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[博士论文] 雷娜
园艺学(蔬菜学) 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:干旱胁迫与高盐胁迫是全球范围内严重影响农作物产量的两种主要非生物胁迫。对于生长调节而言,盐和干旱胁迫包括离子信号通路和渗透平衡信号通路。传统的育种方法耗时耗力,并且对于提高作物对高盐和干旱的耐力效率极低。为了探究非生物胁迫的抗性机理,前人从形态学、生理学、生物化学以及之后的分子水平等方面进行了大量的研究。目前,番茄已成为茄科的一种经济蔬菜作物,并作为双子叶植物基因研究的模式植物。属于一个多基因家族的膜联蛋白在植物胁迫反应和多种细胞过程中发挥着不可或缺的作用。在本研究中,我们从具有抗旱性的野生番茄潘那利(Solanum pennelli)克隆了AnnSp2,并在栽培种中对其进行了功能研究。主要研究成果如下:
  1、对AnnSp2进行克隆和测序,结果表明AnnSp2编码一个有316个氨基酸组成的膜联蛋白。
  2、通过实时定量PCR对AnnSp2表达谱分析,结果表明AnnSp2在叶片和花中大量表达,AnnSp2蛋白主要定位于细胞核。AnnSp2能够被植物激素以及非生物胁迫强烈诱导,如失水,高盐以及脱落酸。
  3、通过农杆菌介导的遗传转化,获得了16个AnnSp2过表达的转基因株系。
  4、对3个AnnSp2过表达株系进行了非生物胁迫的抗性鉴定。通过对发芽率、根系发育状况、存活率、叶片失水率和叶绿素含量等生理学指标的测定,结果表明过表达AnnSp2能增强番茄对干旱及盐胁迫的抗性。
  5、AnnSp2转基因植株在种子萌发期和幼苗期对脱落酸不敏感,这一现象揭示了转基因植株对胁迫抗性有所增强。
  6、此外,ROS的清除,叶绿素总含量的提高,脂质过氧化水平的降低,过氧化酶活性的增强(包括APX,CAT和SOD)以及脯氨酸含量的升高—这些现象均在AnnSp2超表达植株中被观察到,这和那些与胁迫相关的基因的在转录水平的变化联系紧密。
  7、通过与胁迫相关的基因表达量的变化而得到的关于发芽和幼苗实验的结果显示,超量表达AnnSp2基因的转基因番茄株系通过ABA信号调节与ROS的清除提高了对于盐与干旱的抗性。
[硕士论文] 徐进
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界公认的主要粮食作物之一,它的块茎不仅可以当作粮食作物,而且还可以用于工业生产淀粉等。在植物光合作用产生的碳水化合物,通过韧皮部筛管向储存库器官运输并积累的过程中,起到主要作用的就是蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter)。双子叶植物中的蔗糖转运蛋白包括SUT1、SUT2和SUT4三类,主要功能就是对植物光合产物蔗糖的装载、运输和卸载过程的调节作用。在马铃薯中,StSUT1蛋白主要对蔗糖的装载进行调控,StSUT4蛋白主要对蔗糖的卸载过程进行调控,并且还与光周期相互作用来调节马铃薯植株的开花、茎长短和块茎形成,但是StSUT2蛋白的功能仍是未知的。根据国内外多年来对高等植物SUT2的研究分析来看,它的结构与葡萄糖信号感受器类似,因此推测SUT2有可能是蔗糖信号感受器而不是蔗糖转运体。
  本研究主要通过构建马铃薯StSUT2基因的干扰载体,并对其转化至马铃薯中,为对StSUT2蛋白进行功能分析奠定了基础。实验主要分为两部分:一是干扰载体的构建,用Gateway克隆技术可将StSUT2基因干扰片段快速重组到表达载体中,通过对重组子进行测序,确定为干扰表达载体;二是马铃薯遗传转化,将构建好的干扰载体通过农杆菌介导法转化至马铃薯块茎中,使其再分化产生含有干扰基因的转基因植株。取得的主要成果如下:
  (1)利用TOPO克隆,将扩增出的干扰片段整合到pENTR中,构建出入门载体命名为pENTR-SUT2。
  (2)根据Gateway克隆技术进行LR重组,根据入门载体与表达载体的attL和attR位点重组,构建出干扰表达载体pSUT2-RNAi。
  (3)用冻融法将干扰载体pSUT2-RNAi转至农杆菌GV3101中。
  (4)将干扰载体转化至夏波蒂(SHB)和陇薯3号(L3)等马铃薯品种的块茎中,通过卡那霉素筛选和PCR扩增检测,初步确定干扰基因已经成功转入马铃薯植株中。用实时荧光定量 PCR对转化株进行相对表达量检测表明,干扰基因已经转入马铃薯植株,并对StSUT2基因表达产生抑制作用。
[硕士论文] 吴婷婷
自然地理学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:湿地土壤种子库是湿地植被自然更新与演替的种质资源,是湿地植被生态恢复的物质基础。土壤种子库的规模及其物种组成、多样性与丰富度特征等可用来评估湿地植被的恢复潜力,其储量与受损后相应生态系统的恢复速度成正比。本文以图们江下游不同类型湿地土壤种子库为研究对象,通过选取图们江下游四个类型湿地的七块标准样地,采用标准样地调查与取样,野外植被调查与室内种子库不同水分条件萌发控制试验相结合的手段,探究图们江下游不同类型湿地土壤种子库特征及其在湿地植被生态恢复过程中的应用潜力。
  主要研究结果如下:
  (1)图们江下游湿地各样地土壤种子库中优势物种地位突出,储量丰富,具有进行湿地植被生态恢复的种质资源潜力,土壤种子库的储量在垂直方向上基本呈现随深度增加而下降的趋势。本试验共出现物种60种,计植物幼苗数14723株,其中湿润处理条件下出现物种数46种显著高于沉水/淹水处理33种,但从萌发植物幼苗数量上看,沉水/淹水处理条件下种子库萌发数量占土壤种子库总数的60%,表明水文恢复在图们江下游湿地植被恢复过程中具有重要意义。
  (2)图们江下游湿地各样地地上植被群落物种组成较丰富,地上植被群落调查过程中共计出现植物79种,隶属28科58属,优势物种以禾本科、莎草科、菊科、蓼科类植物为主。各湿地样地地上植被群落单位面积内植被数量差异明显,湖泊型湿地地上植被密度最大,约1458株/m2。从植被群落的物种重要值来看,除沼泽型湿地与自然湖泊型湿地仍以以湿生植被:蔗草、密穗莎草、通泉草、雨久花为优势种外,其余湿地样地地上植被群落优势种都已趋向旱化,问荆、稗草等杂草类植物优势突出。
  (3)图们江下游湿地各样地土壤种子库中出现的植物科与地上植被群落调查时出现的植物科相似性系数达到80.77%。但各样地间物种相似性系数均较低,在7.14%-42.86%之间,表明地表植被与种子迁移过程受外界生境因子影响较明显,不同湿地类型植被恢复潜力存在差异,从数据分析结果来看,同等情况下图们江下游地区湖泊型湿地植被的恢复潜力较其它样地大。
  (4)图们江下游湿地各样地土壤种子库特征与地上植被群落物种组成结构特征在时间尺度上均存在差异,主要表现为:植被的物种数量增加,多年生物种比例与湿生植被物种比例均降低。从物种生物多样性指数来看,受人为干扰较小的沼泽型湿地生态系统土壤种子库与地上植被群落稳定性较好。
  (5)针对不同湿地类型的植被群落结构特征,在湿地植被生态恢复过程中应选取适合的修复技术,如:自然恢复法更适用于干扰程度在一定阈值内的区域;表层沉积物去除法,适用于受到强烈人为干扰的区域,但可能需要重播种;种子库移植法对主要依靠无性繁殖的物种恢复效果较好,但大面积施用存在困难。
[硕士论文] 宋晓伟
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:大麦是世界上第四大谷类作物,可作为饲料、食品生产或啤酒酿造的原料,是典型的“三元作物”。控制大麦棱型的六棱基因vrs1,为位于2H染色体长臂上的隐性基因,是独立遗传的,它的等位基因Vrs1能够抑制侧小穗的发育,从而导致二棱的形成。很多研究表明,大麦棱型性状和大麦的产量有着密切联系。单隐性基因nud位于大麦7H染色体长臂上,控制裸颖果的性状,像棱型基因一样,Nud基因对大麦的品质性状也有着显著的影响。为了获得高产量和高品质的大麦品种或种质,本研究使用农杆菌介导法,利用CRISPR-Cas9技术对棱型Vrs1基因和皮裸基因Nud进行基因组的定点编辑,以期获得二棱性状向六棱性状转变以及皮颖果性状向裸颖果性状转变的大麦基因编辑植株。文中分别选取了华大麦5号,华大麦6号和浙农大3号的幼胚愈伤组织转化以棱型基因Vrs1为靶基因的载体,华大麦4号和华大麦7号的幼胚愈伤组织转化以皮裸基因Nud为靶基因的载体,同时对华大麦5号和华大麦6号的成熟胚愈伤组织进行了棱型基因Vrs1为靶基因的转化,最终以潮霉素为筛选标记基因,成功获得了部分不同大麦品种的转基因阳性植株,同时对幼胚愈伤分化率与培养时间的关系进行分析,主要结果如下:
  (1)在农杆菌介导棱型基因Vrs1对大麦幼胚愈伤组织的转化试验中,共得到14株抗性植株,其中华大麦5号未得到再生植株。经PCR检测,共有潮霉素基因阳性植株有4株,分别为浙农大3号和华大麦6号各2株。
  (2)在农杆菌介导棱型基因Vrs1对大麦成熟胚愈伤组织的转化试验中,使用的大麦品种为华大麦5号和华大麦6号,最终没有得到抗性苗。
  (3)在农杆菌介导皮裸基因Nud对大麦幼胚愈伤组织的转化试验中,华大麦7号得到5株抗性苗,而华大麦4号未得到抗性苗。经PCR检测得到1株潮霉素基因阳性植株。
  (4)幼胚愈伤组织侵染后在分化培养基上分化时,华大麦6号和浙农大3号在培养时间8周时愈伤组织分化率最高,而华大麦7号在培养12周时分化率最高。
[硕士论文] 李晨柳
作物遗传育种 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:随着盐碱地面积逐渐增大,盐胁迫已成为制约作物产量的一个重要的非生物胁迫因素。因此,不断探究作物耐盐的生理机制以提高粮食的产量和品质是人类不断追求的目标。高等植物NDH复合体介导的围绕PSⅠ的循环电子传递(CET-PSⅠ)是植物适应各种自然环境胁迫所产生的一个十分重要的保护机制。由于C4植物CO2浓缩机制需要额外ATP,其CET能力强于C3植物。NDH的表达变化是造成C4植物和C3植物CET强弱差异的主要因素。在三大粮食作物中,玉米和水稻分别属于C4和C3植物。本研究基于生物信息学方法全基因组鉴定玉米NDH复合体核编码基因,对鉴定出的基因基于基因家族分别开展系统进化分析,筛选C3和C4植物中可能发生功能分化的基因,并对玉米中筛选到的经历正选择作用的基因家族中的ZmNdhL1基因,在水稻中进行转基因超表达研究,比较分析转基因株系与野生型植株在盐胁迫下光合生理特性差异,主要结果如下:
  1、以17个NDH复合体核编码的亚基蛋白结构域为查询序列,搜索玉米、拟南芥、水稻和高粱参考基因组,共鉴定出27个玉米基因,22个拟南芥基因,23个水稻基因和23个高粱基因。依据基因重复与树图将上述NDH核基因的进化树分为三类。A类:四个物种构建出的树图为单簇且在四个物种中的基因均为单拷贝基因,此类进化树有8个;B类:四个物种构建的树图都为单簇,但在C4作物玉米或高粱中的基因有两个拷贝,此类进化树有5个;C类:四个物种构建的树图有两个以上的同源基因簇,此类进化树有4个。经正选择作用检测发现,NdhL和PnsB2两个基因家族经历了正选择作用。
  2、对玉米中NdhL和PnsB2两个基因家族的基因实时荧光定量分析发现,ZmNdhL1表达量最高,该基因在叶中高表达,受盐、干旱、低温非生物胁迫诱导表达。从具有强CET活性的玉米自交系ZM395中克隆了该基因的全长cDNA,其开放阅读框(ORF)为588bp,编码195个氨基酸。构建了该基因过表达载体,利用农杆菌介导法转化水稻,经过潮霉素抗性鉴定、PCR和RT-PCR鉴定筛选出24个转基因植株,其中转基因植株OE3和OE13表达最高,被用于后续研究。
  3、测定转基因和野生型植株叶片卷曲程度和叶绿素荧光动力学曲线发现,在对照情况下,超表达株系与野生型之间差异不明显。在200mM盐处理条件下,与野生型相比,超表达株系叶片卷曲程度低;作用光关闭后叶绿素荧光瞬间上升幅度大;PSⅠ的最大光化学效率Y(Ⅰ)、PSⅡ的最大光化学效率Y(Ⅱ)、PSⅠ电子传递速率ETRI、PSⅡ电子传递速率ETRⅡ下降幅度小;快速叶绿素荧光OJIP曲线J点下移, K-band峰值小;延迟荧光诱导曲线的I1点和I2点下降幅度小。上述结果表明,超表达株系的耐盐性优于野生型。ZmNdhL1基因的过表达提高了植株的CET活性,使得光合电子传递链的放氧复合体(OEC)和电子由原初醌受体QA向下游传递的活性受伤害程度变轻,从而降低了盐胁迫对PSⅠ和PSⅡ的伤害。
[硕士论文] 闫丽
作物学;作物遗传育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物油脂(三酰甘油TAG)是人类日常生活中主要的能量来源。油料作物的含油量和脂肪酸组成是衡量其优质的两个指标,对于含油量高的作物品种的培育是研究工作者一直关注的问题。利用常规传统遗传育种的方法来实现大豆种子含油量的大幅提高存在客观障碍。因此,通过分子生物学的方法鉴定和调控与油脂合成相关基因的表达,解析其分子机制,从而达到提高油料作物种子的含油量的目的,是目前培育高油新品种的研究方向之一。大豆是重要的油料作物,改良其油含量和脂肪酸组成是大豆育种的重要目标之一,但是大豆栽培品种中种子含油量一般在20-22%,与种子含油量高的花生等(40-50%)相比,大豆种子含油量要低。因此,大豆种子在油脂合成上具有再提高的潜在能力。WRINKLED(WRI)是AP2/EREBP转录因子家族的一员。现有研究表明,WRI控制C流从蔗糖到油的积累中起重要作用,并且在糖酵解和脂肪酸合成途径中起到重要调控作用。本文以大豆转录因子GmWRI1a为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术通过抑制转基因受体植株中内源基因Gm WRI11a的表达,创制大豆GmWRI1a基因突变体,通过测定GmWRI1a基因突变体转基因大豆的种子含油量、分析该基因对糖酵解、脂肪酸合成途径相关基因的调控,解析该基因在调控大豆种子油脂合成中的作用,为进一步通过基因工程方法快速改良大豆品质,更好地改造植物自身的脂肪代谢过程,创造优良的油料作物种质奠定理论基础。
  本研究主要内容包括:⑴设计大豆GmWRI1a基因3个靶点为GmWRI1a-sgRNA-1、GmWRI1a-sgRNA-2、GmWRI1a-sgRNA-3。⑵构建了GmWRI1a基因敲除表达载体pVK005-04-GmWRI1asgRNA-1、pVK005-04-GmWRI1asgRNA-2、pVK005-04-GmWRI1 asgRNA-3,利用发根农杆菌介导法转化大豆,对3个质粒是否在大豆毛状根发生基因定点编辑进行验证。⑶通过大豆发根试验验证发生定点编辑的2个质粒,利用农杆菌介导子叶节法转化大豆,共获得T0代转基因植株107株,其中靶点GmWRI1a-sgRNA-1有74株,靶点GmWRI1a-sgRNA-3有33株。⑷运用除草剂抗性、PCR技术以及DNA序列分析鉴定8株GmWRI1a基因突变体转基因大豆阳性植株分别编号为310、327、287、294、350、282、109、250。⑸运用Real-time PCR技术,分析了GmWRI1a转基因突变株大豆油脂合成相关基因的表达量。结果表明,GmWRI1a基因的突变株中随着GmWRI1a基因的下调表达,可显著下调糖酵解及脂肪酸合成过程中相关基因的表达量,说明GmWRI1a基因是通过调控糖酵解及脂肪酸代谢途径相关基因来增加大豆种子油脂含量的。⑹测定了T1代GmWRI1a转基因突变株大豆种子含油量,研究结果表明,转基因突变株种子的含油量较野生型有不同程度的降低。说明GmWRI1a基因的突变株和大豆种子的总含油量呈现负相关,GmWRI1a基因可以促进大豆种子油脂的积累。
[博士论文] 朱艳芬
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻既是重要的粮食作物,也是单子叶植物基因组研究的模式植物,是生殖隔离研究的模式系统。亚洲栽培稻包括籼稻和粳稻两个亚种,其杂种通常高度不育,阻碍了对亚种间杂种强大杂种优势的利用。S5是控制籼粳杂种胚囊育性的主要位点,包括ORF3,ORF4和ORF5三个连锁基因。典型籼稻的基因型为ORF3+/ORF4-/ORF5+,典型粳稻的基因型为ORF3-/ORF4+/ORF5-。细胞壁蛋白ORF5+与跨膜蛋白ORF4+共同诱导内质网胁迫进而引起细胞程序性死亡从而导致雌配子败育,内质网蛋白ORF3+则能够阻止或者缓解内质网胁迫阻止雌配子被杀死从而恢复正常育性。本研究从分子细胞学和转录组角度对S5作用机理进行了研究。
  我们构建了粳稻Balilla穗组织的酵母双杂交文库。利用ORF3,ORF4和ORF5的各种全长以及截短的蛋白作为诱饵筛选文库,并利用ORF5-得到了两个候选基因,但是经过进一步验证之后发现是假阳性。根据对S5作用模式的设想,我们研究ORF4+与膜受体蛋白如S1L4、LYP4和LYP6的互作关系,但是发现也不互作。
  我们构建了ORF5+-GFP与ORF4+-GFP转烟草BY-2悬浮细胞的稳定细胞系,对ORF5+和ORF4+的蛋白性质进行了初步研究。为了研究位于细胞壁的ORF5+是否通过破坏细胞壁释放寡糖信号分子,我们用三种寡糖对ORF4+-GFP的细胞系进行处理,发现这些寡糖不能诱导细胞的死亡。另外我们也对ORF4+是否为ORF5+的底物进行了初步探究,将ORF5+与N端或者C端带荧光蛋白的ORF4+共同转入烟草叶片,观察ORF4+的定位变化,但是并未观测到有改变。在BY-2细胞系和烟草瞬时转化过程中,我们发现融合了荧光蛋白的ORF5+并不定位在细胞壁上,推测融合的标签可能会影响ORF5+的功能。但是,我们发现ORF5+或者ORF5-融合GFP标签的拟南芥稳定转化植株能够降低叶片中PR基因表达量。
  ORF5+编码天冬氨酸蛋白酶,转基因植株BalillaORF5+不育。为了探究ORF5+酶活功能是否为必需,我们将其两个酶活位点的天冬氨酸D132和D337分别和同时诱变为天冬氨酰并转入Balilla,发现不管是分别诱变还是同时诱变类型都正常可育。因此,我们认为ORF5+的酶活是其发挥功能所必需的。
  ORF4+编码一个N端在细胞外,C端在细胞内的单次跨膜蛋白。ORF4+-GFP与内吞marker部分重合,暗示其可能参与内吞。我们对ORF4+预测的内吞位点进行诱变,发现这些位点与ORF4+的内吞现象无关。ORF4+超表达植株BalillaORF4+OX株高变矮,分蘖数减少,其叶片会产生假病斑并积累胼胝质,植株对白叶枯病菌PXO341的抗性增强,BalillaORF4-OX则不会出现这些表型,这说明ORF4+和ORF4-的功能差异很大。另外,我们利用基因敲除技术CRISPR在Balilla中成功敲除了ORF4+,获得了一个S5位点为ORF3-/ORF4-/ORF5-的植株。
  通过比较Balilla,败育的BalillaORF5+和育性恢复的BalillaORF3+ORF5+胚囊发育过程,我们将胚囊败育过程划分为三个时期(MMC,MEI和AME)并研究了这些时期的转录组数据。通过比较BalillaORF5+和Balilla,发现ORF5+在MMC时期引起大量细胞壁重构基因如EXP,XTH,GH9,PAE,PME,PGase和AGP的上调表达,这些基因可能导致细胞壁完整性的破坏,并诱导了下游的生物和非生物胁迫反应以及内质网胁迫。MEI时期,持续的胁迫反应激活了由TIP2,TDR,OsAP25和OsAP37介导PCD过程。此外胚囊细胞通过上调表达OsSWN1,OsMYB46,OsCesA4,OsCesA7和OsCesA9等控制次生细胞壁合成的基因大量合成纤维素并通过调控胼胝质代谢大量积累胼胝质以稳固细胞壁。AME时期,败育的胚囊中积累了大量的纤维素和胼胝质。通过比较BalillaORF3+ORF5+和Balilla,我们发现MMC时期ORF5+在BalillaORF3+ORF5+依然能够引起部分细胞壁重构基因的上调表达进而引起胁迫反应。由于ORF3+的存在,这些反应没有BalillaORF5+强烈,并且在MEI时期被抑制,胚囊正常发育。ORF3+是一个分子伴侣蛋白,我们推测ORF3+可能通过修饰ORF4+的互作蛋白或者下游的信号分子抑制胁迫信号。通过BalillaORF3+ORF5+与BalillaORF5+的对比发现ORF3+使BalillaORF3+ORF5+中与抗病抗逆相关的基因,如OsMTs,OsLEAs和OsPR10a等的表达量都大幅度上调。
  本研究对S5位点的三个基因功能做了进一步的研究,揭示了ORF5+的酶活对其功能的重要性,ORF4+与抗病的相关性。结合Balilla,BalillaORF5+和BalillaORF3+ORF5+的转录组分析结果,认为ORF5+可能破坏细胞壁的完整性,被细胞膜上的ORF4+感知,向细胞内传递信号引起生物和非生物胁迫以及内质网胁迫和PCD。ORF3+存在时,内质网胁迫被抑制且抗逆能力增强从而抑制了ORF5+引起的胁迫反应,故胚囊正常发育。本研究有助于我们进一步理解S5的作用机理,为更好在生产上利用S5提供理论依据。
[博士论文] 韩忠民
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻(Oryza Sativa)是短日照植物,短日照促进水稻开花,长日照抑制水稻开花。之前大多数水稻开花的研究是在大田生产条件下收集水稻的抽穗期数据,部分水稻在生殖转换之前经历了包含短日照和长日照的混合日照长度。在此研究中,我们调查了从世界范围收集的529份水稻品种在完全自然短日照和长日照下的抽穗期,分别在籼稻和粳稻亚群中进行了全基因组关联分析。同时利用由4个亲本构建的多亲本高级世代互交系(MAGIC)群体,我们解析了自然长日照条件的抽穗期的遗传基础,比较了MAGIC群体中SNP水平的关联分析和bin水平的关联分析的QTL定位能力和分辨率。
  长日照条件下,我们在籼稻和粳稻亚群中分别检测到3个和4个QTL,其中2个QTL的LD(连锁不平衡)区间分别包含已知开花基因Hd17和Ghd7,但是在两个亚群中没有共同检测到的QTL。短日照条件下在籼稻中检测到6个QTL,其中3个QTL的LD区间分别包含已知基因Ghd7、Ehd1和RCN1;而在粳稻中没有检测到QTL。短日照条件下检测到的qHd3和长日照下检测到的qHd4是两个新的QTL,它们值得克隆并且进行深入研究。
  为了检测单倍型水平的关联分析的检测能力,我们对11个已知的抽穗期基因Hd17、Ghd7、Ehd1、RCN1、Hd1、Ghd8、Ghd7.1、DTH2、Hd3a、OsMADS50和OsMADS56进行了单倍型分析。单倍型水平的关联分析以更高的显著水平检测到了Hd17、Ghd7、Ehd1和RCN1,同时还检测到3个额外的基因Hd3a,OsMADS56和Ghd7.1。在这7个基因当中,只有qHd17是在籼粳两个亚群都检测到的。籼稻亚群中,长日照和短日照两个条件共同检测到了Ghd7和Ghd7.1。本研究进一步比较了各单倍型间的效应,鉴定了Ghd7和OsMADS56在育种上有应用价值的单倍型。
  由于自然群体中的历史重组事件难以追溯,所以很难对种质资源群体在全基因组水平进行单倍型水平的关联分析。而MAGIC群体由于存在系谱关系,可以确定任何一个基因组片段的亲本来源,即bin的基因型可以确定。因此可以构建bin图并且比较SNP水平和bin水平的关联分析的QTL检测能力。
  我们首先将4个亲本分为两组并在每组内进行成对杂交,再进行两个二元F1之间的杂交,获得包含4个亲本片段的四元F1植株,最后通过连续多代自交的方式获得F7世代MAGIC群体。我们对亲本和群体进行了重测序并且鉴定基因型,共得到1,231,431个高质量的SNP标记。我们使用基因组上的相互独立SNP进行了进化树的构建和主成分分析,结果显示我们构建的MAGIC群体的群体结构水平较低。我们通过滑动窗口结合IBD和IBS的方法构建了bin图。四亲本MAGIC群体总共有4,872个bin,平均每个bin覆盖基因组88.9kb的区域。通过bin图我们发现在水稻12条染色体的着丝粒区域均有明显的重组抑制发生,在第2、7、12染色体的末端有较强的重组热点。
  我们分别采用SNP水平和bin水平的关联分析对MAGIC群体在两年中的3组抽穗期数据进行QTL检测。使用这两种方法分别检测到了7个和12个QTL,其中已知基因DTH3和Ghd8在3组数据中被两种方法都检测到。Bin水平的关联分析将DTH3和Ghd8分别限定在120kb和330kb的bin内。SNP水平的关联分析单独检测到了Ghd7.1和Ehd1。Bin水平的关联分析单独检测到了Hd3a。此外,B11_324与抽穗期的关联在3组数据中重复地在bin水平的关联分析中检测到,因为没有已知的抽穗期基因在B11_324附近报道,所以它是一个新的抽穗期QTL。我们对DTH3、Hd3a和Ghd8位点的bin和B11_324做了多重比较分析。四个亲本的基因型对这4个位点都有贡献,而且等位基因都以较高的频率出现。其中,亲本Cypress的DTH3等位基因表现为提前抽穗,而它的Ghd8等位基因表现为延迟抽穗。
  结论:籼稻和粳稻亚群中长日照和短日照下的抽穗期的遗传基础不同。在自然群体中,单倍型水平的关联分析比SNP水平的关联分析检测基因能力更强。我们构建的四亲本MAGIC群体有着遗传多样性丰富、高等位基因频率、低群体结构的特点。在MAGIC群体中,Bin水平的关联分析方法和SNP水平的关联分析方法相比有着更高的分辨率。同时表明了MAGIC群体对于育种和遗传研究有着更高的价值。
[硕士论文] 周元委
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:维生素E,包括生育酚和生育三烯酚,是一种重要的脂溶性有机物,它具有很强的抗氧化性,在动植生命中有着不可替代的重要地位。人类对维生素E的需求量巨大,但其中90%左右靠人工合成。天然维生素E主要来源于植物叶片和油料作物种子,人工合成的维生素E在生物活性上与天然维生素E相差甚远。因此提高绿色植物特别是油料作物种子中维生素E的含量就显得尤为重要。
  油菜是世界上最重要的油料作物之一,油菜种子宫含维生素E且种植面积大,因此油菜维生素E育种日渐成为研究的热点之一,越来越受到育种工作者的关注。GWAS分析表明,油菜BnA9CHLSYN位点对种子中生育酚含量有着很强的效应。因此猜测油菜种子中生育酚合成的“瓶颈”在于叶绿素合成酶对生育酚合成的前体物质PDP进行“回收”,重新合成叶绿素,导致PDP浓度过低。想要打破这一“瓶颈”,就有必要研究叶绿素合成酶(Chlorophyll synthetase,CHLSYN)与生育酚合成之间的关系。本研究借助拟南芥这一载体研究种子中CHLSYN的表达量与种子中生育酚合成之间的关系,主要研究结果如下:
  1.不同甘蓝型油菜的BnA9CHLSYN位点对种子中生育酚含量的效应不同,据此将这些材料分为两组,H组和L组(分别对应BnA9CHLSYN位点对种子中生育酚含量呈正向效应和负向效应),H组材料种子中BnA9CHLSYN的表达水平低于L组材料种子中该基因的表达水平,生育酚含量相反。
  2.野生型背景下,采用特异性启动子干扰拟南芥种子中CHLSYN的表达之后,种子中生育酚含量提高,最多可提高33.69%,种子特异性超表达CHLSYN,最多可使拟南芥种子中生育酚含量降低44.73%,即拟南芥种子中CHLSYN的表达水平与生育酚含量呈负相关关系。拟南芥vte5纯合突变体背景下也得到相同的结论。
  3.采用相同种子特异性启动子干扰拟南芥种子中CHLSYN的同时超表达AtHPT,种子中生育酚含量最多能提高125.38%,而在种子中特异性超表达AtHPT最多可使生育酚含量提高123.56%,两者未达到显著差异。
  4.更换超表达AtHPT的启动子,采用不同种子特异性启动子干扰拟南芥种子中CHLSYN的同时超表达AtHPT,种子中生育酚含量最多能提高161.71%,而使用新的启动子超表达AtHPT之后,最多只能使生育酚含量提高95.99%。
[硕士论文] 安玥
生物信息学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻是世界上最重要的粮食作物之一,同时也是禾本科植物研究的重要模式物种。RNA-seq技术可以得到生物体在特定时期特定组织中全部的转录本,这使得我们可以从转录组的分析中挖掘出新转录本以及新基因。本文试图从不同品种、不同组织的水稻转录组数据中挖掘粳稻日本晴和籼稻MH63、ZS97参考基因组上不存在的新转录本和新基因,尽可能全面地补充水稻的注释信息。
  本文采用先组装后比对的策略,通过对NCBI数据库中2012年1月-2016年4月发表的共960个样本的亚洲栽培水稻(Oryza sativa)RNA-seq数据,分籼稻(indica)、粳稻(japonica)两个亚种进行de novo组装,得到28,352条籼稻及50,648条粳稻转录本。其中籼稻有6,939条新转录本、粳稻有11,875条新转录本均未比对到水稻日本晴、MH63以及ZS97参考基因组。通过对籼、粳转录本进行相互比对,发现仅有5.1%的籼稻转录本与3%的粳稻转录本相互间有大于60%的重叠区域,这说明绝大多数的新转录本具有亚种特异性。
  通过开放阅读框预测及与蛋白质非冗余数据库(nr库)进行同源序列比对,从新转录本中分别预测得到3,794条籼稻及6,181条粳稻高可信度蛋白编码序列。通过对其进行功能注释,3,380条(89.1%)籼稻及5,314条(86%)粳稻蛋白编码序列可在Pfam数据库中得到比对注释,1,648条(43.4%)籼稻及2,494条(40.3%)粳稻蛋白编码序列可通过KOG注释到23个蛋白功能分类中。2,489(65.6%)条籼稻及3,795条(61.4%)粳稻蛋白编码序列有GO注释结果。715条(18.8%)籼稻及1,046条(17.0%)粳稻蛋白编码序列在KEGG代谢途径分析中得到注释。并且发现大量基因参与水稻抗病及非生物胁迫响应过程。进一步分析籼、粳稻蛋白编码基因的同源基因家族发现,2,057条(54.2%)籼稻及4,404条(71.3%)粳稻蛋白编码基因是亚种特有的。
  另一方面,通过对籼、粳转录本组装结果进行编码能力预测及蛋白质同源序列比对的综合策略,预测得到16,600条长非编码RNA,为水稻长非编码RNA的分析提供基础。
[硕士论文] 苏欢
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:生育期和分枝数都是影响大豆栽培措施和产量的重要农艺性状,对影响这两个性状的QTL座位进行定位具有重要的理论和现实意义。为定位生育期相关QTL座位,本研究以栽培大豆菏豆14为母本,野生大豆ZYD02810为父本,构建生育期分离群体。在F2代,利用选择基因型方法进行生育期初步QTL座位定位,结果表明C2连锁群上Satt307(121.27 cM)和C1连锁群上Satt718(73.79cM)座位与生育期相关。进一步利用 F2群体中筛选出的 F2:3晚熟残余杂合株系继续种植分离群体对上述定位结果进行验证。结果表明,对于Satt307座位,无论哪种方法,均能得到验证;而对于Satt718座位只在F2单尾中得到验证,F2:3晚熟残余杂合株系没有得到验证,其结论尚需进一步验证。另外,通过对已克隆成熟期基因E1~E4测序结果表明,这些基因在亲本间没有差异,表明本研究中的生育期性状与这些基因没有关系。
  本研究以寡分枝栽培大豆冀黄13为母本,多分枝地方品种小黑豆为父本配制杂交组合,在2012年徐艳萍利用F2:3群体通过寡分枝单尾法选择性基因分型方法定位分枝数QTL的基础上,在2014,我们又利用F2:4群体通过双尾法选择性基因分型方法对大豆分枝数进行QTL定位。研究表明2014年,在F2:4分离群体中的双尾群体中共检测到2个与分枝数QTL座位连锁的座位,分别是F连锁群上的BARC13-1845座位和B2连锁群上的BARC14-1214座位;而在2012年利用寡分枝单尾群体检测到的L连锁群上BARC19-1222(71.32cM)座位,在2014年并没有被检测到。在2014年检测到的两个分枝数QTL座位附近,没有其他分枝数相关QTL座位的报道,这两个座位可能是新的。本研究将为进一步进行分枝数QTL座位的精细定位和分子标记辅助选择育种奠定基础。
[硕士论文] 高小龙
生态学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:WRKY转录因子家族是一类重要的基因家族,可在转录水平通过调控相关基因的表达翻译,参与植物对非生物胁迫的应答调控。本研究立足六倍体栽培种小麦基因组数据库,基于Blast等生物信息学手段分析筛选获得一批小麦WRKY转录因子,对所筛选的小麦WRKY转录因子结合拟南芥抗非生物胁迫WRKY家族成员做进化分析,筛选获得123条与六倍体小麦全长WRKY转录因子序列。TaWRKY146被发现在渗透胁迫下小麦组织中的表达量显著升高。TaWRKY146的过表达植株能显著提高植物的抗旱性。
  本研究主要内容包括:⑴以拟南芥,乌拉尔图和山羊草的WRKY转录因子为模板,通过Blast序列比对分析,获得818条小麦WRKY相似序列。将这些相似序列经SMART和PFAM平台分析,最终获得123条具有全长开放阅读框的小麦WRKY转录因子。将这些序列与拟南芥和水稻的抗非生物胁迫WRKY转录因子进行Blast比对分析,挑选获得18条与非生物胁迫相关度较高的小麦WRKY转录因子,并做进一步的研究。⑵将所获得的六倍体小麦WRKY保守结构域序列结合拟南芥的WRKY序列,利用ClastalW进行序列比对,MEGA5.10软件基于邻比法构建无根进化树。分析发现所有WRKY转录因子被分为三个家族,其中家族Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别包含有26、72、25条WRKY基因。WRKY转录因子在小麦的染色体中分布广泛、不均匀。A、D、B染色体组间复制序列较多。⑶对18条抗非生物胁迫相关WRKY转录因子做荧光定量Q-PCR分析研究,研究发现不同小麦WRKY转录因子在根叶中的表达模式具有组织差异性。Traes_1AL_0404BC790、 Traes_3AL_140B829CB、 Traes_7DL_ A9EF00572、Traes_1DL_5BAB0B6BC、Traes_1AL_F64E07A92表达在胁迫条件下上调表达,这表明它们与小麦的非生物胁迫密切相关。⑷ABA和过氧化氢处理下,Traes_7DL_A9EF00572在小麦幼苗的根叶中都上调表达。Traes_7DL_ A9EF00572被命名为TaWRKY146。结果显示TaWRKY146依赖ABA信号转导途径发挥作用。⑸克隆TaWRKY146全长序列,测序发现TaWRKY146具有1个WRKY结构域,C2HC型锌指结构,属于WRKY转录因子家族的第Ⅲ家族。定量分析数据表明TaWRKY146在小麦抗非生物胁迫的响应过程中发挥重要作用。⑹对TaWRKY146转录因子的过表达拟南芥株系进行胁迫试验。结果表明,干旱胁迫下过表达植株的MDA含量显著低于野生型,脯氨酸和可溶性糖含量显著高于野生型,表明TaWRKY146过表达株系拟南芥在干旱条件下通过调节酶活等保护性物质以稳定细胞内环境,降低干旱对植物的伤害。⑺干旱三周后,测量过表达植株与野生型植株的气孔导度、蒸腾速率。数据表明干旱条件下过表达植株能显著通过降低气孔导度,降低蒸腾速率来减少水分散失,以降低干旱对植物的伤害。
[硕士论文] 胡超
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:油菜是我国重要的食用油料作物,其中冬油菜的主要种植区域分布在长江流域,该地区极易发生秋季和春季渍水危害,严重影响油菜产量,研究渍害缓解技术对促进油菜生产具有重要意义。外源植物激素对调控作物生长和抗逆性有明显效果,独脚金内酯是一种新型植物激素,能够有效调节植物地上分枝的以及地下根系的生产与构型,但在油菜研究中的应用还未见报道。本课题研究以中双11号为材料,进行渍水盆栽试验,油菜五叶期进行渍水处理,7天后结束渍水,以0μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L,5μmol/L四种不同的浓度的独脚金内酯(SLs)分别对渍水胁迫组(W)和正常水分组(C)进行灌根处理,研究对油菜生长,光合作用,荧光反应,地上部分叶片叶绿素含量以及抗氧化酶活性的影响。本实验
  主要研究结果如下:
  1.独脚金内酯对于油菜生长形态的影响。在油菜渍水后,随着独脚金内酯处理浓度增大,油菜生物量均有所增加,其中地上部分在独脚金内酯浓度为1μmol/L时,生物量增加最多;而地下部分在独脚金内酯浓度为1μmol/L时,对生物量的增加最为显著。独脚金内酯能提高油菜叶片相对含水量和叶面积,同时独脚金内酯能有效促进根系部分的生长,增加总根长、提高根系总面积、根系平均直径以及根尖数。
  2.独脚金内酯对油菜光合特性和荧光参数的影响。渍水油菜的光合相较于正常条件有显著的下降,但施加独脚金内酯浓度在1μmol/L时,能够有效的提高了地上部叶片的叶绿素含量(包含叶绿素a和叶绿素b)以及类胡萝卜索含量,显著提高了净光合速率(Pn)、增大叶片的气孔导度(Gs)和提高其蒸腾速率(Tr),降低地上部叶片的胞间CO2浓度(Ci);独脚金内酯增加了叶绿体荧光参数中相对电子传递传递效率(rETR)、叶片中PSⅡ最大光能转换效率(Fv/Fm)。与此同时独脚金内酯也提高了PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)、PSⅡ有效光化学量子产量(Fv'/Fm')和PSⅡ实际光能转换效率(ΦPSⅡ);独脚金内酯降低了非光化学淬灭系数(qN)。
  3.独脚金内酯对于油菜抗氧化酶系统的影响。渍水胁迫会使得植物体内产生大量的活性氧,而植物有着自己的抗氧化酶系统。实验结果表明:施加独脚金内酯浓度在1μmol/L时,使得经过渍水处理的油菜地上部叶片内超氧化物歧化酶活性稍微下降,而显著的提高了其叶片中的过氧化氢酶和过氧化物酶的活性;并且提高了地上部叶片渗透调节物质的含量,例如脯氨酸(Proline)和可溶性蛋白(Soluble protein);同时增大了地上部叶片中膜脂过氧化物质的含量,对细胞起到了很好的保护作用。
[硕士论文] 周晓琳
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:泛素蛋白酶体降解系统是植物降解蛋白质的主要方式,泛素活化酶、泛素结合酶、泛素连接酶三种酶共同参与了蛋白质的泛素化过程。泛素连接酶E3能够特异地识别靶蛋白并使其泛素化,而多泛素化的靶蛋白进一步被26S蛋白酶体识别后降解成肽段。在植物生长发育的各个过程中泛素连接酶E3都起着极其重要的作用。
  棉纤维是由棉花的外珠被细胞分化而来,是探究植物细胞发育的良好模型,然而泛素连接酶E3在棉花纤维发育方面的研究较少。本研究通过分析陆地棉各组织表达谱,筛选到一个在纤维快速伸长期优势表达的泛素连接酶基因,并根据拟南芥的同源基因将该基因命名为GhATL68。利用农杆菌介导的遗传转化方法获得相应的转基因棉花,并对GhATL68在棉花纤维发育中的功能进行了探究。具体结果如下:
  1.GhATL68序列分析
  利用NCBI网站的BLASTP功能寻找GhATL68的同源蛋白,表明GhATL68与拟南芥AtATL68、雷蒙德氏棉GrATL67及可可TcATL67较为同源。对GhATL68的保守结构域分析,发现GhATL68含有泛素连接酶E3家族特有的C3H2C3类型的RING结构域。
  2.GhATL68转基因棉花表型鉴定
  获得了GhATL68的超表达棉花和干涉棉花,并进行拷贝数检测和表达量筛选,最终获得了低拷贝、表达量符合要求的超表达系及干涉系各2个。对转基因T2代植株表型进行观察,发现在8DPA时干涉系棉桃发育开始变缓,到10DPA,与对照系相比,其棉桃发育明显迟缓,纤维长度显著短于阴性对照系和野生型,而超表达系棉桃发育及纤维长度都没有明显变化。对成熟纤维进行鉴定,发现干涉系纤维长度明显短于阴性对照系和野生型,而超表达系纤维长度没有明显变化。对纤维的品质进行鉴定发现干涉系纤维的断裂比强度和整齐度都明显低于阴性对照系和野生型,而超表达系的纤维品质没有明显改变。由此可以确定,GhATL68表达量的降低导致棉桃发育迟缓,纤维品质变差;GhATL68表达量的升高对纤维发育无明显影响。
  3.GhATL68影响纤维发育的可能机制
  为了探寻GhATL68影响纤维发育的机制,运用酵母双杂交系统筛选纤维快速伸长期的酵母文库,得到了一个可能与GhATL68互作的蛋白GhSTP7。GhSTP7为糖转运蛋白,对GhSTP7的组织表达模式进行分析发现GhSTP7在纤维伸长期5DPA、10DPA、15DPA优势表达,与GhATL68的优势表达时期一致。对GhATL68进行亚细胞定位分析,发现在细胞核、细胞质以及细胞膜中该基因均发挥功能,而STP类糖转运蛋白定位于细胞膜上,两者表达部位相符。这说明GhATL68可能通过GhSTP7影响细胞中的糖类转运系统进而影响纤维发育。
[硕士论文] 龙霏
生物化学及分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:组蛋白修饰、DNA甲基化、组蛋白变体和核小体排布等表观修饰是调控基因表达的重要方式。固着生长的高等植物,在逆境胁迫下,可以通过自身的逆境应答机制感知环境的变化并且做出相应的应激反应,以利于自身在逆境中的生存。表观修饰因子在调控植物逆境胁迫应答中扮演了非常重要的角色。H2A.Z是组蛋白H2A的一种变体,具有自身独特的分子调控机制和功能,在调控植物开花、环境应答、生长发育、免疫应答、有丝分裂、DNA修复以及温度感应等方面均发挥了重要作用。本课题的主要研究内容是围绕组蛋白变体H2A.Z及相关染色质重塑因子PIE1和INO80在水稻适应非生物逆境胁迫中的功能研究而展开的。所获得的主要结果如下:
  1.表达谱的分析发现OsH2A.Z、OsPIE1、OsINO80、OsARP6均为组成型表达基因,它们的表达量受盐、干旱和胁迫激素(ABA、SA、JA)的影响。说明以上H2A.Z及相关的基因可能参与水稻的胁迫反应。
  2.转基因材料染色质重塑因子的编码基因OsPIE1RNAi、H2A.Z的编码基因OsHTA705RNAi、染色质重塑因子的编码基因OsINO80RNAi均表现出抽穗期比野生型晚2-3周;OsPIE1RNAi同时还表现出穗稀疏,而且植株变矮,茎节长度变短,籽粒变长且不饱满等表型,OsPIE1可能参与种子的发育。
  3.通过苗期NaCl胁迫处理,发现OsPIE1RNAi和OsHTA705RNAi比野生型更耐盐,OsINO80RNAi比野生型对盐更敏感,并且适宜的NaCl浓度可以提高OsPIE1RNAi和OsHTA705RNAi的发芽率。
  4.通过用200mmol/LNaCl处理的12d野生型全苗做ChIP-PCR和RT-qPCR检测比较ChIP-seq数据,结果显示经过NaCl处理后,H2A.Z在盐诱导全基因组上的富集减少,并且盐诱导基因受诱导表达。正常状态下,在OsINO80RNAi中的H2A.Z盐诱导基因的富集高于野生型;在OsPIE1RNAi中的H2A.Z在盐诱导基因上的富集低于野生型。当OsINO80表达量被抑制后,NaCl处理过程中H2A.Z并不能被有效地去除,导致盐诱导基因的表达量弱于野生型;说明正常状态下,H2A.Z在盐诱导基因的富集对该基因的表达起到抑制作用;PIE1和INO80在分配H2A.Z上有不同的功能;高盐下,INO80可能通过影响H2A.Z去除来调控基因表达。
[硕士论文] 姜少芸
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:稻瘟病是一种在世界范围广泛发生的水稻病害。目前,培育和选用抗病品种以及品种合理布局是防治稻瘟病最经济有效的方法。由于稻瘟病菌生理小种繁多且极易发生变异,导致现有抗病品种在推广种植3~5年即会丧失抗性。因此,了解不同区域内稻瘟病菌无毒基因组成、明确适用于当地种植水稻品种所含抗瘟基因类型、筛选抗病品种等对水稻抗瘟品种利用和合理布局具有重要意义。
  为明确24个已知抗瘟基因在湖北省的利用价值,在宜昌和恩施地区自然病圃对24个水稻单基因系进行田间抗瘟性鉴定。综合2014~2016年三年鉴定结果,2015年的发病情况普遍高于2014和2016年。在宜昌地区单基因系品种K8、K10、K17、K18和K25对叶瘟和穗瘟的抗性较好,说明其含有的抗瘟基因Pikh、Piz5、Pish、Pi1、Pikm在宜昌地区具有推广价值,而K8和K18在恩施地区的抗性高,表明抗瘟基因Pikh和Pi1在恩施地区具有较好利用价值,含有这些抗瘟基因的水稻品种可在恩施地区布局种植。
  2014~2016年利用24个水稻单基因系对恩施地区300个稻瘟菌单孢菌株的无毒基因型进行鉴定。结果表明,来自恩施地区的稻瘟菌菌株致病力普遍较强,24个无毒基因在三年中均有出现,出现频率最高的组合数目为2个无毒基因的组合,且组合数目越少,致病力越强。其中Avr-Pikm、Avr-Pikh和Avr-Pi1出现频率最高且稳定,含有对应抗瘟基因Pikm、Pikh和Pi1的水稻品种适合在湖北省恩施地区推广应用。
  采用16个稻瘟菌标准鉴别菌株对60个湖北省主栽水稻品种进行抗瘟基因型推导,发现供试水稻品种只有科优21与Pi19的抗感反应型完全相同,确定其只含有这一个抗瘟基因,另外有35个品种能够确定推导出可能含有的抗性基因;通过对接种结果进行聚类分析,将60份水稻品种划分为12类,同一类水稻品种含有相同的一个或多个抗瘟基因。
  2014~2016年在宜昌和恩施地区稻瘟病常发病圃对湖北省主栽水稻品种的田间抗瘟性进行评价。在宜昌地区鉴定湖北省主推水稻品种314份,对叶瘟和穗瘟都表现抗(R)或中抗(MR)的品种有123个,其中C两优华占、D优202、曾抗一号、川抗993和金科优651等18个品种经过了2~3年鉴定,抗性稳定,是最为理想的抗源材料。在恩施地区鉴定水稻主栽品种143份,对叶瘟和穗瘟都表现高抗(HR)、抗病(R)或中抗(MR)的品种有41个,绵5优142、全丰2155、全优5138等22个品种在恩施病圃经2年以上的田间抗性鉴定,抗性较为稳定,可在恩施地区推广种植。
[硕士论文] 胡刚
遗传学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻是重要的粮食作物,其较小的基因组大小,丰富的遗传多样性等优点使其成为遗传和基因组研究的单子叶模式植物。水稻粒形以及株型等重要农艺性状的遗传解析一直是育种家们研究的重点内容,定位更多的与粒形、株型相关联的QTLs,挖掘其优良等位基因型,为分子设计育种提供技术指导服务。传统的双亲本群体已经广泛应用于QTL定位,但受其遗传组成狭窄、重组发生有限、作图分辨率不高等影响,很难满足当前的需求。MAGIC群体作为新一代作图群体,凭借其丰富的遗传组成、较小的群体结构以及可以直接或间接的应用于育种进程等优点,开始新兴于各种植物研究中。本研究基于一个包含248个株系的四亲本水稻多亲本高世代回交MAGIC群体的低丰度的全基因组重测序,获取了1231431个高质量的SNP,对该群体进行了遗传多样性分析、主成分分析以及连锁不平衡分析(LD),并结合表型数据对粒形、株型进行了全基因组关联分析(GWAS)。同时,利用本实验室韩忠民博士基于SNP数据构建的高密度的binmap对粒形以及株型数据进行bin水平的关联分析,并进行了两种关联分析方法的比较。在bin水平基础上进行了等位基因间的多重比较,确定优良等位基因型。主要研究结果如下:
  1.利用Hiseq-3000对群体家系进行了平均深度为2X的测序,对四个亲本材料进行了平均测序深度为10X的测序。利用bwa、samtools、vcftools等生物学工具共获取1231431个高质量的SNP,并用Mendel_Impute软件基于家系亲缘关系进行了数据的补缺工作,获取完整的群体基因型。
  2.对群体进行了系统发生树分析,表明群体存在较低的群体结构。PCA分析结果显示前10个成分仅解释25%的样本方差,群体没有出现分层现象,即群体内不存在明显的群体结构。并比较了双亲本和本试验四亲本MAGIC群体的LD衰减图,结果得出:四亲本MAGIC群体LD衰减速度明显低于双亲本材料。
  3.利用粒形数据,我们分别采用SNP水平以及bin水平对两年三个重复的粒长、粒宽数据进行关联分析。粒长表型中,两种方法分别检测到5个和4个QTLs,其中已克隆基因GS3以及GL3.2在两种方法三个重复中均检测到。bin水平关联分析将GS3限定在10kb的bin内,该bin内仅含有一个基因,即GS3。SNP水平单独关联到了已知基因GL7,bin水平并没有显著检测到。SNP水平三个重复均检测到两个新的SNP位点chr03_19636931和chr03_22449318,均位于3号染色体上。bin水平也检测到两个新的QTLs,一个是位于2号染色体上的B2_275,另外一个是位于8号染色体的B8_350,在该区间内没有报道的粒长基因。粒宽表型中,两种方法分别检测到7个和6个QTLs,其中GW5以及GL7被两种方法均检测到。其中GW5被限定在大小为10kb的bin区间内,在SNP水平也是将GW5锁定在单基因水平。SNP水平上新关联的5个QTLs均只在单个重复中检测得到,bin水平共关联到4个新的位点,至少在两个重复中检测到。有趣的是SNP水平关联到的新的位点chr10_10645936和bin水平关联到的B1093相距很近,我们认为是一个新的QTL位点。
  4.利用株型中的株高、分蘖角以及剑叶叶夹角数据,同时采用SNP水平和bin水平进行相对应的关联分析。株高表型中,SNP水平关联到4个QTLs,对应的bin水平也关联到4个QTLs。其中TAD1两种方法均有检测到,SNP水平还关联到已知QTL Psd1。SNP水平关联到的新的SNP位点chr07_24813588与bin水平关联到的B7_247共定位,该区间大小为230kb。对应的在分蘖角表型中两种方法分别检测到2个和3个QTLs,均为已克隆QTL/基因,其中ONAC106以及TAC1为两种方法所共有,bin水平额外还检测到ta9。剑叶叶夹角表型在两种方法分别检测到9个和2个QTLs,新的SNP位点chr07_21605018与bin所检测到的B7_210距离较近,该区间可能含有控制剑叶叶夹角的基因。
  5.我们利用本室构建的bin map,在bin水平对已知QTL GS3、GW5、TAC1、ONAC106和新的候选区间B10_93、B7_247进行多重比较。确定优良等位基因型以及亲本来源,为分子标记辅助选择育种提供技术指导。
[硕士论文] 杨姗
作物学;作物栽培学与耕作学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:玉米是我国主要粮食作物,其保障粮食安全的地位毋庸置疑。由于不合理灌溉的影响,加之施肥及环境恶化等因素的干扰,耕地盐碱化给农业生产造成的损失仅次于干旱,并成为当前影响玉米生产的主要因素之一。玉米是中度感盐植物,尤其在幼苗生长时期受伤害表现最为明显。其耐盐碱性是一个受微效多基因控制的数量性状,仅利用常规育种技术改良品种有很大难度。随着分子生物学的快速发展,各类作物遗传连锁图谱的构建及相关的分子遗传学研究为改良作物耐盐碱性提供了新的机遇。结合精准表型鉴定的QTL定位及功能标记的开发可以更准确地检测和跟踪优势等位基因,极大地推动标记辅助选择在育种实践中的作用,加快育种实践的效率。本研究以(郑58×昌7-2)F2为构图群体,以SSR标记构建遗传连锁图谱。通过发芽率、相对电导率、脯氨酸含量、单株重量及苗情等5个性状对F2∶3群体及其双亲进行苗期耐盐碱性评价。使用Windows QTL Cartographer V2.5软件,采用复合区间作图法(CIM)对五个性状进行QTL定位。最后,基于本实验室耐盐QTL定位结果,结合20份自交系的耐盐性表型鉴定结果,筛选出用于鉴定的有效标记。
  本研究主要内容包括:⑴以郑58/昌7-2构建的142个玉米F2∶3家系为试材,分别用200 mmol/L NaCl溶液和100 mmol/L Na2CO3溶液进行胁迫处理,测定发芽率、相对电导率、pro含量、单株重量和苗情5个性状,并进行性状间相关性分析。结果表明:盐处理条件下,耐盐率除与发芽率不相关外,与其他性状均呈极显著相关,耐盐率与相对电导率及pro含量呈正相关,与单株重量呈负相关,pro含量与相对电导率呈显著正相关;碱处理条件下,除相对电导率与其它性状不相关外,其它性状两两相关。⑵分析F2群体142个株系的276个SSR位点的差异性,采用JoinMap4.0构建了一张拟合233个SSR位点,覆盖玉米全基因组10个连锁群的SSR标记遗传图谱,遗传图谱全长共4507.798 cM,标记间平均间距19.35 cM。⑶采用复合区间作图法在盐胁迫条件下共定位到9个QTL,其中与发芽率相关3个、与相对电导率相关1个、与Pro含量相关3个、与耐盐率相关1个;碱胁迫条件下共定位到9个QTL,其中与发芽率相关2个、与相对电导率相关1个、与单株重量相关4个、与Pro含量相关1个、与耐碱率相关1个。⑷通过主成分分析法(PAC)对69份玉米自交系进行耐盐性分析,并从中选取耐盐和盐敏感材料各10份。基于本研究耐盐QTL定位结果,选用已构建连锁图谱中第五条染色体上的全部引物作为筛选标记,结合20份耐盐性已知的玉米自交系,通过对24个SSR位点各等位变异耐盐等级的方差分析,检测到4个用于耐盐筛选的有效SSR标记(umc1416、umc1349、umc2295和umc1686)。
[硕士论文] 梁冬
作物学;作物遗传育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:大豆异黄酮是主要存在于大豆中的一种酚类次生代谢产物,因其对人类和植物具有重要的生理功能而备受关注。大豆异黄酮的代谢途径是苯丙氨酸代谢途径的一个分支,而在苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸解氨酶PAL(phenylalanine ammonia-lyase)是一个关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)基因是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验通过基因工程技术手段克隆大豆中PAL2-3基因;构建植物过表达载体pCAMBIA3301-GmPAL2-3;根据RNAi干扰技术原理构建RNAi干扰植物表达载体pFGC5941-GmPAL2-3;将将构建好的重组载体质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法获得转基因植株,对获得的阳性转基因植株进行PAL2-3基因相对表达量分析;并对转基因植株成熟大豆籽粒进行异黄酮含量测定;分析PAL2-3基因表达量对大豆异黄酮含量的影响,来研究PAL2-3基因的功能。
  本研究主要内容包括:⑴成功构建了植物过表达载体pCAMB IA3301-GmPAl2-3和植物RNAi干扰载体pFGC5941-GmPAL2-3,并且成功的转化到了根癌农杆菌EHA105中。⑵本试验获得6株不同株系的过表达转基因大豆植株和4株不同株系的RNAi干扰转基因大豆植株。⑶在过表达植株中PAL2-3基因的表达量均高于对照植株的表达量,是对照植株表达量的5.11~11.24倍;RNAi干扰植株中PAL2-3基因的表达量均低于对照植株的表达量,是对照植株表达量的0.16~0.29倍。⑷在过表达植株成熟大豆籽粒中总异黄酮含量(2587.63μg/g)是对照植株成熟大豆籽粒中总异黄酮含量(1616.90μg/g)的1.6倍;RNAi干扰植株成熟大豆籽粒中总异黄酮含量(349.40μg/g)是对照的0.22倍。
[硕士论文] 吕旭才
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:干旱和盐胁迫是影响植物生长发育的两大因素,严重制约了农业的发展。目前,由于转基因技术的不断发展,利用转基因技术开发抗盐抗旱作物的新品种成为了各国的研究重点。油菜是我国的重要经济作物,也是受到干旱和盐胁迫影响比较严重的粮食品种,所以利用转基因技术提高油菜的抗盐抗旱性也是研究的热点之一。
  WHY是耐辐射异常球菌(Deinococcus Radiodurans,DR)中DR1372蛋白存在的一种非特异性结合位点的核心结构域。大量的研究表明Why结构域基因是一个与水分胁迫相关的基因,由此推断Why转入植物可能会提高植物应对水分胁迫的能力,降低盐胁迫和干旱对植物的伤害。
  本研究利用基因工程手段构建GV3103-Why和EHA105-Why植物表达载体,将Why结构域基因转入到拟南芥和油菜中,得到转基因的油菜和拟南芥,并研究了在盐胁迫和干旱条件下转基因拟南芥植株的生理生化变化。研究Why对植株应对干旱和盐胁迫的能力的影响,为Why应用于植株的育种工作提供理论基础。
  研究结果表明:在中度的盐胁迫和干旱胁迫条件下,转基因拟南芥的种子的相对萌发率和幼苗相对根长要明显的大于野生型拟南芥,随着胁迫时间的增长,转基因拟南芥叶片的丙二醛含量和相对电导率明显低于野生型,而脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白以及叶绿素含量明显高于野生型,相对含水量同样明显高于野生型,最为重要的是转基因拟南芥的抗氧化酶活性明显高于野生型拟南芥。说明在盐胁迫和干旱胁迫的条件下,转基因拟南芥具有比野生型更强的抗盐性和抗旱性;以上结果表明,通过转基因手段将Why转入拟南芥后,Why提高了拟南芥抵抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。
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