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[硕士论文] 李夏伟
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:糖尿病是一种常见的严重代谢性疾病,而胰岛移植是目前效果最好的治疗方法,但是胰岛来源匮乏严重制约了该疗法的使用。通过定向诱导或基因工程的方法可以使非胰β细胞具有胰岛素分泌功能,从而代替胰β细胞用于糖尿病的细胞治疗,为糖尿病患者带来了新希望。本研究以脂肪间充质干细胞为研究对象,建立了诱导其形成胰岛素分泌细胞的分化体系并研究了miR-375过表达对分化的影响,为脂肪间充质干细胞在糖尿病治疗中的应用奠定了基础。
  本研究主要内容包括:⑴基于胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞(insulin producing cells,IPCs)期间的关键步骤和规律,以及前期对人脂肪间充质干细胞(human adipose tissue-derived mesenchymal stem,haMSCs)胰向分化的探索,确立五种含有不同诱导因子的分化方案。通过使用这五种方案分别对脂肪间充质干细胞进行诱导分化以及对分化细胞进行基因表达检测和细胞形态学比较,最终确定了以第一阶段添加小分子CYC、NOGGIN、B27和RA的基础高糖培养液;第二阶段添加Nic、GLP1、NOGGIN和B27的基础高糖培养液;第三阶段添加Nic、GLP1、IGF1和NOGGIN的IMDM培养液的三阶段分化方案为最优分化方案。我们通过使用该方案成功诱导haMSCs分化为IPCs,分化细胞表达胰腺相关基因Foxa2、Pdx1、Ngn3、Ins和Gcg,细胞胰岛素免疫荧光染色为阳性,分泌胰岛素的ELISA检测为阳性。并发现BMP信号通路对胰岛素分泌细胞的形成有调节作用,NOGGIN的加入有促进Ins表达的作用。实验室所保存的人脐带间充质干细胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC)可以作为haMSC分化过程中同期处理的对照细胞。⑵miR-375在胰腺、胰岛细胞发育和成熟起到重要的调控作用,控制其表达可能有助于干细胞向胰岛素分泌细胞分化。为了探究基于前期建立的诱导分化方案过表达miR-375后对分化究竟有何影响,我们利用慢病毒载体,成功构建稳定过表达miR-375的haMSC细胞株,并将其诱导分化为IPCs;同时,我们构建了一种在分化第三阶段瞬时过表达/抑制miR-375的脂质体转染体系,来探究过表达/抑制miR-375后对haMSC分化的影响。通过以上两种方法,得出:miR-375和Ins表达呈正相关;过表达miR-375可以降低分化所得细胞中Gcg的表达;在分化第三阶段起始瞬时过表达miR-375可以上调Ngn3; mi-375过表达对Pdx1、Foxa2基因表达影响不大。总之,过表达miR-375可以促进细胞向胰岛素分泌细胞分化,并减少向胰高血糖素分泌细胞分化。
[硕士论文] 李明君
发育生物学 山东大学 2014(学位年度)
摘要:研究背景与目的
  胸腺是哺乳动物的中枢免疫器官,是T细胞分化发育和成熟的场所,胸腺为T细胞发育提供了一个缜密而复杂的微环境,有序的调控T细胞的发育成熟和迁移。胸腺基质细胞、可溶性分子以及细胞外基质共同构成T细胞发育的胸腺微环境。胸腺基质细胞间相互连接成网状结构,不仅起网状支架作用,而且由于这些细胞表面携带大量表面分子、并可以分泌多种胸腺激素和细胞因子,从而为胸腺细胞的发育和成熟提供合适的微环境。T细胞在胸腺内经历TCR重排,阳性选择和阴性选择等发育过程最终发育为成熟的T淋巴细胞并迁移到外周免疫器官。
  根据传统的诱导性中枢耐受的理论机制,如果T细胞发育过程中在胸腺内接触到异基因的抗原,则会被诱导出对该异基因外周移植物的耐受,同时,血-胸腺屏障使血液中的大分子物质包括外来抗原不能进入胸腺,所以胸腺内注射异基因抗原可以躲过免疫监视,诱导出对异基因抗原耐受的T细胞。为了探索异种抗原细胞在机体内的生物学特性及机体产生的免疫耐受和免疫排斥情况,我们将作为异种不同组织的、MHC差异较大的抗原人肝癌细胞Hep-G2注射到10-15d的C57BL/6小鼠的胸腺中,动态观察小鼠胸腺对其发生的应答,进而了解抗原在小鼠胸腺微环境中对T细胞发育的影响及胸腺内可能发生的免疫应答机制和外源人肝癌细胞对胸腺微环境及T细胞发育分化的影响,以及异种人肝癌细胞在小鼠胸腺内的命运。
  研究方法
  1.小鼠胸腺内注射及注射对小鼠胸腺造成的组织病理变化分析
  1)小鼠胸腺发育情况分析;
  2)细胞培养与DiI标记;
  3)胸腺内注射方法的简化;
  4)注射效率的评估:解剖学观察判断及FCM分析检测注射效率;
  5)注射后小鼠体重变化分析与注射方法对小鼠的损伤评估;
  6)石蜡切片制作与HE染色观察:
  2.小鼠胸腺对异种抗原细胞的应答
  1)人肝癌细胞培养与DiI标记;
  2)小鼠胸腺内注射入肝癌细胞;
  3)小鼠胸腺组织称重及胸腺细胞绝对值计数;
  4)石蜡切片制作与HE染色观察胸腺组织病理变化;
  5)FCM分析胸腺内各类细胞亚群比例的变化(T细胞、NK/NKT细胞及调节性细胞);
  6)FCM分析胸腺细胞凋亡情况;
  研究结果
  第一部分:小鼠胸腺发育情况分析
  小鼠在青春期前快速生长和发育,到青春期时达到一个顶峰,在此之后便开始萎缩;小鼠胸腺的体积也随年龄增长而变化。
  Dil染色标记观察
  Hep-G2人肝癌细胞在含有20ug/mlDiI的基本培养基中标记30min后,细胞标记成功,并发射出强烈的红色荧光。
  注射效率评估
  通过解剖学观察,成鼠组的注射成功率为81.47%,乳鼠组的注射成功率为76%,FCM分析的结果证实此种注射方法基本能够保证注射的准确性。
  注射方法对小鼠损伤程度的评估
  通过对注射后小鼠行为及体重的变化分析,我们发现实验组与对照组小鼠在体重和行为上均未表现出明显变化,由此我们认为此注射方法对小鼠的损伤程度很小,值得应用和推广。
  石蜡切片HE染色观察结果
  Hep-G2在小鼠胸腺内遭遇到淋巴细胞的攻击与杀伤,注射后3d就检测到淋巴细胞的浸润及巨噬细胞的募集;注射后7d,大部分的肿瘤细胞已经死亡,肿瘤细胞周围密集大量的淋巴细胞;注射后14d,已经检测不到存活的肿瘤细胞,肿瘤细胞形态模糊,周围大量淋巴细胞密集;注射后21d和28d,已经检测不到肿瘤细胞的存在。
  第二部分:胸腺重量及胸腺细胞总数变化
  相比于平行对照组,胸腺内注射人肝癌细胞后7d,14d及21d实验组小鼠的胸腺重量明显增加,而此时的胸腺细胞总数却明显减少。
  小鼠胸腺组织有一定损伤
  注射后3d检测到注入人肝癌细胞的胸腺组织区域有机械损伤的迹象,有的能明显看出是注射针在胸腺内入针时造成的机械损伤,有些则为细胞悬液及注射针推力共同作用的结果。
  小鼠胸腺组织皮质与髓质比例变化
  胸腺内注射人肝癌细胞后3d,检测到胸腺内肿瘤细胞密集的区域为大面积的髓质区,而注射后14d的结果显示髓质区明显增加,而皮质区却很少。胸腺上皮细胞变化
  小鼠胸腺内注射人肝癌细胞后,梭形上皮细胞聚集并环绕在肿瘤细胞周围,注射后16d上皮细胞非常密集并环绕肿瘤细胞残骸形成椭圆形结构,注射后21d和28d数层鳞状上皮细胞环绕围成同心圆结构包绕肿瘤细胞残骸,注射后2个月胸腺组织恢复正常。胸腺内注射后,在小鼠胸腺组织空隙的地方检测到上皮细胞的富集,提示上皮细胞参与了胸腺组织的重建过程。
  FCM检测胸腺内各类细胞亚群变化
  与对照组小鼠相比,注射Hep-G2后1周的小鼠胸腺内CD4CD8双阳性细胞比例明显减少,CD4CD8双阴性细胞、CD4/CD8单阳性细胞及NKT细胞的比例有明显升高现象;注射后2周检测到调节性T细胞的比例也有增高的现象;注射后3周胸腺内T淋巴细胞、NK/NKT细胞的比例未见有明显变化;
  胸腺细胞凋亡检测
  胸腺内注射Hep-G2后1周,实验组小鼠胸腺细胞的凋亡率有明显升高现象,注射后3周凋亡率没有明显变化。
  研究结论
  1.通过对小鼠胸腺内注射方法进行简化,我们构建了一种简单的小鼠胸腺内注射的方法用于动物实验的研究。
  2.明确了异种人肝癌细胞Hep-G2在小鼠胸腺内被免疫细胞攻击与清除的命运,并初步确定巨噬细胞、NK细胞及成熟的T淋巴细胞均参与了Hep-G2细胞的免疫攻击与清除。
  3.Hep-G2的注入,对小鼠胸腺组织造成一定的病理损伤,包括注射造成的胸腺组织机械损伤、皮质与髓质比例的失衡、胸腺细胞总数的减少及上皮细胞的严重增生等,但随着外来肿瘤细胞的免疫清除,这些组织病理学变化也逐渐消失,小鼠胸腺组织恢复正常。
  4.人肝癌细胞的人为注入,对小鼠胸腺内T细胞发育及各类细胞亚群比例均造成一定影响,胸腺细胞凋亡比例升高,CD4CD8双阳性细胞比例显著减小,同时,CD4/CD8单阳性细胞、调节性T细胞及NK/NKT细胞的比例有所上升,但随着外来肿瘤细胞的免疫清除,各类细胞亚群比例又恢复正常。
[博士论文] 董俊红
生理学 山东大学 2014(学位年度)
摘要:应激反应是面对外界或内部的胁迫刺激,机体产生的一种积极主动的生理变化,以避免意外伤害,并且可以大幅度提高面对困难环境的能力。在应激条件下,机体产生多种应激激素,包括肾上腺素(Epinephrine,Epi)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、糖皮质激素、血管紧张素等。作为最重要的应激激素,Epi和NE主要通过作用在靶细胞表面的肾上腺素受体(Adrenergic receptors,AR)来调节机体的功能。依据肾上腺素在不同的组织上产生的生理效应不同,1948年Alquist提出肾上腺素受体可以分为α和β两种亚型。α-肾上腺素受体激活后介导的主要生理功能包括:促进平滑肌的收缩,抑制胰岛素的分泌,升高血压等。β-肾上腺素受体与α-肾上腺素受体介导的生理功能不完全相同,β-肾上腺素受体激活后介导的主要生理功能包括:舒缓平滑肌,促进胰岛素分泌,促进脂肪分解等。随着生物化学和分子生物学研究进展,人们发现α-肾上腺素受体又可分为主要与Gq偶联的α1-肾上腺素受体和主要与Gi偶联的α2-肾上腺素受体。β-肾上腺素受体分为三个亚型β1、β2和β3-肾上腺素受体。因为β-肾上腺素受体和α-肾上腺素受体激活后在许多生理效应上差异很大,所以选择性激活β-肾上腺素受体的小分子化合物通常也可称为β-肾上腺素受体激动剂,而选择性激活α-肾上腺素受体的小分子化合物则称为α-肾上腺素受体激动剂。
  应用多种具有选择性的激动剂,结合基因敲除小鼠等动物模型,过去的半个世纪对α-肾上腺素受体激动剂和β-肾上腺素受体激动剂产生的多种生理功能的研究取得了很多进展。然而,由于肾上腺素受体的广泛分布和受多种环境因素的调节等特性,人们对α-肾上腺素受体激动剂和β-肾上腺素受体激动剂在有些生理过程中的调节作用还不完全清楚。因此α-肾上腺素受体激动剂和β-肾上腺素受体激动剂对生理功能的调节一直以来都是国内外研究的热点。近些年来,对β-肾上腺素受体激动剂调节生理功能和病理过程的显著进展有很多。美国Duke大学Lefkowitz实验室发现β-肾上腺素受体可以通过与NHERF(Na+/H+exchanger regulatory factor)结合,调节Na+/H+交换,维持肾脏的酸碱平衡;上海生科院裴钢实验室发现异常激活的β-肾上腺素受体与ghrelin相互作用,增加了γ-分泌酶活性,加速淀粉样蛋白斑块的形成,促进了阿尔茨海默病的发生;有报道长期慢性应激条件下,β-肾上腺素受体异常激活会导致DNA损伤,引起基因组的不稳定。
  在本论文中,我们通过药物干预的办法,加入不同的β-肾上腺素受体肾上腺素受体的激动剂(Epinepherine、Isoproterenol)和拮抗剂(ICI118,551、Metaproterenol、Propranolol、Phentolamine),结合细胞模型以及相同遗传背景的WT小鼠和β1AR-/-/β2AR-/-、β1AR-/-、β2AR-/-、β-arrestinl-/-、β-arrestin2-/-的KO鼠为研究对象,探讨了β-肾上腺素受体的激动剂对星形胶质细胞中乳酸(lactate)生成和转运的调节机制。深入研究了β-肾上腺素受体激动剂对胰岛中生长抑素(Somat ostatin,SST)合成的调节机制。
  第一章:β-肾上腺素受体对星形胶质细胞Lactate代谢的调控及机制
  β-肾上腺素受体的三个亚型在神经系统均有表达。研究表明,激活啮齿类动物海马、杏仁核和前额叶皮层中的β2-肾上腺素受体能促进长时程增强,从而加强学习记忆。研究发现增强学习记忆所需的能量,一部分是通过星形胶质细胞中糖原分解获得。在中枢神经系统,糖原主要储存在星形胶质细胞中。静息状态下,神经元活动所需要的能量主要由葡萄糖提供。但在低血糖、低氧、神经活动过强等应激状态下,动员星形胶质细胞中糖原分解产生乳酸是神经元获能方式之一。脑组织中,糖酵解主要发生在星形胶质细胞内,乳酸是糖酵解的终产物。神经元摄取的乳酸主要来源于星形胶质细胞中糖原分解产生。乳酸的转运依赖于单羧酸转运蛋白(monocarboxylatetransporter,MCT)穿梭于星形胶质细胞和神经元之间。MCT1和MCT4主要表达在星形胶质细胞,而MCT2表达在神经元。抑制MCT1,MCT2和MCT4的表达均可导致乳酸转运障碍,引起长期记忆损伤。以上结果表明,乳酸在星形胶质细胞和神经元之间穿梭是长期记忆形成的必要条件。以往人们更多地关注β-肾上腺素受体或乳酸对学习记忆的影响,为学习记忆过程提供能量的乳酸代谢研究的比较少。尤其是星形胶质细胞中,β-肾上腺素受体如何调节乳酸生成及转运的机制尚未明确。
  为了更好的理解星形胶质细胞中β-肾上腺素受体对乳酸生成及转运的调节机制,我们在体外分离得到β1AR+/+/β2AR+/+、β1AR-/-/β2AR-/-星形胶质细胞,并利用U251细胞系,通过药物干预的方法,应用多种肾上腺素受体激动剂(如Epinepherine、Isoproterenol)和拮抗剂(如ICI118,551、Metaproterenol),研究β-肾上腺素受体调节乳酸生成及转运的分子机制。为神经元退行性疾病引起的记忆损伤机制及治疗,提供一定的理论基础。我们取得以下研究结果:
  1.我们应用β-肾上腺素受体激动剂肾上腺素(Epinepherine,EPI)和肾上腺素的类似物异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)孵育从β1AR+/+/β2AR+/+WT小鼠和β1AR-/-/β2AR-/-KO小鼠中分离的原代星形胶质细胞。结果显示,β1AR+/+/β2ARV+星形胶质细胞胞外释放的乳酸量明显增加;而β1AR-/-/β2AR-/-星形胶质细胞释放的乳酸量并无显著性增加。β2-肾上腺素受体特异性阻断剂ICI118,551能明显降低乳酸的释放量,而β1-肾上腺素受体特异性阻断剂Metoprolol却不能明显阻断乳酸的增加。在U251细胞系验证了以上结果。实验结果表明,β-肾上腺素受体,尤其是β2-肾上腺素受体的激活介导着星形胶质细胞中乳酸的生成及转运。
  2.为了进一步探讨β-肾上腺素受体的激动剂引起星形胶质细胞内乳酸生成及转运增加的机制,我们应用Wsternblotting技术,检测了与乳酸生成及转运密切相关的LDHA、MCT1和MCT4的蛋白表达情况。结果显示:三种蛋白表达水平都增加,尤其是MCT1增加的最明显,并都呈一定的时间依赖性。这种增加趋势可被β2-肾上腺素受体特异性阻断剂ICI118,551所阻断。实验结果提示:β2-肾上腺素受体的激动剂ISO通过调节LDHA、MCT1和MCT4的表达,调节星形胶质细胞中乳酸的生成及转运。
  3.为了探究β-肾上腺素受体是否通过调节LDHA、MCT1和MCT4转录激活来影响其蛋白表达。我们利用β-肾上腺素受体的激动剂ISO孵育理星形胶质细胞后,检测到LDHA,MCT1和MCT4的mRNA水平增加,并具有一定的时间依赖性。进一步研究发现,转录调节因子HIF-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在MCT4和LDHA的转录激活过程中起重要作用;而转录调节因子CREB(cAMP-response element binding protein,CREB)在MCT1的转录激活过程中发挥作用。
  4.为了进一步研究β-肾上腺素受体激动剂ISO调节LDHA、MCT1和MCT4转录激活机制。我们应用选择性的小分子化合物抑制剂、结合RNA干扰、免疫荧光和免疫共沉降等实验方法。结果发现:β-肾上腺素受体激动剂ISO主要通过β-肾上腺素受体-β-arrestin1-pERK信号途径,磷酸化了HIF-1α的T506/S515位点,促进HIF-1α进核,与HIF-1β形成有活性的HIF-1。HIF-1作为转录调节因子调控MCT4和LDHA的转录激活。ISO通过另外一条信号通路β-AR-Gs-PKA,磷酸化CREB的S133位点,激活的CREB调节MCT1的转录激活。
  5.初步研究了β-肾上腺素受体调节星形胶质细胞中乳酸的生成和转运所影响的相关生理功能,我们使用β-肾上腺素受体的激动剂ISO处理具有相同遗传背景的β1AR+/+/β2AR+/+WT小鼠和β1AR-/-/β2AR-/-KO小鼠,检测其海马区与学习记忆相关的分子CREB和ERK的激活情况,利用Western Botting技术检测了与乳酸代谢密切相关的蛋白MCT1,MCT4和LDHA的表达情况。结果显示:海马区的LDHA,MCT1和MCT4蛋白表达增加;CREB和CREB磷酸化水平增加。实验结果提示,学习记忆的形成可能与β-肾上腺素受体介导的星形胶质细胞中乳酸代谢有一定的关系。
  综上所述,我们发现β-肾上腺素受体的激动剂ISO主要通过β-AR-Gs-PKA和β-AR-β-arrestinl-pERK两条信号通路共同调节星形胶质细胞中LDHA,MCT1和MCT4的转录激活,从而调节星形胶质细胞中乳酸的生成及转运。本研究首次发现p-ERK磷酸化HIF-1α的T506/S515位点,促进了HIF-1α的进核形成有活性的HIF-1,调节MCT4及LDHA的表达。乳酸为神经元提供能量并且激活与学习记忆相关的关键分子CREB和ERK1/2。这些结果将有助于深入研究乳酸代谢障碍引起的神经退行性疾病导致学习记忆障碍的发病机制。
  第二章:β-肾上腺素受体对胰岛Somatostatin合成的调控及机制
  胰岛是许多大小不等、形状不定的细胞团,散布在胰腺各处,人类的胰岛细胞按其形态学特点,主要分为α细胞、β细胞、δ细胞和PP细胞。α细胞分泌胰高血糖素;β细胞分泌胰岛素;δ细胞分泌生长抑素(Somatostatin,SST);PP细胞分泌胰多肽。这些细胞形成微调网络,共同调节激素的释放,维持胰岛正常的生理功能。δ细胞分泌的SST通过靶细胞膜上的生长抑素受体介导,负性调节多种生理功能。胰腺δ-细胞分泌的SST除了受血糖含量的影响外,外界环境的改变也会对其造成影响。研究发现血管活性肠肽(VIP),胰高血糖素和肾上腺素均能促进SST的分泌。SST是胰岛中重要的激素,其分泌异常将会导致胰岛功能紊乱。如果δ细胞中SST的合成与分泌不平衡,将会影响SST的正常分泌,δ细胞不能执行正常的生理功能。研究已经表明,胰腺δ细胞主要通β-肾上腺素能系统调节SST分泌。然而,肾上腺素能系统在调节SST合成机制尚未明确。
  我们通过不同的激动剂(Epinepherine、Isoproterenol)和拮抗剂(ICI118,551、Metaproterenol、Propranolol、Phentolamine)处理具有相同遗传背景的β1AR+/+/β2AR+/+野生型和β1AR-/-/β2AR-/-KO小鼠;β-arrestinl+/+野生型和β-arrestinl-/-KO小鼠;β-arrestin2+/+野生型和β-arrestin2-/-KO小鼠的胰岛和能分泌SST的δ细胞系TGP52,探讨胰岛中的肾上腺素受体调节SST合成的机制。取得了以下研究结果:
  1.利用QCR和ELISA方法检测SST的合成情况。结果发现β-肾上腺素受体的激动剂Epinepherine和Isoproterenol都能促进胰岛和δ细胞系TGP52中SST的合成。β1AR-/-/β2AR-/-小鼠、β-arrestinl-/小鼠胰岛中SST的合成比WT小鼠明显降低约50%,而β-arrestin2-/-KO小鼠胰岛中SST的合成无明显降低。实验结果显示,β-肾上腺素受体的激动剂通过β-arrestinl途径介导SST的合成。
  2.为了深入了解β-肾上腺素受体的激动剂对胰岛δ细胞中SST合成的调节机制,我们利用双荧光素酶报告基因,结合GloSensor测定第二信使及突变转录因子结合位点等方法,研究β-肾上腺素受体对SST表达的调节机制。实验结果显示,β-肾上腺素受体的激动剂EPI/ISO通过PKA途径,磷酸化CREB的133位,激活的CREB结合到SST启动子的CRE区,调节SST的转录。通过β-arrestinl-ERK途径磷酸化Pax6的S313和S398位点,激活的Pax6与Pdx1形成复合体结合在SST的SMS-UE区,调节SST的转录。
  综上所述,我们的研究结果表明β-肾上腺素受体激动剂促进了胰岛中SST的合成,通过Gs-cAMP-PKA-CREB途径和β-arrestinl-ERK-Pax6途径共同调节转录因子CREB和Pax6的激活,从而调节SST的合成。实验结果提示:δ细胞中β-肾上腺素受体功能障碍,不仅影响SST的分泌,还影响SST的合成,最终导致胰岛δ细胞功能障碍。
[硕士论文] 任春宇
动物生理学 哈尔滨师范大学 2012(学位年度)
摘要:组织学观察结果显示,极北鲵消化道胚后发育具有一定的时空顺序:消化道各器官是按照胃、肠、食管的顺序逐渐分化并不断完善的,消化道壁各层是按照粘膜上皮、环肌层、纵肌层、外膜、固有层、粘膜下层和粘膜肌层的发育顺序依次出现的。而极北鲵成体消化道均由粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜等4层结构组成。
  Grimelius法显示,嗜银细胞最早出现在41期胃粘膜上皮之间;肠中嗜银细胞首先出现在42期;而食管中嗜银细胞出现最晚,在43期被检测到。而嗜银细胞在其成体消化道各部分均有分布,其中以直肠部分布密度为最高,胃幽门和回肠次之,胃体处最低。并且其形态是多种多样的:有圆形、椭圆形、锥体形和梭形等。根据嗜银细胞的形态,认为其具有内分泌、外分泌和旁分泌的功能。
  免疫组织化学方法显示,5-HT细胞分布于消化道全长,分布密度以食管部为最高,胃幽门部次之,十二指肠为最低。SS细胞除了贲门、空肠和直肠以外,其余各部位均有分布,且SS细胞在胃幽门部分布密度为最高,回肠部最低。Gas细胞仅在十二指肠和空肠中检测到。Glu细胞仅在贲门和胃体中观察到。SP细胞只在胃体部检测到,而PP细胞未检测到。极北鲵消化道内分泌细胞细胞的形态是多种多样的:圆形、椭圆形、锥体形和梭形。总体看来,内分泌细胞的分布密度和形态与其消化道的生理功能是相适应的。
[博士论文] 王茂叶
动物学 山东师范大学 2011(学位年度)
摘要:下丘脑、腺垂体和肾上腺皮质组成了机体的应激轴,即下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamus-Pituitary-Adrenal,HPA),控制着机体对外界刺激反应并调节包括机体免疫、情绪及能量利用等机体活动过程。腺体和激素之间的相互作用机制亦来源于此。运动作为一种应激刺激对HPA轴有着较大的影响,不同研究报导了不同强度和时间的运动后对HPA轴的影响的不同,这主要与受试者的年龄、运动强度、运动持续时间、练习形式和身体机能状态包括训练水平等因素有关。也与测定时间不同有关。机体通过HPA使血中糖皮质激素水平升高可能是最重要的。
  HPA轴对于机体动员能量和保持内环境的稳定至关重要。应激时可出现多个内分泌系统如HPA以及下丘脑和垂体其它激素的改变。应激反应的主要特征是以HPA轴的激活为核心的生理和心理反应。HPA轴的激活是机体对应激最重要的适应性反应。HPA轴激活的中枢控制是十分复杂的,在这一系列神经内分泌调节过程中,下丘脑合成和释放的促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)起着关键的作用,下丘脑室旁核(paraventricular nucleu,PVN)是HPA轴活动的直接控制部位。在受到刺激时,PVN上的相应神经元分泌多种促进促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropin hormone,ACTH)分泌的激素,其中最重要的是CRH和精氨酸加压素(arginine vasopressin,AVP)的分泌,其中CRH经垂体门脉血流到达垂体,以高亲和力结合于CRH受体(corticotropin releasing hormone receptor,CRH-R),最终刺激垂体分泌ACTH,后者经血液循环到达肾上腺,刺激肾上腺皮质合成和分泌糖皮质激素来调节HPA轴的生理功能。神经内分泌系统与免疫系统之间存在着完整的功能性调节环路。运动应激可能引起免疫系统内的稳态失衡,T helper1(Th1)/T helper2(Th2)偏移与否是免疫稳态的关键。不同形式、不同强度和不同负荷量的运动可能对Th1/Th2偏移程度和方向有不同影响。运动应激时的内分泌变化可能影响免疫稳态。
  运动也是一种应激源。在身体锻炼或运动训练期间,机体的各项身体成分和生理机能在发生着改变,其中包括HPA轴的各个组成部分及其功能的改变。机体对应激的反应是一种动态平衡,是对应激的调节和适应。如果这种平衡不能保持,适应性反应就会变成适应不良性反应,对机体造成损害,递增运动方式到底对HPA轴发生了何种改变?多大程度上发生了改变?是本论文探讨的最重要的内容。
  本研究以大鼠为实验对象,以递增负荷运动为应激手段,以下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPAA)为主线,以相关器官中相应激素的分泌部位形态、激素、分子水平的变化为切入点,从形态学、运动生理学和免疫学方面观察和阐释以上指标的变化,以期探讨递增负荷运动对大鼠HPA轴的影响,为科学化运动训练提供科学的理论依据。本实验主要结果如下:
  1.递增负荷运动对大鼠下丘脑CRH神经元及腺垂体CRH-R的影响
  CRH阳性细胞在第0周没有显着性的变化;第2周I组比AC组反而有了显著性下降;第4周末的I组达到了最低,3H组达到最高,第6周的各组之间都没有显著性差异。说明随着运动强度的加大,在一定强度范围内,CRH阳性细胞产生了不同程度的适应,身体的各种生理机制得以激活,运动对身体的刺激得到多种系统的反应,但并不是随着运动负荷的增大CRH值越大,应激在一定阶段内对CRH阳性细胞的影响甚至低于安静水平。递增负荷运动对大鼠下丘脑CRH阳性细胞的适应性变化为:AC组的CRH在整个实验周期内没有发生较大的变化;C组在第4周有了显著性降低;而I组在第2周和第4周都比AC组有了显著性降低,第6周末达到最大值;说明第6周的运动负荷已经在很大程度上刺激了机体,使机体产生了剧烈的反应;对于3H组,各组之间反而都没有显著性差异。
  在递增负荷运动过程中,大鼠在应答性和适应性上在某一时间段内有了不同程度的变化。从应答性变化来看:随着运动强度的升高,各周CRH含量也并不是越来越高,也就是对于大鼠承受的运动负荷而言,在到达某一强度时,机体会发生比较强烈的应激,但当适应了此强度后,在稍后某一范围内加大的运动强度的应答也非常有限,甚至出现了第6周各组没有显著性差异的现象。从适应性变化来看:各周AC组都没有显著性差异,说明在大鼠成熟之后的此指标的稳定性,其它各组在不同的强度时段表现出不同的适应结果。其中3H组在各周都没有显著性差异。说明实验各组表现出不同的时相性,也没有因为运动负荷的加大,实验指标成比例或显著性的升高,表明在此实验设计模型中,大鼠在不同时相表现出了不同的适应特点。
  2.递增负荷运动对大鼠腺垂体ACTH阳性细胞及肾上腺ACTH-R基mRNA表达的影响
  低强度的运动刺激(如第0周的适应性训练)也能引起下丘脑的ACTH阳性细胞剧烈的反应,表现为其应答部位的积分光密度的极显著性升高,随着运动强度的加强,这种趋势也非常明显。但是以后的检测也反映出这样一个现象:即随着运动刺激的提高,3H组在反应性上却比I组有了显著性下降,但依然显著性的高于AC组。大鼠对运动刺激出现的最大反应是在第4周末,而到第6周末,其反应性下降,也说明机体的反应是在某一刺激强度下达到最大值,一旦超过某一特定强度,ACTH的反应也不会增加。这是对机体的一种本能的保护机制,达到最大反应后,机体为了确保生存,会对上级器官和系统进行反馈,以期上级系统降低对其正反馈调节,使本级系统不会崩溃,也确保了机体的最低限度的稳态,以防止过度应激对机体造成损伤。从大鼠机体的适应性上看,每组中ACTH反应最高的时间点都是在第4周。其数值的波动性说明了此指标的时相性,也说明大鼠对应激的适应的波动性。这和反应性有很大的相似性。总之,在递增负荷运动过程中,大鼠垂体上的ACTH阳性细胞无论在反应性还是在适应性上,都表现出了时相性,并且在一定的应激刺激范围内,其反应性和适应性达到最高,超过此范围,机体会产生自我保护机制,确保最低限度的稳态,防止过度应激对机体造成致命伤害。
  3.递增负荷运动对大鼠血清糖皮质激素(glucocorticoid,GC)及肾上腺糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR) mRNA表达的影响
  从机体的反应性上看,随着运动强度的加大,对机体的刺激越来越大,对于各周末C组的GC含量影响非常有限,表明在各级运动强度的刺激下,机体只要是休息一天,机体产生的GC基本就能恢复到绝对安静组(AC组)的水平。但是在每周末的I组的水平最高,说明运动后即刻所测试的GC水平在体内积累的量最高,实验结果还显示,3H组和I组相比有所下降,但总体水平还是比AC组和C组有明显升高,表明3小时后GC还没有降低到安静水平。从适应性上看,AC组和C组在各周末的GC含量都没有显著性变化。而I组随着运动强度的加大,其变化趋势和反应性相类似,GC含量也有升高趋势,但第2、4、6周末没有显著性变化,而3H组在各周末皆无显著性变化,表明各组在不同运动强度的刺激下,从适应性上看,各个强度引起的机体适应性相类似。
  从反应性上看,在第0、2、4、6周末,C组和AC相比都没有显著性变化,表明各周的C组GR在不同的运动强度下经过一天的休息都能恢复到安静水平。由于运动强度低,第0周内的四组相比,没有显著性变化。而第2、4、6周末的I组和3H组则受到运动效应的延迟作用,其GR基因表达水平还显著性的低于AC组,说明随着运动强度的增大,机体所承受的刺激越来越大,GR减少越明显。和以上研究者的结果类似。从适应性上看,AC组和C组在各周末皆无显著性变化,也充分说明了运动后休息的重要性,I组和3H组中,都是运动强度最大的第6周末的GR水平最低,说明运动强度越大,机体肾上腺的GR水平越低,也和以上研究者的研究结果类似。
  4.递增负荷运动对大鼠血液Th1/Th2平衡及骨骼肌损伤的影响
  第0周,由于运动强度非常小,实验结果和上述结论吻合,即中小负荷的运动对运动后静息时的大鼠血清干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和白细胞介素4(interleukin,IL-4)的含量没有产生影响,未使IFN-γ/IL-4比率产生向IL-4方向的偏离。可能由于加大的运动强度使大鼠对运动刺激的不适应,导致 I组和3H组的IFN-γ/IL-4比率下降显著,产生向IL-4方向的偏离,继而导致了细胞免疫功能的剧烈下降。经过对运动刺激的适应,到第4周时,大鼠的IFN-γ/IL-4比率出现了稳定状态,回到了安静时的水平,甚至3H组的IFN-γ/IL-4比率有了非常显著的提高。实验进行到第6周时,随着运动强度的加大,大鼠的运动能力越来越接近极限,此时的运动强度接近力竭运动,但从IFN-γ/IL-4比率来看,I组和3H组和AC组相比并没有显著性差异。机体Th1/Th2的平衡状态主要决定于是否对所施加于机体的刺激是否适应。6周末的IFN-γ/IL-4比率说明Th1/Th2平衡状态没有被破坏。
  第0周由于大鼠的运动强度很小,各组之间的IL-6没有显著性差异。随着运动强度的加大,到第2周,只是3H组的含量大大低于其它组,其它组之间没有显著性差异。第4周的运动强度没有引起IL-6的大量分泌,反而有了一定程度的下降,证明此运动负荷没有使实验对象出现不适应,而是对运动负荷产生了良好的适应。到了第6周,各组之间的IL-6含量没有出现显著性变化,也说明骨骼肌没有损伤,机体对运动刺激有良好的适应。
  总结以上实验结果,本研究认为:此运动模型使大鼠HPA轴发生了强烈的应激反应并产生了不同的应激适应。随着运动强度的改变,PVN中的CRH没有表现出随着运动强度的增加而直线增加的趋势,反而在某个阶段表现出下降,即在不同时相表现出不同的适应特点,推测和整个递增负荷运动过程的激素(如CRH、ACTH、GC等)的负反馈调节有关;腺垂体CRH-R在应答性和适应性上和下丘脑PVN中CRH-R的变化也不同步,大鼠垂体上的ACTH阳性细胞无论在反应性还是在适应性上,都表现出了时间依赖性,并且在实验过程后期阳性细胞有减少趋势,推测这可能是机体产生自我保护的机制之一。GC的分泌有高度的运动强度依赖性。GR的基因表达的趋势和GC趋势相反,表明随着运动强度的增大,机体的中GR的含量越低,这应该是机体保持自身最基本稳
[硕士论文] 宋佳乐
细胞生物学 沈阳师范大学 2011(学位年度)
摘要:胸腺属于中枢淋巴器官,是T淋巴细胞的生发和发育分化的主要器官,在细胞免疫中起中枢作用,其具有随着年龄的增长而出现退化的现象。澳大利亚学者Terszowski等发现,在BALB/c和C57BL/6小鼠颈部存在第二胸腺。这个颈部的胸腺有着典型的髓质-皮质结构,可以支持T细胞发育。为了进一步探索其他品系小鼠是否也存在类似结构,以及其与胸腺、颈部淋巴结的关系等,本文应用显微技术和亚显微技术对昆明小鼠的颈部胸腺,胸部胸腺和颈部淋巴结进行研究,主要结果如下:
   一、昆明小鼠同样存在颈部胸腺,其位置和数量表现出一定程度的可变性,一般位于颈部腹侧表面或者隐藏在颈肌束下方,在小鼠颈部的左右侧都有,以左侧居多。颈部胸腺一般呈椭圆形,象牙白色,外被结缔组织薄膜,有少量脂肪连系。经解剖有93.33%的昆明小鼠有颈部胸腺,且其中有一个、两个和三个颈部胸腺的小鼠分别是19只(占所检到有颈部胸腺的56只小鼠的33.93%),31/56(55.35%),6/56(10.71%)。
   二、昆明小鼠的颈部胸腺与胸部胸腺的细胞学组成相似,而与颈部淋巴结完全不同。颈部胸腺与胸部胸腺一样分为皮质和髓质两个区域,但与胸部胸腺由众多小叶组成不同,颈部胸腺表现为单叶,内含由上皮细胞、胸腺小体、巨噬细胞及肌样细胞等组成的胸腺微环境。
   三、昆明小鼠的颈部胸腺与胸部胸腺同样具有随年龄的增大而逐渐衰退的迹象,但它们具有不同的生长和退化规律。颈部胸腺从小鼠出生后1周龄开始逐渐增大,到7周龄时达到最高值,之后逐渐变小,并且有微黄迹象。颈部胸腺指数在1周龄大于2-3周龄,于4周龄达到最大值,之后便随年龄的增大而减小。胸部胸腺则在4周龄时达到最大值,随着年龄的增大,之后逐渐变小,变软,且至48周的小鼠胸部胸腺明显发黄,形态不规则,胸部胸腺指数于3周龄见最高。
  
[博士论文] 张玉玉
动物学 山东师范大学 2009(学位年度)
摘要:大鼠束缚—浸水应激(restraint water—immersion stress,RWIS),作为一种心理和躯体的复合应激模型,能在几小时内产生迷走神经介导的胃运动机能亢进、胃酸分泌增多和急性胃粘膜损伤等现象。此模型已被广泛用来研究应激性胃粘膜损伤的发生机制及其临床治疗药物的筛选等。众多研究表明束缚—浸水应激状态下胃机能紊乱主要是由于脑中神经元的活动异常导致的,而且是通过迷走副交感传出纤维介导的。 支配胃的迷走副交感神经纤维主要来自延髓的迷走神经背核,部分来自疑核。此外,延髓孤束核接受来自胃的部分传入信息。延髓最后区是呕吐反射的化学感受触发区,也接受胃的迷走感觉纤维传入。迷走神经背核、孤束核和最后区位置邻近,神经元的相互联系复杂,功能上关系密切,构成迷走复合体。迷走复合体和疑核是调控胃机能的初级中枢。然而电刺激/化学刺激(L—谷氨酸)迷走复合体和疑核均抑制麻醉状态大鼠的胃运动。因此,RWIS状态下,调控胃机能的初级中枢——迷走复合体和疑核神经元是否被兴奋及其活动的时—空模式成为研究的重点和需要解决的首要问题。 边缘前脑是调控内脏机能的高位脑中枢,关于大鼠RWIS诱导边缘前脑神经元活动的研究仅局限于中间前额叶皮层(mPFC)和下丘脑室旁核(PVN),且未系统研究RWIS过程中边缘前脑不同核团中神经元的活动模式。 传统观念认为应激反应的中枢效应主要发生在下丘脑—垂体—肾上腺皮质(HPA)轴,而众多研究表明RWIS主要诱导副交感神经系统的活动加强。RWIS状态下,整个HPA轴的活动是否加强需要进行探讨。 因此,本文拟用即刻早期基因c—fos表达产物c—Fos蛋白作为神经元活动的标志,研究束缚—浸水应激不同时间段诱导的大鼠不同脑区内神经元的时空活动模式,从而探讨束缚—浸水应激致胃机能紊乱的中枢神经机制,为临床探讨从中枢方面防治应激性胃粘膜损伤、改善胃肠动力的新对策提供重要依据。 根据束缚—浸水应激时间将雄性Wistar大鼠随机分为5组,分别为应激Omin(即对照组)和应激30、60、120和180 min。此外,为探讨c—Fos表达的内在动力学特征,额外设立一组,大鼠应激30 min再恢复30 min(Group30—30),分别与应激30 min和应激60 min的大鼠进行比较。应激完毕后,过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物,测量体温,取胃,甲醛固定统计胃粘膜损伤指数。取胃后,快速心脏灌流固定脑组织及垂体和肾上腺,并进行后固定、脱水处理,然后进行冰冻切片。漂浮切片进行c—Fos蛋白免疫组化显色。c—Fos表达的强弱以单位面积(0.01 mm2)内Fos免疫反应阳性神经元(Fos—IR neurons)的个数与累积光密度来表示。此外,由于不同核团c—Fos表达的基础水平不同,本研究还采用“对照组的倍数”(multiples of controls)作为这些核团的c—Fos表达的相对强度,即每只大鼠c—Fos表达的量除以对照组c—Fos表达的平均值,统计得“对照组的倍数”。 大鼠束缚—浸水应激不同时间段显著影响迷走复合体和疑核中c—Fos蛋白的表达。迷走复合体和疑核都是在应激60 min时c—Fos表达最强,以后随应激时间延长,表达逐渐减弱。值得注意的是,束缚—浸水应激过程中,迷走神经背核的c—Fos表达最强,其次是疑核、孤束核和最后区。迷走神经背核尾段c—Fos表达的高峰出现在应激120 min时,迟于迷走神经背核吻段和中段(60 min),且尾段c—Fos的高峰表达显著强于同一时间段吻段和中段的c—Fos表达。孤束核中段和尾段的c—Fos表达始终显著强于吻段。这些结果表明,调控胃机能的初级中枢——迷走复合体(尤其是迷走神经背核)和疑核神经元的过度活动可能在束缚—浸水应激致胃机能紊乱中起重要的调控作用,且迷走神经背核和孤束核不同区域的调控作用有所差异。 大鼠束缚—浸水应激不同时间段显著影响边缘前脑不同区域c—Fos蛋白的表达。中线皮层区c—Fos表达在应激60 min时达到高峰,随后逐渐降低。隔区和杏仁核的c—Fos表达倾向于在应激120 min时达到高峰。下丘脑大部分核团尤其是视上核(SON)和PVN中c—Fos表达在应激30 min时显著增强,然后维持在相对高的水平。然而,非常值得探究的发现是,束缚—浸水应激过程中,下丘脑SON的c—Fos表达总是最强,其次是下丘脑PVN、皮质后杏仁核(PCoA)、中央杏仁核(CeA)和mPFC。此外,胃粘膜损伤随着束缚—浸水应激时间的延长逐渐加重,而大鼠体温在应激60 min后降低到最低水平。上述核团神经元活动的增强可能与调控机体对RWIS的反应和RWIS诱导的体温降低及胃机能紊乱有关。 大鼠束缚—浸水应激诱导HPA轴c—Fos蛋白的表达情况比较复杂,3个器官的表达并不平行。与对照组相比,应激组大鼠HPA轴中的PVN和腺垂体(特别是中间部)有显著多的c—Fos阳性细胞,但每一部位的c—Fos表达在4个不同时间段均无显著差异。HPA轴中的肾上腺皮质束状带在对照组和应激组中均未观察到c—Fos蛋白的表达。束缚—浸水应激诱导PVN和腺垂体(尤其是中间部)c—Fos蛋白的显著表达,提示PVN和腺垂体,尤其是中间部,参与机体对束缚.浸水应激的响应,且上述部位中c—Fos蛋白可能参与调控应激过程中促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的合成。 此外,束缚—浸水应激包含着束缚和冷水的双重刺激。已知单纯束缚短时间内并不导致胃粘膜损伤,且大鼠应激后再恢复一段时间体温很快恢复正常,胃粘膜损伤不再加重,脑中一些核团的c—Fos表达也显著减少。冷水刺激可能在RWIS致胃粘膜损伤中起关键作用。冷水刺激引起的体温降低是否是诱发应激性胃粘膜损伤的关键因素?因此,本研究还观察了不同水温下单纯浸水应激对大鼠胃粘膜损伤的影响,以进一步分析体温降低与应激性胃粘膜损伤的关系。研究发现相同水温下束缚—浸水应激和单纯浸水应激导致大鼠产生同等程度的胃粘膜损伤,表明“冷水刺激”在束缚—浸水应激导致的胃粘膜损伤中起关键作用,而“束缚刺激”不起关键作用。浸水的水温越低,腹腔温度就越低,胃粘膜损伤也就越严重,说明大鼠束缚—浸水应激模型中冷水刺激引起体温降低是诱发胃机能紊乱和胃粘膜损伤的关键因素。 总之,大鼠束缚—浸水应激不同时间段诱导迷走复合体和疑核中c—Fos蛋白不同程度的表达,表达最强的是迷走神经背核和疑核,提示迷走神经背核和疑核神经元的过度活动可能是束缚—浸水应激致胃机能紊乱的初级中枢机制之一。大鼠束缚—浸水应激不同时间段诱导前脑中不同区域c—Fos蛋白不同程度的表达,表达最强的核团始终是下丘脑SON,其次是PVN、PCoA、CeA和mPFC,这些核团中神经元活动的增强可能是束缚—浸水应激致胃机能紊乱的高位中枢机制之一。延髓迷走神经背核和疑核及下丘脑视上核和室旁核中强烈的c—Fos表达为束缚,浸水应激过程中迷走副交感神经系统活动加强致胃粘膜损伤提供了神经解剖学的直接证据。束缚—浸水应激诱导下丘脑室旁核和腺垂体(尤其是中间部)c—Fos蛋白的显著表达,表明HPA轴中室旁核和腺垂体参与束缚—浸水应激反应。
[硕士论文] 陈佩文
动物学 福建师范大学 2009(学位年度)
摘要:感觉神经元特异性受体(sensory neuron-specific receptor,SNSR)mRNA只特异性地分布于背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)和三叉神经节(trigeminal ganglia,TG)的小型感觉神经元内,应用其激动剂牛肾上腺髓质素8-22(bovine adrenalmedulla8-22,BAM8-22)可以部分抑制吗啡耐受的形成,但其机制还不清楚。肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)是降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)超家族中的一员,与CGRP具有相似的结构和功能。已知AM参与了炎症痛的形成和维持。 本研究应用行为学,组织学和生物化学等实验方法研究了:(1)慢性吗啡作用对牛肾上腺髓质素22(bovine adrenal medulla22,BAM22)和AM表达的影响及机制;(2)SNSR和AM受体对吗啡耐受的影响及机制。结果显示:慢性给予吗啡会导致脊髓背角及DRG内BAM22的表达下调和AM的表达上调。蛋白激酶C(proteinkinase C,PKC)介导了慢性吗啡作用导致的AM表达上调,而蛋白激酶A(proteinkinase A,PKA)不参与此过程;间隔鞘内注射BAM8-22可以完全抑制吗啡耐受的形成,其机制与调节BAM22,神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthesis,nNOs)和CGRP等神经递质或调质的表达有关;鞘内注射AM受体拮抗剂肾上腺髓质素22-52(adrenomedullin22-52,AM22-52)可以剂量依赖性的抑制吗啡耐受的形成,并且可以部分翻转吗啡耐受。AM22-52抑制和翻转吗啡耐受的作用是通过调节AM,CGRP,nNOS和BAM22等的表达来实现的。这些结果提示了镇痛性介质的表达减少或致痛性介质的增加是吗啡耐受形成的原因之一;本研究表明SNSR激活能抑制吗啡耐受,AM参与了吗啡耐受的形成和维持。
[硕士论文] 罗琪
制药工程 北京化工大学 2008(学位年度)
摘要:干扰素α<,2b>(IFNa<,2b>)是一种抗病毒、抗肿瘤药物,并且具有免疫调节活性。胸腺肽a<,1>(THYa<,1>)具有促进体内细胞因子的分泌及淋巴细胞功能的作用,是一种细胞免疫增强剂。重组细胞因子作为免疫调节剂具有抗病毒、抗肿瘤和增强疫苗免疫效果的作用,在抗肿瘤、抗感染等治疗中取得良好疗效。多细胞因子协同作用具有明显强于单一细胞因子作用的效果。本课题利用分子生物学技术将干扰素IFNa-2b和THYa<,1>组成新型重组融合蛋白,可以优化药物的特性、提高药物的使用价值,在治疗疾病方面取得更大的成果,在医学上有较大的使用前景。 本文考察了基因工程菌的生长周期,优化了发酵条件:37℃,Kna浓度为30mg.L<'-1>发酵液,IPTG浓度为0.5mmol·L<'-1>,培养3h后进行诱导,诱导4h结束发酵,融合蛋白表达量最高,可得到精制包涵体2.5g.L<'-1>。重组蛋白质在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体,必须经过体外变性、复性的过程。通过多种变性复性方法的对比,得出变性复性的最佳条件:10mmo·L<'-1>l DTT,7mol·L<'-1>盐酸胍搅拌48h溶解包涵体变性;采用脉冲加样的操作方式按1:10将变性液加入到含有1 mol·L<'-1>尿素、0.2mmol·L<'-1> GSSG-2mmol·L<'-1>GSH的复性液中,每间隔2小时加入1mL变性液进行复性。本实验还考察了目标蛋白分离纯化的最佳方法:包涵体变性复性后引入金属螯合层析和阳离子交换层析联用进行纯化、重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G-50柱除盐纯化后,最终目的融合蛋白产量达68mg.L<'-1>发酵液。电泳结果及酶联质谱显示融合蛋白表达正确。 实验结果证明重组人干扰素α<,2b>和胸腺肽α<,1>融合蛋白的分子设计合理,基因工程菌构建成功。本实验打通了一条从菌种表达直至融合蛋白分离纯化的工艺路线。为进一步研究利用基因工程菌表达重组融合蛋白及纯化提供了理论参考。
[硕士论文] 裴彦锋
临床兽医学 甘肃农业大学 2008(学位年度)
摘要:本文主要利用试验方法证明光照对小白鼠松果体褪黑素的自然节律性分泌有一定的调节作用,基于此研究探讨了褪黑素分泌对血液白细胞总数及各种白细胞百分率的影响情况,并且通过对小白鼠血清半数溶血值测定,研究探讨了褪黑素对体液免疫的影响情况;在分析褪黑素对免疫器官功能的影响时,在不同剂量褪黑素腹腔注射条件下,分别测定了脾脏和胸腺指数。 结果显示随着光照昼夜节律性变化,褪黑素在松果体中的分泌和释放与白细胞计数水平和各种白细胞的百分率呈现自然的或高或低的周期节律性变化。为证实在白细胞计数(WBC)和白细胞分类计数(WBDC)中白细胞水平与白细胞百分率变化是由自然光照通过调节松果体分泌及释放褪黑素的作用而实现的,试验进一步选定在同一个时间段利用褪黑素腹腔注射法测定了单位体积血样中白细胞计数水平和各种白细胞百分率。结果显示WBC和WBCD中各种白细胞百分率的变化的确是注射一定剂量褪黑素引起的。由此得出结论视上核神经感受自然光照调节着松果体合成分泌褪黑素,MT对各种白细胞前体细胞在骨髓中的分化成熟发挥着很大的调控作用:光照较弱的夜晚是褪黑素分泌释放到血液中浓度较高的时间,单位体积白细胞计数水平也较高,中性粒细胞的百分率有很大下降,随着中性粒细胞百分率的大幅度降低,而淋巴细胞的百分率有很大升高,单核细胞百分率在晚间也相对较低,嗜酸性粒细胞是白细胞分类计数中百分率变化随光照强度周期变化最不敏感的一类白细胞,尤其是午夜1:00~3:00,褪黑素在血清中的浓度达到最高峰,白细胞计数水平也达到高峰值,各种白细胞百分率变化也相应达到它的极限值。在白天,光线较强,松果体分泌释放褪黑素的能力减弱,白细胞计数水平降低;各种白细胞分类计数百分率又有了新的变化,中性粒细胞百分比有很大上升,而淋巴细胞百分率相对降低,单核细胞百分率也有较大的提高。在光线最强的13:00~14:00时段,是褪黑素在血清中浓度的低谷时分,血液白细胞计数水平也达到最低值,中心粒细胞百分率却上升到最高,持续到下午17:00时,而淋巴细胞百分率则降低到最低限度。 结果还显示,褪黑素随着光照呈周期性分泌,对体液免疫和免疫器官的免疫功能都发挥着一定的调节作用,随着褪黑素注射剂量的增加,免疫缺陷性小白鼠血清半数溶血值也呈极显著性上升(P<0.01),脾脏指数也极显著的得到恢复(P<0.01)。 试验证实:小白鼠机体褪黑素依赖于光照的自然变化而呈自然节律性分泌,以此对动物机体免疫系统发挥着重要的调节作用。
[硕士论文] 张莹
生理学 延边大学 2007(学位年度)
摘要:PACAP27对ANP分泌的影响及其机制研究心脏作为内分泌腺,生成和分泌钠尿肽激素。钠尿肽激素以钠尿肽家族(familyof natriuretic peptides,NPs)形式存在于人和哺乳动物体内,其成员有ANP(atrial natriuretic peptide,ANP)、BNP(brain natriuretic peptide,BNP)、CNP(C-type natriuretic peptide,CNP)和DNP(dendroaspis natriuretic peptide,DNP)。这类激素共同的生物学作用是排钠、利尿,参与水盐平衡和血压调节。 ANP是心房肌细胞生成和分泌的钠尿肽家族第一个成员。它与心脏、血管、中枢神经系统、淋巴组织、生殖器官及肾脏组织等以结合形式存在的钠尿肽受体(nalriuretic peptide receptor,NPR)结合而发挥舒张血管、降低血压、利钠利尿、抑制细胞增殖、调节免疫和保护细胞以及参与脂质代谢等作用。ANP的分泌受较多因素的调节,如心房肌细胞受到牵拉刺激(比如静脉血容量突然增加)时,心房肌细胞高尔基体附近的分泌颗粒增加ANP的释放。而且一些体液因素也可影响ANP的分泌。整体情况下,糖皮质激素刺激ANP的分泌,静脉注射血管紧张素Ⅱ、酚妥拉明、内皮素、抗利尿激素和前列腺素均可使血浆ANP浓度增加。相反,一氧化氮则可抑制心房ANP的分泌。离体情况下,升高渗透压和Na<'+>的浓度增加以及缺氧均可促进离体心脏分泌ANP。另外,肾上腺素能、胆碱能以及肽能受体也参与调节ANP的分泌,只是对各自作用效果尚存在争议。 垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)是1989年Miyata等人在牛的下丘脑中分离出来的一种能够激活腺苷酸环化酶的神经肽。PACAP属于分泌素、胰高血糖素、血管活性肠肽及生长激素释放激素家族的新成员,它包括PACAP38和PACAP27两种类型。PACAP广泛分布于许多动物的下丘脑、中枢神经系统、周围神经系统以及非神经组织内,并充当神经递质/调质及神经营养因子。 现已证实,大鼠心房肌组织含有PACAP38和PACAP27,且其受体在心脏也有分布,但PACAP对心房ANP分泌的调节尚不甚清楚。因此,本项研究利用放射免疫技术,采用离体搏动的心房灌流模型,观察和探讨PACAP27对家兔心房ANP分泌的影响及其作用机制,为阐明ANP分泌机制及其功能研究提供理论依据。本项研究结果如下: 1.PACAP27(100 nmol/L)明显抑制家兔心房ANP分泌的(p<0.01)同时显著增加cAMP逸出量(p<0.001)和心房搏出量(p<0.01)。 2.PACAP受体阻断剂PACAP6-27(1.0 μmol/L)明显增加ANP的分泌(p<0.01),而对cAMP逸出量和心房搏出量并不产生显著影响。在PACAP6-27存在下给予PACAP27(100 nmol/L)时,ANP的分泌量降低(p<0.05)的同时cAMP的逸出量显著增加(p<0.001),此时心房搏出量没有明显改变。 3.L.型Ca<'2+>通道阻断剂nieardipine(1.0 μmol/L)增加ANP分泌量的同时(p<0.05)显著降低心房内压和心房搏出量(p<0.001);在nicardipine存在下给予PACAP27(100 nmol/L)时,心房ANP分泌量依旧增加(p<0.05)的同时心房内压和心房搏出量仍显著降低(p<001)。 4.蛋白激酶非选择性抑制剂staurosporine(1.0 μmol/L)明显增加ANP分泌量的同时伴随着心房内压和心房搏出量显著降低(p<0.01);在staurosporine存在下处理PACAP27(100 nmol/L)时,心房ANP分泌量仍递增的(p<0.01)同时心房内压和心房搏出量进一步下降。(p<0.001)。 5.cAMP依赖的蛋白激酶抑制剂H-89(3.0μmol/L)使心房ANP分泌量明显增加(p<0.05),并抑制心房内压和心房搏出量(p<0.05);在H-89存在下给予PACAP27(100 nmol/L),使心房ANP分泌量依旧增加(p<0.05)的同时心房搏出量仍显著降低(p<0.05),但对心房内压没有发生明显变化。 6.腺苷酸环化酶的直接激活剂forskolin(1.0μmol/L)明显抑制ANP分泌(p<0.01)的同时显著增加心房搏出量(p<0.01)和cAMP逸出量(p<0.01),且在一定范围内,cAMP的生成与ANP分泌的抑制效应呈负相关(Y=-5.268 X+9.506,r<'2>=0.971,p<0.001)。 7.L-型Ca<'2+>通道阻断剂nifedipine(1.0 μmol/L)明显增加ANP分泌(P<0.01)的同时显著抑制心房搏出量(P<0.01)。但nifedipine未能改变forskolin对ANP分泌的抑制(P<0.01)和促进cAMP生成增多的效应(P<0.01)。在nifedipine存在下,forskolin增加心房搏出量的作用被消失并呈现抑制效应(P<0.01)。 8.蛋白激酶非选择性抑制剂staurosporine(1.0 μmol/L)对ANP分泌和cAMP逸出量没有产生明显影响,但显著降低心房搏出量(P<0.01)。在staurosporinc存在下,forskolin仍明显增加cAIMP逸出量,但对ANP分泌的抑制效应得到缓解(P<0.01)。此时,心房搏出量明显受到抑制(P<0.01)。 以上结果提示: 1.PACAP27和腺苷酸环化酶直接激活剂forskolin促进cAMP生成增多的同时抑制心房ANP的分泌; 2.PACAP27对ANP分泌的抑制作用是通过AC-cAMP-PKA和L-型Ca<'2+>通道的信号转导途径实现的; 3.Forskolin通过AC-cAMP-蛋白激酶依赖而非依赖于L-型Ca<'2+>通道的信号转导途径抑制ANP的分泌。
[硕士论文] 和俊涛
动物学 河南师范大学 2007(学位年度)
摘要:以部分肝切除(partial hepatectomy,PH)诱导的雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180~200g)再生肝为材料,在PH前3天行双侧肾上腺切除术(bilateral adrenalectomies)。不同剂量外源皮质酮分散于芝麻油中皮下注射去肾上腺大鼠,每12 h 一次,直至乙醚麻醉处死。用一步法RT-PCR与Southern blot相结合的方法定量研究了大鼠再生肝中鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)mRNA的水平,分析了皮质酮剂量与ODC基因转录活性之间的关系。为阐明糖皮质激素在大鼠肝再生中的作用及其调节机制积累资料。结果如下: (1)对定量分析ODC基因表达的一步法RT-PCR的条件进行优化,模板量为1μg肝总RNA,反转录30 min后分别对ODC mRNA和GAPDH mRNA进行25及22个循环数扩增。 (2)完整肝脏(PH 0 h)中,对照鼠(去肾上腺假手术鼠)ODC mRNA较低;肾上腺切除导致mRNA的水平升高50%;低剂量(10mg/kg体重)、中等剂量(20 mg/kg体重)和高剂量(40 mg/kg体重)外源皮质酮处理分别降低odc表达5%、7%及64%。 (3)PH诱导的再生肝中,对照组ODC mRNA水平快速升高,在3 h显著高于0 h近2倍;5 h达到峰值,几乎为0 h的3倍,随后逐渐降低;但在观察到的实验阶段仍维持高水平,极显著高于0 h(P<0.01)。 各个剂量外源皮质酮处理组ODC mRNA水平变化趋势与对照组相似。与对照组相比,低剂量、中等剂量、高剂量皮质酮处理,PH后再生肝ODC mRNA水平在3 h分别降低22%、36%、55%;在5 h分别降低17%、36%、63%;在7 h分别降低12%、38%、64%;在9 h分别降低20%、45%、69%;在12 h分别降低27%、46%、77%,均有极显著性差异(P<0.01)。而去肾上腺组在对应的时间点则分别升高:11%、13%、9%、1%、4%。 结果表明,对大鼠完整肝以及早期的再生肝,外源皮质酮和内源糖皮质激素调节ODC基因转录的方式一致,均为抑制作用,抑制程度与处理剂量呈正相关。
[硕士论文] 刘振军
动物营养与饲料加工 四川农业大学 2006(学位年度)
摘要:本试验研究饲粮中添加γ-氨基丁酸(GABA),对21日龄仔猪在断奶后第14天和第28天生长性能的影响,并通过考察与采食量相关的内分泌激素以探讨GABA对断奶仔猪的作用机理。试验选取21日龄断奶杜长大仔猪40头,随机区组分成4组,每组设10个重复,每个重复1头。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲粮在基础饲粮中分别添加50mg/kg(处理一),100mg/kg(处理二),150mg/kg(处理三)GABA。实验结果如下: 1.与对照组相比,饲粮中GABA的添加量为50mg/kg时,前期(实验前两周)、后期(试验后两周)及全期的日采食量和日增重分别提高了11.2%、13.2%、12.6%和5.6%、18.9%、15.2%。添加量为100mg/kg时,分别提高了5.4%、4.4%、4.7%和8.6%、4.3%、5.4%。添加量为150mg/kg时降低了前期、后期、全期的采食量和日增重分别达10.1%、6.4%、7.5%和20%、1.6%、6.6%。处理组间相比,随着GABA添加量的提高,断奶仔猪的前期、后期和全期采食量和日增重逐渐降低。从后期和全期看,处理一组仔猪的日采食量显著高于处理三(P<0.05)。添加GABA不影响后期和全期饲料转化效率;且消化试验表明,添加GABA对没有影响粗蛋白的表观消化率。 2.与对照组相比,饲粮中添加50mg/kgGABA能够抑制仔猪CCK分泌;150mg/kg刺激了仔猪CCK分泌。而添加100mg/kgGABA对仔猪CCK分泌有较弱的抑制作用。 3.各试验组采食后NPY的浓度较采食前均有升高的趋势;并且GABA添加量越高,采食后血液中NPY的浓度提高幅度越大。 4.与对照组相比,处理组第14天,28天各采食前血液中α-MSH浓度均有升高的趋势;第14天,100mg/kg和150mg/kg组采食后血液中α-MSH浓度高于对照组(P>0.05);而50mg/kg组采食后血液中α-MSH浓度要低于对照组(P>0.05)。 结论:本研究结果表明,饲粮中添加适量水平的GABA能够促进断奶仔猪的生产性能。其中,50mg/kg的GABA提高了采食量和日增重;而100mg/kg的GABA对采食量和日增重的改善程度较低;150mg/kg的GABA却降低了采食量和日增重。另外,GABA并没有影响饲料利用率。通过对采食相关的内分泌激素研究表明,低剂量GABA促采食的原因可能与此时GABA降低了机体CCK分泌,提高NPY分泌,抑制α-MSH分泌有关。
[博士论文] 董静
生理学 浙江大学 2006(学位年度)
摘要:胰岛素参与人和动物的糖代谢。血糖水平直接调节胰岛素分泌。我们研究发现严重低氧显著降低动物摄食量和体重增重,并使动物体内的糖代谢从有氧氧化转化为无氧糖酵解,导致葡萄糖大量消耗,血糖水平降低。低氧,特别是连续低氧如何影响胰岛素分泌?低氧激活的下丘脑-垂体-肾上腺轴是否参与胰岛素分泌的调节?我们利用低压氧舱模拟不同海拔高度(2 km和5 km)、不同时间的低氧对胰岛素分泌的影响。用放射免疫测定法检测大鼠血浆和胰腺胰岛素、胰高血糖素、生长抑制素(水平或者含量)以及血浆瘦素、皮质酮水平,用葡萄糖氧化酶法测试血糖浓度和胰腺葡萄糖含量,用葸酮法测定肝糖原含量。同时,研究5km连续低氧5天,CRFR1、CRFR2和SS参与胰岛素分泌的调节。实验结果如下: 1.间歇性低氧、低温、束缚及其复合应激对胰岛素分泌水平的影响 模拟2 km间歇低氧(4小时/天,连续15天)对大鼠的体重增重没有显著影响,而模拟5 km间歇低氧(4小时/天,连续15天)显著抑制大鼠体重增重。单独冷应激、模拟2 km低氧应激(4小时/天,连续2天)+冷应激、2 km低氧应激、2 km低氧应激+束缚应激和单独束缚应激都明显抑制大鼠体重的增重,其中束缚应激的抑制作用最为明显,可是对大鼠血浆胰岛素水平无明显影响。与各自的单独应激相比较,冷应激+5 km低氧(4小时/天,连续2天)的复合应激,束缚应激+5 km低氧的复合应激显著地抑制了大鼠体重的增重。这五种应激又显著降低了大鼠肝糖原含量,升高了血浆胰高血糖素水平。 2.连续性低氧对胰岛素分泌水平的影响 与海平面常氧对照组相比,模拟2 km连续低氧1-25天(1、2、5、10、15和25天)没有明显影响大鼠体重变化、摄食量和血浆胰岛素水平,但在低氧第2天显著升高肝糖原含量和血糖水平,在第10天明显升高血浆胰高血糖素水平,在第1天血浆皮质酮水平显著升高,在第1和第2天瘦素水平明显上升,然而在第5天瘦素水平显著下降。与海平面常氧对照组相比,模拟5 km连续低氧1-25天(1、2、5、10、15和25天)显著地降低了大鼠体重和摄食量。5 km连续低氧第1和2天显著降低大鼠肝糖原含量,第5、10、15和25天显著降低大鼠血糖水平,第2、5、10和15天显著下降低大鼠血浆胰岛素水平,第2天显著增加大鼠血浆胰高血糖素水平,第1和第2天显著增加大鼠血浆瘦素水平,然而低氧5天后,大鼠的血浆瘦素水平降低,低氧第1、2、5、10和15天,大鼠的血浆皮质酮水平显著上升。 3.促肾上腺皮质激素释放因子1型受体(CRFR1)参与调节低氧抑制胰岛素分泌水平 与海平面常氧对照组相比,模拟5 km连续低氧5天显著降低了大鼠体重、摄食量、血糖水平、胰腺葡萄糖含量、血浆胰岛素水平,也显著升高胰腺胰岛素含量和血浆皮质酮水平。与低氧组相比,CP-154,526预处理+模拟5 km连续低氧5天进一步降低血糖,逆转了低氧诱导的胰腺葡萄糖和血浆胰岛素的降低以及血浆胰高血糖素的升高,也逆转了血浆皮质酮的升高。与CP-154,526对照组相比,CP-154,526处理+模拟5 km连续低氧5天显著降低体重、血糖和血浆胰高血糖素水平,显著升高胰腺葡萄糖和胰腺胰岛素含量。 4.促肾上腺皮质激素释放因子2型受体(CRFR2)参与调节低氧下胰岛素分泌水平 与海平面常氧对照组相比,AS-30拮抗(30μg/kg)+模拟低氧4小时组显著升高了血糖水平,也显著降低血浆胰岛素水平。低氧组、低氧+AS-30拮抗组(20μg/kg)和低氧+AS-30拮抗组(30μg/kg)显著降低摄食量以及低氧组显著降低血浆皮质酮。低氧+AS-30拮抗组(30μg/kg)进一步降低了摄食量。 5.生长抑制素参与调节低氧抑制胰岛素分泌水平 与海平面常氧对照组相比,模拟5 km低氧1-10天(1、2、5和10天)显著降低大鼠体重和摄食量,低氧第5和10天显著降低血糖水平,低氧第1和2天显著升高胰腺葡萄糖含量,而第5和10天显著降低,第5和10天显著降低血浆胰岛素水平和升高胰腺胰岛素含量,第2天显著升高胰高血糖素水平,第5和第10天显著升高血浆生长抑制素水平和胰腺生长抑制素含量。与5 km低氧组相比,CSH-HCl预处理+低氧组的第1和5天体重和摄食进一步降低,第5天完全逆转低氧诱导的血糖降低和胰腺胰岛素的升高,第1和5天血浆胰高血糖素水平降低,第1和5天逆转低氧诱导的血浆生长抑制素的升高。与CSH-HCI对照组比较,CSH-HCI处理+低氧组第5天显著降低体重和摄食,5天显著降低血糖、血浆胰岛素、胰腺胰岛素和血浆胰高血糖素,但胰腺生长抑制素含量显著升高。 结论: 1.模拟2 km间歇低氧(4小时/天,连续2天)、低温、束缚及其复合应激对大鼠胰岛素分泌无明显影响。 2.模拟连续5 km低氧明显抑制大鼠胰岛素分泌,并呈以低氧时间和强度依赖性关系。该抑制作用与低氧引起的低血糖和高皮质酮水平相关。 3.胰岛素分泌抑制与促肾上腺皮质激素释放因子1型受体相关。 4.生长抑制素也参与低氧抑制胰岛素分泌。
[硕士论文] 郑丽娜
组织学与胚胎学 天津医科大学 2006(学位年度)
摘要:第一部分碘过量对Wistar大鼠仔鼠垂体TSH细胞的形态学影响 目的: 观察不同浓度碘酸钾喂养的20日龄和60日龄Wistar大鼠仔鼠其垂体TSH细胞的形态学变化,进一步探讨碘过量对垂体-甲状腺轴影响的机制。 方法 选用断乳后一个月,体重在120-140g的Wistar大鼠,雌雄各半,随机分为6组:①低碘组(LI);②适碘组(NI);③5倍碘组(5HI);④10倍碘组(10HI);⑤50倍碘组(50HI);⑥100倍碘组(100HI)。LI组动物饲以低碘地区的粮食(玉米、小麦、黄豆)制成的低碘饲料并添加动物必需的无机盐和维生素,平均碘含量小于50μg/kg,其它5组饲以正常鼠料(平均碘含量300μg/kg),上述两种饲料中各种粮食的配比是相同的,以保证饲料的主要营养素相同,只是碘含量不同。LI组饮用去离子水,NI组饮用自来水,5HI、10HI、50HI、100HI组大鼠分别饮用含不同浓度的碘酸钾的自来水,其饮水中碘含量(以I-计)分别为820μg/L、1845μg/L、10045μg/L和20295μg/L。大鼠每日碘摄入量估计如下:大鼠每日进食20g,进水30mL,天津市自来水的碘含量为5μg/L,去离子水碘含量为0μg/L,各组动物每日摄碘量估计为1μg/L(LI),6.15μg/L(NI),30.75μg/L(5HI),61.5μg/L(10HI),307.5μg/L(50HI),615.0μg/L(100HI)。喂养3个月后,雌雄大鼠按1∶1比例合笼交配生育仔鼠。断乳后各组仔鼠的喂养方法同前。观察20日龄、60日龄仔鼠垂体TSH细胞的组织学变化,测定20日龄、60日龄仔鼠垂体和60日龄甲状腺的相对重量,对垂体TSH细胞的体密度和面数密度进行形态计量学分析,并计数分析60日龄仔鼠TSH的强阳性细胞数。 结果 (1)20日龄、60日龄LI组和各碘过量组仔鼠垂体的相对重量与NI组相比无差异(P>0.05),60日龄各碘过量组仔鼠的甲状腺相对重量与NI组相比无统计学意义(P>0.05)而LI组明显高于NI组(P<0.01)。(2)对垂体TSH细胞免疫组化光镜观察显示:TSH细胞胞质内免疫反应程度不同,反应较强的呈棕褐色,较弱的呈浅棕色,反应产物呈颗粒状,胞核均不着色。(3)对TSH细胞体密度和面数密度的测定,结果表明20日龄仔鼠100HI组的体密度明显高于NI组(P<0.01),各碘过量组的面数密度与NI组相比无变化(P>0.05),LI组的体密度和面数密度均高于NI组(P<0.01);60日龄仔鼠50HI组、100HI组的体密度和面数密度明显高于NI组(P<0.01),LI组显著高于NI组(P<0.01),5HI、10HI组与NI组相比无统计学意义(P>0.05)。(4)60日龄仔鼠强阳性细胞计数:LI组强阳性细胞数量较少,50HI组、100HI组的强阳性细胞数明显高于NI组(P<0.01)。 结论 20日龄仔鼠100HI组TSH细胞的体积增大。60日龄仔鼠50HI组、100HI组TSH细胞的体积增大、数目及强阳性细胞数增多,但垂体和甲状腺的相对重量无明显变化,因此没有造成60日龄仔鼠甲状腺肿大,可见甲状腺对碘过量有较强的适应性和耐受性。 第二部分碘过量对大鼠仔鼠胸腺的形态学影响 目的:研究碘过量对Wistar大鼠仔鼠胸腺指数与胸腺皮髓质体积比的影响。 方法:选用断乳后一个月,体重在120-140g的Wistar大鼠(购自北京维利通华实验技术有限公司,属SPF/VAF级动物),雌雄各半,随机分为6组:①低碘组(LI);②适碘组(NI);③5倍碘组(5HI);④10倍碘组(10HI)⑤50倍碘组(50HI)⑥100倍碘组(100HI)。LI组动物饲以低碘地区的粮食(玉米、小麦、黄豆)制成的低碘饲料并添加动物必需的无机盐和维生素,平均碘含量小于50μg/kg,其它5组饲以正常鼠料,(由北京科澳饲料有限公司提供,平均碘含量300μg/kg),上述两种饲料中各种粮食的配比是相同的,以保证饲料的主要营养素相同,只是碘含量不同;;LI组饮用去离子水,NI组饮用自来水,5HI、10HI、50HI、100HI组大鼠分别饮用含不同浓度的碘酸钾的自来水,其饮水中碘含量(以I-计)分别为820μg/L、1845μg/L,10045μg/L,20295μg/L。大鼠每日碘摄入量估计如下:大鼠每日进食20g,进水30mL,天津市自来水的碘含量为5μg/L,去离子水碘含量为0μg/L,各组动物每日摄碘量估计为1μg/L(LI),6.15μg/L(NI),30.75μg/L(5HI),61.5μg/L(10HI),307.5μg/L(50HI),615.0μg/L(100HI)。喂养3个月后,雌雄大鼠按1∶1比例合笼交配生育仔鼠。断乳后各组仔鼠的喂养方法同前。大鼠仔鼠于1日龄、20日龄、60日龄时处死,取出胸腺,称重,HE染色,测定胸腺指数和胸腺皮髓质体积比两个指标。 结果:(1)与NI组相比,1日龄和20日龄LI组仔鼠的胸腺指数显著降低(P<0.01),60日龄降低不明显(P>0.05);20日龄100HI组的胸腺指数降低(P<0.05),1日龄和60日龄碘过量组的胸腺指数与NI组相比均无差异(P>0.05)。(2)与NI组相比,1日龄、20日龄和60日龄仔鼠各组间胸腺皮髓质体积比无明显变化(P>0.05);1日龄、20日龄和60日龄胸腺皮髓质体积比的总趋势为:从1日龄到20日龄升高,从20日龄到60日龄降低。 结论:碘过量对1日龄、20日龄和60日龄仔鼠胸腺的皮髓质体积比没有明显影响;100HI可使20日龄仔鼠的胸腺指数降低,但随时间的延长在60日龄时又恢复正常。
[硕士论文] 许晓军
动物学 河南师范大学 2006(学位年度)
摘要:目的:KK-42是一种保幼激素拮抗物。本文研究了KK-42处理对经济十足类儿纳滨对虾的促生长作用及其对儿纳滨对虾大颚器官发育、大颚器官细胞的超微结构和性腺发育的影响,旨在探讨KK-42促进凡纳滨对虾生长的机理。 方法:采用浸润法,用1.95×10-4mol/L的KK-42处理儿纳滨对虾虾苗(体长0.6-0.8cm)40秒,然后按正常方法饲养。在养殖过程中定期采样,测量虾的体重;用常规组织学技术研究凡纳滨对虾大颚器官发育和KK-42对其影响;用透射电镜技术研究凡纳滨对虾大颚器官细胞超微结构特点和KK-42对其影响;用常规组织学技术研究凡纳滨对虾精巢、卵巢发育和KK-42对其的影响。 结果:在养殖后期,KK-42处理组凡纳滨对虾体重显著高于对照组,第90天和第105天处理组体重分别高于对照组42.5%和22.1%。伴随动物的发育,其大颚器官细胞直径在第105天显著增大;腺泡数目逐渐增多,在第60天、第90天和第105天显著高于第30天。KK-42处理后,大颚器官细胞直径和大颚器官腺泡数目在第30天、第60天、第90天和第105天显著小于对照组。大颚器官细胞超微结构特点为:滑面内质网与线粒体丰富,滑面内质网常紧密围绕线粒体,基膜一侧有大量细胞膜内陷;KK-42处理后产生的影响主要表现在动物生长发育的后期,所观察到的细胞器中变化最为显著的是线粒体,第90天和第105天,线粒体嵴及其膜遭到不同程度的破坏。在第90天凡纳滨对虾精巢发育处在精原细胞阶段,处理组精原细胞直径小于对照组6.5%,具有显著性差异;第105天精巢出现初级精母细胞,KK-42处理组初级精母细胞直径大于对照组11.4%;在第105天儿纳滨对虾卵巢发育处于卵原细胞阶段,处理组卵原细胞直径小于对照组7.7%。 结论:KK-42对儿纳滨对虾有促生长作用,并能抑制大颚器官的发育、破坏线粒体的结构,对性腺发育也有一定程度的抑制作用。
[博士论文] 季业伟
药理学 重庆医科大学 2006(学位年度)
摘要:真核生物细胞中热休克蛋白90(Hsp90s)作为关键的和广泛存在的分子伴侣,对于一系列客户蛋白的折叠、活化和组装具有重要的作用,从而影响信号转导、细胞周期调控和转录调节等过程。糖皮质激素受体(GR)是非常重要的信号分子,与糖皮质激素(GC)结合后引起广泛的生理效应和药理效应,对于许多生理过程如应激、代谢、炎症和免疫反应具有不可缺少的调节作用。 GR是Hsp90的客户蛋白之一,研究得较为深入,Hsp90对GR的作用过程可以代表性的展示分子伴侣蛋白对信号分子的处理和作用方式。我们知道,Hsp90能够改变GR的立体构象,使GR的配体结合域象一个口袋一样打开,从而能够与糖皮质激素结合。当GC浓度增加,Hsp90从多种蛋白组成的GR复合体解离,使GC有机会进入这。一口袋,得以与配体结合域结合。然后将会形成一个新的多蛋白复合体,包括GR,Hsp70,Hsp56和亲免素。Hsp70和Hsp56将发挥对已活化的GR复合体的导向功能,使GR转运到细胞核内,然后GR可以上调或者下调目标基因的转录从而得以发挥生理效应。然而,有研究者指出,GR与GC结合后,仍然是在Hsp90的参与下并依赖于细胞骨架结构才从胞浆向胞核运动。 胞浆中的Hsp90主要有两种亚型,Hsp90ct(诱导型)和Hsp90p(组成型)。这两种亚型的编码基因位于不同的染色体。比对发现,同物种(如人或小鼠)的两种亚型的碱基序列的同源性低于不同物种之间的(如人与小鼠之间)相同亚型的序列同源性。而且,Hsp90a和Hsp90p的表达与诱导模式都不一致。考虑到这些,我们设想Hsp90a和Hsp90p在发挥对GR信号通路的伴侣功能方面具有不同的作用。我们进一步假设,Hsp90p亚型,而非Hsp90a亚型,才是使GR形成能结合GC的成熟构象的关键分子。 众所周知,不同的个体可能因为遗传背景不一致而具有不同的糖皮质激素敏感性。最近的研究指出,正常人群中6.6%的人对糖皮质激素相对高敏,而2.3%的人对糖皮质激素相对抵抗。尽管少数家系对GC抵抗的病例具有GR基因的多态性,许多病例并没有发现这种GR基因多态性。既然Hsp90在GR信号通路中扮演的角色极为关键,我们设想一些个体糖皮质激素的敏感性不同源于Hsp90p基因的单核苷酸多态性(SNP)。我们实验室发现,遗传背景相似的两种小鼠,C57BL/6和BALB/c,在全身性冲击伤和急性胰腺炎损害中,耐受潜能和死亡率不一致。我们发现这两种品系小鼠的GR效应是不一致的,GR核转位能力不一样,与染色质的结合能力也不一样,我们认为GR效应的差异至少是损伤耐受能力表型差异的部分原因。所在实验室已完成了对C57BL/6小鼠的Hsp84mRNA全长测序工作,当和Genebank上面已提交的BALB/c小鼠的Hsp84mRNA序列比对时发现有四个碱基发生错义突变,使Hsp84蛋白质的4个氨基酸残基发生替换。我们将进一步检查这一个假设:这两种品系小鼠Hsp84存在着SNP,决定了GR效应的差异,进而影响炎症和损伤耐受方面的表型差异。 一研究目标 1.证明Hsp90a、Hsp90p(小鼠Hsp84、Hsp86)对于GR形成并维持能结合GC的成熟构象进而与GC结合后从胞浆转运到胞核等环节的作用有差异。 2.证明Hsp84基因多态性能够影响GR的生物学效应,即来源于C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的Hsp84在协助GR从细胞浆到细胞核转位的方面具有不同的效率,Hsp84基因多态性是遗传背景高度同源的C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠炎症反应程度差别显著的重要原因。 二研究内容和研究结果 1.将化学合成的三段寡聚核苷酸与线性化的pSUPER-EGFP载体连接获得了可用于沉默Hsp90p基因实验的三个质粒,测序验证沉默质粒构建成功。我们先后用不同的脂质体和质粒比例转染HUVEC、HepG2、HEK293三种细胞,以绿色荧光蛋白作为评价转染效率的指标,在HEK-293细胞中优化转染条件,转染效率可以达到80%左右。2通过RT-PCR的方法扩增小鼠Hsp84基因,将其先后重组入pMDl8-T和pcDNA3.1载体,通过测序和双酶切的方法表明载体构建正确,得到了可用于在真核细胞中表达Hsp84蛋白的重组质粒pcDNA3.1一hsp84。 3用半定量PCR的方法,通过与空质粒转染组和未处理组比较发现:pSuper-Hsp9082转染后18小时HEK-293细胞中Hsp90BmRNA水平明显下降,而pcDNA3.1一hsp84转染后18小时HEK-293细胞中Hsp90BmRNA水平明显上升。 4GR结合GC后会从细胞浆向细胞核转移以调节基因转录,细胞核中GR与细胞浆中GR数量的比值会增大。免疫印迹实验发现,pcDNA3.1-Hsp84转染HEK-293细胞24h后,与正常细胞组和pcDNA3.1组相比,GR核浆IOD相对值的比显著升高。pSuper-Hsp9082转染细胞24h后,与正常细胞组和pSuper—control组相比,GR核浆IOD相对值的比显著下降。这提示Hsp90B是负责使GR构象转化的亚型。 5BALB/c小鼠来源的Hsp84mRNA通过RT-PCR,将全长编码框插入pMDl8-T载体后进行测序,另外用三对引物分段扩增Hsp84mRNA上不同区段得到的PCR产物直接测序。结果表明:和C57BL/6Hsp84mRNA的序列比较,BALB/c小鼠Hs~84mRNA序列仅存在无义碱基突变。从Hsp84基因SNP的角度去解释两种品系小鼠GR功能的差异是失败的。但是GR信号通路是多种伴侣分子和辅助伴侣分子参与的多个环节的过程,探讨其他分子是否存在SNP并是否因之导致GR效应差异是合理的设想和研究方向。
[硕士论文] 赵勤
代谢内分泌学 中南大学 2006(学位年度)
摘要:本研究的目的是探讨成年男性血清瘦素(Leptin)、脂联素(Adiponectin)、抵抗素(Resistin)、内脏脂肪素(Visfatin)与骨密度(BMD)及体脂的关系。 方法:用ELISA测定232名20-80岁健康男性血清Adiponectin、Leptin、Resistin、Visfatin;化学发光法测定血清Estradiol;放免法测定血清Insulin;用DXA测定腰椎前后位仰卧(AP)、L2~L4侧位中间区(Lat)、左侧髋部BMD(T-hip),全身扫描测定全身BMD(TBMD)及体脂(FTM)、躯干体脂、瘦体重(LTM),用10种回归模型拟合男性血清Leptin、Adiponectin、Resistin、Visfatin和体脂与各部位BMD的相关关系,找出最佳拟合模型。采用逐步多元线性回归法分别判定年龄、身高、瘦体重、体脂、吸烟及血清Leptin、Adiponectin、Resistin、Visfatin对各部位BMD的决定作用。 结果: (1)血清Adiponectin、Leptin与年龄、体重、腰围、BMI、WHR显著相关,血清Leptin与年龄、腰围、BMI以三次回归模型拟合程度最好,拟合曲线的决定系数(R<'2>)为0.042~0.380(P<0.05),血清Leptin与体重、WHR以复合回归模型拟合程度最好,R<'2>为0.261~0.262(p=0.000);血清Adiponectin与年龄、体重、腰围、BMI、WHR以三次回归模型拟合程度最好,R<'2>为0.0230.085(p<0.05);血清Resistin与年龄、体重、腰围、BMI相关,血清Resistin与年龄以S型回归模型拟合程度最好,R<'2>为0.096(P=0.0000),血清Resistin与体重、腰围、BMI以三次回归模型拟合程度最好,R<'2>为0.024~0.034(p<0.05);血清Visfatin与年龄以二次回归模型拟合程度最好,R<'2>为0.042(p<0.05)。 (2)血清Leptin与体脂、躯干体脂及体脂百分比显著正相关(r=0.658~0.688,p=0.000),血清Leptin与体脂、躯干体脂及体脂百分比以复合回归模型拟合程度最好,R<'2>为0.411~0.433(P=0.000);血清Adiponectin与体脂、躯干体脂及体脂百分比显著负相关(r=-0.199~0.248,p<0.002),血清Adiponectin与体脂、躯干体脂及体脂百分比以三次回归模型拟合程度最好,R<'2>为0.096(p=0.000);Visfatin、Resistin与体脂、躯干体脂及体脂百分比不相关。 (3)血清Adiponectin与Lepfin、Estradiol、Insulin呈负相关(r=-0.139~-0.262,p<0.007),与血清Resistin呈正相关(r=0.262,P=0.000),Levtin与Estradiol、Insulin呈显著正相关(r=0.152~0.364,p<0.003),Visfatin与Estradiol呈负相关。 (4)血清Adiponectin与各部位BMD呈负相关(r=-0.320~0.361,P=0.000),血清Leptin与腰椎正位、侧位及髋部总体呈正相关(r=0.142~0.162,P<0.038),血清Resistin与腰椎正位及股骨颈呈负相关(r=-0.172~-0.185,P<0.029),血清Visfatin与股骨颈、髋部总体呈正相关(r=0.161~0.171,p<0.022),校正年龄及吸烟、体脂及瘦体重后,血清Adiponectin与各部位BMD仍显著负相关,而血清Resistin、Leptin、Visfatin与各部位BMD均不相关。 (5)体脂及瘦体重与各部位BMD均显著正相关(r=0.230~0.355,P<0.006),瘦体重与各部位BMD的相关性强于体脂与各部位BMD相关性。 (6)逐步多元线性回归分析,血清Adiponectin是男性各部位BMD的独立影响因素,Adiponectin的单独变化可以预测各部位BMDl.3~3.9%的变异;瘦体重的单独变化可说明各部位BMDl0.5~16.3%的变异。 (7)按血清Adiponectin值的四分位数将研究人群分为四组,发现血清Adiponectin第四个四分位数组各部位BMD明显低于第一个四分位数组极低水平组。 结论 1.血清Leptin、Adiponectin、Resistin、Visfatin与年龄相关,校正体脂后Leptin、Adiponectin、Resistin、Visfatin与年龄的相关性消失。 2.血清Leptin与体脂、躯干体脂及体脂百分比呈正相关,血清Adiponectin与体脂、躯干体脂及体脂百分比呈负相关,Resistin、Visfatin与体脂、躯干体脂及体脂百分比不相关。 3.血清Adiponectin与各部位BMD呈负相关,是男性各部位BMD的独立影响因素;血清Resistin、Lepfin、Visfatin与男性各部位BMD均不直接相关。 4.瘦体重与各部位BMD呈正相关,是男性各部位BMD的独立影响因素。
[硕士论文] 滕丽萍
生物化学与分子生物学 南京医科大学 2006(学位年度)
摘要:运用高密度寡和苷酸芯片建立大鼠胰腺发育不同阶段(胚胎(E)12.5,E15.5,E18.5,新生和成年)的基因表达谱,经过生物信息学数据分析发现许多与胰腺功能相关的基因在E18.5相对高表达,提示胚胎发育后期胰腺功能正趋于完善和成熟,这个时期正是胰岛细胞迁移聚集形成典型胰岛结构的关键阶段,而典型的胰岛结构是胰腺发挥正常生物学功能的基础。本研究从基因表达谱中筛选出一条在E18.5特异性高表达的基因Mesothelin,旨在初步探讨该基因在胰岛细胞迁移、黏附及胰岛结构维持中的作用。 运用实时荧光定量PCR技术进一步验证Mesothelin基因在大鼠胰腺胚胎发育不同阶段的mRNA表达水平,同时检测与之相关的上游调控因子Wnt-1和Wnt-5a的表达情况。结果显示:实时荧光定量PCR与基因芯片中检测到的Mesothelin基因的表达趋势一致;Wnt-5a呈现出两种截然相反的表达趋势,其中一种趋势与基因芯片中的表达相吻合,且与Mesothelin的表达趋势相反;Wnt-1表达量极低,几乎未检测到。 基于以上实验结果,我们推测细胞黏附分子Mesothelin可能调控胰腺胚胎发育后期胰岛细胞的迁移、聚集、黏附及胰岛结构的形成和维持,其作用的发挥可能受上游Wnt-5a信号通路的调控;而Wnt-5a在大鼠胰腺胚胎发育过程中可能存在两种不同转录变异体,其存在的机制可能在于转录水平转录起始位点的调控或者是转录后水平选择性剪切的作用。
[博士论文] 杨凌辉
内科学(内分泌与代谢病) 第二军医大学 2005(学位年度)
摘要:褪黑素(Mel)是松果体分泌的一种神经内分泌激素,其昼低夜高的分泌规律,决定了人类昼夜节律生物钟的模式运行。近年来研究表明,褪黑素除具有催眠、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等作用外,松果体褪黑素作为光周期信号在调节昼夜节律和季节性节奏方面起着重要作用。其中,褪黑素与能量代谢的关系在肥胖如此盛行的今天尤为引人注目,但报道的较少。 在许多小型哺乳动物中,体重存在季节性变化是对能量的获得性(食物数量与质量)与能量需求(体温调节、繁殖等)的适应。光照周期的缩短使生物感受到冬天的来临,自然选择使那些善于感知并能预先准备的生物得以幸存。各种生物均有自己的越冬方式,而在寒冷的环境中生存,能量问题是决定命运的首要问题。大多数季节性哺乳动物采用的是提前的能量储存,即在感受到光照周期缩短开始逐渐增加摄食并将多余的能量转换成脂肪储存起来以备越冬,如叙利亚仓鼠。非常有趣的是少数季节性哺乳动物则以相反的方式来面对冬季,如西伯利亚仓鼠就是在夏季体重保持稳定,而在冬季来临之前减少身体脂肪的存储。虽然此举减少了动物御寒的保护层,但体重的下降同样也使它们减少了负担以及食物的需求量,或许还有不为人类所知的其他原因。但无论如何,从中发现光照引起的褪黑素的改变的确与能量代谢有着密切的关系。 虽然人类具有昼夜节律的存在,但对光照周期的季节性生理改变不明显,因此其对人类能量代谢的影响尚未见报道。由于人类应用人造光的历史悠久,据此一些科学家认为人类已进化成不依赖光周期及褪黑素作用的一类生物。其实,根据褪黑素对人类睡眠影响的实验结果及其它实验结果,相信褪黑素仍然是一个对人的昼夜节律和季节性节奏调节的光周期信号,只是因为影响人类能量代谢的因素太多,使得光周期信号在人类这样高级的动物面前显得有些微不足道。研究发现在人类褪黑素信号是通过视交叉上核传入室旁核,而瘦素及胰岛素的信号则是通过弓状核传入室旁核。由此看出虽然路径不同,但都是传入起能量整合作用的室旁核。在人类,随着年龄的增加褪黑素的水平在不断减少,而腹腔脂肪组织的量、血浆瘦素、胰岛素水平却在不断的增加。每日给大鼠一定剂量的褪黑素喂养可以使大鼠腹腔脂肪组织的量保持在较年轻的水平。由此认为,光照周期的改变引起褪黑素的浓度的变化,的确可以作为一种环境因素起到调节能量代谢的作用,光照作用与其他影响能量代谢的因素如:社会心理因素、饮食因素、运动因素、遗传因素等一起参与能量代谢的调节。但褪黑素影响能量代谢的机制尚不清楚。 该实验通过长、短光照周期及高、低剂量褪黑素干预SD大鼠3周,观察: (1)大鼠体重及腹腔脂肪组织量的改变。 (2)大鼠血浆瘦素、胰岛素及三酰甘油等的变化。 (3)大鼠腹腔脂肪组织β3肾上腺素能受体、褪黑素受体表达的变化。 (4)下丘脑组织褪黑素受体的改变。以进一步明确褪黑素及光照周期改变对能量代谢调节的作用及机制。 方法 1.光照周期及Mel对大鼠能量代谢影响的观察 (1)长(光:暗=16:8)、短(光:暗=8:16)光照时间及不同剂量(高剂量褪黑素浓度即药理浓度为10mg/kg/d,低剂量褪黑素浓度即生理浓度为0.2mg/Kg/d)Mel干预3周后,对大鼠体重及腹腔脂肪组织质量进行称重测量。 (2)长、短光照时间及不同剂量Mel干预3周后,观察大鼠外周血与能量代谢有关的指标如瘦素、胰岛素以及三酰甘油的改变。 2.光照周期及Mel对大鼠脂肪组织代谢影响机制的研究 (1)长、短光照时间及不同剂量Mel干预3周后,采用实时定量RT-PCR方法观察腹腔脂肪组织β3肾上腺素能受体、褪黑素受体mRNA表达的变化。 (2)长、短光照时间及不同剂量Mel干预3周后,采用免疫组化方法观察大鼠下丘脑褪黑素受体表达的变化。 结果 1.高剂量Mel干预可以降低大鼠的体重、腹腔内脂肪组织、血浆瘦素水平,但对血浆胰岛素、三酰甘油水平无影响。 2.高剂量Mel干预使下丘脑褪黑素受体1蛋白表达降低,褪黑素受体2蛋白表达无变化。 3.高剂量Mel干预使腹腔脂肪组织褪黑素受体1的mRNA表达降低、β3受体mRNA表达增强,褪黑素受体2的mRNA表达无变化。 4.低剂量Mel干预及光照周期的变化对上述指标均无明显影响。 结论 1.Mel具有调节大鼠脂肪组织代谢的作用,但其作用具有剂量的依赖性,大剂量干预对其有影响,而小剂量干预对其没有影响。光照周期改变尽管没有影响,但该文认为这可能与实验周期仅为3周,其时间跨度不够有关,因为环境的影响是长期的作用结果。 2.Mel对大鼠脂肪组织代谢的作用表现在可以改变大鼠的体重及附睾周围脂肪组织的量,是否对皮下脂肪组织有影响尚未做观察。 3.Mel可以改变大鼠的体重及附睾周围脂肪组织的量可能与血浆瘦素的改变有着互为结果的关联,但血浆三酰甘油无改变说明可能只是局部脂肪组织代谢的改变或者只是褪黑素本身影响生殖功能的一种体现。胰岛素的变化不明显,推测与褪黑素具有抗氧化应激作用,通过提高胰岛素的敏感性起作用。 4.Mel可以引起腹腔内脂肪细胞mt1表达降低,mt1已被证实是与季节性节律有关的受体,说明Mel可能通过其在脂肪细胞上的受体直接参与了能量的调控;Mel也可以引起腹腔内脂肪细胞beta3受体表达增强,可能是Mel能量调控的作用部分是通过交感神经的作用所致。 5.Mel可以引起下丘脑mt1表达降低似乎可以证实其作用可能是通过视交叉上核到室旁核的途径,也表明mt1的确参与了能量代谢,因为瘦素及胰岛素的信号也是通过弓状核传入室旁核的。
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