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[硕士论文] 尹思睿
临床兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:抵抗素是一种炎性细胞因子,能够参与机体的免疫调节,与Ⅱ型糖尿病和肥胖等多种疾病的发生有关。NLRs(NOD-like receptors),包括NOD1(Nucleotide-binding oligomerization domain1)、NOD2、NLRP3等是天然免疫系统中的重要受体,可接受多种物质的调控,与多种免疫相关信号通路的激活有关。实验室前期研究表明,抵抗素不影响RAW264.7细胞NOD1的表达,但能促进其NOD2的表达,活化NOD2-NF-κB信号通路并释放IL-6、IL-18、TNF-α等炎性细胞因子,但NOD2并不是抵抗素作用的必需受体。NLRP3受NF-κB的调控并参与炎症过程,是NLRP3炎性体的中心,但目前尚无抵抗素与NLRP3关联的报道,抵抗素能否通过NF-κB信号通路活化NLRP3,启动NLRP3炎性体的组装,尚有待研究证明。因此,利用RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)研究抵抗素对其NLRP3基因和蛋白表达,以及活化NF-κB信号通路促进炎性细胞因子释放的影响,明确抵抗素与NLRP3的作用机制。
  方法与结果:(1)用终浓度为50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL和200ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7至预定时间(0h、3h、6h、12h、24h)。运用Real Time-PCR和Western Blot技术分别检测细胞NLRP3、NF-κB的基因和蛋白表达水平,ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1α等细胞因子的浓度。结果表明,抵抗素上调RAW264.7中NLRP3及NF-κB基因和蛋白的表达;培养上清液中TNF吨、IL-6、IL-18和IL-1β的含量随抵抗素终浓度(50-200ng/mL)的增高及培养时间(0-24h)的延长而增加。
  (2)设计三条不同的siRNA沉默NLRP3基因,荧光显微镜下检测转染效率,Real Time-PCR检测沉默效果。结果发现在转染效率较高的条件下,三条siRNA沉默效果均不好。随后更换为用终浓度为10nmol/L的MCC950(NLRP3的特异性抑制剂)预处理RAW264.7细胞0.5h,添加200ng/mL的抵抗素继续孵育24h,检测NLRP3及NF-κB的基因、蛋白表达变化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的浓度。结果:添加MCC950,RAW264.7细胞中NLRP3基因和蛋白表达水平较抵抗素组极显著下调(P<0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的浓度极显著降低(P<0.001)。表明NLRP3是抵抗素促进RAW264.7细胞释放促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的关键调控因子,但不影响抵抗素激活NF-κB的表达。
  (3)用终浓度为25μmol/L的小白菊内酯(NF-κB的特异性抑制剂)预处理RAW264.7细胞1h,添加200ng/mL的抵抗素继续孵育24h,检测NLRP3及NF-κB的蛋白表达变化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的浓度。结果:添加小白菊内酯,RAW264.7细胞中NLRP3和NF-κB蛋白浓度显著降低(P<0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的浓度显著降低(P<0.001)。表明NF-κB是抵抗素促进RAW264.7细胞NLRP3蛋白表达和促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的释放的必需因子。
  结论:(1)抵抗素促进RAW264.7细胞的NLRP3基因表达上调、蛋白表达增高,激活NF-κB并促进细胞因子如TNF-旺、IL-6、IL-18和IL-1β等的释放。(2)NLRP3参与抵抗素诱导RAW264.7细胞促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的释放过程,但其并非抵抗素激活NF-κB的必需因子。(3)NF-κB是抵抗素诱导NLRP3表达升高和RAW264.7释放促炎细胞因子的关键调控因子之一。
[硕士论文] 何婷婷
临床兽医学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:目的:抵抗素(Resistin,RETN)是2001年Steppan在研究胰岛素增敏剂(噻唑烷二酮类药物)的作用机制时发现的一种脂肪细胞因子,与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病相关联。抵抗素除参与机体炎症与免疫反应,具有促炎作用外;还影响机体糖脂代谢,具有促胰岛素抵抗作用。抵抗素可促使单核或巨噬细胞的IκB磷酸化并与NF-κB解离,使NF-κB信号通路激活,释放IL-6、TNFα等炎症细胞因子,引起炎症反应;除此外,抵抗素还可促进巨噬细胞脂质蓄积,但其作用机制不明确。已有研究表明,罗西土碱和薯蓣皂苷元等可通过PI3K/AKT/PPARγ信号通路抑制巨噬细胞LPL表达,进减少细胞脂质蓄积。抵抗素能够激活PI3K/AKT/PPARγ信号通路,发挥促胰岛素抵抗、影响内皮细胞NO生成、抗细胞凋亡等生物学作用,但其能否通过该信号通路影响LPL表达并进而促进巨噬细胞脂质蓄积,尚有待研究证实。因此,基于PI3K/AKT/PPARγ信号通路开展了抵抗素对RAW264.7细胞LPL表达及脂质蓄积的研究。
  结果与分析:(1)用终浓度为50ng/mL,100ng/mL,150ng/mL,200ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7细胞24h,用qRT-PCR和Western blot方法分别检测LPL的基因和蛋白表达结果,随抵抗素作用浓度的增高(50-200ng/mL),RAW264.7细胞LPL基因和蛋白表达增加。终浓度为200ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7细胞,检测其LPL在0h,3h,6h,12h,24h,48h的基因和蛋白表达情况,随抵抗素作用时间(24h以内)的增加LPL基因和蛋白表达也增加。上述结果表明,抵抗素具有促进RAW264.7细胞LPL基因和蛋白表达的作用。
  (2)用终浓度为40μmol/L的PI3K特异性抑制剂(LY294002)孵育RAW264.7细胞1h,加入终浓度为200ng/mL的抵抗素继续孵育24h,qRT-PCR检测RAW264.7细胞PI3K、Akt、PPARγ、LPL的基因和蛋白表达变化。LY294002孵育后,添加抵抗素孵育RAW264.7细胞的LPL、PI3K、Akt、PPARγ基因和蛋白表达显著下调(P<0.01)。结果表明,抵抗素通过激活PI3K促进LPL基因和蛋白的表达。
  (3)用LPL-siRNA孵育RAW264.7细胞24h,再添加终浓度为50μmol/mL的ox-LDL孵育1h,加入终浓度为200ng/mL抵抗素孵育24h,检测LPL的基因和蛋白表达变化,并用油红O染色法检测细胞内脂滴蓄积,酶法定量检测TG、TC的含量。LPL-siRNA孵育后,添加抵抗素孵育RAW264.7细胞的LPL基因和蛋白表达显著降低(P<0.01),细胞内脂滴蓄积明显减少,细胞内TG、TC含量显著降低(P<0.01)。结果表明,LPL是抵抗素促进巨噬细胞脂质蓄积的关键调控因子。
  结论:(1)抵抗素具有促进RAW264.7细胞LPL基因和蛋白表达的作用,并受作用浓度和作用时间影响。(2)抵抗素具有与PI3K作用活化PI3K/Akt/PPARγ信号通路进而促进RAW264.7细胞LPL基因和蛋白的表达的作用。(3)抵抗素导致RAW264.7细胞的脂质蓄积与抵抗素促进其LPL基因和蛋白的表达增加密切关联。
[硕士论文] 王亚南
免疫药物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  淋巴细胞通常被认为是在淋巴器官和血液之间不断循环的,但是在一些非淋巴器官尤其是屏障部位(包括粘膜表面和皮肤中)存在组织驻留的淋巴细胞。目前发现的驻留淋巴细胞主要包括先天性淋巴细胞(ILCs)、非传统的T细胞(例如NKT、MAIT、γδT细胞和CD8αα+IELs)和组织驻留记忆T(TRM)细胞。这些特殊的组织驻留淋巴细胞亚群作为组织感染和损伤的传感器,参与固有免疫和适应性免疫,在屏障组织中发挥重要的抵抗感染和防止组织损伤的作用。
  肝脏具有独特的解剖结构,不仅是一个重要的代谢、解毒器官,也是独特的免疫器官。肝脏含有多种非实质细胞群体,包括肝窦内皮细胞、Kupffer细胞、胆管细胞、星状细胞和肝内淋巴细胞,尤其富含NK细胞、NKT细胞和γδT细胞。近年来研究发现,肝脏中存在一群驻留性NK细胞,在表型、功能与发育方面同传统的NK细胞存在巨大差异。而研究表明,相比于脾脏和胸腺等其他器官,肝脏γδT细胞比例较高,并且分泌较高水平的IL-17A。基于肝脏独特的有利于细胞驻留的微环境,我们推测肝脏中含量相对丰富的以分泌IL-17A为主的γδT细胞同驻留NK细胞类似,在肝脏驻留,并且具有不同于常规IL-17A+γδT细胞的特性。为了探讨这些问题,本课题从以下几个层面对肝脏分泌IL-17A的γδT细胞亚群进行了研究。首先,我们发现肝脏CD44hiCD27-γδT细胞以分泌IL-17A为主,并且在肝脏中的比例高于脾脏和胸腺;其次,通过对驻留相关的表型进行检测,发现肝脏CD44hiCD27-γδT细胞高表达某些驻留相关的表型,通过联体小鼠模型,进一步确定了这群细胞具有肝脏驻留的特性;最后,我们探讨了肝脏微环境中促进这群细胞在肝脏驻留的因素和机制。
  方法:
  1.分离C57BL/6J小鼠肝脏、脾脏、胸腺、小肠及淋巴结内的单个核细胞,流式细胞术检测其中γδT细胞的比例以及IL-17A和IFN-γ的分泌能力。
  2.利用CD44和CD27作为分群标记,流式细胞术确定小鼠肝脏、脾脏和胸腺γδT细胞各个亚群的位置和比例,PMA与离子霉素体外刺激,检测细胞因子的分泌。
  3.流式细胞术检测成年小鼠肝脏、脾脏和胸腺中CD44hiCD27-和CD44hiCD27+γδT细胞表面驻留相关标记和转录因子的表达。
  4.利用联体小鼠模型验证肝脏CD44hiCD27-γδT细胞的组织驻留特性,流式细胞术检测此细胞亚群Vγ型的表达。
  5.通过流式细胞术检测肝脏、脾脏和胸腺γδT细胞前体细胞的比例,通过联体小鼠模型验证肝脏γδT前体细胞的组织驻留特性,通过与OP9-DL1共培养实验确定γδT前体细胞向成熟γδT细胞发育分化的能力。
  6.流式细胞术检测肝脏CD44hiCD27-γδT细胞Notch1的表达;灌流法分离提取小鼠肝窦内皮细胞,普通PCR检测肝窦内皮细胞Notch配体的表达。
  7.流式细胞术检测肝脏CD44hiCD27-γδT细胞趋化因子受体CXCR3和CXCR6的表达;体外培养肝窦内皮细胞,ELISA检测培养上清中CXCR6的配体CXCL16的水平。
  8.灌流法分离小鼠肝窦内皮细胞,流式细胞术检测肝窦内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达;流式细胞术检测肝脏CD44hiCD27-γδT细胞LFA-1和VLA-4的表达。
  结果:
  1.C57BL/6J小鼠肝脏中存在较高比例的γδT细胞,且分泌较高水平的IL-17A。根据CD44和CD27的表达可以将γδT细胞分为三个不同的亚群,CD44hiCD27-γδT细胞亚群、CD44hiCD27+γδT细胞亚群和CD44lo/-γδT细胞亚群。同脾脏和胸腺相比,肝脏中存在相对较丰富的以分泌IL-17A为主的CD44hiCD27-γδT细胞。
  2.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达较高水平的细胞驻留相关标记CD69和CD49a,而低表达淋巴细胞迁出相关分子CD62L。
  3.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞高表达IL-17A相关的转录因子RORγt,低表达IFN-γ相关的转录因子T-bet,并且高表达驻留相关转录因子PLZF而低表达Eomes。
  4.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞具有肝脏驻留的特性。在联体小鼠模型中,发现CD45.1小鼠肝脏中几乎只存在CD45.1+CD44hiCD27-γδT细胞,CD45.2小鼠肝脏中几乎只存在CD45.2+CD44h1CD27-γδT细胞。
  5.肝脏驻留特性的CD44hiCD27-γδT细胞可能在肝脏中发育。相对于脾脏来说,肝脏中存在较高比例的CD24hiCD73+γδT前体细胞,通过联体小鼠模型证明这群前体细胞亦具有肝脏驻留特性,通过体外培养发现该群前体细胞能够发育分化为分泌IL-17为主的成熟γδT细胞。
  6.相对于脾脏和胸腺来说,肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达较高水平的Notch1受体,肝窦内皮上表达Notch的配体JAG1、DLL1和DLL4,提示Notch信号对于CD44hiCD27γδT细胞在肝脏的发育和驻留可能发挥重要作用。
  7.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达促进淋巴细胞向肝脏归巢的趋化因子受体CXCR6,肝窦内皮细胞分泌其配体CXCL16;肝脏CD44hiCD27-γδT细胞高表达粘附分子LFA-1和VLA-4,肝窦内皮细胞表达它们的受体ICAM-1和VCAM-1,提示肝窦内皮细胞可能通过趋化和黏附作用促进CD44h1CD27-γδT细胞在肝脏的驻留。
  结论:
  1.肝脏含有较高比例的分泌IL-17A为主的CD44hiCD27-γδT细胞。
  2.肝脏CD44hiCD27-γδT细胞表达驻留相关的分子标志,具有肝脏组织驻留的特性。
  3.肝脏CD24hiCD73+γδT前体细胞亦具有肝脏组织驻留的特性,且可向成熟γδT细胞发育分化。
  4.肝窦内皮细胞在维持CD44hiCD27-γδT细胞在肝脏的发育和驻留中发挥重要作用。
[硕士论文] 莫淑宜
内科学(血液病) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  嵌合抗原受体T淋巴细胞(chimeric antigen receptor T lymphocyte,CAR-T cell)治疗是一种新型肿瘤免疫治疗方法,目前已经在白血病、儿童神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤等癌症中应用,并取得一定疗效。制备CAR-T cell必须有足够数量、具有活性的CAR-T前体细胞,应用血细胞分离机的单采功能和技术,获取足够数量且具有活性的CAR-T前体细胞是CAR-T细胞免疫治疗成功的基础。但是应用血细胞分离机安全、可行、可靠、有效富集CAR-T前体细胞的方案需要研究,如血细胞分离机类型和单采程序选择、单采参数设置、不良反应预防和处理、安全性评估等。幼儿不同于成人,各系统生理发育尚未成熟,循环血容量少,依从性和配合度低,分离采集前不使用动员剂,循环血中T淋巴细胞绝对数少。因此,我们设计了采用连续流动式COM.TEC血细胞分离机富集幼儿CAR-T前体细胞的方案,评价该方案的安全性、可行性、有效性和可靠性。
  研究方法:
  对本院拟行CAR-T免疫治疗的16名幼儿,按设定的富集方案采用连续流动式COM.TEC血细胞分离机,选择Auto-MNC程序,采集未经动员的幼儿外周血单个核细胞;对获得的单个核细胞分类计数,并对采集前后幼儿血常规、血生化指标变化进行分析,预防、观察和处理富集过程中的不良反应。使用SPSS21.0统计软件对数据进行分析。计量资料以“均数±标准差((x)±s)”表示,富集前、后外周血细胞计数及血生化指标的变化,应用配对t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
  研究结果:
  1.本方案完成16人共22例次幼儿CAR-T前体细胞富集,每次采集时间(135±39)分钟,处理血液量平均为幼儿循环血容量的2.2倍,处理血液量为(2271±294)ml,抗凝剂用量(340±101)ml,含CAR-T前体细胞采集物容量为59(30~102)ml。
  2.含CAR-T前体细胞采集物主要成分为淋巴细胞,采集获得淋巴细胞(32.25±22.39)×109/L,占比例约为62.92%。采集物中还有一定数量的红细胞、血小板、单核细胞及中性粒细胞。
  3.富集CAR-T前体细胞前、后患儿的WBC、Hb、Hct及单核细胞绝对值水平变化不大,差异无显著意义(P>0.05)。PLT从富集前的(205±87)×109/L下降到富集后的(115±36)×109/L,下降幅度达43.9%,差异显著,但患儿无需输注血小板,亦无临床出血情况发生。富集CAR-T前体细胞后,淋巴细胞计数较前明显下降,从富集前的(1.18±0.69)×109/L下降到富集后的(0.95±0.45)×109/L,有显著差异(P<0.05)。
  4.富集CAR-T前体细胞前,血清k+、Ca2+和血Glu分别为(4.10±0.32)mmol/L、(2.27±0.30)mmol/L和(5.74±1.30)mmol/L,富集后CAR-T前体细胞后,血清k+、Ca2+和血Glu分别是(3.58±0.54)mmol/L、(2.52±0.20)mmol/L和(5.71±1.22)mmol/L。富集前、后电解质水平变化不大,差异无统计学意义(P>0.05)。临床上亦未出现低钾血症、低钙血症、高糖或低糖血症等。
  5.幼儿在CAR-T前体细胞富集过程中生命体征平稳。观察到1例患儿双足麻木,皮疹1例。未观察到唇周麻木、抽搐等枸橼酸盐中毒反应,未出现低血容量或循环超负荷等不良反应。
  6.回输CAR-T细胞数平均6.77±3.01×107cells(1.8×107cells~1.2×108cells)。输注18例次未发现明显的毒性反应,输注安全。
  研究结论:
  我们的富集幼儿CAR-T前体细胞方案安全、可行、有效、可靠。
[博士论文] 韩利杰
内科学(血液病) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:背景及目的:异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是治疗恶性血液疾病等的重要手段,甚至被认为是治愈某些恶性血液疾病的唯一方法。移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是allo-HSCT后的主要并发症,也是当前制约allo-HSCT疗效的重要因素之一。多种因素影响了GVHD的发生发展,如:HLA配型、供者来源、干细胞来源、预处理方案、供受者年龄、性别等。除此外,近年一些研究表明肠道菌群与急性GVHD(acute GVHD,aGVHD)的发生发展密切相关。
  肠道菌群与机体免疫稳态密切相关,肠道菌群紊乱会改变上皮和粘膜通透性,打破免疫稳态,导致炎症性疾病的发生。在allo-HSCT动物模型显示:肠道厌氧菌(如梭状芽孢杆菌等)的代谢产物短链脂肪酸,可促进CD4+T细胞内乙酰化组蛋白的表达,进一步促进Foxp3的组蛋白乙酰化,介导调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)的组蛋白修饰作用,诱导免疫耐受,减轻aGVHD。此外,需氧菌(如致病性肠杆菌等)除了产生肠毒素破坏肠粘膜并抑制厌氧菌生长外,还可产生大量脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),LPS透过损伤的黏膜屏障进入血液循环并到达全身靶器官,激活T细胞,导致Th细胞分化失平衡,促进aGVHD发生。但是在人体内,肠道菌群影响T细胞免疫平衡的机制还不清楚。尤其是aGVHD发生前,肠道菌群对机体细胞免疫,Th细胞分化平衡等的影响,以及哪些菌群在aGVHD的发生发展中起关键作用都亟待进一步研究。基于以上科学问题,本研究目的是:探讨allo-HSCT后aGVHD和未发生aGVHD患者,在移植前和造血植入时肠道菌群、T细胞亚群的差异性;分析肠道菌群与机体免疫之间的关系;揭示肠道菌群在aGVHD的发生发展中作用及机理;为临床aGVHD预测及aGVHD防治提供新的思路和依据。
  方法:(1)临床样本收集:2015年1月至2016年12月在本院接受allo-HSCT的受者,分别收集病人预处理前、造血植入时(造血植入后第3-4天)粪便1g左右及外周血4-5ml。基于移植后100内aGVHD发生情况分为二组:aGVHD组(Ⅱ-ⅣaGVHD);non-aGVHD组(0-ⅠaGVHD)。
  (2)肠道菌群检测:利用HiPure Stool DNA Kit试剂盒提取菌群基因组DNA,用荧光定量方法检测样品浓度,使用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定样品完整性。对提取的基因组DNA进行PCR扩增,构建菌群文库,使用Agilent2100Bioanalyzer对菌群文库质控;利用HiSeq2500测序仪对PCR扩增产物的16s rRNA V3-V4可变区进行测序,通过SILVA数据库将所测序列进行序列比对,并经多样性指数、LEfSe(Linear discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe)分析等方法对各组微生物种类进行多样性和分类学的比较,以期发现aGVHD患者肠道菌群的差异性改变。
  (3)T细胞亚群的检测:采用流式细胞术检测外周血T细胞亚群(Treg、Th17、Th1)的比例,CD4+T细胞内乙酰化组蛋白H3(ace-H3)和ace-H4表达水平(中位荧光强度(median fluorescence intensity,MFI))。
  (4)细胞因子的检测:采用液相芯片技术检测血浆细胞因子----白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10、IL-17A及干扰素(interferon,IFN)-γ表达水平。
  (5)相关性分析:采用Spearman相关分析,分析肠道菌群与T细胞亚群、CD4+T细胞内乙酰化组蛋白水平的相关关系。
  (6)对aGVHD的预测:基于移植后患者肠道菌群特征,通过ROC(receiver operator characteristic,ROC)曲线下面积(AUC)评估菌群对aGVHD的预测价值。对AUC≥0.65的菌群,通过菌群累计积分再对aGVHD预测,并分析菌群积分与aGVHD分级的相关性。
  结果:(1)二组病人临床与移植特征:在81例纳入本研究的患者中,移植后32例患者发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD、49例患者发生Ⅰ度aGVHD或没有发生aGVHD。两组病人除了aGVHD组有更多病人接受强化预处理,临床特征无明显差异。
  (2)二组抗菌药物应用:在造血植入前,aGVHD组较non-aGVHD组有更多病人接受β-内酰胺类抗菌药(预处理开始至植入前,连用3天或以上)。
  (3)预处理前二组菌群:预处理前二组病人的菌群多样性无显著差异。菌群结构方面,在门、纲、目、科、属水平均没有显著差异。
  (4)造血植入时二组菌群差异:造血植入时aGVHD组菌群多样性低于non-aGVHD组。在菌群结构方面,从纲水平看,梭菌纲(Clostridia)的丰度在aGVHD组少于non-aGVHD组,而γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)在aGVHD组多于non-aGVHD组。在科水平,Lachnospiraceae、Ruminococcaceae等的丰度在aGVHD组少于non-aGVHD组,而Enterobacteriaceae在aGVHD组多于non-aGVHD组。
  (5)抗菌药物及预处理对肠道菌群的影响:β-内酰胺类抗菌药物和万古霉素均导致菌群多样性降低。同时β-内酰胺类药物会导致Lachnospiraceae丰度降低;万古霉素则导致Enterobacteriaceae丰度升高。其次,强化预处理较标准预处理会导致菌群多样性降低,以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceaee丰度降低。没有发现其他因素对菌群的显著影响。
  (6)aGVHD的危险因素:Cox回归模型分析显示,β-内酰胺类抗菌药物应用和移植后低菌群多样性是aGVHD的独立危险因素。而患者年龄、供者类型、万古霉索(静脉)等不是aGVHD的独立危险因素。
  (7)植入时二组T细胞亚群及细胞因子水平:造血植入时aGVHD组外周血Treg细胞占CD4+细胞比例低于non-aGVHD组。而aGVHD组Th17细胞比例高于non-aGVHD组。Th1细胞比例没有显著差异。血浆中细胞因子IL-17A水平在aGVHD组高于non-aGVHD组,而IL-4、IL-10、IFN-γ表达水平没有显著差异。
  (8)CD4+T细胞内乙酰化组蛋白水平与T细胞亚群的关系:aGVHD组CD4+T细胞内ace-H3的MFI水平低于non-aGVHD组。ace-H4的MFI水平二组没有显著差异。ace-H3的MFI水平与Treg/Th17细胞数比值正相关。没有发现ace-H4与Treg/Th17有相关性。
  (9)肠道菌群与免疫的关系:Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Enterobacteriaceae的丰度与Treg/Th17细胞数比值分别呈正相关、正相关和负相关。Lachnospiraceae、Ruminococcaceae的丰度与CD4+T细胞内ace-H3的MFI水平呈正相关。
  (10)肠道菌群对aGVHD的预测价值:在探索肠道菌群对aGVHD的预测价值时发现,四种菌科的丰度----Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae能预测aGVHD的发生。这四种菌群累计积分后预测Ⅱ-Ⅳ和Ⅲ-ⅣaGVHD的ROC曲线下面积分别为0.73和0.85。而且,四种菌群的积分与aGVHD的分级密切相关(r=0.560,P<0.001)。
  结论:(1)在allo-HSCT后造血植入时,肠道菌群多样性和菌群结构都与aGVHD的发生密切相关,而特定菌群的变化与抗菌药物应用和预处理损伤有关。
  (2)allo-HSCT后,肠道菌群与外周Treg/Th17细胞免疫平衡以及CD4+T细胞内的ace-H3水平密切相关,可能影响Treg/Th17的免疫平衡及aGVHD发生发展。
  (3)allo-HSCT后造血植入时肠道菌群组合积分不仅能够预测aGVHD的发生,而且能够预测aGVHD严重程度。
[硕士论文] 楚红蕾
免疫学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:固有免疫是机体免疫系统防御微生物感染的第一道防线。激活固有免疫需要模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别微生物病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)后,在机体内形成相应信号转导,最终引起免疫应答。YIPF5是YIP家族蛋白成员之一,定位于内质网、ERGIC、顺面高尔基体上。研究表明YIP家族蛋白成员能与Rab GTPase结合,参与调节内质网与高尔基之间的囊泡运输。作为YIP家族蛋白中的一员,YIPF5与内质网上COPⅡ被膜小泡的生成过程有关,可以随COPⅡ小泡由内质网转移至顺面高尔基体上。STING是调控Ⅰ型干扰素基因表达的重要信号分子,在感受胞质DNA和免疫防御方面起着重要的信号传递作用,研究表明STING所介导的信号通路的活化依赖于它在细胞内的转位,当机体感染DNA病毒后,STING从内质网经过高尔基体转移至核外周小体上,进而活化下游信号通路,促进Ⅰ型干扰素的产生。YIPF5参与了胞内囊泡运输,并且影响从内质网到高尔基体的转运过程,但YIPF5是否参与机体的天然免疫反应以及STING的转位仍然未知。因此本论文探索了YIPF5是否通过影响STING功能进而调控天然免疫抗病毒反应。在本文中,发现用siRNA干扰小鼠腹腔巨噬细胞中YIPF5的表达后,ISD、LPS、SeV诱导的Ⅰ型干扰素IFN-β和炎性细胞因子TNF-α、IL-6等表达下调,干扰素调节因子IRF3和激酶TBK1的磷酸化都明显下调;在感染VSV病毒后,巨噬细胞的抗病毒能力同样下降。同时YIPF5影响STING在核周的聚集,说明YIPF5可能通过影响STING的转位调节机体天然免疫反应。
  研究目的:
  探讨YIPF5在抗病毒天然免疫中的作用,YIPF5是否通过STING影向天然免疫信号通路。
  研究方法:
  1)敲低YIPF5的表达是否影响天然免疫信号通路中不同细胞因子的表达
  获得小鼠原代腹腔巨噬细胞,转染YIPF5siRNA48h后,分别转染ISD3h、6h、9h;LPS刺激2h、4h、6h;感染SeV4h、8h、12h,提取细胞总RNA,将RNA反转录成cDNA后,用qRT-PCR在mRNA水平上检测不同信号通路下游细胞因子IFN-β,TNF-α,IL-6,Ccl5和Cxcll0在mRNA水平表达的变化。
  2)敲低YIPF5的表达是否影响天然免疫信号通路中IRF3和TBK1磷酸化
  获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,向巨噬细胞中转染siYIPF5为实验组,同时以siCtrl做对照组。48h后转染ISD1h、2h、4h;LPS刺激0.5h、lh、2h;感染SeV2h、4h、6h,提取细胞总蛋白,用Western Blot在蛋白水平上检测IRF3和TBK1磷酸化水平的变化。
  3)敲低YIPF5的表达是否影响巨噬细胞抗病毒能力
  获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,转染siYIPF5,同时以siCtrl做对照组。用VSV-GFP感染4h、8h、12h,保留细胞上清培养液,用试剂盒提取细胞总RNA,反转录为cDNA后,用qRT-PCR在mRNA水平上检测IFN-β、VSVmRNA的表达;收集细胞培养液上清,在HEK293细胞中用病毒空斑实验检测病毒滴度;转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达,用VSV-GFP感染4h、6h,提取细胞总蛋白,检测细胞内VSV-G在蛋白水平的变化。
  4)YIPF5是否影响STING的聚集
  获得小鼠原代腹腔巨噬细胞,转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达后,转染ISD刺激细胞内STING发生转位,使STING活化聚集成大的复合物,通过免疫荧光染色在荧光显微镜下观察STING的聚集状态。
  构建YIPF5过表达载体,在Hela细胞中过表达YIPF5,以Vector为对照,同时转染STING-GFP,在荧光显微镜下观察STING-GFP的表达是否受影响。
  在Hela细胞中转染siCtrl或siYIPF524小时后,转染STING-GFP,24小时后在荧光显微镜下观察STING-GFP在核周的聚集状态。
  5)YIPF5是否与STING相互作用
  在Hela细胞中过表达STING-Myc,同时梯度过表达YIPF5-Myc,用Western Blot检测STING和STING-Myc在蛋白水平上的表达变化。
  在Hela细胞中过表达YIPF5,以Vector为对照,同时转染STING-GFP,24h后转染ISD激活STING使其转位发生二聚化,免疫荧光染色YIPF5,在荧光显微镜下观察STING与YIPF5是否存在共定位现象。
  获得原代小鼠腹腔巨噬细胞,转染ISD2h、4h后,用免疫共沉淀检测内源性YIPF5和STING的是否直接结合。
  研究结果:
  1)敲低YIPF5的表达下调天然免疫信号通路中多种细胞因子的表达
  在小鼠原代腹腔巨噬细胞中用小干扰RNA敲低YIPF5的表达后,转染ISD或感染LPS/SeV,激活细胞内多条免疫信号通路,用qRT-PCR检测多种下游细胞因子在mRNA水平的变化,发现敲低YIPF5的表达后,细胞内IFN-βmRNA水平表达下降,IFN-β相关基因Ccl5和Cxcl10在mRNA水平上表达下降;促炎因子TNF-α,IL-6mRNA水平表达下降。
  2)敲低YIPF5的表达下调天然免疫信号通路中IRF-3和TBK1磷酸化水平
  转染siRNA敲低巨噬细胞中YIPF5的表达,转染ISD或用LPS、SeV感染不同时间段之后,Western Blot检测结果显示转录因子IRF3、激酶TBK1在蛋白磷酸化水平均有明显下降趋势。
  3)敲低YIPF5的表达使巨噬细胞抗病毒能力减弱
  用VSV验证了YIPF5的抗病毒作用,发现敲低YIPF5表达后,VSV感染小鼠巨噬细胞引起细胞内IFN-βmRNA表达下降,而VSV mRNA水平表达上升,同时病毒空斑实验也发现YIPF5表达下降使VSV病毒滴度升高;VSV-G在蛋白水平表达上升。
  4)YIPF5影响STING的聚集
  在转染siRNA敲低小鼠原代腹腔巨噬细胞中YIPF5的表达后,转染ISD使STING活化,发生转位和聚集,然后对STING进行免疫荧光染色,在显微镜下观察STING的表达和聚集情况,发现在不给予ISD刺激时,实验组荧光强度相较于对照组较弱;在ISD激活STING后,实验组荧光强度相较于对照组则明显减弱;
  在Hela细胞中共转染STING-GFP和YIPF5-Myc,同时转染Vector做阴性对照,24h后收细胞做免疫荧光染色,发现过表达YIPF5对STING的聚集现象没有明显增强作用。
  在Hela细胞中转染siCtrl或siYIPF524小时后,转染STING-GFP,24小时后在荧光显微镜下观察STING-GFP在核周的聚集状态,发现对照组STING-GFP明显在核周聚集,而实验组相对分散。
  5)YIPF5与STING没有直接结合
  在Hela细胞中转染STING-GFP,同时梯度共转染YIPF5-Myc,24h后Western Blot检测发现细胞内STING和STING-Myc在蛋白水平没有明显变化。
  在Hela细胞中共转染STING-GFP和YIPF-Myc,24h后转染ISD使STING活化聚集,4h后收细胞做免疫荧光染色。在荧光显微镜下观察后,发现STING和YIPF5没有共定位现象。
  同时在小鼠原代腹腔巨噬细胞中转染ISD使STING活化,收细胞蛋白,用Co-IP检测STING与YIPF5在巨噬细胞内是否存在内源性结合,结果显示二者也没有直接结合。
  研究结论:
  1)YIPF5在抗病毒天然免疫中发挥作用,敲低YIPF5的表达影响IRF3和激酶TBK1的磷酸化,进而影响免疫应答下游多种细胞因子的表达。
  2)敲低YIPF5的表达会影响STING转位聚集,但YIPF5不影响STING的表达,而且YIPF5与STING没有直接相互作用。YIPF5调控STING转位的精确调控机制还需要进一步研究。
[硕士论文] 李晓梅
影像医学与核医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  目前仍然缺乏可以实现预期疗效的挽救终末期脏器功能衰竭的替代疗法。器官移植是迄今为止唯一有效的挽救患者生命的关键技术,而移植术后必然发生的针对移植物的免疫排斥反应是影响移植物长期存活的最大障碍。
  目前临床诊断急性移植排斥反应的监测手段主要包括临床症状观察、外周血相关生化指标检测、移植物病理学活检和影像学检查等,其中移植物病理学活检是最可靠的手段,是“金标准”。但是病理学检查的侵入性、创伤性及潜在并发症等问题严重限制了其临床应用,而其他检测手段及指标普遍缺乏敏感性和特异性,难以早期发现病变。因此寻找移植物表达的新的靶向分子,选择新的非侵入性检测手段,尽早发现并实时监测移植排斥反应,对于改善器官移植受者预后,阐明移植排斥机理具有重要意义,这也是是移植免疫学领域迫切需要解决的关键问题。
  本论文通过两部分研究抑制CDK9对TLR5靶向监测同种异体移植排斥的影响。一是体外研究抑制同种移植排斥反应效应细胞CDK9对TLR5表达的影响;二是体内研究抑制同种移植排斥反应效应T细胞CDK9移植物生存期的影响及对TLR5靶向监测同种异体移植排斥显像的影响。
  本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 抑制同种效应细胞CDK9对TLR5表达的影响及125I-anti-TLR5mAb制备
  研究方法:
  1.CCK-8法同种效应细胞增殖实验
  分别制备效应细胞(BALB/c小鼠脾细胞)和刺激细胞(经丝裂霉素处理的C57BL/6小鼠脾细胞),将二者进行混合淋巴细胞培养。实验分为对照组和CDK9抑制组(经CDK9抑制剂LDC000067处理),CCK-8法分别检测两组细胞增殖状况。
  2.Western blot检测蛋白表达状况
  利用不同浓度CDK9抑制剂(LDC000067)处理细胞,检测同种反应效应细胞CDK9表达状况。结合对细胞增殖结果的分析,获得CDK9抑制的最佳抑制剂浓度。利用CDK9抑制最佳浓度的LDC000067处理同种反应效应细胞,检测TLR5表达状况。
  3.125I标记抗TLR5抗体的制备
  参照文献提供的方法进行常规标记:Iodogen法常规碘化标记、制备125I-anti-TLR5mAb,并利用凝胶色谱柱Sephadex G-25进行洗脱纯化,计算标记率。
  研究结果:
  1.CDK9抑制对同种反应脾细胞增殖的影响
  结果显示,不同浓度的CDK9抑制剂LDC000067处理后,均可抑制同种反应细胞增殖,抑制细胞增殖的最佳浓度为5μM。
  2.CDK9抑制对同种反应脾细胞TLR5表达的影响
  结果显示,与对照组相比,不同浓度下CDK9抑制剂LDC000067处理同种反应细胞后,CDK9表达量均有不同程度的降低,浓度为5μM时同种反应效应细胞CDK9表达量最低。通过分析效应脾细胞增殖反应结果,确定LDC000067抑制CDK9的最佳抑制浓度为5μM。
  利用5μM的CDK9抑制剂LDC000067处理同种反应脾细胞,Western Blot分析TLR5表达,结果显示,与对照组相比,抑制组TLR5表达明显增加。
  3.125I-anti-TLR5的标记率、放化纯及稳定性
  利用Iodogen法制备125I-anti-TLR5mAb,标记率为96.2%。利用纸层析法得出比移值Rf为0.11;同样此方法得出标记物在生理盐水(NS)和人血清(Serum)中稳定性高,至72h仍维持在90%以上,且二者之间无明显差异。
  第二部分 抑制效应T细胞CDK9对同种移植模型小鼠TLR5靶向监测移植排斥影响
  研究方法:
  1.C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型的构建
  随机选取C57BL/6(B6,H-2b)小鼠(雌性,6-8周)作为供体;BALB/c-SCID(H-2d)小鼠(雌性,6-8周)作为受体,按照标准方法构建C57BL/6-SCID小鼠同种皮肤移植模型。
  术后3周,移植皮片部位生长出黑色毛发即为模型构建成功。
  2.分离纯化野生型BALB/c小鼠T细胞并分组
  按照常规方法分离野生型BALB/c小鼠脾细胞,并用Mouse T CellEnrichment Column分离纯化T细胞。随后分别用LDC000067(5μM)或等量的PBS处理T细胞6h;收集细胞后,用生理盐水重悬,过继转输至已经构建好的C57BL/6-SCID模型小鼠,分别建立T细胞介导的同种异体移植CDK9抑制组(LDC000067处理组)和同种异体移植排斥对照组模型(分别简称为抑制组和对照组)。
  3.CDK9抑制对T细胞介导同种异体移植物生存影响
  分别向同种移植模型小鼠过继转输两组T细胞后,每日观察两组小鼠移植皮片的变化,直至对照组移植皮片完全排斥,记录生存期。
  4.同种皮肤移植模型125I-anti-TLR5mAb的体内生物学分布分析
  在对照组排斥高峰期,选取两组小鼠,3% NaI喂水24h封闭甲状腺,分别经尾静脉注射125I-anti-TLR5mAb,注射标记物72h后处死小鼠,分别收集小鼠血、移植皮片、对侧正常皮片以及肝、肾、心等重要器官、组织,称重后,测量放射性,计算每克组织百分之标准标记物注射量(%ID/g),研究125I-anti-TLR5mAb在两组小鼠的体内生物学分布状况以及靶非靶比值(移植部位/对侧正常皮片,Target/Nontarget, T/NT ratio)。
  研究结果:
  1.成功构建T细胞介导的C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型
  同种皮片移植术后7天拆包,移植皮片与受体小鼠移植床贴合,移植皮片柔软、湿润、无颗粒感,周围无红肿、无渗液等感染表现;移植手术后的第3周,移植部位可见黑色毛发,表明C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型构建成功。
  分别过继转输两组野生型BALB/c小鼠脾T细胞后,未见异常反应;20天左右对照组移植部位出现排斥反应,表明成功建立了T细胞介导的C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型。
  2.CDK9抑制对T细胞介导同种异体移植物生存影响
  通过对模型小鼠移植皮片的观察和记录,结果显示对照组小鼠移植皮片平均生存期为(20±1.58)天,而抑制组小鼠移植皮片延长至(29±2.77)天。两者相比有统计学差异,P<0.05。结果提示T细胞CDK9抑制可以明显延长同种移植物的存活。
  3.125I-anti-TLR5mAb在模型小鼠的生物学分布
  两组小鼠尾静脉注射125I-anti-TLR5 mAb,72h后处死后,进行模型小鼠的生物学分布研究,结果显示:两组小鼠肝、肾以及移植部位皮片均具有较高的放射性计数,但抑制组移植皮片的放射性计数明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。CDK9抑制组的T/NT比值(3.7±0.16)显著高于对照组(2.02±0.06),差异有统计学意义(P<0.05)。
  4.模型小鼠全身动态磷屏放射性自显影显像
  两组小鼠注射标记物48及72h后,对照组及抑制组小鼠均可见移植皮片明显显影;与对照组相比,抑制组小鼠显影更明显。而TLR5阻断组,移植皮片在所有时间点均无明显显影。OptiQuantTM图像分析可得,组别与时间有交互作用,且三组之间的差异有统计学意义(均P<0.05),48h时间点上,抑制组放射性活度比明显高于对照组(2.35±0.19 vs.1.11±0.09,P<0.05);72h放射性活度比,与对照组(1.30±0.02)相比,抑制组(2.09±0.01)明显升高,而阻断组(1.09±0.04)明显降低,均具有统计学差异(P<0.05)。全身动态磷屏自显影显像结果与体内生物学分布结果一致。
  研究结论:
  1.CDK9抑制剂可明显抑制同种反应效应细胞增殖,促进其TLR5表达;抑制移植排斥效应T细胞CDK9可明显延长同种异体移植物的生存期;移植物炎性浸润明显减少,而TLR5表达增加。
  2.成功制备125I-anti-TLR5mAb;抑制效应脾细胞CDK9,明显促进脾细胞TLR5与标记物125I-anti-TLR5mAb的亲和力。抑制T细胞CDK9,可明显促进125I-anti-TLR5mAb在T细胞介导的同种移植模型中移植物的局部浓聚,结果提示抑制CDK9有利于体内TLR5靶向同种异体移植急性排斥的监测。
  创新点:
  1.CDK9抑制剂LDC000067可促进同种反应T细胞TLR5表达明显增高。
  2.抑制T细胞CDK9可促进125I-anti-TLR5 mAb同种移植物的局部浓聚,有利于TLR5靶向同种异体移植急性排斥监测。
[硕士论文] 龚明
口腔临床医学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:观察钛离子作用于Jurkat T淋巴细胞后KCa3.1通道表达情况及阻断KCa3.1通道前后细胞膜电位、胞内钙离子变化,探讨KCa3.1通道在钛离子对JurkatT淋巴细胞活化中可能存在的作用机制。
  方法:1、体外培养Jurkat T淋巴细胞,采用植物凝血素(PHA)预活化,CCK8法检测不同浓度钛离子对活化Jurkat T淋巴细胞的增殖影响。
  2、根据是否被植物凝血素(PHA)预活化,将Jurkat T淋巴细胞分为PHA(+)及PHA(-)两大组,两组分别加入浓度为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L钛离子,作用12h后,实时荧光定量多聚酶链反应技术(Real-time PCR)检测KCa3.1通道的表达量。流式细胞术检测TRAM-34阻断前后Jurkat T淋巴细胞膜电位及细胞内钙离子浓度的变化。
  结果:1、钛离子对预活化Jurkat T淋巴细胞随着钛离子的浓度的增加增殖更加明显(P<0.05)。
  2、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L浓度的钛离子在PHA(-)Jurkat T淋巴细胞作用的下培养12小时,随着钛离子浓度的增加KCa3.1mRANA相对于对照组表达增加,差异没有统计学意义(P>0.05)。25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L浓度的钛离子在PHA(+)Jurkat T淋巴细胞作用的下培养12小时,随着钛离子浓度的增加KCa3.1mRANA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。
  3.KCa3.1通道被TRAM-34阻断后,50μmol/L钛离子(PHA-)Jurkat T淋巴细胞组的膜电位与不加钛离子组比较差异无统计学意义(P>0.05),TRAM-34(+)与TRAM-34(-)组间比较差异有统计学意义(P<0.05);50μmol/L钛离子(PHA+)Jurkat T淋巴细胞组的膜电位与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),TRAM-34(+)与TRAM-34(-)组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。50μmol/L钛离子(PHA-)Jurka T淋巴细胞组的钙离子浓度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),TRAM-34(+)与TRAM-34(-)组间比较差异无统计学意义(P>0.05);50μmol/L钛离子组(PHA+)JurkatT淋巴细胞组的钙离子浓度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),TRAM-34(+)与TRAM-34(-)组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:1.100μmol/L以内的钛离子能增加活化Jurkat T淋巴细胞的增殖效应。
  2.钛离子可引起活化Jurkat T淋巴细胞KCa3.1通道表达的改变。
  3.KCa3.1通道可在一定程度上调节钛离子对活化Jurkat T细胞内钙离子浓度及膜电位。
[硕士论文] 李巧玲
生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:目前,抗体片段Fab在治疗人类多种疾病(如癌症、病毒感染、炎症等)方面起着重要作用。由于其缺少糖基化的Fc区,因此并不需要进行糖基化修饰。此结构特点使得Fab可在大肠杆菌中进行活性表达。Escherichia coli作为宿主菌株的突出优势在于低成本、生长快、易控制,在短时间内可以获得高产量,因此,已逐渐成为生产抗体的中坚力量。但是,在E.coli中生产抗体片段Fab的主要限制因素在于Fab的产量较低,原因主要是Fab易在胞质中错误折叠、聚集,形成无生物学活性的包涵体,且宿主菌中含有多种蛋白酶,对Fab有一定的降解作用等。因此,为提高抗体产量,可以从表达载体、宿主菌株、分子伴侣及折叠酶等几个方面着手,以期达到理想目标。
  本课题从三方面对Fab的表达进行了优化:1)在实验室前期工作基础上,以E.coli DH11T7为宿主菌株,通过构建不同的Fab表达载体,最终提高Fab在E.coli中的产量;2)在1)工作的基础上,通过共表达多种分子伴侣,进一步提高Fab在E.coli中的产量;3)在E.coli周质蛋白酶缺陷菌株DH11-ptr-degp(以下简称86D)的基础上,对其基因组上spr(extragenic suppressor,抑制prc基因缺陷造成的菌体过早裂解)基因H145A位进行单个氨基酸突变,获得突变菌株86D-Mspr,同时共表达优势Fab表达载体及分子伴侣,最终通过发酵实验,提高Fab在E.coli中的产量。
  对于Fab表达载体的构建,主要对信号肽进行优化。尤其是重链信号肽DsbA及STII,通过改变信号肽翻译起始区(translation initiation region,TIR)强度,将获得的13个重链片段分别与PelB-LC连接至pET-3b载体骨架,经ELISA分析获得了Fab最优表达载体的组合DsbA8+HC+PelB+LC(pET-DH8PL),总产量约14mg/L左右。通过进一步构建单一分子伴侣表达载体及多个分子伴侣表达载体,能够在一定程度上改善Fab在E.coli中的分泌表达,尤其当以p15c-FkpA-SurA组合时,Fab产量可达到20mg/L左右,产量提高了30%。将宿主菌株由E.coli DH11T7替换为E.coli周质蛋白酶缺陷菌株86D时,抗体片段Fab的产量可提高20%左右。
  E.coli属于原核表达系统,其发酵工艺相对简单,对表达宿主的大规模培养是为了获得大批量的抗体蛋白。本课题在实验室所构建的Red无痕敲除法的基础上,用类似的方法完成了对E.coli86D spr H145A单个氨基酸的突变,获得了基因组突变菌株86D-Mspr。第一步,将构建的供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB与辅助质粒pAAICDGBE共转入E.coli86D中,在L-阿拉伯糖的作用下,诱导表达Ⅰ-CreⅠ核酸内切酶和Red重组酶。Ⅰ-CreⅠ酶切割供体质粒上的左右同源臂及Cm抗性基因,并在Red重组酶的作用下,进行同源重组,最终在E.coli86D基因组上成功整合Cm抗性基因。第二步,将辅助质粒SN3K转化至第一步含Cm抗性基因的E.coli86D中,同样在L-阿拉伯糖作用下,诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶和Red重组酶。在Ⅰ-SceⅠ酶作用下,将基因组上的Is-Cm片段切除,同样在Red重组酶的作用下,左右同源臂与染色体发生同源重组,从而获得基因组突变菌株86D-Mspr。最终对其进行初步发酵工艺研究,在3L发酵罐中抗体片段Fab的产量可达到72mg/L左右。本工作为进一步提高抗体Fab产量打下了基础。
[硕士论文] 周林华
脊柱外科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的分选及鉴定
  目的:分选出纯度较高的人外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,为后续细胞实验的准确性提供保。
  方法:取健康志愿者外周血20ml,抗凝后置于冰上保存备用,用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血中的单个核细胞,将所得的单个核细胞经抗体孵育后,通过免疫磁珠分选法分选出CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,所得细胞经过流式抗体染色孵育后上流式细胞仪检测纯度。
  结果:通过免疫磁珠法分选得到的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞纯度都在90%以上
  结论:免疫磁珠分选外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,所得细胞纯度较高,可以满足后续实验。
  第二部分 力生长因子对人外周血调节性T细胞体外增殖的影响
  目的:探讨力生长因子(Mechano growth factor,MGF)对人外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)体外增殖的影响。
  方法:(1)用免疫磁珠法分选20毫升人外周血得到的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞,用羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)标记细胞后,通过CD3,CD28,IL-2刺激,以不同浓度MGF(0nM,10nM,100nM)干预细胞6d后,经流式抗体染色孵育后,上机检测细胞增殖情况。(2)分离4毫升外周血中单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),通过CD3,CD28,IL-2刺激,以不同浓度MGF(0nM,10nM,100nM)干预1d后,经流式抗体染色孵育,上机检测TREG细胞占PBMC的比例。
  结果:(1)在分离纯化的TREG细胞,MGF干预6d后二代细胞占总细胞比例,0nM MGF组为:49.66%±9.86%,10nnM MGF组为:58.66%±5.95%,100nM MGF组为:62.6%±4.66%。100nM MGF组的增殖效率高于0nM MGF组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)MGF干预1d后,PBMC中TREG细胞比例,0nM MGF组为:17.82%±1.23%,10nM MGF组为:20.73%±1.61%,100nnM MGF组为:20.29%±1.46%,1OnM MGF组和1OOnMMGF组比例都高于OnM MGF组(P<0.05)。
  结论:力生长因子MGF对人外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞体外增殖具有促进作用。
  第三部分 力生长因子对人外周血单个核细胞中Th17(T helper cell17)/Treg比例的影响
  目的:探讨力生长因子干预外周血单个核细胞后,外周血单个核细胞中Th17/Treg细胞比例的改变
  方法:抽取健康人4毫升外周血,用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出单个核细胞,经CD3,CD28,IL-2(interleukin-2)刺激后,以不同浓度MGF(0,10,100nM)干预1d后,经流式抗体染色孵育,上流式细胞仪检测不同药物浓度Th17与Treg在PBMC中的比例,并计算出不同药物浓度下Th17/Treg比值。
  结果:不同浓度力生长因子干预PBMC1d后,各组Treg细胞占PBMC比例为,0nM MGF组为:21.80%±1.02%,10nM MGF组为:23.55%±1.16%,100nM MGF组为:23.28%±0.70%;各组TH17细胞占PBMC比例为,0nMMGF组为:10.04%±2.08%,10nnM MGF组为:9.29%±1.85%,100nM MGF组为:6.48%±1.26%;各组Th17/Treg比例为,0nM组比值为:0.46±0.10,10nM组比值为0.40±0.09,100nM组比值为0.29±0.06,100nM组Th17/Treg比例与0nnM组相比,明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)
  结论:力生长因子MGF干预外周血PBMC后,外周血PBMC中Treg比例增高,Th17比例降低,Th17/Treg比值下降。
[博士论文] 陈班茹
细胞生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:小肠中存在大量肠道菌群,而上皮层则是位于宿主和肠道菌群之间的重要物理屏障。其中,肠道上皮细胞由位于肠腔一侧的一层单细胞层组成,这群细胞面对着寄居在肠道中数以亿计的共生菌群。肠道上皮淋巴细胞(IEL)则是定位于肠道上皮组织细胞之间的淋巴细胞,它参与抵御病原体的保护性免疫反应,并帮助机体维持对共生菌的耐受,在维持肠道组织稳态的过程中发挥了重要作用。
  这群位于前线部位的IEL几乎全部由T细胞组成,并且以CD8+T细胞为主。根据其T细胞受体以及共受体表达的差异,可以将IEL分为两大类:A型IEL和B型IEL。其中,A型IEL是一群经过抗原活化的细胞毒T细胞,主要由CD8αβ+IELs组成,它们在定位到肠道上皮之前,预先在派氏结或肠系膜淋巴结经过了抗原的活化,同时,这群CD8αβ+IELs具有很强的细胞毒效应,并且其数量会随着年龄增长而逐渐增多。这群IEL在肠道上皮中面临更多的是肠道中的共生菌群,而不是入侵的病原菌,由此提出了两个问题:CD8αβ+IELs针对肠道共生菌群会有怎样的效应功能?CD8αβ+IELs在面对肠道共生菌时是否会发挥除了细胞毒效应之外的功能?这群CD8αβ+IELs和肠道共生菌之间的功能关系目前还不明确,针对这些问题展开了以下研究。
  目前取得的主要工作结果包括四个部分:
  1.共生菌可以调控CD8αβ+IELs在小肠上皮的累积
  为了进一步探讨CD8αβ+IELs和肠道共生菌之间的作用,首先关注了它们之间的正向调控关系。实验发现,在无菌小鼠和抗生素水处理后的小鼠中,肠道上皮CD8αβ+IELs的数量和比例显著低于对照组小鼠,说明肠道共生菌能调控CD8αβ+IELs在肠道上皮中的数量。进一步比较抗生素水饲喂以及正常水饲喂小鼠的肠道微生物DNA总量后,发现在抗生素处理后的小鼠中,肠道菌群总载量出现了大幅降低,这进一步提示了肠道上皮CD8αβ+IELs的数量和肠道菌群的载量正相关。同时,抗生素水处理组小鼠中肠道菌群的组成也发生了明显变化,其中最突出的变化是放线菌门和拟杆菌门的细菌大幅减少。抗生素单独处理的模型也提示了,肠道中影响CD8αβ+IELs数量的是一群氨苄青霉素敏感的细菌。
  为了进一步探究在抗生素处理过程中被大量清除的拟杆菌门和放线菌门是否可以诱导CD8αβ+IELs,选择了拟杆菌门中的益生菌——双歧杆菌来进行菌种移植的实验。在抗生素的初步处理后,小鼠肠道中原有的双歧杆菌被完全清除。之后,对小鼠进行了双歧杆菌的灌胃处理,灌胃9天后对小鼠粪便样本进行定量PCR检测,结果显示小鼠肠道中成功植入了双歧杆菌。植入双歧杆菌15天后,肠道上皮中CD8αβ+IELs数量明显增多,证明肠道中一些特定的共生菌(如双歧杆菌)可以诱导CD8αβ+IELs的产生。
  2.共生菌依赖的CD8αβ+IELs在肠道上皮的聚集需要Toll样受体信号
  Toll样受体(TLR)在肠道巨噬细胞、树突状细胞和肠道上皮细胞中有广泛的表达,并且可以识别多种共生和病原相关分子模式,因此关注了TLR信号在调控A型IEL方面的作用。在多种TLR缺陷鼠(包括TLR2缺陷鼠,TLR4缺陷鼠,TLR9缺陷鼠及其联合缺陷鼠)中均发现了CD8αβ+IELs的数量减少,这一现象和抗生素处理组小鼠一致,这一结果说明肠道共生菌通过TLR信号影响了CD8αβ+IELs在肠道上皮中的数量,此外,CD8αβ+IELs上本身并没有TLR的表达,因此TLR信号对CD8αβ+IELs的调控作用是间接的。
  3.CD8αβ+IELs具有潜在的杀菌活性
  已经证明了共生菌对CD8αβ+IELs在肠道上皮中的数量维持十分重要,下一步想到的是:CD8αβ+IELs是一群具有细胞毒效应的T细胞,为什么它们的数量会和肠道共生菌存在这样的正相关性?在稳态状况下,这群CD8αβ+IELs在细胞毒效应之外,是否具有一些和肠道共生菌相关的其他功能?为了进一步对这些问题进行研究,通过基因芯片分析对比了CD8αβ+IELs和脾脏中的CD8αβ+脾脏淋巴细胞(CD8αβ+SPLs)。基因芯片的结果显示,在没有经过任何体外刺激的情况下,CD8αβ+IELs中一系列和抗菌过程相关的基因均出现上调表达,且上调倍数在20倍以上,这些基因包括Defa1,RegⅢγ,ypd8。而在CD8αβ+IELs中上调表达的基因里,上调表达最明显的是α-防御素家族的基因,其中包括mmp7,它所编码的基质金属蛋白酶MMP7可以将无活性的α-防御素前体加工为成熟的活化形式。进一步通过RT-PCR,流式细胞术和免疫荧光实验证明了CD8αβ+IELs在基因和蛋白水平都能表达α-防御素。此外,在无菌小鼠和抗生素处理组小鼠中,defensin1+CD8αβ+IELs的数量都显著低于对照组中未处理的SPF级小鼠,这进一步证明了defensin1+CD8αβ+IELs的存在也依赖肠道共生菌。综上,证明了CD8αβ+IELs能够产生抗菌肽并且这群能产生抗菌肽的CD8αβ+IELs数量与肠道共生菌正相关。
  4.CD8αβ+IELs的分泌产物能抑制细菌的生长
  防御素是一种广谱的抗菌肽并且针对多种细菌都有抗菌作用,因此,在确认了CD8αβ+IELs中α-防御素的表达之后,通过体外实验进一步研究了CD8αβ+IELs的抗菌活性。分选出CD8αβ+IELs和CD8αβ+SPLs并在体外分别培养24小时,在培养的最后6小时中加入PMA和离子霉素进行刺激,并收取细胞培养上清进行抗菌活性的检测。在抗菌实验中,添加了CD8αβ+IELs刺激培养上清的牛津杯周围形成了清晰的抑菌环,说明CD8αβ+IELs的分泌产物可以抑制细菌生长,这一抑菌活性很可能来自于CD8αβ+IELs分泌的防御素等抗菌肽。此外,IL-15刺激后CD8αβ+IELs的培养上清周围同样出现了抑菌环,且抑菌环直径显著大于未刺激组,进一步提示IL-15可以促进CD8αβ+IELs的抑菌活性。
  总结:综上所述,作为肠道上皮淋巴细胞中的重要组成部分,CD8αβ+IELs和肠道共生菌密切相关,而CD8αβ+IELs在细胞毒作用之外的功能尚不明确,其在稳态过程中的作用也值得进一步探究。在我们的研究中,首先确认了肠道共生菌能够调控CD8αβ+IELs在肠道上皮中的数量,并且这一调控作用是通过TLR信号进行的。此外,证明了一些特定的共生菌能够诱导CD8αβ+IELs的增多。进一步的基因芯片分析发现,在这群共生菌依赖的CD8αβ+IELs中,一系列编码抗菌肽的基因都出现了上调表达,并且CD8αβ+IELs的分泌上清具有直接的抗菌活性,说明共生菌依赖的CD8αβ+IELs能够有效地抑制细菌生长。总之,我们的研究发现,CD8αβ+IELs受到肠道共生菌的调控,同时,其分泌产生的抗菌肽也能抑制细菌的生长,CD8αβ+IELs和肠道菌群的这一相互作用共同促进了肠道微环境的稳态。
[硕士论文] 王建
有机化学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:本论文分为两个部分:第一部分涉及用活泼酯的方法制备蛋白质偶联复合物;第二部分研究抗肿瘤糖疫苗的抗体免疫反应。探讨NKT细胞激动剂和肿瘤糖抗原之间的共价连接臂对于疫苗免疫活性的影响。
  目前,在活泼酯连接法中,N-羟基琥珀酰亚胺酯连接臂有较高的反应性,但缺乏足够的稳定性,而对硝基苯酚连接臂有较高的稳定性,但反应性不足。如何平衡反应性与稳定性,使活泼酯达到较高的偶联效率是本论文研究的问题。本文系统研究了五种活泼酯(即N-羟基琥珀酰亚胺酯、苯硒酚酯、对硝基苯酚酯、四氟苯酚酯和五氟苯酚酯)和苯乙胺在三种不同pH值条件下的反应性。随后制备出相应的己二酸二酯连接臂,并将它们应用到功能分子与蛋白质的偶联反应中。结果表明:相对于N-羟基琥珀酰亚胺酯和对硝基苯酚酯,四氟苯酚酯、五氟苯酚酯和苯硒酚酯能够较好的平衡反应性与稳定性。采用四氟苯酚酯、五氟苯酚酯和苯硒酚酯的连接臂,能够使功能分子与蛋白质达到较高的偶联效率。
  肿瘤癌细胞表面通常会过量表达一些肿瘤相关糖抗原,而糖抗原是非T细胞依赖性抗原,无法激活辅助T细胞,帮助B细胞实现从IgM到IgG的抗体类型转换。本课题组发现将肿瘤糖抗原和NKT细胞激动剂共价偶联,制备疫苗STn-αGalCer,该疫苗无需引入辅助T细胞表位肽,能迅速引发针对肿瘤糖抗原的高滴度的IgG抗体免疫反应。为了研究NKT细胞激动剂和肿瘤糖抗原之间共价连接臂对疫苗免疫活性的影响,本文比较了共价偶联疫苗(STn-αGalCer)和非共价偶联疫苗(STn-βGalCer/αGalCer)的抗体免疫反应。结果表明:STn-βGalCer/αGalCer可以引发和STn-αGalCer相似的针对STn的IgG抗体滴度。
[硕士论文] 李雪
内科学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  一、归巢肽修饰的外泌体靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞
  目的:外泌体是由细胞膜两次内陷形成的直径约40-120nm的囊泡,是体内细胞-细胞之间通讯及物质交换的重要途径。外泌体避免了其它传统基因运送载体(质粒、病毒、脂质体等)的诸多缺陷:如载体毒性,失靶现象,低效基因运送,体内快速清除,生物半衰期短,引起炎症、免疫反应,致瘤性等。外泌体具有天然、稳定、良好的生物分布、相容性、及低免疫源性等特性。此外,外泌体可穿过生物屏障并能够携带单一或随意组合的治剂等优点。天然未经修饰的外泌体经系统给药后,会优先分布于肝、肾、脾等器官而被很快清除。利用基因工程可以将归巢肽展示在外泌体表面,从而增加外泌体在体内的滞留时间,加速所携带药物向靶器官运送的速度,并增加药物在靶器官的浓度。由于外泌体在形成过程中选择性的富集来源细胞的各种信号分子,且外泌体的组成可以反应来源细胞的生理及病理状态,因此,外泌体已被广泛用于许多疾病包括心血管疾病的诊断、治疗及预防。本研究旨在前期构建的携带有靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞能力的归巢肽质粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-mLAMP2b-CSTSMLKAC)的基础上进一步探讨经基因工程修饰后的外泌体是否可以将归巢肽展示在外泌体表面,及该外泌体是否具有靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞的能力,从而为缺血性心脏病的靶向治疗提供一种全新的、理想的运送载体。
  方法:HEK293T细胞上通过Lipofectamine2000转染携带具有靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞能力的归巢肽质粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-mLAMP-2b-CSTSMLKAC)和携带FLAG标签的对照质粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-mLAMP-2b-DY-KDDDDK),48小时后收取细胞培养基,采用差速超速离心法提取细胞培养基中的外泌体。通过电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析仪、Western blot方法对外泌体进行鉴定;免疫沉淀技术证明FLAG标签是否成功的展示在外泌体表面;利用胰酶联合Ⅱ型胶原酶两步法分离培养原代乳大鼠心肌细胞,加入250μM氯化钴共同培养12小时,然后正常培养2小时复制心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型;采用qPCR检测缺氧诱导因子-1A的表达及乳酸脱氢酶试剂盒测定培养基中乳酸脱氢酶的活性对H/R-CMs模型进行鉴定;荧光染料(红色荧光)标记靶向外泌体并分别加入正常的乳大鼠心肌细胞及缺氧/复氧的心肌细胞,细胞免疫荧光技术检测外泌体的分布情况。
  结果:(1)电镜下差速超速离心法分离得到的外泌体大小在100nm左右,具有球型的膜性结构,Western blot显示该外泌体为CD9和CD63蛋白阳性,并且非外泌体标志蛋白GRP94和Calnexin阴性;纳米颗粒跟踪分析仪示显示外泌体直径集中在50-100nm;(2)免疫沉淀结果显示FLAG标签成功的展示在了外泌体表面。(3)氯化钴共同培养的心肌细胞相比正常心肌细胞缺氧诱导因子-1A的表达水平明显上调(p<0.01);H/R-CMs组细胞培养基中乳酸脱氢酶的活性比正常心肌细胞培养基中乳酸脱氢酶的活性明显升高(P<0.01);(4)细胞免疫荧光示H/R-CMs中分布了较多的红色荧光,而正常心肌细胞中未见红色荧光。
  结论:靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞的归巢肽成功地展示在外泌体表面,经修饰后的靶向外泌体具有靶向缺氧/复氧心肌细胞的能力。
  二、人食道癌相关基因4在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及机制研究
  目的:探讨人食道癌相关基因4(Ecrg4)在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其机制。
  方法:采用结扎小鼠左冠状动脉前降支及分离培养的乳大鼠心肌细胞经氯化钻处理分别建立体内及体外水平的心肌缺血/再灌注损伤模型,实时荧光定量PCR, Western blot及免疫组化检测Ecrg4在心肌缺血/再灌注损伤后表达水平的变化。荧光素酶活性检测ECRG4启动子对缺氧的反应。实时荧光定量PCR C qPCR)法检测心肌细胞过表达 Ecrg4后在发生缺氧/复氧损伤后炎症相关基因(IL1,CD44,NF-KB)及凋亡相关基因(Bcl2及Bax)表达水平的变化,流式细胞术检测心肌细胞过表达Ecrg4后心肌细胞的凋亡情况。
  结果:1.qPCR,Western blot及免疫组化显示Ecrg4在心肌缺血/再灌注损伤发生后其表达水平快速下调;2.ECRG4基因启动子(EP400)-304到-300含有的经典缺氧反应元件(HRE),对氯化钻诱导的缺氧高度敏感。HIZE突变后(EP404mut)明显减低该启动子对氯化钻诱导的缺氧反应,HIF-1A显著抑制了EP400的启动子活性,而EP400mut则丧失了对HIF-lA的反应性(p<0.01);3.心肌细胞过表达Ecrg4后炎症相关基因(IL 1, CD44, NF-KB)表达明显下调及抗凋亡基因Bcl2表达上调,促凋亡基因Bax下调(p<0.5);4.流式细胞分析显示过表达Ecrg4后心肌细胞凋亡率明显下降。
  结论:1.Ecrg4在心脏对缺氧的反应性中起重要的作用;2.Ecrg4在心肌缺血/再灌注损伤后表达下调,过表达Ecrg4后,炎症因子及促凋亡相关基因的表达明显下调,抗凋亡相关基因明显上调,提示Ecrg4在心肌缺血/再灌注中起心脏保护作用,其机制为减轻心肌细胞炎症反应及减少心肌细胞的凋亡。
[硕士论文] 欧阳生群
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:节球藻毒素-R(NOD-R)是由丝状浮游蓝藻节球藻(Nodularia spumigena)产生的一种蓝藻肝毒素。研究表明,NOD-R不仅具有强烈的促癌作用,而且还是一种致癌剂。NOD-R的水溶性强、热稳定性好,而且耐受pH变化,因此,现有的自来水处理工艺,如沉淀、过滤和活性炭吸附等都无法将其完全去除。吸入NOD-R污染的水和误食NOD-R污染的水产品是导致中毒的主要途径。NOD-R是通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1(PP1)和2A(PP2A)的活性来发挥毒性作用的,其中毒症状主要表现为腹泻、乏力、厌食等,甚至死亡。目前,常用的NOD-R的检测方法主要有三种,即生物分析法、物理化学分析法和免疫化学法。但是,这些检测方法都存在一定的局限性,例如特异性差、成本高、耗时长等,亟需发展一种可以克服传统方法缺点的新型检测方法。
  适配体是一种新型分子识别元件,被誉为“化学抗体”。研究者们通过将其与生物传感器相结合,开发出了新的检测方法,并被广泛应用于毒品检测、食品安全和分析诊断等领域。本课题组通过磁珠筛选法(MB-SELEX)获得了NOD-R的最佳适配体N13,该适配体能够以很高的亲和力(KD=138 nM)和NOD-R特异性结合。根据在线工具themfold web server对适配体N13二级结构的预测结果,本课题组对适配体N13进行了截短优化,并获得了其核心区域N13-T-O2。优化后,适配体N13-T-O2与NOD-R之间的亲和力有所提高(KD=29.6 nM)。
  生物膜干涉(BLI)技术是一种无需标记的技术,可以提供实时、高通量的生物分子相互作用信息。因此,借助BLI技术平台,本课题组以适配体N13-T-O2为识别分子,成功构建了一种灵敏度高、特异性强的NOD-R适配体传感器。该适配体传感器能够在15 min内完成NOD-R的检测,其线性检测范围为40-200 nM,检测限为167 pM,而且不和NOD-R类似物MC-LR以及其他类型的毒素,如GTX、STX、BTX和PTX等发生交叉反应。另外,该适配体传感器具有很好的稳定性和重复性(CV=8.23%)。为了评估该适配体传感器在实际样品检测中的应用潜能,本课题组还将该其应用于自来水中NOD-R的检测,结果表明该适配体传感器具有较高的回收率(91.92~102.16%)和较低的CV值(1.31~3.73%)。
  综上所述,本课题组获得了高亲和力、强特异性的NOD-R适配体N13-T-O2,并且,基于该适配体,构建了BLI适配体生物传感器,具有特异性强、灵敏度高、以及稳定性好等优点。因此,我们相信,这种新型BLI适配体传感器检测法有望成为NOD-R准确和快速检测方法的雏形,并为传统NOD-R检测方法的更新提供基础。
[硕士论文] 卢浩
生物学 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过观察交感神经阻断后,小鼠子宫蜕膜抗原提呈细胞膜分子及NF-κB表达的变化,探讨交感神经对小鼠子宫局部免疫微环境的影响及作用机制。
  方法:将40只昆明种雌性小鼠随机分为两组:对照组20只(A组,生理盐水注射组)、实验组20只(B组,6-OHDA注射组)。A组小鼠采用腹腔注射法每日下午2点注射0.2ml灭菌生理盐水(溶液含0.01%抗坏血酸),B组小鼠则采用腹腔注射法每日下午2点注射0.2ml的6-OHDA溶液(溶于含0.01%抗坏血酸的灭菌生理盐水中),连续注射五天后分别按雌雄2∶1合笼受孕,小鼠受孕后第一天记为D1,而后依次在D1、D3、D5、D7、D9的14:00时剖取小鼠子宫。采用免疫组织化学法检测小鼠子宫CD23、CD209、CD11b的蛋白表达量,原位杂交检测CD23、CD209和CD11b的mRNA水平,ELISA检测小鼠子宫NF-κB含量。
  结果:(1)与对照组相比,实验组小鼠子宫组织内的CD23、CD11b和CD209的蛋白表达量与mRNA表达水平在D1、D3和D9均减少,且存在显著性差异。在子宫各部位中,子宫内膜CD23、CD11b和CD209表达最多,注射6-OHDA后,除D5外,各项指标各时间点均有所下调。(2)对照组子宫组织中CD23、CD11b和CD209蛋白与mRNA在D3时表达最多,而后随着时间推移开始下降并逐渐趋于平稳,实验组则在D5达到峰值,而后开始下降。(3)与对照组相比,实验组子宫中NF-κB含量在注射6-OHDA后全部上调且达到了显著水平,但在D5开始下降。
  结论:(1)交感神经可能通过正向调控CD23+B细胞、CD209+树突细胞和CD11b+巨噬细胞以形成良好的母胎免疫耐受环境,此三种细胞变化趋势具有同向性。(2)通过调节蜕膜抗原提呈细胞CD23、CD209和CD11b的表达,可能是交感神经参与子宫局部免疫耐受形成的途径之一。(3)交感神经可能通过NF-κB信号通路调节CD23、CD209和CD11b的表达量以调控抗原提呈细胞功能活性。
[博士论文] 张子腾
卫生毒理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  当前人们工作竞争激烈,生活节奏加快,不可避免地处于应激状态。持续的应激状态会对人体的正常生理机能造成严重影响,进而导致多种疾病发生发展,其中就包括疲劳[1]。疲劳以及过劳已经日益成为全球性公共健康问题。长期的疲劳会造成学习记忆能力下降和及工作效率低下,影响人们正常生活,甚至可能引发安全生产问题。特别在高强度的军事冲突或非战争军事行动中,疲劳应激损伤严重影响战士身体健康。因此研究疲劳发生发展过程中的相关机制,并开发有效的抗疲劳药物具有非常重要的科学意义和社会意义。
  疲劳发生的病理生理机制复杂,目前尚不明确。现有的观点认为,疲劳的发生是神经系统、免疫系统以及内分泌系统等多因素共同参与的结果[2]。研究表明疲劳发生发展过程中免疫系统异常激活,体内多种炎症因子水平(如白介素-1β,IL-1β等)显著升高,并作用于中枢神经系统,诱导机体产生疲劳样症状[3]。
  炎症小体的研究近年来受到了越来越多的关注。NLRP3炎症小体是机体固有免疫的重要组成部分,它可以通过自身的NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)识别损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)以及病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),进而激活下游的信号转导通路,并诱导机体产生适应性免疫应答[4]。当被激活时,NOD样受体将募集凋亡相关斑点样蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和半胱天冬氨酸蛋白酶前体pro-Caspase-1形成多蛋白复合体,即NLRP3炎症小体。活化的NLRP3炎症小体可以切割pro-Caspase-1生成活化的Caspase-1,活化的Caspase-1可以切割IL-1β及IL-18前体并生成有活性的IL-1β及IL-18,并分泌到胞外,发挥致炎作用。炎症小体的适当活化可以抵抗病原体感染和减轻应激损伤,但是当其活化失控时也能造成炎症效应的放大和器官损伤[5]。
  目前已有研究发现,慢性疲劳综合症(chronic fatigue syndrome,CFS)患者的血清中IL-1β水平显著升高,而IL-1β是NLRP3炎症小体活化后的重要产物,因此推测NLRP3炎症小体可能参与了疲劳的发生发展。但是对于NLRP3炎症小体是否参与疲劳的发生发展,以及涉及的具体机制目前尚无文献报道。因此深入研究NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用及其相关分子机制,对于阐述疲劳的发生机制,以及提出新的疲劳防治策略具有重要意义。
  研究目的:
  本研究拟利用急性疲劳和慢性疲劳两种小鼠模型,检测中枢神经系统中NLRP3炎症小体的激活水平;利用Nlrp3基因敲除(Nlrp3/-)小鼠明确NLRP3炎症小体在疲劳发生中的作用;检测活性氧水平,阐明NLRP3炎性小体激活的活性氧机制;最后应用Ω-3不饱和脂肪酸对上述疲劳模型进行干预,验证NLRP3炎症小体和活性氧在改善和治疗疲劳过程中的作用。
  研究方法:
  本课题首先探索建立了(1)急性疲劳模型:脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)复合强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型;(2)慢性疲劳模型:反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型。选择小鼠的自发活动距离和转棒仪在棒时间作为其疲劳状态的行为学指标,判定疲劳模型是否成功以及小鼠的疲劳程度。
  然后以小鼠中枢神经系统作为研究靶器官,检测NLRP3炎症小体在中枢神经系统中的激活水平。
  再次对Nlrp3-/-小鼠进行相同的疲劳模型建模处理,并检测包括自发活动距离和转棒仪在棒时间在内的行为学指标。同时检测野生型和基因敲除型小鼠脑中活性氧的生成情况,探究NLRP3炎症小体活化的具体机制。
  最后,选用Ω-3不饱和脂肪酸—DHA对反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳进行干预,进一步验证NLRP3炎症小体作为疲劳治疗靶点的价值。
  研究结果:
  1、NLRP3炎症小体参与了LPS复合强迫游泳诱导的小鼠急性疲劳模型
  1.1成功建立小鼠急性疲劳模型,建立的方法是先在小鼠腹腔注射3mg/Kg LPS然后进行强迫游泳20min,小鼠出现了明显疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,说明模型建立成功。
  1.2该疲劳模型小鼠血清IL-1β和IL-6含量的升高,脑中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA和蛋白表达水平升高,免疫荧光结果显示NLRP3炎症小体组装形成并激活。
  1.3与野生型小鼠相比,Nlrp3-/-小鼠在LPS复合强迫游泳诱导下所表现的疲劳行为显著减轻。Nlrp3-/-小鼠在相同的LPS复合强迫游泳诱导下脑组织中Caspase-1酶的激活显著减少,并伴有IL-1β水平的明显降低。
  2、NLRP3炎症小体参与了反复强迫游泳诱导的小鼠慢性疲劳模型
  2.1成功建立小鼠慢性疲劳模型,通过反复强迫游泳,负重每12h游泳10min,连续持续14天,建立了慢性疲劳模型。反复强迫游泳可以诱导野生型小鼠产生明显的疲劳样行为,表现为小鼠自发活动距离缩短,转棒仪在棒时间缩短,与之相比,Nlrp3-/-小鼠的疲劳样行为明显减轻。
  2.2反复强迫游泳建立的慢性疲劳模型,野生型小鼠大脑前额叶皮质脑区的NLRP3炎症小体显著组装并活化,IL-1β水平显著升高。和野生型疲劳小鼠相比,Nlrp3-/-小鼠的疲劳样行为显著减轻,并伴有前额叶皮质脑区和血清中IL-1β的水平显著降低。
  2.3在反复强迫游泳诱导的疲劳下,野生型和Nlrp3-/-小鼠脑中的活性氧水平,血清中丙二醛都显著升高,但在野生型和Nlrp3-/-小鼠之间的差异没有统计学意义。
  3、Ω-3不饱和脂肪酸在反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳模型中的作用及其可能机制
  3.1Ω-3不饱和脂肪酸可以明显改善反复强迫游泳诱导的小鼠疲劳样行为,小鼠自发活动距离和转帮仪在棒时间显著延长。
  3.2Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制反复强迫游泳诱导的疲劳小鼠前额叶皮质脑区中NLRP3炎症小体的组装激活、IL-1β的升高以及疲劳小鼠脑中活性氧的生成来改善疲劳状态。
  研究结论:
  本课题发现中枢神经系统NLRP3炎症小体激活导致两种不同模型的疲劳发生;NLRP3-IL-1β通路在疲劳发生过程中起重要作用。Ω-3不饱和脂肪酸通过抑制NLRP3炎症小体的激活和活性氧的生成,进而缓解小鼠疲劳样行为。
[硕士论文] 先德群
免疫学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:胸腺基质细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)于20多年前,被鉴定为小鼠胸腺基质细胞系分泌的一种细胞因子。不久后,相应的人类直系同源基因也被发现。目前,TSLP所介导的信号传导通路已被广泛研究,包括上调多种Th2相关疾病的细胞因子,如:哮喘、遗传过敏性皮炎、超敏反应,甚至有部分癌症也与之相关。所以,TSLP被认为是治疗相关疾病的潜在靶标[1]。自1975年杂交瘤技术问世以来,人们能制备具有良好特异性的单克隆抗体。但由于此类单抗的鼠源性,在用于治疗人类疾病时,会产生强烈的人抗鼠抗体反应(HAMA)[2,3],导致临床应用受到限制。目前的抗体药物领域的研究热点,主要集中于利用基因工程技术,将鼠源抗体进行人源化改造[4-6]。单克隆抗体药物的发展先后经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体四个阶段[7]。本实验平台前期构建大库容量全人源抗体文库和噬菌体展示技术,筛选获得了anti-TSLP-scFv(抗胸腺基质细胞生成素全人源单链抗体),很好的解决了免疫原性问题,但通过此技术获得的抗体亲和力较低[8,9]。本研究通过计算机辅助技术对抗体和抗原进行同源建模,并通过分子对接和分子动力学模拟,预测可以提高抗体亲和力的氨基酸残基,进行定点突变,以促进抗TSLP人源重组抗体的体外亲和力成熟。
  方法:本研究前期,已通过噬菌体展示技术从全人源抗体文库筛选了特异性好的抗TSLP-scFv(84),并通过基因公司测序,获得了该抗体的DNA序列。1.本研究利用计算机辅助技术构建TSLP和抗TSLP-scFv的同源三维模型,并使用分子对接技术进行分子动力学及力场模拟,获得合理稳定的对接模型。通过丙氨酸扫描及单点突变,预测出突变后能提高抗体亲和力的氨基酸位点。2.根据突变位点设计特异性引物,采取重叠PCR原理,对目的片段进行单点突变,获得突变后的抗TSLP-scFv的DNA序列。将突变后的序列与原核表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF'感受肽,表达后通过ELISA筛选出亲和力提升的抗TSLP-scFv菌株。3.将亲和力提升的抗体基因插入真核表达载体PCDNA3.1-sp-Fc和PMH3en,转染HEK-293T细胞,表达抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定获得的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。4.通过生物大分子相互作用技术检测重组抗体的亲和力。
  结果:1.利用计算机Discovery studio4.5系统,建立TSLP抗原和抗TSLP-scFv三维模型。通过BLAST Search(NCBI Server)搜索到与TSLP和抗TSLP-scFv序列相似度最高的5J11A和4KFZ C(VH)/4HS6A(VL)作为初始模型。通过ZDOCK对蛋白质进行对接计算,基于CHARMm力场能量,使用RDOCK对ZDOCK寻找到的对接复合物构型进行优化。通过分子动力学模拟,获得最终的对接稳定构象Pose50。通过对接表面氨基酸分析,进行丙氨酸扫描及饱和突变,确定虚拟突变后亲和力提升的氨基酸组合为TRP(109)-ARG,TRP(109)-LYS,TRP(109)-TYR,TRP(109)-LEU,TRP(109)-GLU。2.通过突变位点的特异性引物相互配对,扩增出突变点前片段大小约为300bp,突变点后片段大小约为450bp。重叠延伸PCR连接后的抗TSLP-scFv基因片段大小约为750bp。3.将突变后的抗TSLP-scFv基因序列插入表达载体pLZ16,测序验证重组成功的质粒转化E.coli DH5αF'。通过原核系统表达抗TSLP-scFv,ELISA筛选出突变后的M4亲和力明显提升。4.突变前的84和突变后的M4基因序列,成功重组到真核表达质粒PCDNA3.1-sp-Fc和pMH3en,转染HEK-293T细胞后表达的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白,经SDS-PAGE、Western blot鉴定大小约为67KD。5.生物大分子相互作用技术(BIAcore)测定突变后的M4,亲和力较突变前提高了约10倍。
  结论:利用计算机辅助技术,成功促进了抗TSLP重组抗体的体外亲和力成熟。
[博士论文] 张华
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:机体天然免疫系统(innate immune system)能够识别和清除感染病原体,从而抵抗病原体感染与损伤。天然免疫系统主要由天然免疫细胞以及相关细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),启动细胞内天然免疫信号转导,产生Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ)和促炎细胞因子,以抵抗病原体感染。
  RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptors,RLRs)属于PRRs中的一类关键受体,在细胞浆中识别RNA病毒,介导抗病毒天然免疫反应,在机体天然免疫应答中发挥着至关重要的作用。RIG-Ⅰ作为RLRs中的最关键的受体分子,可以通过识别RNA病毒或病毒复制中产物,通过接头分子MAVS,活化TBK1-IRF3信号,激发IFN-Ⅰ产生,从而抵抗病毒感染。在RIG-Ⅰ发挥功能的过程中,磷酸化修饰和泛素化修饰以及相关的酶分子发挥了重要的调控作用,影响着RIG-Ⅰ信号的起始、传递和终止等进程,进而维持着机体的免疫平衡。基于我们前期对RIG-Ⅰ信号转导通路的研究,我们通过IP-MS技术鉴定与RIG-Ⅰ相互作用的蛋白质分子及其翻译后修饰类型。通过分析质谱数据,我们发现RIG-Ⅰ的相互作用分子中包括甲基转移酶、乙酰基转移酶、E3泛素连接酶、激酶/磷酸酶、代谢以及RNA修饰相关分子等,小鼠RIG-Ⅰ(mRIG-Ⅰ)的翻译后修饰类型包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化修饰等;其中,许多相互作用分子和翻译后修饰在RIG-Ⅰ信号转导通路中的功能尚未知。我们对质谱数据进行了验证并克隆了mRIG-Ⅰ修饰位点的突变载体,开展了相关功能学研究。
  蛋白精氨酸甲基转移酶是一类在组织细胞中广泛表达的酶分子,其主要包含9个家族分子,介导蛋白精氨酸残基的甲基化修饰,参与调控多种细胞进程,影响肿瘤、炎症、代谢、DNA损伤修复等生命活动过程。随着抗体开发技术和蛋白组学技术的发展,PRMTs和精氨酸甲基化修饰的研究得以广泛开展,但是其在天然免疫,尤其在抗病毒天然免疫中的功能还没有相关报道。
  在质谱鉴定的RIG-Ⅰ的相互作用分子中,我们发现多个PRMTs家族的成员,提示PRMTs可能参与调节天然免疫应答。我们克隆了PRMTs的9个分子,利用报告基因实验对PRMTs影响IFN-β表达的功能进行筛查,发现9个PRMTs分子都能调控IFN-β的表达,而PRMT6是其中抑制IFN-β表达效应最显著的分子。我们还通过构建PRMTs稳定过表达的Raw264.7细胞株,用VSV病毒感染,发现PRMT6稳定过表达可以显著抑制病毒感染诱导的IFN-Ⅰ和IL-6的产生,相应的IRF3活化也显著低于对照。此外,在Raw264.7细胞、NIH3T3细胞和A549细胞中瞬时过表达PRMT6分子,再用病毒刺激,也获得类似的结果。以上结果证实了PRMT6可以负向调节抗病毒天然免疫反应。
  为了检测PRMT6的体内效应,我们构建了Prmt6基因敲除小鼠。首先,我们发现Prmt6缺失并不影响小鼠的正常生长发育和免疫系统的发育。通过VSV病毒感染同窝小鼠,我们发现,Prmt6缺失可以显著提高小鼠的生存率。进一步用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中细胞因子水平,发现Prmt6缺失小鼠血清中的IFN-α、IFN-β和IL-6显著高于对照小鼠,相对应的,Prmt6缺失小鼠的肝脏、脾脏和肺脏中VSV病毒的复制显著低于对照。组织学检测肺部炎性细胞浸润情况也显示Prmt6缺失小鼠的肺部炎性细胞浸润明显低于对照小鼠。这些结果表明了Prmt6缺失可以显著增强小鼠抵抗病毒感染的能力,证实了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能。我们进一步用RNA和DNA病毒分别刺激Prmt6缺失的BMDM细胞,发现VSV病毒和HSV-1病毒刺激均能够诱导Prmt6缺失的BMDM细胞产生更多的IFN-α、IFN-β和IL-6,这与体内实验结果是一致的。我们进一步分析了信号转导通路变化情况,发现Prmt6缺失可以显著增强病毒诱导的RF3的活化,而不影响TBK1的磷酸化以及NF-κB和MAPK信号。这些结果说明了PRMT6通过抑制IRF3活化来抑制IFN-Ⅰ产生,从而抑制抗病毒天然免疫反应。
  体内体外的结果明确了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的功能,病毒感染是否会引起PRMT6表达水平和细胞定位的改变呢?我们利用Western Blot分析了病毒感染细胞的蛋白变化,发现病毒感染可以显著上调小鼠和人巨噬细胞中PRMT6的蛋白水平,同样,病毒感染也可以引起人肿瘤细胞A549和HepG2中PRMT6的蛋白增加。与此同时,GDS5093、GDS1667和GDS2164中的公共数据也提示病毒感染可以上调PRMT6的表达,而且这种变化可能与病程密切相关。我们利用Western Blot检测了巨噬细胞中PRMT6的胞浆胞核分布情况,发现PRMT6主要分布在细胞浆中,只有很少量的PRMT6分布于细胞核中,而且PRMT6的分布不随病毒感染而改变。这些结果与PRMT6通过调控IRF3磷酸化水平抑制IFN-Ⅰ产生的效应相吻合。
  PRMTs功能的发挥大多依赖其甲基转移酶活性,PRMT6抑制抗病毒天然免疫反应是否依赖其甲基转移酶活性呢?我们根据已有的文献信息,构建了PRMT6的酶活性突变体PRMT6(dead)。通过报告基因实验,我们发现PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、RIG-Ⅰ-2CARD、MAVS、TBK1、IRF3-5D等诱导的IFN-β的表达,而PRMT6(dead)并不能有效地逆转PRMT6的抑制效应。这些结果证实了PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,表现出与常规PRMTs不一样的功能特征。接头分子TRIF、STING、MAVS均可以通过TBK1-IRF3信号激活IFN-Ⅰ的产生,而我们的报告基因结果也证实了PRMT6可以显著抑制TRIF、STING、MAVS诱导的IFN-β的产生,这说明了PRMT6可能靶向TBK1-IRF3信号。进一步的报告基因实验结果也证实了PRMT6确实可以通过靶向TBK1-IRF3复合体来抑制IRF3活化,从而抑制IFN-β表达。结合前面Prmt6缺失可以增强IRF3磷酸化,但并不影响TBK1活化的结果,我们进一步检测PRMT6是否影响TBK1的激酶活性。通过体外激酶实验,我们发现PRMT6并不影响TBK1的激酶活性。以上结果证实了PRMT6靶向TBK1-IRF3复合体进而抑制IRF3的活化,这一过程不依赖其甲基转移酶活性,也不影响TBK1的激酶活性。
  既然PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能不依赖其酶活性,也不影响TBK1活化和TBK1的激酶活性,那么,PRMT6是否可以直接结合TBK1或者IRF3,从而抑制信号的传递呢?通过免疫共沉淀实验,我们发现PRMT6可以直接结合IRF3,而不结合TBK1、IKKε和IRF7。通过检测内源性的蛋白结合情况,发现在静息的小鼠和人的巨噬细胞中,PRMT6可以结合IRF3,而当病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强。在Prmt6缺失的BMDM细胞中,发现Prmt6缺失可以显著促进病毒诱导的TBK1与IRF3的结合,从而增强IRF3的活化。利用HEK293T细胞过表达实验也证实了PRMT6可以结合IRF3,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF3磷酸化。研究结果表明,PRMT6可以结合IRF3,而且,在病毒感染时,PRMT6与IRF3的结合增强,从而阻断TBK1与IRF3的结合,抑制IRF3的活化,使IFN-Ⅰ产生减少,抑制机体抗病毒天然免疫反应。
  我们进一步根据PRMT6的结构域特征构建了PRMT6的截短体表达载体,通过免疫共沉淀实验,发现PRMT6与IRF3的结合主要依赖其N端结构域,而PRMT6发挥其抑制抗病毒天然免疫的功能则主要依赖其AA189-318结构域。这些结果也提示了PRMT6发挥功能可能依赖其N端结构域结合IRF3,进而通过空间位阻效应阻碍TBK1与IRF3的结合,从而抑制IRF3活化和抗病毒天然免疫反应。
  综上,在本研究中,我们鉴定了RIG-Ⅰ的相互作用分子和翻译后修饰类型,揭示了PRMT6负向调节抗病毒天然免疫反应的效应与机制,将PRMTs与天然免疫联系起来,为PRMTs的生物学研究提供了新的视角,也为病毒感染的干预和治疗提供了潜在靶点和理论依据。同时,我们的研究所揭示的具体机制也可能是病毒逃逸免疫系统攻击的一种策略,在一定程度上增加了我们对病毒逃逸机制的认识。
[硕士论文] 陈静
口腔临床医学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:口腔是一个复杂的电解质环境,同时存在大量的微生物,植入的钛及钛合金材料在长时间接触后会发生多种形式的腐蚀,导致钛离子从种植体表面析出。此外,种植体-骨界面的微动磨损也会加速钛离子的析出。这些释放出来的钛离子可能进入周围组织或通过血液循环向远端扩散,诱发机体细胞产生一系列不良的生物学效应,从而加剧种植体周围骨组织吸收。线粒体不仅是细胞能量代谢中心,而且在机体免疫应答强度的调节中发挥重要作用。免疫应答强度的调节是机体可否产生适度的免疫应答,使之能够有效清除致病因素而又不致于损伤自身组织的关键。
  目的:
  本课题以Jurkat T细胞为研究对象,拟从骨免疫学的角度出发,探讨线粒体在钛离子对T淋巴细胞胞内钙信号调控过程中的作用以及钛离子引起线粒体钙转运功能变化的可能作用机制。
  方法:
  1.利用钙离子特异性荧光标记探针Fluo-3、Rhod-2结合激光共聚焦显微镜扫描技术,分析钛离子(0~100μM)对Jurkat T细胞胞浆及线粒体内钙离子浓度的影响。
  2.利用线粒体特异性荧光探针Mito-tracker Green结合激光共聚焦扫描、流式细胞术,分析钛离子对Jurkat T细胞内线粒体的数目及位置分布的影响。
  3.利用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒结合流式细胞术,分析钛离子作用不同时间(3h、6h、12h、24h)后线粒体膜电位的变化。
  4.应用实时荧光定量PCR技术,分析钛离子对线粒体钙单向转运体MCU-mRNA表达的影响。
  结果:
  1.钛离子无论是单独作用还是协同PHA共同作用时,Jurkat T细胞胞浆及线粒体内钙离子平均荧光强度均随钛离子作用时间延长逐渐升高,且升高的程度呈一定的浓度依赖性,但协同PHA刺激作用更显著。
  2.钛离子或PHA单独作用均可引起胞质内线粒体数量的增加,同时刺激线粒体由散在分布趋向于胞膜附近区域集中分布。
  3.钛离子单独作用及钛离子与PHA协同作用时,12小时内各组细胞线粒体膜电位均无显著变化,24小时后钛离子与PHA共刺激组细胞线粒体膜电位开始下降,其中高浓度组较对照组显著降低,差异具有统计学意义。
  4.钛离子与PHA协同作用时线粒体单向钙转运体(MCU)mRNA表达水平上升,但钛离子单独作用并未引起线粒体MCU mRNA表达的显著变化。
  结论:
  本研究结果表明在Jurkat T淋巴细胞预活化状态下,钛离子可通过增加线粒体数量、改变其空间分布以及激活MCU通道调控线粒体钙转运功能,促进T淋巴细胞内线粒体摄取胞膜附近局部过增高的钙离子,从而维持胞外钙离子的内流,胞内钙信号进一步增强。随着钛离子浓度的升高及作用时间的延长,线粒体内钙离子浓度过度增高,可引起线粒体膜电位下降。
[博士论文] 李文婷
细胞生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:自然杀伤细胞(NK细胞)是机体内除T细胞和B细胞以外的另一类重要的淋巴细胞,是固有免疫系统的成员之一,参与机体抗感染和抗肿瘤应答,也具有免疫调节作用。与T细胞不同,NK细胞非特异性识别靶细胞,主要通过其表面的杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)与靶细胞的MHC-Ⅰ分子相互作用来区分“自我”和“非我”的细胞。NK细胞对表达自身MHC-Ⅰ分子的正常细胞不杀伤,对异常下调表达或不表达MHC-Ⅰ分子的靶细胞则启动杀伤机制。抑制性KIR与MHC-Ⅰ相互作用介导NK细胞“教育”,使其获得表型和功能成熟,但对于NK细胞发育过程中KIR的表达调控机制仍有待研究。另外,越来越多的临床相关研究表明,除抑制性KIR外,活化性KIR受体也可能影响NK细胞功能发挥。
  一、KIR表达调控与NK细胞成熟
  人外周血NK细胞中,KIR受体主要表达于CD56dimCD16+NK细胞,而CD56briCD16low/-NK细胞几乎不表达KIR受体(除KIR2DL4外)。通常认为,在NK细胞开始发育成熟的阶段,KIR以随机的模式表达在NK细胞上,且认为KIR分子启动子区的甲基化与NK细胞特定KIR谱的维持相关。目前为止,涉及KIR表达调控相关因子的报道还很少,KIR表达调控的具体机制仍未明确。
  由于KIR分子对NK细胞功能的重要性,研究KIR表达调控元件有利于加深我们对临床中与KIR/MHC相关疾病及NK细胞应用的认识。我们的研究围绕NK细胞KIR分子的表达调控相关因子展开。外周血NK细胞主要由骨髓CD34+造血前体细胞发育而来。分离新生儿脐带血中的CD34+造血干细胞,在体外用多种细胞因子刺激培养,且无需饲养细胞支持,就可以诱导其向NK细胞的表型分化。我们发现这种体外分化体系得到的成熟NK细胞其KIR表达比例远低于外周血NK细胞。我们通过流式分选得到外周血KIR+CD56dimCD16+,KIR-CD56dimCD16+和CD56briCD16-三种类型的NK细胞,以及KIR+和KIR-体外分化NK细胞,并对以上5种细胞进行转录组的RNA测序。通过对以上5组NK细胞的比较分析,我们发现体外诱导NK细胞虽然具有外周血成熟NK细胞部分特征性表型,如CD56、CD16、CD107a、perforin等,但其全转录组基因的表达谱区别于外周血NK细胞。另外,体外诱导NK细胞与外周血CD56briCD16-NK细胞的转录组基因的表达谱更为接近,而其自身KIR-与KIR+细胞在转录谱上差异度较小。
  通过生物信息学手段分析外周血KIR+和KIR-(KIR-包括KIR-CD56dimCD16+和CD56briCD16-)NK细胞的差异基因及体外诱导分化的NK细胞中KIR-和KIR+NK细胞的差异基因,我们发现在筛选到的差异基因中除KIR家族基因外,RASSF4基因在KIR+NK细胞中亦表达上调,而RUNX2、MYC、ID3基因在KIR+NK细胞中显著下调。另外,RUNX2基因在外周血CD56briCD16-NK细胞中的表达居外周血三组NK细胞中最高。
  我们还进一步研究了NK细胞发育过程中RASSF4和RUNX2基因的表达。在人脐带血CD34+造血干细胞于人源化小鼠体内发育(辅以IL-15/IL-15Rα复合物RLI)的模型中,RASSF4基因在NK细胞发育的中期阶段表达升高,此后一直维持这种较高水平的表达,且发育成熟后也不下调;而RUNX2基因在NK细胞发育的中期阶段表达升高,但是在后期开始下降,成熟后表达水平较低。该现象提示NK细胞在体发育过程中,RASSF4可能促进NK细胞KIR的表达,而RUNX2可能与NK细胞KIR的表达沉默相关。人脐带血CD34+NK细胞体外分化体系展现了有不同的表达模式,RASSF4在NK细胞发育后期表达下调,而RUNX2则表达升高,这种差异可能与体外分化NK细胞低表达KIR分子相关。我们的研究发现了两个关键的分子RASSF4、RUNX2,它们与NK细胞KIR的表达相关,可能参与KIR表达调控,其具体机制还需要进一步的探讨。
  二、活化性KIR3DS1参与HBV免疫应答
  NK细胞是固有免疫系统的重要组成部分,在机体早期抵御外部感染中发挥重要作用。KIR是NK细胞识别被感染细胞的重要受体,其具有高度的等位基因多态性。已经有很多研究表明,KIR及其配体HLA的基因多态性与多种感染性疾病如HIV,HCV的感染或疾病进程存在相关性。但是KIR及其配体HLA与乙型肝炎(HBV)治疗效果的相关性还鲜有研究。我们通过对CHB(慢性乙型肝炎)病人临床治疗的观察,探讨KIR/HLA基因型与乙肝的感染及α干扰素治疗CHB病人的治疗效果的相关性,并寻找对CHB病人治疗效果有提示作用的KIR/HLA基因型。
  为此,我们选取了临床实验中119例接受α干扰素单独治疗或核苷类似物联合α干扰素治疗的e抗原阳性的CHB病人作为研究对象,另外选取96例体检正常的健康人作为对照,对其所有KIR基因及三种主要HLA配体(HLA-C1,HLA-C2,HLA-Bw4)的基因型进行了PCR-SSP分型鉴定。在接受了为期48周的治疗和24周的后续随访观察后,共有43例病人获得了持续性应答(表现为e抗原转阴,HBV DNA拷贝数低于2,000IU/mL及转氨酶水平恢复正常)而其余76例病人表现为对治疗不应答。我们研究了慢性乙型肝炎病人与健康人群,接受抗病毒治疗后获得持续性应答的病人与不应答病人的KIR及HLA的基因分型,携带情况,结合乙肝病人动态监测的病毒学和血清学指标,取得了以下结论:
  1.乙肝主要在亚洲地区流行,在欧洲和北美地区流行率较低。而HBV的感染和慢性疾病的形成是否与人群中KIR基因的携带或缺失相关仍需要进一步研究。为了研究KIR基因与HBV感染是否相关,我们分析了96例体检正常的健康人与119例CHB病人KIR基因的携带情况,没有显著性的差异。但是与文献中已经报道的高加索人群中KIR基因的携带率进行对比后,发现汉族人群,特别是汉族的CHB人群,其活化性KIR的携带率显著低于高加索人群。因此,活化性KIR可能与HBV感染的自然清除相关。
  2.干扰素疗法可以促进免疫系统抗原递呈,活化NK细胞及其它免疫细胞,从而促进HBV的清除。KIR是否在此过程中对NK细胞的活化状态起着一定的调节作用?为此,我们对经48周干扰素单独治疗或联合核苷类似物治疗的CHB病人进行研究,发现KIR3DS1在表型为对治疗持续性应答的病人群体有更高的携带率(51.2%v.s.18.4%,[OR]=4.64,P=0.0002)。而KIR3DS1又是NK细胞的活化性受体,该现象提示我们KIR3DS1可能促进了NK细胞的抗病毒功能。
  3.KIR分子的功能发挥离不开与其配体HLA分子的相互作用。我们对KIR及其可能配体的基因型组合的携带率进行分析后发现同时拥有KIR3DS1与HLA-B Bw4Ile基因的CHB病人有更好的治疗效果,在治疗过程中,HBVDNA、HBeAg的水平下降更为显著。
  4.多项逻辑回归模型可以用于预测干扰素治疗CHB的治疗效果的指标,该模型的结果表明KIR3DS1/HLA-B Bw4Ile基因型组合在CHB的治疗过程当中具有正向保护作用,可以作为预测病人获得更高治疗应答率的指标(OR=16.98,P=0.01)。
  综上所述,我们的研究主要集中于NK细胞重要受体KIR的获得和功能。我们首先研究了KIR受体,特别是抑制性KIR受体,在外周血NK细胞和脐带血来源CD34+造血干细胞体外分化得到的NK细胞的表达。进一步通过生物信息学手段分析与KIR表达获得和维持相关的表达调控元件,发现RASSF4能正向作用于KIR的表达,而转录因子RUNX2可能参与KIR表达的负向调控。但具体机制还有待进一步探讨。另外,通过对慢性乙型肝炎临床治疗的观察,我们发现活化性KIR基因与HBV感染和流行相关,并首次发现活化性KIR3DS1及其可能的配体HLA-B Bw4-80Ile基因型组合与慢性乙型肝炎病人对干扰素治疗产生持续性应答相关。该基因型组合可以作为治疗效果的预测指标。同时,本研究提高了我们对活化性KIR参与NK细胞抗HBV免疫应答的认识。
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