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[硕士论文] 缪欣
病理学与病理生理学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:miR-16是具有肿瘤抑制功能的miRNA之一,在慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中表达下调。为研究miR-16对机体抗肿瘤免疫功能的影响,课题组前期从美国Jackson实验室引进miR-15a/16-/-基因敲除小鼠,对其免疫细胞表型分析发现,生理状态下miR-15a/16-/-小鼠脾脏中巨噬细胞的功能无明显变化,而在H22肝癌细胞荷瘤状态下miR-15a/16-/-小鼠体内巨噬细胞频率显著减少,活性发生改变。本研究进一步对miR-15a/16-/-小鼠CD8+T细胞的表型及功能进行了测定,并以DSS诱导的小鼠肠炎模型评价该小鼠体内CD8+T细胞的功能。
  研究内容分为3个部分:
  1.miR-15a/16-/-小鼠CD8+T细胞的活性分析
  目的:明确miR-15a/16-/-小鼠CD8+T细胞的功能是否发生变化。
  方法:分离miR-15a/16-/-小鼠与C57BL/6小鼠脾脏并制备脾脏单细胞悬液,通过流式细胞术分别检测CD8+NKG2D+、CD8+CD44+、CD8+CD44+CD62L-、CD8+CD25+CD69+细胞的频率。以PMA/Ionomycin刺激小鼠CD8+T细胞后,胞内染色法检测CD8+T细胞IFN-γ的产生能力。同时,CD8+T细胞与MC-38细胞共孵育后以CD107a标记法检测CD8+T细胞的脱颗粒活性。
  结果:与对照组C57BL/6小鼠相比,miR-15a/16-/-小鼠脾脏来源的CD8+CD25+CD69+、CD8+CD44+、CD8+NKG2D+、CD8+CD44+CD62L-T细胞的频率显著增高,且该小鼠脾脏来源的CD8+T细胞脱颗粒活性增强。
  结论:miR-15a/16基因敲除上调小鼠脾脏CD8+T细胞的频率,并增强其生物学活性。
  2.miR-15a/16-/-小鼠CD8+T细胞对DSS-肠炎发病的影响
  目的:明确miR-15a/16-/-小鼠体内CD8+T细胞活性的增强是否参与DSS-肠炎小鼠的发病。
  方法:以2.5%DSS喂养miR-15a/16-/-小鼠和对照C57BL/6小鼠,诱导其肠炎的发生,观察并记录小鼠的体重、腹泻、便血等情况,计算小鼠肠炎的疾病活性指数(DAI)。通过流式细胞术检测miR-15a/16-/-小鼠和对照C57BL/6小鼠脾脏和肠道中CD8+NKG2D+T细胞的频率。记录小鼠肠道组织的炎症发生情况,并制备小鼠肠道组织切片,利用H&E染色法,观察小鼠肠道组织的病理学变化。利用免疫组织化学等方法检测小鼠肠道组织内CD8+T细胞的浸润情况。
  结果:与对照组C57BL/6小鼠相比,miR-15a/16-/-小鼠经2.5%DSS喂养后体重及体重指数显著下降。且miR-15a/16-/-小鼠疾病活性指数(DAI)显著高于对照小鼠,表现为便血情况的加剧和小鼠肠道的显著缩短等。同时,miR-15a/16-/-肠炎小鼠肠道组织中CD8+T细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润量显著高于对照小鼠,其中CD8+T细胞高表达NKG2D分子。此外,miR-15a/16-/-肠炎小鼠脾脏中CD8+NKG2D+T、CD8+IFN-γ+细胞的频率也显著高于对照小鼠。
  结论:miR-15a/16基因敲除加剧DSS诱导的小鼠肠炎发病,miR-15a/16-/-肠炎小鼠肠道组织中有大量CD8+T细胞的浸润,且高表达活化型分子NKG2D。
  3.miR-16对小鼠CD8+T细胞生物学活性发挥的影响
  目的:初步探讨小鼠CD8+T细胞活性变化是否由miR-16调控。
  方法:制备C57BL/6小鼠脾脏单细胞悬液,磁珠分选脾脏CD8+T细胞,经pre-miR-16或anti-miR-16慢病毒感染72小时后,以流式细胞术检测其表面分子NKG2D的表达情况。并以PMA/Ionomycin刺激后,检测CD8+T细胞IFN-γ的产生情况。
  结果:使用pre-miR-16慢病毒体外感染C57BL/6小鼠脾脏CD8+T细胞后,GFP+CD8+T细胞表面NKG2D分子表达下调,而anti-miR-16慢病毒感染后,GFP+CD8+T细胞表面NKG2D分子表达上调。与空白对照组相比,过表达miR-16后,GFP+CD8+T细胞IFN-γ分泌功能减弱,而敲低miR-16后,GFP+CD8+T细胞IFN-γ分泌功能显著增强。
  结论:miR-16可能通过调控NKG2D的表达影响CD8+T细胞的功能。
[硕士论文] 吴青青
数学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:传染病动力学是生物数学的一个重要分支.本文中我们针对霍乱的传播,研究了其微分方程模型,系统地分析了这些模型的阈值动力学性质,得到病毒传播的全局渐近性态.本文具体内容如下:
  第一章主要介绍了霍乱传播的数学模型,及与之有关的背景知识、研究现状,并简要概述了本文的主要工作.
  第二章我们研究了一类描述霍乱传播规律的常微分模型,主要讨论稳态解的存在性、唯一性和渐近性.首先,我们用下一代矩阵法得到模型的基本再生数R0.接着利用线性化结合谱分析的方法得到结论:R0<1时无病平衡点局部渐近稳定;R0>1时无病平衡点不稳定,系统存在唯一染病平衡点且局部渐近稳定.最后,分别通过构造Lyapunov泛函和上下解迭代的方法得到无病平衡点和染病平衡点的全局渐近稳定性.
  第三章中,我们考虑了细菌和感染者的扩散,研究了具第三边界条件的非线性抛物问题.我们首先利用特征值问题给出了系统的基本再生数RR0;接着,利用构造上解和比较原理得出无病平衡点是全局渐近稳定的;最后,通过上下解的方法讨论了染病平衡点的存在性和稳定性.
  为了考察具变系数的反应扩散问题,我们在第四章中进一步考虑了非均质空间中的反应扩散方程.首先给出了系统的基本再生数RD0.然后借助特征方程,利用反证法得到染病平衡点的局部渐近性质.再运用比较原理结合构造上解的方法得出无病平衡点的全局渐近稳定性.接着通过上下解和迭代的方法得到染病平衡点的存在性和稳定性.最后考察了细菌扩散、感染者不扩散的特殊情形下疾病持续或趋于稳定状态的条件.
  第五章我们使用Matlab软件对上述问题进行了数值模拟,利用所绘制的图形验证所得到的理论结果.
  最后,第六章对本文的主要内容进行简单总结,结合本文的研究结果对今后的研究工作做进一步的思考.
[硕士论文] 王超
流行病与卫生统计学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  1.通过对2012~2015年江苏省人源、食品源以及动物源肠炎沙门氏菌的耐药情况测试,耐药谱分析,研究肠炎沙门氏菌的耐药特点。为指导临床医生合理选择使用抗生素,同时为有效预防沙门氏菌感染以及控制疾病流行提供科学参考。
  2.根据肠炎沙门氏菌β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类、磺胺类/甲氧苄胺类、四环素类以及喹诺酮/氟喹诺酮类耐药表型以及相关耐药基因检测结果,了解耐药基因在肠炎沙门氏菌中的分布情况以及耐药表型和基因型之间的关系,分析探索多重耐药性肠炎沙门氏菌产生的原因。
  3.利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对肠炎沙门氏菌进行分子分型及溯源分析,比较不同来源肠炎沙门氏菌同源性,确定江苏省肠炎沙门氏菌主要分子型别以及分子型别与耐药表型及基因型间关系,为监测肠炎沙门氏菌流行及疾病暴发溯源提供参考。
  研究方法:
  1.参照GB4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中方法,对2012~2015年江苏省地区动物源(鸡、猪专项)基线调查专项、食源性疾病哨点监测腹泻病人及食品行业从业人员健康体检共93株肠炎沙门氏菌分离株进行血清型鉴定;参照美国临床实验室标准化研究所CLSI标准推荐的Kirby-Bauer(K-B)纸片法对肠炎沙门氏菌进行β-内酰胺类(氨苄西林、阿莫西林/克拉维素、头孢西丁、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢吡肟)、氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星)、喹诺酮类(萘啶酸、环丙沙星)、磺胺类(磺胺甲恶唑)、氯霉素类(氯霉素)、四环素类(四环素),共计16种抗生素敏感性试验。
  2.通过PCR方法检测肠炎沙门氏菌分离株β-内酰胺类(blaTEM-1-like、blaCTX-M、blaOXA-1-like、blaCMY-2、blaPSE-1、blaSHV)、氨基糖苷类(aadA1-like、aadA2、aadB、aacC4、aac(6')-1b、氯霉素类(catA1、cmlA1、floR)、甲氧苄胺类(dfrA1-like、dfrA12、dfrA17)、磺胺类(sul1、sul2、sul3)、四环素类(tet(A)、tet(G)、tet(B)、tet(C))以及喹诺酮/氟喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD)共29种耐药基因携带情况。
  3.参照国际PulseNet沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分子分型标准操作方案,对所有受试肠炎沙门氏菌进行分子分型。选择限制性内切酶XbaⅠ消化菌株基因组,经脉冲场凝胶电泳后,使用凝胶成像系统获取电泳图像,通过国家致病菌识别网软件对图像条带进行处理、分析。
  研究结果:
  1.耐药表型结果:肠炎沙门氏菌对萘啶酸、氨苄西林、链霉素以及头孢哌酮耐药率较高,其耐药率分别为93.55%(87/93)、74.19%(69/93)、65.59%(61/93)和51.61%(48/93)。93株肠炎沙门氏菌对16种抗生素共形成22种耐药谱,菌株主要表现对4~5种抗生素耐药;部分菌株形成固定耐药谱型:AMP-CFP-STR-NA-TE(21/93)、AMP-STR-NA-TE(15/93)、AMP-CFP-STR-NA(10/93),对3类及3类以上药物耐药即MDR多重耐药菌株比例为75.27%(70/93)。
  2.耐药基因PCR检测结果:sul2和sul3基因携带率最高,超过80%,其次为blaTEM-1-like、tet(A)、tet(G)、blaCTX-M和aac(6')-1b基因,检出率分别为7527%、40.86%、35.48%、12.90%和9.8%。sul1基因与磺胺类耐药表型符合率为93.55%,blaTEM-1-like基因与青霉素类耐药表型符合率为91.40%,tet(A)、tet(G)与四环素耐药表型符合率为66.67%。
  3.PFGE分型结果:PFGE聚类分析可分为A和B两个大聚类,共形成PFGE-XbaⅠ28个型别。B19和B23为主要PFGE型别,来源于不同地区,且多数菌株来源于动物源(鸡源)。B19型别菌株耐药表型主要为AMP-CFP-STR-NA-TE,携带的耐药基因主要为blaTEM-1-like、sul2、sul3以及tet(A);B23型别菌株耐药表型主要为AMP-CFP-NA-TE,携带的耐药基因主要为blaTEM-1-like、sul2、sul3、tet(A)和tet(G)。
  研究结论:
  1.肠炎沙门氏菌普遍对萘啶酸、氨苄西林及链霉素等抗生素耐药,且多重耐药性情况严重,菌株主要以耐4类抗生素为主,最多可对10种抗生素耐药,部分菌株形成固定型别耐药谱型:AMP-CFP-STR-NA-TE、AMP-STR-NA-TE、AMP-CFP-STR-NA。
  2.耐药基因sul2、sul3、blaTEM-like、tet(A)、tet(G)在肠炎沙门氏菌中携带率较高。耐药基因与耐药表性之间存在一定的关联性;携带全部或部分耐药基因簇blaTEM-1-like/blaCTX-M-tet(A)/tet(G)-sul1-aac(6')-Ib是导致肠炎沙门氏菌多重耐药性主要原因。
  3.PFGE结果显示肠炎沙门氏菌分化程度不高,优势PFGE型别为B19、B23,其所包含的菌株耐药表型、基因型存在明显相似性。溯源结果表明不同来源(人源、食品源以及动物源)以及不同地区肠炎沙门氏菌可形成相同PFGE带型,表明同一菌株克隆肠炎沙门氏菌,可在不同宿主及不同地区之间流行传播。
[硕士论文] 郑鑫
儿科学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过对患有抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎儿童的临床症状、实验室检查、治疗及随访转归的回顾性分析,总结其临床特点,尽早明确诊断,及时治疗,预后较好。
  方法:
  选取2012年9月-2017年12月期间于我院住院确诊为抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎的患儿4例为研究对象,回顾性分析其临床资料,包括发病过程、脑脊液(CSF)、脑电图(EEG)、磁共振(MRI)、治疗及转归等,探讨该病临床特点,治疗方法。
  结果:
  1、回顾分析的4例病例中,3例患儿为男性(平均年龄7岁),1例患儿为女性(年龄5岁);均无发现肿瘤,倾向感染诱发可能性大。
  2、临床症状主要表现为精神症状(4例,100%),运动障碍(3例,75%),抽搐(2例,50%),睡眠障碍(2例,50%),自主神经功能障碍(2例,50%),语言障碍(1例,25%)。
  3、实验室检查方面,脑脊液白细胞数升高(4例,100%),脑脊液寡克隆蛋白检测阳性(3例,75%),血液抗NMDAR抗体阳性(3例,75%),脑脊液抗NMDAR抗体均阳性(4例,100%),支原体抗体阳性(2例,50%)。
  4、辅助检查可见脑电图呈弥漫性慢波(3例,75%),随着病情痊愈,复查脑电图也均恢复正常;MRI检查阴性(3例,75%)。
  5、治疗上其中3例经糖皮质激素和免疫球蛋白免疫治疗后痊愈(3例,75%),另外1例因症状有缓解,拒绝返院进一步免疫治疗。
  结论:
  儿童抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎的常见临床表现包括精神行为异常、运动障碍、癫痫、睡眠障碍、语言障碍、自主神经功能障碍等,脑脊液检测抗NMDAR抗体是诊断ANE的特异性实验室指标,血液检测抗NMDAR抗体特异性稍弱,及时进行相关免疫治疗尤为关键,预后一般较好。
[硕士论文] 张月涛
中医内科学 黑龙江中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过对谢晶日教授治疗慢性乙型肝炎中药处方进行统计学处理,以探究谢晶日治疗本病的用药规律。
  方法:
  收集2013年1月至2017年12月期间就诊于谢晶日教授肝脾胃门诊的慢性乙型肝炎患者的门诊处方。根据纳入与排除标准,筛选符合本课题研究的首诊方药176个。将方剂中的中药规范化,再运用WPS Excel2016建立数据库并进行统计整理,得出常用药并对其进行功效、四气、五味、归经的频数与频率的统计;通过IBM SPSS19.0软件的聚类分析方法,得出相关性较高的中药组合。结合临床实际,总结治疗慢性乙型肝炎的对药及常用药物组合。根据统计结果,探讨谢晶日教授治疗慢性乙型肝炎的临床用药规律。
  结果:
  统计分析得到治疗本病的148味中药,总使用频数是3309次。总药物中计有43味中药使用频数高于20次,为谢师治疗本病的常用药,占总使用频率的84.59%,其中柴胡、白术、黄芪、佛手、薏苡仁、紫苏子、连翘、板蓝根、砂仁、苍术、太子参、金钱草的使用频次超过70次,占总使用频率的41.50%。常用药物构成中以补虚药频率最高,达17.44%,位居其后的分别是利水渗湿药(15.45%)、理气药(13.29%)、化湿药(11.62%)。性味归经的分布情况中四气:温性(含微温)占(49.87%),寒性(含微寒)占(25.43%),平性占(14.90%);五味中前三位:苦味(29.23%),甘味(27.72%),辛味(25.98%);归经前四位依次为脾经(26.69%),肺经(18.02%),胃经(16.77%),肝经(12.94%)。结合临床共8对常用药对和4组常用药物组合。
  结论:
  1.谢晶日教授治疗慢性乙型肝炎的核心药物主要有:柴胡、白术、黄芪、佛手、薏苡仁、紫苏子、连翘、板蓝根、砂仁、苍术、太子参、金钱草。
  2.补虚药、利湿药、理气药、化湿药为谢晶日教授治疗慢性乙型肝炎的常用药类。
  3.温性、平性、寒性;苦味、甘味;脾经、肺经、胃经、肝经是谢晶日教授临证治疗慢性乙型肝炎的主要范畴。
  4.肝脾同调,以平为期是谢晶日治疗慢性乙型肝炎的基本准则;健脾扶正,理气祛湿是谢晶日教授治疗慢性乙型肝炎的基本方法。
[硕士论文] 林繁海
呼吸内科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:提高气管-支气管-肺受累的马尔尼菲蓝状菌病的认识。
  方法:回顾性分析广西医科大学第一附属医院2013年1月1日至2018年1月1日收治的11例马尔尼菲蓝状菌病累及气管-支气管-肺患者的临床资料。
  结果:本组男6例,女5例,平均年龄52.7岁(31-67岁),人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性1例,HIV阴性10例。误诊肺结核5例(45.5%),误诊感染性发热1例(9.1%)。临床表现依次为咳嗽(100%)、咳痰(100%)、胸腔积液(100%)、淋巴结肿大(100%)、发热(81.1%)、体重减轻(81.1%)、贫血(81.1%)、气促(45.5%)、胸痛(36.4%)、骨破坏(36.4%)、皮疹(27.3%)、咯血(9.1%)。白细胞总数、中性粒细胞与淋巴细胞计数中位数分别为12.88×109/L、8.8×109/L、2.03×109/L。所有患者血清白蛋白降低、血沉升高,肝功能异常3例,肾功能异常1例。1例HIV阳性者CD4+T细胞4个/μL,9例HIV阴性患者CD4+T细胞中位数744个/μL(65-1202个/μL),其中2例降低。支气管肺泡灌洗液GM试验阳性60%(3/5),血清GM试验阳性50.0%(5/10)。所有病例胸部影像学异常,包括斑片状阴影、肿块、空洞、胸腔积液、肺门纵膈淋巴结肿大等。气管镜下表现为肿块、息肉/结节、隆起,伴有粘膜水肿、肥厚,管腔狭窄或闭塞,可见脓性分泌物。TM检出部位依次:支气管灌洗液培养(BALF)9/9(100%),支气管粘膜培养2/2(100%),淋巴结活检1/1(100%),皮肤培养2/3(66.7%),支气管粘膜活检4/8(50%),痰培养1/9(11.1%),外周血培养1/10(10%),骨髓培养及活检(2例)未检出TM,皮肤活检(2例)未检出TM。病理特征主要为肉芽肿性炎、化脓性炎症。所有患者均抗真菌治疗,初始治疗:4例单用两性霉素B,2例单用伏立康唑,1例两性霉素B联合伏立康唑,1例两性霉素B联合伊曲康唑;3例单用氟康唑,效果不佳,分别改用伏立康唑和两性霉素B。维持治疗:8例伊曲康唑200mg每天2次,2例伏立康唑200mg每天2次。3例全身抗真菌治疗同时联合两性霉素B雾化吸入。1例高效抗逆转录病毒治疗,1例抗肿瘤治疗。10例好转出院,1例死亡。
  结论:1、气管-支气管-肺马尔尼菲蓝状菌病临床表现、影像学及支气管镜大体改变缺乏特异性。2、气管-支气管-肺马尔尼菲蓝状菌病可能以淋巴内皮系统为主要播散途径,累及局部引流区域淋巴结,外周血培养阳性率低,局部临床标本有较高的TM检出率。3、支气管镜检查是必不可少的检查手段,支气管灌洗液、支气管粘膜真菌学及病理学是可靠的确诊方法,GM试验检查有利于鉴别。4、气管-支气管-肺TSM抗真菌治疗包括全身治疗及雾化吸入,及时诊断和有效治疗的患者,预后较好。
[硕士论文] 吴晓君
预防兽医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,不仅能引起多种畜禽疾病(鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒、猪副伤寒等),给养殖业造成严重经济损失,而且能够通过污染食物引起人类食物中毒,对人类健康造成严重威胁。目前,主要采用抗生素来预防和治疗沙门菌病,但由于抗生素的滥用和药物残留问题,严重影响养殖业的健康发展和公共卫生安全。因此,采用疫苗接种的方法来预防沙门菌感染显得尤为重要。但是,灭活苗需要经皮下多次接种,使用不方便,且不能诱导产生消化道局部保护力和细胞免疫,无法提供有效的保护效果。而弱毒活疫苗能够模拟自然感染状况,可以诱导细胞、体液和黏膜免疫,免疫力坚实,免疫期长。因此,利用基因工程技术构建基因缺失株,用作新型减毒活疫苗的研究备受关注。
  本研究调查了华东地区沙门菌流行情况,结果表明华东地区养殖场中沙门菌分布广泛,耐药性十分严重。然后,筛选合适的菌株,构建鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS,对其安全性及免疫效果进行评价,研制沙门菌基因缺失弱毒疫苗,为沙门菌病的防控提供参考。
  1.华东地区沙门菌的流行病学调查
  为了解华东地区沙门菌的分子流行情况,分别在上海、江苏、安徽、浙江等地养殖场采集样品285份,采用选择性培养基和PCR方法分离鉴定沙门菌,然后利用PCR方法检测沙门菌临床分离株的血清型及毒力因子,采用药敏纸片法检测其耐药性,并选取其中分离的7株临床株进行半数致死量(LD50)测定。结果共分离鉴定得到48株沙门菌,分离率为16.84%。血清学结果显示所检测的48株沙门菌中鼠伤寒沙门菌占64.58%;肠炎沙门菌占8.33%;其他血清型占27.09%。毒力基因检测发现除了sopE基因分布率为25%外,其它15个毒力基因分布率可达97%以上。LD50结果显示,7株临床分离的沙门菌LD50分别为1.26×104 CFU、1.26×104 CFU、5.01×104 CFU、5.01×104 CFU、5.01×104 CFU、1.26×105CFU、2.00×105 CFU,证明沙门菌分离株对小鼠具有较强毒力。药敏试验结果显示沙门菌分离株对常见抗生素具有不同的耐药性,其中对红霉素、阿奇霉素、克林霉素、新霉素、大观霉素、四环素、利福平、复方新诺明等抗生素的耐药率均超过50%以上。结果表明,鼠伤寒沙门菌在华东地区养殖场广泛流行,沙门菌分离株含有多个毒力基因,且存在多重耐药性菌株。
  2.鼠伤寒沙门菌aroA基因缺失株和aroA、luxS双基因缺失株的构建及生物学特性分析
  本研究通过Red同源重组技术,构建了SAT52的aroA基因缺失株SAT52ΔaroA和aroA、luxS双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS,并对其生长曲线、运动性、生物被膜、HeLa细胞的黏附入侵能力等生物学特性进行研究。生长曲线结果显示,在对数生长期,基因缺失株SAT52ΔaroA和SAT52ΔaroA-luxS与野生株SAT52相比生长较慢,但差异不显著;其他时期SAT52、SAT52ΔaroA与SAT52ΔaroA-luxS的生长速度基本一致。生物被膜结果显示,基因缺失株SAT52ΔaroA和SAT52Δaro A-luxS的生物被膜形成能力均显著低于野生株SAT52。运动性结果显示,与野生株SAT52相比,基因缺失株SAT52ΔaroA的运动性无明显变化,但基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS的运动能力显著下降。细胞黏附入侵试验显示,与野生株SAT52相比,基因缺失株SAT52ΔaroA的入侵能力无明显区别,而黏附能力有所增强;基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS的黏附能力无明显区别,而入侵能力有所增强。LD50结果表明,SAT52、SAT52ΔaroA和SAT52ΔaroA-luxS的LD50分别为3.16×104 CFU、1.78×107CFU和4.22×107 CFU。双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS与野生株相比,其毒力降低了约1400倍,与单基因缺失株相比毒力降低2.4倍,表明缺失aroA、luxS基因可以显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。
  3.鼠伤寒沙门菌基因缺失弱毒疫苗株的安全性及免疫效果评价
  为了评价鼠伤寒沙门菌基因缺失株的安全性及免疫效果,本研究以6周BALB/c清洁级小鼠作为实验动物进行评价。免疫鼠伤寒沙门菌基因缺失弱毒疫苗后,以野生株SAT52攻毒,分析免疫保护率并确定最佳免疫剂量和保护持续期。然后,免疫鼠伤寒沙门菌基因缺失弱毒疫苗,不同时间点取小鼠脾脏,测定疫苗在体内的定殖清除情况。同时还进行动物体内传代试验,分析弱毒疫苗株是否返强以评价其安全性。结果显示,双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS免疫后有很好的免疫效果,可以刺激机体产生高水平的抗体,且免疫后6周、8周效价均能保持在一个很高的抗体水平。双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS以免疫剂量为1×106CFU/只免疫小鼠,其免疫保护期可达7周,因此最佳免疫剂量定为1×106CFU。在安全性方面,体内定殖清除结果显示,SAT52Δaro A-luxS在脾内定植能力显著低于SAT52ΔaroA,免疫10天后即可完全清除。体内传代试验结果表明基因缺失疫苗株SAT52ΔaroA-luxS不易返强,安全可靠。因此,本研究构建的双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS具有优异的免疫保护效果且安全有效,可以用于防控鼠伤寒沙门菌的感染。
[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[硕士论文] 姚璐
呼吸内科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨M.arundinis引起播散性暗色丝孢霉病(PHM)的临床特点及诊治过程,从而提高对暗色丝孢霉病诊治的认识。
  方法:回顾性分析广西医科大学第一附属医院2017年10月18日诊治的1例由M.arundinis引起的肺、支气管、淋巴结、骨破坏的播散性暗色丝孢霉病感染患者的临床资料,并检索中国知网、Pubmed等数据库,对相关文献进行系统性分析,归纳其临床特点。
  结果:1.本例资料:①一般资料:男性患者,56岁,五金店零工;②临床表现:咳嗽、咳痰、胸痛、双下肢疼痛;查体:颈部触及多枚肿大淋巴,较大约1.5cm×1cm大小,质韧、有压痛,活动度可。双侧腋窝、腹股沟可触及多发肿大淋巴结,较大约1cm×0.5cm,质韧,活动度可,两下肺可闻及少量湿性啰音。③影像学检查:两肺上叶、右肺中叶、下叶可见团片状、密度增高结节影。④肺功能未见异常。⑤经皮肺穿刺病理:镜下可见肺泡组织,轻度慢性炎,纤维组织轻度增生,未见结核依据;⑥纤支镜见:左上叶、左下叶、右中叶粘膜增厚,可见结节样隆起,管腔尚通畅。内见脓性分泌物。支气管粘膜病理提示慢性炎症改变,抗酸、PAS及D-PAS均为阴性,未见特殊病原菌感染。⑦两次淋巴结活检病理均提示:慢性肉芽肿性炎,抗酸(-),PAS(-),D-PAS(-)。⑧全身骨骼SPECT:第7、11胸椎代谢明显增高,考虑转移瘤可能。行T7、11椎体穿刺活检术中见T7椎体压缩性Ⅲ°骨折。⑨T7椎体病理:骨质间有纤维组织增生,大量淋巴、浆细胞、组织细胞为主的慢性炎细胞浸润。符合慢性骨髓炎改变。⑩治疗:患者在外院先后予以哌拉西林舒巴坦、头孢哌酮舒巴坦钠、克林霉素抗感染,复查胸椎MRI新见L2椎体异常信号,遂行L2椎体穿刺活检术。L2椎体病理提示慢性骨髓炎改变,椎体培养出暗色丝孢菌(真菌类)。外送金域L2椎体靶向DNA测序鉴定为microsphaeropsis arundinis。于9月15日开始予伊曲康唑口服液抗真菌治疗。期间间断发热,37~39℃,多于晚上出现,咳嗽、咳痰、胸痛及双下肢疼痛未见好转,在我院就诊期间予以头孢地嗪+莫西沙星+伏立康唑治疗。但仍有反复低热,体温波动在37.5至38℃,联合两性霉素B联合抗真菌治疗,患者发热症状消失,咳嗽咳痰好转后出院。出院继续予以伏立康唑0.2g q12h口服治疗。治疗后浅表淋巴结较入院时缩小,肺CT病灶较前吸收。出院后失访。2.系统性文献复习结果:(1)1989年~2017年,国内暗色丝孢霉病有36例报道,其中关于M.arundinis腔孢菌报道1例,占国内暗色丝孢霉病2.8%。36例中2例为播散性病例,播散性好发淋巴结、肝脏等部位。余下34例中有20例为皮肤皮下病变,占55.6%,肺部病变2例。确诊方法中真菌培养确诊27例,DNA测序鉴定确诊9例。(2)自2004年至今全球仅9例人类感染M.arundinis的报道,病变仅累及皮肤。且均为个案报道,无播散性病例。①一般情况:好发年龄在中老年,中位发病年龄在68岁。男性4例,女性5例,男∶女1∶1.25。其中有4例为肾移植术后患者,2例为糖尿病合并自身免疫疾病患者,3例为风湿免疫性疾病,5例服用糖皮质激素药物治疗,2例接受免疫抑制剂治疗,2例患者同时接受激素联合免疫抑制剂治疗。②临床表现:9例患者全部以皮肤皮下病变为临床表现,为皮下红斑、溃疡、结节。无特征性影像学及血清学表现。③在报道的9例人类感染M.arundinis中,8例通过基因测序确诊,1例通过真菌培养出确诊。对于M.arundinis病原菌认识缺乏,目前诊断主要依赖于分子生物学方法,分子生物学提高了对病原检测敏感度,在罕见病原菌诊断上以及真菌种属鉴定发挥了优势。④目前治疗方法主要是抗真菌治疗。参照暗色丝孢霉病抗真菌治疗,在报道文献中,体外抗真菌药敏实验中,三唑类及两性霉素B具有较好的敏感性。对于难治性感染,如引起中枢神经系统和播散性感染中,联合抗真菌治疗方法可能优于单一抗真菌治疗。抗真菌感染时间较长,一般治疗达6-12月。
  结论:①M.arundinis引起的暗色丝孢霉病国内外报道均以皮肤受累为临床表现,且播散性感染未见报道。本例患者是首例以呼吸系统症状起病,累及肺部、支气管、淋巴结、骨质,椎体培养出暗色丝孢菌,并经分子鉴定为Microsphaeropsis arundinis的播散性病例。②分子生物学技术对于难以分辨的真菌种属鉴定起到了精确诊断的作用,大大提高了该疾病诊断。③目前抗真菌治疗方案参照暗色丝孢霉病抗真菌治疗,体外抗真菌药敏实验中,三唑类具有较好的敏感性,两性B对于播散性及难治性感染中具有一定的疗效。治疗长疗程,6-12个月。
[博士论文] 许仲旻
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的致人畜共患病病原,主要分布在亚洲及欧洲地区,在其余大洲也有零星报道。该菌目前按血清型分型共计29个血清型,其中血清型2型(SS2)被广泛报道为S.suis主要致病血清型。从有报道以来,S.suis已在全球各洲造成上千人感染,幸存者也会留下多种后遗症。它更是东南亚地区造成脑膜炎的主要细菌病原,给人类公共卫生带来了极大的威胁。尤其在中国SS2出现过两次爆发,极高的死亡率和伴随的中毒样休克综合征(Streptococcus toxic shock like syndrome,STSLS)引起了世界广泛关注。病原菌在侵入宿主致病的过程中,其毒力相关因子会随着外界环境的变化而发生变化,这都要依靠转录因子来调节。本研究对SS2中89K上的转录因子进行了筛选,并针对其中一个转录因子调控机制进行了研究,主要研究结果如下:
  1.筛选到一个影响猪链球菌致STSLS的转录因子
  通过宿主体内诱导表达,我们发现候选的8个转录因子大部分发生了上调,对其逐一缺失并通过小鼠实验确认,发现其中一个转录因子tstS的缺失使SS2致病力大幅下降。由于其位于89K毒力岛上,我们检测了该缺失突变株对小鼠巨噬细胞炎性因子的刺激,发现其能力有显著的下降。进一步检测小鼠血中含菌量及血清中炎性因子含量证实,缺失tstS后其宿主体内存活及激发高炎性因子的能力较显著地减弱。但由于感染早期缺失突变株反而能够引起宿主高炎性及之后的清除,我们以不含该基因的欧洲标准株P1/7作为母本,将其导入过表达。结果显示,获得tstS后,P1/7菌株同样获得了激发高炎性因子的能力。结果显示tstS的存在能够提高菌株感染急性期促炎能力,对SS2致STSLS起着重要作用。
  2.发现tstS影响SS2的调控机制
  为了深入研究tstS影响SS2致STSLS的机制,我们通过基因芯片筛选缺失突变株△tstS与野生株05ZY的差异基因。经GO分析发现,大部分基因属于细菌代谢相关,此外还有Sspep、Fhb、Fhbp、SSU05_2103四个已被证实的猪链球菌表面毒力相关因子。而体外模拟环境刺激发现,在葡萄糖匮乏的环境下,tstS的转录水平会进一步上升。经凝胶迁移实验(EMSA)验证,tstS受CcpA调控。结合本实验室前期研究,我们推测TstS与Fhbp以及CcpA间存在一定的联系。将tstS启动子区CcpA结合序列插入tstS缺失突变株中Fhbp启动子区后,我们发现其葡萄糖摄取能力得到了恢复,致病力也有一定的加强。因此我们确认TstS通过Fhbp这个媒介与CcpA存在反馈调节,促进了SS2对低葡萄糖浓度环境的适应,增强了在该环境下荚膜等毒力相关因子的表达来逃避宿主免疫系统清除,即使葡萄糖浓度极低的情况下,TstS同样能够通过其调控的Fhb以及Fhbp来完成免疫逃避。同时这是有关CcpA调控的新机制,为认识和理解CcpA调控的精细化提供了新的视角。
[硕士论文] 付岩峰
应用数学 哈尔滨工程大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要通过释放不育雄蚊的方法来研究登革热病毒的传播模型。考虑野生蚊子生长的各个阶段,建立野生蚊子的结构模型,通过构造Lyapunov函数和应用Routh-Hurwitz定理,分析了该模型平衡点的存在性和稳定性,并给出野生蚊子灭绝的条件。
  针对不同的感染阶段,本文建立了登革热在人与野生蚊子之间传播的模型,计算模型的无病平衡点、地方性平衡点和基本再生数,绘制各感染阶段人和雌蚊数量随时间变化的情况,并对基本再生数进行灵敏度分析,找出了模型中对基本再生数较为敏感的参数。
  本论文构建不育雄蚊和野生蚊子的结构模型,以及登革热在不育雄蚊、野生蚊子与人之间传播的模型。求解蚊子模型的基本再生数,得到野生蚊子在自然界中的存在条件,分析了平衡点的存在性和稳定性。计算登革热模型中的无病平衡点、地方性平衡点和基本再生数,并对模型进行数值仿真,绘制在投放率为1000时各感染阶段人和雌蚊数量随时间变化的情况,并对比不同投放率下感染人数的变化情况。
  结果表明,释放不育雄蚊会有效地控制登革热疫情。本文为进一步研究登革热的控制措施提供了理论参考。
[硕士论文] 魏思琪
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),该病毒感染人体后能够跨过血脑屏障进入中枢神经系统,进而导致胎儿大脑畸形,青少年格林-巴利综合征等。到目前为止,仍然没有商品化疫苗和抗病毒药物上市。NS5是ZIKV最大的非结构蛋白,由一个甲基转移酶(Methyltransferase,MTase)和一个依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)组成,与病毒复制、RNA加帽和抑制宿主天然免疫反应有关。而NS1是ZIKV另一个重要非结构蛋白,可以通过抗体依赖的细胞毒性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity,ADCC)和补体依赖途径诱导感染细胞产生保护性非中和抗体,故用该蛋白来研制ZIKV疫苗及治疗药物,有更强的安全性。
  本研究通过制备ZKIV NS5蛋白的单克隆抗体以及构建表达NS1蛋白的重组杆状病毒,以期为ZIKV复制机制和疫苗研发提供重要材料。具体研究内容如下:
  1.ZIKV NS5蛋白单克隆抗体的制备
  从感染ZIKV MR766毒株的细胞中提取RNA并反转录成cDNA,以此cDNA为模板,通过PCR扩增NS5基因序列。然后将其克隆至原核表达载体pET-28a中,构建原核表达质粒pET-28a-ZIKV-NS5。经IPTG诱导、包涵体纯化,获得ZIKV NS5蛋白。用纯化的ZIKV NS5蛋白免疫4周龄BALB/c小鼠,经细胞融合、ELISA及亚克隆,筛选出10株能够稳定分泌ZIKV NS5单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。分别命名为:1H5、1D3、1D11、2A11、2C1、3A2、3A7、4D11、4F12和4G11。通过间接免疫荧光和Western Blot验证,结果表明10株单抗均能与ZIKV反应,且1D3、1D11、3A7、4F12四株单克隆抗体还与登革热病毒交叉反应。
  2.构建表达ZIKV NS1蛋白的重组杆状病毒
  将ZIKV NS1基因克隆至杆状病毒载体pFastBac1中,构建杆状病毒重组质粒。将带信号肽的重组质粒pFastBac1-ZIKV-F-NS1和不带信号肽的重组质粒pFastBac1-ZIKV-NS1转化至DH10Bac感受态中,获得杆状病毒穿梭质粒rBacmid-ZIKV-F-NS1/rBacmid-ZIKV-NS1;穿梭质粒被转染至sf9(Spodoptera Frugiperda,sf9)细胞中,获得分泌表达ZIKV NS1蛋白的重组杆状病毒;大量培养High5细胞表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化培养基上清,获得纯度较高ZIKV NS1蛋白。经SDS-PAGE和Western Blot检测,ZIKV NS1蛋白在杆状病毒获得高效、分泌性表达。将纯化出ZIKV NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,其血清特异性抗体效价实验表明,纯化的ZIKV NS1蛋白能够诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫反应,有很好的免疫原性。
[硕士论文] 李海敏
呼吸内科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:检测马尔尼菲篮状菌孢子感染支气管上皮细胞后lncRNA及mRNA的表达谱,筛选出相关的lncRNA及mRNAs基因并探讨它们之间的相互关系。
  方法:(1)利用基因芯片技术检测马尔尼菲篮状菌孢子感染支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)4小时后BEAS-2B细胞中的lncRNA及mRNA的表达谱。(2)以BEAS-2B细胞为研究对象,实验分为空白对照组和实验组,实验组用马尔尼菲篮状菌孢子感染BEAS-2B细胞(感染复数为10-20∶1)4小时,采用qPCR法检测基因芯片的可靠性。(3)我们的前期研究证实lncRNA NR046269具有差异表达,因此我们通过生物信息学做lncRNANR046269与芯片表达谱中差异表达mRNA的相关性分析,筛选lncRNANR046269-mRNA关系对。(4)使用慢病毒载体转染BEAS-2B细胞,构建稳定过表达和低表达的lncRNA NR046269的BEAS-2B细胞系。实验分为空载阴性对照组、NR046269过表达、NR046269干扰组。挑选出部分与感染阶段生物过程相关的并且与lncRNANR046269显著相关的部分mRNAs(APOL1、HMOX1、FOXO3A、LTC、ALPK2、LTB4、APOL1、MFSD12),利用qPCR技术检测阴性对照组、NR046269过表达、NR046269干扰组中lncRNANR04626、mRNAs的表达量,初步筛选出存在调控关系对lncRNANR04626-mRNA,随后对该关系对进行重复试验,并通过免疫印迹法检测阴性对照组、NR046269过表达、NR046269干扰组中mRNA蛋白的表达量。
  结果:(1)基因芯片检测结果发现329个mRNA及519个lncRNA有显著差异表达,qPCR法检测结果与基因芯片结果一致。(2)CNC结果显示:筛选出lncRNA NR046269与154个mRNA显著相关,(|PCC|>0.97,P<0.05),(3)通过构建稳定过表达和低表达的lncRNA NR046269的BEAS-2B细胞系,qPCR检测结果显示:与阴性对照组相比,NR046269过表达组中NR046269明显高表达,而NR046269干扰组中NR046269明显低表达(P<0.05,差异具有统计学意义),结果发现lncRNANR046269对APOL1具有负调控作用同时,APOL1在NR046269过表达组中的基因表达量显著下调,APOL1在NR046269干扰组中的基因表达量显著上调(P<0.05,差异具有统计学意义)。western blotting检测结果:与阴性对照组相比,在NR046269过表达组中APOL的蛋白表达量显著下调,在NR046269干扰组中APOL1的蛋白表达量显著上调(P<0.05,差异具有统计学意义)。
  结论:(1)芯片结果显示马尔尼菲篮状菌孢子感染支气管上皮细胞后lncRNA和mRNA存在着差异性表达(2)支气管上皮细胞在马尔尼菲篮状菌孢子感染后lncRNANR046269与APOL1表达显著上调。(3)成功构建稳定过表达和低表达的lncRNANR046269的BEAS-2B细胞系,NR046269过表达组中APOL1表达下调,而NR046269干扰组中APOL1表达上调,NR046269对APOL1的表达具有负性调控作用。
[硕士论文] 闫振华
社会医学与卫生事业管理 广西大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  对滑县地区2008-2016年法定传染病进行描述性统计分析,对几种重点传染病的发病情况进行重点分析,从而为以后拟定传染病防控措施提供可靠的依据。根据分析结果提出优化绩效考核方案、SWOT分析等多种对策。
  方法:
  收集2008-2016年滑县法定传染病疫情报告资料,对收集到的月报表、年报表进行整理。应用Excel2003和SPSS17.0软件对收集到的资料进行统计分析。计算发病率、死亡率、病死率、环比、定基比、构成比等,率、构成比比较的卡方趋势性检验、卡方检验。
  结果:
  (1)2008-2016年该地区发病率整体呈下降趋势(x2趋势=114.07,p=0.000)。(2)传染病死亡率呈现不规则变化(x2趋势=2.44,p=0.118)。传染病病死率呈不规则变化(x2趋势=1.31,p=0.235)。(3)2008-2016年报告传染病总病例数位于前5位的依次是病毒性肝炎、肺结核、手足口病、流行性腮腺炎、其他感染性腹泻病。(4)2008-2016年血源及性传播疾病发病率位居四大类传染病之首,发病率整体上呈下降趋势(x2趋势=50.02,p=0.000);呼吸道传染病的发病率呈下降趋势(x2趋势=288.92,p=0.000);肠道传染病发病率呈下降趋势(x2趋势=97.60,p=0.000);自然疫源及虫媒传染病整体上呈上升趋势(x2趋势=85.72,p=0.000)。(5)2008-2016年病毒性肝炎发病率呈下降趋势(x2趋势=260.12,p=0.000);2008-2016年肺结核发病率变化整体呈下降趋势(x2趋势=328.70,p=0.000);2008-2016年手足口病发病率变化呈波动趋势(x2趋势=13.03,p=0.000);2008-2016年流行性腮腺炎发病率变化呈波动变化趋势(x2趋势=74.19,p=0.000);2008-2016年其他感染性腹泻病发病率变化呈抛物线趋势(x2趋势=131.87,p=0.000)。
  结论:
  1、2008-2016年滑县法定报告传染病发病率整体呈下降趋势。
  2、病毒性肝炎、肺结核、其他感染性腹泻病、流行性腮腺炎等传染病仍需重点防控。
  3、基层公共卫生机构需要加强传染病防治工作。
  4、需优化绩效考核方案,改变人才引进策略,对传染病防控影响因素进行SWOT分析。
[博士论文] 刘莹
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:近年来,埃博拉病毒(EBOV)导致的疫情对全世界人类的安全带来巨大威胁。2014年西非爆发的埃博拉疫情造成了大量死亡,引起了全世界的关注。由于没有针对EBOV的特定药物和治疗,因此,疫苗被认为是控制该流行病最有希望和最有效的方法,开发有效且安全的埃博拉疫苗对于公共安全十分重要。EBOV的糖蛋白GP是病毒粒子上唯一的表面蛋白,负责调节与宿主细胞的吸附和融合,因此成为埃博拉疫苗研究的主要目标蛋白。GP的基因通过基因编辑,不仅编码结构蛋白GP,还编码分泌型糖蛋白(sGP),且占GP基因编码产物的70%。
  目前,疫苗的接种方式主要为肌肉注射(M),使用该种免疫方式的疫苗多为溶液,需要在冷藏或冷冻的条件下保存以保持疫苗的稳定性。最近的几十年,微针(MN)作为一种新的疫苗接种技术被广泛应用与皮内免疫研究中。皮肤是人体最大的免疫器官,其真皮层富含大量的树突状细胞、朗格汉斯细胞等多种免疫细胞,且丰富表达这两种抗原递呈细胞受体,可与包括单核细胞、巨噬细胞在内的其他免疫活性细胞结合,这使得皮肤成为免疫的理想部位。
  本研究针对EBOV GP进行亚单位疫苗的研究。在对GP及sGP进行三维结构的预测和比对后,发现sGP与GP氨基酸序列相同部分形成的空间结构高度相似,因此sGP或可作为GP的替代物。使用牛痘病毒真核表达系统成功表达EBOV GP与sGP,作为亚单位疫苗,分别使用MN与IM进行免疫,评价抗体水平。研究结果表明,MN免疫EBOV GP后刺激产生的抗体水平更高,约是IM免疫产生抗体水平的2倍,其中MN免疫产生抗体的中和抗体效价为900,而IM免疫产生的中和抗体效价为300;此外,MN免疫产生的抗体维持的时间更长,加强免疫后16周,MN免疫产生的抗体水平下降约30%,同抗原使用IM免疫,抗体水平下降约60%。使用sGP作为GP的替代抗原研究中,MN免疫较IM免疫仍然能够刺激产生更高水平的抗体,但产生的中和抗体效价无明显区别。
  为了进一步提高EBOV GP及sGP的免疫原性,我们首次在疫苗配方中加入佐剂Matrix-M并使用MN免疫。研究结果表明,Matrix-M可以显著提高MN和IM免疫GP或sGP亚单位疫苗所诱导的抗体反应,中和抗体效价显著增高,IgG水平约是无佐剂组的5倍,且可以诱导IgG2a的产生,多元化IgG亚型,平衡IgG1/IgG2a的比例。对免疫后小鼠进行致死性EBOV的攻毒试验,结果显示,无论抗原为GP或sGP,免疫方式为MN或IM,Matrix-M作为抗原成分的加入均可对小鼠提供100%的保护率,且小鼠无明显体重下降和临床症状。在无佐剂加入的攻毒试验中,使用MN免疫GP亚单位疫苗后,可对感染致死性EBOV的小鼠提供80%的保护,而IM免疫组的5只小鼠中只有1只存活。综上所述,使用MN免疫GP亚单位疫苗能够有效保护EBOV感染,佐剂Matrix-M的加入,使sGP成为GP有效的替代抗原成为可能。本研究为埃博拉疫苗的开发提供了新的实验及理论基础。
[硕士论文] 任雪
应用数学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:随着环境污染的加剧和病原体抗药性的增强,传染病发生的越来越频繁,甚至一些已经被控制的传染病再次流行起来。因此,掌握传染病的发病机制和传播机理,制定有效的措施来控制和预防传染病的发生和传播对人类社会具有重要意义。由于研究传染病时,不能对人类进行实验,所以建立反应传染病动力学行为的数学模型是研究传染病的重要手段。本文将研究三类传染病模型,通过分析模型的动力学性质,了解传染病的传播特性。
  首先,研究了一类具有脉冲和多延迟的离散SI传染病模型,该离散模型是以原有的连续SI模型为基础,利用Euler法建立的。根据模型持久性定义,证明了离散模型的持久性,给出模型持久性的充分条件,并通过数值模拟,验证了模型的持久性。
  其次,研究了一类具有延迟项的离散SIS传染病模型,该离散模型是以原有的连续SIS模型为基础,利用Euler法建立的。给出了模型具有正平衡点的条件,通过分析特征方程,给出了平衡点稳定及产生Neimark-Sacker分支的条件,并通过数值模拟,验证了所得结论的正确性。
  最后,研究了一类具有年龄结构的积分偏微分形式的SIS传染病模型。采用无网格插值法研究了该类模型的数值解,分析了方法的稳定性,并通过实验算例验证了方法的有效性。
[硕士论文] 张小燕
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)感染会导致手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD),目前对于EV71病毒引起的疾病尚无有效的治疗方法,并且灭活疫苗能否起到预期的预防作用,仍需进一步研究。EV71病毒的衣壳蛋白VP2暴露在颗粒表面,含有决定EV71病毒免疫学性质的抗原决定簇。有研究结果表明,VP2是EV71分型的依据之一,同时在抵抗EV71的免疫应答中,VP2也是参与激活宿主细胞免疫应答的重要蛋白分子。由于EV71分型诸多,各个地区EV71病毒的流行特点普遍存在差异,本文以内蒙古地区EV71病毒C33株vp2为研究对象,克隆了该株病毒的vp2基因,了解其序列特征并原核表达充足VP2蛋白,探讨了VP2作为重组蛋白疫苗的可能性。
  提取该株病毒的RNA,扩增其长度为774bp的vp2cDNA,测序发现其编码区的第78位、288位碱基处与设计引物使用的序列(登录号HQ456307.1)不同,其中第78位碱基(G→A)和288位碱基(C→G)的差异引起了氨基酸的改变,即A→T,P→A,该结果可能是不同地区EV71病毒分型存在差异所致。随后分别构建了表达载体pET3a-VP2和pET3a-HIS-VP2,转入大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了VP2和带有His标签的HIS-VP2蛋白。并将纯化的VP2和HIS-VP2蛋白分别免疫小鼠,注射S180细胞,制备了鼠抗VP2和HIS-VP2腹水多克隆抗体。
  Western Blot实验中,鼠抗VP2和HIS-VP2腹水抗体都能分别与EV71病毒发生特异性反应,而且无明显差异。随后把两种腹水抗体进行稀释,与EV71病毒共同感染Vero细胞进行中和实验,结果显示,这两种腹水抗体在稀释度为1∶16时,CPE小于50%,说明对Vero细胞起到了保护作用。又通过VP2腹水抗体与EV71病毒的等体积体外中和并免疫1日龄乳鼠(200μL/只),结果显示,VP2腹水抗体对已攻毒的1日龄乳鼠具有良好的保护作用,存活率近70%。
  总之,本实验制备的VP2腹水抗体具有良好的免疫原性,对细胞和动物有一定的保护作用,可能成为EV71疫苗的候选者。
[硕士论文] 沈文启
中西医结合临床 福建中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨慢性乙型肝炎肝组织HBcAg表达模式与中医证型的关系,进一步揭示慢性乙型肝炎中医证型与免疫功能状态的关系。
  方法:以479例慢性乙型肝炎患者为研究对象,根据《慢性乙型肝炎中医诊疗专家共识》(2012年01月)中慢性肝炎辨证标准辨证后分组:脾肾阳虚证20例、瘀血阻络证24例、肝肾阴虚证34例、肝郁气滞证49例、肝郁脾虚证186例、湿热蕴结证166例。用免疫组化法检测肝组织中HBcAg表达模式,分为阴性型、浆核各半型、胞浆优势型、胞浆型,分析中医证型与肝组织HBcAg表达模式的关系。数据分析采用统计软件SPSS20.0,以多样本非参数检验对各证型肝组织HBcAg表达模式做显著性检验。
  结果:(1)湿热蕴结证的肝组织炎症坏死分级较其他证型高,肝肾阴虚证、瘀血阻络证、脾肾阳虚证的肝组织纤维化分期较高。(2)胞浆型的肝组织炎症坏死分级最高,阴性型和胞浆优势型次之,浆核各半型最低;与浆核各半型、胞浆优势型比较,胞浆型、阴性型的肝组织纤维化分期较高。(3)各中医证型肝组织HBcAg表达模式的差异具有统计学意义(x2=80.889,P<0.001),其中湿热蕴结证与肝郁脾虚证、肝郁气滞证、肝肾阴虚证、瘀血阻络证及脾肾阳虚证差异具有统计学意义;肝郁脾虚证与肝肾阴虚证差异具有统计学意义;肝郁气滞证与肝肾阴虚证、瘀血阻络证差异具有统计学意义。湿热蕴结证主要表达胞浆型和胞浆优势型,肝郁脾虚证、肝郁气滞证主要表达胞浆优势型和浆核各半型,肝肾阴虚证、瘀血阻络证、脾肾阳虚证主要表达浆核各半型和阴性型。(4)肝组织HBcAg表达模式为中医证型独立影响因素。
  结论:1.慢性乙型肝炎各中医证型患者肝组织HBcAg表达模式存在差异,其中湿热蕴结证主要表达胞浆型和胞浆优势型,肝郁脾虚证、肝郁气滞证主要表达胞浆优势型和浆核各半型,肝肾阴虚证、瘀血阻络证、脾肾阳虚证主要表达浆核各半型和阴性型;2.各中医证型患者的免疫状态各异;3.肝组织HBcAg表达模式可能更加敏感地反映慢性乙型肝炎患者的免疫功能状态。
[博士论文] 刘永相
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:固有免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线,宿主的模式识别受体能够对病原相关分子模式进行识别,进而激活固有免疫系统,最终释放干扰素和炎症因子等一系列细胞因子通过抗病毒或参与炎症反应等发挥作用。Ⅰ型干扰素可以通过JAK/STAT通路激活数以百计的干扰素刺激基因(ISGs)转录表达,从而发挥抗病毒作用。而病毒也进化出了许多对抗宿主抗病毒反应的策略,尤其是对抗宿主的固有免疫系统。因此研究固有抗病毒免疫和病毒对固有免疫系统的抑制,对于基础研究和临床应用都有很大的意义。
  猫杯状病毒(FCV)是杯状病毒科,水疮性病毒属(Vesivirus)成员,感染猫后可引起上呼吸道疾病和急性口腔炎溃疡,病情严重的,可引起感染猫的死亡。同病毒科的人诺如病毒是引起急性胃肠炎和腹泻最重要的病原之一。目前还没有对抗人诺如病毒的有效药物和疫苗,主要原因是一直以来人诺如病毒的体外培养技术都不成熟。此外杯状病毒与宿主免疫系统的相互作用研究相对较少,FCV体外培养技术比较成熟,是目前研究人诺如病毒最好的模式病毒之一,研究FCV与固有免疫系统的关系对整个杯状病毒科的研究都有很重要的意义。
  本研究首先应用蛋白质组学技术筛选FCV感染CRFK细胞前后的差异表达蛋白,共筛选到差异蛋白429个,其中229个蛋白表达量升高,有200个蛋白表达量降低;与固有免疫相关的蛋白有IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等,且这些蛋白表达量都发生了不同程度的下调;其中IFNAR1为Ⅰ型干扰素受体组分,IRF1为Ⅰ型干扰素信号通路重要调控分子,该发现为FCV抑制Ⅰ型干扰素通路研究奠定基础。
  其次,通过IFN-α抗病毒试验,发现IFN-α不能够抑制FCV复制,Western blot和流式细胞术结果表明FCV感染后下调了IFNAR1在细胞表面的表达量,qRT-PCR、半定量PCR和Northern blot结果表明FCV感染后IFNAR1的mRNA表达量减少,最终发现FCV非结构蛋白PP和p30可以抑制共转染质粒的表达,且PP和p30转染后可以使IFNAR1的mRNA表达量降低。
  此外,克隆了猫源IRF1(Fe-IRF1),瞬时转染Fe-IRF1后可以显著抑制FCV的复制。双荧光素酶试验结果表明Fe-IRF1通过激活Ⅰ型干扰素通路发挥抗病毒作用;Western blot结果表明FCV感染可以下调IRF1蛋白表达量;qRT-PCR结果表明FCV感染可以下调IRF1的mRNA表达量。
  总之,本研究应用差异蛋白质组学方法,筛选到FCV感染后下调表达的固有免疫相关蛋白IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等;FCV感染后可以通过下调IFNAR1的mRNA表达,阻断Ⅰ型干扰素通路发挥作用,FCV感染后同时可以下调IRF1的mRNA水平,抑制Ⅰ型干扰素通路发挥作用。最终FCV可以通过两种方式抑制Ⅰ型干扰素信号通路的抗病毒作用。
[硕士论文] 杨玉倩
预防兽医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasive Escherichia coli,AIEC)与肠道感染的发生发展密切相关,其毒力因子影响自身在肠上皮和巨噬细胞内的存活与复制,近年来受到广泛关注的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)可能与该致病菌密切相关。AIEC引发IBD的致病机理目前尚不明确,其鞭毛和菌毛被认为是主要的两大致病因子。AIEC菌株中基因fliC编码的鞭毛蛋白是鞭毛丝的主要结构亚基,参与细菌的一系列致病过程。Ⅰ型菌毛中fimH亚单位作为Ⅰ型菌毛的主要组成部分,在介导细菌黏附宿主细胞的同时,为进一步侵入机体创造条件。本研究以鞭毛蛋白FliC和Ⅰ型菌毛主要结构亚单位FimH为切入点,探究其在AIEC中所发挥的生物学作用,从而更好地理解AIEC的致病机理。
  首先通过比对NCBI GenBank上不同大肠杆菌E.coli菌株的fliC、fimH基因序列,设计相应的PCR引物用于扩增检测AIEC菌株LF82(Wild-type,O83∶H1)中的fliC、fimH基因,对扩增后基因产物进行纯化、克隆以及序列测定。依据LF82的fliC、fimH基因序列设计相应的缺失引物用于Red同源重组的一步PCR法缺失靶基因。这两对缺失引物5'端分别与fliC、fimH两翼序列同源,而3'端与质粒pKD3上氯霉素抗性基因cat两翼序列同源。运用λ-Red同源重组系统,以质粒pKD3为模板,通过缺失引物扩增出含cat抗性片段的PCR产物纯化后,将该融合片段导入含有质粒pKD46的LF82菌株内,在三种Red同源重组酶的作用下,cat基因片段与靶基因发生同源重组,将fliC、fimH基因置换下来,在氨苄、氯霉素抗性平板上筛选出一次同源重组菌LF82△fliC∷cat、LF82△fimH∷cat和LF82△fliC△fimH∷cat。随后,将质粒pCP20电转导入一次重组菌内,利用其编码表达的Flp重组酶识别cat阅读框两侧Flp位点,消除氯霉素抗性基因。最后,依据PCR检测结果及测序结果分析,确认成功构建出fliC、fimH基因缺失株LF82△fliC、LF82△fimH及双缺失株LF82△fliC△fimH。并在此基础上,分别将表达fliC基因、fimH基因的pBR322质粒电化学转化入LF82△fliC、LF82△fimH中,成功构建缺失株LF82△fliC、LF82△fimH的回补株LF82△fliC/pfliC、LF82△fimH/pfimH。
  细菌生长曲线实验结果显示各菌株生长曲线无明显差异。细菌半固体培养基运动实验结果显示缺失了fliC基因的菌株在半固体培养基上无运动性,而野生株、fimH缺失株与回补株均可观察到明显的运动环。生物被膜定量试验表明FliC与FimH均能显著影响LF82生物被膜的形成(p<0.05),其中fimH缺失株生物被膜形成能力下降更为明显(p<0.01)。体外对Caco-2细胞的黏附试验结果显示fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株的黏附能力分别明显下降约74%、72%、85%(p<0.01);体外对Caco-2细胞的侵袭试验中,fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株的侵袭能力分别下降约59%(p<0.05)、58%(p<0.05)、86%(p<0.01)。随后通过Real-time PCR检测fliC缺失株、fimH缺失株及双缺失株主要毒力因子转录量的变化,结果显示,相对野生株LF82,fliC缺失株中Ⅰ型菌毛主要结构亚单位fimH)、P菌毛(papC)、长极性菌毛(lpf)、细胞侵袭因子(ibeA)、溶血素(hlyA)的基因转录量分别下降了43%,46%,74%,57%,94%,差异显著(p<0.05);fimH缺失株中fliC、papC、lpf、ibeA、hlyA基因转录量分别下降了43%、52%、78%、62%、63%,差异显著(p<0.05)。双缺失株中fliC、fimH基因基本不转录,papC、hlyA基因转录量分别下降了28%(p>0.05)、57%(p<0.05),而lpf、ibeA、vat基因转录量分别上调了6%,29%,10%,差异均不显著。以上结果提示fliC和fimH基因参与LF82的生物学功能,且不同毒力因子之间发挥协同作用,共同参与致病机制。此外,黏附抑制试验结果显示LF82对Caco-2细胞的黏附作用可以被FliC多克隆抗体及D-甘露糖抑制,这提示FliC与FimH可能是其潜在的治疗靶点。小鼠肠道定植试验结果显示LF82主要定植于小鼠的盲肠和回肠部。在小鼠回肠部中,fliC、fimH单缺失株和双缺失株的定植能力较野生株相比,虽然分别下降约33%、25%、26%,但差异不显著,其潜在机制有待进一步探析。
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