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[博士论文] 张晓月
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:通过生物炼制将木质纤维素类生物质资源转化为生物能源和生物基化学品可有效缓解能源和资源短缺问题。该过程包括原料预处理、纤维素酶水解制备可发酵性糖以及微生物发酵产品生产等步骤,其中纤维素酶成本过高是制约整个生物炼制过程的瓶颈之一,因此选育纤维素酶高产菌株,降低纤维素酶生产成本,具有十分重要的意义。
  里氏木酶(Trichoderma reesei)是纤维素酶生产的常用工业菌株,其生产的纤维素酶主要由外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶组成,三种酶协同作用将纤维素水解成葡萄糖,这三种酶的合成受到多个关键转录因子的调控,包括转录激活因子Xyr1和抑制因子Cre1等。随着多组学研究的深入,其他影响纤维素酶合成的转录因子和功能基因不断被发现。另一方面,纤维素酶合成需要寡糖等诱导物诱导,其中槐糖是目前发现的最有效的诱导物,但价格昂贵。本课题组前期研究工作通过β-葡萄糖苷酶催化高浓度葡萄糖的转糖苷反应制备了廉价的葡萄糖-二糖混合物(Mixture of glucose and disaccharide,MGD),可高效诱导里氏木霉生产纤维素酶,但是MGD与常用的可溶诱导物乳糖在诱导产酶机理方面存在哪些差异还不清楚。
  为了深入探究MGD高效诱导产纤维素酶的内在机制,挖掘与纤维素酶生产相关的新功能基因,选育纤维素酶高产菌株,本文首先比较了乳糖和MGD两种可溶诱导物诱导T.reesei Rut C30纤维素酶生产的全局基因转录差异。结果表明,两者在诱导纤维素降解酶基因转录水平上存在明显差异,以MGD为诱导物时,糖苷水解酶(Glycoside hydrolase,GH)基因总转录量高于乳糖,编码主要纤维素酶的GH5、GH6和GH7家族基因总转录量是乳糖的1.4倍,但是编码木聚糖酶基因的总转录量低于乳糖对照组。里氏木霉纤维素降解酶基因表达受转录因子的协同调控以及负责碳信号转运的转运蛋白等影响,MGD诱导影响了转录因子和转运蛋白的转录量,负责全局转录调控作用的激活因子Xyr1转录量提高了1.6倍。同时,MGD上调了负责信号传导的丝裂原活化蛋白激酶途径中相关基因转录量,可能与提高纤维素酶基因表达有关。此外,MGD诱导时激活了mRNA监管途径中的相关基因,RNA运输过程加速,内质网蛋白质加工途径高速运转,并引起未折叠蛋白响应(Unfolded Protein Response,UPR),细胞中感受未折叠蛋白的跨膜激酶Ire1、诱导UPR特异转录因子Hac1以及分子伴侣Bip1和蛋白二硫键异构酶Pdi1转录量在MGD诱导条件下显著上调,有利于缓解UPR。
  里氏木霉纤维素酶合成与蛋白加工途径密切相关,因此继续研究了小分子量热激蛋白家族基因shsp(TrireC30_100314)、核苷交换因子基因nef(TrireC30_124246)和谷胱甘肽转移酶基因gst(TrireC30_10865)对纤维素酶生产的影响。在T.reesei Rut C30中分别过表达这三个功能基因,筛选得到转化子sHSP、NEF和GST,发现其过表达未显著提高纤维素酶分泌量,但是过表达三个功能基因均可提高菌株耐温性,在40℃高温条件下转化子的生长未受到明显抑制,而原始菌株生物量降低了约50%。以10g/LMGD作为诱导物时,与原始菌株相比,转化子在发酵24h时ire1表达量显著降低,而后纤维素酶基因转录量增大,蛋白质合成速率增加,转化子UPR相关基因的转录量亦增加。二硫苏糖醇(DTT)可以引起内质网应激反应,检测转化子和原始菌株在添加DTT平板上的生长情况,发现当添加10mM DTT时,转化子sHSP和NEF在培养84h时即有菌落生成,而转化子GST和原始菌株培养至120h时才开始有菌落生成,说明过表达shsp和nef可部分缓解内质网压力。
  纤维素降解酶基因启动子区域存在大量Xyr1和Cre1结合位点,T.reesei Rut C30的Cre1蛋白结合域因发生突变不能结合在基因启动子区,可利用这些结合位点强化Xyr1的激活效应。因此本研究设计了一个新型人工嵌合转录激活因子Xyr1-Cre1b,其具有Xyr1和Cre1的DNA结合域以及Xyr1激活域,该人工嵌合转录因子可以结合在Xyr1或Cre1结合位点,并通过Xyr1激活域高效启动纤维素降解酶基因表达。以T.reesei Rut C30为出发菌株,使用组成型强启动子pdc1持续高效表达Xyr1-Cre1b,可以激活主要的纤维素酶、半纤维素酶以及辅助蛋白基因表达,所得转化子在非诱导条件下具备产酶能力,但以MGD、乳糖或纤维素为诱导物时得到的最高酶活未发现显著变化。以10g/L葡萄糖为碳源,摇瓶培养转化子T.reesei zxy-2的滤纸酶活达到1.02IU/mL,较原始菌株提高了12.75倍。使用7-L发酵罐批式发酵48h时,滤纸酶活可达2.63IU/mL,木聚糖酶活达到108.72IU/mL。将制备得到的粗酶液用于水解碱预处理玉米秸秆以及吸附重金属Cd并解析后的自絮凝斜生栅藻,补加β-葡萄糖苷酶后,葡萄糖得率分别可达99%和65.9%,说明这种纤维素酶在酶解生物质制备可发酵性糖的过程中具备一定优势。
  本研究通过比较转录组学分析了可溶诱导物MGD诱导里氏木霉产纤维素酶的内在机制,构建了新的纤维素酶生产菌株,且证明使用人工嵌合转录激活因子Xyr1-Cre1b可有效提高菌株纤维素酶分泌量,为深入理解里氏木霉纤维素酶的诱导合成机制以及构建性能优良的产酶菌株提供了借鉴。
[硕士论文] 王莹
生物化工 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非天然手性氨基酸,在医药、化工领域都有广泛的应用。L-ABA的合成方法主要有化学法和生物法,其中以亮氨酸脱氢酶合成L-ABA的体系具有转化效率高、无副产物以及产物易分离等优点,在工业化生产上具有很大应用前景。亮氨酸脱氢酶合成L-ABA的体系是以L-苏氨酸为底物,先经苏氨酸脱氨酶脱氨生成α-酮丁酸,再利用亮氨酸脱氢酶将酮酸还原为L-ABA,同时还原反应所消耗的NADH通过甲酸脱氢酶再生。但是,在该生产体系中存在辅酶消耗量过大的问题,即反应过程中需再添加辅酶。针对此现状,本文通过在嗜温表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)中表达热稳定蛋白,再对重组细胞热处理以消除宿主蛋白对L-ABA合成的影响。使体系中辅酶的损耗降低,从而降低辅酶的需求量,为大规模工业生产L-ABA提供了更大的可能。同时,也为有辅酶参与的工业生物催化路径提供了一定参考。
  本文首先在嗜温通用表达宿主E.coli BL21(DE3)中分别表达Escherichia coli K12来源的苏氨酸脱氨酶(L-TD),热稳定的Bacillus sphaericus DSM730来源的亮氨酸脱氢酶(L-LeuDH)及Candida boidinii来源的甲酸脱氢酶(FDH)。
  针对野生型L-TD的热稳定性差而无法满足热处理的问题,故对其进行稳定性改造。首先设计了针对L-TD的高通量筛选方法,并利用易错PCR构建具有稳定突变率的突变体库。通过筛选,得到了三株阳性突变株:A14T、T344A和R449C,其在42℃下的半衰期(t1/2,42℃)从野生型的10min分别延长到14min,19min和15min。T5015(酶在该温度下15min内丧失50%的活力)则由39℃分别提高到41℃,42℃和41.2℃。为获得更多的阳性突变株,利用多重序列比对结合计算机模拟的方法选出可能与L-TD的稳定性相关的氨基酸残基,再通过定点饱和突变进行验证。最终筛选到两株阳性突变株G323D和F510L,其t1/2,42℃分别从野生型的10min延长到57min和44min,T5015则分别提高到46.2℃和44.8℃。以稳定性提高最明显的突变株G323D为模板,分别与A14T,T344A,R449C及F510L进行组合突变。其中组合突变株G323D/F510L的稳定性提高最明显,其t1/2,42℃延长至201min,T5015提高到52.5℃。再以G323D/F510L为模板,分别与T344A,R449C,T344A/R449C进行组合突变,其中组合突变株G323D/F510L/T344A的热稳定性最优,其t1/2,42℃和T5015分别为210min和53℃。
  探究了L-ABA催化体系中FDH酶活和辅酶添加量对L-ABA合成的影响,发现体系中FDH与辅酶的添加量对L-ABA产率影响都很大。通过测定在50℃下不同热处理时长的宿主E.coli BL21(DE3)蛋白对NADH的影响,发现50℃热处理1h能有效的解除宿主蛋白对NADH的降解,即此时宿主蛋白对体系中NADH的浓度影响很小。最后,对比改进后体系(经热处理的G323D/F510L/T344A、L-LeuDH、FDH)与原始体系(野生型L-TD、L-LeuDH、FDH),改进后体系在较低的NAD+添加量(0.04g/L)时,L-ABA的摩尔转化率可达到99%,而原始体系的摩尔转化率只有65.3%。
[博士论文] 程诚
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:木糖是木质纤维素原料水解液中最主要的五碳糖成分,其利用有助于提高木质纤维素生物转化效率,然而广泛用于多种生物燃料和生物基化学品生产的酿酒酵母缺乏有效的木糖利用途径,必须通过代谢工程改造才能利用木糖。虽然已对木糖利用重组酵母的构建进行了多年的研究探索,但木糖发酵能力差的问题仍然比较突出。此外,木质纤维素原料预处理过程中产生多种抑制酿酒酵母生长和发酵的物质,其中乙酸是主要抑制物成分,且酵母在木糖发酵时对乙酸的敏感性比在葡萄糖条件下更高。因而,提高酿酒酵母菌株的木糖代谢能力和乙酸胁迫耐受性是选育高效发酵菌株的关键。
  近期研究表明,酿酒酵母中涉及转录调控、线粒体功能相关以及MAPK信号通路等的多个内源关键基因的突变或表达水平变化对木糖利用具有重要影响,但内源基因对酿酒酵母木糖利用的影响机理还不清楚。因此,对影响木糖利用的关键内源基因进行深入探索,有利于揭示酿酒酵母木糖利用的全局调节机制,提高菌株选育效率。
  首先,本研究比较了多个酿酒酵母菌株,包括实验室酵母、工业酵母和自然界分离的野生酵母菌株等的混合糖发酵能力和环境胁迫耐受性。发现一株分离自甘蔗渣中的野生酿酒酵母菌株YB-2625具有较好的混合糖利用能力,在80g/l葡萄糖和20g/l木糖的培养基中发酵96h时消耗15.2g/l木糖,而实验室模式酵母S288c仅可消耗7.6g/l木糖,因此推测野生酵母菌株可通过长期自然选择调整其碳源利用相关的代谢调控网络。其次,利用转录组测序(RNA-Seq)比较了YB-2625和模式酵母S288c在混合糖利用过程中全局基因转录的差异。对混合糖发酵阶段和纯木糖利用阶段分别进行比较转录组分析,发现与实验室酵母S288c相比,野生酵母YB-2625的内源木糖代谢基因(XYL2和XKS1),糖异生以及TCA循环相关基因有更高的表达水平,可能有利于菌株的木糖利用。此外,野生酵母YB-2625胞内与葡萄糖抑制相关的转录调控因子编码基因,包括MIG1、MIG2、MIG3和HXK2转录水平明显下调,推测该菌株可通过缓解葡萄糖抑制作用促进木糖的利用。此外,YB-2625菌株在混合糖发酵过程中,与抗氧化酶相关的基因(CTT1、CAT1、SOD2和PRX1)转录水平更高,与之对应的是在木糖发酵阶段YB-2625过氧化氢酶(CAT)酶活水平为S288c的1.9倍,此外,在混合糖和纯木糖发酵这两个阶段,其胞内ROS水平分别比对照低43.3%和58.6%,推测氧化胁迫耐性的提高有助于木糖利用。进一步实验证明,过表达抗氧化酶基因CTT1和PRX1可增加菌株以木糖为唯一碳源的生长能力,过表达菌株的木糖消耗分别增加了13.5%和18.1%。
  除了转录水平,基因组序列突变分析也可提供影响木糖利用和胁迫耐受性的相关基因信息。因此进一步对YB-2625基因组进行了测序,并分析与木糖利用和环境胁迫耐性相关的功能基因。YB-2625基因组全长11.84Mb,与模式酵母S288c相比较,存在多个YB-2625特异性的基因以及与碳代谢和环境胁迫相关功能基因的突变。其中组蛋白乙酰化酶编码基因RTT109在YB-2625菌株中存在错义突变位点,在转录组分析中该基因表达也下调,因此对该基因的功能进行了深入研究。在实验室菌株BY4741中敲除RTT109基因后提高了菌株的乙酸耐受性,在添加了5.5g/l乙酸的抑制条件下进行100g/l葡萄糖发酵,RTT109敲除突变株延滞期由对照菌株的60h缩短至12h,乙醇生产强度由对照菌株的0.39提高至0.60g/l/h。敲除突变体中胁迫响应相关的基因,如CTT1、GSH1、SOD1和GPX1等转录水平均有所提高。在乙酸胁迫条件下发酵至稳定期时RTT109敲除突变体胞内的总SOD酶活力为115.45U/mg蛋白,而对照菌株酶活仅为79.63U/mg蛋白,同时RTT109敲除突变体GSH-Px活力也比对照菌株高77.1%。但在YB-2625中敲除RTT109未观察到环境胁迫耐性的差别,推测该基因的作用可能具有宿主遗传背景依赖性。
  利用YB-2625作为宿主菌株构建木糖利用重组酿酒酵母,初始构建的菌株YB-2625CCX木糖利用率低且副产物木糖醇产率高,因此在rDNA位点进行木糖醇脱氢酶(XDH)基因多拷贝整合过表达,通过筛选得到的YB-73菌株在混合糖发酵过程中木糖醇产率降低了64.6%,乙醇产量提高了13.9%。对基因组测序和比较转录组数据进行深入分析,发现染色体重构复合体亚基编码基因NGG1具有点突变,且在木糖利用阶段基因转录明显下调。敲除NGG1可明显增强木糖重组菌株在5mM H2O2氧化胁迫条件下的生长,更为重要的是,NGG1敲除可提高重组菌株的木糖发酵能力,在40g/l纯木糖中发酵96h后,木糖残糖量为4.9g/l,对照菌株的残糖量为12.7g/l。同时,NGG1敲除突变体的乙醇产量相比于对照菌株提高了84.6%。进一步对NGG1敲除菌株木糖利用提高的分子机理进行初步探索,发现NGG1敲除可提高木糖脱氢酶基因XYL1的表达,同时可提高氧化胁迫相关基因SOD1和CTT1的表达水平,推测NGG1可通过调控碳代谢关键基因表达与酵母细胞的胁迫耐受性基因表达提高木糖利用。
  本文的研究为进一步深入探讨酿酒酵母内源基因表达调控和宿主遗传背景影响木糖利用的机理,开发新的代谢工程改造靶点,选育木糖代谢和乙酸耐受性提高的重组菌株,进而提高木质纤维素原料的生物转化效率提供了基础。
[硕士论文] 厉嘉辉
植物保护 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:漆酶(laccase,EC1.10.3.2),又名对苯二酚:氧化还原酶(benzenediol:oxygen oxidoreductase),是指一类含铜的多酚氧化酶,其在环境污染物生物修复、生物能源生产、化合物合成及生物检测等领域有广阔的应用潜力。本论文以白腐菌——血红密孔菌Pycnoporus sanguineus MX5为漆酶生产菌株,研究了其发酵产酶条件、粗酶液的分离纯化、纯酶液的酶学性质以及其对染料的脱色能力,目的是为了探索未知的真菌漆酶种类,并发现其潜在的工业应用潜力。全文的主要结论如下:
  分别通过添加诱导剂、表面活性剂及真菌共培养这3种方式,对P.sanguineus MX5液态发酵产漆酶的条件进行了部分优化,首先设置不同的浓度梯度,接着采用多重比较进行统计分析,最终发现邻甲苯胺、吐温80、Gongronella sp.w5的接种量(v/v)分别为0.006%、0.04%和2%时,其诱导效果最好,达到顶峰时的漆酶产量分别为20980.55、12724.07和9389.81U/L,较对照提高36.25%、119.93%和42.13%。
  经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE FF离子交换层析和Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析,分离得到3个漆酶同工酶Lac1、Lac2、Lac3,总的漆酶回收率为5.21%,其中Lac1达到2.01%,纯化倍数为3.49,Lac2达到1.29%,纯化倍数为2.93倍,Lac3达到1.92%,纯化倍数为0.86倍。经酶谱分析,它们均为单体蛋白,表观分子量分别为61.8、61.8和60.6kDa,且三者在330nm左右处有明显的特征吸收峰。通过Nano LC-MS/MS蛋白鉴定技术及氨基酸序列分析,它们均为血红密孔菌漆酶。
  这3个漆酶同工酶的最适反应pH值呈偏酸性(2.5-5.0),且反应温度范围较宽,在高温和低温环境下均有一定的催化活性;在中性条件下具有良好的pH稳定性,同时表现出一定的热稳定性,其中以Lac3的pH及热稳定性最为优异。漆酶催化底物广泛,本文中ABTS是最适底物,以ABTS为底物时,Km值分别为0.0093、0.0143和0.0230mmol/L,Kcat/Km值分别为64343.43、38586.04和4148.67S-1·mM-1。Fe2+能够强烈地抑制漆酶活力,而低浓度的Na+、Mn2+、Cu2+、Zn2+则稍有促进作用;抑制剂SDS、β-ME、L-半胱氨酸、DTT、NaF对漆酶有强烈的抑制效果,而螯合剂EDTA-2Na的抑制作用相对较弱。
  对P.sanguineus MX5漆酶在工业染料的脱色方面进行了研究,实验结果显示RB亮蓝(蒽醌类)、酸性红1(偶氮类)和活性黑5(偶氮类)是P.sanguineus MX5漆酶的反应底物,在没有介体ABTS存在的情况下也能催化染料的脱色,介体ABTS的加入有助于提高染料的脱色率,其中对酸性红1(偶氮类)的提升效果最好,反应180min后,Lac1、Lac2、Lac3和粗酶液对染料AR1的脱色率分别达到65.33%、70.04%、70.09%和69.84%;而结晶紫(三苯甲烷类)以及中性红(杂环类)不是P.sanguineus MX5漆酶的直接作用底物,只有在添加介体ABTS后才能脱色这两种染料。其中,漆酶对中性红的脱色效果较差,只有Lac3和粗酶液对该染料有一定的脱色作用。总的来看,LMS对染料脱色能力的大小顺序为酸性红1>结晶紫>活性黑5>RB亮蓝>中性红。
[博士论文] 吕佳佳
运筹学与控制论 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:随着全球能源短缺问题的日益加重和受到石油价格不断攀升的影响,生物基化学品的生产逐渐引起人们的重视.微生物发酵法生产1,3-丙二醇由于具有条件温和、易于操作、副产物少、绿色环保等优点而受到人们的广泛关注.本论文以微生物发酵法生产1,3-丙二醇的实际过程为研究背景,以非线性动力系统的稳定性和控制理论及常微分方程的数值计算方法为工具,对多维微生物发酵酶催化的非线性动力系统的稳定性进行了研究.本论文的工作不仅可以丰富非线性动力系统稳定性的理论,而且还可以为实现1,3-丙二醇的产业化生产提供参考,因此该项研究具有重要的理论意义与应用价值.本论文的主要工作概括如下:
  1.在综合考虑了3-羟基丙醛对于细胞增长的抑制作用、甘油和1,3-丙二醇跨越细胞膜的运输方式、以及所有可能代谢路径的前提下,研究了一个非线性不可微微生物连续发酵动力系统的稳定性.首先,证明了该系统平衡点的存在性,采用数值方法求得了该平衡点;然后由于系统的不可微性,在平衡点附近构造了一个可微的有效域,并在该有效域内证明了系统的Jacobian矩阵和三阶张量的局部有界性,给出了该三阶张量的表达式;最后构造了该非线性动力系统的一个近似线性系统,证明了该线性近似系统的局部稳定性,从而得到了非线性动力系统是渐近稳定的.
  2.针对一个不具有平衡点的非线性微生物间歇发酵多阶段动力系统,研究了该系统的强稳定性.该动力系统针对间歇发酵过程分为发育期,生长期和稳定期三个阶段,由于该系统无法求得解析解,因此构造了针对非线性系统不同阶段解的齐次线性变分系统和相应的基本矩阵解,证明了基本矩阵解的性质及这个非线性多阶段动力系统的强稳定性.
  3.讨论了一个非线性微生物间歇发酵酶催化时滞动力系统的强稳定性.首先,由于该系统无平衡点,也无法求得其解析解,所以构造了与该时滞非线性动力系统的解相对应的时滞非齐次线性变分系统及其基本矩阵解.然后,根据该时滞线性变分系统的非齐次性和时滞性,在各个时滞子区间上分别讨论了时滞变分系统的基本矩阵解的性质,并证明了基本矩阵解的有界性.最后,证明了该时滞非线性动力系统的强稳定性.
[硕士论文] 高春霞
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:克拉维酸(clavulanic acid,CA)是由棒状链霉菌产生的一种具有β-内酰胺酶抑制作用的抗生素。本文通过对棒状链霉菌的培养基及发酵工艺进行优化,提高了菌株的克拉维酸生产能力。主要研究结果如下:
  首先,摇瓶种子培养基及培养条件的优化。实验表明种子培养基的最佳配方为(g/100mL):玉米淀粉2.0,超细豆粉2.0,自溶酵母粉0.5,三油酸甘油酯0.5,KH2PO40.1,pH6.9;中温超细豆粉更有利于种子生长。种子培养的最佳工艺为初始pH7.0、接种量1.0%、培养温度28℃、种龄60-66h。
  其次,摇瓶发酵培养基的优化。以玉米淀粉乳替代玉米淀粉既提高了产量又可以节约成本;培养基中添加天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸均有利于CA的合成,其最佳添加浓度分别为0.02%、0.1%、0.05%、0.1%,然而甲硫氨酸对CA的合成却具有强烈抑制作用,且浓度越高,抑制作用越强;磷酸二氢钾、硫酸亚铁的添加对CA生物合成有显著影响,其最佳添加浓度分别为0.5%、0.1%。
  再次,摇瓶发酵工艺的优化。经优化后的最佳培养工艺为:培养基初始pH7.0、培养温度25℃、接种量2.0%、摇瓶装液量45mL/500mL、转速250r/min。
  最后,种子罐及发酵罐生产工艺的优化。种子罐的初始pH最佳为6.8,接入摇瓶种子的比例为0.1%。发酵罐培养基中大豆蛋白粉、豆油与甘油的最适加量分别为2.2%、1.2%和1.0%;种子罐转接发酵罐的最佳接种量为15%;发酵过程中采用22h后流加50%甘油溶液的工艺,并控制甘油残留量在1-3g/L之间,最有利于CA的生物合成。
  在中试实验的基础上,对棒状链霉菌进行100m3实验罐的放大培养,其克拉维酸发酵单位可达7520μg/mL,产率提高了24.3%。
[硕士论文] 董兵
食品工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:枯草芽孢杆菌是食品加工用酶制剂的主要生产菌种,也是某些功能性食品的发酵菌种,因此,它已成为食品基因工程中研究最为广泛的菌种之一,针对其构建的枯草芽孢杆菌表达系统可高效表达多种外源性食品中常用酶和蛋白质。在表达系统中,载体是外源蛋白能否成功表达的必要且关键因素,因此,构建一套结构完整、功能多样的表达载体,可为外源酶或功能蛋白在枯草芽孢杆菌中高效表达提供新素材。
  猪肉食品中抗生素物质大量残留,威胁人类健康。功能性蛋白pEGF具备较好的促生长功能和生物安全性,在抗生素替代物研究方面具备很大的潜力,但是其提取纯化困难,产量低,限制了其规模化的生产。利用食品基因工程技术,通过枯草芽孢杆菌表达系统实现pEGF的外源高效表达,并进行初步发酵条件摸索,可为其规模化生产打下基础。
  本试验构建了一套用于B.subtilis的载体,并对其性能进行检验,然后将该载体应用于pEGF蛋白的外源表达,内容如下:
  1.以穿梭载体pDG150为基础,通过重组改造构建了B.subtilis的系列载体,并验证了它们的表达能力和稳定性。其中,pTD160为基础载体,pTD161为表达载体,pTD162为表面展示载体。将lipa基因导入上述pTD系列载体,转化B.subtilis168中表达,利用Rashid N p-NPP比色法检测其lipA酶活性为23.4U/mg和15.31U/mg,表明载体能高效表达lipA蛋白。通过无抗生素压力传代培养,培养10代后发现其稳定性仍为96.5%和95%,证明构建成功的重组质粒具备较高的稳定性。
  2.将功能性蛋白pEGF的基因pegf按大肠杆菌密码子优化后合成,分别导入pTD161和pTD162,转化B.subtilis,检测其表达量,并优化其诱导培养条件。ELISA法检测Bs168-pTD162-pegf中pEGF蛋白表达量可达365ng/mL,Bs168-pTD162-pegf芽孢的蛋白表达量为285ng/mL,证明其得到表达。同时,对其诱导培养条件进行优化,优化后的表达量提高到380ng/mL。
  3.将pegf导入pET21b,并转化BL21,诱导表达,检测其表达量为783ng/mL,然后对pEGF进行初步分离纯化,其纯化后可蛋白量达723ng/mL。
  4.将pEGF和GFP融合表达,之后导入pTD161和pTD162并转化B.subtilis168,检测其荧光信号和融合蛋白表达量。通过融合PCR获得pEGF和GFP融合蛋白基因pegf-gfp。将其导入pTD161转化B.subtilis168,IPTG诱导表达,ELISA检测pEGF蛋白表达量为358ng/mL,并通过荧光显微镜检测可见荧光信号,表明pEGF-GFP获得表达。将融合基因pegf-gfp导入pTD162,转化B.subtilis168,用DSM培养基收集芽孢,检测pEGF蛋白表达量为268ng/mL,用荧光显微镜检测其荧光信号,证明pEGF-GFP获得表达。
[硕士论文] 王鑫媛
食品工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:燕麦具有促进胃肠蠕动、预防动脉硬化、降脂降糖以及调节肠道微生态平衡等益生保健功能。益生菌对健康具有良好的促进作用,如提高免疫力,缓解乳糖不耐症和促进肠道益生菌增殖等。燕麦加工主要停留在初级加工阶段,精深加工产品相对缺乏。传统益生菌发酵的产品多为动物乳制品,发酵植物乳制品相对较少。本研究以燕麦为主要原料添加少量牛乳通过益生菌发酵制得一种新型益生菌发酵燕麦乳产品,以期为燕麦精深加工以及新型益生菌发酵乳的开发提供理论依据。
  首先,本研究确立了优良纯燕麦乳的制备方法。选用干酪乳杆菌为试验菌株,通过研究料水比对干酪乳杆菌发酵纯燕麦乳中的pH值、滴定酸度、活菌数以及产品的感官评价等方面的影响,确定燕麦乳最佳料水比为1∶8。以葡萄糖当量值(DE值)为指标,通过单因素以及正交试验对酶解工艺条件进行优化,确定中温α-淀粉酶酶解的最佳条件是:酶添加量0.35%(g/mL),酶解温度55℃,酶解时间110min;糖化酶酶解的最佳条件是:酶添加量0.15%(g/mL),酶解温度50℃,酶解时间90min。
  其次,本研究确立了燕麦发酵基质的制备工艺。通过牛乳和蔗糖添加量对干酪乳杆菌发酵燕麦乳的pH值、滴定酸度、活菌数以及产品的感官评价等方面的影响,优化了燕麦乳发酵基质。结果表明,向纯燕麦乳中添加20%(m/V)的牛乳以及7%(m/V)的蔗糖时发酵乳的活菌数较高、酸甜适口。以乳化稳定性和离心沉淀率为指标,评价不同乳化剂和稳定剂对燕麦乳组织稳定性的影响。确定复合乳化剂(单甘脂∶蔗糖酯=7∶3(m/m))最佳添加量为0.1%(g/mL);复配稳定剂最佳添加量为:0.15%(m/V)黄原胶、0.25%(m/V)CMC-Na、0.25%(m/V)瓜尔豆胶。通过灭菌条件对发酵基质稳定性的影响确定最佳灭菌条件为100℃,10min。
  再次,本研究优化出发酵燕麦乳的最佳发酵工艺。通过研究不同接种量、发酵温度以及发酵时间这三因素对发酵燕麦乳的pH值、滴定酸度、活菌数以及产品的感官评价等方面的影响,确定三个因素最佳水平。在此基础上,利用响应面试验对发酵工艺条件进行优化,确定干酪乳杆菌发酵燕麦乳的最佳工艺条件为:接种量5.0%、发酵温度37℃、发酵时间5.3h,在此条件下干酪乳杆菌活菌数达8.8×108CFU/mL,滴定酸度为49.05°T,且组织状态均一稳定,风味俱佳。
  最后,本研究对发酵燕麦乳终产品贮藏稳定性、感官指标、卫生指标、理化指标、乳酸菌活菌数指标、功能性成分含量等方面的质量分析评价。结果表明,发酵燕麦乳产品在4℃条件下的贮藏货架期为24d。发酵燕麦乳产品呈乳黄色,色泽协调、质地良好、酸甜适口、香味纯正,与普通益生菌发酵产品相比发酵燕麦乳具有特有的燕麦香味以及更低的脂肪含量且含有β-葡聚糖和多酚等生物活性成分,有更高的营养价值。
  本研究将燕麦的精深加工、乳品工业与益生菌发酵相结合,研制出一种新型发酵乳,开辟我国燕麦资源利用的新途径,提高燕麦产品的附加值,同时还可以为发酵燕麦乳产品的工业化生产及其推广应用提供科学有力的理论参考。
[硕士论文] 巩俊明
食品工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:本课题以科技成果“抗酸奶后酸化发酵剂的开发”为核心技术依托,研究抗后酸化直投式酸奶发酵剂的制备,进行中试生产及产业化应用示范,研制出具有自主知识产权的抗后酸化直投式酸奶发酵剂,并利用抗后酸化直投式酸奶发酵剂开发出后酸化活力降低,稳定性增强,保藏期延长的酸奶制品。
  (1)抗后酸化直投式酸奶发酵剂制备关键技术的实验室优化
  采用硫酸新霉素法筛选了抗后酸化保加利亚乳杆菌菌株,检测了抗后酸化保加利亚乳杆菌菌株的遗传稳定性。筛选出了一株具有抗后酸化性能的保加利亚乳杆菌Lb-s1rp-1,抗后酸化保加利亚乳杆菌Lb-s1rp-1比保加利亚乳杆菌Lb-s1产酸慢,该菌株传至第8代仍具有抗后酸化性能,具有遗传稳定性。
  通过单因素筛选廉价基础培养基和促生长物质,利用正交试验优化了促生长物质的最适添加量,确定廉价增殖培养基配方。廉价增殖培养基为在胡萝卜汁基础培养基中添加0.3%的大豆蛋白胨、1.0%的蛋白胨、0.5%的酵母浸膏和0.5%的碳酸钙,抗后酸化保加利亚乳杆菌Lb-s1rp-1在该廉价增殖培养基中的活菌数能够达到5.80×109cfu/mL,是MRS液体培养基中活菌数(5.11×108cfu/mL)的11倍。
  测量冻干前后的活菌数,计算不同转速不同时间的离心收得率。得出最佳转速和时间5000r/min10min,离心收得率为88.70%。以脱脂乳10%为基础,通过单因素试验筛选基本保护成分,利用正交试验优化了基本保护成分的最适添加量。冻干保护剂配方为脱脂乳10%、乳糖2%、谷氨酸钠5%、酵母浸粉1%,抗后酸化保加利亚乳杆菌Lb-s1rp-1在该保护剂中的存活率为64.00%,冻干后发酵剂活菌数达到1.35×1011cfu/g。测量冻干菌粉烘至恒重前后的质量,计算真空冷冻干燥不同时间发酵剂的含水量。确定冻干时间为14h,发酵剂含水量为1.82%。
  (2)抗后酸化直投式酸奶发酵剂的中试生产
  对中试生产温度进行了优化,研究了中试发酵剂产品的贮藏稳定性并与进口发酵剂科汉森进行了对比。确定中试生产温度为37℃,中试发酵剂产品活菌数为9.60×1011cfu/g,4℃储藏6个月发酵剂活菌数仍保持在1011cfu/g以上,抗后酸化直投式酸奶发酵剂生产成本较进口科汉森发酵剂降低33.87%,活菌数增加了15.24倍。
  (3)抗后酸化直投式酸奶发酵剂的产业化应用示范
  通过单因素试验优化了发酵剂混菌发酵条件,利用正交试验确定混菌发酵最优条件。混菌发酵最优条件为菌种配比抗后酸化保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1∶2、接菌量3(‰)、发酵温度37℃、蔗糖添加量5%,凝乳时间为4.25h,酸奶活菌数为3.70×109cfu/mL。在河北新希望天香乳业有限公司进行10t规模应用示范,对酸奶产品进行了4℃的贮藏试验。抗后酸化酸奶产品,活菌含量达3.71×109cfu/mL,4℃贮藏30d活菌数2.50×108cfu/mL,pH值为4.28,滴定酸度由83.84°T增加到90.98°T,增加了7.14°T,实现日产10t抗后酸化发酵乳制品应用示范规模。
  本研究从根本上解决了酸奶后酸化问题,实现抗后酸化发酵乳制品应用示范规模,实现科技成果的转化。
[硕士论文] 康晓乐
食品加工与安全 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:酵素是以动物、植物、菌类等为原料,添加或不添加辅料,经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品。酵素具有很好的保健功效,市场上产品种类繁多,但是目前国内外对酵素中微生物的研究和报道相对较少,因此开展对自然发酵的酵素中微生物的研究具有重要意义。
  本论文以苹果为原料添加白砂糖、无菌水、Vc自然发酵制成的植物液态酵素,在发酵40d的过程中,每5d测定一次苹果酵素液的微生物指标、理化指标、抗氧化性和蛋白酶活力,观察其变化规律。并在这些指标变化的不同阶段采用宏基因组学技术初步探索微生物群落组成及其变化规律。
  以发酵不同时期的酵素液为原料,采用梯度平板稀释法测定微生物指标。菌落总数呈先上升后下降之后趋于稳定的趋势。第0d菌落总数为2.27×108cfu mL-1,第10d达到最大值3.21×109cfu mL-1,第20d减少至6.82×104cfu mL-1。21~25d菌落总数上升至105cfu mL-1,之后趋于平稳。理化指标:发酵过程酵素液的pH值、还原糖、可溶性固形物含量一直呈现下降趋势,0~15d下降较快,16~40d基本平稳。
  以发酵不同时期的酵素液为原料,采用分光光度计法测定抗氧化性能,采用国标方法测定蛋白酶活力。结果总酚含量先增多后减少,第10d含量最高为28.6g L-1,发酵后较发酵之前增长近一倍。羟自由基清除能力先升高后降低,第10d清除率增加到88%,11~20d下降为35%,比发酵之前提高一倍多。DPPH.清除能力先增加后降低之后又增加最后基本稳定。蛋白酶活力0~5d为0,6~25d逐渐上升,第25d达到最大值0.1230U mL-1。以上指标变化为确定酵素的发酵周期奠定基础。
  以发酵10d、20d和35d的苹果酵素液为原料,采用宏基因组学技术分析发酵过程中微生物的组成和动态变化。通过提取样品中菌群的DNA,对细菌16srDNA和真菌ITS区扩增得到细菌的优化序列数135033,优化碱基数目59756429个,species数386个,聚类分析得到466个OTU;真菌的优化序列数227417个,高质量碱基数目72649655个,species数5个,聚类分析得到8个OTU。结果显示,在苹果酵素微生物组成方面细菌的种类比较丰富,真菌的种类相对要少。三个阶段的苹果酵素液中,真菌的物种数变化较小,略微增加;细菌物种数第10d最多,然后减少之后再增加。真菌主要有Saccharomyces,Hanseniaspora和Zygosaccharomyce,细菌主要有Lactobacillus,Gluconobater,Lactococcus,weissella,Leuconosloc和Acetobacter。
  以发酵10d、20d和35d的苹果酵素液为原料,采用平板划线分离法,对菌株进行分离,共分离出细菌23株,真菌11株。采用16srDNA和ITS序列分子生物学方法,鉴定出10株Lactobacillus plantarum strain,3株Lactococcus Lactis strain,3株Gluconbacter sp,2株Weissella sp,1株Gluconbacter oxydan,1株Lactobacillus pentosus strain,1株Lactobacillus rhamnosus。真菌经ITS序列鉴定出3株Lodderomyces elongisporus,3株接合酵母Zygosaccharomyces rouxii,3株Saccharomyces cerevisiae,2株Hanseniaspora vineae。
  通过测定菌株在不同糖浓度和不同起始pH值的培养基中的生长能力,选出耐糖耐酸性能好的植物乳杆菌(P J-L-1、PJ-L-2、PJ-L-4)戊糖乳杆菌PJ-L-10和魏斯氏属P J-L-19;酿酒酵母(PJ-Y-1,P J-Y-2,P J-Y-3)和葡萄糖酸杆菌PJ-L-14。对耐性较好的菌株,利用传统鉴定方法进行鉴定,得到结果与分子鉴定结果一致。
  本课题通过测定自然发酵苹果酵素中的指标变化,通过这些指标变化初步揭示酵素自然发酵的规律,并且通过传统分离培养和现代宏基因组学技术相结合的手段分析微生物多样性,同时分离鉴定出发酵过程的优势菌,为人工可控的酵素发酵提供一定的理论基础和技术指导。
[硕士论文] 韩莹莹
林产化学加工工程 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:随着塑料食品包装材料地大量使用所造成的资源枯竭和环境污染等问题的日益严重,可再生、可降解的天然高分子包装材料受到了人们的广泛关注。大豆分离蛋白(SPI)是大豆油加工的副产品,它具有良好成膜性和营养价值。SPI薄膜有较好的机械性能和极好的阻氧、阻油性,因此在食品包装领域具有潜在的应用价值。然而,机械强度低和水敏感性高等缺点限制了SPI包装膜的商业应用。因此,对SPI薄膜的性能进行提升是非常有必要的。此外,向SPI膜中添加天然抗氧化剂赋予薄膜抗氧化性能,可以防止食品氧化变质,延长食品货架期,从而更好地提高SPI薄膜的应用价值。本文将纳米SiO2和甘草渣纳米纤维素(LNC)作为增强剂添加到SPI膜中,用以提高薄膜的机械强度和阻隔性能。甘草渣提取物(LRE)则作为抗氧化剂来提高SPI薄膜的抗氧化性能。主要研究结果如下:
  (1)研究了纳米SiO2的粒径和添加量对SPI薄膜的结构和物理性能的影响。结果表明添加的SiO2显著提高了薄膜的机械强度和阻隔性能。SPI/SiO2薄膜的结构致密,具有较好的热力学稳定性。当SiO2的粒径为8.11nm,添加量为3%时,薄膜的综合性能最佳。此时,抗拉强度(TS)和接触角(CA)分别为9.04MPa和79.7°,分别提高了36.3%和32.4%。水蒸汽透过率(WVP)、氧气透过率(OP)和断裂伸长率(E%)分别为1.28×10-5g m m-2day-1Pa-1、7.23×10-5cm3mm mm-2day-1atm-1和105.05%,分别下降了22.4%、14.9%和36.9%。
  (2)利用甘草渣制备LNC,将制备的LNC添加到SPI中制备环境友好型纳米复合材料。研究了LNC的添加量对SPI薄膜的结构、机械性能和阻隔性能的影响。结果表明:LNC呈短棒状结构(长100-400nm,直径10-35nm),在水介质中具有较好的稳定性,具有较高的结晶度。SPI/LNC薄膜的结构粗糙,结晶结构得到提高。LNC的添加显著提高了薄膜的性能,特别是在添加量为6%时。此时,薄膜的TS和CA为11.17MPa和72.4°,分别提高了68.5%和20.3%。WVP、OP和E%为1.20×10-5g m m-2day-1Pa-1、2.81×10-5cm3mm mm-2day-1atm-1和63.8%,分别下降了27.3%、66.9%和61.8%。
  (3)探讨了不同浓度的LRE对SPI薄膜的微观结构、物理性能和抗氧化性的影响,并将抗氧化SPI薄膜应用于猪油的保鲜。结果表明:添加LRE的SPI薄膜的结构粗糙,薄膜具有极好的紫外阻隔性能,外观呈棕色。LRE的添加显著提高了薄膜的机械性能和阻隔性能。当添加LRE添加量为5%时薄膜性能最佳。此时,TS和E%为10.83MPa和101.7%。CA、WVP和OP为71.4°、1.42×10-5g m m-2day-1Pa-1和6.14×10-5cm3mm mm-2day-1。此外,SPI/LRE薄膜具有良好的自由基清除能力。室温储存20天后,使用SPI/LRE薄膜包装的油脂的过氧化值和酸价要明显低于空白膜和聚乙烯包装膜包装后的油脂,表明SPI/LRE薄膜对油脂有很好的保鲜效果。
[硕士论文] 余茜
农产品加工及贮藏工程 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:中性蛋白酶是最早用于工业生产的蛋白酶,在食品、生物和医药等方面得到广泛应用。本试验从自然发酵的霉豆瓣中分离筛选出一株高产中性蛋白酶的菌株米曲霉Y1,通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析两种纯化方法获得电泳级纯度的中性蛋白酶,研究发现常见金属离子能提高中性蛋白酶的酶活,其中以Cu2+激活效果最强,通过单因素试验筛选出Cu2+最适作用浓度,进一步探讨了添加Cu2+对中性蛋白酶酶学性质的影响,并探讨Cu2+对米曲霉Y1生长和产酶情况的影响。
  主要研究结果如下:
  (1)传统自然发酵的霉豆瓣作为本试验菌株的样品来源,试验共分离得到18株菌,有6株菌在中性酪蛋白培养基上产生透明圈,其中菌株Y1水解圈直径与菌落直径的比值最大,为2.54,其中性蛋白酶的酶活最高,为342.42U/mL。通过形态学对菌株Y1进行初步鉴定,采用18S rDNA片段扩增后进行序列测定,将序列测定结果与NCBI数据库进行同源性分析确定菌株Y1是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
  (2)将米曲霉Y1接种到蚕豆培养基中,经过35℃培养48h后发酵成霉豆瓣,经过70%硫酸铵盐析,4℃透析48h除盐,DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离得到两个蛋白峰,分别测定两个蛋白峰的中性蛋白酶酶活,确定峰2为目的蛋白峰,峰2经过SDS-PAGE电泳显示为分子量约为45kDa的单一条带。整个纯化过程中性蛋白酶比酶活从226.94U/mg提高到2264.28U/mg,纯化倍数和回收率分别为10.0和21.0%。
  (3)米曲霉中性蛋白酶的最适反应pH值和最适反应温度分别是7.0和55℃,当pH值在7.0~7.5时,中性蛋白酶较稳定,当温度在55℃时,经过55℃孵育30min后,中性蛋白酶酶活基本保持不变;四种蛋白酶抑制剂对米曲霉中性蛋白酶存在不同程度的抑制作用,Na+,K+,Fe2+,Ca2+,Sn2+,Pb2+,Al3+和Mn2+对其均有激活作用,其中Cu2+激活效果最显著,相对酶活提高了225.99%,Zn2+、Mn2+和Ba2+表现为抑制作用,米曲霉中性蛋白酶的米氏常数和最大反应速率分别为20.0769mg/mL和256.4103μg/mL·min。
  (4)添加0.2mM的Cu2+后,米曲霉中性蛋白酶的最适反应pH值和最适反应温度未发生改变,但酶活大小均有提高;中性蛋白酶的耐酸碱能力和耐热性都得到增强;四种抑制剂的抑制作用均有所降低,金属离子作用效果与空白组结果基本保持一致;相同条件下,其米氏常数和最大反应速率分别为14.0009mg/mL和649.3506μg/mL·min。
  (5)在35℃恒温培养条件下,空白组和Cu2+实验组在48h时孢子数量达到最大值,分别为6.63×108CFU/g和8.77×108CFU/g;在39h中性蛋白酶活达到最高值,分别为487.19U/mL和572.88U/mL。感官评分结果显示:在同一时间点Cu2+试验组分值均高于或等于空白组。
  综上,本试验从自然发酵霉豆瓣中筛选得到了一株高产中性蛋白酶的菌株Y1,经鉴定为米曲霉,使用两种纯化方法得到了电泳级纯度的中性蛋白酶,研究发现添加0.2mM的Cu2+能提高中性蛋白酶的酶活、耐酸碱耐高温的能力以及对底物酪蛋白的亲和力,并且能促进米曲霉孢子的萌发,提高中性蛋白酶的酶活。
[硕士论文] 杨梦露
粮食、油脂及植物蛋白工程 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:细菌素(Bacteriocin)是由不同种类的细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质。许多乳酸菌产生的细菌素有非常广泛的抑菌谱,在食品保藏中有很好的应用前景。将细菌素应用在食品工业中可以减少化学防腐剂的添加,减少热处理强度,更自然的保存食物并且丰富其感官和营养特性。本研究中分离得到一株产细菌素且活性强的植物乳杆菌HD-23,优化其发酵培养基;将原核表达得到的细菌素PlnEF用于抑制鼠伤寒沙门氏菌SL1344,研究其基本的抑菌机理;探究PlnEF在鼠伤寒沙门氏菌SL1344细胞膜上可能的细菌素受体,主要结果如下:
  1产细菌素乳酸菌的分离鉴定从各地采集的自制泡菜水、豆豉、自酿酸奶、腐乳、腊鱼中分离出80株在MRS平板上有明显透明溶钙圈的疑似乳酸菌。复筛采用抑菌试验,对抑菌物质进行生物学特性鉴定后筛选出一株产细菌素活性最强的菌株,分子生物学鉴定后命名为植物乳杆菌HD-23。
  2响应面优化玉米粉培养基成分玉米作为我国粮食发展的支撑性作物,将其作为培养基成分是对粮食资源的合理利用,并且能降低细菌素生产成本,适应工业上低成本高产量的需求。对玉米粉培养基成分进行响应面优化,抑菌试验以抑菌圈直径为响应值,得到最优的培养基成分为8g/l玉米粉、3.13g/l葡萄糖、1.22g/l蛋白胨、0.57g/l乙酸钠、10g/l牛肉膏、1g/l酵母粉、2g/l柠檬酸氢二铵、0.4g/l碳酸氢二钾、0.58g/l硫酸镁、0.25g/l硫酸锰、1ml/l吐温-80。
  3细菌素基因plnE和plnF的原核表达及纯化使用同源重组酶的方法诱导载体质粒pET-32a与目的扩增产物重组,重组质粒经两次转化后构建pET-32a-plnE-E.coli BL21和pET-32a-plnF-E.coli BL21表达菌株。经Ni-NTA亲和层析柱,超滤以及肠激酶酶切后获得纯的PlnE肽(3.6kDa)和PlnF肽(3.7kDa)。抑菌谱测定显示细菌素PlnEF对革兰氏阳性、阴性菌均有抑菌作用。
  4细菌素PlnEF作用鼠伤寒沙门氏菌SL1344抑菌机理以纯化后的细菌素PlnEF作用于鼠伤寒沙门氏菌SL1344,测得其细胞裂解率随PlnEF添加量的增加而增加。正常情况下,胞外各物质含量很少,经细菌素处理后发现胞外ATP、乳酸脱氢酶、紫外吸收物质都有明显的增加。结果表明细菌素PlnEF通过使鼠伤寒沙门氏菌SL1344胞内物质泄露,从而导致细胞死亡。
  5细菌素PlnEF对鼠伤寒沙门氏菌SL1344作用结合位点的研究使用细菌素PlnEF处理鼠伤寒沙门氏菌SL1344,同时提取细菌素处理和未处理的的细胞膜蛋白进行双向电泳,谱图分析电泳图上缺失的蛋白斑点,通过MALDI-TOF-MS测得可能产生影响的蛋白为磷酸甘油酸激酶(PGK)蛋白。用λ-red技术对PGK基因完整的开放阅读框进行敲除,验证细菌素PlnEF可能通过该蛋白对鼠伤寒沙门氏菌SL1344造成影响,使细胞死亡。
  本论文筛选出一株产细菌素活性较好的植物乳杆菌HD-23,将玉米粉添加至MRS培养基成分中发酵HD-23产细菌素,合理利用粮食资源,符合工业化生产需要。将细菌素基因plnEF同源重组到工程菌中,获得纯的细菌素PlnEF。鼠伤寒沙门氏菌SL1344为全基因组测序菌株,将其作为目标菌,有效的研究了细菌素PlnEF对该菌的抑菌机理是导致胞内物质泄露,从而使细胞死亡。本试验中还探究了PlnEF在鼠伤寒沙门氏菌SL1344细胞膜受影响的为磷酸甘油酸激酶蛋白,并采用基因敲除的方法进行验证。本研究中针对纯细菌素PlnEF的试验为二肽细菌素的深入研究提供了一定的基础。
[博士论文] 姜莉莉
生物工程与技术 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一种重要的化工原料,应用广泛,主要作为单体合成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)和聚呋喃二甲酸丙二酯(PTF)。目前1,3-PD的生产方法包括化学法和生物法,生物法具有利用可再生资源、条件温和、环境污染小等优点,越来越受到人们的重视。生物法生产1,3-PD主要是以微生物纯培养技术为基础,需要严格的无菌条件、使用的原料具有一定的纯度,同时在发酵过程中常伴随乙酸、乳酸、乙醇、2,3-丁二醇(BD)等副产物的生成,给下游产物的分离纯化带来困难并增加了1,3-PD的生产成本。为了克服纯培养技术的缺点,本论文以微生物菌群为研究对象,考察了微生物菌群转化粗甘油生产1,3-PD的发酵特性、微生物菌群中单菌间的相互作用、微生物菌群的稳定性以及微生物菌群的结构组成对菌群功能的影响。主要研究结果如下:
  (1)从大连海域筛选了两个微生物菌群DL38和CJD-3,并通过间歇发酵实验对两个微生物菌群的发酵性能进行比较。实验结果表明:微生物菌群DL38生产1,3-PD的浓度和转化率要高于微生物菌群CJD-3,并且产生的副产物较少,两者的副产物中均不含BD,利于产物1,3-PD的分离纯化降低生产成本。在间歇发酵实验中微生物菌群DL38最高可耐受200 g/L甘油,1,3-PD的浓度可达到81.40 g/L,转化率为0.63 mol/mol。通过微生物菌群结构分析表明两个微生物菌群发酵性能的差异与两个菌群的结构组成有关,主产1,3-PD的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在微生物菌群DL38中所占的比例(95.57%)显著高于在微生物菌群CJD-3中所占的比例(85.99%)。从微生物菌群DL38中分离纯化了三株克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae):单菌W3、Y1和Y5。当甘油浓度为40 g/L时,单菌W3主产1,3-PD(17.84 g/L),是微生物菌群DL38的优势菌株;单菌Y5主产1,3-PD(9.63 g/L)和乙醇(7.60 g/L),而单菌Y1主产乙醇(12.69 g/L)。当三种单菌按照比例W3∶ Y5∶ Y1=208∶82∶17进行混合发酵时发酵性能最佳,并且优于其他单菌混合比例和单菌W3单独发酵,表明在自然状态下微生物菌群的组成具有一定的优越性和合理性,并且单菌之间的协同作用可以提高混合菌群的底物耐受性和1,3-PD的产量。
  (2)通过间歇发酵实验和微生物菌群结构分析,考察了影响微生物菌群稳定性及发酵性能的关键因素。实验结果表明:随着传代培养次数的增加,微生物菌群DL38的发酵性能发生了改变(该此菌群命名为DL38-BH),如发酵时间延长,1,3-PD的产量和转化率下降,并且副产物中乳酸、乙醇的产量增加。通过16S rRNA高通量测序发现,微生物菌群DL38的结构组成发生了显著变化,如微生物菌群中主产1,3-PD的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在菌群中的比例从95.57%降低到71.46%,而不产1,3-PD的肠球菌科(Enterococcaceae)和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的比例大幅度增加,分别从2.10%和1.21%增加到15.31%和12.97%。通过间歇发酵实验发现,微生物菌群DL38-BH中主产1,3-PD的单菌W3-BH发酵甘油的时间延长,并且1,3-PD的产量下降,副产物中乳酸和乙醇的含量大幅度增加;单菌Y5-BH消耗甘油的速度加快,1,3-PD的产量降低,乳酸和乙醇的产量均增加;单菌Y1-BH消耗甘油的速度也加快,1,3-PD、乳酸、乙酸的产量增加,但乙醇的产量有所下降。由此推断正是由于微生物菌群结构组成和菌群中单菌发酵性能的变化,导致了原始微生物菌群DL38发酵性能的改变。
  (3)通过间歇发酵实验和微生物菌群结构分析,考察了离子液体对微生物菌群转化粗甘油生产1,3-PD的影响。实验结果表明:离子液体对微生物菌群发酵性能的影响不仅与离子液体的种类有关,还与离子液体和底物的浓度有关。当粗甘油的浓度为60 g/L、[Emim][TfO]为10 g/L时,微生物菌群DL38-BH生产1,3-PD的浓度和转化率显著提高,分别由23.14 g/L、0.45 mol/mol增加到31.17 g/L、0.60 mol/mol。与对照组相比,添加离子液体[Emim][TfO]后的微生物菌群DL38-BH中主产1,3-PD的克雷伯氏菌属(Klebsiella)的数量和比例显著增加,分别由51346个、79.20%增加到55514个、89.50%,而菌群中不产1,3-PD菌属的含量显著下降。菌群DL38-BH中Klebsiella含量的增加提高了与甘油代谢相关的三种关键酶(GDH、GDHt和PDOR)的活性,从而使产物1,3-PD的产量和转化率有所提高。在利用单菌进行间歇发酵中,离子液体影响单菌生产副产物的种类和产量,但是对1,3-PD的产量和转化率并没有显著的影响。由此得出结论,离子液体通过调整微生物菌群的结构组成来影响菌群的发酵性能。
  (4)通过添加抗生素和微生物菌群中优势种的方式,考察微生物菌群结构的改变对菌群发酵性能的影响。实验结果表明:氨苄青霉素虽然提高了微生物菌群DL38-BH中克雷伯氏菌属所占的比例(由85.86%增加到94.98%),使甘油消耗速度加快,但是1,3-PD的产量并没有增加,可能是由于菌群中主产乙醇的单菌Y5-BH和Y1-BH比例增加的缘故。通过增加微生物菌群中单菌W3-BH和Y5-BH的比例对菌群结构进行调整,提高了微生物菌群DL38-BH的发酵性能,发酵时间由30h缩短到26h,1,3-PD的产量和转化率有所增加,分别由21.31 g/L、0.25 mol/mol提高到37.16 g/L、0.35 mol/mol。
  综上所述,微生物菌群发酵技术可以代替纯培养发酵技术来解决廉价原料难以利用、底物转化率低、副产物多、发酵和分离成本高等产业化难题,为微生物菌群用于其他生物基化学品的生产制备提供参考。
[硕士论文] 尹梦雯
食品科学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:血栓栓塞类疾病的发病率近年来不断上升。利用纤溶酶溶解是血栓栓塞类疾病治疗的重要方法,而微生物是非常重要的纤溶酶来源,且具有种类多、易于培养、繁殖快,人们的提取工艺也较为成熟的优点。乳酸菌广泛存在于发酵食品中,并且大多数乳酸菌是肠道内的有益微生物。因此,从传统发酵食品中筛选产纤溶酶的乳酸菌,并对其产生的纤溶酶进行研究,对开发预防血栓栓塞类疾病的保健食品具有重要的意义。
  本研究从传统发酵食品中分离筛选产溶纤酶的乳酸菌,对其进行形态特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列综合鉴定,以确定菌株的种属;对目的菌株进行安全性的初步评估,选取安全的菌株进行后续研究。进行菌株的基本生物学特性的研究;对菌株所产的纤溶酶进行分离纯化,并对酶学性质进行研究;采用响应面的方法对该菌株进行产酶条件优化。主要研究结果如下:
  (1)从传统发酵食品中经初筛、纤维蛋白平板复筛,筛选出2株溶解纤维蛋白的菌株,分别命名为HYD09和HYN06。测定两株菌的发酵上清液酶活,其分别是115.3U/mL和107.2U/mL。根据菌株菌体特征、菌落特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对结果,判定两株菌均为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。
  (2)进行安全性评估实验结果表明:菌株HYD09和HYN06溶血试验、吲哚试验、硝酸盐还原酶试验、氨基脱羧酶试验的结果均呈阴性;12种抗生素作用后,并未表现出多重耐药性;菌株HYD09无毒力基因检出,而菌株HYN06检出esp毒力基因。综合以上结果,初步推测菌株HYD09安全。因此,后续试验以菌株HYD09作为实验对象。生物学特性实验结果表明,菌株HYD09具有一定的耐酸性,且对胆盐的耐受力较好。其发酵上清液经过胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,仍具有纤溶活性且酶活无明显变化。
  (3)将菌株HYD09的发酵上清液进行不同硫酸铵饱和度的分级沉淀试验,选取60%为最佳硫酸铵饱和度对菌株HYD09发酵上清液进行盐析。盐析后,透析除盐,经过DEAE-Sephadex A-25交换层析等手段处理得到两个蛋白峰,将两个峰的收集液经过浓缩,采用纤维蛋白平板检测得出峰Ⅱ具有纤溶活性,峰Ⅱ经过活性电泳和SDS-PAGE电泳均显示为一个条带,分子量为31.018kDa。整个纯化过程纤溶酶的比活力从203.2U/mg提高至1889.8U/mg,纯化倍数为9.3,回收率为19.3%。
  (4)对纤溶酶HYD09酶学性质进行研究,结果表明:最适反应温度为35℃,最适pH值为7.5;抑制剂PMSF、IAM、β-巯基乙醇对该酶的抑制作用相对较弱,抑制率分别为2.3%、3.7%、5.8%;而EDTA则可以完全抑制该酶的活性,表明该酶可能为金属蛋白酶。金属离子对酶活的影响试验表明,Ca2+对纤溶酶HYD09的酶活力有明显的促进作用,酶活提高了12.2%,Fe2+和Ba2+对该酶的酶活力有轻微的促进作用,酶活分别提高了3%和1.8%,Zn2+对此酶有明显的抑制作用,酶活降低了86.8%。
  (5)主要采用单因素实验法确定对菌株HYD09产酶活力影响较大的因素,选用响应面法对菌株HYD09的发酵条件进行优化,最后确定出产酶量最大的发酵条件为:乳糖9g/L,酵母提取物15g/L,接种量为2.96%,初始pH值为7.0,此条件下,产酶量可达394.74U/mL,酶活提高了3.4倍。
  本研究筛选出两株产纤溶酶的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HYD09和HYN06,对菌株进行了安全性评估,初步判定菌株HYD09为安全。进一步研究菌株HYD09的生物学特性,并对其发酵条件进行优化。对纤溶酶HYD09进行分离纯化,并进行酶学性质的初步研究。从而为进一步开发和利用该酶提供科学的理论依据。
[硕士论文] 康培
化学工艺 苏州科技学院;苏州科技大学 2018(学位年度)
摘要:赤藓糖醇是一种低热值、耐受量高、且可以有效防治龋齿的四碳糖醇,因其具备多种优良特性,它已经成为国际认可的食品添加剂。在发酵过程中,球头三型孢菌(Trichosporonoides oedocephalis ATCC16958)会产生赤藓糖醇和甘油等醇类物质,通过改变发酵培养过程的营养物质、无机盐等的添加,可能影响代谢途径关键酶的活性,从而改变菌株发酵生产不同多元醇的量。为此,本文研究主要围绕金属离子盐添加、金属离子盐与碳源葡萄糖的协同补料发酵、以及表面活性剂(两性离子)等的添加来研究球头三型孢菌的代谢调控,旨在探明相关的代谢调控机制和提高多元醇(主要是赤藓糖醇)的产量,本文研究的主要内容如下:
  首先,系统研究了四种金属离子盐CuSO4·5H2O,Ni(NO3)2·6H2O,MnSO4·H2O,Al2(SO4)3·18H2O对球头三型孢菌多元醇产量的影响。摇瓶培养120h后,与对照相比,在30mg/L CuSO4·5H2O作用下的赤藓糖醇含量增加了86.40%,副产物甘油减少了31.23%。此外,在5-L发酵罐中分批培养108h后,补充30mg/L CuSO4·5H2O下的赤藓糖醇产量达到44.27g/L,比对照增加了27.10%。进一步研究表明,培养60h后,与对照相比,在发酵罐中添加30mg/L CuSO4·5H2O的赤藓糖还原酶(ER)活性显著增加,而大多数发酵时间里3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)活性都在降低。此外,与对照细胞相比,用Cu2+处理的球头三型孢菌细胞中的NADPH/NADP比例略低。
  其次,在铜离子研究的基础上,为考察不同发酵方式下的多元醇生产状况,我们在5-L发酵罐中先采用不同浓度的葡萄糖进行分批发酵,然后用优化的葡萄糖浓度并添加CuSO4·5H2O进行发酵探索。结果表明,初始葡萄糖浓度为300g/L的赤藓糖醇产量最大为44.52g/L,其体积生产速率为0.371g/(L·h)、产率为0.167g/g。在此浓度葡萄糖的基础上添加30mg/L的CuSO4·5H2O后,赤藓糖醇产量达到49.62g/L,提高了11.5%。进一步控制总糖浓度为300g/L,且初始浓度为200g/L,分别进行单独补糖和协同补糖与铜离子的补料发酵,结果赤藓糖醇产量分别为47.25g/L和55.31g/L,比初始300g/L的葡萄糖分批发酵分别提高了6.1%和24.2%。特别地,协同补糖与CuSO4·5H2O后,赤藓糖还原酶的活性在84h达到最大,为0.152U/mg protein,比单独补糖时提高了18.8%;通过铜离子盐和葡萄糖的协同补料发酵可显著提高赤藓糖醇的产量,最终使赤藓糖醇生产速率达到0.461g/(L·h)。
  最后,我们又考察了不同种类的表面活性剂对球头三型孢菌发酵产多元醇的影响。摇瓶发酵120h后,添加0.5g/L甜菜碱所对应的赤藓糖醇产量最大,为37.16g/L,比对照提高了50.38%。通过对酶活的分析,发现发酵48h后,0.5g/L甜菜碱(0.211U/mg protein)作用下的赤藓糖还原酶活性略高于对照(0.192U/mg protein),且两者都在此时达到最大值;此外,在整个发酵过程中两者的ER活性大小没较大差别。进一步用扫描电子显微镜观察后发现,发酵培养96和120h后,对照组细胞破损严重,而0.5g/L甜菜碱作用下的细胞结构仍然较完整。
[硕士论文] 黄军
化工过程机械 广西大学 2018(学位年度)
摘要:随着养殖业蓬勃发展,畜禽养殖废弃物逐年增加。畜禽养殖废弃物由于不能及时处理,给环境带来严重的污染,另外,国内养殖废弃物资源存在利用率较低的情况。基于此,本课题对畜禽养殖废弃物好氧发酵工艺进行研究,根据工艺要求设计了一个好氧发酵罐,可快速实现畜禽粪便无害化处理和利用,具有一定的经济效益和社会意义。
  畜禽养殖废弃物好氧发酵罐由进出料系统、保温结构、搅拌系统、通风系统、传动系统等组成。通过理论计算得最低耗氧量为396m3/h;对搅拌机构建立数学模型,得到的扭矩为170742N·m;对大扭矩低转速工况,设计了液压驱动棘轮棘爪传动机构,选用的液压缸行程为500mm,压力为16MPa,棘轮为十二齿。应用建模软件SolidWorks建立了零部件的三维模型,利用有限元分析软件ANSYS Workbench对复杂的受力部件进行强度和应力校核。其中发现:分离板中心处变形较大,刚度不能满足要求。针对此情况提出改进,并对改进后的模型进行应力分析,结果得出改进后的分离板刚度和强度均能满足实际要求;对移料机构进行应力分析,得出最大应力分布在叶片与轮毂的焊接处,最大变形在叶片的自由端,设计的移料机构能够正常工作。在机械系统动力学自动分析软件ADAMS中对传动机构进行动力学仿真分析,由仿真得到棘轮运动轨迹、棘爪和活塞杆的位移变化曲线,分析各曲线可知设计的传动机构能够按照设计要求进行运动,满足传动要求。
  利用调控处理的物料进行试验,经过一个周期的发酵,得到了发酵产物深褐色、无臭,检测结果达到农业标准NY525-2012要求。
[硕士论文] 舒中玉
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:长期使用抗生素导致了诸多问题,许多国家早已限制在饲料添加剂中抗生素的使用。在此背景下,无毒副作用的益生菌得到了广泛关注。乳酸片球菌是具有益生效果的肠道益生菌,利用乳酸片球菌代替抗生素对畜牧业的可持续发展具有重要意义。但是益生菌的活性会受外界环境的温度、湿度、pH值等的影响,当处于不利条件下时会大量死亡,导致其不能充分发挥对宿主产生的有益作用。本研究对乳酸片球菌的体外益生特性、发酵工艺及喷雾干燥工艺进行了研究。具体研究结果如下:
  对实验室保藏的菌种进行菌落形态和16S rRNA基因保守序列分析,鉴定该菌株为乳酸片球菌,将其命名为乳酸片球菌S204(Pediococcus acidilactici S204)。从P.acidilactici S204的抑菌能力及其对高温、模拟胃液、猪胆盐、抗生素耐受性等方面研究其益生特性。结果表明该菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均有抑制作用;55℃处理20min时活菌数数量级没有变化;60℃处理10min时活菌数下降约3个数量级,20min时活菌数降至0。耐受pH2.5的模拟胃液达1h时存活率66.17%,2h时存活率17.95%;对0.1%-0.5%的猪胆盐表现出良好的耐受性;对青霉素敏感,对氨苄西林、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、万古霉素有耐药性。
  采用单因素实验对乳酸片球菌S204的发酵工艺进行优化。得到的培养基组分为葡萄糖6%,酵母浸粉6%,MnSO4·H2O0.02%,MgSO4·7H2O0.04%,无水乙酸钠0.5%,柠檬酸铵0.2%,K2HPO40.2%,吐温-800.1%。发酵条件:培养基初始pH6.5,接种量5%,37℃下静置培养。该菌株在此培养基及培养条件下培养15h时活菌数可达到7.9×109cfu/mL。用5L发酵罐进行放大实验,装液量1.5L,葡萄糖6%,酵母浸粉6%。发酵过程通过流加碱液调控pH为6.5,并补加70g的葡萄糖和70g的酵母浸粉,发酵15h时活菌数可达2.72×1010cfu/mL。
  采用单因素实验对乳酸片球菌S204的喷雾干燥工艺进行优化。得到复配壁材组成为脱脂奶粉12%,乳糖2%。在进风温度160℃,出风温度63-68℃条件下,微胶囊中乳酸片球菌活菌数3.83×109cfu/g,存活率67.06%。
[硕士论文] 孙华菊
化学工艺 广西大学 2018(学位年度)
摘要:本文为了从家蚕蚕丝的丝胶蛋白酶解液中筛选ACE抑制多肽,具体研究内容主要包括三部分:(1)通过对蚕丝的脱胶工艺的优化获得丝胶蛋白;(2)运用理论分析与体外实验相结合的方式从丝胶蛋白酶解液中筛选ACE抑制多肽;(3)通过亲疏水性不同的高交联聚合物对丝胶蛋白酶解液中的ACE抑制多肽的初步筛选。主要研究成果如下:
  (1)研究结果得出在温度121℃,0.2Mpa的压力下,料液比为1∶30的高温高压下对蚕丝脱胶2h,脱胶率高达29.5%左右,其中丝胶蛋白的蛋白质含量高达96.8%。
  (2)运用理论酶切点分析与实验验证相结合筛选出高活性的ACE抑制的丝胶蛋白酶解液,再基于C端氨基酸对ACE抑制活性起重要作用的策略,构建QSAR模型并预测得出丝胶蛋白酶解液中ACE抑制多肽的活性并通过合成多肽实验验证发现其预测准确性大于75%以上(log IC50<0.7),该方法实现了对ACE抑制多肽的快速、高通量的筛选。同时对合成多肽中活性差异最大的两个多肽(SSR和SSK)进行抑制机理分析,通过实验分析Lineweaver-Burk曲线显示两个多肽与ACE的抑制都为竞争性抑制,再通过分子对接分析发现多肽的C端含有更多的H键受体更容易与ACE活性口袋中的关键氨基酸形成氢键,因此会具有更高ACE抑制活性,从而解释了SSR(IC50=42.6μM)比SSK(IC50=239.9μM)具有更高的ACE抑制活性的原因。
  (3)通过亲疏水性不同的高交联聚合物(HCP-Ben、HCP-Th和HCP-Py)对丝胶蛋白酶解液的选择性吸附来进行ACE抑制多肽的初步筛选。吸附后通过体外活性实验证实,通过HCP-Ben吸附48h后的酶解液的ACE抑制活性增加,IC50值从49.98mg/L降为37.04mg/L;通过HCP-Th和HCP-Py吸附后平衡后的酶解清液的ACE抑制活性降低,分别为80.40mg/L和60.64mg/L。达到了初步筛选的目的,为进一步纯化分离奠定良好的理论基础。
[硕士论文] 高波
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:萜类化合物是一类主要来源于植物的次级代谢产物,结构上通常为异戊二烯单元倍数及其含氧衍生物。萜类化合物广泛应用于药品、食品、香料和化妆品行业,具有很高的经济价值。合成生物学的发展使得利用微生物生产萜类化合物成为一种更加简单、高效和节约成本的生产方式。本论文以分子生物学技术为手段构建了一系列酿酒酵母整合载体,利用基因组整合的方式对酿酒酵母的类异戊二烯代谢途径进行调控,增加各个阶段前体物质供应,进而提高工程酵母萜类化合物的产量。在引入无环单萜香叶醇合成酶基因后,代谢工程改造的酿酒酵母工程菌株的香叶醇产量相比于原始菌株有了较大程度的提高,为萜类化合的生物合成打下了基础,研究取得的主要结论如下:
  (1)本文以Gal1/Gal10双向表达穿梭载体pCTCON-dual-intra-Metab v1为基础载体,依据文献报道的能够使整合基因高效表达的酿酒酵母基因组整合位点选择合适的整合位点构建了一系列酿酒整合载体,pINT1-TRP1-ERG8-ERG19-24REC、pINT1-URA3-ERG13-ERG10-20REC、pINT1-HIS3-mvaA-ERG12-21REC、pINT1-LEU2-ERG20-IDI1-19REC。这一系列载体可以在线性化后整合至酿酒酵母基因组用于代谢工程改造,也可以在更换代谢调控基因后在酿酒酵母中整合表达并稳定遗传,为酿酒酵母代谢工程改造提供了基础。
  (2)本研究以酿酒酵母CEN.PK2-1C为底盘生物,将上述构建的酿酒酵母整合表达载体依次整合至酿酒基因组得到了一系列代谢工程改造的菌株。工程酵母的整合基因相对表达量分析结果显示目的基因ERG8、ERG19、ERG13、ERG10、mvaA、ERG12、ERG20和IDI1相对于原始菌的表达量分别提高了18.51倍、18.38倍、8.40倍、8.75倍、1472667.19倍、372.22倍、160.90倍和91.77倍。
  (3)为了研究代谢工程改造后的工程酵母合成萜类化合物的能力是否相对于原始菌有所提高,在原始菌和代谢工程改造的工程酵母中引入来源于罗勒中的香叶醇合成酶基因(GES)。其中MG6、MG10和MG11菌株在半乳糖诱导培养后分别产生了0.06mg/L、3.08mg/L和1.09mg/L的香叶醇,其他代谢工程改造的工程酵母并没有检测到香叶醇的产量。
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