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[博士论文] 罗鹏
农产品加工及贮藏工程 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:葵花籽是我国五大油料之一,年产量约为250万吨,取油后的葵花籽饼粕仍含有29%~43%的蛋白质,是一种重要的蛋白资源。近年来,以各种蛋白源制备ACE抑制肽已经逐渐成为研究热点,也为降压药的开发提供了一种新思路。本课题以低温脱脂葵花籽粕为原料,通过对葵花籽ACE抑制肽酶解制备工艺的优化、ACE抑制肽的分离纯化、氨基酸序列分析及稳态化进行研究,以期为葵花籽蛋白资源的开发利用提供科学依据。本论文的主要内容及结论如下:
  1.葵花籽ACE抑制肽制备工艺的优化
  本课题分别采用单一蛋白酶水解、碱性蛋白酶与风味蛋白酶分步水解和碱性蛋白酶与风味蛋白酶双酶协同水解工艺制备葵花籽ACE抑制肽。单酶水解条件下,碱性蛋白酶酶解效果最佳,水解度为21.14±0.76%,ACE抑制率为62.34±0.57%;经碱性蛋白酶-风味蛋白酶分步水解后,葵花籽蛋白水解度达32.32%,ACE抑制率提高至67.80%;经碱性蛋白酶-风味蛋白酶双酶协同水解后,葵花籽蛋白水解度为31.25±1.24%,ACE抑制率为65.23±0.58%。碱性蛋白酶-风味蛋白酶双酶分步水解制备的葵花籽ACE抑制肽活性强,在优化条件下制备的葵花籽多肽ACE抑制IC50值为1.39mg/mL,相对分子量主要分布在3kDa以下(占97.34%),其中Mw<1kDa的级分高达81.52%;与葵花籽蛋白相比葵花籽多肽中的疏水性氨基酸、中性氨基酸、芳香族氨基酸和碱性氨基酸含量均有一定程度的减小,而酸性氨基酸含量则出现大幅度的增加,增幅达50%。
  2.葵花籽ACE抑制肽的分离纯化及结构分析
  本课题利用大孔树脂吸附、超滤、凝胶层析和反相液相色谱对葵花籽ACE抑制肽进行分离纯化,并借助质谱技术对其氨基酸序列进行分析。
  研究了S-8、X-5、D-101、DA201-C和HPD-100五种大孔树脂对葵花籽ACE抑制肽的富集作用,其中DA201-C型树脂对葵花籽多肽的吸附和解吸效果最好。经DA201-C型树脂吸附葵花籽多肽的脱盐率达到85%以上,ACE抑制IC50值降低至1.09mg/mL。
  葵花籽多肽经超滤得到Mw<1kDa、1kDa<Mw<3kDa、Mw>3kDa三种级分,各超滤级分的氨基酸组成和含量有一定的差异,但主要是由谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)组成;其中Mw<1kDa级分的ACE抑制IC50值最低,为0.41mg/mL。
  将Mw<1kDa的超滤级分经Sephadex G-10和Sephadex G-25凝胶层析分离分别可以得到4个峰和3个峰;其中,Sephadex G-10分离出的BⅢ峰的ACE抑制IC50值为83±5μg/mL;液相色谱分离BⅢ组分得到6个峰,其中,4#峰的ACE抑制IC50值为5.6±0.5μg/mL,并根据二级质谱信息可以推测出其氨基酸序列为G-L/I-R-P,通过固相多肽合成上述两种四肽,其ACE抑制IC50值分别为4.5±0.5μg/mL和5.0±0.4μg/mL,二者之间无显著差异。最后将固相合成两种四肽(即G-L-R-P和G-I-R-P)与葵花籽多肽原样采用高效液相色谱进行比较可以确定本实验制备的葵花籽ACE抑制肽的氨基酸序列为G-L-R-P。
  3.葵花籽ACE抑制肽的体内活性初步研究
  葵花籽ACE抑制肽一次性给药后,各剂量组均使SHR大鼠的收缩压出现不同程度的降低,且存在明显的量效关系。另外,一次给药后SHR大鼠的收缩压的最低值出现在给药后3h左右,之后收缩压开始逐渐回升,表明葵花籽ACE抑制肽的降血压活性还具有一定的时效性。
  长期灌胃葵花籽ACE抑制肽使SHR大鼠的体重均出现增加现象,其中空白组SHR大鼠的体重增加量最大,阳性对照组体重增加量最小,剂量组居中且各组SHR大鼠体重增加量之间无显著差异。各剂量组和对照组SHR大鼠的收缩压在为期4周的饲养过程中,除低剂量组和空白组的收缩压无显著差异外,其他各组均与对照组相比均有显著的差异。各实验组SHR大鼠的心率值之间无显著差异性,表明葵花籽ACE抑制肽对SHR大鼠的心率无显著的副作用。
  4.葵花籽ACE抑制肽的稳态化研究
  葵花籽ACE抑制肽对热和酸碱度极其敏感,当pH≥8,加热温度≥60℃,加热时间超过2.0h时ACE抑制活性与对照组(未加热组)相比呈明显下降趋势,仅当pH<4.0,加热温度≤40℃,加热时间<2.0h时,ACE抑制活性才能较好的保持。葵花籽ACE抑制肽在模拟胃肠液中的活性却相对稳定,其活性不仅没有下降反而有小幅上升。
  葵花籽ACE抑制肽微胶囊化的最佳工艺参数为:芯壁比(葵花籽ACE抑制肽:β-环糊精)1∶18,包合温度30℃,超声强度150W,超声时间70min,在此条件下微胶囊的载药量为4.9±0.5%。在模拟胃液和模拟肠液中的体外释放试验表明:以β-环糊精为包埋壁材的微胶囊化处理对葵花籽ACE抑制肽起到了一定的缓释效果,且微胶囊化的葵花籽多肽ACE抑制活性保持较好,敞口贮藏9d后ACE抑制率仍可达到24.6%。
  在葵花籽ACE抑制肽脂质体制备工艺中,磷脂:胆固醇、超声时间和磷脂:ACE抑制肽是影响脂质体包封率的三个关键因子(p<0.001),经中心组合设计实验及响应面优化,葵花籽ACE抑制肽脂质体制备的最优工艺参数为磷脂:胆固醇为4.1∶1,超声时间为8.05min和磷脂:ACE抑制肽为15∶1,脂质体包封率为91.25±0.48%。葵花籽ACE抑制肽脂质体在磷酸缓冲液中12h的累计释放率为77.83%,而未被包封的葵花籽ACE抑制肽在同样条件下累计释放率达到95.74%,表明脂质体的包封作用对ACE抑制肽能够起到一定的缓释作用;且Logistic释放模型和一级动力学模型均能较好的对葵花籽ACE抑制肽脂质体的累计释放率和释放时间进行拟合。葵花籽ACE抑制肽脂质体在分别保存15d、30d、45d和60d后,包封率分别为88.40%、86.74%、84.52%和81.86%;ACE抑制率分别为75.65%、74.32%、70.79%和68.83%,表明葵花籽ACE抑制肽脂质体具有较好的稳定性,而且对ACE抑制活性具有一定的保护作用。
  综上,本课题从葵花籽多肽中分离纯化得到了一个活性较高的新的ACE抑制肽,并鉴定其氨基酸序列为G-L-R-P,并利用固相多肽合成验证了其ACE抑制活性;首次对葵花籽ACE抑制肽的微胶囊化和脂质体制备工艺进行了系统的研究,并获得了具有实用价值的成果。
[硕士论文] 赵英垒
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:双水杨酯是一种应用广泛的消炎镇痛药物,近年来临床研究表明该药物可用于2型糖尿病的预防和治疗。目前对于双水杨酯的研究多停留在合成工艺和药用领域,缺乏相平衡及结晶过程研究。本文对双水杨酯固液平衡及结晶工艺进行实验与理论研究。
  利用激光动态法测定双水杨酯在十种不同纯溶剂(甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、甲酸、乙腈、丙酮、氯仿)和两种混合溶剂(乙醇+乙腈、乙酸乙酯+乙腈)中的溶解数据。双水杨酯在丙酮中的溶解能力最强,在醇类溶剂中溶解性相似。在乙醇+乙腈混合体系中,双水杨酯的溶解度随乙醇比重的增加呈先增后减趋势。在乙酸乙酯+乙腈混合体系,其溶解度随乙酸乙酯比重的增大而升高。使用van't Hoff方程、Apelblat方程及修正的J—A模型对实验溶解数据进行关联,并计算得到双水杨酯在不同溶解过程的热力学函数。
  为进一步解释双水杨酯在不同溶剂中的溶解机理,本文基于量子化学方法对双水杨酯分子与溶剂分子间O…H的距离和角度、电子密度性质及相互作用能进行分析。结果表明双水杨酯分子分别与甲醇、乙醇及丙酮分子间存在两个氢键作用,且强弱不同。三种复合物的相互作用能大小说明了双水杨酯在三种不同溶剂中溶解能力的差异。
  依据双水杨酯在乙醇中的溶解数据,对双水杨酯以乙醇为溶剂,水为溶析剂的结晶工艺条件进行优化。以晶体收率、粒度分布及晶习为指标,研究溶液初始浓度、温度、搅拌速率、溶析剂滴加流速和溶剂与溶析剂配比因素对晶体质量的影响,并确定较佳的结晶条件。初始溶液浓度0.22g/ml,温度20℃,搅拌速率150rpm,溶析剂水滴加速率1ml/min,溶剂乙醇与溶析剂水配比为1∶3。
[硕士论文] 卢广伟
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:目前,肺结核仍然是危害人类生命健康的世界疾病,而吡嗪酰胺(PZA)是治疗该疾病最为有效的药物,但由于具有较低的水溶性严重限制其口服吸收。药物共晶作为一种新型固体型态,可以调节药物的不良理化性质,从而提高其疗效。因此,本文将吡嗪酰胺选定为研究对象,从以下几个方面对PZA共晶进行了系统的研究。
  选用肉桂酸、酒石酸、马来酸(MA)作为共晶配体(CCF),采用反应结晶法进行PZA共晶的筛选。并经过粉末X-射线衍射、差示扫描量热法、红外光谱法以及扫描电镜法对产物进行了定性分析;采用粉末X-射线衍射法和高效液相色谱法对PZA-MA共晶进行了定量分析,最终确定PZA与MA以1∶2的化学计量比结合形成了共晶。
  采用激光动态法测定了二者在五种纯溶剂(甲醇、正丙醇、水、丙酮、乙酸乙酯)和一种混合溶剂(丙酮+正丙醇)中的溶解度数据。从数据可以看出,在所选定的溶剂中,PZA-MA共晶的溶解度均明显高于PZA。同时,选用不同的经验模型对测定的数据进行了关联和计算。基于测定的溶解度数据,计算了PZA和PZA-MA共晶与所选溶剂混合过程的热力学性质。同时,结合晶格能和溶剂化能理论对PZA-MA共晶增强溶解度的机理进行了解释。
  研究了PZA和PZA-MA共晶在水、模拟胃液(pH=1.2的盐酸缓冲液)、模拟十二指肠液(pH=4.0的醋酸缓冲液)、模拟肠液(pH=6.8的磷酸缓冲液)中溶解时,PZA的浓度随时间变化的溶出曲线。同时,结合无定型药物增溶的“弹跳-伞降”理论,对PZA-MA共晶的溶解性能进行了具体分析;基于抑制药物沉淀的相关理论,进一步推测了PZA-MA共晶溶解时,MA在PZA沉淀过程中所起的作用。
  本文的研究内容为通过共晶提高难溶药物溶解度的研究提供了一定的理论依据和基础数据。
[硕士论文] 彭静
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:本研究在人绒毛膜促性腺激素(hCG)的结合多肽的基础上应用嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体,简化单域抗体制备过程,提高多肽生化稳定性。利用单域抗体通用骨架(cAbBCII10),以hCG结合多肽取代互补决定区CDR1或CDR3,合成cAbBCII10嫁接抗体全基因序列并与sfGFP基因序列融合后,插入到带有His标签的原核表达载体pET30a(+)中,成功构建了pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP与pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP融合蛋白表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白,得到高表达量的可溶性融合蛋白。利用Ni-NTA亲和柱纯化得到纯蛋白,应用SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白为正确表达的目标蛋白。通过抗原抗体结合实验,发现hCG结合多肽嫁接到单域抗体通用骨架的互补决定区CDR1或CDR3后都有抗原结合活性,具有相似的抗体滴度,且嫁接到CDR3后的抗原结合活性比CDR1要高(2-3倍)。嫁接抗体基本保留了所用单域抗体框架较为稳定的生化特性、具有一定的热稳定性和较好的碱耐受性,同时,所接入的hCG结合片段对hCG具有较特异的结合活性,为进一步优化抗原结合多肽嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体提供了可靠的实验基础。
[硕士论文] 涂杰
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,侵袭性真菌感染(Invasive Fungal Infections,IFIs)的发病率和死亡率呈明显上升趋势,临床上真菌耐药性问题日趋严重,而用于治疗深部真菌感染的药物存在毒副作用大、抗菌谱窄、易产生耐药等诸多不足,因此,发现全新结构类型和作用机制的先导化合物成为抗真菌药物研究的重要方向。
  目前,抗真菌药物研发主要有以下策略:(1)现有抗真菌药物的优化和改进;(2)发现抗真菌新靶点并设计特异性的抑制剂;(3)基于表型筛选的先导化合物发现和靶标确证。对现有药物进行结构优化和改进难以避免其固有作用机制带来的缺陷。因此,本文基于抗真菌新靶点Pdr1-Gal11A KIX蛋白,设计合成了两类全新结构的抗真菌先导化合物,并针对课题组前期研究发现的咔啉类先导化合物进行深入的抗真菌作用机制研究。
  一、基于Pdr1-KIX相互作用的抗真菌先导物的设计、合成和活性研究
  本研究基于Pdr1-Gal11A KIX蛋白-蛋白相互作用,以抑制剂iKIX1为先导化合物,通过分析iKIX1与KIX蛋白的氢键作用模式图,设计、合成了19个肼硫代甲酰胺类衍生物。通过体外抗真菌活性测试,确证iKIX1对于光滑念珠菌有中等抑制活性(MIC50=1μg/mL)。构效关系表明,硫脲结构是其发挥活性的关键基团,将硫脲结构中的硫原子替换为氧原子活性丧失,骨架苯环上引入供电基、芳环、芳杂环均不能提高活性。但是,苯环上硝基取代的化合物5q、乙炔基取代的化合物12a对光滑念珠菌和新生隐球菌的抑制活性均优于先导化合物iKIX1,与阳性对照药氟康唑相当。采用秀丽隐杆线虫真菌感染模型进行初步的体内抗真菌药效研究,结果表明,化合物5q、12a能在一定程度上延长线虫的生存期。
  二、吡唑硫代酰胺类新型抗真菌先导物的发现、优化和活性研究
  在对IKIX1进行合成的过程中,意外分离得到一个副产物7a,经核磁、质谱鉴定,确定该化合物结构为5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺。经体外抗真菌活性测试,发现其对三种常见致病真菌均具有优秀的体外抗真菌活性(MIC值为0.016-0.25μg/mL),是一个全新抗真菌分子骨架。本研究以7a为先导化合物,对其进行三个方面的结构优化。首先,对5-氧代-1,2-吡唑酮环进行骨架跃迁,用变构的3-氧代-1,2-吡唑酮环替换,并在环上引入乙酰基;其次,对骨架苯环进行取代基优化,引入卤素、烷基、芳香环等取代基;最后,在化合物7a杂环上引入疏水性基团苯环。
  经体外抗真菌活性测试,优选得到抗真菌活性最好的化合物7a、6d和11a,并进行初步作用机制研究和的体内抗真菌药效考查。
  结果表明,化合物7a、6d和11a可以抑制真菌被膜形成,可以有效延长新生隐球菌感染线虫的生存期。此外,化合物7a可以浓度依赖地抑制新生隐球菌生长,且明显优于氟康唑;在小鼠系统性感染模型中,化合物7a对新生隐球菌感染小鼠表现出一定的体内抗真菌活性。
  三、咔啉类化合物的抗真菌活性和作用机制研究
  课题组前期通过表型筛选、结构优化,发现了具有优秀抗隐球菌活性的咔啉类化合物JYJ-19和JYJ-20(MIC值为0.25-1μg/mL),但该类化合物的体内抗真菌活性、作用机制和作用靶点并不明确。本研究建立了小鼠系统性隐球菌感染模型,对该类化合物的体内药效进行考察;对其作用机制进行深入研究,考察化合物对真菌增殖、生物被膜、黑素、尿素酶形成、细胞表面疏水性等新生隐球菌毒力因子的抑制作用,考察化合物作用下真菌细胞形态学改变和对细胞周期的影响。根据研究结果,进一步考察化合物可能的作用通路。体内活性测试结果表明,化合物JYJ-19可以显著提高系统性新生隐球菌感染小鼠的生存期。作用机制实验结果表明,化合物JYJ-19和JYJ-20呈浓度依赖地抑制真菌细胞的增殖,对黑素、被膜和细胞表面疏水性有较好的抑制作用。透射电镜结果显示,在化合物JYJ-19作用下,真菌细胞核固缩、染色体凝集、细胞膜和细胞壁均受损,与对照药氟康唑作用下的损伤结果不同;细胞周期结果表明,JYJ-19阻滞真菌细胞于G2期,而氟康唑阻滞真菌细胞于G1期。以上结果提示该类化合物可能具有全新的作用机制,为了进一步探索该类化合物的作用机制,通过Western Blot实验考察其可能的作用通路。
  结果表明,化合物JYJ-19作用下,Cdc25C和CDK1蛋白表达量上调,该类化合物可能作用于CDK1-CyclinB通路。综上所述,咔啉类化合物具有优秀的体内外抗隐球菌活性,其作用机制新颖,为隐球菌病治疗药物的研究提供了新的思路。
[硕士论文] 李新方
化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤,严重威胁全球女性身心健康甚至危及生命,发病率在美国女性恶性肿瘤中居于首位。近年来我国乳腺癌发病率的增长速度高出高发国家1~2个百分点,特别是其发病有年轻化的趋势,乳腺癌已经成为现代社会重大公共卫生问题。肿瘤耐药是导致乳腺癌化疗失败的主要原因,也是影响乳腺癌患者预后的重要因素,因此能够克服或逆转乳腺癌肿瘤化疗耐药的新方法的研究,成为当前治疗耐药乳腺癌的关键探索方向。本课题采用现代纳米技术基于磁性介孔二氧化硅纳米材料构建出肿瘤双重靶向和pH响应释药的多药共载复合纳米载体,实现肿瘤靶向的化疗/光动力联合治疗与自噬抑制剂联合应用,并且能够实现肿瘤靶向传递及控制释药,有效提高肿瘤组织药物浓度,降低全身毒副作用。本课题的研究内容主要包括以下三部分:
  在第一章研究中,首先采用改进St(o)ber方法合成了具有双孔道核壳结构的介孔二氧化硅纳米粒,MSN粒径大小约为100nm,形貌规整呈球形,且分散性较好,总孔容为2.47cm3/g,孔径为5.36nm,较大的比表面积和孔容,使MSN能够有效负载大量的药物。其次在氨基化MSN表面通过亲核取代修饰嵌合超顺磁性氧化铁纳米粒,构建了磁性介孔二氧化硅纳米粒。然后以DCC为缩合剂酰胺化共价结合光敏剂Ce6,同时负载BCRP抑制剂Ko143,并交联高分子聚合物FA-PEG-b-PAsp,最后负载抗肿瘤药物DOX,完成了共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA的构建。共载药纳米复合物DOX的载药量为21.76%,pH相应性释药研究表明其具有pH敏感控制释放性能,在弱酸性条件下60h时,DOX累积释放率高达80.53%,pH响应性释药能够有效降低DOX在正常组织的释放,同时在肿瘤组织定向释药、增加肿瘤组织中药物浓度,能够更高效地发挥抗肿瘤作用;通过磁滞回线测试仪检测构建的共载药纳米复合物的磁饱和强度为5.3emu/g,结果显示其具有良好的超顺磁性,可以达到良好的磁靶向效果。
  在第二章研究中,从细胞水平评价了共载药纳米复合物对乳腺癌MCF-7/ADR细胞的增殖抑制及逆转作用。荧光显微镜、生物透射电镜及流式细胞仪结果显示共载药纳米复合物具有良好的磁靶向性、叶酸靶向性及细胞摄取能力;根据CCK-8及流式细胞仪的检测结果可知共载药纳米复合物对MCF-7/ADR细胞的抑制作用存在着浓度依赖性,化疗/光动力联合治疗具有一定的协同作用,其IC50值为4.23μg/ml,而游离DOXIC50值高达363.2μg/ml,共载药纳米复合物可以显著逆转MCF-7/ADR细胞耐药,有效诱导MCF-7/ADR细胞凋亡或死亡;Transwell实验结果表明共载药纳米复合物可以有效抑制MCF-7/ADR细胞的转移及迁移。
  在第三章研究中,利用体内实验通过观察肿瘤体积、肿瘤重量、裸鼠体重、生存周期评价共载药纳米复合物对阿霉素耐药乳腺癌的治疗作用。采用在BABL/c裸鼠第四乳腺脂肪垫上注射MCF-7/ADR细胞的方法建立了耐药乳腺癌移植瘤模型;普鲁士蓝染色实验结果表明共载药纳米复合物具有良好的体内磁靶向性;裸鼠血液生化参数及HE染色检测结果显示共载药纳米复合物的体内毒性小;裸鼠肿瘤体积和肿瘤重量表明共载药纳米复合物具有显著的抑制肿瘤生长作用,生存曲线结果显示共载药纳米复合物能够延长裸鼠生存时间,施加磁场共载药纳米复合物组肿瘤体积和重量最小,生存期相对最长,并具有统计学差异。动物实验结果表明共载药纳米复合物具有良好的体内耐阿霉素乳腺癌治疗效果且毒副作用小。
  综上所述,本研究成功构建了具有肿瘤双重靶向及pH响应性释药共载药纳米复合物,该复合物具有良好的超顺磁性,能够有效的被MCF-7/ADR细胞摄取,具有较好的叶酸靶向性、磁靶向性及pH响应性释药性能,在细胞水平及动物水平均表现出良好的抑制耐药乳腺癌生长的效果,具有克服肿瘤细胞的化疗耐药、降低毒副作用的能力。本研究有望为肿瘤靶向联合递药体系设计提供新思路,为耐药乳腺癌的治疗开辟新途径,具有重要的科学和研究意义。
[硕士论文] 陈龙
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:胰腺癌是一种恶性程度很高,诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤,被称为“癌中之王”,目前尚缺乏特异性的药物。KRAS与胰腺癌密切相关,约90%的胰腺癌中KRAS基因突变,频率最高。抑制KRAS的活性对于胰腺癌治疗具有重要意义。由于KRAS蛋白表面缺少合适的小分子结合空腔,基于KRAS的小分子抑制剂的研发一直是药物化学领域的难点之一。
  KRAS-PDEδ蛋白-蛋白相互作用是近年来发展起来的胰腺癌治疗新靶点,但目前缺乏具有成药性的小分子抑制剂。PDEδ也称为PDE6D,能够影响细胞中KRAS蛋白在细胞膜上的扩散及正确定位并调节信号转导。PDEδ下调会导致KRAS蛋白在细胞膜上的分布随机化,从而抑制KRAS下游信号转导。因此,利用小分子抑制KRAS-PDEδ的相互作用为胰腺癌治疗带来巨大希望。
  基于KRAS-PDEδ蛋白相互作用的结构基础,本课题从以下两部分内容展开研究:
  一、基于片段连接法设计新型KRAS-PDEδ小分子抑制剂及抗胰腺癌活性评价
  基于小分子与PDEδ晶体复合物(PDB:4JV6、5X73),选择本课题组虚拟筛选发现的二氢喹唑啉酮类KRAS-PDEδ抑制剂与苯并咪唑类抑制剂,运用片段连接方法进行连接,获得了19个新型KRAS-PDEδ抑制剂。该类化合物活性优异,蛋白结合常数均小于20nM,化合物C2对PDEδ蛋白的结合活性最优(KD=4.5±1.1nM),明显优于阳性药Deltazinone(KD=8±4nM);化合物C8(IC50=58.6±6.3μM)、化合物D9(IC50=52±2.5μM)的体外抗胰腺癌增殖活性均与阳性药(IC50=48±6μM)相当。
  二、新型喹唑啉酮类KRAS-PDEδ小分子抑制剂的结构优化、抗胰腺癌活性评价和作用机制研究
  现有KRAS-PDEδ抑制剂的主要缺陷在于细胞活性低、成药性能差。本研究通过两轮合理设计和结构优化获得了18个全新结构化合物。这些化合物均表现出良好的体外活性,其中以化合物E1(KD=58±5nM,IC50=28±6.3μM)、G3(KD=38±17nM,IC50=8.8±2.4μM)活性较优,体外抗胰腺癌增殖活性明显优于阳性药Deltazinone(IC50=48±6μM)。机制研究表明,高活性化合物G3能有效诱导肿瘤细胞凋亡,显著抑制细胞内的KRAS-PDEδ相互作用,影响KRAS的细胞膜定位,下调细胞内Erk和Akt蛋白磷酸化水平。本研究为深入探索KRAS-PDEδ的生物学功能,验证靶点的成药性能以及抗胰腺癌的新药研发提供了新型分子探针和先导化合物。
[硕士论文] 程凯
应用化学 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:本文的研究目的是对制备的生物素偶联多西紫杉醇牛血清白蛋白纳米粒(DTX-BIO-BSANPs)进行特征描述,并通过体外和体内实验评估其抗肿瘤活性。
  采用反溶剂化法制备DTX-BIO-BSANPs。生理盐水复溶0、1、2、4和8h后DTX-BIO-BSANPs粒径分别是166.9、160.3、159.0、176.1和184.8nm,zeta电位分别为-29.97、-26.42、-38.58、-35.14和-25.50mV。多分散指数稳定在0.159-0.178范围内。体外细胞摄取实验表明DTX-BIO-BSANPs具有良好的靶向性。体外缓释实验结果表明具有一定的缓释作用。
  体外细胞毒性的研究结果表明,孵育48小时后,对MCF-7、SGC7901、LS-174T和A549细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用。S180-肉瘤荷瘤小鼠的体内实验结果显示DTX-BIO-BSANPs和多西紫杉醇具有明显的肿瘤生长抑制作用,其抑制率分别为52.4%和45.1%。
  总之,这些结果表明DTX-BIO-BSANPs具有良好的稳定性、靶向性和体外释放可控性,其体外和体内抗肿瘤活性与多西紫杉醇相当。
[硕士论文] 杨铭宇
机械工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:目前,片剂型药物加工方式是使用压片机批量化生产,而生产定制具有靶向释放功能的药片是未来药剂学的一个重要发展方向。三维打印技术具有可定制化特点,可以加工复杂的立体结构。将三维打印技术与片剂成型加工技术结合,可以通过设计片剂结构,改变片剂比表面积对片剂崩解释放进行控制。本文以对乙酰氨基酚粉末为材料,提出一款粉末混合料复合式三维打印机的设计与实现方法,并进行了相关分析,内容如下。
  (1)本文对一台用于片剂加工的双喷头三维打印机进行机械设计。设计内容包括三维打印机的机身结构、动力来源、传动装置、挤出装置、打印平台等。使用SolidWorks进行虚拟装配,最后实物搭建调试。
  (2)对于三维打印机上的一些梁结构和悬臂式结构,例如X轴、Y轴、Z轴和打印平台。本文采用Ansys Workbench进行静力学分析,得到了相应的位移云图和等效应力云图。对箱体结构进行模态分析。
  (3)对三维打印成型误差来源进行分类,对系统误差和参数误差进行研究,主要对分层厚度、挤出速度、填充速度、填充率、填充图案等参数对打印精度的影响进行了分析和计算,并以此结果进行后续的三维打印片剂实验。
  (4)在双层对乙酰氨基酚片剂打印实验中,采用正交试验获取了最佳打印参数组合,并配制了对乙酰氨基酚片的速释层药剂和缓释层药剂,得到三维打印对乙酰氨基酚片剂。进而对三维打印片剂的物理性能(重量、硬度、脆碎度)和化学性能(含量、释放特性)进行了实验测定。从在物理特性和化学特性两方面证明三维打印双层对乙酰氨基酚片达到了设计要求。证明了三维打印技术在制药方面的应用可行性。
[硕士论文] 王成龙
有机化学 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:喹啉酮及其衍生物是一类非常重要的含氮杂环类化合物,其骨架结构广泛存在于天然产物或者药物活性分子中。其中,2-喹啉酮类化合物因为其优异的生物活性、药理活性以及在临床药品中的应用而受到广泛关注。自从1962年第一个喹啉酮类抗菌药物萘啶酸被研发并应用之后,以2-喹啉酮为先导化合物的药物的研发一直是化学家们关注的热点。
  通过文献调研,开发出了一条可见光诱导的脱羧偶联/分子内环合反应的一锅法合成4-芳基-2-喹啉酮类化合物的工艺路线:首先,采用斯克劳普合成法由芳胺为起始原料得到喹啉类化合物,经过还原和酰化反应得到N-乙酰基-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物;同时以苯乙酮类化合物为起始原料,经过氧化反应得到苯甲酰甲酸类化合物;最后,以苯甲酰甲酸类化合物为酰化试剂与N-乙酰基-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物经可见光诱导的脱羧偶联/分子内环合反应实现了一锅法获得目标产物4-芳基-2-喹啉酮类化合物。利用优化的反应工艺路线共合成出22个4-芳基-2-喹啉酮类化合物,并使用高分辨质谱、红外光谱、1H-NMR和13C-NMR等手段对所合成的目标产物的化学结构进行了表征与确认。
  对反应的机理进行了推测与相关实验验证,成功对反应自由基中间体进行了捕获并进行了结构表征,证明了该反应为自由基反应机制。
  最后,为了验证所设计路线的应用性,运用该方法成功合成了一种乙肝病毒抑制剂HBV inhibitor。
[硕士论文] 芮佳佳
化学工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:针对当前常用农药剂型和蛋白质药物存在持效性低、不稳定易损失等问题,本论文研究分别采用改进的溶剂提取法和复乳的溶剂蒸发法制备吡唑醚菌酯混合剂型和牛血清蛋白微胶囊(BSA-MS),并对产品进行了一系列表征。同时,采用通过对乳液溶剂蒸发法的改进实现产品颗粒形貌调控。本论文研究结果表明:
  1.以吡唑醚菌酯为芯材,以聚己内酯为壁材,以丙酮为溶剂,以水为抗溶剂,以聚乙烯醇为表面活性剂,利用溶剂提取法可“一步”制备吡唑醚菌酯微胶囊剂和悬浮剂的混合剂型。对产品包载药率、释放性能、稳定性、粒径分布以及形貌进行了表征并考察了芯壁比、温度等工艺参数对产品包载药率和释放性能的影响。混合剂型的稳定性和缓释性能良好,持效期可以延长12d以上。
  2.采用单因素法考察了均质搅拌速率、蒸发温度、油相溶剂种类等因素对O/W乳液溶剂蒸发法产品高分子颗粒形貌的影响。当采用单一疏水性溶剂作为油相溶剂时,通过改变溶剂的蒸发速率和高分子链的活动性从而调节产品颗粒形貌:表面光滑的球状实心颗粒、疏松的球状颗粒和碗状颗粒等。当使用混合溶剂作为油相溶剂时,(Ⅰ)若使用的是两种疏水性溶剂,其情况与单一疏水性溶剂类似;(Ⅱ)如果使用的是一种疏水性溶剂和另一种亲水性溶剂时,(A)亲水性溶剂添加量较小时,分散相液滴中高分子浓度仍远未达到相分离浓度,与上述的(1)类似。(B)亲水性溶剂添加量较大时,若发生液-液相分离并接近液-固相分离点,产品为较短的微米纤维。(C)若已经发生液-固相分离,配合溶剂蒸发温度的提高将促进碗状颗粒的生成。
  3.以牛血清蛋白(BSA)作为芯材,以聚乳酸(PLA)为壁材,采用W1/O/W2复乳的溶剂蒸发法制备了BSA-MS并考察了W1/O质量比、O/W2质量比以及BSA的浓度等因素对包药率和载药率的影响。在本研究范围内中:W1/O质量比为1/5、O/W2质量比为1/6、BSA的浓度为1wt%、PLA的浓度为3wt%以及PVA浓度为3wt%时包药率与载药率最高。在该条件下制备了BSA-MS,并对其行粒径分布、产品颗粒形貌以及体外释放等局限性了表征。在PBS缓冲溶液中,BSA-MS体外释放缓释周期为180h以上,且其释放行为更符合一级体外释放模型拟合结果。
[硕士论文] 房华
机械工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:枕包水针自动装托设备是将枕式包装的水针制剂自动装入到托盘的一种设备。目前药品包装行业对该设备的需求极为迫切,但是由于水针自动装托技术还不够成熟,在装托过程中会出现缺针或入托错乱不到位等问题,使得该设备的入托成功率仅为77%,导致水针自动装托技术迟迟得不到广泛应用。因此,迫切需要提高该设备的入托成功率并使之适应枕包水针自动化包装生产线。
  鉴于此,本文对目前枕包水针自动装托设备的工艺特点进行了分析研究,并综合目前先进的真空技术和机器人技术对枕包水针自动装托设备的真空吸持机构进行了分析与改进。分析显示造成设备入托成功率过低的原因有两个:一是吸盘不能有效吸附枕包;二是SCARA机器人转运枕包时运行不够平稳。针对这两个方面的问题本论文在如下三个方面进行了分析与改进:首先通过分析真空吸盘在拾取时的受力状况,根据给定的工艺条件和实际工况参数,对真空吸盘的类型、尺寸进行了选型及设计,并结合实际问题优化选择了更容易与折皱枕包形成密闭空间的硅橡胶50°ShoreA作为真空吸盘的材料。实验结果显示选用φ8硅橡胶50°ShoreA吸盘后该设备的入托成功率达到97.58%;然后建立了水针装托SCARA机器人运动学模型和误差模型,对影响SCARA机器人运动平稳性及精度的各运动参数误差进行分析,验证了机器人运行的平稳性,排除机器人自身因素对枕包水针入托质量的影响,并对误差项显著性结果进行了仿真。仿真结果显示SCARA机器人1、2、3、4关节对机器人总体运行误差的影响依次减弱,这为后续机器人运动的程序优化提供了有力参考;最后结合传统机器人轨迹运行中经常采用的梯形曲线和正弦函数曲线对枕包入托过程的运行曲线进行优化,并通过实验验证了该工作的可行性。
  在采用φ8硅橡胶50°ShoreA吸盘的基础上对枕包入托过程的运行曲线进行优化后,枕包水针自动装托设备的入托成功率达到99.35%。设备以此状态运行,大大降低了该设备生产过程中人员的干预频率,满足了设备的高效化、连续化的生产要求。
[硕士论文] 扈长青
制药工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:消旋卡多曲是一种脑啡肽酶抑制剂,主要用于治疗成人及儿童腹泻。被加拿大儿科协会和美国疾病预防中心列入儿童腹泻治疗的必备用药,我国于2011年将其列为中国国家儿科腹泻病治疗共识的推荐用药。以往,由于消旋卡多曲合成所用中间体2-[(乙酰硫)甲基]-3-苯基丙酸、甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐的供应及质量不稳定,药品生产企业多采用自己合成的工艺路线,工艺路线较长,所用有毒有害溶剂较多,不利于操作人员职业卫生安全及环境安全。目前,安全、环保压力日趋严峻,国家陆续对危化品生产、使用企业进行整合,许多药品生产企业不再自己合成2-[(乙酰硫)甲基]-3-苯基丙酸、甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐等化学中间体。同时,目前该中间体的供应、质量、价格都已趋于稳定。因此,直接采用市售中间体,对中间体及产品工艺开展质量研究,进而缩短合成路线,是消旋卡多曲原料药产业发展的必经之路。
  新工艺缩短了工艺路线,在参考专利CN101768095A的基础上,选用酰氯缩合法替代DCC缩合法,能够有效的避开DCU等副产物的产生。新工艺以2[(乙酰硫)甲基]-3-苯基丙酸为起始原料,经酰氯化反应生成2-[(乙酰硫)甲基]-3-苯基丙酰氯,再以四氢呋喃、水为溶剂,碳酸氢钠为缚酸剂,与甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐经缩合反应生成消旋卡多曲,最后精制得成品。中间体供应商的合成工艺路线与公司原工艺路线相同,降低了引入不同杂质的风险。对起始原料内控标准中的纯度和有关物质也做了进一步限定。
  为提高产品质量及参数可行性,对合成及精制工艺参数进行了筛选和优化。酰化反应中对二氯甲烷、甲苯两种溶剂进行了比较,对草酰氯、氯化亚砜两种酰化剂进行了比较,并对反应温度进行了优化;缩合反应中对反应温度、粗品析晶溶剂进行了筛选;精制过程中对析晶溶剂、析晶温度进行了筛选。按照小试确认的工艺参数进行了重现性实验,并对实验样品进行了结构确证。
  根据小试确定的工艺参数在车间进行了消旋卡多曲中试、放大,2-[(乙酰硫)甲基]-3-苯基丙酸投料量分别为4.00kg、30.0kg。中试放大过程,工艺参数重现性及稳定性较好,具有较强的可行性。所得产品经检测各指标均符合拟定的质量标准。生产过程进一步确认了新工艺切实避免了污染及危害严重的操作步骤,生产操作更简洁可控,VOC更易于有组织收集处理,避免了对环境和人体的伤害。
  为实现产品质量与国际质量标准接轨,对注册批准的消旋卡多曲原料药生产工艺和质量标准进行了研究。根据《化学药物原料药制备研究技术指导原则》以及《已上市化学药品变更研究的技术指导原则(一)》,并参考欧洲药典(EP7.0)和英国药典(2013版)的相关标准,拟定了新的质量标准。
[硕士论文] 范剑
制药工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:干姜和桂枝为传统常用药对。干姜含有挥发油、姜酚等化学成分,是药食兼用的常用中药,其醚提物和水提物具有明显的镇痛作用;桂枝主要含肉桂酸和桂皮醛,具有明显的解热、镇静、平喘、抗过敏等作用。中医桂枝-干姜药对在中药复方中配伍应用广泛,如黄连汤、小青龙汤、柴胡桂枝干姜汤等张仲景《伤寒论》所载方剂中均出现桂枝-干姜药对配伍。桂枝辛温散寒,宣通经络,其性走散;干姜辛热可散里寒,其性守尔不走。桂枝伍干姜具有温脏驱寒,走守兼备,表里同治之功效。现代药学研究表明,桂枝、干姜均含有大量挥发油且为两药主要药效成分。在中药新药参枝苓口服液生产中,干姜桂枝作为药对混合蒸馏提取;随着2016年《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》发布,未来中药配方颗粒限制将逐步放开。配方颗粒使用量将大大增加。相对于单味药材提取的配方颗粒,经典药方或药对形式的配方颗粒,因其更加贴近中医用药理论,将来会受到越来越多的重视。进行干姜和桂枝混合蒸馏提取过程的研究,也可为经典药对配方颗粒的开发提供一定的技术支持。
  过程分析技术(PAT),是对原材料和生产过程中材料的关键质量和性能参数进行实时监控,来设计、分析、控制生产过程,保证产品质量稳定均一,是提高生产效率的有效方法。近红外光谱分析技术(Near-infrared Spectroscopy,NIRS)是一种适合于快速、在线分析的绿色PAT技术,已在中药领域的定性、定量分析、在线检测和过程控制分析中获得广泛应用研究。本文以干姜和桂枝混合蒸馏提取过程为研究对象,利用NIRS和化学计量学方法对干姜药材中6-姜酚和水分含量;桂枝中桂皮醛、水分、浸出物含量;蒸馏提取过程中桂皮醛、水溶性物质含量等关键点的快速检测技术进行了研究。为近红外光谱法应用于干姜、桂枝混合蒸馏提取过程的在线质量控制奠定了理论基础。
  具体研究内容及其结果有以下几个方面:
  1.NIRS用于干姜药材中6-姜酚和水分含量快速检测方法研究
  采用AntarisⅡ傅立叶变换近红外光谱仪漫反射模块采集97批干姜样品近红外光谱,以甲苯法和超高效液相色谱法(UHPLC),分别测定样品中水分和6-姜酚含量,作为参考值,结合偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)算法分别建立水分和6-姜酚含量的快速定量模型。水分最佳PLS模型参数为R2c=0.9935,R2p=0.9764,RMSEC=0.0809,RMSEP=0.207;6-姜酚最佳PLS模型参数为R2c=0.9902,R2p=0.9758,RMSEC=0.0174,RMSEP=0.0284。模型线性良好,误差较小。
  2.NIRS用于桂枝中桂皮醛、水分、浸出物含量快速检测方法研究
  采用AntarisⅡ傅立叶变换近红外光谱仪漫反射模块采集85批桂枝样品近红外光谱,以甲苯法、超高效液相色谱法(UHPLC)和浸出物测定法,分别测定样品中水分、桂皮醛和浸出物含量,作为参考值,结合偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)算法分别建立水分、桂皮醛和浸出物含量的快速定量模型。水分最佳PLS模型参数为R2c=0.964,R2p=0.962,RMSEC=0.14419,RMSEP=0.13736;桂皮醛最佳PLS模型参数为R2c=0.9855,R2p=0.9601,RMSEC=0.0427,RMSEP=0.0487。浸出物含量最佳PLS模型参数为R2c=0.967,R2p=0.900,RMSEC=0.22104,RMSEP=0.3763。模型线性良好,误差较小。
  3.桂枝和干姜混合蒸馏提取过程NIRS的研究
  研究选取干姜和桂枝混合蒸馏提取过程中蒸馏液和水提液为研究对象。收集蒸馏液和水提取液。采用AntarisⅡ傅立叶变换近红外光谱仪透射模块采集近红外光谱。测定蒸馏液中挥发性物质代表性成分桂皮醛含量,结合偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)算法建立蒸馏液中桂皮醛的快速定量模型。桂皮醛最佳PLS模型参数为:R2c=0.9788,R2p=0.9623,RMSEC=0.0472,RMSEP=0.0658。对采集水提液近红外图谱,利用自适应移动窗口标准差(Adaptive moving window standard deviation,AMWSD)判断光谱的相异性,得出与目标成分相关的趋势模型。
[硕士论文] 刘秀萍
制药工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:眼睛干燥症,又被称作“干眼症”,这是由于多种多样原因导致的眼部干燥不适,疾病的常见表现为眼表面和泪膜水分不正常,眼睛感觉到干燥、疼痛,情况严重的患者,疼痛甚至会波及到眼周及头部。近年来,干眼症是眼科临床上的多发病,但目前并没有有效的方法治愈。自1908年以来,人们开始采用人工泪液治疗。在七十年代之后,人工泪液开始在临床上被使用,人工泪液是由与粘蛋白性质相似的一些聚合物制成的,可以用来增加水分在眼表面的润湿时间。目前临床上常用各种泪液替代品增加泪液的总量并改善流动性,以减少角膜和结膜干燥面之间的磨擦,缓解干燥症状,增加人眼的舒适性。目前使用的人工泪液,水分停留在眼表面的时间短,发挥保湿作用的时间短,使用次数频繁,保湿效果不明显。凝胶眼用制剂与人工泪液相比,流动性差,故其在眼球表面可长时间停留,所以它成为目前眼用制剂的研究热点。
  透明质酸作为酸性粘多糖的一种,大部分来源于生物发酵,由于其拥有的分子结构比较特殊,使用时能展现出特别的理化性质,在应用过程中可显示出多种重要的生理作用,其中,特殊的保水作用是它比较重要的一种功能,是人们到目前为止能够寻找到的、来自天然的、保湿性最好的材料其中之一,它被看作是理想的天然保湿因子。一定浓度的透明质酸眼用凝胶有很好的保湿效果,使用过程中凝胶在眼中附着力强,滞留时间长,可以延长保湿时间,减少使用次数,并且无明显的副作用,安全性好。
  凝胶制剂的生产过程,由于物料的性状比较粘稠,含量、pH等质量属性很难达到均一。凝胶制剂中,透明质酸钠的含量测定方法比较复杂。本课题以透明质酸钠为主要保湿润滑成分,结合卡波姆940特殊的粘弹性及润滑性,制备一种眼用凝胶,并对处方的合理性进行验证。质量研究过程引入近红外光谱分析技术,样品的近红外图谱分别与凝胶中透明质酸钠含量和pH、相对黏度相关联,快速监测样品质量研究的关键参数。经过实验研究证明,制备的眼用凝胶一定时期内有效稳定,近红外光谱技术用于眼用凝胶中透明质酸钠含量的测定,建立的PLS定量分析模型参数为:Rc=0.9851,Rp=0.9374,RMSEC=0.405,RMSEP=0.621。近红外光谱分析技术用于凝胶样品的pH预测,建立的PLS分析模型参数为:Rc=0.9847,Rp=0.9930,RMSEC=0.227,RMSEP=0.176。
[硕士论文] 曲艺
药理学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:肥胖及其相关的代谢疾病已经引起人们的广泛关注。脂肪组织过多是肥胖的主要特点之一,已有研究表明,脂肪组织不仅是能量储存器官,还是一个活跃的内分泌器官。脂肪组织可产生和分泌多种脂肪因子,通过脂肪因子影响机体的代谢、胰岛素敏感性、心脑血管稳态、免疫系统、炎症等。因此,围绕脂肪因子开展一系列研究,对疾病的预防及治疗具有重要的意义。
  2008年,课题组发现一种新的脂肪因子Metrnl。Metrnl在皮下脂肪高表达,又被称为Subfatin。迄今为止,关于Metrnl功能的研究非常有限。据报道,Metrnl可促进白色脂肪棕色化、轴突生长、软骨细胞分化,以及增加胰岛素敏感性等。但是在进一步研究中,本课题组发现Metrnl缺乏相应的抗体工具,严重限制了对其开展深入研究。抗体用途广泛,在多种检测方法中不可或缺,如Western blot、ELISA、免疫组化、免疫共沉淀等。因此,本课题拟使用杂交瘤技术制备小鼠Metrnl单克隆抗体,进而通过初步的筛选鉴定,以期筛选出可用于后续Metrnl研究的小鼠单克隆抗体。
  实验方法
  1.小鼠Metrnl单克隆抗体的制备
  (1)设计小鼠Metrnl多肽抗原表位,合成后将其与载体蛋白偶联,以SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色检测多肽抗原的偶联情况。
  (2)将小鼠Metrnl基因与改造的pET-28a载体偶联,原核表达后,使用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色检测表达的蛋白;Western blot方法检测蛋白携带的His标签。
  (3)以多肽和小鼠全长蛋白为抗原免疫小鼠,免疫结束后一周取血,使用ELISA方法检测血清效价。选取效价较高的小鼠,取其脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,在HAT培养基上筛选杂交瘤细胞,随后进行两次亚克隆。选取状态良好的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔内,收集腹水进行纯化。
  2.Metrnl全敲小鼠的培育及基因鉴定
  (1)使用MetrnlloxP/loxP小鼠和Ella-Cre小鼠杂交得到带有Ella-Cre基因的Metrnl杂合子小鼠(Metrnl+/-;Ella-Cre)。为去掉Ella-Cre基因,将Metrnl+/-;Ella-Cre小鼠与C57小鼠杂交,得到Metrnl杂合子小鼠(Metrnl+/-)。最后将Metrnl+/-小鼠自交,即可得到Metrnl-/-全敲小鼠及野生对照小鼠。使用PCR方法鉴定子代基因型。
  (2)使用Real-time PCR方法检测Metrnl全敲小鼠mRNA表达。
  (3)使用ELISA方法检测Metrnl全敲小鼠血清中Metrnl蛋白浓度。
  3.小鼠Metrnl单克隆抗体的鉴定和应用
  (1)使用Western blot方法以重组蛋白,C57结肠组织蛋白,WT、KO结肠组织蛋白对单克隆抗体进行鉴定。
  (2)将不同有效的单克隆抗体应用于免疫组化、免疫共沉淀检测。
  实验结果
  1.本课题共设计了14条多肽抗原序列,合成后将其与载体蛋白偶联,经检测其中一个偶联失败,其它均偶联成功。本课题又重新改造设计了一条多肽抗原并检测成功。
  2.小鼠Metrnl重组蛋白表达成功,且蛋白中含有His标签。
  3.根据ELISA检测免疫后小鼠血清效价的结果,选取效价较大的小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。在以小鼠Metrnl多肽抗原制备抗体的过程中选出56株阳性杂交瘤细胞,在以小鼠Metrnl蛋白制备抗体的过程中选出25株阳性杂交瘤细胞,共筛选出81株阳性杂交瘤细胞。
  4.以小鼠Metrnl全长重组蛋白鉴定所有腹水抗体。实验未能从56株Metrnl多肽抗原制备的抗体中筛选出有效抗体;由小鼠Metrnl全长蛋白制备的25株抗体中,有12株单克隆抗体可识别Metrnl重组蛋白。
  5.在C57小鼠各组织Metrnl mRNA表达检测中,结肠表达最高。
  6.本课题成功构建了Metrnl全身敲除小鼠,并在组织表达、血液水平上进行了验证。
  7.以小鼠结肠组织蛋白为样品鉴定12株识别重组蛋白的抗体,结果显示抗体并不适用于组织样品Western blot检测。
  8.将12株识别重组蛋白的抗体应用于免疫组化、免疫共沉淀检测,结果显示有不同的有效抗体。
  综上所述,本课题分别利用小鼠Metrnl多肽片段和全长重组蛋白免疫小鼠,共获得81株单克隆抗体,其中,由Metrnl全长蛋白制备的25株抗体中,有12株单克隆抗体可在Western blot检测中识别小鼠Metrnl重组蛋白,这些抗体有望在今后有关Metrnl的研究中发挥作用。在抗体的验证过程中,本课题成功构建了Metrnl全身敲除小鼠,可用于后续Metrnl功能研究。在12株能检测重组蛋白的单克隆抗体中,又进一步筛选出不同的抗体可应用于免疫组化、免疫共沉淀检测。
[硕士论文] 刘明霞
制药工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:依维莫司是雷帕霉素衍生物,是新一代的mTOR抑制剂PI3K/AKT通路,它是一种丝氨酸/苏氨酸。该药物最先由诺华研制,2003年首次在瑞典上市用来预防肾移植和心脏移植手术后的排斥反应。2009年3月在美国上市依维莫司片治疗晚期肾癌,在舒尼替尼或索拉非尼治疗无效情况下使用。依维莫司可以减缓肾癌细胞的生长,降低67%的死亡率,通过抑制肿瘤细胞的生长和增殖,直接作用于肿瘤细胞;通过作用于血管起到抑制作用减少肿瘤血管生成。
  通过查阅FDA及EMEA的相关资料可知,原研公司上市的依维莫司片现有2.5mg、5mg、10mg三个规格,但现有技术制备过程中存在残留溶剂及稳定性的问题,本论文以克服现有技术缺陷为出发点,研究依维莫司2.5mg和10mg的处方工艺,创新点在于采用羟丙基纤维素代替羟丙甲纤维素制备固体分散体,然后再与其它辅料混合、筛分、压片。并通过对依维莫司片处方的筛选、溶出曲线的研究及处方的确定,稳定性考察及工艺参数的初步验证,同时评价方法采用f2因子是评价依维莫司与原研对照品的溶出行为,研究表明,溶出行为相似。
  本文对依维莫司片分别进行了质量研究和稳定性研究,是为了更好控制产品质量,提高产品质量。从依维莫司片的性状、鉴别、检查(水分、含量均匀度、溶出度、有关物质、异构体等)测定进行研究,验证溶出度、有关物质和含量,该方法适合用于本产品的处方和制备工艺。结果表明,该方法专属性强、测定结果准确、精密度高、线性范围符合含量测定的要求,符合中国药典2015版的规定,样品与有关物质能够达到完全分离效果。依维莫司峰与其异构体峰及经强制破坏后的降解产物峰均能有效分离,峰纯度符合规定,且检测的有关物质远低于药典标准要求,本法可作为依维莫司片的检查方法。
  分别从本品的影响因素试验、加速试验、长期稳定性试验三个方面给予了稳定性考察。结果表明,经高温(60℃)、光照(4500Lx)、高湿(75%±5%及92.5%±5%)的强烈条件处理后,其中60℃高温、高湿有关物质明显增加,光照条件、加速实验符合《中国药典》规定,表明依维莫司片对热及湿度较为敏感,应注意防潮,在常温处保存。
  本文的研究结果为填补国内空白,将来实现产业化,提供了相应的理论依据。
[博士论文] 郭玉川
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:糖基转移酶在自然界广泛存在,具有重要的生物学功能,参与生物体寡糖、多糖、糖脂、糖蛋白和各类糖昔的生物合成。糖基转移酶以活化的糖苷如尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)、鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-Man)、磷酸胞苷唾液酸(CMP-Sia)等为糖基供体,受体可以是糖类、脂类、蛋白质、抗生素和核酸等,可催化产生α和β两种不同的糖苷键。糖基转移酶遵循“一种酶,一种键”的原则,具有良好的立体选择性和区域选择性,反应效率高,能高效的合成特定糖苷键,在糖链合成中得到广泛应用。
  分枝硫醇(mycothiol,MSH)是仅在放线菌中发现的低分子硫醇,而在低(G+C)%革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及真核生物中没有发现MSH的存在。与谷胱甘肽功能相同,MSH在细菌抵抗氧化压力和异源物质的脱毒过程中起到重要的作用。分枝杆菌是放线菌中MSH含量最高的一类菌,其MSH代谢过程被广泛研究。MSH-缺失的突变体表现出对氧化压力、烷基试剂、以及一系列抗生素的敏感性,说明MSH在分枝杆菌存活和致病性中起到重要作用,而对结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis Erdman的MSH合成途径进行破坏,没有细菌能够存活,说明MSH为M.tuberculosis Erdman生存所必须。另外通过提高细胞内MSH的含量,能有效提高谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum对烷基试剂、草甘膦、肌醇、抗生素、重金属和芳香类化合物的抵抗力。因此MSH生物合成途径是一个开发新型抗菌药物或能提高现行抗生素效能试剂的靶点。
  MSH的生物合成包括五步酶催化反应,分别由1L-myo-inositol-1-phosphate N-乙酰氨基葡萄糖转移酶MshA、磷酸酶MshA2、乙酰氨基葡萄糖脱乙酰化酶MshB、ATP-依赖连接酶MshC和乙酰基转移酶MshD实现。目前,除了MshA2尚未被鉴定以外,其它四个酶已有晶体结构的报道。糖基转移酶MshA起始MSH的生物合成,介导将UDP-GlcNAc的α-GlcNAc单元转移至1L-myo-inositol-1-phosphate(1L-Ins-1-P)上形成GlcNAc-Ins-3-P。目前,仅有C.glutamicum来源的MshA被克隆表达,而有关MshA的许多生化性质尚未被研究。因此,对MshA以及MSH生物合成中其它相关酶的研究具有重要意义。
  本论文首先对来源于病原菌C.diphtheriae的mshA基因进行克隆与表达。将mshA基因与pET-22b载体连接转化表达宿主E.coli BL21(DE3),构建基因工程菌用于重组酶的诱导表达。经口IPTG诱导和Ni-亲和色谱纯化,获得均一的可溶性蛋白,分子量约为50kDa。以UDP-GlcNAc和1L-Ins-1-P为底物并应用HPLC分析对CdMshA进行酶学性质研究发现,CdMshA的最适温度是40℃,在20-50℃范围内酶活稳定;最适pH为8.0,在pH7-10范围内保持80%以上的活性。CdMshA的催化不需要金属离子的参与,而部分金属离子如Mg2+、Ca2+和K+能稍微增强酶的活性。CdMshA具有严格的底物选择性,只能催化UDP-GlcNAc和1L-Ins-1-P间的反应,不能识别其它UDP-糖苷如UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GalNAc、UDP-GlcA以及糖基受体受体如myo-肌醇、1D-myo-1-phosphate(1D-Ins-1-P)、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、半乳糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸等。CdMshA对糖基供体UDP-GlcNAc的米氏常数Km为0.185±0.047mM,Kcat为5.184±0.442Min-1,对糖基受体1L-Ins-1-P的Km和Kcat分别为0.485±0.049mM和6.907±0.347Min-1。CdMshA对UDP-GlcNAc的Km与文献报道其他来源的MshA相符,而对1L-Ins-1-P的Km是文献报道的其它来源MshA的两倍左右,说明CdMshA对1L-Ins-1-P有较低的亲和性。随后利用Q-柱对CdMshA转糖基产物进行分离纯化,并用质谱和NMR对其结构进行鉴定,其中GlcNAc异头碳位置质子的耦合常数JH1-2为3.6Hz,说明糖苷键构型为α-构型,最终转糖基产物为GlcNAc-α1,1-D-myo-inositol-3-phosphate,产率为95%。
  根据谷氨酸棒状杆菌CgMshA的晶体结构、CdMshA同源模建和多序列比对推测出D23、M27、N28、K81、Y113、T137和R157等7个与1L-Ins-1-P结合相关氨基酸位点。这些位点分别突变成丙氨酸并对突变体蛋白纯化,以UDP-GlcNAc和1L-Ins-1-P为底物在最优反应条件进行下进行转糖基反应,结果显示与原始酶相比,N28A、K81A和R157A突变体几乎完全失去了转糖基能力,T137A保留有30%的活性,而D23A、M27A和Y113A突变体酶活性只有稍微降低。K81/R157和N28分别与1L-Ins-1-P的磷酸基和4-OH间形成氢键,这些能使1L-Ins-1-P在CdMshA活性中心中保持适当的定向,并促使1L-Ins-1-P的3-OH与UDP-GlcNAc的焦磷酸基接近。T137也能与1L-Ins-1-P的磷酸基形成氢键,同时与M27和Y113一起形成一个口袋,它能安置1L-Ins-1-P轴向的2-OH并限制其自由度以促进反应进行。突变实验结果说明N28、K81、R157和T137是CdMshA关键氨基酸位点。
  目前尚未有MshA2酶的报道,为筛选具有MshA2活性的磷酸酶,本论文根据文献报道,M.tuberrculosis来源的肌醇单磷酸酶Rv3137可能参与MSH生物合成。我们在C.glutamicum中以Rv3137氨基酸序列为起点进行BLAST,筛选到四个同源序列,GenBank登录号分别为WP_011013898.1、WP_003861968.1、WP_011265625.1和WP_003862394.1,指定为ImpA、ImpB、ImpC、ImpD,基因大小分别为783bp、828bp、876bp和759bp,分别编码28.9、30.2、31.9和27.3kDa蛋白。将这些磷酸酶基因经载体连接转化到表达宿主E.coli BL21(DE3),构建成工程菌用于重组蛋白的表达。经过亲和色谱纯化后,四个蛋白都获得纯度高的蛋白,其中ImpA、ImpB和ImpC含有His-标签,ImpD在以His-标签表达时为包涵体,后改成GST-标签。在Tris-HC1缓冲液以CdMshA转苷产物GlcNAc-Ins-3-P为底物对四个磷酸酶进行活性筛选,发现ImpC酶对GlcNAc-Ins-3-P有很好的水解活性,而ImpA酶对检测底物活性很差,ImpB和GST-ImpD没有水解活性。对ImpA进行底物选择性分析确认ImpA具有果糖1,6-二磷酸酶活性和1D-Ins-1-P肌醇单磷酸酶活性,对1L-Ins-1-P及其衍生物GlcNAc-Ins-3-P活性很差。ImpC具有MshA2酶活性,为首次发现,因此后续实验围绕磷酸酶ImpC展开。
  进一步对磷酸酶ImpC研究表明,ImpC在酸性条件下没有活性,在pH7~9的范围内活性较高,最适pH为8.0,在pH大于10时,酶活性显著降低。ImpC在20~50℃催化比较稳定,最适温度在40℃,高于55℃活性降低明显。Mg2+是ImpC催化所必需的,不加入Mg2+时ImpC反应中没有无机磷酸的产生,在5mM Mg2+的条件下ImpC具有最大活性,继续增加Mg2+浓度对ImpC活性有一定的抑制,在100mM Mg2+条件下ImpC保持70%的活性。其它二价金属离子在5mM浓度时能部分替代Mg2+的功能,如Zn2+、Mn2+和Co2+存在时ImpC有80%以上的活性,Ni2+的作用稍差,约有50%的活性,而Ca2+、Cu2+和Fe2+对ImpC的催化几乎没有作用。Li+是ImpC的抑制剂,IC50为2.0mM,当Li+达到20mM浓度时ImpC仅有10%的活性,而其它单价金属离子如高浓度的Na+和K+对ImpC活性影响不大。ImpC具有广泛的底物选择性,能水解多种磷酸化合物,包括GlcNAc-Ins-3-P、1L-Ins-1-P、葡萄糖-1-磷酸、1D-Ins-1-P、果糖-1,6-二磷酸、甘油磷酸和对硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate,pNPP),其中GlcNAc-Ins-3-P、1L-Ins-1-P和葡萄糖-1-磷酸为优势底物。ImpC对1D-Ins-1-P的水解活性为GlcNAc-Ins-3-P的35%,为1L-Ins-1-P的25%,说明ImpC对肌醇单磷酸的构型存在选择性。ImpC对GlcNAc-Ins-3-P的米氏常数Km值为1.29±0.52mM,Kcat为37.11±4.66s-1。水解产物正离子模式下有荷质比为406.82的[M+Na]+的离子峰,与GlcNAc-Ins(383.14,[M+Na]+406.13)的分子量相符。通过多序列比对选取了三个位点D62、L96和D117进行定点突变,分别突变为D62N、L96A和D117N,并对突变体蛋白分离纯化。以GlcNAc-Ins-3-P为底物进行反应,结果显示L96A和D117N突变体完全失去了水解活性,说明L96和D117为ImpC关键氨基酸位点。
  肽连接酶是一类能在特定氨基酸位点形成肽键的酶类,具有底物选择性和位点特异性,是蛋白工程的理想工具。Butelase1(Btl1)是一种近来从蝶豆Clitoria ternatea中发现的连接酶,它只需要一个非常简单的C-端结构域Asn/Asp-His-Val进行特异识别,且催化效率非常高(1340000M-1s-1),反应条件温和,具有广泛的底物选择性,在连接反应中能接受大部分N-末端的氨基酸(除了Pro),且反应结束后酶的识别序列仅有Asn/Asp残留。Butelase1以简单的底物识别信号、高效的反应效率、广泛的底物选择性等优点,被应用于蛋白和多肽的N-端特异性标记、蛋白的环化、环化细菌素的全合成、硫酯蛋白的合成、含D-氨基酸的多肽的大环化等等。Btl1的纯化是通过传统复杂的蛋白纯化方法从植物的新鲜豆荚中提取,每千克材料大约能提取出5mg的纯化蛋白,极大限制了其在蛋白工程中的应用。因此对Btl1进行异源表达具有重要的研究意义和应用价值。在本研究中,我们成功构建了Btl1大肠杆菌和毕赤酵母两种表达体系。在大肠杆菌表达体系中,btl1与不同的载体连接构建成表达质粒,包括pET-28b-btl1、pET-32EK/LIC-btl1、pET-41EK/LIC-btl1和pMAL-c5E-btl1等,并将pET系列表达质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta2pLysS表达菌株,pMAL-c5E-btl1转化E.coli BL21(DE3),经蛋白表达和纯化发现转化pET-28b-btl1的表达菌株中没有重组蛋白表达,pET-32EK/LIC-btl1和pET-41EK/LIC-btl1仅在E.coli rosetta2pLysS表达菌株中有蛋白表达而且表达的蛋白是以包涵体形式,pMAL-c5E-btl1在E.coli BL21(DE3)中能以可溶蛋白形式表达和纯化出来。在Btl1毕赤酵母蛋白表达体系中,我们构建了胞内表达和分泌表达两个表达载体pPICZ-B-btl1和pPICZ-αC-btl1,转化Pichia postoris KM71H菌株,经甲醇诱导表达后均获得可溶蛋白。以合成的多肽KALVINHV和GIGGIR为底物对重组蛋白活性进行检测,不幸的是没有检测到目标产物(KALVINGIGGIR),重组蛋白未检测到催化活性。以上结果说明通过蛋白重组的方法获得的可溶性重组Btl1的折叠构象与其天然构象存在差异。
[硕士论文] 李楠
制药工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:乙型病毒性肝炎是严重威胁人类健康的世界性疾病,也是我国当前最为广泛流行、危害性最严重的一种疾病。目前在中国上市的、最流行的核苷类抗乙肝药物只有四种:拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定和恩替卡韦。依据疗效及耐药性结果,恩替卡韦(Entecavir)是目前国内上市的抗乙肝的最佳药物。国内外目前上市的恩替卡韦制物制剂具有以下缺陷:(1)食物对该药有一定的影响,为了最佳疗效,需要空腹服用,故有患者依从性问题;(2)恩替卡韦属于生物药剂学分类系统的第三类药物(高溶解度,低渗透率),低渗透率限制了其生物利用度。因此,本课题所要开发的新型恩替卡韦药物制剂通过提高恩替卡韦的渗透率,克服食物影响,将有更高患者依从性以及更低的毒副作用。
  本实验恩替卡韦新型片剂的主要研发内容由以下三个部分组成:
  1、新型恩替卡韦制剂的配伍及中试工艺研究
  首先开展了对前期所筛选的渗透增强剂Pluronic P85和Labrasol与恩替卡韦及其它制剂辅料进行双组份和包括初始制剂配方的多组份处方前配伍研究。配伍研究中所用的主要辅料包括稀释剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂等,以确保所选用的辅料对最终片剂的加工成型、外观、稳定性、有效性及安全性等没有不良影响。最后以颗粒休止角、颗粒松密度、片剂硬度、崩解时间和片剂外观为评价指标来确定中试配方和工艺。最终确定的中试制剂配方成分为稀释剂乳糖(16-18%)、微晶纤维素(70%)、聚维酮(3%)、硬脂酸镁(0.5%)、聚维酮K30(5%)、渗透增强剂Labrasol/普郎尼克85(4.5%)。中试放大研究将新型恩替卡韦制剂规模提高到了10000片,并仔细研究了中试生产工艺,生产了三个10000片的批次,中试放大试验结果表明所开发的中试配方和工艺稳定,有利于工业化生产放大。
  2、新型恩替卡韦制剂的药物分析研究
  质量研究和稳定性考察是处方筛选和工艺优化的重要的科学基础。为对本项目研发所得的新型恩替卡韦制剂进行质量研究,我们针对所优化的中试制剂建立了含量测定、稳定性检查及溶出度测定等定性和定量分析方法,并对所采用的分析方法进行了方法学验证,为相应的国内外恩替卡韦制剂最终药品质量标准的制定提供支持。药物分析方法学验证试验对所建立分析方法的专属性、灵敏度、准确度、精密度、回收率、检测限、定量限、耐用性进行了系统的方法学考察,方法学验证结果表明所建立的“恩替卡韦片剂剂量和降解产物测定HPLC方法学”、“恩替卡韦片剂溶出度测定HPLC方法学”达到了国家“化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则”的要求,可以满足新型恩替卡韦片剂质量评价研究的需要。使用新开发的“恩替卡韦片剂剂量和降解产物测定HPLC方法学”、“恩替卡韦片剂溶出度测定HPLC方法学”以及《中国药典》的片剂检测方法学对批次号为3个中试批次140303-1、140303-2、140303-3的恩替卡韦新型片剂进行了分析测定,其批次分析结果表明恩替卡韦新型片剂符合初步建立的质量标准。
  3、新型恩替卡韦制剂的药物代谢动力学研究
  该部分研究建立了测定大鼠血浆中恩替卡韦含量的LC-MS/MS生物分析方法,并对所建立生物分析方法的专属性、灵敏度、准确度和精密度、提取回收率、稳定性进行了系统的方法学考察,方法学验证结果表明所建立的恩替卡韦生物分析方法学达到了国家非临床药代动力学研究技术指导原则中有关生物分析方法学验证的要求,可以满足恩替卡韦在大鼠体内药代学研究的需要。新型恩替卡韦制剂的药物代谢动力学研究将新型恩替卡韦制剂与参比制剂原研药博路定片(己上市恩替卡韦(博路定)片,中美上海施贵宝制药有限工司产品)进行了比较评价,试验结果表明新型恩替卡韦制剂明显优于原研药博路定片,新型恩替卡韦制剂的生物利用度(AUC)比博路定片提高了46.1%,并且将半衰期(t1/2)延长了67.1%。这些数据表明与原研药博路定片不同的是食物没有降低新型恩替卡韦片的生物利用度,因此,新研发的新型恩替卡韦制剂提高了疗效,有效地克服了原研药博路定片的食物影响
  综上所述,本课题通过恩替卡韦渗透增强剂与恩替卡韦的处方前配伍及中试制剂的研究、中试制剂药物分析学评价、恩替卡韦制剂的药代动力学研究等系统中试研究开发,成功地研发出了恩替卡韦新型片剂,所研究的恩替卡韦新型片剂通过提高恩替卡韦的渗透率有效地克服了美国施贵宝制药有限工司产品原研药“博路定片”的食物影响,已经达到本课题的预期目标。
[硕士论文] 王真
制药工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:骨缺损指骨的结构完整性被破坏,是临床常见病。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。临床上粉碎性骨折造成的大段骨缺损一直是外科医生的一大难题,常用的办法是自体骨移植,然而,自体骨移植不仅来源有限,而且会造成取骨区疼痛、出血。近年来,骨组织工程的研究有望解决这一问题,具诱导成骨活性的生物支架材料是骨组织工程中的一大热点。另外,一些成骨生长因子或细胞因子如骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子等加入支架中可以增强骨的修复率。
  骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)属于转化生长因子-β超基因家族,BMP-2是BMP家族中被研究的较早也是研究的最多的一种骨诱导生长因子,具有很强的诱导成骨的作用。研究表明,BMP-2作为骨折初始阶段的启动因子,可以诱导间充质细胞向骨细胞分化,促进成骨细胞分化成熟,参与骨和软骨的生长发育及其重建过程,进而加速骨缺损的修复。然而,作为一种蛋白质类药物,BMP-2亦具有蛋白质类药物普遍表现出的生物稳定性差、半衰期短,进入人体内后快速随体液扩散或者被降解的特性,从而不能在期待部位发挥长效作用,无法达到预期的疗效。所以,如果将BMP-2与合适的载体相结合以制备BMP-2缓释系统,就可以避免由于BMP-2半衰期短所造成的不便,发挥其良好的诱导成骨作用。
  近年来,使用可生物降解聚合物材料运载蛋白质,将蛋白质类药物制成微球的研究引起人们广泛的关注。生物可降解聚合物材料指的是天然或者能够通过人工合成得到的,可以在人体内通过酶解或非酶解作用降解的大分子聚合材料,其降解产物对机体无毒,且能参与机体新陈代谢或者通过正常生理途径排出体外。其中聚乳酸(PLA)由于具有良好的生物相容性、可生物可降解性、无毒性而成为常用的药物载体之一,已得到美国FDA的批准,成功应用于临床骨科及手术缝合线等领域。但因PLA中含有大量的酯键,因而其亲水性较差,为满足运载不同性质药物的要求,对PLA改性就显得尤为重要。最常见的改性方法是向PLA中引入亲水性物质聚乙二醇(PEG),PEG具有优良的生物相容性,其安全性已经得到了美国FDA的认证。PEG的引入能在提高PLA亲水性的同时赋予PLA一些新的特性和功能,它能降低生物体内蛋白质在材料表面的吸附和细胞的黏附,从而避免在体内被免疫系统识别;它还能保护被改性的PLA不受免疫系统的破坏,且形成的两亲性共聚物具有可修饰性,如可引入端基活性基团。
  本课题以BMP-2为模型药物,以可降解多聚物聚乳酸-聚乙二醇两亲性嵌段共聚物(PPLA)作为载体材料,采用复乳溶剂挥发法成功制备了用于治疗骨缺损的BMP-2/PPLA缓释微球,并对所制备的微球进行了一系列的研究,主要包括BMP-2/PPLA微球的处方和工艺研究、BMP-2/PPLA微球的理化性质研究、BMP-2/PPLA微球的体外释药性研究。
  1.BMP-2/PPLA微球的处方和工艺研究
  首先,建立BMP-2/PPLA微球药物含量测定方法,然后,以包封率为评价指标,对微球的处方和工艺因素进行单因素考察,找到对微球包封率影响最主要的四个因素;采用正交实验设计优化处方和工艺;选择合适的方法对BMP-2/PPLA微球进行干燥;最后,进行重现性试验,验证处方组成的合理性以及制备工艺的稳定性。
  结果表明,采用超速离心、考马斯亮蓝UV法测定BMP-2/PPLA微球的包封率和载药量,精密度和回收率均高、重现性好,BMP-2在5.5~49.5μg/mL浓度范围内,吸光度与BMP-2浓度的线性关系良好;通过单因素及正交试验得到最优处方为PVA浓度为4%,PPLA浓度为90mg/mL,内水相、油相体积比为1:5,油相外水相体积比为1∶10。微球重现性结果良好。
  2.BMP-2/PPLA微球的理化性质研究
  根据最优处方制备BMP-2/PPLA微球,通过光学显微镜及超景深显微镜观察其外观形态;通过激光粒度分析仪对所制备的BMP-2/PPLA微球的粒径、粒度分布以及Zeta电位进行研究。
  采用复乳溶剂挥发法制备BMP-2/PPLA微球,该法制备的BMP-2/PPLA微球在光学显微镜和超景深显微镜下观察成圆整的球形,平均粒径为(3.74±0.45)μm,Zeta电位平均值为(-23.27±0.76)mv,包封率为(79.80±0.06)%。
  3.BMP-2/PPLA微球的体外释药性研究
  首先,建立了BMP-2/PPLA微球体外释放度的测定方法并进行了方法学考察;然后,采用动态膜透析法,以pH4.0的醋酸盐缓冲液为释放介质,以BMP-2溶液为对照,测定不同时间点BMP-2/PPLA微球的体外释药情况,绘制释放曲线,考察BMP-2/PPLA微球的体外释药规律。
  结果表明,所建立的BMP-2/PPLA微球含量测定方法,精密度高、准确度高、稳定性好,在0.55~11μg/mL浓度范围内,吸光度与BMP-2浓度的线性关系良好,符合含量测定要求。体外释放试验结果表明,BMP-2原料在释放介质中释放较快,仅需50分钟累积释放百分率就达89.34%;BMP-2/PPLA微球制剂可长期稳定释放,3天的累积释放百分率达40%,第12天累计释放百分率达到85%,缓释效果较好。
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