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[硕士论文] 张亚男
生态学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:在野外调研中发现分布于大别山区的树蛙属物种与此前所记录的黑点树蛙在外部形态存在显著差异,于是对其开展系统的物种鉴定研究,并进而展开了树蛙属的谱系地理学等研究。
  基于多基因(12S rRNA、16S rRNA、t-RNAVal、BDNF、POMC、RAG-1、RHOD、TYR)对树蛙属的系统发生分析显示树蛙属主要包含了三个大的支(A、B、C),研究中的疑似新种在系统发生树中单独成支,与绿背树蛙互为姐妹群,而与黑点树蛙谱系关系较远。物种界定(BPP)分析结果显示疑似种为独立物种的概率超过0.99。研究还通过19个形态指标,将疑似新种与其它树蛙属物种进行比较分析,发现该疑似新种与其他物种之间均存在显著的形态学差异,据此将该物种确定为一新种,并命名为安徽树蛙(Rhacophoruszhoukaiyae sp.nov.)。目前,仅知安徽树蛙分布在大别山地区,其栖息地主要为山区的溪流、池塘和灌溉地等湿地,以及附近林地。安徽树蛙区别于树蛙属其它物种的形态特征如下:(1)腹侧面、股部前后的皮肤为浅黄色,并带有不规则形状的灰色斑点,指蹼、趾蹼背面无明显斑点;(2)外蹠突小;(3)外侧指间蹼为半蹼,外侧的趾间蹼为2/3蹼;(4)体背皮肤光滑,无扁平疣;(5)喉部到胸腹部的肤色均为白色略带淡黄色;(6)指、趾背面为灰白色;(7)虹膜颜色为金黄色。
  对树蛙属的谱系地理学研究发现,树蛙属物种多样化事件可追溯到中渐新世(大约3000万年前),通过LLT分析发现它在系统发生上有两个主要的物种形成时期(1400-1200万年前、1000-400万年前)。祖先地区重建分析显示东南亚地区为树蛙属的祖先区域,并向印度和亚洲东部逐步扩散。在此过程中,亚洲季风的加强(1500万年前、800万年前、400-300万年前),青藏高原快速隆起以及带来的气候变化、冰期循环(开始于约280万年前)等多种因素强烈地影响着树蛙属多样化的形成。
[硕士论文] 康兴
细胞生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:中国雨蛙种组(Hyla chinensis-group)是从无斑雨蛙种组分离出而来,为了确定中国雨蛙种组内物种数目、成种过程以及扩散模式,本研究选用线粒体12SrRNA和ND1基因,核基因POMC作为分子标记,对中国雨蛙种组进行物种界定和谱系地理学研究。
  研究样品采集自大别山地区和黄山地区,并结合来自数据库的雨蛙种组的物种的序列,分别采取贝叶斯法和最大似然法对中国雨蛙种组进行系统发生分析。分析得到的系统发生树拓扑结构一致并且得到很高的置信值的支持。系统发生树中中国雨蛙种组共分为六个支系,提示中国雨蛙种组可能存在六个独立的物种。进一步的物种界定分析也支持这一结果。其中BFD的分析结果中BF值大于10,在BPP分析中结果大于0.95,均显著地支持在中国雨蛙种组中有六个物种存在。
  对中国雨蛙种组进行分歧时间模拟的结果显示,中国雨蛙种组起源于约18.84百万年前(处于中新世早期)。基于分歧时间,进行了祖先区域重建分析,发现中国雨蛙种组首先出现在广西-海南地区,然后从不同的扩散路线遍布全国。其中向东扩散的路线大致为:至南岭、武夷山地区,然后向北扩散到黄山周边地区,向南扩散至台湾。西向的扩散路线为:由广西-海南地区向西至云贵高原、四川盆地,进而到达秦岭山脉,最后抵达大别山地区。从整体上来看,中新世时期中纬度地区气候干旱、寒冷环境,以及在上新世时期青藏高原不断隆以及伴随而来的环境变化的后果可能是导致中国雨蛙种组形成目前谱系地理格局的主要原因。
[硕士论文] 耿章珍
细胞生物学 安徽师范大学 2016(学位年度)
摘要:蛇亚目(Serpentes)是爬行纲有鳞目(Squamata)下的一个较大类群,全球现生物种数接近3500种。基于在地理分布、栖息环境、行为方式及形态上所呈现的多样性,蛇亚目的系统学研究一直是两栖爬行动物系统学研究的热点。本研究测定了6种蛇的线粒体基因组全序列及3个核基因的序列数据,结合NCBI中已公布的相关物种序列数据,利用贝叶斯法(BI)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了中国蛇类的系统发生树,旨在进一步探讨蛇亚目内以蝰科(Viperidae)和游蛇科(Colubridae)为代表的重要分类阶元间的系统发生关系。
  本研究主要内容包括:⑴分别测定了蝰科2个物种(白头蝰Azemiops feae和莽山烙铁头Zhaoermia mangshanensis)和游蛇科4个物种(百花锦蛇Elaphe moellendorffi、颈棱蛇Macropisthodon rudis、花尾斜鳞蛇Pseudoxenodon stejnegeri和锈链腹链蛇Amphiesma craspedogaster)的线粒体基因组全序列,其中花尾斜鳞蛇和锈链腹链蛇的控制区暂缺。其获得的长度分别为17383 bp、17628 bp、17191 bp、18922 bp、15031 bp和14804 bp。研究发现,它们的线粒体基因组包含十三种蛋白编码基因,转运RNA基因(16-23个),两种核糖体RNA基因,非编码控制区结构(CRI与CRII)以及一个轻链的复制起始位点(OL)。其中,两个控制区序列在各自的线粒体基因组中是高度相似的,但各个物种之间又不尽相同。莽山烙铁头蛇中,CRI含有75 bp的串联重复,而颈棱蛇的两个控制区重复单元分别为249 bp和250 bp,且均出现两次。通过与其它蛇类线粒体基因组的比较分析,研究对蛇类线粒体基因组在基因排列上的进化规律进行了讨论。⑵测定了这六种蛇的三类核蛋白编码基因的部分序列,依次为C-mos基因:451 bp(白头蝰),435 bp(莽山烙铁头),440 bp(百花锦蛇),438 bp(花尾斜鳞蛇),437 bp(颈棱蛇),448 bp(锈链腹链蛇);RAG-1基因:928 bp(莽山烙铁头),961 bp(百花锦蛇),932 bp(花尾斜鳞蛇),956 bp(颈棱蛇);BDNF基因:703 bp(白头蝰),692 bp(莽山烙铁头),696 bp(百花锦蛇),696 bp(花尾斜鳞蛇),694 bp(颈棱蛇)。⑶基于56个蛇类的13种mtDNA蛋白编码基因及26种蛇类的3个核基因序列数据,利用MP法、ML法及BI法分别对其系统发生关系进行了重建。得到一个普遍被认同的看法,即蠕蛇类与真蛇类构成单系的姊妹关系,且蠕蛇附目的钩盲蛇位于系统树的根部。数据明显地支持蛇亚目存在着如下系统发育关系:(游蛇科,眼镜蛇科,水蛇科),蝰科,瘰鳞蛇科),蚺科,闪鳞蛇科),筒蛇科),盲蛇科)。系统发生分析表明,我国分布的百花锦蛇与黑眉锦蛇聚为一支,并和红纹滞卵蛇、紫灰锦蛇及横斑锦蛇构成姊妹群。因此,本研究支持将它们从锦蛇属中分离并各自归类新属的建议。基于mtDNA和核基因的数据分析,本研究支持将原水蛇亚科提升为水蛇科(Homalopsidae)的建议,同时也认同闪皮蛇亚科被确定为科的观点。此外,白头蝰的单系性未得到验证,莽山烙铁头蛇并未独成一支,而是与原矛头蝮属聚类。本研究结果也与以前的分子系统学研究保持了较为一致的观点:蝰科是新蛇类中首先分化出来的类群,游蛇科与眼镜蛇科则出现较晚。
[硕士论文] 李颖华
动物学 华中师范大学 2016(学位年度)
摘要:主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)基因,是脊椎动物体内普遍存在的一类多基因家族。其表达产物具有识别抗原,介导机体免疫反应的重要作用。高多态性水平的MHC基因能够增强机体抵抗病原的能力,因此,探究MHC基因的多态性及其进化机制,有助于了解适应性免疫系统的进化过程。目前对MHC基因多态性及其维持机制的研究,大多集中在哺乳类、鸟类和鱼类等脊椎动物中,两栖类作为最早开始陆栖的脊椎动物,其水陆两栖的生活环境使得它们接触的病原体更为复杂,因此探讨两栖动物MHC基因的进化机制具有重要的意义。目前的研究主要集中在模式物种非洲爪蟾(Xenopus laevis)和一些无尾目动物中,有尾目MHC基因的进化机制尚不清楚。为了更加深入全面的探究两栖动物MHCⅠ类基因的多态性水平及其维持机制,本研究选取有尾目3个科的5个代表物种,即红瘰疣螈(Tylototriton verrucoosus)、无斑肥螈(Pachytriton labiatus)、商城肥鲵(Pachyhynobius shangchengensis)、巫山北鲵(Ranodon shihi)和中国大鲵(Andrias davidianus),通过分子克隆和DNA测序等方法得到MHCⅠ类基因的序列,对5个物种MHCⅠ类基因的多态性水平及其进化机制进行研究,主要结果如下:
  (1)5个物种共克隆得到1100余条序列,长度在730bp左右,包括部分的外显子2和外显子4及全部的外显子3区域。并从克隆序列中鉴定得到26个等位基因,它们的核苷酸多态性水平较无尾两栖类动物低,结合其生活环境进行分析,我们推测物种对环境的适应性与MHC基因的多态性水平相关。
  (2)不同物种包含的等位基因数目不同。五个物种至少含有1-2个MHCⅠa类基因座,这种物种间基因座数目呈多态性的现象说明有尾两栖类物种MHCⅠ类基因进化过程中经历了基因复制或丢失,符合基因“出生-死亡”进化模式(birth-and-deathmodel)。
  (3)5个物种的MHCⅠ类基因序列的平均核苷酸距离均小于平均氨基酸距离,暗示MHCⅠ类基因受到正选择的作用。通过平衡作用检测,发现受正选择作用的氨基酸位点位于推断的抗原结合位点(putative Antigen-binding sites,pABS)及其附近位置,并且五个物种中ABS区的非同义突变率与同义突变率的比值大于1(dN/dS>1),据此推断在ABS区存在正选择作用,结合ABS区识别和呈递抗原的功能,我们认为有尾目MHCⅠ类基因在进化过程中受到病原体介导的平衡选择作用。
  (4) MHCⅠ类基因的外显子2和外显子3的交界处检测到多个重组断裂位点,表明外显子2与外显子3/4发生了基因交换,这种重组模式与无尾两栖类MHCⅠ类基因的外显子改组(exon shuffling)相同,说明基因重组在有尾目MHCⅠ类基因的多态性进化过程中发挥着重要的作用。
  (5)从三个外显子区域的系统发育树中发现,不同区域MHCⅠ类基因的进化关系在种间和种内有明显区别,这可能与发生在外显子之间的重组作用有关。此外,无斑肥螈和中国大鲵这两个物种MHCⅠ类基因跨物种多态性的现象说明MHCⅠ类基因在这两个科物种分化前就已经存在。
  以上研究结果表明,有尾两栖类MHCⅠ类基因具有较高的多态性,在进化过程中经历了基因复制和基因重组,平衡选择是维持MHCⅠ类基因多态性的重要机制。
[硕士论文] 刘欣阳
生态学 安徽师范大学 2016(学位年度)
摘要:线粒体基因组的测序和功能分析是追踪了解动物适应进化的重要途径。本研究对线粒体基因组测定并分析鲸类线粒体基因组信息,以栖息在安徽省铜陵淡水豚国家级自然保护区的长江江豚为研究对象,探讨了长江江豚线粒体基因组的适应进化,为进一步揭示长江江豚的演化历史、保护长江江豚的遗传多样性提供基础资料。
  本研究通过酚-氯仿抽提实验获得了长江江豚的线粒体基因组,对其线粒体基因组的全序列进行测定(GenBankID:KP170488)。长江江豚线粒体基因组长度16385 bp,与GENBANK中其它鲸类线粒体基因组的大小相似,AT含量高于其GC含量,包含13个蛋白编码基因,2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)、22个tRNA、1个非编码区。除了8个tRNA基因(tRNAGln,tRNATyr,tRNASer,tRNAAsp,tRNAAla,tRNAAsn,tRNACys,tRNAPro,tRNAGlu)和NADH6基因位于L链上,其余均在H链上编码。长江江豚的线粒体基因组的各功能单位(除COX2基因),均与同属物种印度洋江豚和东亚江豚保持着高度的相似性,在鼠海豚科线粒体基因组系统进化树上仍聚为一枝即江豚属。长江江豚与白鳍豚的COX2基因相似度高于其他同科的物种,推测可能是长江江豚适应进化的一种表现。由于长江江豚与白鳍豚生境重叠,在长期的进化选择下二者COX2基因的差异减少。通过GENBANK数据库中50条鲸类线粒体基因组全序列,分别对比其功能单位和非编码区,鲸类线粒体基因组的结构与排列基本相同,长度不同的原因可能是由于控制区大小不同。鲸类的线粒体蛋白编码基因起始密码子略有所不同,个别物种与其他物种差别较大,可能是由于目前数据不完善,也可能与遗传进化选择相关。对鲸类科内功能单位相似性检测和差异分析发现,不同种鲸类间均有差异,但不同亚种间基本无差异,这在对长江江豚线粒体基因组的研究中也得到了验证。这些功能单位可在一定程度上验证亲缘关系,但进一步的区分需要借鉴更多其他基因数据。
[博士论文] 王尚洪
动物学 南昌大学 2015(学位年度)
摘要:本研究测定了彩石鳑鲏、彩副鱊和广西副鱊的线粒体全基因组序列,并对其进行了注释与分析,以充实线粒体基因组数据库,联合Genbank中所收录的鳑鲏亚科14种鱼类等线粒体全基因组数据,对鳑鲏亚科鱼类线粒体基因组GC含量偏性、密码子偏性进行了分析,并以鳜鱼和餐鱼为外群构建了鳑鲏亚科17种鱼类的系统发育树。本研究所得到的主要结果如下:
  ⑴测定了彩石鳑鲏、彩副鱊和广西副鱊的线粒体全基因组序列,三种鱼类的线粒体基因组均为环状双链,全长分别为16,677bp、16,819bp、16,563bp。均含有2个核糖体RNA、22个转运RNA、13个蛋白质编码基因和1个D-loop区。基因排列顺利与其他大多数鲤科鱼类一致。
  ⑵彩石鳑鲏、彩副鱊和广西副鱊线粒体全基因组的碱基组成中,A+T含量分别为56.09%、56.98%和57.88%,明显高于GC含量。13个蛋白质编码基因的总碱基组成中,A+T碱基含量分别为56%、56.8%和58.1%;各蛋白质编码基因的碱基组成上,A+T含量明显高于G+C含量;均表现出AT碱基的偏性。
  ⑶彩石鳑鲏、彩副鱊和广西副鱊的13个蛋白质编码基因碱基总长度分别为11422bp、11422bp和11423bp;蛋白质编码基因的起始密码子使用方面,除C0X1基因以GTG为起始密码子外,其余均以ATG为起始密码子;在终止密码子使用方面,彩石鳑鲏ND1、COX1、ATP8、ATP6、ND4L、ND5和ND6以TAA作为终止密码子,ND4以TA作为终止密码子,其余以T为终止密码子。彩副鱊ND1、COX1、ATP8、ATP6、ND4L和ND6以TAA作为终止密码子,ND5以TAG作为密码子;ND4以TA作为终止密码子,其余以T为终止密码子;广西副鱊ND1、COX1、ATP8、ATP6、ND4L、ND5和ND6以TAA作为终止密码子,ND3和ND4以TA作为终止密码子,其余以T为终止密码子。
  ⑷彩石鳑鲏、彩副鱊和广西副鱊tRNA二级结构均属于典型的三叶草结构;D-Loop区长度分别为1015bp、1172bp和910bp。
  ⑸对鳑鲏亚科鱼类的核酸碱基组成、相对同义密码子使用度、有效密码子数进行分析,结果显示,鳑鲏亚科鱼类线粒体中,密码子NNA使用数量最多,密码子NNG使用最少;且鳑鲏亚科鱼类线粒体密码子使用的这种偏性为较强的突变压力和较弱选择作用共同影响的结果。
  ⑹基于rRNA & PCGs和PCGs序列进行系统发育分析,结果显示:①广西副鱊与大鳍鱊和须鱊的亲缘关系较近,彩石鳑鲏与中华鳑鲏和高体鳑鲏亲缘关系较近。②高丽鱊、油鱊、韩鱊及细鱊与鳑鲏属鱼类亲缘关系更近。
[硕士论文] 甘姗姗
生物化学与分子生物学 安徽师范大学 2015(学位年度)
摘要:斑蝶亚科隶属于鳞翅目(Lepidoptera),蛱蝶科(Nymphalidae)。根据现有资料,全世界斑蝶亚科的种类共有12属300多种,主要分布在热带地区。目前,依据形态学、行为学以及基因序列数据等证据,有关斑蝶亚科在蝶类中的分类地位及其与其他类群间的系统发生关系还存在一些争议,因此还需要更多的形态学同源性状和分子数据来厘清这些问题。
  本研究利用Long-PCR和primer-walking测定了斑蝶亚科4个代表种类(金斑蝶、绢斑蝶、拟旖斑蝶、青斑蝶)的线粒体基因组全序列,并分析它们的基因组成和变异特点;另外,以28种全变态类昆虫为外类群,基于线粒体基因组的2个rRNA基因序列数据,运用贝叶斯推论法和最大似然法构建了74种已测蝶类物种的系统发生树,探讨斑蝶亚科与蝴蝶各主要类群之间的系统发生关系;同时,基于化石记录资料,运用宽松分子钟方法推测了蝶类主要类群间的分歧时间。
  结果显示:4种斑蝶的线粒体基因组结构与其他已测蝶类相同,都包括1个非编码的AT富集区,2个rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA),13个蛋白质编码基因(ND2,COI,COII,ATP8,ATP6,COIII,ND3,ND5,ND4,ND4L,ND6,Cytb,ND1)和22个tRNA基因。它们的线粒体全序列长度分别为15236 bp、15210 bp、15200 bp和15285 bp。
  金斑蝶、绢斑蝶、拟旖斑蝶和青斑蝶线粒体基因组都包含基因间隔区和基因重叠区,它们的总长度分别为103 bp与33 bp、123 bp与32 bp、132 bp与37 bp和133 bp与36 bp。四种斑蝶的16S rRNA和12S rRNA基因的长度分别为1339 bp与783 bp、1311 bp与780 bp、1318 bp与786 bp和1352 bp与779bp;大多数tRNA基因二级结构是三叶草构型,但tRNASer(AGN)基因不具有二氢尿嘧啶臂,只形成了一个简单环。除COI基因(起始密码子为CGA),剩下的12个蛋白编码基因的起始密码子都是ATN;除COI、COII、ND5和ND4基因外(终止密码子为单独的T),剩余基因的终止密码子都是ATN。四种斑蝶的D-loop区分别长418 bp、443 bp、404 bp和438 bp,A+T含量分别为95.0%、93.2%、95.7%和93.4%。它们都含有一些单一的核苷酸重复序列以及微卫星重复序列,如poly(A),poly(T),(TA)n and(AT)n。
  本研究所得的蝶类各科之间的系统发生关系为:((((灰蝶科+蚬蝶科)+蛱蝶科)+粉蝶科)+弄蝶科)+凤蝶科。蛱蝶科内部的系统发生关系为:((((((((蛱蝶亚科+苾蛱蝶亚科)+丝蛱蝶亚科)+闪蛱蝶亚科)+(线蛱蝶亚科+釉蛱蝶亚科))+喙蝶亚科)+眼蝶亚科)+绢蛱蝶亚科)+螯蛱蝶亚科)+斑蝶亚科。上述结果与之前基于多基因或线粒体蛋白编码基因重建的系统发生关系基本一致。谱系年代学分析结果显示,鳞翅目昆虫的分歧时间大约在侏罗纪(139.7 Ma;95%置信区间:120.1~160.9 Ma);凤蝶科、粉蝶科、蛱蝶科和灰蝶科的分化时间在中生代的白垩纪,分别为85.7 Ma(64.5~107.1 Ma)、82.3 Ma(64.7~100.8 Ma)、78.7 Ma(63.2~95.6 Ma)和71.9 Ma(54.4~90 Ma),弄蝶科分化时间大约在新生代古新纪56.6 Ma(47.3~66 Ma)。
[硕士论文] 张艳丽
生态学 安徽师范大学 2015(学位年度)
摘要:鹟科(Muscicapidae)是鹟总科(Musicicapoidea)鸟类中物种最多的一个类群,现存鹟科鸟类49属312种。关于该科内的系统发育关系备受争议。太平鸟科(Bombycillidae)隶属鹟总科(Musicicapoidea)现有鸟类1属3种。
  本研究通过LA-PCR(Long and accurate polymerase chain reaction)及巢式PCR(nested PCR)测定并分析了鹟科7种鹊鸲(Copsychus saularis)、赭红尾鸲(Phoenicurus ochruros)、红胁蓝尾鸲(Tarsiger cyanurus)、北红尾鸲(Phoenicurus auroreus)、红尾水鸲(Rhyacornis fuliginosus)、姬鹟(Ficedula mugimaki)和紫啸鸫(Myophonus caeruleus)及太平鸟科太平鸟(Bombycilla garrulous),共8种鸟类线粒体全基因组序列。基于本课题组新数据,以及GenBank报道的相关序列,主要讨论了以下两个方面问题:
  (1)鹟总科8种鸟类线粒体基因组特征及鹟总科鸟类系统发育关系;
  (2)鹟科内部各属间系统发育关系。主要的研究结果如下:
  1.鹟总科8种鸟类的线粒体全基因组序列特征
  分析结果:
  ⑴本研究中8种鸟类mtDNA序列长短不同,最短的是姬鹟(F.mugimaki)的长度16767 bp,最长的是太平鸟(B.garrulous),长度是16875 bp。所有物种的线粒体全基因组均包含37个基因以及一个非编码控制区,分别是13个PCGs、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个CR。其中8个tRNA基因(tRNAGln,tRNACys,tRNAAla,tRNAAsn,tRNASer(UCN),tRNATyr,tRNAGlu和tRNAPro)和一个蛋白编码基因nad6在轻链编码,而其余都在重链。
  ⑵线粒体控制区只有1个;
  ⑶8种鸟类的tRNA都能折叠成典型的三叶草结构;
  2.基于线粒体全基因组序列的鹟总科(Musicicapoidea)系统发育关系
  本实验对鹟总科鸟类进行系统发育分析所用的序列包括以下几个方面:本研究所得鹟科(Muscicapidae)和太平鸟科(Bombycillidae)8种鸟类线粒体全基因组序列及GenBank报道的14条鹟总科(Musicicapoidea)(太平鸟线粒体全基因组序列部分缺失约200bp)、7条莺总科(Sylvioidea)线粒体全序列,以燕雀科(Fringillidae)的黄胸鹀(Emberiza aureola)为外类群,共30个物种的12个蛋白编码基因序列,用贝叶斯法(BI)、最大似然法(ML)及最大简约法(MP)分别对鹟总科鸟类的系统发育关系进行构树。分析结果:
  (1)支持Marshall[37]等关于鹟科(Muscicapidae)是并系类群观点;
  (2)支持Spellman[35]等关于太平鸟科(Bombycillidae)是单系类群的观点;
  (3)支持Barker[49]等认为太平鸟科与莺总科聚在一起的结论;
  (4)对于 Marshall等[37]认为以地山雀为代表的山雀科(Paridae)从莺总科(Sylvioidea)中分离出来并归属于鹟总科的观点不予支持。
  (5)山雀科不是单系类群。
  3.基于nd2、cytb和myo基因序列的鹟科(Muscicapidae)系统发育关系
  本研究基于所测得以及结合GenBank所报道的122条鹟科鸟类(共计19个属物种)和山雀科的地山雀(P.humilis),椋鸟科的丝光椋鸟(Sturnus sericeus)和鸫科(Turdidae)的灰背鸫(Turdus_hortulorum)的nad2、cytb和myo基因,用BI和ML两种方法进行系统发育分析。
  结果:
  (1)支持Marshall等认为鹟科不是单系类群的观点;
  (2)支持Voelker、Clements等研究认为歌鸲属(Luscinia)、Calliope属及鹊鸲属(Copsychus)为单系类群观点;
  (3)单型属物种侏蓝仙鹟(Muscicapella hodgsoni)及物种栗尾鹟(Muscicapa ruficauda)与姬鹟属(Ficedula)物种聚为一支,且二者位于姬鹟属物种内部的分支,不支持Moyle等[90]认为姬鹟属是单系类群观点;
  (4)支持Aliabadian等认为桂红蚁鵖(Thamnolaea cinnamomeiventris)归于Myrmecocichla属的观点;
  (5)黄纹石鵖(Campicoloides bifasciatus)的分类地位一直备受争议:有研究证明应归于Myrmecocichla属;也有人指出归于Saxicola属;本研究支持支持Aliabadian等认为该物种归到Cercomela属,且与Cercomela schlegelii、Cercomela sinuata和Cercomela tractrac三者构成姐妹群的观点;
  (6)白额蚁鵖(Myrmecocichla albifrons)与Myrmecocichla属其他鸟类系统发育关系距离较远,推测认为该物种不归于Myrmecocichla属。Cercomela属、Myrmecocichla属和Oenanthe属聚为一大支,支持Outlaw等关于这三者的亲缘关系较近、非单系类群的观点。
[硕士论文] 霍永霞
细胞生物学 安徽大学 2015(学位年度)
摘要:在生物学中,骨骼系统的定义是为生物体提供支持作用的生命系统。骨骼系统对生物体的生命活动十分重要,它提供了很多必需的功能,如提供机械支持,保护很多至关重要的器官,造血作用的微环境,也是钙和其他矿物质的仓库等。同时物种表现出的表型多样性有很大一部分是由骨骼系统塑造的,如现代人类不同群体之间表现出的身高、脸型、骨密度等的不同,还有家养动物在不同品系之间表现出显著的表型多样性。而生物的表型多样性是研究生物进化的一个很好素材。随着新一代测序技术的快速发展,大量的基因组和群体数据不断涌现,而且数据分析的方法也越来越多,这些为我们研究这些表型多样性的分子进化机制提供了机遇,便于我们去探索生物特异性状的适应进化、物种的起源等生物学问题。本研究就分别以人类和观赏鸡为研究对象,基于群体基因组学的一些群体遗传学分析方法来分别探讨他们的骨骼系统的快速进化的分子机制。
  在第二章中,利用数据量丰富的千人基因组数据对之前文献所找到的130多个与人类骨骼发育相关的基因进行群体分析,数据分析则是采用基于不同原理的检测正选择的方法如FST,Tajima's D,iHS等。结果首先支持了之前的非洲和非非洲群体之间具有很高的群体分化,走出非洲之后,骨骼基因在达尔文正选择的作用下发生了快速进化这一研究结果。除此之外,进一步的分析表明非洲、美洲群体的骨骼系统也受到了达尔文正选择的作用。骨骼系统不仅仅在人类走出非洲之后受到选择作用,而且留在非洲的群体的骨骼系统也受到达尔文正选择的作用。数据分析的结果还显示美洲人群的骨骼系统在近期受到了达尔文正选择的作用,而非洲、亚洲、欧洲这三个群体的骨骼系统在近期可能不受达尔文正选择的作用。由于人类分散至全球后,面临的环境不同造成了近期不同群体的进化不一致性。
  第三章,观赏鸡的表型多样性也是研究骨骼系统进化的很好的素材。我从小型鸡的体型差异着手,通过全基因组重测序的数据及网上公布的一些基因组数据,利用群体遗传学方法分析找出了在不同大小品系间分化显著的与骨骼相关的基因BMP10,并对所找出的基因进行扩大样品验证及在模式动物中过表达验证该基因对体型的影响。其中PCR扩大样本验证找出了在小型鸡中该基因中很多高度连锁不平衡的SNPs位点。并对小型鸡和体型较大的鸡中的SNPs进行单倍型的构建,结果显示小型鸡和体型较大的鸡的单倍型组成差异显著。在模式动物斑马鱼中过表达BMP10基因的结果是导致斑马鱼的体型显著变小。现在还在对该基因做一些其他功能实验,如荧光双报告和凝胶迁移实验。这些结果说明BMP1基因是导致小型鸡体型变小的关键基因。这为研究家鸡的群体历史提供了一定的资料,也为从人工选择的角度进行小型鸡的育种提供了可能。
[硕士论文] 印翠
生物学 上海海洋大学 2015(学位年度)
摘要:牙鲆(Paralichthys olivaceus)作为珍贵的温带海洋性物种之一,由于其蛋白质含量较高,个体大,脂满味美且极易消化,具有很高的营养和经济价值,已经成为我国重要的海洋鱼类养殖品种。人工养殖中,雌鱼2年龄性腺发育成熟,雄鱼1年龄性腺就已发育完成,但鉴于雄鱼用于精巢发育所消耗的能量要比同时期还未性成熟的雌鱼多的多,加之性成熟后牙鲆雄鱼有近5个月的繁殖期,摄取的营养大多用于繁殖,在人工培育过程中雌鱼个体要明显大于雄鱼,所以通过性别控制来增加养殖产量成为重要的研究内容。因而相关的性别决定及性腺发育分子机制的研究也备受重视。
  牙鲆中已有不少关于性腺发育和分化相关基因的鉴定和功能分析报道,但此类基因的挖掘多集中于这些编码基因的表达规律和功能分析,对其转录后水平调控尤其是microRNA(miRNA)的研究鲜有报道。本实验室先前已建立了牙鲆精卵巢miRNA文库,并通过第二代测序(NGS)技术和生物信息学方法鉴定了141个成熟miRNA,筛选出一批在牙鲆雌雄性腺中差异或特异表达的miRNA。
  在此基础上,本研究首先挑选了2个表达量较高且在精卵巢中显著差异表达的miRNA(pol-miR-26a,26b),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和原位杂交进行pol-miR-26a,26b在牙鲆性腺中的表达分析,结果表明:pol-miR-26a,26b在牙鲆成鱼的精巢中表达量相对最高,在牙鲆脑组织中也有较高的表达,但在卵巢中两者的表达量均显示相对较低。原位杂交定位显示:pol-miR-26a,26b蓝紫色阳性信号明显成片状分布且多集中在成熟的精子细胞中分布在小叶腔内;而在成鱼卵巢中pol-miR-26a,26b基因的阳性信号成稀少的片状分布,表达主要集中在V时相的卵母细胞及其细胞边缘的滤泡膜上。这些结果表明pol-miR-26a,26b可能在牙鲆性腺的发育中发挥重要作用。
  miRNA靶标的检测是研究miRNA功能的重要环节。本实验利用TargetScan、PicTar和miRBase等靶基因预测软件预测出pol-miR-26a,26b有多个靶mRNA,挑选出了其中和鱼类性别决定和性腺分化相关的empty spiracles homeobox2(emx2)基因,并进行了emx2基因鉴定和表达研究,该基因cDNA长1665bp,包含一段编码246个氨基酸残基的741bp的开放阅读框(ORF),一段12bp的5’-UTR区和一段912bp的3’-UTR区(GenBank accession number:KP260631)。氨基酸序列比对结果表明牙鲆 Emx2与其他物种具有71-98%的高度同源性,且具有高度保守的emx2的经典同源框序列。Neighbor-Joining法(bootstrap1000)构建的系统进化树表明牙鲆Emx2与硬骨鱼类同属于鲽形目的半滑舌鳎的Emx2聚为紧密的一支。不同组织和早期不同发育时期的定量PCR结果显示:牙鲆emx2基因在成鱼性腺中有很高的表达水平,且在卵巢中具有比精巢相对较高的表达水平,此外在脑组织中也有较高的表达。而在牙鲆胚胎早期发育阶段,牙鲆emx2基因在神经胚时期相对表达量最高。而在随后早期的胚胎发育和仔鱼生长时期emx2 mRNA的相对表达量逐渐降低。对比emx2基因和pol-miR-26a,26b在牙鲆雌雄性腺中的表达,发现二者在牙鲆精卵巢的表达趋势恰好相反,这也暗示了emx2基因很可能是pol-miR-26a,26b潜在的靶基因。
  为了进一步验证emx2基因是否为pol-miR-26a,26b的靶基因,最后成功克隆了牙鲆emx23’-UTR区,对其与pol-miR-26a,26b的结合位点进行了定点突变将GACTTGA突变为 AGTCCAG,并构建了野生型和突变型的靶标报告载体;采用DLR双荧光素酶检测系统验证emx2基因与pol-miR-26a,26b结合位点是否预测正确。结果表明:pol-miR-26a,26b与野生型质粒psiCHECK-emx2-3’UTR共转染后,与空白组和阴性对照组共转染相比较,海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)活性明显降低,证明pol-miR-26a,26b的“种子序列”与emx23’UTR的结合从而切割降解靶基因。pol-miR-26a,26b inhibitor与野生型质粒psiCHECK-emx2-3’UTR共转染后,pol-miR-26a,26b inhibitor海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)比值与blank、NC inhibitor比较P>0.05无统计学差异。表明细胞内源性pol-miR-26a,26b表达量没有达到能阻碍其与emx2基因3’UTR结合而影响其荧光活性改变。而突变型质粒psiCHECK-mutated emx2-3’UTR与pol-miR-26a,26b共转染后,海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)比值较之空白组和对照组均无显著性差异。从而证明由于位点的突变,pol-miR-26a,26b缺失与emx23’UTR的结合能力从而无法发挥对靶基因的切割降解作用。因此,双荧光素酶报告实验表明牙鲆emx2基因是pol-miR-26a,26b直接作用的靶基因,并为pol-miR-26a,26b在牙鲆性腺发育中的调控提供了分子证据。
[硕士论文] 卢燕梅
生物化学与分子生物学 安徽师范大学 2015(学位年度)
摘要:通过设计mtDNA-II基因序列扩增的引物,运用DNA提取、PCR技术、克隆培养、产物纯化和测序的方法,获得了尾突臂尾轮虫以及盖氏晶囊轮虫的mtDNA-II环上的基因组序列。
  尾突臂尾轮虫mtDNA-II环总长12200bp,包含8个编码蛋白质的基因,6个tRNA基因以及一段约4.7 kb的非编码区。尾突臂尾轮虫有6个基因的起始密码子是ATG(COI、NAD6、NAD4L、NAD5、COII和NAD3),另外的2个是ATA为起始密码子(NAD4和COIII)。mtDNA-II环的A+T的含量为74%。
  盖氏晶囊轮虫mtDNA-II环总长15081bp,包含8个编码蛋白质的基因,9个tRNA基因以及一段约7.5 kb的非编码区。8个编码蛋白质的基因中有6个起始密码子是ATG(COI、NAD6、NAD4L、NAD4、COIII和NAD3),另外的2个是ATA为起始密码子(NAD5和COII)。mtDNA-II环的A+T的含量为70.4%。
  依据这两种轮虫,结合Genbank和实验室研究中的其他11种轮形动物线粒体上的6种基因(COI、COII、COIII、NAD3、NAD5和NAD6),利用Clustal X和Mega等软件进行序列的比对和分析,以线形动物门的猪蛔虫为外群建立了系统树,对轮形动物门的13种动物的系统发生关系进行了探讨。
[硕士论文] 杨松霖
遗传学 中国科学技术大学 2014(学位年度)
摘要:自然界存在成千上万的苦味物质,大多数被认为是有毒有害的。苦味味觉在动物的生存防御过程中扮演着重要的角色。不同物种或相同物种不同个体之间对苦味物质的敏感性各不相同,反映了动物进化过程中饮食发生了变化。在长期的进化过程中,生活在相同或相似环境中的不同物种,生活习性包括食性极有可能相近,即觅食时接触的苦味物质可能相同,逐渐会表现出对苦味物质极其敏感的趋同现象,是适应性进化的表现。
  苦味受体(TAS2Rs)是典型的G蛋白偶联受体,家族成员较多。不同的哺乳动物苦味受体数目各不相同。不同的苦味受体识别不同或相同的苦味物质,而不同物种中相同的受体通过氨基酸替换表现出不同的敏感性。可见苦味味觉的复杂性。TAS2R16是第一个鉴定出苦味物质为β-吡喃葡萄糖苷的受体,自然界10%的植物含有该苦味物质。我们提出假设,在进化过程中,不同哺乳动物TAS2R16受体可能会发生趋同进化的现象。为了验证该假设,本文通过进化分析和功能实验相结合的方法对此进行深入研究。结果如下:
  1)序列比对发现,不同哺乳动物中只有白面僧面猴和人TAS2R16序列在172氨基酸位点均为天冬酰胺(N),其余物种均为赖氨酸(K);通过构建共同祖先序列并计算显示该位点不是随机变化的,而是平行进化的结果;自然选择检测发现白面僧面猴和人TAS2R16基因在172位点受到正选择,说明该位点在进化中对适应环境很重要。此外,实验结果表明从人猿超科、旧大陆猴、新大陆猴、到原始猴共同祖先氨基酸替换率不断增大;类人猿下目(Simiiformes)共同祖先枝检测到正选择信号并且极显著;并且检测出15个正选择位点,为进一步功能实验提出理论指导。
  2)点突变介导的功能试验表明,白面僧面猴TAS2R16受体的172位点突变为赖氨酸(K)后,反应的EC50值增加,同源模建受体与配体结合(docking)时发现结合自由能值增加,172位点位于受体第五跨膜区胞外与胞内的交界处,对TAS2R16受体功能有着重要的作用。综上,白面僧面猴与人TAS2R16受体探测苦味能力发生了趋同进化。本研究首次在哺乳动物中发现苦味受体功能趋同。这将为以后苦昧受体功能趋同进化的研究提供新视野。
[硕士论文] 刘小召
水产养殖 华中农业大学 2014(学位年度)
摘要:通过文献查阅的方法,综述了鱼类和两栖类年龄鉴定的方法。2012年6月到2014年3月,陆续从浙江某养殖基地采集大鲵(Andriasdavidianus)261尾,包括1~6龄6个年龄段,测量其体长体重并取骨骼材料。比较选择了大鲵年龄鉴定的骨骼材料,对利用趾骨材料进行年龄鉴定的实验方法作了详细研究,对体长体重法鉴定大鲵年龄作了初步探索,用骨龄学方法结合体长体重数据对大鲵的生长特征作了一定的描述。
  选择2龄大鲵作为实验材料,分别对大鲵的脊椎骨、耳石、趾骨和跖骨进行初步观察和切片处理。发现耳石细小且脆弱,取材较困难。脊椎骨材料丰富,取材方便,但骨质较坚硬。选用大鲵的趾骨和跖骨共17块骨骼材料进行切片和染色处理,结果显示,共有7块骨节可以作为年龄鉴定的材料,包括所有五趾的第二趾骨和第三、四趾的第三趾骨。其中以第三、四趾的第二趾骨的骨骼横截面直径大、骨髓腔最小、骨化面积最大,可以作为年龄鉴定的理想材料。
  选择5龄大鲵趾骨作为实验材料,对其进行了去福尔马林、去除肌肉和结缔组织、脱钙、冰冻切片机切片、染色观察的处理。分别对趾骨切片法的各步骤具体的处理方法进行了探究。结果显示,用2%的氢氧化钠进行短暂的煮沸处理是去除骨骼上附着组织的最好方法。2%~6%浓度的硝酸均可以用来进行5龄大鲵趾骨的脱钙,其中以3%和4%效果最好。脱钙不足的切片重新脱钙后,在潮湿状态下可以在短时间内重新显现年轮。染色对比实验显示,染色和不染色两组切片均能有效的显示年轮。染色后主要对骨髓腔的显示更为清晰,对年轮的加强效果一般,可以选择不染色。
  大鲵趾骨切片显示为疏密、明暗交替的环纹,环片成闭合的同心圆排列。暗而窄的环纹即为年轮,年轮特征明显,可以用于年龄鉴定。没有经历越冬的1龄大鲵不形成年轮,从2龄越冬开始开始,每一年增长一个年轮,表现出一年一轮的增长规律。年轮形成的时间与冬眠时间同步,即1次冬眠1个年轮。6龄之内年轮的直径匀速增长。
  对1~5龄大鲵体长体重数据进行分析,对大鲵的体长体重和年龄的关系分别进行拟合,并分析体长体重的频率分布。根据相关分析结果对大鲵年龄进行推算,对大鲵年龄实测值与估算值进行比较,判断其对年龄鉴定的准确度。5个年龄组,各年龄组体长范围分别为:1龄体长范围≤23.33cm,平均体长为18.64cm;2龄体长范围27.47~36.61cm,平均体长为32.18cm;3龄体长范围38.03~47.15cm,平均体长为46.05cm;4龄体长范围为48.68~54.49cm,平均体长为49.43cm;5龄体长58.17~69.88cm,平均体长为63.24cm。不同年龄段体长数据没有交叉。各个年龄组体长增长的级差幅度不大,除了3龄到4龄增长幅度较小外,其他相邻年龄组体长增长均匀。方差分析表明,不同年龄组体长之间具有极显著差异(P<0.01),其中3龄和4龄大鲵体长差异显著,其他相邻年龄组体长差异极显著。体长随年龄增长呈直线上升。二者关系以最小二乘法求出其一元回归方程为y=10.646x+9.97,回归系数b=10.64,相关系数R2=0.9728,为显著相关。利用体长范围对大鲵年龄进行计算,存在数据范围过窄,无法涵盖所有的大鲵样本的问题,可鉴别率63%,准确度79%;利用体长年龄回归方程对大鲵年龄进行计算,可鉴别率100%,准确度71%,存在低估大鲵年龄的问题;利用体长频率分布对大鲵年龄进行鉴定,可鉴别率86%,准确度61%。
  对5个年龄组的大鲵体重进行分析,各年龄组体重范围为:1龄体重≤55.40g,平均体重为40.47g;2龄体重范围168.37~246.99g,平均体重为199.19g;3龄体重范围437.85~674.02g,平均体重为626.94g;4龄体重范围699.43~931.46g,平均体重为783.36g;5龄体重范围1200.80~2013.56g,平均体重为1691.45g。不同年龄段体重数据没有交叉。随着年龄增长,大鲵体重增加越来越快,并且体重增长的速度也越来越快。方差分析结果显示,不同年龄大鲵体重之间具有显著差异(P<0.05),其中除了3龄和4龄的体重差异不显著外,其他相邻年龄组体重差异均显著。1~5龄大鲵体重的增长随年龄龄增长呈指数函数曲线。以最小二乘法求出其一元回归方程为y=25.94e0.8835x,回归系数b=25.94,相关系数R2=0.8835,为显著相关。利用体重范围对大鲵年龄进行鉴定,可鉴别率74%,准确度63%;利用体重年龄回归方程计算大鲵年龄,可鉴别率100%,准确度60%。
  综合体长体重年龄鉴定法和硬组织材料年龄鉴定法两种方法,比较可知:趾骨切片法是大鲵年龄鉴定的最精确方法。利用体长体重进行年龄鉴定比较方便快捷,缺点是需要较大的样本量和有效的数据分析方法,否则鉴定结果不准确。大鲵趾骨轮纹的形成周期和冬眠周期可能保持一致,在进行硬组织年龄鉴定时要考虑到具体的饲养条件。
[硕士论文] 战莹
生物学 哈尔滨工业大学 2014(学位年度)
摘要:MicroRNA是非编码RNA的重要家族成员之一,广泛存在于动植物中,大小约为22个碱基,是一类在进化上高度保守的内源性的小分子RNA。本课题所研究的miR-370位于位于小鼠12号染色体(12qF1),对应人14号染色体(14q32)。miR-370的成熟体包含20个核苷酸,位于Dlk1-Dio3印记基因簇的Gtl2下游。miR-370在胚胎中特异性表达,对miR-370的异常表达进行深入研究,对小鼠胚胎发育、个体生长、疾病发生调控生命活动具有重要意义。
  为了阐明miR-370对小鼠发育的影响,本课题通过建立过表达miR-370转基因小鼠模型,以野生型FVB鼠和转基因鼠的胚胎和成年小鼠为研究对象,利用实时定量PCR、苏木精-伊红染色和亚硫酸盐测序等方法,检测野生鼠和转基因鼠胚胎和成鼠中miR-370的表达情况、组织形态变化和DNA甲基化水平,并观察雄性小鼠的精子活力和雌性小鼠的动情周期,以此分析miR-370过表达对小鼠各个组织尤其是生殖腺的影响和对小鼠胚胎发育及性成熟后发育的影响。
  形态学观察显示miR-370转基因小鼠每胎产子数降低,异常死亡情况增多,雌雄比例异常。雄鼠在胚期18.5天和出生后体重均有所增加。实时定量RT-PCR结果表明相对野生型小鼠,miR-370在转基因鼠各组织中表达水平均有所上升。HE染色结果显示转基因鼠胚期肺脏出现大量瘀血。肾脏皮质发育尚可,髓质部分发育不完全,皮髓交界处不清晰。胎盘三层界限不清晰,成胶质细胞层和蜕膜层明显减少,血窦扩张,存在淤血。成体转基因鼠肺脏间质大量出血,肺泡断裂融合,瘀血严重,局部出现实变。肾脏大量瘀血,血管扩张,肾小球内出血。精巢中曲细精管的间隙增大,出现曲细精管萎缩和生精细胞减少现象,并伴随精子活力降低,畸形率升高,质膜完整率下降的情况。卵巢颗粒细胞层减少,卵泡内卵母细胞放射冠消失,颗粒细胞排列疏松,间隙增宽,核固缩以及卵泡囊性扩张,同时动情周期出现紊乱。
  综合以上结果可知,miR-370过表达对小鼠胚胎、胎盘和成体各组织的发育均产生影响,为进一步阐述miR-370在小鼠发育中的功能奠定了基础。
[硕士论文] 黄晓晨
水生生物学 南昌大学 2014(学位年度)
摘要:淡水蚌类(双壳纲:蚌目)广泛分布于世界各地,是淡水生态系统中最重要的生物类群之一。中国长江中下游地区淡水蚌类种类繁多,主要基于贝壳形态学特征的种类鉴定使得一些蚌科物种的种名有效性仍存在争议,属及其以上阶元的分类混乱。
  双壳纲中蚌目、贻贝目和帘蛤目的线粒体遗传模式是特殊的双重单亲遗传,存在父系和母系两种高度分化并与性别相关的线粒体基因组,且两种线粒体分布具有组织特异性。基于线粒体基因组全序列的系统发育分析能够增强系统树的解析度和数据置信度,适用于各阶元的系统发育关系。
  蛏蚌属(Solenaia)是亚洲特有属,中国目前能采集到活体样本的蛏蚌有3种且均为中国特有种,分别是龙骨蛏蚌 S. carinatus、橄榄蛏蚌 S. oleivorus以及河蛏蚌 S. rivularis。因食用需求的大量捕捞,以及人类活动导致的栖息地退化、改变和破碎化,蛏蚌属物种的分布范围日益狭窄、种群数量急剧下降。仅基于贝壳形态或解剖学特征,蛏蚌属属上单元分类仍具有争议,相关遗传信息也少见报道。
  本研究首次报道龙骨蛏蚌、橄榄蛏蚌以及河蛏蚌的父系与母系线粒体基因组全序列,其中所测定的父系线粒体全基因组为中国淡水蚌类中首次报道。结合 Genbank数据库中其它淡水蚌类的线粒体基因组数据,进行比较基因组学分析。首次基于线粒体全基因组对蚌目进行系统发育分析,以期为淡水蚌类的分类提供强有力的分子证据,真实反映它们的亲缘关系。主要研究结果如下:
  1.使用 LA-PCR扩增和步移法测序,拼接获得中国特有三种蛏蚌的父系与母系线粒体基因组全序列,6个线粒体基因组全长范围从16392 bp到17550 bp不等。线粒体基因组大小的差异主要源于非编码区长度的不同,此外,父系线粒体 cox2比母系线粒体 cox2要长~80%。
  2.三种蛏蚌父系与母系线粒体的基因排列有较大差异,父系或母系线粒体基因组种间无任何基因重排。与 Genbank数据库中其他淡水蚌类的线粒体全基因组比较,父系线粒体基因组均显示出一致的基因顺序,母系线粒体基因组则存在重排现象。与除隆嵴蚌亚科(Gonideinae)外的蚌科(Unionidae)母系 mtDNA的基因顺序相比,珍珠蚌科(Margaritiferidae)母系 mtDNA发生 trnE的移位。蛏蚌所隶属的隆嵴蚌亚科母系 mtDNA与其他蚌科动物的相比,cox2-rrnS区域因串联重复随机丢失发生了重排。cox2-rrnS区域的基因重排被认为是隆嵴蚌亚科母系线粒体基因组水平的共同衍征,该区域内 nad2与 nad3相对排列位置变化这一母系线粒体基因组特征可用来客观准确的判别一些贝壳形态上相似的属种。
  3.三种蛏蚌父系与母系线粒体基因组表现出显著的序列差异,同种蛏蚌父系与母系线粒体基因组间核苷酸序列差异超过40%(pDnt),氨基酸序列差异超过47%(pDaa),均超过父系或母系 mtDNA种间差异。母系 mtDNA种间核苷酸与氨基酸差异均要小于父系 mtDNA种间的差异。单个蛋白质编码基因方面,cox1最为保守,atp8最不保守,COX和 CYTB基因普遍比要 NADH脱氢酶亚基基因保守。
  4.基于淡水蚌类父系与母系线粒体全基因组,使用贝叶斯法和最大似然法构建的系统发育树都获得很高的数据置信度,结果表明:三种蛏蚌与尖锄蚌、背瘤丽蚌、三角帆蚌、池蝶蚌以及日本的 Pronodularia japanensis亲缘关系密切,都隶属于隆嵴蚌亚科;父系与母系演化支互为单系群;父系比母系线粒体基因组有更快的进化速率;支持蚌科中的珠蚌亚科、无齿蚌亚科、小方蚌亚科和隆嵴蚌亚科为单系群,系统发育树的基本结构为(珠蚌亚科 Unioninae+无齿蚌亚科 Anodontinae)+(小方蚌亚科 Ambleminae+隆嵴蚌亚科 Gonideinae)。
  5.基于线粒体16S与 ND1基因联合数据,分类单元使用更为全面的淡水蚌类系统发育分析表明:北美的西方隆嵴蚌与亚洲的蛏蚌和尖锄蚌有着密切的关系,它们来源于一个最近的共同祖先。
[博士论文] 李恩
生态学 安徽师范大学 2014(学位年度)
摘要:线粒体基因组作为独立于细胞核外的遗传物质,具有分子量小、基因组织结构保守、母系遗传等特性,因此,作为一个重要的分子标记,广泛应用于分子系统学和分子进化等方面研究。本文采用常规PCR和长片段PCR(LA-PCR)技术测定了游蛇科五种蛇类的线粒体基因组全序列,结合GenBank中蛇亚目线粒体基因组全序列,对蛇亚目线粒体基因组结构进行了比较分析,并探讨了蛇亚目主要类群的系统发生关系和分歧时间。主要结果和结论如下:
  1.所测定的五种蛇类线粒体基因组分别为翠青蛇(Cyclophiops major)(17217 bp),赤链蛇( Dinodon rufozonatum)(17189 bp),红纹滞卵蛇( Oocatochus rufodorsatus)(17159 bp),黑眉锦蛇(Elaphe taeniurus)(17183 bp)和乌梢蛇(Zaocys dhumnades)(17164 bp)。它们的基因组织结构与其他真蛇类一样,包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因,2个rRNA基因、2个控制区(CRI和CRII)和1个轻链复制起点(OL),其中,赤链蛇、红纹滞卵蛇和黑眉锦蛇额外多了个tRNAPro假基因。
  2.通过对蛇亚目各物种线粒体基因组的碱基组成比较,发现AT含量明显高于GC含量,且AT偏斜为正值,GC偏斜为负值。所有真蛇类线粒体基因组都具有显著特征,即基因组不同位置具有两个几乎完全相同的重复控制区,tRNALeu(UUR)基因移位(导致LQM基因簇的形成)和大多数tRNA基因具有较短的TΨC臂。在五种所测定的蛇类tRNA二级结构中,一些tRNA基因的TΨC环也存在缩短现象,同时,tRNACys基因在五种蛇中都缺失TΨC环,这在蛇类中尚属首次报道。
  3.本研究基于12种蛋白质编码基因序列,运用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)构建了蛇亚目56个物种的系统发生关系。系统发生树强烈支持蛇亚目的单系性,蠕蛇附目聚于系统树的基底部,最先分化出来。在游蛇超科中,美姑脊蛇位于基部,与蝰科、眼镜蛇科和游蛇科存在并系群关系,其分歧时间也早于游蛇超科的其他类群,建议将美姑脊蛇所属的闪皮蛇亚科上升为闪皮蛇科;四川温泉蛇始终与美洲钝头蛇亚科聚成一支形成姊妹群关系,建议将其置于美洲钝头蛇亚科。所有系统树中铅色水蛇与游蛇科和眼镜蛇科组成的单系群均互为姊妹群关系,从而支持水蛇科的科级分类地位。
  4.分歧时间估算显示,蛇类线粒体基因组结构发生显著变化的时间约在66.57 MYA(95%置信区间为58.34-74.59 MYA),突出表现在双控制区的出现、tRNALeu(UUR)基因的移位;同时,在游蛇超科中,绝大多物种的分歧时间在10-40 MYA之间,这与新生代的气候环境有利于蛇类的物种形成和辐射演化密切相关。
[硕士论文] 薛慧慧
生物化工 东华大学 2014(学位年度)
摘要:性发育(puberty)是哺乳动物个体性成熟并获得生殖能力的过程,受到遗传、环境等多种因素的影响。下丘脑-垂体-性腺轴系统控制着人类生殖系统的发育、成熟及功能的维持,对哺乳动物性发育起着决定性的作用,其所分泌的各种激素水平直接影响或控制青春期发育。在正常情况下,人类生长发育到一定时期时,随着下丘脑—垂体—性腺轴(HPGA)的成熟,启动青春期的发育,但其确切的分子机制尚不明确。
  近年来,很多人利用小鼠对性发育机制进行研究。本实验室从2004年开始,从400多种近交品系小鼠品系中,筛选出两个性发育启动时间有明显差异,全基因组及线粒体背景已知的近交品系小鼠C3H/HeJ和C57BL/6J作为亲本杂交产生F2代,全基因组STR扫描和遗传分析结果显示,在6号、13号和X染色体得到了与雌鼠阴门开启时间相关的区段,其中X染色体上的~25cM(DXMit103-DXMit119,LOD=3.86)的QTL区段是显著相关且首次发现的,遗传效应为C57BL/6J显性、C3H/HeJ隐性。针对小鼠X染色体初步定位的QTL区段构建数个特异性区段同类系,利用STR和SNP位标进行基因分型,并结合表型鉴定,在N7代家系中将小鼠性发育QTL区段缩短到X染色体rs13483770-rs29055848之间1cM的范围内,最终将候选基因定位在了miR-505。
  miR-505是非编码的内源性小分子RNA,初级体只有90bp,成熟体有两种状态,分别为miR-505-3P和miR-505-5P。其能在转录后水平负性调节靶mRNA表达。在正常状态下,miR-505-5P在RNA水平的表达量高于miR-505-3P。
  本课题组为深入研究miR-505对性发育的影响,构建了全cDNA的转基因小鼠。
  本研究基于stem-loop逆转录引物建立实时定量PCR技术检测成熟的miRNA;和基于绝对定量法的qRT-PCR检测microRNA的前体和初级体。Stem-loop qRT-PCR通过改进的茎环引物逆转录方案,采用相对定量的方法对样本进行分析。用以检测前体和初级的qRT-PCR方案,采用绝对定量的分析方法,分别检测出前体和初级体的初始拷贝数。利用该技术检测miR-505在转基因小鼠及其对照品系C57BL/6J中在5、15、25、35四个不同日龄下,丘脑、垂体、卵巢、肌肉、脂肪五个不同组织中miR-505表达水平的差异,结果显示:在不同日龄不同组织中,pri-miR-505的表达量都非常地低,只有几十拷贝;但是在5和15日龄下,pre-miR-505初始拷贝数在转基因小鼠不同组织中均比C57BL/6J高约10多倍。在成熟状态下,miR-505-5P除丘脑组织外,在垂体、卵巢、肌肉和脂肪组织中,其相对表达量基本上都大于1,尤其在卵巢和脂肪组织中,在5和15天日龄下,其相对表达量更是高达4左右。miR-505-3P其在位于性发育轴上的丘脑、垂体、卵巢组织中,相对表达量基本上都在1左右。
  同时,本研究鉴定了miR-505转基因小鼠及近交系品系C57BL/6J的表型,包括:阴门开启、角质化和生长曲线,发现均无显著性差异。
  综上所述,本研究成功的构建了检测microRNA前体和成熟体的经济实用、灵敏、高效的检测方案;利用该技术对不同日龄、不同组织的转基因小鼠和野生型小鼠进行分析,发现在转基因小鼠中miR-505的前体是明显提高的,但是成熟体在性发育相关丘脑-垂体-性腺轴上并没有表现出来,表明转基因小鼠的构建是成功的,但在基因表达水平上并没有显现出来;同时,由miR-505-3P和miR-505-5P在转基因小鼠中表达量的差异推测,miR-505-5P与性发育无关,这需要进一步的实验证明。通过本研究,对性发育的后续工作奠定了实验和理论基础。
[博士论文] 孙静
生态学 上海交通大学 2013(学位年度)
摘要:远盲蚓属(Amynthas)属于巨蚓科(Megascolecidae),是该科蚯蚓最大的类群之一,主要分布于东亚和东南亚地区。目前全世界共记录远盲蚓属蚯蚓500余种。中国是该属蚯蚓最主要的分布区之一,至本研究为止,共记载302种(亚种)。对该属蚯蚓的调查和深入研究是探明我国蚯蚓多样性和蚯蚓区系的重要过程。本文旨在通过系统采集我国东洋界区域的蚯蚓,对远盲蚓属蚯蚓进行形态分类学物种鉴定,丰富和完善我国蚯蚓区系;通过分子生物学和生物信息学新技术的运用,为我国远盲蚓属蚯蚓系统发育研究提供分子方面的最直接证据;结合分子和形态双重证据阐明中国远盲蚓属蚯蚓的起源和演化路径。全文主要工作包括三方面内容:1)中国南方上海、浙江、福建、广东、湖北、云南、贵州、四川和海南九省市蚯蚓调查采集;2)中国远盲蚓属蚯蚓分类学研究;3)中国远盲蚓属蚯蚓分子系统发育研究。本项研究所采用的方法为形态分类学和基于线粒体基因COI、COII、ND1、12S、16S和核基因18S的分子系统发育方法。主要研究结果如下:
  1.本项研究共采集和鉴定远盲蚓属蚯蚓143种(亚种),其中117种和亚种初步鉴定为新种(亚种)。
  2.在陈义、钟远辉等蚯蚓名录基础上,整合最新成果,编制了“中国远盲蚓属蚯蚓名录”。我国Amynthas物种目前已增至302种。其中华南区163种,华中区116种,西南区82种,华北区11种,东北区2种,蒙新区1种,呈现南方多于北方,东部多于西部的特点。
  3.基于我国143个Amynthas物种的研究结果表明线粒体基因COI、COII、ND1、12S和16S均可用于区分物种,但COI效果最佳,种间平均P距离16.57%。使用单个基因分析属内种间系统发育关系时,COI效果最差,COII和ND1各具优势,16S效果最好,但依然具有局限性。COI& COII& ND1&12S&16S&18S六基因联合DNA片段比单基因、3蛋白编码基因联合以及2 rRNA编码基因联合片段均能获得效果明显提高的系统发育树,属内种间关系澄清程度大幅提升。
  4.系统发育分析结果显示,我国Amynthas属物种的分化与扩散具有明显的区域特征。伴随着受精囊位置或对数的变化沿各自不同路径进化的单系群在地理分布上极具规律。闽粤群形成受精囊孔以7/8-8/9为起始状态,6/7-8/9为过渡态,5/6-8/9为最终状态的进化路径。云贵川群内,4对受精囊孔在进化过程中逐渐退化为2或3对。在海南群中,一支中受精囊孔均为5/6-6/7,而另一支中受精囊孔为5/6-6/7和5/6-8/9的物种交错出现。
  5.同样,系统发育结果表明Sims& Easton1972划分的Amynthas属和Metaphire属均不是单系群,但关系密切。它们不是在各自属内进化,而是先形成单系群,然后在单系群内Amynthas和Metaphire建立起种间差异和关系。就属内物种群而言,Sims&Easton1972按照受精囊孔位置和对数划分的5个物种群在分子系统发育树中均非单系群。
  6.研究采集到Amynthas属孤雌生殖蚯蚓9种。他们在地理分布上单独发生,福建广东、海南、四川分别居于各自的分枝中。闽粤群中的孤雌生殖物种群可能起源于受精囊为3对的两性生殖种。
  通过本文的研究结果,可推测出中国Amynthas属起源于印支半岛,在中国大陆沿东西两条路线分化扩散,受精囊孔4对的物种沿云贵川一线分化扩散,物种进化路径伴随着受精囊孔由4对逐渐退化为2或3对,受精囊孔2对的物种沿闽粤一线分化扩散,物种进化路径伴随着受精囊孔由7/8-8/9经6/7-8/9最终发展为5/6-8/9;海南岛位于闽粤线上,但该岛特殊的古地理变迁历史使得其具有独立于闽粤的物种群,但又有个别物种与广东物种具有很近的关系;在种间或物种群间亲缘关系上,分布在相邻区域内的物种间关系总是较近。
[硕士论文] 兰天明
生理学 东北林业大学 2013(学位年度)
摘要:抗菌肽系统是两栖类最重要的先天性免疫防御系统之一。基因复制后的正选择和平衡选择作用维持了两栖类抗菌肽极高的多样性,与病原微生物进行协同进化。基因复制后,若不同分子进化方向不同,那么一定存在另外一些分子承受了很强的负选择作用,为其他分子在适应性进化过程中提供种群基本生存保障。为了验证这一假设,我们采用东洋界和古北界的广布种黑斑侧褶蛙(Pelophylax nigromaculatus)为研究对象,选择了3种具有广谱抗菌能力的抗菌肽Temporin、Esculentin-1N和Esculentin-2Na,研究其基因拷贝数、等位基因数以及变异方式。黑龙江哈尔滨(HRB)、山东东营(DY)、湖北武汉(WH)和广东茂名(GD)4个地理种群的数据显示,一个体基因组中共有7个Esculentin-1N基因单倍型、8个Temporin基因单倍型,确定两基因中至少存在4个基因座位。Temporin基因的8个单倍型全部编码同一种抗菌肽,群体分析(n=20)表明,Temporin基因成熟肽编码区无任何变异,而内含子和3'UTR区域的遗传多样性显著高于外显子2和中性核基因FIBI7内含子,排除了近期的复制事件和选择清除作用,支持强烈负选择和基因转换作用保持了Temporin基因极低的遗传多样性。Esculentin-1N基因则编码了4种不同抗菌肽,共发现4个变异位点,其中3个非同义突变。中性检验法、非保守与保守氨基酸变化比值和最大似然法均检验到正选择作用于Esculentin-1N基因,但没有达到显著性水平。支持低等程度正选择作用维持了Esculentin-1N基因较高的多样性。Esculentin-2Na为单座位基因,6个地理种群(增加黑龙江抚远-FY和河北唐山-TS)127只个体的分析发现,成熟肽编码区11个突变位点,8个为同义突变;中性检验参数显著小于0(P<0.05);Jukes-Cantor修正的Nei-Gojobori法计算所得dN/dS显著小于1(P=0.0176);最大似然法对每个氨基酸位点所受选择压力分析没有发现正选择位点的存在(P=1),且92%的氨基酸位点后验平均ω<0.2,后验概率支持均大于95%;单倍型网络呈星状分布并由短枝长相连接。支持Esculentin-2Na抗菌肽编码基因受到了强烈负选择压力的作用。上述结果表明,Tmporin和Esculentin-2Na基因受到强烈的负选择作用,在黑斑侧褶蛙抗菌肽系统中承担了基础免疫防御功能,而Esculentin-1N基因受到了低程度正选择作用,代表了抗菌肽的适应性进化。
  为辅助对黑斑侧褶蛙抗菌肽基因进化模式的研究,我们基于线粒体控制区和中性核基因对6个地理种群黑斑侧褶蛙种群的遗传结构和遗传多样性进行了研究。结果再次验证了东北支系和大陆支系的存在,大陆支系又分支为支系A各支系B。大陆支系B仅存在TS和WH种群共享单倍型,大陆支系B共享单倍型则包括了TS、DY、WH、GD四个种群。支持支系B起源于西部高地,支系A起源于东南部沿海地区。
[硕士论文] 陈思
生物化学与分子生物学 曲阜师范大学 2013(学位年度)
摘要:环棱螺属Bellamya隶属于软体动物门Mollusca、腹足纲Gastropoda、前鳃亚纲Prosobranchia、原始纽舌目Mesogastropoda田螺科Viviparidae。环棱螺属除南美以外,广泛分布于世界各地的淡水水域中,如亚洲、非洲、北美,现已发现150种,31属被鉴定。环棱螺属的一些物种是众多寄生虫(如吸虫类)的中间宿主,因而对于医学和兽医学研究具有十分重要的价值。
  本文以2011年采集于南四湖湿地的环棱螺类为供试材料,首先以传统的形态学分类法对样本进行初步鉴定与分类,然后以18S rDNA、28S rDNA、ITS的部分序列为分子标记,进行遗传距离分析、系统进化分析、同源性分析,探讨环棱螺类的分类地位以及与其它地区不同种类环棱螺的亲缘关系,以期为南四湖环棱螺遗传资源的保护与利用提供相关的理论依据。主要研究内容如下:
  1.对南四湖环棱螺类的形态观察发现,仅通过外形的描述很难明确的区分出环棱螺的种类,分类特征不十分明显;而相关形态参数的聚类分析将南四湖环棱螺类聚为三支;据此,可将南四湖采集的环棱螺类分为三类,即铜锈环棱螺、方形环棱螺与梨形环棱螺。
  2.以南四湖环棱螺类的基因组DNA为模板,根据腹足纲通用引物,PCR扩增出9条目的片段,经目的片段的回收、克隆、测序,并进行遗传距离与标准差的分析,结果显示,铜锈环棱螺与方形、梨形环棱螺为不同的种类,方形环棱螺与梨形环棱螺的遗传距离与标准差为0.000,二者亲缘关系极其相近,初步推断二者为同一物种。
  3.以18S rDNA、28S rDNA、ITS的部分序列为分子标记,分别进行同源性分析,结果表明方形环棱螺与梨形环棱螺的相似性在99%以上,可见二者的亲缘关系十分接近;系统进化分析结果也显示,无论属间的还是科间的聚类分析,这两种螺类始终聚在一支上,进一步提示二者在分类地位上的一致性,应为同物异名。
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