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[博士论文] 范晓明
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在创面愈合过程中,表皮细胞发挥着关键作用,其功能状态深刻影响着创面愈合的质量。而这其中,表皮细胞的增殖活性是影响创面愈合的重要机制之一。在表皮细胞的增殖过程中,诸多分子及信号通路参与了其增殖活性调控过程,其中链接黏附分子A(Junctional Adhesion Molecule A,JAM-A)近年来逐渐成为研究热点。
  JAM-A是一种跨膜蛋白,属于细胞间粘附分子家族,结构中包含PDZ结构域,同源二聚化后能够与胞内含PDZ结构域的分子结合,发挥信号转导功能。同时,JAM-A本身是粘附分子,与细胞的粘附、迁移功能密切相关,高表达于表皮细胞、内皮细胞、炎症细胞、间充质干细胞等多种细胞的膜表面,参与了上皮细胞屏障形成、调节免疫稳态和炎症、血管新生等过程。
  据最新的研究显示,除了调控细胞粘附、迁移以及信号转导外,JAM-A还能够正向调控肿瘤细胞的增殖活性,在骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、头颈部鳞癌等恶性肿瘤中,JAM-A的表达均显著提高,与癌细胞的增殖、侵袭、趋化等功能呈现出明显的正向相关关系。而我们前期通过预实验发现,干扰JAM-A表达后,表皮细胞增殖速度反而较高表达JAM-A的表皮细胞明显加快。显然,这与JAM-A在上述肿瘤组织中的功能是矛盾的,那JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控到底是正向还是负向?此外,在这些肿瘤研究中,JAM-A表现出来的功能多是由蛋白来发挥的,鲜有学者关注其长达3600bp、内有大量非编码RNA结合位点的3'UTR区域,那JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控是否依然是其蛋白分子发挥主要作用?
  由于microRNA主要通过与靶分子mRNA的3'UTR区结合发挥转录后抑制作用,所以我们猜想,JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控是否也是通过microRNA来实现的?我们通过检索文献发现,miR-21、miR-31、miR-203、miR-205、miR-210等多种microRNA,参与了创面形成后表皮细胞增殖功能的调控。但目前尚无文献报道microRNA通过与JAM-A的3'UTR区结合调控细胞增殖。这提示我们,或许可以挖掘到与JAM-A3'UTR区结合的新的miRNA。
  因此,根据以上JAM-A、microRNA与细胞增殖有关的研究进展,结合我们预实验结果,我们拟从非编码RNA角度切入,在表皮细胞中深入探索JAM-A是否通过microRNA机制发挥与其在肿瘤细胞中相反的调控作用。
  我们拟在确认预实验现象的基础上,进一步通过高通量测序筛选差异表达的非编码RNA,结合生物信息学分析筛选潜在的非编码RNA靶向识别结合的分子,探索JAM-A通过非编码RNA调控下游增殖关键调控分子,进而负向调控表皮细胞增殖功能的新机制。这将有助于更加深刻地理解创面愈合过程,为后续在糖尿病足、压力性溃疡等慢性难愈性创面中探索促愈合机制、寻找潜在的临床治疗靶向药物奠定基础。
  JAM-A影响表皮细胞增殖活性,过表达JAM-A抑制表皮细胞增殖,干扰JAM-A促进表皮细胞增殖
  据课题组前期研究显示,干扰JAM-A表达后表皮细胞增殖速度加快,这与文献报道的并不一致。为了明确JAM-A在表皮细胞中的对增殖活性的影响,我们用慢病毒作为载体,分别构建了过表达JAM-A、干扰JAM-A的人永生化表皮细胞HaCaT,通过CCK-8和ki67实验证明,过表达JAM-A后表皮细胞增殖减慢,干扰JAM-A后表皮细胞增殖加快,与我们预实验结果一致,与文献报道JAM-A在肿瘤细胞中正性调控增殖功能相矛盾。
  JAM-A通过其mRNA的3'UTR区结合miR-221/222cluster调控表皮细胞增殖功能的作用
  既往文献报道,JAM-A在肿瘤细胞的迁移、增殖中发挥作用,往往通过蛋白质-蛋白质相互作用的方式。我们通过PubMed网站Gene数据库,发现JAM-A mRNA的3'UTR区有大量的microRNA结合位点,并从miRNA数据库中预测JAM-A3'UTR区能够结合多条microRNA。因此,我们拟从microRN的角度切入,探索JAM-A调控表皮细胞增殖功能的可能分子机制。为验证科学假设,我们在干扰JAM-A表皮细胞的基础上,分别构建了过表达CDS区、过表达3'UTR区的表皮细胞,通过PCR证明JAM-A调节表皮细胞增殖活性是通过其3'UTR区。接下来,我们设计了Dicer酶敲除实验,进一步证明JAM-A是通过其3'UTR区与microRNA结合的方式来发挥调节表皮细胞增殖的功效。
  基于上述发现,我们将过表达JAM-A、干扰JAM-A的表皮细胞进行RNA-seq高通量测序,结合生物信息学分析和文献检索,依据(1)在过表达组表达量明显下调、(2)在干扰组明显上调、(3)在细胞内基础丰度2000TPM以上、(4)靶点与细胞增殖有关的microRNAs。经过初筛,miR-221和miR-222完美符合上述标准,不仅排名靠前,而且同属一簇。通过RT-PCR,我们验证了干扰JAM-A后miR-221/222表达上调,而过表达JAM-A3'UTR区后miR-221/222表达下调。通过体外细胞实验,我们也证明了miR-221/222的拟似物促进表皮细胞增殖,抑制物抑制增殖。据此,miR-221/222cluster确立为研究对象,JAM-A3'UTR负向调控miR-221/222。
  miR-221/222cluster同时靶向结合JAM-A、PTEN发挥转录后抑制作用
  目前研究显示,microRNA主要通过与靶基因mRNA的3'UTR区识别结合,导致靶基因mRNA降解或者干扰其正常表达,从而发挥转录后抑制作用。为进一步阐明miRC在表皮细胞中发挥抑制增殖功能的分子机制,我们拟寻找与其功能吻合、直接识别结合的下游靶分子。通过对miRC靶分子的预测分析(microRNA.org、targetscan、miRbase)以及检索PubMed和Web of Science等文献数据库,我们锁定了PTEN为miR-221/222潜在的下游靶分子,并通过双荧光素酶报告基因实验验证了我们的设想,此外双荧光素酶报告基因实验还进一步证明了miR-221/222能够同时靶向JAM-A和PTEN。接下来,通过细胞和分子实验,我们进一步验证了miR-221-3p、miR-222-5p的拟似物负向调控JAM-A和PTEN表达,抑制物正向调控JAM-A和PTEN表达,随后又通过rescue实验发现过表达miR-221-3p、miR-222-5p后能够降低过表达JAM-A3'UTR后PTEN的表达水平,进一步证明了JAM-A mRNA保护PTEN免于被miR-221-3p/222-5p降解。
  JAM-A3'UTR突变体对PTEN无调控作用,对表皮细胞增殖功能无抑制效果
  最后,我们探索了miR-221/222cluster在JAM-A3'UTR区具体的结合位点。由于miR-221在JAM-3'UTR区有3个结合位点,在PTEN有2个结合位点,故而重点选择miR-221-3p为主要研究对象。基于JAM-A3'UTR区序列和miR-221-3p的3个结合位点,我们分别构建了各个位点突变体和全突变体质粒,根据双荧光素酶报告基因实验的结果,证明miR-221-3p与JAM-A3'UTR区三个位点均可结合。因此,后续实验皆以全突变体为实验对象,分别通过RT-PCR和CCK-8实验验证了JAM-A3'UTR突变体对PTEN无调控作用,对表皮细胞增殖活性无抑制效果。
  综上所述,在本研究中,明确了JAM-A参与负向调控表皮细胞增殖活性,这种调控方式依赖于其mRNA的3'UTR区,而非传统的蛋白-蛋白间直接的相互作用,筛选得到了miR-221/222cluster,并进一步筛选得到miR-221/222的下游靶分子PTEN。随后的机制研究中,我们明确了miR-221/222能够同时靶向结合JAM-A和PTEN,阐明了miR-221/222具体的结合位点,勾勒出JAM-A、miR-221/222cluster、PTEN之间清晰的关系网络。本课题对于从microRNA角度理解表皮细胞增殖活性的调控机制进行了有益的探索,加深了对创面愈合过程中表皮细胞增殖功能的调控机制认知,有利于将来针对性开发促进创面愈合的新药。
[硕士论文] 金剑
外科学(烧伤外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  人工真皮能有效修复累及真皮层的损伤,促进创面愈合,改善愈合后功能和外观。目前临床上使用的人工真皮多为双层结构,如Intgra、Pelanc等,主要由作为生长支架的胶原层和具有屏障功能的硅胶层两层结构构成。这些人工真皮主要作用于经清创等处理彻底清除坏死组织,且未发生感染的创面,因为人工真皮移植失败的主要原因是移植后感染。移植后感染多发生于移植后早期,该时期内,由人工真皮未能与创面建立良好的血供,抗菌能力较弱,且随着创面细菌侵入、增殖,细菌分泌胶原酶,降解人工真皮的胶原层,降解产物成为细菌增殖的良好培养基,进一步增加了其移植后感染风险。移植后一旦发生感染,不但会造成移植失败,还可能引发脓毒血症,威胁患者生命。移植前彻底清创、移植后加强换药、全身使用抗生素等一系列抗菌措施应用于预防人工真皮移植后感染的问题,虽然取得了一定成效,但仍无法避免移植后感染的出现。已有大量研究将各种生长因子加入人工真皮,以期进一步促进创面愈合,借鉴于此,有研究将抗菌成分加入其中以期研制一种本身就具有一定抗菌能力的人工真皮将为改善人工真皮移植后感染问题提供新的思路和方法,也将拓展人工真皮适用范围,为创面治疗提供更多的选择。本研究选择国内Lando(@)双层人工真皮修复材料作为基础人工真皮,筛选合适的临床抗菌制剂,进行人工真皮的抗菌修饰,并验证其持续抗菌能力及促创面愈合的效果。
  第一部分:赋予人工真皮持续抗菌能力的抗菌成分选择
  目的:选择一种具有较强抗菌能力的抗菌制剂,作为后续研究赋予人工真皮抗菌能力的成分。
  方法:选择临床创面消毒常用消毒剂作为备选抗菌制剂,本研究所选择消毒剂包括:碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林。采用微量肉汤法测定创面常见细菌菌种(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌)标准菌株和临床菌株(各20株)对以上消毒剂的MIC、MBC,以消毒剂临床应用于创面的浓度作为消毒剂初始浓度,计算MIC、MBC分别为消毒剂初始浓度的稀释倍数,记为MIC稀释、MBC稀释。比较临床菌株和标准菌株对同一消毒剂的MIC、MBC,将MIC和/或MBC大于标准菌株的临床菌株认为是对该消毒剂敏感性降低的菌株,计算敏感性降低菌株百分比,初步判断临床菌株对各消毒剂的敏感性情况。选择具有较小MIC稀释和MBC稀释且临床菌株对其具有较高敏感性的消毒剂成分作为本次研究的候选抗菌制剂,用以下一阶段实验制备具有抗菌能力的人工真皮。
  结果:金黄色葡萄球菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC稀释分别为2-5、2-6、2-6、2-7、2-6、2-1,MBC稀释分别为2-5、2-5、2-6、2-7、2-6、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为30%、30%、55%、5%、5%、50%。鲍氏不动杆菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC稀释分别为2-4、2-4、2-5、2-5、2-2、2-1,MBC稀释分别为2-3、2-4、2-4、2-5、2-1、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为40%、25%、60%、10%、45%、55%。肺炎克雷伯菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC稀释分别为2-4、2-6、2-6、2-7、2-2、2-1,MBC稀释分别为2-4、2-5、2-6、2-7、2-1、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为35%、20%、40%、10%、40%、45%。
  结论:金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌对PHMB具有较小MIC稀释、MBC稀释,且临床菌株对其敏感性较高,故PHMB被选择为赋予人工真皮持续抗菌能力的抗菌成分。
  第二部分:具有抗菌能力的人工真皮的制备及性状检测
  目的:以PHMB作为抗菌成分,分别采用浸泡法、微球法、夹层法处理人工真皮,检测3种方法处理后的人工真皮可持续抗菌时长,并检测相关性状。
  方法:将人工真皮分别进行如下处理:1.浸泡法:分别浸泡于0.1%、0.5%、1%、2%浓度PHMB溶液中24h;2.微球法:制作直径50μm、100μm的明胶微球,每种直径明胶微球各自分别含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB,将人工真皮浸泡于上述明胶微球水溶液中24h;3.夹层法:制作含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB的水凝胶,加入人工真皮的硅胶层和胶原层之间。分别将制备好的实验样品制成直径5mm的圆形,放置于涂抹金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌标准菌株的培养皿,每天更换新的涂抹细菌的培养皿,记录每天形成得抑菌圈大小,分析各方法可持续形成有效抑菌圈时间。选择具有最长可持续形成有效抑菌圈时间且PHMB浓度较低的实验样品用于后续研究,检测性状。体外细胞毒性卖验,以未加入抗菌成分的人工真皮作为对照,分别观察实验样品和未加入抗菌成分韵人工真皮在第3、7、14、21d对人成纤维细胞和人血管内皮细胞存活率的影响。体外自然降解实验,观察在自然环境下实验样品降解情况。体内埋植实验,将实验样品埋入大鼠皮下,观察埋入部位大体反应,并记录降解情况。扫描电子显微镜观察,比较实验样品和未加入抗菌成分的人工真皮结构差异。
  结果:使用浸泡法制备的不同浓度的实验样品对各菌种仅在浸泡后0d形成了有效抑菌圈;使用微球法制备的实验样品对3个菌种最长可持续形成有效抑菌圈时间均为1d,由浸泡于直径50μm、PHMB浓度为1%和2%的明胶微球溶液后形成;使用夹层法,1%和2%PHMB水凝胶加入人工真皮后对金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌标准菌株可持续形成有效抑菌圈时间分别为8d、7d、7d。综合分析1%PHMB水凝胶加入人工真皮胶原层和硅胶层间可作为赋予人工真皮持续抗菌能力的方法,行下一步研究检测性状。细胞毒性实验结果显示,具有抗菌能力的人工真皮对人成纤维细胞和人血管内皮细胞存活率产生影响较小,与不含抗菌成分的人工真皮比较无明显差异,P>0.05。体外自然降解实验显示,1%PHMB水凝胶降解率较低,至第6周时降解率为27.388±1.943%。体内埋植实验显示,1%PHMB水凝胶埋入部位未出现明显炎症反应,切口生长较好,水凝胶至第3周降解率为23.648±2.336%。扫描电子显微镜检查结果显示,加入1%PHMB水凝胶后,人工真皮胶原层结构无明显改变,胶原层孔隙内可观察到PHMB晶体分布。
  结论:1%PHMB水凝胶加入人工真皮胶原层和硅胶层间,能有效赋予人工真皮较长时间持续抗菌能力,生物毒性较低,降解较慢,且不改变人工真皮胶原层原结构。
  第三部分:具有抗菌能力的人工真皮的在体效果验证
  目的:验证加入1%PHMB水凝胶的人工真皮对创面愈合的影响以及抗菌能力。
  方法:清洁创面移植实验:取40只SD大鼠,制备全层皮肤缺损创面模型,随机分为2个组,分别为人工真皮组(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组(Anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),各组创面分别给予不做特殊处理、覆盖人工真皮、覆盖1%PHMB水凝胶、覆盖具有抗菌能力的人工真皮,分别于第3、7、14、21d换药,观察创面愈合及感染情况,计算每次换药时的新发感染率。换药时每组大鼠随机选取5只大鼠处死,取创面组织,分别行病理切片HE染色和CD31免疫组化,计算微血管密度(Micro-vascular Density,MVD),并行创面组织细菌定量实验。感染创面移植实验:取20只SD大鼠,随机分为人工真皮组2(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每组10只,制备感染创面模型,ADG2覆盖人工真皮,AADG覆盖具有抗菌能力的人工真皮。于第3、7、14、21d换药,观察创面感染情况,计算每次换药时的感染率,于21d换药时处死所有大鼠,取创面组织行细菌定量实验。移植后持续暴露于感染环境实验:取20只SD大鼠,随机分为人工真皮组(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组3(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每组10只,制备全层皮肤缺损创面模型,ADG覆盖人工真皮,AADG覆盖具有抗菌能力的人工真皮,每日于硅胶层外滴注1mL鲍氏不动杆菌标准菌株细菌悬液,于移植后3、6、9、12d换药观察创面感染情况,计算每次换药时的感染率。
  结果:清洁创面移植实验:ADG于第7d换药时出现1个感染创面,新发感染率均为6.67%。AADG在第3d MVD少于ADG,P<0.05,但后期AADG与ADG的微血管密度间无明显差异,P>0.05。排除感染创面后,各组未感染创面细菌含量检测,第3、7、14d AADG创面组织细菌含量明显少于ADG,P<0.05。
  结论:具有抗菌能力的人工真皮对创面愈合影响较小,移植于感染创面后能有效控制感染,且对移植后可能导致创面感染的因素具有一定抵抗能力。
[硕士论文] 张永存
外科学(烧伤外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在烧伤病人的救治工作中,皮肤移植和削痂是非常重要的基础治疗技术。皮肤移植不仅可以修复烧伤创面,亦广泛的应用于创伤、糖尿病溃疡、压疮、皮肤肿瘤以及疤痕切除后皮肤损伤的修复。随着负压封闭引流等技术的应用拓展,越来越多采用游离皮片进行创面修复,皮片种类包括刃厚皮片、中厚皮片、全厚皮片、含真皮下血管网皮片。皮片的厚度和创面修复的效果密切相关,合适的厚度不仅能很好契合创面修复需要,而且对供皮区损伤控制在最小程度,避免临床上主要依靠医生经验取皮所导致的厚度控制不佳,出现皮片过薄满足不了创面修复的需求,或者皮片过厚加重了供皮区损伤,以及疤痕形成、色素沉积、瘙痒、疼痛等问题。类似的问题在烧伤创面处理中并不少见,按烧伤经典的三度四分法,一度到浅二度可自愈,三度一般需要切削痂植皮治疗,这些在治疗上都是明确的,唯深二度烧伤的治疗存在较大的困惑,深二度烧伤深及真皮乳头层以下,没有损伤真皮全层,进一步可细分偏浅、偏深等深二度,同薄中厚皮片、厚中厚皮片的皮肤层次类似。理论上,偏浅深二度创面存在自愈可能,偏深深二度创面痂皮手术处理的方式有磨痂、削痂、剥痂等,达到创面广泛的点状出血之后再进一步处理。同取皮一样,这种通过手术去除痂皮的深度主要靠医生经验判断,具体深度因人而异,但对于烧伤创面而言,去除痂皮最理想的深度却只有一个,削痂过浅,坏死组织清理不彻底影响创面愈合,削痂过深则破坏了机体的健康组织。因此,无论取皮还是削痂,如何在术前获得这个最佳深度,对于治疗效果非常重要。同样,找到一个对取皮和削痂后的创面效果进行实时、无创的评价方法也很重要,其可决定下一步的医疗决策,提示医疗人员及时调整对创面的处理方法。
  高频超声具备超高的分辨率,被称为“超声显微镜”,测量结果可以精确到微米级,可对皮肤组织的纵深情况进行清晰地呈现,并计算不同层次皮肤组织的厚度,且无创、操作简单。皮肤镜也叫皮表透光显微镜,其通过自带光源模式的调整,分为偏振和非偏振法,是一种可以观察皮肤表面情况,并使表皮下解剖结构的可视化的技术,可充当临床观察和组织病理学的桥梁,又被称为皮肤科医生的“听诊器”。随着近年来人工智能在图像识别领域的快速进展,Andre Esteva等利用深度学习技术对皮肤癌和黑色素瘤的图片进行学习后,取得准确率高达91%的识别效果。2018年张康等利用基于图像的深度学习技术,采用“迁移学习”方式,已取得了对肺部、眼部部分疾病医学图像高达96.6%诊断准确度。基于此,未来人工智能图像识别技术在烧伤图像方面的应用值得期待。
  课题拟建立稳定的、易于获取的SD大鼠的供皮区模型、深二度烧伤削痂模型,通过组织学病理结果验证其稳定性,为涉及供皮区、深二度削痂方面的研究提供一个稳定的动物平台,并采用皮肤镜和高频皮肤超声对其鉴定,探索相关影像和创面层次之间的关系,进一步探究其在未来临床应用中的潜在价值。并为未来可能的人工智能图像识别技术在烧伤领域的应用提供基础数据和实验方法。
  研究目的:
  1.建立SD大鼠供皮区和深二度烧伤削痂模型,通过组织病理学切片验证其稳定性。
  2.在皮肤纵深维度,探索高频超声,对于精确取皮、削痂操作的应用价值。
  3.通过皮肤镜对取皮或削痂创面图像的获取和特征分析,探索皮肤镜在创面观察和评价中应用价值,为创面深度的评价提供一个新方法。
  研究方法:
  第一部分:20只SD大鼠随机分为2组(辊轴取皮刀取皮组、电动取皮刀取皮组),每组10只,使用各自的取皮刀在大鼠背部皮肤取皮,每只SD大鼠背部设定4个供皮区,通过皮下注射肿胀液形成局部隆起后,两名实验人员相互配合,设定取皮厚度分别为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm进行取皮。取皮前后分别用数码相机记录大体形态;用皮肤镜采集图像,对图像特征,包括色彩、出血、毛细血管形态等进行观察、归纳、分析;通过高频超声仪图像,测量皮肤不同层次厚度,记录并保存。图像数据采集完成后,取皮肤创面标本,进行组织学病理观察,计算断层皮片厚度。比较分析正常皮肤表皮、真皮、全层(表皮+真皮)及断层皮片厚度的病理测量数据与高频超声所测量结果之间的关系。
  第二部分:采用15mm×15mm×30mm大小铜块,浸入沸水5分钟后,予以铜块15mm×15mm面紧贴背部皮肤,靠铜块自重作用于大鼠背部8秒可致大鼠背部深二度烧伤。20只SD大鼠随机分为2组(辊轴取皮刀削痂组、电动取皮刀削痂组),每组10只。使用铜块在大鼠背部制作四个深二度烧伤的创面两组使用各自取皮刀分别对各自组内10只深二度烧伤的SD大鼠背部皮肤削痂,置烫伤面积同样大小的铜块于待削痂的创面下方,左手固定创面平展于铜块上,右手进行削痂,每个大鼠背部四个创面设定削痂深度分别为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm进行削痂,随后进行图像采集、分析和病理观察(方法同实验第一部分)。比较分析痂皮厚度的病理测量数据与高频超声所测量结果之间的关系。
  以上数据均采用用SAS9.4统计软件进行分析。
  研究结果:
  第一部分:SD大鼠供皮区模型的构建及高频皮肤超声仪、皮肤镜在其稳定性评估中的应用探索
  电动取皮刀组多次尝试,获得创面不理想。辊轴取皮刀组共获得不同深度的供皮区40个,每组10个,其中1个取皮过深导致皮下筋膜暴露,其余创面外观规整,形态均一性较好。
  图像特征:
  皮肤镜:设置0.1mm刻度取皮的创面可见粉白色,散在分布的点状出血点;设置0.2mm深度取皮的创面可见密度远高于前者的点状出血点,毛细血管末梢呈碎发样分布;设置0.3mm深度取皮的创面密集网状结构清晰可见,散在分布较大出血点,毛细血管分布可见,较多毛细血管纹路清晰呈现,设置0.4mm深度取皮的创面可见弥散性大出血点,毛细血管广泛可见,皮下筋膜隐约呈现。
  高频皮肤超声:SD大鼠表皮呈一条连续的平滑线状强回声,真皮层回声较表皮明显降低,真皮—皮下分界处呈不连续的线状回声,回声强度介于表皮、真皮之间,浅筋膜表现为规则的线状高回声。取皮后超声图像中表层线状强回声带消失,真皮层回声带宽度随着取皮厚度的递增而递减,随着取皮厚度进一步增加,真皮回声带亦消失。
  组织学观察:所取皮片、及相应的供皮区镜下厚薄均匀一致,无明显起伏。皮肤各层次组织结构清晰可见。
  使用SAS9.4统计软件对数据进行分析,SD大鼠背部皮肤表皮、真皮、全层病理厚度与其高频超声图像计算结果正相关,其中:表皮相关系数0.836,P<0.01;真皮相关系数0.932,P<0.01;皮肤厚度0.855,P<0.01。断层皮片病理厚度与超声检查结呈正相关。
  第二部分:SD大鼠深二度烧伤削痂模型的构建及高频皮肤超声仪、皮肤镜在其稳定性评估中的应用研究
  电动取皮刀组,削痂效果不理,创面起伏较大不均一,不进行图像分析。辊轴取皮刀组共获得不同深度的供皮区40个,每组10个,其中2个取皮过深导致皮下筋膜暴露,其余创面外观规整,形态均一性较好。
  图像特征:
  皮肤镜:设置0.1mm刻度削痂后创面呈现一片瓷白色,可见网样外观,网眼空隙较小,密集分布;;设置0.2mm刻度削痂后创面呈白色、淡红色相间,可见网样外观,空隙变大,网眼密度下降,散在较为规则、尺寸大小相仿的点状血管,局部可见细网状毛细血管纹路,;设置0.3mm刻度削痂后创面大部分呈现淡红色,依然可见网样外观,网眼空隙进一步变大,网眼密度稀疏,出血点分布较前者密集,可见广泛的毛细血管断端,血管纹路;设置0.4mm刻度削痂后创面呈鲜红色,弥漫性出血,毛细血管完整性和网样外观,不可见。
  高频皮肤超声:烧伤后可见真皮层水肿,厚度明显增加,削痂后超声图像中可见痂皮及削痂后的创面图像,痂皮回声带宽度随着削痂厚度的递增而递增。
  组织学观察:痂皮厚度镜下厚薄比较均一,无明显起伏。皮肤各层次组织清晰可见。使用SAS9.4统计软件对数据进行分析,病理结果和超声图像计算结果均比较稳定,变异性小,超声图像计算结果均大于病理结果,削下痂皮的病理厚度与超声检查结呈正相关。
  研究结论:
  1.通过辊轴取皮刀可以建立SD大鼠供皮区和深二度烧伤后削痂模型,该方法简单易行,稳定性和可重复性高。可以为涉及到上述两种创面的药物、敷料及治疗方研究提供一个稳定的动物模型平台。
  2.高频超声影像测量断层皮片、痂皮的厚度结果分别和各自病理测量结果正相关,可以为个性化、精确的取皮、削痂提供实时、无创的检测和参考。
  3.皮肤镜采集的平面图像,可以清晰地观察创面多维度的情况,尤其是对毛细血管损伤情况的清晰成像,能为供皮区及创面削痂效果的评价提供更准确、客观的方法。
[硕士论文] 李海航
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:组织工程学为皮肤替代物的研究提供很好的方法,但目前遇到瓶颈难以解决。本研究围绕生物3D打印构建人工皮肤进行开展,研发一种可用于进行人工皮肤构建的生物型3D打印机,并进行体外的生物3D打印构建人工皮肤的初步探索。
  第一部分:生物型3D打印机研发与测试
  研究目的:研发一种可用于进行生物3D打印人工皮肤的生物型3D打印机,并对其进行稳定性测试。
  研究方法:为实现通过生物型3D打印机体外构建人工皮肤,课题组提出课题研究需要的生物型3D打印机设备的设计要求,并交由器械公司完成设备的制造。完成生物型3D打印机PrototypeSK00的制造后,通过3D Studio Max软件设计2种不同参数的三维模型(Cylinder001.stl和Cylinder002.stl)并通过RepetierHost软件解析成GOC文件,配置1%、2.5%和5%的海藻酸钠溶液,基于2种不同参数的模型和3种不同的打印成分测试5种不同内径的打印头(0.09mm,0.16mm,0.25mm,0.41mm和1.00mm)的运行情况。将成纤维细胞和表皮细胞消化形成细胞密度为1×108/ml DMEM悬液,将2种细胞经过不同内径的打印头的直接打印种植于12孔板中,检测经过打印操作后0h、6h、24h和48h的细胞存活率,对照组为直接通过微量移液枪将细胞种植于培养孔中。此外,为检测生物型3D打印机PrototypeSK00构建人工器官的稳定性,设计一个仿真鼻的三维模型并基于2.5%海藻酸钠和0.41mm打印头进行体外打印运行测试,对照为相同的三维模型在工业型3D打印机构建的聚乳酸人工鼻模型。
  研究结果:经课题组设计并完成制造生物型3D打印机-PrototypeSK00。运行检测过程发现基于0.09mm打印浓度较高的海藻酸钠溶液时,容易发生堵头现象。打印浓度较低海藻酸钠溶液时,总体积较大的模型在打印后期,容易发生水分蒸发导致前期构建的模型干燥坍塌而致使打印失败。成纤维细胞和表皮细胞经过打印操作后,0h-48h的细胞存活率最低95%,最高100%,与对照组无明显统计学差异。通过生物型3D打印机PrototypeSK00的仿真鼻能够与工业型3D打印机构建的人工鼻模型接近。
  研究结论:课题组研发了一种运行相对稳定的生物型3D打印机-PrototypeSK00,其运行过程无明显错误发生,经过其打印操作后细胞存活率与微量移液枪无差异,通过该打印能稳定运行体外构建高级人工结构。
  第二部分:应用于生物型3D打印机的皮肤“生物墨水”的研发与检测
  研究目的:研制一种能够在生物3D打印机使用的进行体外构建人工皮肤需要的作为支架成分的“生物墨水”。
  研究方法:将重组胶原蛋白与藻酸盐溶液混合灭菌形成“生物墨水”,对照品为不含胶原蛋白成分的藻酸盐溶液。将部分样品冻干形成固态进行扫描电镜检测观察材料的物理表征,并于流体旋转流变仪上进行样品的流体力学检测。以传代培养旺盛的成纤维细胞和表皮细胞为实验体系,检测“生物墨水”的细胞毒性。通过bal/bc裸鼠及SD大鼠的全层皮肤缺损模型检测该“生物墨水”修复创面的作用,第1、2、3、4周取病理,观察创面愈合情况、血管化情况、胶原残留情况及表皮爬行情况。
  研究结果:通过重组人胶原蛋白构建了一种孔隙均匀的具有高生物活性的胶原蛋白“生物墨水”,对表皮细胞及成纤维细胞无明显毒性。裸鼠的创面治疗实验证实了含有胶原蛋白的“生物墨水”能够有利于促进创面血管化、促进皮肤真皮层厚度恢复以及提高创面的胶原蛋白含量。
  研究结论:本部分的研究内容为通过应用重组人Ⅲ型胶原蛋白作为本课题使用的“生物墨水”材料,构建一种与皮肤的细胞外基质相接近的“生物墨水”,检测其生物毒性与创面治疗作用,其本身具有加速创面愈合和改善创面愈合质量作用,为构建生物3D打印人工皮肤做准备。
  第三部分:基于生物型3D打印机的人工皮肤的初步构建与检测
  研究目的:基于自主研发生物型3D打印机PrototypeSK00和研制的胶原蛋白“生物墨水”,结合成纤维细胞和表皮细胞,进行通过生物3D打印的方式初步探索体外模拟构建生物3D打印人工皮肤的试验,并对其进行初步的生物学评价。
  研究方法:以计算机3D Studio Max程序(Autodesk公司,美国)作为模型建立软件,建立了模拟人皮肤真皮层和表皮层的多层次三维模型数据。将成纤维细胞与表皮细胞混合入“生物墨水”中,进行模拟人体皮肤结构的体外3D打印,并立刻进行冰冻切片的方式结合HE染色观察其显微结构。通过转染EGFP基因序列成纤维细胞中,并以嘌呤霉素进行筛选构建能稳定表达EGFP蛋白的成纤维细胞,以该细胞体系为种子细胞体外3D打印构建多层结构,并在荧光显微镜下观察体外培养7天后的细胞状态。
  研究结果:基于生物型3D打印机和“生物墨水”成果完成人工皮肤的体外生物3D打印构建,冰冻切片后的HE染色观察,能够明显区分“真皮层”和“表皮层”。体外培养7天后,具有稳定表达EGFP的成纤维细胞的通过3D打印构建的多层结构证明成纤维细胞在“生物墨水”中存活良好,并且底层的细胞呈贴壁增殖。
  研究结论:通过生物3D打印的方式,以胶原蛋白“生物墨水”为支架,成纤维细胞和表皮细胞为种子细胞,能够在体外模拟皮肤的结构仿生构建人工皮肤。
[硕士论文] 鲁晋
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:烧伤是由物理或者化学因素造成的体表和深部组织的伤害。烧伤的临床诊断通常包含面积诊断与深度诊断两方面内容,烧伤面积的诊断是判断烧伤病情严重程度、休克复苏方案的制定、判断病情进展的重要依据。当前临床医师常用的烧伤面积估算方法主要有“Lund-Browder表格法”、“九分法”、“手掌面积法”等,它们均为二维的估算,没有充分考虑烧伤患者的年龄、性别、种族、体质差异和有可能存在的身体残缺(断肢畸形)等一系列可能影响结果的因素,存在较大差异。同时不同评估者的诊断之间主观差异性较大,在一定程度上影响了临床诊断与治疗效果。
  在科研工作中,对于创面面积的精确评估,采用的方法有网格透明膜进行边界描绘的方法和NIH ImageJ结合拍照的方法等,网格透明膜描边界法经济、简便、直观、准确且具有可重复性,但使用时需要与伤口直接接触,增加患者疼痛及感染的风险。NIH ImageJ法快捷、简便、且无需与伤口直接接触,但其本质仍为二维计算,存在一定误差。本课题组在原先烧伤创面扫描设备BurnCalc扫描系统的基础之上,进一步升级了便携式的伤口3D(three dimension)扫描设备的硬件及软件系统,即WoundCleverCalc扫描设备。该设备在扫描的过程中重建被扫描对象的3D点云数据图形,可以计算出被扫描对象的3D表面积,对局部组织缺损的深度和体积也可以进行评估。本课题拟在前期研究的基础之上,验证WoundCleverCalc扫描设备在烧伤创面面积评估、慢性皮肤溃疡创面面积测量的准确性、稳定性及可操作性。同时进一步评估WoundCleverCalc扫描设备对于伤口深度和体积测量的功能。
  第一部分 三维伤口扫描系统在烧伤面积评估中的应用
  研究目的:验证WoundCleverCalc扫描设备对于烧伤面积评估的准确性。
  研究方法:首先,由三名医师分别使用WoundCleverCalc扫描设备单独计算12例烧伤患者伤口,比较三名医师评估数据的差异,来评价WoundCleverCalc扫描设备的稳定性。其次,以网格透明膜描边界法为金标准,分别使用网格透明膜描边界法、NIH ImageJ方法和WoundCleverCalc扫描方法测量四肢烧伤伤口12例、前躯干烧伤伤口12例、侧躯干烧伤伤口12例,验证WoundCleverCalc扫描设备对于不同部位烧伤面积评估的准确性。比较三种计算方法进行伤口评估所用的时间,评价WoundCleverCalc扫描设备的操作便捷性。
  研究结果与结论:1、三位医师测量相同伤口面积无统计学差异,证实WoundCleverCalc扫描设备具有较高的稳定性。2、WoundCleverCalc扫描法测量四肢、前躯干、侧躯干伤口所得结果,与网格透明膜描边界法无统计学差异,证实该系统在测量烧伤创面面积时具有良好的精确性。NIH ImageJ方法在测量前躯干创面面积具有良好的准确性,但在测量四肢、侧躯干测量面积较其它两种方法小。3、WoundCleverCalc扫描法测量所需时间明显小于网格透明膜描边界法所需时间。
  第二部分 三维伤口扫描系统在慢性伤口面积评估中的应用
  研究目的:验证WoundCleverCalc扫描设备对于慢性溃疡伤口面积评估的准确性。
  研究方法:根据该试验的纳入排除标准,纳入30例慢性溃疡伤口病例,分别使用网格透明膜描边界法、NIH ImageJ方法和WoundCleverCalc扫描方法进行伤口面积的测量,验证该设备对慢性溃疡伤口面积评估的准确性。
  研究结果与结论:试验结果显示WoundCleverCalc扫描所得伤口面积与其它两种方法所得面积无统计学差异。证实WoundCleverCalc扫描系统对于慢性溃疡伤口面积测量较为准确。
  第三部分 三维伤口扫描系统在伤口深度和体积评估中的应用
  研究目的:验证WoundCleverCalc扫描设备对于伤口深度和体积的计算的准确性。
  研究方法:1、在巴马香猪背部使用打孔器制作16个圆柱形组织缺损伤口,首先比较扫描系统与直尺法测量伤口深度的差异,其次比较扫描所得体积与Jeltrate(@)填充物体积之间的差异,验证系统对于巴马香猪圆柱形伤口的深度和体积评估的准确性。2、通过橡皮泥制作16个底面积一致,深度逐渐增加的圆柱形凹陷模拟伤口,按照上述方法分别比较扫描所得深度和体积与实际值的差异,评估系统对于不同深度缺损伤口模型深度和体积评价的准确性。
  研究结果:WoundCleverCalc扫描方法所得伤口深度和体积要比实际伤口深度和体积偏大。
  研究结论:1.WoundCleverCalc扫描设备能够准确的评估烧伤伤口的面积及慢性溃疡伤口的面积。
  2.WoundCleverCalc扫描设备具有良好的稳定性,测量所需时间较短。
  3.WoundCleverCalc扫描设备具有扫描伤口体积和深度的功能,但测量深度和体积时计算值要较真实值偏大。
[博士论文] 杨聪娴
麻醉学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:全世界每年有超过1100万患者遭受不同程度的烧伤,其中96%的患者诉烧伤急性期伴随剧烈的疼痛,52%的患者诉在皮损愈合后疼痛持续存在,其中66%认为疼痛影响身体康复,55%认为疼痛严重影响日常生活;其中60%以上的患者对疼痛的管理靠“转移注意力”、“家庭治疗”等方式;目前对烧伤后的慢性疼痛缺少特效的治疗药物,主要镇痛药物为阿片类药物,镇痛效果并不理想,而且还有一些患者存在药物滥用问题。烧伤后的慢性疼痛不仅出现在皮损区域,而且在未受热损伤的皮肤部位也表现出触诱发痛和感觉异常,目前认为热损伤后的慢性疼痛是一种神经病理性疼痛,其形成过程有中枢敏化的成分,临床上这种现象一般发生在皮损面积较大的Ⅱ°和Ⅲ°烧伤的患者,浅表的Ⅰ°烧伤患者一般不产生慢性疼痛。调查研究发现,热损伤后的慢性疼痛主要表现为触觉痛阈降低,其温度觉痛阈受影响较小。热损伤后神经病理性疼痛的产生主要由于皮肤的神经组织不良愈合、形成错构,导致中枢敏化,产生神经病理性疼痛。
  染色体是由DNA和组蛋白(Histone)通过离子键相结合并不断螺旋形成的,组蛋白可以影响基因转录活性,组蛋白乙酰化修饰是基因转录调控的重要机制:组蛋白乙酰化酶(Histone Acetylases,HAT)通过催化组蛋白乙酰化,激活基因转录;而组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)通过组蛋白去乙酰化,抑制基因转录。沉默调节蛋白(Sirtuin)属于第Ⅲ类HDAC,人类基因组中存在7类Sirtuin(SIRT1-7),SIRT1存在于细胞核中,作用于细胞核中的组蛋白,调节基因表达。近年来的研究表明,SIRT1、HDAC和组蛋白乙酰化状态的失衡与神经病理性疼痛相关,但是其具体的作用存在争议。早期的观点认为,在神经病理性疼痛的大鼠模型中,脊髓水平SIRT1表达水平减低,其去乙酰化活性降低,而鞘内给予HDAC激动剂白藜芦醇(Resveratrol,RSV)可以产生镇痛作用。近年来的一些研究则指出,HDAC抑制剂丁酸钠、曲骨抑菌素A(Trichostatin A,TsA)、丙戊酸(Valproic Acid,VPA)等,可以通过提高乙酰化组蛋白水平,促进基因转录(例如亲代谢型谷氨酸受体2(metabotropic glutamate receptor2)、δ_阿片受体等),进而起到镇痛作用。关于这一争议,目前的解释有很多:一是HDAC抑制剂的镇痛作用一般为增加受体表达,因此可以作为阿片类药物的辅助用药;二是目前共发现有4类HDAC,SIRT1属于第3类,RSV仅作用于SIRT1而不影响其他几类HDAC,而VPA、TsA则是第1类、第2类HDAC抑制剂。Bai等人的研究认为热损伤局部和损伤部位远处的SIRT1升高,具有抑制凋亡、修复组织的作用,而热损伤后脊髓SIRT1的变化以及热损伤后慢性疼痛与脊髓SIRT1之间的关系目前尚未见报道。
  RSV是存在于天然植物中的多酚类物质,RSV对突出髓核导致的疼痛、神经病理性疼痛以及炎性痛方面都显示出了一定的镇痛作用。在神经病理性疼痛的镇痛方面,Yin等人的研究证明,在慢性压迫性损伤(Chronic Constriction Injury,CCI)之后即刻鞘内注射RSV可以推迟神经病理性疼痛的形成,在CCI后4-7天鞘内注射RSV可以抑制神经病理性疼痛的程度。Shao等人的研究中,CCI之前1小时,鞘内注射RSV可以延迟神经病理性疼痛的发展,表明RSV对于神经病理性疼痛的形成是有一定的预防作用的,而且以上研究认为RSV的镇痛作用是与SIRT1相关的。Sharma等人认为RSV对糖尿病周围神经病变的大鼠具有治疗作用,但机制是通过SIRT1之外的其他途径实现的。RSV对热损伤疼痛(Burn Injury Pain,BIP)大鼠有无治疗作用以及作用机制目前尚未见报道。
  基于以上背景,进行了本次研究,目的在于探讨鞘内注射RSV对BIP大鼠的镇痛作用以及可能的作用机制,内容共分两个部分,每个部分包含两个实验。
  第一部分 鞘内注射RSV对BIP大鼠的镇痛作用以及对脊髓SIRT1/Ac_H3的影响
  目的:建立BIP大鼠模型,验证鞘内注射RSV对BIP大鼠的镇痛作用,并检测大鼠脊髓SIRT1/Ac_H3的变化。
  方法:(1)实验一:大鼠随机分为3组:na(i)ve组、sham组、BIP组;BIP组采用85.0±0.5℃,保持10g的压力,精确控制持续加热15秒的方法进行BIP大鼠的动物模型制作;以Von Frey法测量各组大鼠在热损伤前以及热损伤后第1、3、5、7、9、11、14和21d的机械缩足反射阈值(PMWT);以Western Blot检测各组大鼠在热损伤后第3、7、14、21d的脊髓SIRT1/Ac_H3的表达。
  (2)实验二:将大鼠随机分为7组:sham组、sham+DMSO组、sham+400μgRSV组、BIP组、BIP+DMSO组、BIP+200μgRSV组和BIP+400μgRSV组;BIP造模方法参照实验一;热损伤后第7-9d,连续3d鞘内给药(sham+DMSO组和BIP+DMSO组鞘内给予对照剂DMSO、BIP+200μgRSV组鞘内给予200μgRSV、sham+400μgRSV组和BIP+400μgRSV组鞘内给予400μgRSV),以Von Frey法测量各组大鼠在热损伤前以及热损伤后第1、3、7、9、14和21d的PMWT;以Western Blot检测其中5个组(sham组、sham+DMSO组、BIP组、BIP+DMSO组和BIP+400μgRSV组)大鼠在热损伤后第9d的脊髓SIRT1/Ac_H3的表达。
  结果:(1)实验一:热损伤后第1d,BIP组大鼠患侧肢体PMWT降低(持续至热损伤后21d),与na(i)ve组相比有统计学差异(P<0.05);热损伤后笫7d,BIP组大鼠健侧肢体PMWT降低(持续至热损伤后21d),与na(i)ve组相比有统计学差异(P<0.05);热损伤后第7、14、21d,BIP组大鼠脊髓SIRT1/Ac_H3表达增加,与na(i)ve组相比有统计学差异(P<0.05)。
  (2)实验二:热损伤后第7-9d,鞘内给药后,BIP+200μgRSV组和BIP+400μgRSV组与BIP组相比,大鼠PMWT升高,差异有统计学意义(P<0.05);BIP+DMSO组与BIP组相比,大鼠PMWT无统计学差异(P>0.05);BIP+200μgRSV组和BIP+400μgRSV组两组之间大鼠PMWT无统计学差异(P>0.05)。热损伤后第14、21d,BIP+200μgRSV组和BIP+400μgRSV组两组大鼠PMWT降低,与BIP组相比无统计学差异(P>0.05)。热损伤后第9d,BIP+400μgRSV组脊髓SIRT1表达增加,Ac H3降低,与BIP组相比有统计学差异(P<0.05);BIP+DMSO组与BIP组相比,在脊髓SIRT1/Ac_H3表达方面,无统计学差异(P>0.05)。
  结论:RSV对BIP大鼠具有镇痛作用,其作用机制可能是通过激活脊髓SIRT1实现的,因此RSV有可能成为治疗BIP的药物之一。
  第二部分 鞘内应用SIRT1抑制剂对大鼠PMWT的影响以及对RSV镇痛作用的影响
  目的:测定SIRT1的高选择性抑制剂EX527是否影响大鼠PMWT,以及是否影响RSV对BIP大鼠的镇痛作用。
  方法:(1)实验一:将大鼠随机为分6组,na(i)ve组、DMSO组、EX5276.4μg组、EX5278μg组、EX52710μg组和EX52712.5μg组;后4组大鼠鞘内分别注射不同剂量的EX527,以Von Frey法测量各组大鼠置管前、给药前、以及给药后第30、60、90、120、150、180min的PMWT。
  (2)实验二:将大鼠随机分为5组,sham+DMSO+DMSO组、BIP+DMSO+DMSO组、BIP+EX527+DMSO组、BIP+DMSO+RSV组、BIP+EX527+RSV组;BIP造模方法见第一部分;热损伤后第7d,BIP+EX527+DMSO组和BIP+EX527+RSV组鞘内给予EX5278μg预处理,1h后BIP+EX527+RSV组鞘内给予RSV400μg,连续给药3d,以Von Frey法测量各组大鼠在热损伤前以及热损伤后第1、3、7、9、14和21d的PMWT。
  结果:(1)EX52710μg组和EX52712.5μg组,在给药后第30、60、90min时大鼠PMWT降低,与na(i)ve组相比有统计学意义(P<0.05);至给药后第120、150、180min,大鼠PMWT与na(i)ve组相比则无统计学意义(P>0.05),EX5276.4μg组和EX5278μg组大鼠PMWT与na(i)ve组相比,各时点均无统计学意义(P>0.05)。
  (2)热损伤后第7d和第9d,BIP+DMSO+RSV组和BIP+EX527+RSV组大鼠PMWT均有升高,与BIP+DMSO+DMSO组相比有统计学差异(P<0.05);BIP+EX527+RSV组和BIP+DMSO+RSV组相比,大鼠PMWT降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:SIRT1高选择性抑制剂EX527预处理可以降低RSV对BIP大鼠的镇痛作用,RSV对BIP大鼠的镇痛作用至少部分是通过激活SIRT1实现的。
[博士论文] 史惠
临床检验诊断学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:皮肤烫伤破坏皮肤屏障功能,给患者带来触觉痛觉等障碍,且皮肤烫伤现有治疗方法效率不高,加速创面愈合至关重要。以间质干细胞为主的细胞治疗被广泛报道,利用小分子药物预处理间质干细胞可提高其在损伤修复中的治疗效率,加速损伤组织愈合。本文旨在研究小分子药物3,3'-二吲哚甲烷(3,3'-diindolylmethane,DIM)对人脐带间质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells,hucMSC)预处理后的作用,以期在皮肤烫伤中发挥更好治疗效果,并阐明DIM预处理hucMSC的分子机制。
  方法:MTT试验确定DIM作用的浓度和时间。体内构建SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型,以PBS和hucMSC为对照,观察DIM改造后hucMSC的治疗效果。创面大体照片,HE染色及组织学评分用以评价皮肤表皮再生及毛囊等附属结构再生情况。免疫组织化学染色检测损伤部位增殖细胞核抗原PCNA,免疫荧光染色检测角蛋白CK19表达,荧光定量PCR检测Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值,免疫组化检测皮肤组织β-catenin表达。体外探寻DIM对hucMSC预处理作用时,运用荧光定量PCR和Western blot检测hucMSC干性转录因子Oct4,Sox2,Nanog,Sall4表达情况。平板克隆检测hucMSC自我增殖能力,成脂诱导试验及成骨诱导试验检测hucMSC诱导分化潜能,定量PCR检测脂联蛋白adiponectin及碱性磷酸酶ALP表达,蛋白液相芯片技术检测hucMSC在DIM作用后旁分泌水平的改变。在研究DIM通过何种机制改造hucMSC时,采用荧光素酶报告基因检测Wnt信号通路的活化情况,免疫荧光及高内涵分析β-catenin的表达和入核情况。Westen blot检测β-catenin及其下游基因CyclinD3,CD44蛋白表达水平。使用β-catenin信号通路抑制剂ICG001进一步验证Wnt/β-catenin信号通路的作用,免疫荧光验证抑制剂抑制效果。平板克隆试验,成脂成骨诱导试验检测ICG001阻断β-catenin后,hucMSC自我增殖和多向分化的能力的改变。在进一步寻找关键Wnt分子时,荧光定量PCR筛选DIM作用后hucMSC中改变最为明显的Wnt分子。借助慢病毒载体干扰Wnt11基因的表达,定量PCR和Western blot验证慢病毒敲减效率。平板克隆,成脂成骨诱导试验检测Wnt11敲减后hucMSC自我增殖和多向分化能力的改变,并在体内模型中进一步验证。为了寻找Wnt11的有效传递形式,我们收集DIM处理过hucMSC的条件培养基,ELISA检测其中Wnt11分泌情况。用蔗糖密度梯度超速离心法提取上清中exosome。Western blot检测exosome表面标记物CD9,CD63,CD81,Nanosight分析对提取的exosome直径、分布、颗粒及表面标记进行鉴定。同时留取匹配的去exosome上清,ELISA检测exosome及去exosome上清中Wnt11表达情况。将不同处理的exosome和去exosome上清作用于皮肤细胞,检测皮肤细胞增殖和迁移能力的改变。
  结果:MTT结果显示hucMSC较肿瘤细胞对DIM显示出更强的耐受性,DIM IC50为158.11μM,我们选取既不损伤细胞活性又具有最强效应的浓度和时间,即50μM DIM作用hucMSC48小时。DIM预处理后的hucMSC(DIM-hucMSC)在体内明显加速大鼠深Ⅱ度烫伤修复,大体创面结痂脱落,表皮再生化完成,毛囊等附属结构增殖活跃,炎性浸润显著降低,组织学评分及治疗效率高于hucMSC治疗组。免疫组化检测结果显示DIM-hucMSC治疗组,损伤部位皮肤细胞增殖活跃。CK19表达及Ⅰ/Ⅲ型胶原表达比值均上调。免疫组化检测损伤组织中β-catenin的表达,DIM-hucMSC组也明显升高。体外检测DIM对hucMSC预处理作用,能明显上调其干性转录因子Oct4,Sox2,Nanog,Sall4的mRNA和蛋白表达水平,增强其核内表达。平板克隆和成脂、成骨诱导试验显示DIM-hucMSC较hucMSC呈现出更强的自我增殖和多向分化的诱导潜能,Adiponectin和ALP表达水平佐证了这一结果。蛋白液相芯片结果显示DIM-hucMSC旁分泌水平上调。荧光素酶报告基因检测显示DIM-hucMSC中Wnt信号活性增强,β-catenin表达上调且入核增加,转录稳定性提高。β-catenin信号通路抑制逆转了DIM-hucMSC中干性上调和旁分泌能力增强的作用,并在体内抑制了DIM-hucMSC的修复作用。慢病毒载体干扰Wnt11基因表达,Wnt11的干扰体外抑制了DIM-hucMSC中β-catenin的活化,体内削弱了DIM-hucMSC在烫伤组织中的治疗作用。收取DIM-hucMSC上清,发现上清同样具有上调hucMSC干性的作用。ELISA检测DIM-hucMSC上清中Wnt11分泌量增加,且去exosome上清中Wnt11表达含量较低。Exosome对Wnt11分子有效富集并成为其在细胞间传递,发挥生物学功能的主要活性形式。
  结论:DIM促进hucMSC中Wnt11蛋白的自分泌,活化自身Wnt/β-catenin信号通路,上调hucMSC自我增殖,多向分化和旁分泌水平,提高其在大鼠深Ⅱ度烫伤修复中的修复效率,为干细胞及干细胞成分治疗提供了新的方法和实验依据。
[博士论文] 余益民
公共卫生政策与管理 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:1、分析院前急救创伤患者的流行病学特征,为制定科学的创伤防控措施提供依据;2、探讨影响严重道路交通伤院前急救效果的危险因素,为完善创伤院前救治体系提供依据;3、通过对院前、急诊、院内创伤死亡病例综合分析,探寻每个急救阶段所存在的缺陷,为改善创伤整体救治体系和优化流程提供参考依据。
  方法:1、收集深圳市急救中心2011-2015年所有创伤患者调度出车及院前电子病历数据,导入SPSS19.0进行描述性统计分析;2、回顾性分析2011-2015年深圳市严重道路交通伤患者120调度出车及院前急救病历数据共488例,通过多因素Logistic回归分析,得出可导致严重道路交通伤患者院前急救无效的影响因素;3、通过急救死亡病例调查收集整理2014年深圳市急救网络医院创伤患者急救3天内死亡患者资料,综合运用与2004年数据纵向比较、可预防性死亡多因素Logistic回归分析及专家评价分析等方法寻找院前、急诊、院内病房各个阶段存在的主要缺陷。
  结果:1、5年间院前创伤患者逐年增加,在纳入的79480例创伤患者中,20~49岁青壮年占76.5%。一年中,以10-12月份创伤患者较多,二月份最少;一天中,以夜间20:00-22:00点较多,凌晨4:00-6:00点较少。救护车到达现场时间中位数为9.12min,救护车到达医院时间中位数为23.31min,各区急救反应时间不均衡。致伤原因前3位为交通伤、斗殴伤、跌倒伤,交通伤占42.74%,55岁之前的致伤原因前3位均为交通伤、斗殴伤、跌倒,56岁之后顺位改变为跌倒、交通伤和斗殴伤,跌倒居首位,占39.51%;下肢和脊柱受伤比例随年龄增长而增高;重伤原因以交通伤、高处坠落伤、刀砍刺伤、斗殴伤、酗酒致伤为主。2、488例严重道路交通伤患者中,院前急救无效347例(71.1%)。多因素Logistic回归分析提示受伤部位、昏迷、PHI、救援到达时间长、院前急救非规范化措施是决定院前急救无效的危险因素。3、2014年创伤患者中院前死亡构成比73.44%,2014年到达现场致死率92.71%;急诊死亡患者中,2014年会诊医师30分钟到场率58.62%;院内病房死亡病例中,会诊医师30分钟到场率、30分钟开始输血率及手术率均有不同程度下降,均在30%以下。创伤可预防性致死率达27.7%,可预防性相关影响因素有受伤地点、受伤机制、是否转院、死亡地点、死亡原因,不包括医院等级。急救死亡病例专家评价中,急诊死亡病例问题出现率最高,50.37%,流程问题占95.59%;系统问题在院内病房病例最多见,占50%。
  结论:1、深圳院前创伤患者的流行病学特点与其移民城市的性质密切相关,深圳市急救资源的配置仍然不均衡,老龄人创伤的流行病学分布不同于其他人群,值得重视。2、严重道路伤患者的受伤部位、PHI和是否发生昏迷,是院前急救效果的重要影响因素。缩短救援到达时间、规范院前急救措施有助于提高院前急救有效率,从而改善严重创伤的预后。3、院前死亡构成比、到达现场致死率均较高,应重视现场自救互救。可预防性死亡发生率高于发达国家,创伤院前急救——急诊——院内病房急救服务绿色通道实施仍未到位,急救措施缺乏标准化。总之,深圳创伤救治体系需要重新规划。
[硕士论文] 彭耀
生物医学工程 重庆理工大学 2017(学位年度)
摘要:统计数据显示十多年来中国交通事故死亡人数一直位居全球前列。而发生重大交通事故,导致高死亡的最主要的场所就是在高速路上。对于这样的结果,专家认为驾驶员缺乏安全意识、法制观念淡薄是主要原因;比如在高速路上倒车是一种极度危险,危害公共安全的违法行为,后果相当严重。可是,目前在中国的高速路上,尤其是下道口附近,这种违法倒车的行为屡见不鲜。对这类高速公路交通事故进行准确的事故重建分析,在责任认定、保险索赔、人体损伤防护、完善道路交通管理及相关法律法规等方面具有重要意义。
  我国交通法规虽然规定禁止高速公路上倒车的行为,但是由于驾乘人员安全意识淡漠,在高速路上不少驾驶员因路况不熟悉、或开小差而导致驶过下道口;本应行驶至前面的下道口掉头行驶,但为了节省时间或节约燃料,抱着侥幸心理而冒险采取倒车方式,而导致事故的发生。事故发生后,双方当事人各执一词,如何进行责任认定便是最大的难题。因此,如何确定前车是否为倒车,如何利用现有资料、技术解决高速公路上倒车问题尤为重要。有些高速公路倒车事故在有路面监控视频、车辆行车记录仪的情况下是很容易确定的;但是很多高速公路倒车事故中是没有任何监控及行车记录仪的,基于此,我们引入汽车EDR数据结合人体损伤、PC-Crash计算机仿真软件对事故发生前后车辆的行驶速度及行驶状态进行分析研究,还原事故真相。
  本研究在交通事故深度调查的基础上,筛选出两例典型的高速道路上的事故进行分析。通过对人体损伤进行分析,发现了典型的、严重的挥鞭样损伤。同时引入EDR数据进行深入分析,采用PC-Crash计算机仿真技术,结合动量守恒定律、人体损伤生物力学等方法对事故进行还原。通过对典型案例的事故重建,深入探讨如何运用综合的分析方法还原事故真相;通过对典型案例的人体损伤分析,研究事故中人员伤情机制,为交通事故人体损伤分析及防护提供真实可靠的研究数据。
[硕士论文] 司可可
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:皮肤是机体最大的器官,作为机体最表层,皮肤像一道屏障覆于机体的表面,起到保持皮肤水分,维持正常生理功能的作用。当皮肤受到外界损伤或者疾病等因素的影响而造成缺损时,会对生命体造成严重的危害,甚至危及生命。研究发现,细胞治疗有助于皮肤损伤的修复。本研究主要探讨由大鼠骨髓间充质干细胞(Rat Bone marrow mesenchymal stem cells,rBM-MSCs)诱导盼汗腺样细胞(sweat gland-like cells)与羊脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)复合后对创面愈合的影响。
  本研究以大鼠骨髓为材料来源,采用全骨髓贴壁法培养获得目的细胞。通过形态、增殖能力和表面标志的鉴定显示出所得细胞为rBM-MSCs。其次,通过将rBM-MSCs与大鼠热休克汗腺细胞(sweat glands cells,SGCs)共培养的方法进行细胞诱导。RT-PCR和细胞免疫荧光检测显示:诱导所得细胞为汗腺样细胞。随后,采用酶消化法制备出羊ADM,通过MTS法检测细胞毒性和HE染色检测其脱细胞程度显示:ADM脱细胞程度较为彻底,且没有细胞毒性。最后,分别将复合有汗腺样细胞的ADM和未复合汗腺样细胞的ADM覆盖于裸鼠损伤创面上。通过对创面愈合率、参与创面愈合的蛋白VEGF和Collagen-Ⅰ的表达情况、愈合创面细胞凋亡相关基因Bax/Bcl-2的相对表达量的变化的测定显示:汗腺样细胞复合羊ADM抑制了愈合创面组织的细胞凋亡并且加快了创面的愈合速率。综上所述,由BM-MSCs诱导分化的汗腺样细胞与羊ADM复合后抑制了愈合创面组织的细胞凋亡并且加快了创面的愈合速率。
[博士论文] 戴跃龙
中西医结合临床 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:大面积烧伤后微血管通透性增高导致大量血浆成分渗出,有效循环血量锐减,如缺乏及时有效的液体复苏,常导致休克发生。液体复苏虽可纠正低血容量状态,但烧伤后微血管通透性持续升高,重症烧伤患者常处在“边补边漏”的困境中,大量液体经由受损的血管内皮屏障进入组织间隙,而使组织水肿、器官功能障碍加重。因而,保护血管内皮屏障功能对于烧伤救治研究具有重要意义。缺氧与炎症损伤时烧伤后血管内皮屏障损伤的始动因子。血必净注射液广泛应用于烧伤、脓毒症、全身炎症反应综合征等疾病的治疗当中。既往研究显示血必净可降低烧伤患者炎症因子水平,部分恢复微血管收缩与舒张功能,但血必净对血管内皮屏障功能的影响尚缺乏研究。
  目的:
  1.研究血必净对烧伤后血管内皮屏障结构损伤、功能损害的保护作用;
  2.探讨血必净作用机制是否与减轻烧伤后缺氧与炎症损伤有关,为其用于烧伤休克治疗,特别是无静脉补液条件下早期救治研究提供实验依据。
  方法:
  1.血必净对烧伤后血管内皮屏障的保护作用
  建立50%TBSAⅢ度烫伤大鼠模型,并随机分为4组:①假烫+生理盐水组(Sham+NS);②假烫+血必净组(Sham+XBJ);③烫伤+生理盐水组(Scald+NS);④烫伤+血必净组(Scald+XBJ),于伤后10min内,腹腔注射4ml/kg血必净注射液(②④组)或等量生理盐水(①③),并于伤后2h、6h取材检测肺微血管通透性(伊文斯兰法)、组织含水率(干湿重法)、病理损伤评估(HE染色、Gloor评分)、VE-cadherin、ZO-1(Western blot)及Syndecan-1水平(免疫荧光)变化。此外,采用Kaplan-Meier分析评价血必净对烫伤大鼠生存率的影响。
  原代培养大鼠肺微血管内皮细胞(RPMEC),通过烫伤大鼠血清刺激模拟烧伤后血管内皮屏障损伤。跨膜电阻法(TER)评价RPMEC单层通透性变化。RPMEC随机分为4组:①10%/20%假烫血清刺激组;②10%/20%烫伤血清刺激组;③10%/20%PBS/血必净预处理+20%假烫血清刺激组;④10%/20%PBS/血必净预处理+20%烫伤血清刺激组,测量血清刺激后30、60、120、180、240min TER指标变化,评价血必净对RPMEC单层通透性的影响。
  2.血必净减轻烧伤后血管内皮屏障损伤的机制
  50%TBSAⅢ度烫伤大鼠分组处理同前,分别于烫伤后2h、6h,Western blot检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)水平变化,ELISA法分析VEGF、TNF-α、IL-6及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平变化。
  RPMEC随机分为4组:①PBS预处理+假烫血清刺激组;②血必净预处理+假烫血清刺激组;③PBS预处理+烫伤血清刺激组;④血必净预处理+烫伤血清刺激组,测量血清刺激后4h后各组VEGF、TNF-α、IL-6水平变化。
  结果:
  1.血必净对烧伤后血管内皮屏障的保护作用
  与假烫组相比,烫伤后2h,烫伤大鼠肺组织含水率、EB含量、病理损伤评分即开始升高,烫伤后6h上升趋势更为明显(P<0.05);血必净干预组上述指标优于生理盐水对照组(P<0.05)。此外,烫伤后2h大鼠肺组织VE-cadherin、ZO-1蛋白表达水平降低,分别为假烫组的0.75倍、0.55倍;伤后6h下降更为明显,分别为假烫组的0.39、0.36倍;伤后2h烫伤大鼠肺组织Syndecan-1表达水平降低,血必净干预组上述指标优于生理盐水对照组(P<0.05)。血必净干预组大鼠平均生存时间明显长于生理盐水对照组(582.1±21.2 VS345.8±25.4 min, P<0.01)。
  与假烫血清刺激相比,烫伤血清刺激后RPMEC跨膜电阻(TER)持续下降,通透性持续升高;高浓度烫伤血清(20%)刺激后内皮细胞TER下降更为明显(P<0.05)。血必净高剂量干预组(20%体积分数)TER高于PBS对照组(P<0.05);血必净低剂量组与对照组相比,无统计学差异。
  2.血必净减轻烧伤后血管内皮屏障损伤的机制
  烫伤后2h,烫伤大鼠HIF-1α、MLCK水平即开始升高,分别为假烫组的3.0倍、2.1倍;伤后6h升高更为明显,分别为假烫组的3.6倍、2.8倍;同时间点血必净干预组HIF-1α、MLCK水平低于生理盐水对照组(P<0.05)。此外,烫伤大鼠VEGF、TNF-α、IL-6、MMP-9水平均高于假烫组(P<0.01),同时间点血必净干预组上述指标低于生理盐水对照组(P<0.01)。
  烫伤血清组RPMEC炎症因子VEGF、TNF-α、IL-6水平明显高于假烫血清组(P<0.01),血必净预处理组VEGF、TNF-α、IL-6水平低于PBS对照组(P<0.01)。
  结论:
  严重烧伤后出现明显的血管内皮屏障损伤,表现为血管内皮表面糖萼损伤、内皮细胞间连接破坏、血管通透性增高,进而导致组织水肿、器官功能障碍的发生。烧伤后缺氧与炎症反应通过激活HIF-1α及其下游因子MLCK、VEGF,以及炎症因子TNF-α、MMP-9、IL-6可多层次损伤血管内皮屏障结构,造成内皮屏障功能受损。血必净可减轻烧伤后血管内皮屏障结构损伤(内皮表面糖萼、细胞间连接),保护内皮屏障功能,其机制与其抑制HIF-1α及其下游因子MLCK、VEGF激活,降低炎症因子TNF-α、MMP-9、IL-6水平,减轻烧伤后缺氧与炎症损伤有关。
[硕士论文] 邹琼
外科学(烧伤) 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  严重烧伤将引起机体免疫功能的紊乱,而后者则被认为是导致烧伤患者发生多种难以控制的并发症如多器官功能障碍综合征(MODS)、全身炎症反应综合症(SIRS)的重要因素之一。现阶段针对烧伤后免疫功能变化的研究多是对免疫细胞及免疫因子的作用机制入手,亦或者从感染是器官功能损害方面出发,并无对烧伤后基因转录水平变化进行深入的研究与分析。而对基因芯片数据的分析以及生物信息学技术的应用能帮助寻找出在烧伤早期潜在的诊断及治疗的靶标。
  本课题组在前期选取并研究分析了GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中小鼠烧伤后早期白细胞基因芯片的数据,发现烧伤后小鼠白细胞表现为多种生物学过程的紊乱,其中免疫系统过程、刺激反应等生物学过程贯穿整个烧伤早期,有研究显示Myd88、Stat3、Stat1、Jun等基因在烧伤早期刺激反应过程中起着重要的作用。为从分子水平了解烧伤后免疫相关基因的表达情况的变化,并筛选出在其中占据重要位置的差异基因靶标,本实验利用生物信息学方法对小鼠烧伤早期免疫细胞差异基因表达谱进行分析并构建蛋白互作网络,筛选在烧伤后免疫系统功能变化过程中起到重要作用的潜在生物学靶标,利用实时荧光PCR及Western blotting对所筛选的基因表达变化情况进行验证,以期从分子水平了解烧伤后免疫功能变化情况,为临床上烧伤早期诊断及治疗靶点的筛选提供新方向。
  研究目的:
  利用生物信息学方法对小鼠烧伤早期免疫细胞差异基因表达谱进行分析,筛选相关差异基因,并对所筛选的基因表达情况进行验证,以期找到潜在的诊断及治疗靶标。
  研究方法:
  1.基因芯片数据处理及分析
  从NCBI的GEO数据库下载GSE7404数据集。对烧伤后1天的样本进行分析,共8个样本(小鼠,25%TBSAⅢ°烧伤,全血游离白细胞),其中4个为烧伤组,4个为对照组。
  2.差异表达基因的获取
  差异基因的获取及统计分析采用开源统计软件R3.02版本(http://www.r-project.org)进行。采用RMA(robust multiarray average)对原始数据进行背景矫正,配对样本t检验和倍比法(fold change,FC)获取差异表达基因。
  3.功能富集分析及免疫相关差异基因蛋白互作网络的构建与分析
  将差异基因经DAVID进行ID转换后输入到STRING9.1数据库中,选取中等可信度(交互作用评分大于0.4)的互作关系构建免疫相关差异表达基因的蛋白互作网络(Protein-protein interaction network,PPI),并对差异基因进行GeneOntology(GO)功能富集分析,网络分析及MCL子网络聚类分析采用生物图表可视化工具Cytoscape软件进行。
  4.免疫相关基因靶标表达的检测
  选取32只健康成年BALB/c小鼠,体重20-22g,雌雄不限。随机分为两组,第一组为假烫伤组(sham组)、37度温水。第二组为烫伤后1d组,小鼠用1%的戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉后,背部备皮,将背部脱毛区域置于97℃热水中烫伤15秒(建立三度烧伤模型),烫伤后立即腹腔注射生理盐水抗休克处理。各组小鼠按分组的时间点行眼部取血,提取血液中的白细胞,然后提取mRNA及蛋白,实时荧光PCR及Western blotting检测小鼠烧伤后白细胞中LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1的相对表达情况。
  5.统计分析:
  采用开源统计软件R3.02版本及SPSS19.0统计软件进行数据分析。原始数据进行RMA背景矫正,采用配对样本t检验和倍比法获取差异表达基因,同时满足p-value<0.01以及|logFC|>1,且表达量变化为2倍者为差异基因。实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。
  研究结果:
  1.基因芯片分析结果
  共有1825个差异基因,其中上调基因658个,下调基因1167个。
  2.差异表达基因蛋白互作网络的构建与分析
  将差异基因构建蛋白互作网络,该网络共有1211个节点,5176条边组成。在蛋白互作网络中位于中心位置的蛋白具有最大的互作关系,并且在疾病的进展过程中可能发挥重要的作用。在蛋白互作网络中,STAT1,JUN,LCK,CD40,STAT3,CD19,CD86,CDKn1a,CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作关系。运用BinGo筛选PPI网络中关联紧密的模块,发现LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1这5个基因在相应的子网络中占据中心位置,并且在烧伤后早期免疫过程发挥重要作用。
  3.检测小鼠烧伤早期免疫相关基因靶标的表达
  Jun和Cdk1烧伤后第1天mRNA表达量较sham组增加(P<0.05),其蛋白表达量较sham组明显增加(P<0.01);Stat1烧伤后第1天mRNA表达量较sham组下降(P<0.05),蛋白表达量较sham组明显下降(P<0.01),这与芯片数据分析结果相一致。但LCK及CD19烧伤后第1天的表达量较sham组增加,与蛋白互作网络分析结果不一致,且与sham组无统计学差异(P>0.05)。
  研究结论:
  1.小鼠烧伤后细胞存在免疫系统过程、应对刺激反应等方面的紊乱。
  2.在免疫相关基因的蛋白互作网络中,STAT1,JUN,LCK,CD40,STAT3,CD19,CD86,CDKn1a,CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作关系。而LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1这5个基因在相应的子网络中占据中心位置,可能在烧伤早期免疫系统功能变化过程中起着重要的作用。
  3.在后续的验证试验中发现STAT1、JUN和CDK1基因表达情况与数据分析结果相一致,但LCK及CD19在烧伤后第1天的变化情况较对照组比较无统计学意义。由此提示STAT1、JUN和CDK1基因可能在烧伤后免疫系统功能变化过程中起到重要作用。
[博士论文] 应龙
车辆工程 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:儿童乘员作为交通事故中的弱势对象,其身体结构与损伤机理均与成人存在差异,针对成人开发的约束系统难以对儿童提供有效保护。根据道路交通事故统计,儿童胸部损伤致死率高,损伤数量仅次于头部。目前,有关儿童胸部损伤机理的研究还未充分展开,各国损伤准则对儿童乘员的保护尚不健全,儿童的损伤耐受阈值仍需进一步的研究与确立。同时,现有假人模型胸部结构简单,不能直接、准确的反映儿童胸部骨骼、软组织损伤。因此,开发符合我国儿童身材与生理特征的人体生物力学模型,具有十分迫切的现实意义。针对上述问题,本文在大量文献研究的基础上,自主开发并验证了符合我国儿童身材的6岁儿童胸部生物力学模型,并利用校车正面碰撞工况完成儿童胸部骨骼损伤机理研究。本文的主要工作及创新点如下:
  (1)根据我国儿童身材统计数据特点,在合理范围内筛选出我国6岁儿童新鲜尸体进行CT扫描。通过DICOM图像逆向建立了头部、颈椎以及胸部几何模型。对胸部模型进行体网格划分,完成包括胸骨、肋软骨、肋骨、心肺、肌肉与皮肤的胸部有限元模型。结合成人材料参数缩放,实际建模经验与验证材料参数反求,完成各部分材料参数定义。在此基础上,构建6岁儿童生物力学胸部人体模型(PEdiatric BIomechanical Thorax Human Model,PEBIT Humanmodel)。
  (2)根据成人胸部碰撞实验缩放通道与儿童尸体胸部碰撞实验,建立6岁儿童胸部生物力学模型动态响应仿真模型。对比实验数据与仿真结果,获得胸部力、胸部变形量与胸部力-变形曲线的良好吻合,验证胸部生物力学模型的准确性。
  (3)鉴于校车碰撞为6岁儿童乘员普遍乘坐的危险工况,采用校车正面碰撞,两点式与三点式安全带约束,对比多体假人、MADYMO人体模型与PEBIT人体模型在碰撞过程中的整体运动姿态、各部分运动轨迹与脊椎运动形态。首创提出运动位移误差与运动趋势误差计算理论,定量分析MADYMO人体模型与PEBIT模型在不同约束系统下的运动轨迹相似度,结果误差值基本小于10%。表明所建PEBIT人体模型与MADYMO人体模型在运动结果与过程上都具备充分的一致性的同时,能够完成胸部子结构损伤分析。完成PEBIT人体系统级验证,使模型可直接运用于整体加载工况。PEBIT人体模型胸部良好的回弹特性使头部运动轨迹更符合真实生物力学响应。
  (4)采用PEBIT人体模型进行校车正面碰撞中的胸部骨骼损伤机理分析。通过波形简化,提取校车碰撞波形特征参数,建立不同外载加速度下的系列正碰工况。采用三点式安全带约束,对PEBIT人体模型进行系列工况下的动态响应仿真。均布选取胸部中心的第四肋骨处胸骨-肋软骨-肋骨内外侧为局部参考点,通过应力应变分析初步确定正面受载下肋骨腔危险区域。结合云图分析,确立能够反映胸部骨骼整体危险部位的全局参考点。
  根据全局参考点应变,首次提出基于失效应变的胸部骨折风险函数,由潜在损伤、损伤转换与损伤预测三个阶段。潜在损伤阶段表明骨骼在未发生实际损伤前,可能发生损伤的潜在危险程度;损伤转换阶段代表潜在损伤向实际损伤的转换过程;损伤预测阶段能够在不同失效应变下准确反映胸部实际骨折数量。求得当失效应变为0.04,骨折风险为23.9%时,骨骼由潜在损伤转变为实际损伤;风险超过27.2%后,函数进入预测阶段。
  (5)解析胸部骨折风险函数与胸部损伤评价准则之间的关系。建立胸部加速度、胸部压缩量、安全带力、VC值,并引入的胸部骨骼耗散能量、肺部耗散能量,建立各项目与外载加速度间的拟合关系,进而完成胸部骨折风险函数、肺部主应变值与各评价准则间的关系。结果表明胸部骨折风险与胸部压缩量的高度线性关系,肺部损伤与其自身耗散能量的明显线性关系,总结了骨骼与肺部的损伤机理。并确定当胸部压缩率达到25.76%时,肺部开始出现损伤,而压缩率达到29.23%时,骨骼开始出现损伤。
  本文开发的6岁PEBIT人体模型,其胸部具有较高生物仿真度,可用于整体碰撞工况中加载,是评价汽车正面碰撞安全中6岁儿童胸部损伤的有效工具,对于儿童胸部损伤研究,约束系统在正面碰撞中的开发与保护效果提升具有重要意义。
[硕士论文] 孙岳
临床医学(外科学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的
  在烧伤创面削痂清创术联合邮票皮片或大张皮植皮术后,包扎换药成为常规的后续创面治疗。这种治疗常引起创面的感染、局部水肿以及皮片成活率低及创面愈合不理想等不良反应。现负压创面治疗技术(vacuum sealing drainage,VSD)被应用于临床削痂植皮术后的治疗。本研究旨在量化对比广泛深度烧伤(extensive deep burns,EDB)后的患者行削痂植皮术(tangential excision and skingrafting,TESG)联合VSD技术治疗与削痂植皮术联合传统治疗对创面愈合过程中皮片愈合及预后质量的影响,分析探讨其影响因素。以期为临床应用VSD技术的可行性提供一定的临床参考。
  方法
  回顾性调查2014年3月至2016年12月山东大学附属济南市中心医院烧伤科连续收治的35例深Ⅱ度~Ⅲ度烧伤行削痂植皮术联合VSD技术治疗(A组),以及43例深Ⅱ度~Ⅲ度烧伤行削痂植皮术联合传统治疗(B组)患者的资料。通过单因素方差分析与卡方检验比较A、B组两种不同的后续治疗方法在首次植皮成功率、术后14d植皮成活率、创面愈合时间、愈合质量、换药次数以及住院费用上的差异。
  结果
  (1)A组共35例38次手术纳入研究,男17例,女18例,年龄(31.74±30.67)岁,烧伤总面积(6.83±5.95)%TBSA,深Ⅱ度面积(4.37±5.24)%TBSA,Ⅲ度面积(2.46±1.77)%TBSA;B组共43例49次手术纳入研究,男25例,女18例,年龄(35.44±23.69)岁,烧伤总面积(8.09±7.45)%TBSA,深Ⅱ度面积(5.12±6.40)%TBSA,Ⅲ度面积(2.98±1.99)%TBSA。两组患者以上资料经单因素方差分析及卡方检验比较,差异无统计学意义(P>0.05),对结果无影响。
  (2)A组35例病人有3例须再次行植皮手术;B组43例病人有6例须再次行植皮手术。A组术后14d植皮成活率(87.43±19.79)%TBSA、B组术后14d植皮成活率(75.00±25.10)%TBSA;A组愈合时间为(22.06±10.79)d,B组愈合时间为(28.74±13.37)d;A组换药次数为(5.77±3.17)次,B组换药次数为(9.53±4.05)次;A组愈合质量有21例优,10例良,3例良,1例差。B组愈合质量有13例优,17例良,7例中,6例差;A组住院费用为(40282.49±17464.59)元,B组住院费用为(35301.60±30587.53)元。两组患者以上资料经单因素方差分析及卡方检验比较,其中首次植皮成功率、住院费用无统计学意义(P>0.05)。术后14d植皮成活率、愈合时间、愈合质量有统计学意义(P<0.05)。换药次数有紧密的统计学意义(P<0.01)。
  结论
  对广泛深度烧伤创面采用削痂植皮术联合负压创面治疗技术与传统治疗相比,有效缩短了残余创面的愈合时间,提高了术后14d植皮成活率,提高了愈合质量,明显地减少了平均换药次数。尽管治疗组的住院费用平均数高于传统组,但在统计学上并无明显差异。在手术次数上,两种治疗方法的首次植皮成功率都很高,在统计学上无明显差异。可能由于缩短了住院时间,所以其在住院费用上并没有明显高于传统治疗方法,总体上来说值得在临床推广应用。
[硕士论文] 陈彬雄
外科学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  分析总结近年来我科重度以上烧伤病人早期血糖变化情况,探讨严重烧伤早期血糖变化的影响因素,及其对临床预后的影响,为今后临床诊治提供参考借鉴。
  方法:
  收集自2013年1月至2016年5月我院烧伤整形外科所收治的122例重度和特重度烧伤患者的临床资料,包括患者的年龄、性别、有无休克延迟复苏、烧伤原因、烧伤面积、吸入性损伤发生率、早期随机血糖、全身性感染发生率、死亡率、住院时间、感染部位数量以及MODS发生率。应用SPSS19.0统计学软件进行T检验等统计分析.
  结果:
  通过单因素分析,烧伤面积与早期血糖具有线性关系,相关系数R2=0.534,P<0.05;各年龄组早期随机血糖对比,差异具有统计学意义(F=6.91,P<0.05);休克延迟复苏组和非休克延迟复苏组早期血糖对比,差异有统计学意义(T=3.58,P<0.05);不同程度的吸入性损伤间烧伤早期血糖对比,差异具有统计学意义(F=24.79,P<0.05);不同的烧伤原因间烧伤早期血糖对比,差异具有统计学意义(F=7.02,P<0.05)。但经COX回归分析,显示只有休克延迟复苏、重度吸入性损伤、Ⅲ度烧伤面积、深Ⅱ度烧伤面积四个因素与烧伤早期血糖变化相关联,血糖异常组和正常组间对比,住院时间、全身感染发生率、感染部位数量、死亡率差异具有统计学意义(P<0.05),血糖异常组住院时间大于正常组,异常组全身感染发生率高于正常组,异常组感染部位数量多于正常组,异常组死亡率高于正常组,多器官功能障碍发生率差异无统计学意义(X2=2.064,P>0.05)。
  结论:
  ①烧伤深度、面积、休克延迟复苏、重度吸入性损伤四个因素是影响严重烧伤早期血糖变化的主要因素。
  ②患者性别、年龄以及烧伤原因与严重烧伤早期血糖变化无相关联。
  ③早期血糖升高增加烧伤患者死亡率、住院时间、感染发生率,但对多器官功能障碍发生率影响较小。
[博士论文] 王枭
免疫学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  2013年数据统计显示,每年因创伤就医的人次高达9.7亿,死于创伤的人数达480万。与此同时,创伤占全球疾病总负担的10%,是最为严重的全球性公共健康问题之一。近年来,随着急救技术的进步,在创伤早期因伤导致的直接死亡率已显著下降,但创伤后期并发症仍严重威胁患者的生存。脓毒症(sepsis)和多器官功能障碍综合征(MODS)是创伤后期较为常见的严重并发症。因此,如何有效地防治脓毒症和MODS等严重并发症,是提高创伤救治水平的关键。
  近年来,我们在危重病患者的救治和管理中取得了重大进展,但脓毒症的发病率和死亡率仍然居高不下。目前,脓毒症还没有特效的治疗方法。因此,早期预警、早期诊断是脓毒症救治的关键。生物标志物是指在不同生物学水平上特异性反映机体生理、病理或治疗过程中某种特征性变化的指标,是疾病早期预警诊断最常用的方法。目前已有多项关于脓毒症预警诊断标志物的研究,但均未获得令人满意的结果。脓毒症是一种涉及多器官、多系统的疾病综合征,发病机制极为复杂,单一标志物对脓毒症的诊断价值极其有限。因此,从基因、分子、细胞等多个层面系统地探寻创伤后脓毒症的敏感标志物,建立多种标志物联合的预警诊断模型,可能会提高对脓毒症的预警诊断效率。
  材料与方法:
  通过Tagger软件,从CXC趋化因子基因家族中挑选出13个标签SNP位点。在3个独立的创伤人群中(1个筛选人群,2个验证人群,总共1700人),使用iMLDR方法对筛选出的SNP位点进行分型。计数在创伤人群中各标签SNP的基因型分布,并分析在显性遗传模式下、隐性遗传模式下各基因型与创伤后脓毒症的发生率及多器官功能障碍评分的关系。
  采集严重创伤患者伤后2小时内的外周血,使用脂多糖刺激后,分离血浆。并通过ELISA方法检测血浆中IFN-γ、IL-10、IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-4、LBP、HMGB1等9种细胞因子的表达水平。
  在创伤后1、3、5、7、14天,通过流式细胞术检测HLA-DR比例、CD64指数、CD4/CD8比值、NK细胞、Treg细胞比例;通过液相芯片技术检测38种细胞因子的表达水平。
  结果:
  在筛选人群中,通过关联分析发现rs1429638、rs2297630位点与创伤后脓毒症发病率显著相关。在2个独立的验证人群中,rs1429638、rs2297630位点仍与创伤后脓毒症具有显著的相关性。在总人群中,rs1429638位点与创伤后脓毒症及多器官功能障碍评分存在显著的相关性;rs2297630位点与创伤后脓毒症存在显著的相关性。
  Rs2297630位点与脂多糖刺激后血浆中IL-6的表达水平相关,即携带rs2297630 A等位基因的患者IL-6表达水平更高。线性回归分析同样表明rs2297630位点与IL-6的相关性。
  在创伤早期,HLA-DR、CD64对创伤后脓毒症有一定的诊断价值,ROC曲线下面积最大分别为0.84与0.80。将HLA-DR、CD64、CD4/CD8联合后,可在脓毒症临床诊断前2天较好地预警脓毒症的发生,ROC曲线下面积可达到0.83。联合G-CSF、GM-CSF、IL-10、MDC、IL-15等5种细胞因子,能较好地诊断脓毒症。在创伤后第3、5、7天,诊断脓毒症的ROC曲线下面积均可达到1.00。
  结论:
  本研究探索了CXC趋化因子家族基因多态性与创伤后并发症的关联意义。发现CXCL1基因中的rs1429638位点与创伤后脓毒症及多器官功能障碍评分存在显著的相关性;CXCL2基因中的rs2297630位点与创伤后脓毒症存在显著的相关性。这两个SNP位点可以作为创伤后脓毒症的基因标志物。
  HLA-DR、CD64、CD4/CD8可作为创伤后脓毒症预警诊断的标志物,将3种标志物联合后可提高对脓毒症的预警诊断效率。此外,多细胞因子的联合检测或许是一种非常有前景的脓毒症诊断方法。
[硕士论文] 吴亚军
烧伤整形外科学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过采集并分析2013年3月至2017年2月广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科儿童烧伤住院患者流行病学数据,建立儿童烧伤流行病学数据库,为制定干预措施,降低儿童烧伤率提供临床依据。
  方法:收集广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科2013年3月至2017年2月收治住院的1158例0至14岁儿童烧伤的病例资料,并对年龄、性别、致伤原因、受伤季节、城乡分布及烧伤严重程度等进行回顾性统计分析。
  结果:4年中,广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科共收治1158例烧伤儿童。其中,男性烧伤患儿占61.0%(706例),女性患儿占39.0%(452例),男∶女=1.56∶1。3-7岁年龄组儿童比例最高占54.5%(631例),其次,0-3岁年龄组儿童占34.2%(396例),7-14岁年龄组儿童比例最低11.3%(131例)。乡村患儿占71.5%(828例),城市患儿占28.5%(330例)。乡村患儿∶城市患儿为2.51∶1,乡村患儿比例明显高于城市。5%TBSA以下者占14.9%(173例),5-15%TBS之间(包括5%TBSA)者占47.7%(552例),15-25%TBSA之间(包括15%TBSA)者占21.2%(246例),25%TBSA及以上者占16.2%(187例)。轻度烧伤患儿占8.8%(102例),中度烧伤患儿占46.6%(540例),重度烧伤患儿占27.4%(317例),特重度烧伤患儿占17.2%(199例)。致病原因中,热水、热油、热汤等烫伤者占86.7%(1004例)。火焰、烟花、电火花等火焰烧伤者占9.6%(111例),电损伤占2.3%(27例),强酸、强碱等化学烧伤占1.4%(16例)。致病季节中,春季占25.2%(292例),夏季占22.9%(265例),秋季占23.7%(275例),冬季占28.2%(326例)。儿童烧伤后至入院期间,看护者未及时处理有448例,创面冷水冲洗、冰敷、烧伤膏、直接外院处理有381例,其他如涂抹牙膏、蜂蜜、芦荟、尿液、中药、白酒等有329例。入院后,创面需要手术治疗的有312例,通过换药等非手术治疗者有846例。其中输血治疗有266例,未输血者有892例。住院时间中,住院时间≤7天出院有577例,7<住院天数≤14天出院者有314例,14<住院天数≤21天出院者有130例,3周以上患儿有137例,死亡率为0.3%(3例)。根据患儿医保覆盖情况,其中自费484例,医保支付674例,人均治疗费用为1.4243万元。
  结论:2013年3月至2017年2月,广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科收治的住院患儿中,男孩比例明显高于女孩、3-7岁年龄组构成比最高、热液烫伤仍为主要致伤因素、农村儿童发病率高于城市儿童、烧伤在2月份所占比例最高,其次是10月份,冬季所占比例最高,其次是春季。伤后现场能基本正确、简单地处理创面者占32.9%。
[博士论文] 吴海斌
外科学(烧伤) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  增生性瘢痕往往是皮肤在遭受创伤或重度烧伤后难以避免的愈合结果。瘢痕继续发展还会导致皮肤瘙痒、活动受限、外观畸形以及挛缩等诸多问题,给患者生理和心理两方面均造成不良影响。据统计,每年有数百万人遭受瘢痕带来的身心伤害,生活质量很差。由于传统治疗手段难以产生满意的效果,因此迫切需要寻找一种新的治疗方式来防治增生性瘢痕。
  1991年Bradham等首先在人脐静脉内皮细胞培养基中发现人类CTGF。CTGF作为一类基质细胞蛋白,主要表达于成纤维细胞、肝星状细胞、软骨细胞等间质细胞,在机体生长发育及损伤时表达相应增加。CTGF病理生理功能主要是刺激细胞有丝分裂、粘附、凋亡、ECM合成分泌以及促进其他类型细胞的迁移,同时它还能够改变其他分子的活性。最近,越来越多文献证实CTGF在病理性瘢痕真皮层中过量表达,但是其参与瘢痕形成的具体机制仍不十分清楚。
  干扰(interference RNA) RNA是一种短双链RNA,作为一种基因沉默技术,其可以与mRNA互补配对并促使其降解,最终发挥特异性基因阻断作用。siRNA作为RNAi技术的一种,相比反义核酸技术,具备基因抑制率高、特异性强以及浓度低等优势,在基因功能研究领域已得到广泛应用。然而,由于体内外环境的复杂性,诸如核酸酶等酶类的存在,本身就不稳定的裸siRNA在进入细胞和胞核前极易被降解,因此总体转染效率不高。之后虽然化学修饰或病毒载体等一些改进措施可以延缓其降解,但又带来细胞毒性大、效果差等缺点。因而,急需寻找一种更理想的转染载体来介导siRNA进入细胞并发挥基因阻断效应。
  壳聚糖是一种非病毒载体,具有细胞毒性低、免疫原性低、降解性好和生物相容性良好等优点。此外,作为唯一一种天然阳离子材料,壳聚糖还可以与带负电荷的核酸如DNA、siRNA以及miRNA等结合形成纳米复合物。壳聚糖纳米载体主要通过增进与带负电细胞膜的粘附和避免siRNA被内源性核酸酶降解两个方面来提高siRNA的基因干扰效率。近年来,壳聚糖纳米粒作为一种安全、经济的非病毒载体,已经获得了越来越多的关注。
  基于以上背景,本研究通过将载siCTGF壳聚糖纳米粒应用于新愈合兔耳皮肤创面,通过靶向干扰CTGF的表达及其生物学功能,进而抑制成纤维细胞过度增殖、分化以及减少胶原蛋白合成沉积,最终发挥减轻瘢痕形成的作用。载siCTGF壳聚糖纳米粒有望成为一种安全、有效的瘢痕防治技术。
  第一部分构建siCTGF以及筛选最佳干扰序列
  研究目的:分离培养及鉴定原代瘢痕成纤维细胞;确认构建序列的有效性并筛选最佳干扰序列。
  研究方法:采用组织块贴壁和胰蛋白酶联合消化的方法,分离培养瘢痕成纤维细胞,并采用流式细胞术鉴定瘢痕成纤维细胞。参照siRNA设计原则,应用RNA在线设计软件,设计3段RNA干扰序列,分别转染瘢痕成纤维细胞,并以无同源性的乱码siRNA作为对照组,应用RT-PCR、蛋白印迹等方法检测各组细胞CTGF mRNA及蛋白的表达,比较分析后选出沉默效率最大的一组siCTGF。
  研究结果:该改进的方法能够快速分离出高活性的成纤维细胞,流式细胞仪得到FSP阳性率可达94.37±1.31%。该合成方法所构建的siRNA能成功转染成纤维细胞。与未转染组和乱码组相比,候选序列3的基因抑制效率最高,CTGFmRNA表达降低到0.294±0.093倍,CTGF蛋白表达降低到0.33±0.065倍,均有统计学差异(P<0.05)。
  研究结论:干扰序列3的成纤维细胞CTGF基因沉默效率最高。
  第二部分载siCTGF壳聚糖纳米粒的制备及相关特性的研究
  研究目的:探讨载siCTGF壳聚糖纳米粒制备方法及其相关物理特征。
  研究方法:采用经改进的离子胶凝法,通过对分子量、氮磷比等条件进行摸索来制备载siCTGF壳聚糖纳米粒。粒径分析仪和透射电镜分别检测纳米粒平均粒径和电位,紫外分光光度计计算载药率,同时对其在体外的控释周期以及细胞毒性实验进行测定,最后完成纳米粒在细胞内的示踪。
  研究结果:投射电镜图像显示壳聚糖纳米粒呈圆形颗粒,大小一致,分布均匀,平均粒径在98.3±2.7nm左右。粒径分析仪测得zeta电位为15.3±4.2mV。siCTGF的包封率为96.5±2.4%。在PBS溶液中体外控释周期最长可达6天。CCK8细胞毒性实验提示空白对照组与阴性对照组相比,各浓度壳聚糖纳米粒组未见明显细胞毒性,无统计学差异(P>0.05)。
  研究结论:本方法制备的壳聚糖纳米粒具备粒径小、细胞毒性低以及体外控释周期长等特点,是一种较好的基因转染载体。
  第三部分体外实验评价载siCTGF壳聚糖纳米粒对瘢痕成纤维细胞的作用
  研究目的:评价体外应用载siCTGF壳聚糖纳米粒对成纤维细胞纤维化基因表达的抑制效果。
  研究方法:实验按照空白对照组、载乱码RNA壳聚糖纳米粒组、三种浓度载siCTGF壳聚糖纳米粒组(50nmol/ml,100nmol/ml,200nmol/ml)分成5个组。选用CCK8试验方法比较各组对瘢痕成纤维细胞增殖效率的影响;RT-PCR、Western-blot等技术测定目标基因CTGF、细胞外基质成分Ⅰ型胶原以及细胞分化标志α-SMA的表达。
  研究结果:CCK8法结果显示相比空白组和阴性对照组,各浓度载siCTGF壳聚糖纳米粒组细胞增殖得到不同程度抑制,均存在统计学差异(P<0.05)。RT-PCR、Western-blot等技术测定目标基因CTGF、细胞外基质成分Ⅰ型胶原以及细胞分化标志α-SMA表达,结果显示载siCTGF壳聚糖纳米粒组3种基因的表达水平均明显低于空白组和阴性对照组(P<0.05),又以200nmol/ml载siCTGF壳聚糖纳米粒组下降程度最高。
  研究结论:体外应用载siCTGF壳聚糖纳米粒能有效抑制成纤维细胞增殖,Ⅰ型胶原蛋白合成以及向肌成纤维细胞转分化。
  第四部分局部应用载siCTGF壳聚糖纳米粒对兔耳瘢痕增生的影响
  研究目的:评价局部应用载siCTGF壳聚糖纳米粒对瘢痕增生的抑制效果。
  研究方法:实验动物按照空白对照组、载乱码RNA壳聚糖纳米粒组,三种浓度载siCTGF壳聚糖纳米粒组分成5组。采用活体成像仪监测纳米粒在裸鼠体内的控释周期;建立兔耳瘢痕模型,局部注射不同浓度载siCTGF壳聚糖纳米粒,肉眼观察局部创面瘢痕增生的大体图像,并超声探测仪动态监测治疗过程中瘢痕厚度的变化。采用免疫组织化学染色法检测局部真皮内CTGF的表达分布,胶原合成(Ⅰ型胶原)以及向肌成纤维细胞转分化(α-SMA)的情况差异,并采用Masson三色染色法观察真皮内胶原的堆积及排列情况。同时,提取皮肤组织蛋白,采用Western-blot技术检测各组皮肤内CTGF、Ⅰ型胶原、α-SMA三种蛋白的表达差异。
  研究结果:纳米粒组裸鼠创面可观察到红色荧光并持续到第5天。大体图像可见第2周创面基本愈合,之后开始向外增生突起,到第6周增生达到顶峰,B型超声结果显示相比空白对照组和载乱码RNA壳聚糖纳米粒组,三种浓度载siCTGF壳聚糖纳米粒组超声测量值(瘢痕厚度)呈现不同程度下降,有统计学差异(P<0.05)。组织学结果显示治疗组真皮内CTGF蛋白表达减少,而其他纤维化相关因子表达也有不同程度下降,且Masson染色显示载siCTGF壳聚糖纳米粒组胶原堆积减少且排列较规则。
  研究结论:载siCTGF壳聚糖纳米粒能有效减轻兔耳瘢痕增生,在增生性瘢痕防治中具有较大的应用前景。
[硕士论文] 虞芳
全科医学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:创伤后严重出血的患者往往伴随有机体血容量的大量丢失及凝血功能的紊乱,病情危重的患者常早期出现创伤性凝血病的表现。研究证实,采用大量输血救治创伤后严重出血的患者,可以及时补充机体血容量、改善凝血功能紊乱状态,提高创伤后严重出血患者的生存率。大量输血是指伴有严重活动性出血的患者在短时间内输注大量血制品,即24h内输注红细胞≥10U。创伤后严重出血的患者死亡率高,因此,采取大量输血进行救治时,选择合适的血浆及红细胞输注比例至关重要。2016年《欧洲创伤后严重出血和凝血障碍管理指南》建议对预期需要大量输血救治的患者输注血浆与红细胞之比≥1∶2。针对创伤后需要大量输血救治患者血制品输注比例问题,将血浆及红细胞的输注比例以1∶2作为分界点,通过严格筛选、数据合并、综合分析及讨论,以明确高/低(≥1∶2/<1∶2)比例输注血浆及红细胞对患者预后的影响。鉴于高比例输注范围较广,包含输注比例众多,为进一步明确血浆及红细胞的最佳输注比例,对高比例(≥1∶2)输注血浆及红细胞进行分段分析(A组为1∶2~1∶1、B组>1∶1),以患者24hHb、PLT、APTT、FIB等检验结果变化为观察指标,通过严格筛选、数据合并、综合分析及讨论,为明确高比例输注的确切范围提供相关依据。
  方法:计算机检索Cochrane-Library、Pubmed、Web of science、EMBASE、万方数据库、中国学术期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、维普数据库等,手工检索相关领域的杂志。检索时采用主题词与自由词相结合的方式,所有检索策略经过多次预检索后予以确定。语种仅限中文和英文。检索时间2009.1~2016.12。按照纳入/排除标准筛选文献,对纳入文献进行质量评价、数据提取、统计分析,最终进行综合讨论。
  结果:(1)第一部分纳入5篇文献,均为回顾性研究,共计1024例患者,高比例组患者24h死亡率明显降低(OR0.35,95%CI[0.25,0.48],p<0.00001);高比例组患者30d死亡率仍明显低于低比例组(OR0.55,95%CI[0.41,0.75],p=0.0001);高比例组患者24h生存率也显著提高(HR2.34,95%CI[1.46,3.73],p=0.00001)。(2)第二部分纳入4篇文献,共计430例患者;A组(1∶2~1∶1)及B组(>1∶1)患者在Hb、PLT、APTT、PT-INR及FIB均未见明显差异(p>0.05)。
  结论:(1)输注高比例血浆及红细胞可显著降低创伤后需要大量输血救治患者短期和长期死亡率,提高患者短期生存率。(2)采用大量输血救治创伤后严重出血患者只要满足血浆及红细胞输注比例达到高比例范围,对改善患者短期血常规及凝血功能等指标的作用无统计学差异。
[硕士论文] 田猛
影像医学与核医学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:在腹腔实质脏器创伤中,肝脏一直是创伤多发的脏器。文献报道的数据显示,在腹腔实质脏器创伤中以脾创伤发生率最高(约为40.6%),肝创伤次之(约为24.4%)。按照美国创伤外科学会对肝创伤的分级方法,肝创伤以Ⅱ~Ⅲ级较为常见,占到了56.6%~71.8%。而创伤后出血严重威胁着患者生命安全。由此可见,早期止血是肝创伤患者急救的关键。
  手术治疗是肝创伤治疗的传统方法,但微创和介入治疗在过去的几十年中也得到了发展,包括肝周填塞治疗、选择性肝动脉栓塞治疗、CT或超声引导下介入治疗等已广泛应用于肝创伤的救治,占血流动力学稳定病人的50%~85%。近年来,肝创伤止血治疗研究中也有学者运用了高强度聚焦超声(High-intensity Focused Ultrasound,HIFU)、射频或微波热凝固止血的方法,且都取得了较好的治疗效果。然而,尽管这些方法效果确切,但也存在一些缺点,比如电离辐射、热损伤正常组织、仪器设备体积大等。最近的研究表明,微泡增强的超声空化作用可以在较低声功率条件下对肝脏微血管造成损伤还可以阻断肝血流灌注,并已有相关文献报道了微泡增强的超声空化效应在肝创伤止血治疗研究中的运用和效果,但对其相关的止血机制以及治疗的安全性尚无深入研究。
  为进一步验证和评价微泡增强的非聚焦超声对肝创伤止血治疗的有效性和安全性,并深入探讨其止血机制,本研究建立了肝脏切割伤模型来模拟肝创伤出血。①通过对比治疗前后的出血量、出血视觉评分以及肝脏超声造影来评价肝创伤止血治疗的效果,并观察治疗后1小时内肝脏血流灌注恢复情况;②在光学显微镜和透射电镜下观察治疗后肝脏组织的微观改变,探讨微泡增强的非聚焦超声用于肝创伤止血治疗的相关病理机制;并用肝素化的肝创伤出血模型来探讨机体凝血系统在治疗中的作用;③采用微泡增强的非聚焦超声与HIFU对比的方法,对肝创伤止血治疗后1个月内的血清肝酶、治疗区肝脏超声造影、病理变化等进行连续观察,评价本治疗方法的安全性。
  研究结果显示,①在较低声功率时,微泡增强的非聚焦超声即可实现肝脏创伤的快速和有效止血,而且治疗后血流灌注恢复较快;②肝细胞肿胀压迫肝窦及肝脏微循环在止血中起主要作用。微泡增强的非聚焦超声不会对机体自身的凝血系统造成明显影响,但凝血系统的存在起到了增强止血效果的作用;③微泡增强的非聚焦超声对肝小叶微血管以及肝细胞的内部结构会造成了一定的损伤,并可导致治疗区及周围肝细胞的凋亡,但并未对血清肝酶造成长期的影响,在病理损伤上也较HIFU治疗轻。
  综上,本研究说明微泡增强的非聚焦超声用于肝创伤治疗是可行的有效的,肝细胞肿胀压迫肝窦和肝脏微循环在止血治疗中起到主要作用,机体凝血系统的存在可以增强止血的效果;治疗后的肝脏血流灌注恢复快,肝细胞损伤较小,对肝功能影响较小,有望成为一种无创、快速、有效的肝创伤治疗方法。这也将给腹部实质脏器创伤的超声治疗和后续的临床应用研究提供理论依据。
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