细胞计数后与对照组比较差异显著(P<0.05,P<0.01),给予EDA后动物大脑前额叶皮质小胶质细胞活化和神经元丢失明显减轻。1-BP导致大鼠大脑前额叶皮质神经元明显减少(P<0.01),3 mg/kg.bw和5 mg/kg.bw的EDA能够明显抑制1-BP导致的神经元丢失(P<0.05,P<0.01)。尼氏染色结果与NeuN免疫组化染色结果趋势一致。
  3.1-BP明显降低大脑前额叶皮质细胞线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性(P<0.05,P<0.01)。1-BP染毒同时给予不同剂量的EDA,大鼠大脑前额叶皮层线粒体复合体活性均有不同程度的升高。
  4.1-BP染毒能够升高大脑NO及TNF-α含量,1-BP模型组动物大脑组织中NO、TNFα含量分别比正常对照组增加了147.6%(P<0.05)和18.7%(P<0.01)。1-BP+1 mg/kg.bwEDA、1-BP+3mg/kg.bw和1-BP+5mg/kg.bwEDA组,NO分别比1-BP模型组降低了53.8%,55.4%和59.8%,TNF-α分别降低了12.2%、15.8%和22.2%,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。1-BP模型组动物大脑皮层GSH含量也较对照组明显降低(P<0.01),GSSG含量显著升高(P<0.01),GSH/GSSG比值明显降低(P<0.01);5mg/kg.bw剂量的EDA能够明显逆转1-BP导致的GSH含量降低(P<0.01),3mg/kg.bw和5mg/kg.bw的EDA能够明显升高GSH/GSSG比值(P<0.01)。
  结论:
  1.1-BP能够引起大鼠学习记忆下降,可能与1-BP导致与学习记忆功能的相关的PFC及HPC区域神经元受损有关。
  2.1-BP能够激活大脑小胶质细胞,并使NO含量升高、炎性因子TNF-α表达上调,导致炎性反应。EDA减轻1-BP中枢神经毒性的作用可能与其抑制1-BP暴露引起的神经炎症密切相关。
  3.1-BP损伤大脑皮质线粒体,导致氧化应激,GSH耗竭升高细胞内 GSH/GSSH比值。EDA能够保护线粒体,减轻1-BP引起的氧化应激,进而减轻1-BP对神经元的损伤。
[硕士论文] 张博
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  五氯酚(Pentachlorophenol,PCP)与五氯酚钠(sodiumpentachlorophenol,NaPCP)曾被用作杀灭血吸虫中间宿主-钉螺的药剂。目前五氯酚作为廉价且易获得的木材防腐剂、果树杀虫剂及除草剂等,仍被广泛使用。五氯酚属中等毒性毒物且具有蓄积作用,尿中五氯酚含量可以作为职业接触五氯酚的生物监测指标。我国职业接触五氯酚的生物限值为0.64mmol/mol肌酐或1.5mg/g肌酐(WS/T264-2006);美国政府工业卫生专家会议(ACGIH)制定的五氯酚的职业接触生物限值为2mg/g肌酐(尿中总PCP)。我国国家标准制定了尿中五氯酚的分光光度检测方法与高效液相色谱检测方法(1996年),但由于方法制定的时间太久、受到当时检测技术限制且尿中成分较为复杂,使得低含量五氯酚的测定结果的精密度和准确度都受到很大的影响;并且样品前处理操作复杂,极易引入干扰物质,影响实验结果准确性。本研究旨在建立更灵敏、更准确地检测尿中五氯酚的方法,联用顶空固相微萃取技术与气相色谱检测技术,完成对复杂基质尿液中五氯酚的检测,为今后国家标准检测方法的改进与职业接触五氯酚人群尿中五氯酚的检测提供方法经验。
  方法:
  利用顶空-固相微萃取技术对样品进行前处理,然后将萃取头直接伸入气相色谱仪进样口解析进样,进行定性定量分析。使用单因素轮换实验方法与正交设计实验方法,对顶空-固相微萃取过程中涉及的平衡时间、平衡温度、盐析剂等条件和气相色谱仪检测条件进行优化,并对方法学的线性范围、检测限、定量限、准确度、精密度及实际样品应用等性能参数进行测试,以判定其能否满足方法学及实际应用要求。应用该方法对大学生志愿者尿样进行检测;并选择雄性SD大鼠喂养含五氯酚的饮用水,采集实验组与对照组尿样进行实验方法的应用验证。应用该方法测定某浓度尿液中五氯酚并计算不确定度,进行不确定度评定,综合衡量结果的可靠性。
  结果:
  优化的测定条件结果:5ml尿样加2.0g氯化钠在顶空瓶中混匀,选择100μm PDMS萃取头在80℃的恒温水浴中萃取30min,然后直接将纤维头取出插入气相色谱进样器,解析涂层上吸附的物质5min。气相色谱仪条件为:色谱柱选择HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)毛细管柱;检测器选择电子捕获检测器(ECD);进样口温度设置为280℃;检测器温度设置为300℃;柱箱温度设置为40℃稳定2min,随后以20℃/min升温至240℃,稳定3min;不分流。方法学性能指标:检测限为0.009mg/L,定量限为0.030mg/L,测定范围为0.50mg/L~5.00mg/L,线性回归方程为y=10549x+175.77,r=0.9993,实验选定三种代表性的浓度(低、中、高)测得平均加标回收率范围为97.6%~103.7%,日内、日间精密度的相对标准偏差为1.63%~6.78%,样品在4℃的冰箱里至少能保存14天,待测物含量损失率<10%。实际应用大学生志愿者尿样中五氯酚的检测;将尿样进行加标回收实验,测得加标回收率范围为:96.0%~105.0%。配制浓度为1.50mg/L的五氯酚溶液喂养SD大鼠,同时做空白对照,收集SD大鼠尿样,应用建立的方法进行检测,对照组中未检出,实验组SD大鼠尿中五氯酚含量的范围为0.12mg/L~0.47mg/L。用建立的方法测定某浓度为1.45mg/L尿样中五氯酚,合成标准不确定度为0.04mg/L;拓展不确定度为0.08mg/L;则使用本方法测定该尿中五氯酚含量应报告为:(1.45±0.08) mg/L。
  结论:
  研究建立的顶空固相微萃取-气相色谱法测定尿中五氯酚的实验方法,简便快速,精密度、准确度、稳定性好,结果准确可靠,各项指标均满足《职业卫生标准制定指南第5部分:生物材料中化学物质测定方法》(GBZ/T210.5-2008)的要求。实际应用方面,通过对大学生志愿者尿样的检测,以及定量喂养SD大鼠五氯酚溶液收集其尿样进行检测验证方法可行,适用于职业接触五氯酚人群尿中五氯酚的检测。通过识别和分析检测过程中不确定度的来源,评定实验过程中引入的不确定度,判断实验过程中引入不确定度的主要因素,从关键环节加以控制,为有效提高尿中五氯酚检测的准确度提供理论依据。
[博士论文] 贾建博
分析化学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:随着纳米科技的发展,越来越多的含纳米材料的产品进入到人们的日常生活。截至2017年3月,全球商品化的纳米产品己达1827种。由于其独特的物理化学性质,纳米材料在能源、化工、电子工业、生物医药等领域应用广泛。纳米材料的广泛应用极大的增加了其与人类接触的机会。纳米材料暴露可通过产生氧化应激、诱发炎症反应等途径在细胞、器官和动物水平表现出显著的毒性效应。无论是处于特殊生理时期的群体还是疾病群体,通常都伴随着机体正常生理功能的减弱或缺失。纳米材料所表现出的毒性效应在易感群体中会得到进一步的放大。因此,评价纳米材料在易感群体中的潜在毒性十分必要和迫切。
  超重和肥胖是指可损害人体健康的异常或过量的脂肪累积。超重和肥胖能显著增加个体的死亡风险以及脂肪肝,糖尿病,高血压,胰岛素抵抗综合症,甚至某些癌症的发生风险。此外,超重群体是环境有害因素的易感群体,环境污染物暴露通常在超重群体中表现出更强的毒性效应。近些年来,人们饮食结构和生活方式的改变使得超重和肥胖人群的数量在全球范围内迅速增加。据WHO估计,2014年全球成年人口中有超过19亿人超重或肥胖,其中逾13亿人超重但未达到肥胖的标准(25≤ BMI<30)。儿童青少年的超重比例也在10%以上。纳米材料暴露对超重群体的生物安全性评价具有十分重要的现实意义。
  纳米银是目前应用最为广泛的纳米材料之一,其与人类接触的机会也相对较多。已有的研究结果显示,纳米银在细胞和动物水平上均表现出显著的毒性效应,引起细胞损伤和靶器官毒性。氧化应激、炎症反应以及线粒体损伤等是目前认为纳米银产生毒性效应的主要作用机制。此外,纳米银在溶液环境中会释放银离子,其释放的银离子也被认为是纳米银毒性的主要来源之一。目前纳米银的生物安全性评价工作更多的是在细胞和正常动物中开展的,其在易感群体中的毒性评价相对较少。
  本论文首先评价了口服暴露银纳米材料对高脂饮食诱导的超重小鼠的毒性效应,并对毒性机制做了阐明。体内分布实验结果显示,肝脏是纳米银和银离子经胃肠道吸收后的主要聚集场所。通过对超重小鼠肝脏中银的状态的定性和定量的分析,我们发现银离子可以在超重小鼠的肝脏中被还原成纳米银,且模拟的银离子暴露组超重小鼠肝脏中经还原生成的纳米银的量与实测的纳米银暴露组超重小鼠肝脏中的纳米银积累量相当。
  在对正常小鼠不造成显著毒性的暴露剂量下,连续14天口服暴露纳米银或硝酸银在超重小鼠中引起类似程度的加剧的非酒精性脂肪肝发病进程。具体表现为,肝脏炎症因子水平及脂质含量显著升高,肝组织出现显著的炎症和水样变性,高脂饮食所致肝脏脂肪变性程度进一步加剧。超重小鼠肝组织上述病理学改变结果暗示,纳米银暴露促进了超重小鼠肝脏由单纯性脂肪肝病向脂肪性肝炎的转变。这种转变加剧了超重小鼠肝脏向更严重阶段的非酒精性脂肪肝病发展的风险。结合超重小鼠肝脏中银的状态的定性和定量的分析结果,我们认为纳米银暴露对超重小鼠肝脏造成的毒性损伤来自银纳米颗粒,而不是银离子。
  为深入探讨纳米银加剧非酒精性脂肪肝发病进程的机制,我们对脂肪肝相关基因做了PCR阵列的筛查。结果显示,纳米银或银离子暴露显著上调了炎症相关基因(Tnfa,Il6,Il10等)的表达,显著下调了脂肪酸氧化相关基因(Ppard,Pdk4等)的表达。进一步的基因、蛋白水平的分析结果表明,在超重小鼠肝脏中积累或生成的银纳米颗粒可激活Kupffer细胞,诱导TNF-α和IL-6的释放,引起NFκB,JNK和p38 MAPK等炎症信号通路的激活,最终导致肝脏炎症的发生。此外,纳米银可通过直接或间接(通过增加TNF-α释放)下调Ppard及其靶基因的表达,抑制脂肪酸氧化过程,最终导致超重小鼠肝脏脂肪变性程度加剧。尽管纳米颗粒的潜在毒性效应及其对人类健康的潜在威胁已得到了广泛的研究,本课题的研究意义在于,我们发现纳米材料的健康危害会在易感的超重群体中得到进一步放大。本研究充分说明了纳米银在超重人群中的应用或意外暴露的危险应该受到高度关注。
  另一方面,纳米材料进入环境之后,随空气、水、食物等各种介质在环境中扩散的过程中,势必与环境中的其它有机或无机污染物相互作用,形成纳米材料-环境污染物复合体系。此外,纳米材料高的比表面积和表面活性使得其在环境污染物吸附方面优势明显,在污染物去除等环保领域应用前景广阔。这进一步加剧了环境中纳米材料-污染物共存现状,增加了人类共暴露纳米材料和环境污染物的机会。已有的研究结果显示,纳米材料与环境污染物共暴露可显著改变污染物在细胞、低等水生生物以及高等哺乳动物中的吸收分布,引起差异于污染物单独暴露的毒性效应。然而,纳米材料-环境污染物复合体系在易感群体中的生物分布行为及毒性效应研究目前相对较少。
  本研究在课题组前期工作的基础上,选用氧化锌纳米材料为纳米材料的代表,选用铅离子为典型重金属污染物的代表,评价了氧化锌纳米材料和铅离子共暴露在超重小鼠中的生物分布行为及毒性效应。经口服暴露后,纳米氧化锌显著增加了铅离子在正常及超重小鼠肾脏、脾脏、肝脏等主要脏器的累积量,这一方面可能是由于纳米氧化锌作为重金属离子的载体,促进了铅离子的吸收,另一方面,游离的铅离子比纳米氧化锌-铅离子复合物更容易被各脏器清除。高脂饮食饲喂引起超重小鼠小肠通透性的增加,进一步加剧了铅离子在超重小鼠中的积累。
  毒性评价结果显示,纳米氧化锌与铅离子共暴露引起了超重小鼠体重的显著性下降。此外,铅离子在主要脏器的积累对超重小鼠的肾脏和脾脏没有造成显著的病理学改变,但加重了超重小鼠的肝脏损伤,显著增加了超重小鼠血清中表征肝脏功能的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量。本研究工作充分说明了超重小鼠对纳米材料与重金属离子共暴露反应更加敏感,警示超重群体应该更加谨慎的对待环境中纳米颗粒与重金属污染物的复合暴露。
  综上所述,虽然我们在将模型小鼠中的研究结论外推至人类,将实验室研究外推到实际环境暴露时应该特别谨慎,本研究仍然显示,超重群体对环境暴露纳米材料及纳米材料-污染物复合物反应更加敏感,超重群体应该更加谨慎的对待环境中纳米颗粒暴露(应用暴露及意外暴露)及其与重金属污染物的复合暴露。
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