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[硕士论文] 杜志锋
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:对于成年女性而言,其生育力随年龄增长而下降。其中卵巢衰老,包括卵泡在数量上的减少和功能上的衰退等,成为生育力下降的重要原因。挽救衰老的卵巢,是提高女性生殖力的一个重要策略。藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,PC)是一种具有抗氧化、抗炎症、增强免疫力的钝顶螺旋藻类蛋白质,在医学和生物领域具有广泛应用价值。
  我们的前期研究利用D-半乳糖(D-Galactose,D-gal)致衰小鼠模型,表明PC可通过抑制活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)途径改善致衰小鼠卵巢功能;进一步又通过转录组测序(RNA-Sequencing,RNA-Seq)技术筛选到致衰组和致衰改善组差异表达基因提高生殖力的富集通路。但在自然衰老小鼠模型中,PC能否改善雌性生殖力,以及PC的作用功效和机制尚未得知。
  本研究取6周龄小鼠为年轻组(Young),8.5月龄小鼠为自然衰老组(Aged),灌胃PC的8.5月龄小鼠为处理组(Aged+PC),小鼠品系均为ICR。经45天灌胃处理后,利用RNA-Seq技术,分析卵巢在转录组水平表达变化,得到以下结论:
  (1)高通量二代测序获得Young组、Aged组、Aged+PC组三组卵巢转录组的数据,数据过滤后总共得到约58.14G数据量,平均有92.85%比对到基因组上,9个样品Q30指数均在93.20%以上,说明测序质量高,后续分析结果可靠。
  (2)构建了自然衰老小鼠卵巢表达谱,鉴定了597个差异基因,其中上调基因数为252,下调基因数为345。根据GO分析,差异表达基因在生物学过程中主要富集在循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答、补体激活经典通路、B细胞介导的免疫等;在细胞组分中主要富集在血液微粒、免疫球蛋白复合物循环、染色体浓缩运动等;在分子功能中主要富集在抗原结合、免疫球蛋白受体结合等方面。根据KEGG分析,差异表达基因在细胞周期、细胞粘附分子方面发生显著富集。
  (3)同Aged组相比,Young组与Aged+PC组鉴定了13个共同差异表达基因,根据GO分析,共同差异表达基因在生物学过程中主要富集在细胞对干扰素-β的反应、细胞因子应答、先天免疫应答、对原生动物的防御反应等;在细胞组分中主要富集在液泡膜共生体、宿主细胞质、宿主细胞内部分等方面。
  (4)基于Young组与Aged组差异表达基因,并结合RT-qPCR结果表明,在Aged+PC组中,Aurka、Gdf9、Mest、Rad5等基因出现上调,其中Gdf9和Rad51为显著上调;另外Cd74、Cxcl10、Nlrc5、Zbp1等基因出现显著下调,这与RNA-Seq结果相符。上调基因涉及卵母细胞微管形成、卵泡发育、促进生长、DNA修复等过程,下调基因涉及到炎症反应、低甲基化参与的衰老调控等作用。推测灌胃PC有助于提高卵巢功能,延缓衰老,为PC抵抗卵巢衰老、提高生殖力提供理论依据。
[博士论文] 李春宏
流行病与卫生统计学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  人类的长寿与衰老受遗传因素影响,长寿家族人群相对于非长寿家族人群、老龄群体相对于年轻群体,其基因表达水平有差异,拟从转录组学层面挖掘长寿与衰老差异表达基因,探讨基因表达与长寿和衰老的关系。DNA甲基化是表观遗传学修饰方式之一,它易受环境因素的影响而发生动态改变,与人类长寿、衰老、疾病的发生、发展均有关联。基于以上的研究线索,以广西巴马地区人群为研究对象,筛查长寿相关的DNA差异甲基化位点和基因,并在人群中检测长寿高甲基化基因NFATC1基因的甲基化水平,从表观遗传学对基因调控的角度探索DNA甲基化与人群长寿的关系。
  方法:
  (1)运用WGCNA分析GEO数据库中的长寿人群数据集GSE16717的二代测序数据(RNA-seq),以获取长寿与衰老差异表达基因。在人群中随机抽取不同年龄段的个体、抽取其外周静脉血、提取RNA,用于检测特异性衰老差异表达基因CCR6和ID3的表达水平。
  (2)在广西巴马地区的长寿家族和非长寿家族中抽取个体,分别组成长寿家族组和非长寿家族组,抽取研究对象的外周静脉血、提取DNA,用于甲基化芯片检测以获取长寿差异甲基化位点和基因。另建立由长寿老人、长寿老人后代组和非长寿家族人群组成的病例对照研究,检测长寿高甲基化基因NFATC1的甲基化水平。
  结果:
  (1)获得296个长寿差异表达基因,表达水平与寿命负相关,主要涉及GO:0005634~nucleus、T cell receptor signaling pathway等生物学功能和通路。排名前10的是CAMK4、SLC16A10、EPHA4、TAMM41、MAN1C1、DPH1、SIT1、GMPS、PRRC2B、DEXI等;获得46个衰老差异表达基因,表达水平与年龄负相关,主要涉及GO:0042113~B cell activation and hsa04662:B cell receptor signaling pathways等生物学功能和通路。排名前10的是CR2、VREB3、ID3、MS4A1、TCL1A、CCR6、OSBPL10、USPL1、HS3ST1、SPIB等。
  (2)特异性衰老差异表达基因CCR6和ID3在不同年龄段人群中表达水平有差异(74岁以下组>75岁及以上组),基因表达水平与年龄呈负相关关系。
  (3)NFATC1、SHC2、ULBP1、CD37、IL11等基因在长寿家族组人群中高甲基化,而MAPK3、PIK3R5、CORO1A、AKT1和PRKCZ等基因发生了低甲基化。
  (4)NFATC1基因启动子区域chr77157891位点的甲基化水平差异有统计学意义(长寿老人组>非长寿家族组,长寿老人后代组>非长寿家族组)。77157909位点甲基化水平差异也有统计学意义(长寿老人组<长寿老人后代组,长寿老人组<非长寿家族组),且在长寿家族后代组与非长寿家族组的男女间比较,该位点的甲基化水平差异有统计学意义(女<男,p=0.014)。
  (5)H19、PFKFB4、SFTPA1基因在长寿家族人群中低表达、高甲基化。
  结论:
  (1)人类的长寿和衰老均与基因差异表达有关,长寿差异表达基因主要参与细胞免疫;衰老差异表达基因主要参与体液免疫,基因表达水平与年龄呈中度相关关系。
  (2)衰老差异表达基因CCR6和ID3表达水平随着年龄的增加而下降。
  (3)分别获得了长寿高甲基化与低甲基化基因,长寿高甲基化基因NFATC1基因启动子区域部分位点的甲基化水平可能与广西巴马地区人群的长寿相关。
  (4)H19、PFKFB4、SFTPA1既是长寿相关低表达基因,也是长寿相关高甲基化基因。
[硕士论文] 龙志文
耳鼻喉 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在喉腔,喉内肌的正常收缩是保证喉各项功能的基础。喉的发音、呼吸等生理功能与喉内肌关系密切。喉返神经损伤类疾病具备极其复杂的发病机制,在这些机制中喉内肌扮演着重要的角色。本文通过对5例男性尸体、13例病人喉内缩肌、喉外展肌进行解剖学、组织学、免疫组织化学、超显微结构及糖原含量等方面的研究并采用形态定量学方法做比较分析,为后续研究和探讨喉肌疾病病因学奠定实验基础。
  方法:
  1、5例国人成年头颈部标本,采用10%甲醛溶液防腐固定,解剖尸体喉腔环杓侧肌、环杓后肌,观察并记录其起止与形态,测量其体积参数。同时采用单反照相机(佳能600D)及微距镜头(佳能18-55ISII镜头)于专业的静物摄影台上拍摄环杓后肌、环杓侧肌的标本图像。
  2、喉内收肌取自环杓侧肌,外展肌取自环杓后肌。应用免疫组织化学技术鉴定13例环杓后肌和环杓侧肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纤维,显微镜下摄像,采用ImagePro Plus6图像分析软件计算两组肌肉各型肌纤维的构成比。应用HE染色技术观察13例同一标本来源环杓后肌、环杓侧肌肌纤维结构。
  3、应用电镜技术研究13例同一标本来源环杓后肌、环杓侧肌线粒体结构参数。应用蒽酮法分别测定13例同一标本来源环杓后肌、环杓侧肌糖原含量。
  结果:
  1、环杓后肌处于环后黏膜下,肌腹形态呈扇形状,左右两侧肌肉外观呈弧形线状,起于环状软骨背面背板正中脊两旁浅凹及下远处,双侧环杓后肌分别朝向外、向上、向前方向斜行会聚止于同侧杓状软骨肌突后面。环杓侧肌位于杓状软骨肌突部位的前外侧,起于左右两侧环状软骨弓的上缘,向上、向后、向内止于杓状软骨肌突部位的前面。环杓后肌平均长度上部为12.3mm±0.72mm,中部为15.3mm±1.33mm,下缘为20.3mm±1.55mm;平均宽度上缘为18.5mm±1.12mm,中央为15.2mm±0.74mm,下缘为7.4mm±1.45mm;平均厚度上缘为2.3mm±0.54mm,中部为2.3mm±1.35mm。环杓侧肌平均长度上部为18.4mm±1.45mm,中部为12.3mm±1.34mm,下缘为7.3mm±0.54mm;平均宽度上缘为15.1mm±0.49mm,中央为9.3mm±0.53mm,下缘为4.2mm±1.56mm;平均厚度上缘为2.3mm±1.72mm,中部为4.3±1.56mm。
  2、HE染色可见环杓后肌、环杓侧肌有横纹等结构。测量环杓后肌和环杓侧肌Ⅰ型纤维的构成比例分别为75.5%±4.2%和22.5%±2.8%,Ⅱ型纤维的构成比例分别为24%.5±4.2%和77.5%±2.7%。组间比较,环杓后肌Ⅰ型纤维构成比例高于环杓侧肌,Ⅱ型纤维构成比例低于环杓侧肌。
  3、13例环杓后肌面积密度0.673±0.001826、体积密度0.07246±0.001330、面数密度0.35323±0.001481。13例环杓侧肌面积密度0.42±0.006083、体积密度0.04792±0.000954、面数密度0.17623±0.001589。同一标本来源的环杓后肌的线粒体面积密度、体积密度、面数密度均大于环杓侧肌,且差异十分显著(P<0.05)。测量每100g喉肌含糖原结果,环杓后肌0.09438g±0.003228g,环杓侧肌0.7477g±0.003059g,糖原含量在组间有显著性差异(P<0.05),环杓后肌糖原含量高于环杓侧肌。
  结论:
  以环杓侧肌为代表的喉内收肌和以环杓后肌为代表的喉外展肌,在解剖学、免疫组织化学、超微结构及糖原含量方面均存在较大差异,这种差异是与两种肌肉在机体喉腔进行发音、呼吸及下呼吸道防护等生理过程中所担负的不同功能相适应的。
[硕士论文] 刘志祥
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大脑作为人体最为复杂、精密的器官,由数百亿个神经元构成。单个神经元通过突触结构与其他神经元连接并形成具有功能的神经网络,从而赋予动物个体意识与行为。基于组织样本投入的传统建库测序技术会掩盖神经元彼此间存在的异质性,不适用于单神经元研究,同时,不同神经元的形态、功能以及基因表达存在的差异性由表观遗传因素所决定。因此研究提出了一种对单神经元示踪标记及其细胞核分离的研究方法,并选取表观遗传的重要形式——DNA甲基化作为研究对象。
  在对重组腺相关病毒(rAAV)的构建工作中,本课题首先构建了表达目的核膜蛋白的腺相关病毒重组载体pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag,分别用广谱启动子CMV和神经元特异性启动子hSyn在细胞系转染实验体外表达和鼠脑神经元活体表达表达目的核膜蛋白。构建载体被转染进HEK-293T细胞以进行验证,转染后的细胞通过荧光显微镜观察,可见荧光信号呈圆形分布、边缘更加明亮,说明目的核膜蛋白如预期实现核膜定位标记。但通过病毒鼠脑注射实验对所包装重组病毒载体进行验证,未能在脑切片上观察到荧光信号。由于可能存在因启动子差异或是实验操作因素造成阴性结果的可能,本研究也构建包装了腺相关病毒重组载体rAAV-hSyn-eGFP-NLS,并对其进行活体注射,在脑切片可观察到大量被荧光标记的神经元,成功实现对海马投射内嗅皮层神经元的逆向标记,从而排除上述可能性。
  在分离被标记细胞核的研究过程中,本课题通过细胞转染的方式模拟被重组病毒标记的神经元。研究过程中,首先对转染后的细胞进行匀浆处理及密度梯度离心,以分离细胞核。分离到的细胞核形态完整且杂质较少。之后通过免疫共沉淀的方式对被标记细胞核细胞核进行捕获,所捕获细胞核阳性率约为70%,捕获率在65%~85%。同时对照组阴性细胞核漂洗后的残留率仅为0.18%,因此可认为实验组中阴性细胞核已基本漂洗干净,该实验方法可己满足后续研究需求。
  在利用单细胞进行DNA甲基化测序建库的研究过程中,本课题参照单细胞亚硫酸盐测序(scBS-seq)的方法,先后分别以寡量细胞及单个神经元作为建库投入,成功获得DNA甲基化测序建库。所建文库经琼脂糖凝胶电泳检测,文库片段分布大小与预期相符(300bp~500bp),同时条带明亮,满足上机测序要求。同时对测试样本的测序结果进行生物信息学分析,发现文库测序质量较好,且组间因建库操作造成的差异较小,因此认为该方法具有较好的可重复性。
  针对本课题所遇到AAV载体装载容量受限的问题,本文最后还对如何现有提高AAV装载容量的研究进行论述,并提出对衣壳蛋白编码基因cap进行人工进化的改进的新思路。此外也单细胞DNA甲基化测序技术在医学检测中的应用进行论述。
[硕士论文] 魏莹莹
动物学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:在女性生殖健康中,与年龄相关的卵巢功能衰退以及多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)和卵巢早衰(premature ovarian insufficiency,POI)等卵巢相关疾病呈现越来越高的发病趋势。但是,对人类女性卵巢自然衰老的研究因为取样困难及道德等方面的限制而难以进行。猪和人在生理学,解剖学和生物化学等方面具有一定的相似性,因此猪可以作为研究卵巢衰老及相关疾病的动物模型。在整个卵巢发育的过程中,常常将初潮期和绝经期作为卵巢行使生殖功能的开端和结束,为此,本实验选取了与女性初潮期和绝经期相对应的母猪的青春期和生殖衰竭期即180日龄和8岁作为卵巢衰老过程中的两个关键时间点,以雅南母猪卵巢为实验材料,分别进行了全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)和全转录组测序(RNA-seq)。主要结果如下:
  1.构建了全基因组甲基化图谱,比对后发现甲基化修饰发生在CpG,CHH和CHG的胞嘧啶上,在基因上甲基化修饰主要发生于基因的CDS区,并在转录起始位点和转录终止位点呈现一个急剧的下降。而整体甲基化水平在两个时间点中并无明显变化,且甲基化水平和染色体长度呈负相关(Pearson's r=-0.636,P=1.844×10-9),和GC含量(Pearson's r=0.903,P<2.2×10-16)、基因数量(Pearson's r=0.398,P<2.2×10-16)、CpG岛比率(Pearson's r=0.792,P<2.2×10-16)和重复区密度(Pearson's r=0.126,P<2.2×10-16)均呈现正相关。
  2.在两个时间点母猪卵巢内鉴定到422个差异甲基化区域(P<0.05),其中303个甲基化区域表现出上调,119个甲基化区域表现出下调,揭示在卵巢的发育过程中DNA甲基化修饰的动态变化。有146个和12个差异甲基化区域分别存在于基因的CDS区和启动子区域,这些差异甲基化区域关联的基因功能主要富集于凋亡代谢通路、胚胎发育和免疫系统的调节等。而更多的DMR位于CDS区域则提示我们这一部分差异表达区域可能具有一定的功能,通过对DMR和该区域所在基因的mRNA表达进行相关性分析,发现甲基化水平和基因的表达具有显著的负相关(r=-0.179,P=5.72×10-7)。
  3.通过RNA-seq分别鉴定出了20,357个mRNAs、1,196个miRNAs、4,879个lncRNAs和7,600个circRNAs。经过差异表达分析,最终显著差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA数量分别为2243个,95个,248个和116个。这些差异表达的转录本相关基因富集于病毒反应、蛋白结合、细胞凋亡以及包括排卵、受精、怀孕和胚胎发育的生殖能力相关等功能。
  4.通过对DNA甲基化和几种RNA进行联合分析发现,在卵巢组织的两个时间点,基因组分别有8,845个(34.9%)和9,663个(38.2%)的基因同时表达出mRNA和miRNA且处于甲基化状态,除此之外,表达的或甲基化的基因均是相对减少,而基因未表达且未甲基化的基因数量约为600;同样的情况也出现在miRNA,lncRNA和DNA甲基化的联合分析中,分别有16.7%(1,354)和18.1%(1,465)的基因同时表达出lncRNA和miRNA且处于甲基化状态。这个结果表明大部分的基因均呈现出DNA甲基化和转录表达的协同调控,并且这种调控方式在衰老期会更优先出现。为了更深刻的揭示这种协同调控,对差异甲基化区域及几种RNA相关的基因进行GO功能对比,发现它们在凋亡过程、受精、怀孕和胚胎发育等卵巢功能方面出现交叉。
  5.基于竞争性内源RNA(ceRNA)理论,我们用显著差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA构建了以miRNA应答元件为桥梁的几种RNA互作网络,具体包括4个miRNA(miR-125b,miR-504,miR-92b-5P,miR-9),4个基因(FADD,EGFL7,PER2,CELSR1),3个lncRNA(MSTRG62621,MSTRG114143,MSTRG167556)和2个circRNA(circ000675,circ13607)。并对这个网络通过皮尔逊相关系数进行了共表达分析,揭示了受FADD、MSTRG.114143和miR-92b-5p调控的RNA网络,以及PER2和miR-92b-5p之间互相调控的两种方式分别为CELSR1,PER2和circ13607对miR-125b和miR-92b-5p.的竞争。尽管miR-92b-5p和PER2没有对应的miRNA应答元件,但其共表达的关系暗示了也许存在另外的调控因子及RNA内部更复杂的关系。
  本研究通过WGBS,RNA-seq和相关性分析等方法对青春期及生殖衰竭期的母猪卵巢从基因组水平和转录组水平对DNA甲基化和四种RNA进行了联合分析,构建了基于ceRNA理论和共表达的调控网络,同时也揭示了DNA与转录组及RNA之间相互调控和协同调控机制。研究结果将为进一步了解及研究卵巢衰老及其分子机制提供基础。
[硕士论文] 刘帆
中药药理学 黑龙江中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  基于UPLC/Q-TOF-MS,探讨慢性睡眠剥夺不同时间对大鼠脑脊液中内源性代谢产物的变化并寻找睡眠因子。
  方法:
  1.慢性睡眠剥夺大鼠模型的复制
  取实验动物SD雄性大鼠48只,在实验条件下饲养一周,以适应环境,期间自由饮水和获取食物。一周后将大鼠随机分为6组,分批次置于睡眠剥夺仪,每次8只,分别进行睡眠剥夺1、3、5、7、9天,期间自由饮水和获取食物,睡眠剥夺仪速度设置为5m/分钟,运动5秒,暂停5秒。空白对照组的实验动物在睡眠剥夺仪上饲养,速度设置为0m/分钟,自由饮水和获取食物。
  2.基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  于慢性睡眠剥夺后,为避免睡眠剥夺的消退,立即腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠,用脑立体定位仪固定,头部剪毛,消毒,并于腹下垫恒温垫。参考大鼠脑立体定位图谱,以枕骨嵴下3毫米处的肌肉间隙处为进针点。进针角度与身体平行,针坡面向上缓慢向前进针到小脑延髓池,深度约为0.5厘米。缓慢抽取约80微升脑脊液,后迅速退针,将脑脊液移入EP管中,放入液氮中速冻后移入-80℃中保存。待所有样品采集完毕,集中将脑脊液进行处理,利用UPLC/Q-TOF-MS进行分析。筛选出内源性代谢产物并探究其变化趋势。
  结果:
  1.慢性睡眠剥夺大鼠模型的复制
  本课题睡眠剥夺的原理是利用实验动物所站立的平台的随机移动而使实验动物无法进入睡眠,减少了水环境睡眠剥夺或电刺激睡眠剥夺给实验动物造成的伤害。运行和休息时间可以循环进行,达到了慢性睡眠剥夺的目的,很好地模拟了人的睡眠不足状态,成功地完成了慢性睡眠剥夺动物模型的复制。
  2.基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  2.1正离子模式下,基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  根据PLS-DA得分图呈现出的分组趋势如下:空白组和慢性睡眠剥夺1天的样品集中在第四象限,慢性睡眠剥夺3天、5天、7天的样品集中在第一象限,慢性睡眠剥夺9天的样品离散在第一象限与其他各组在主成分1上存在明显差异。经过交叉验证,在经过标签打乱后累积R2Y由0.77下降到0.51,累积Q2由0.56下降到-0.14,模型不存在过拟合现象,模型中分组信息可信,有必要进一步对差异性代谢产物进行分析。
  筛选出的内源性代谢产物有:组氨半胱氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、辛酰左旋肉碱、L-谷氨酰胺、左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、戊酰基左旋肉碱、己左旋肉碱等25种。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中L-蛋氨酸、癸左旋肉碱和L-色氨酸的含量总体呈先升高后降低的趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的L-组氨酸、L-谷氨酰胺、丁酰左旋肉碱、十四烷左旋肉碱与磷脂(O-16∶0/0∶0)的含量总体呈升高趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的1-亚油酰甘油磷酸胆碱与戊二酰左旋肉碱的含量变化无显著性趋势,基本保持平稳。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的己烯-左旋肉碱、甲基戊二左旋肉碱、十六烷左旋肉碱、溶血磷脂(16∶0)和溶血磷脂(18∶1)的含量基本呈先降低再升高的趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的辛酰左旋肉碱和戊酰基左旋肉碱的含量变化相对平稳,只有第3天左右显著升高,并有显著性差异。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、十一烷左旋肉碱和溶血磷脂(18∶0)的含量变化整体呈先升高再降低而后升高的趋势。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中组氨半胱氨酸和L-赖氨酸的含量在睡眠剥夺的前5天均无显著性变化,组氨半胱氨酸在第7天显著降低并在之后快速升高,L-赖氨酸在第7天左右迅速降低。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的己左旋肉碱的含量变化趋势幅度较大,在第1天至第7天急速上升,并在第7天至第9天保持稳定。
  正离子模式下,大鼠脑脊液中的硬脂酰左旋肉碱的含量变化呈下降趋势,在第3天左右有短暂的小幅度升高。
  在正离子模式下筛选出的25个离子中,L-色氨酸、L-组氨酸和组氨半胱氨酸与睡眠有关。
  在有关睡眠的代谢产物中,大鼠脑内组氨半胱氨酸的含量虽有波动但始终上升,猜测其为睡眠因子,组氨半胱氨酸与睡眠的关系,需要通过药效学试验,进一步研究证实。
  2.2负离子模式下,基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
  根据PLS-DA得分图呈现出的分组趋势如下:空白组和慢性睡眠剥夺1天的样品、慢性睡眠剥夺3天和5天的样品与慢性睡眠剥夺7天和9天样品离散开。经过交叉验证,在经过标签打乱后累积R2y由0.74下降到0.58,累积Q2由0.41下降到-0.034,模型不存在过拟合现象,模型中分组信息可信,有必要进一步对差异性代谢产物进行分析。
  筛选出的内源性代谢产物有:柠檬酸、d半乳糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸、L-酪氨酸、琥珀酸、(R)-3-羟基-十六烷酸、磷脂(O-16∶0/2∶0)。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的d半乳糖、L-天冬氨酸和L-谷氨酸盐的含量变化趋势大体均呈先降低,而后升高,再下降的趋势。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的L-丝氨酸、柠檬酸、琥珀酸和磷脂(O-16∶0/2∶0)的含量先升高再降低,在第7天左右最大,而后急速降低。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的L-酪氨酸的含量整体呈下降趋势,差异显著。
  负离子模式下,大鼠脑脊液中的(R)-3-羟基-十六烷酸的含量变化相对平稳,只有第5天左右显著升高。
  在负离子模式下筛选出的9个离子中,L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸、L-酪氨酸与睡眠有关。
  在有关睡眠的代谢产物中,大鼠脑内的L-丝氨酸的含量在睡眠剥夺的前7天始终上升,猜测其为睡眠因子,L-丝氨酸与睡眠的关系,需要通过药效学试验,进一步研究证实。
  结论:
  1.慢性睡眠剥夺会使大鼠脑脊液中的多种内源性代谢产物发生一定变化,且变化趋势不一致。
  2.通过UPLC/Q-TOF-MS检测技术,在正离子模式下,在大鼠脑脊液中检测到25个内源性代谢产物,在负离子模式下,检测到9个内源性代谢产物。
  3.这些代谢产物中,组氨半胱氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸和L-酪氨酸与睡眠有关,其中L-组氨酸和L-丝氨酸随着睡眠剥夺的进行含量升高,猜测其为睡眠因子。
[博士论文] 陈茂启
生物医学工程 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:运动单位(Motor Unit,MU)是神经肌肉控制系统的最小功能单位。表面肌电信号(Surface Electromyogram,SEMG)是肌肉兴奋时所募集的运动单位产生的运动单位动作电位序列(Motor Unit Action Potential Trains,MUAPT)经过肌肉、皮下脂肪以及皮肤组织等的滤波作用,在皮肤表面采集电极处叠加形成的信号。表面肌电信号的分解则是将表面肌电信号分解成其基本组成成分——运动单位动作电位序列的过程。肌电分解可以获得单个运动单位的募集和发放信息,以及运动单位动作电位(MUAP)的波形信息,进而能够了解单个运动单位在中枢神经系统中的活动状态,从根本上研究神经系统的运动控制策略。因此,研究表面肌电信号分解技术对神经肌肉系统的运动控制机理的研究和临床应用诊断均有着重要的意义和价值。
  由于表面肌电信号的信噪比低、波形叠加严重,分解表面肌电信号十分困难。高密度柔性表面电极阵列的兴起和应用,使得表面肌电信号的分解成为可能。本文基于盲源分离技术(Blind Source Separation,BSS),提出了全新的高密度表面肌电信号分解的新框架,并对所提框架进行了验证。本文的主要研究内容和成果如下:
  (1)提出了基于FastICA的高密度表面肌电分解的新框架——逐步独立分量剥离法(Progressive FastICA Peel-off,PFP)。该框架的分解过程可以看成是运动单位发放时间序列集合逐渐扩充的过程。整个框架基于线性卷积模型。首先利用FastICA算法逐个估计出运动单位发放时间序列;再通过剥离策略利用发放时间序列估计出这些运动单位的动作电位序列并将它们从原始信号中剥去,以减少已经识别的运动单位对FastICA收敛性的影响;接着在剥离后的残余信号中利用FastICA继续找到更多的运动单位发放时间序列。不断重复这样的剥离步骤,从而最终实现了高产量的表面肌电信号的分解。为了保证剥离法的准确性,在框架中还引入带时域约束的Constrained FastICA算法来评估所分解出的发放时间序列并纠正其中可能的错误或遗漏的发放。以上因素结合在一起使得整个框架具有良好的分解性能。
  (2)基于PFP框架提出了自动化的表面肌电分解方法——Automatic Progressive FastICA Peel-off(APFP)。APFP针对PFP框架中的非自动化部分进行了自动化的改进。具体地,提出了偏度结合迭代阈值法的办法来自动设置阈值从FastICA的输出中提取运动单位发放时间序列,同时引入无监督的寻谷聚类方法对FastICA的输出中的发放波形进行聚类,以提高分解的产量和准确性。提出了有效的参数约束和缓存策略来对所提出的运动单位发放时间序列进行最后的筛选和鉴定。所有的自动化细节的改进很好地与PFP框架结合起来,并且实现了与人工分解相似的性能,最终实现了自动、高效、准确的表面肌电信号分解算法。
  (3)对本文研究所提的表面肌电分解框架进行了全面、详细的验证。利用仿真的表面肌电信号对算法的性能与准确性进行了定量的分析和验证;在正常受试者和部分神经肌肉疾病患者的信号上实现了PFP/APFP框架的双源法验证;并与国际学术界比较公认的卷积核抵消算法(Convolution Kemel Compensation,CKC)的分解结果进行了对比。所有的结果均表明PFP/APFP框架是可靠准确的表面肌电分解算法。
  本研究工作在实现了自动化的表面肌电分解同时,也给表面肌电信号分解的研究(算法、验证以及应用)提供了一些新思路。
[硕士论文] 王清华
应用心理 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探究催眠感受性与催眠效果以及人格特征的关系。
  方法:第一部分:催眠感受性与催眠效果的关系研究。检测16名右利手高催眠感受性被试和5名右利手低催眠感受性被试在安静状态和催眠状态(催眠引导后,唤醒前)下大脑额叶氧合血红蛋白(HbO)、脱氧血红蛋白(HbR)以及总血红蛋白(HbT)的相对浓度,并用主观体验问卷测查被试在意识清晰度、注意范围、意志状态、躯体感觉等维度上的主观体验程度。
  第二部分:催眠感受性与人格的相关研究。使用哈佛群体催眠感受性量表(HGSHS:A)、中国大五人格问卷-简版(CBF-PI-B)对114名健康大学生被试进行施测后,比较不同催眠相关经历及不同性别被试的催眠感受性差异;分析催眠感受性与人格各因子之间的相关关系,以及催眠相关经历和性别对催眠感受性与人格间关系的影响。
  结果:第一部分:1、不同催眠感受性的血红蛋白浓度变化差异性:不论在安静状态还是催眠状态下,不同催眠感受性被试三种血红蛋白浓度相对量都没有显著的组间差异。2、不同催眠感受性的主观体验差异性:催眠感受性在除躯体感觉外的其他三个维度及总分上均有显著的主效应(意识清晰度:F=5.051,p<0.05;注意范围:F=10.342,p<0.01;意志状态:F=7.643,p<0.05;总分:F=14.812,p<0.001),且高催眠感受性的得分更高。3、不同状态(催眠状态vs安静状态)下血红蛋白浓度变化差异性:左侧背外侧前额叶的氧合血红蛋白浓度相对量在催眠状态下比在安静状态下有显著的增加,相对浓度变化曲线图也显示出这种变化。4、不同状态(催眠状态vs安静状态)下主观体验差异性:状态在主观体验问卷所有维度及总分上都具有显著的主效应(总分:F=23.752,p<0.001;意识清晰度:F=16.206,p<0.001;注意范围:F=6.081,p<0.01;意志状态:F=16.515,p<0.001;躯体感觉:F=12.045,p<0.01);且催眠状态下的得分更高。催眠感受性与状态在躯体感觉上有显著的交互效应(F=5.87,p<0.05),只有在催眠状态下,高催眠感受性在该项目的得分更高;只有高催眠感受性被试的躯体感觉得分经催眠后有了显著的增加。
  第二部分:1、催眠感受性在催眠相关经历和性别上的差异性:催眠感受性无性别差异,也没有“是否读过被催眠小说”或“是否认识被催眠的人”的差异性。“以前被催眠过”的被试(6.000±1.803)比没有该经历的被试(5.049±2.037)报告了更深的催眠深度(t=2.334,p<0.05)。2、人格与催眠感受性的关系:宜人性与主观印象部分总分(r=0.199,p<0.05)、“头向前垂下”(r=0.204,p<0.05)、“右手固定”(r=0.315,p<0.01)有显著的正相关;与其他主观体验部分总分(r=0.196,p<0.05)以及“看起来在整个过程中我停留在一个稳定的催眠水平上”的体验程度(r=0.219,p<0.05)有显著的正相关;只对男性群体客观反应部分“头向前垂下”行为有正向预测作用;只对“以前被催眠过”群体的催眠深度有正向预测作用。外向性与主观体验部分“闭眼”行为有显著的负相关(r=-0.202,p<0.05);与客观反应部分“十指紧锁”行为有显著的正相关(r=0.263,p<0.01);只对女性群体客观反应部分“头向前垂下”行为有正向预测作用。开放性与主观内在反应部分“头向前垂下”的无意识程度具有显著的正相关(r=0.305,p<0.01)。严谨性与主观内在反应部分“催眠后遗忘”的无意识程度有显著正相关(r=0.256,p<0.01);与其他主观体验部分“我感到我比平常有更大的做事和理解事情的能力”的体验程度有显著的正相关(r=0.224,p<0.05)。神经质与“左手下沉”行为发生的无意识程度有显著的负相关(r=-0.231,p<0.05)。
  结论:1、不同催眠感受性被试在意志状态、意识清晰度、注意范围上的体验不同,对躯体感觉的体验受状态的影响。2、不同催眠感受性被试的额叶活动状态相似。3、左侧背外侧前额叶皮层功能变化与催眠状态有关。4、催眠感受性与人格具有弱相关关系,人格可以在一定程度上预测催眠感受性,其预测效果受催眠相关经历或性别的影响。
[博士论文] 董凤云
临床检验诊断学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 双氢青蒿素抗血管新生分子机制的研究
  血管新生(angiogenesis)是指先前已经存在于组织的成熟血管在外界作用下生长形成新的微血管的过程。血管新生涉及到多个生理过程,主要包括血管内皮细胞的激活,增殖,迁移,分化,成熟及小管形成等。血管内皮细胞(endothelialcell)在血管新生过程中起关键作用。异常的血管新生表现为血管新生过度或血管新生缺陷,参与肿瘤,风湿病和糖尿病等疾病的发生发展。阻断异常的血管新生,无疑成为治疗血管新生性疾病的一个重要手段。
  青蒿素是从绿色青蒿植物里萃取的倍半萜烯内酯内过氧化物,广泛用作抗疟药物。青蒿素及其衍生物在细胞模型和动物模型中都显示出较强的抗血管新生作用。双氢青蒿素(Dihydroartemesinin,DHA)是一种青蒿素的半合成衍生物,水溶性高,在抗疟治疗中毒副作用较少,在实体肿瘤模型中已被证实具有抗血管新生作用,但这种效应的具体分子机制尚不明确,限制了其在临床治疗上的应用。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth fator,VEGF)是主要的促血管内皮细胞生长因子,VEGF在内皮细胞中与其受体VEGFR2结合后可以激活下游信号通路,并且促进血管新生。另外,细胞外信号调节激酶(Extracellularsignal-regulated kinase,ERK)信号通路可以诱导内皮细胞增殖。本研究假设DHA在内皮细胞中通过抑制VEGFR和ERK信号通路的激活来发挥抗血管新生作用。
  研究目标:
  (1)体外细胞学实验确认DHA对HUVECs增殖和迁移的作用;
  (2)体外细胞学实验确认DHA抗血管新生的具体分子学机制;
  (3)在小鼠视网膜血管新生模型中,确认DHA抗血管新生作用及其分子机制。
  研究方法:
  (1)质粒构建
  pGL3-basic多克隆位点载体用于构建包含VEGFR2启动子片段质粒和NF-κB突变质粒,其中VEGFR2启动子选择-115到+296片段,VEGFR2启动子的-90 NF-κB碱基序列由GGAGAGCC CC突变为AAAGAGCCTT。
  (2)对细胞进行转染与刺激
  对于剂量梯度实验,终浓度为0,1,5,25和100μMDHA分别刺激HUVECs;对于时间梯度实验,DHA刺激后的0,0.5,1,3,6,12和24小时进行下一步检测;为验证DHA是否影响NF-κB信号通路,本实验用终浓度为100μM的PDTC(NF-κB信号通路抑制剂)预刺激细胞1小时,以阻断NF-κB信号通路;为验证DHA是否影响ERK信号通路,本实验用终浓度为10μM的PD98059(ERK信号通路抑制剂)预刺激细胞1小时,以阻断ERK信号通路;对于质粒转染实验,六孔板每孔加0.75μg质粒,使用lipo3000转染试剂转染后进行后续实验。
  (3) MTT实验
  采用MTT增殖实验,检测不同浓度梯度DHA刺激HUVECs后的增殖能力;对于NF-κB信号通路的检测,细胞分为对照组(DMSO)、DHA组(25μM)、PDTC组(100μM)和PDTC+DHA组(100μM+25μM);对于ERK信号通路的检测,细胞分为对照组(DMSO)、DHA组(20μM)、PD98059组(10μM)和PD98059+DHA组(10μM+20μM),分别比较各组HUVECs的增殖能力。
  研究结果:
  (1) MTT实验和Transwell小室迁移实验结果表明,DHA以剂量依赖性方式抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖和迁移,且DHA终浓度为20-25μM或再高浓度的情况下,效果明显。
  (2) WB和qRT-PCR实验结果表明,DHA特异性下调HUVECs中VEGFR2蛋白和mRNA的表达,对VEGFR1的表达无明显影响作用;DHA下调ERK1/2,p-ERK1/2,c-fos和c-myc蛋白和mRNA的表达,抑制ERK信号通路的激活。
  (3) WB实验结果表明,DHA可使HUVECs细胞质中的IκB-α蛋白表达显著增加,使细胞核中NF-κB p65蛋白表达显著降低,抑制NF-κB信号通路的激活;免疫荧光结果直观表明DHA可抑制NF-κB p65的核移位来抑制NF-κB信号通路的激活。
  (4)双荧光素酶报告基因检测结果表明,DHA可显著降低VEGFR2启动子活性;染色质免疫共沉淀实验结果证实,DHA通过特异性减少NF-κB p65与VEGFR2启动子的结合,来降低VEGFR2启动子活性,导致VEGFR2表达降低。
  研究结论:
  DHA通过抑制NF-κB信号通路,以VEGFR2蛋白为作用靶点,发挥其抗血管新生作用;DHA通过抑制ERK信号通路调控内皮细胞的增殖。
  第二部分 镉对血管内皮细胞通透性的影响及分子机制的研究
  随着我国工业的快速发展,重金属污染事件层出不穷,引发公众的广泛关注和担忧。镉是常见的重金属污染物之一,被美国毒物管理委员会(ATSDR)列为第六位危害人体健康的有毒物质,半衰期长达10-30年。镉具有易富集的特性,易在人体内特别是肝脏和肾脏内蓄积。镉摄入的主要途径是吸烟及误食镉污染食品。依据镉暴露的剂量大小和镉暴露的时间长短可导致不同程度的慢性镉中毒,对包括肾、肺、肝、脑、睾丸、骨骼、血液及血管等在内的多种组织和器官造成长期损伤。
  镉经过循环系统进入人体各个组织。血管内皮是直接接触进入人体毒素的器官。镉通过呼吸或其它途径进入人体循环系统后,以自由离子或与血浆蛋白结合形成复合体的形式存在血液循环中。血管内皮细胞是首当其冲的受害细胞,是镉的一个重要靶点。高浓度镉可直接杀伤血管内皮细胞,低浓度镉虽对血管内皮细胞的活力没有明显影响,但可导致血管屏障受损。虽然镉的毒理学研究开展很早,但大部分研究集中在长时间镉蓄积上,对一过性低浓度镉暴露损害血管内皮细胞的研究较少。
  血管通透性的维持主要依赖血管内皮的完整性,粘附连接在维持血管内皮细胞通透性方面起主要作用。血管内皮细胞钙粘素(VE-cadherin)与β-catenin形成连接复合体,是粘附连接的支架蛋白。VE-cadherin和β-catenin从细胞粘着连接处分离可导致内皮细胞通透性增高。p38 MAPK信号通路在调控内皮细胞通透性方面起重要作用。本研究假设重金属镉可以通过p38 MAPK信号通路调控血管内皮细胞通透性。
  研究目标:
  (1)确认环境毒物氯化镉(CdCl2)对内皮细胞通透性的损害作用;
  (2)确认p38 MAPK信号通路在调控CdCl2诱导内皮细胞高通透性中的作用。
  研究方法:
  (1)对细胞的刺激
  剂量梯度实验中,分别用终浓度为0,1,4,10,50和100μM的CdCl2刺激HUVECs;时间梯度实验中,分别在刺激后的0,1,2,6,12,24和48小时进行检测。后续实验中选择终浓度为4μM的CdCl2进行刺激,刺激后24小时进行检测;为确认CdCl2对p38 MAPK信号通路的影响,加入终浓度为10μM的p38 MAPK信号通路抑制剂SB203850进行预刺激HUVECs1小时,以阻断MAPK信号通路。
  (2)台盼蓝染色
  采用台盼蓝染色,不同浓度CdCl2刺激HUVECs后,分别在刺激后的24小时和48小时检测各组HUVECs的活力变化。
  (3) MTT实验
  终浓度为4μM CdCl2刺激HUVECs后,采用MTT增殖实验,在不同时间点检测细胞的增殖能力。
  研究结果:
  (1)MTT和台盼蓝实验结果表明,当镉离子浓度低于4μM时,CdCl2对HUVECs的增殖能力和活力无明显影响作用;
  (2) Trasswell FITC-dextran通透性实验结果表明,终浓度为4μM CdCl2可导致HUVECs通透性增高。
  (3)WB实验结果发现,CdCl2刺激HUVECs后,细胞中p38和磷酸化p38(p-p38)蛋白的表达量明显增加,表明CdCl2刺激可激活p38 MAPK信号通路。
  (4) ECIs通透性实验和Trasswell FITC-dextran通透性实验表明,SB203850可有效阻断CdCl2诱导的内皮细胞间通透性增高现象。
  (5)免疫荧光实验结果发现,终浓度为4μM镉离子能使VE-cadherin和β-catenin在HUVECs细胞膜上重新分布,有效减少细胞连接处VE-cadherin蛋白的含量;而SB203580可有效逆转镉诱导的VE-cadherin和β-catenin重新分布。表明抑制p38 MAPK信号通路可阻断镉诱导的VE-cadherin和β-catenin蛋白在细胞膜的重新定位,改善细胞通透性问题。
  (6) ELISA结果发现,镉刺激HUVECs后,可使细胞中TNF-α的分泌明显增加,同时qRT-PCR实验结果发现,HUVECs中TNF-α基因表达量增加;而SB203580可有效减弱镉刺激所诱导的TNF-α升高。结果表明,抑制p38 MAPK信号通路可阻断镉诱导的HUVECs中TNF-α分泌和表达。
  研究结论:
  镉通过激活p38 MAPK信号通路增加HUVECs通透性,靶向抑制p38 MAPK信号通路可为镉污染相关疾病提供新的治疗方案。
[硕士论文] 董晓菲
口腔临床医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  高脂血症使得种植体的周围骨丧失增加,新骨质形成减少,但是机制不明。本实验借助RNA测序技术,筛选高脂血症大鼠种植体周围骨组织中差异显著的RNA分子,构建基因共表达网络,并研究高脂血症抑制种植体周围骨形成的可能调控机制。
  方法:
  1.20只约4周的雄性Wistar大鼠,随机均分为实验组和对照组,分别以高脂、普通饲料喂养。8周后,检测两组动物的血清脂质水平。确认实验组建模成功后,两组动物于双侧的股骨干骺端植入纯钛种植体。术后10天处死,获取包含种植体在内及其周围1mm骨组织的样本。
  2.分别取实验组和对照组的部分样本,经固定、包埋后获得硬组织切片,采用苏木素伊红染液染色后,观察结合界面和周围的成骨细胞、骨形成。
  3.取两组的部分样本行RNA测序,检测差异表达的信使RNA(messenger RNA,mRNA)、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)。通过基因本体论(Gene Ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书信号通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,推测这些RNA功能,建立lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA的共表达网络。聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-PCR)验证部分RNA的表达水平。
  4.8只约4周的雄性Wistar大鼠,均以高脂饲料喂养。按如上方法确认建模成功后,在种植术前三天,实验组肌注慢病毒载体构建的过表达的miR-193a-3p,对照组肌注阴性对照液。种植体植入后10天,取材并用RT-PCR检测miR-193a,Sdccag3,lnc MSTRG.97162.4,lnc MSTRG.78883.18和ALP、Runx2的表达水平。
  结果:
  1.实验组血脂浓度的平均值显著高于对照组的(P<0.05)。
  2.与对照组相比,实验组成骨细胞排列紊乱,数目较少,植体周围新骨生成降低。
  3.在两组中,有389mRNA,70miRNA,770lncRNA和7circRNA差异表达(P<0.05,差异倍率>2)。这些差异表达RNA的功能分析显示,retromer复合体、肌动蛋白细胞骨架等相关的生物学过程,以及成骨、成脂代谢相关的信号通路发生明显变化。
  4.建立与成骨相关的lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA共表达网络,RT-PCR显示这些RNA的表达水平与测序结果一致。
  5.过表达的miR-193a后,实验组miR-193a-3p的表达升高(P<0.05),Sdccag3、lnc MSTRG.97162.4、ALP、Runx2的表达降低(P<0.05),lnc MSTRG.78883.18的表达无明显差异(P>0.05)。
  结论:
  1.高脂血症使得大鼠种植体周围的骨形成减少。
  2.差异表达的mRNA,miRNA,lncRNA和circRNA构成基因共表达网络,调控高脂血症大鼠种植体周围骨形成。
  3.MiR-193a-3p抑制高脂血症大鼠种植体周围的骨形成,这种抑制作用可能通过lnc MSTRG.97162.4-miR-193a-3p-Sdccag3调控网络实现。
[硕士论文] 陈丽娟
眼科学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  TGF-β1/Smad信号通路是巩膜重塑的重要信号通路之一,Smurf2(Smad ubiquitination regulatory factor)是TGF-β1/Smad信号通路中的枢纽蛋白。本研究探讨Smurf2在人胚胎眼巩膜成纤维细胞(Human fetal scleral fibroblasts,HFSFs细胞)中表达,及TGF-β1作用下HFSFs细胞中Smurf2和效应蛋白COL1A1含量的变化,以期阐明TGF-β1对HFSFs细胞Smurf2通路的作用。
  方法:
  HFSFs细胞复苏并稳定传代后,用免疫细胞化学法检测细胞中Smurf2蛋白的表达;分别用不同浓度TGF-β1(0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml)处理HFSF细胞24h以及10ng/ml TGF-β1处理HFSFs细胞不同时长(1h、6h、12h、24h)后,用实时荧光定量法检测各组Smurf2mRNA和COL1A1mRNA表达水平;用蛋白免疫印迹(Western-Blot)法检测各组Smurf蛋白2和COL1A1蛋白的表达水平。
  结果:
  1.Smurf2在HFSFs细胞的表达:
  免疫细胞化学检测的结果显示HFSFs细胞中有Smurf2蛋白的表达;
  2.不同浓度TGF-β1干预对HFSFs细胞Smurf2和CoL1A1表达的影响:
  5ng/ml、10ng/mlTGF-β1干预组Smurf2mRNA表达上调(P=0.002、0.028)。1ng/ml和5ng/mlTGF-β1干预组Smurf2蛋白表达上调(P=0.011、0.037)。其中,10ng/mlTGF-β1干预组COL1A1mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01)。
  3.不同时长TGF-β1干预HFSFs细胞Smurf2和CoL1A1表达的影响:
  10ng/mlTGF-β1共培养HFSFs细胞1h、6h、12h、24h后,COL1A1mRNA24h干预组表达显著升高(P=0.033);COL1A1蛋白表达改变呈先增加后降低趋势,6h组COL1A1蛋白表达显著升高(P=0.003),12h表达呈下降趋势(P=0.121),24h组表达有所回升(P=0.017)。Smurf2mRNA和蛋白表达改变呈先增加后降低趋势,6h组Smurf2mRNA和蛋白的表达升到最高(P=0.024、0.044);而在24h下降至与未刺激无显著差异(P=0.750,>0.05)。
  结论:
  1.Smurf2蛋白在HFSFs细胞中有表达。
  2.10ng/mlTGF-β1干预早期促进Smurf2mRNA和蛋白的表达,可有效诱导HFSFs细胞I型胶原的合成。
  3.Smurf2蛋白可能参与调控HFSFs细胞中TGF-β1/Smad信号通路的调控。
[博士论文] 李青
生理学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:胰岛是胰腺的内分泌腺,其主要作用是感受体内的血糖水平并对其进行调节。胰岛在形态上是许多大小不等、形状不同的细胞团。其中主要的细胞类型包括α、β、δ、pp和ε等5种细胞。当人体内的血糖水平降低的情况下,比如在饥饿的状态下,胰岛α细胞会分泌胰高血糖素来促进体内的血糖水平升高。相反,如果当体内血糖水平升高的时候,胰岛β细胞会分泌胰岛素(Insulin,Ins)来降低体内的血糖水平。而δ细胞主要分泌生长抑素(Somatostatin,Sst),并以负反馈作用的方式影响α细胞和β细胞的激素分泌,从而形成一个精准的细胞调节环路。最近的研究表明,δ细胞作为胰岛细胞环路的一个重要组成部分,其功能的稳定对于维持血糖平衡非常重要。然而,胰岛δ细胞的功能在胰岛环路中的精确调控机制尚不清楚。
  CULLIN-RING连接酶复合物(CRLs)是目前研究发现已知的哺乳动物体内种类最多的一类E3泛素连接酶复合物,可以通过对底物进行泛素化修饰,从而改变蛋白功能或促进被修饰蛋白的降解,Cullin家族成员在此泛素连接酶复合物中起到支架蛋白的作用。本研究中利用Cre-Loxp重组酶系统,将Ins2-Cre小鼠或Sst-Cre小鼠与Cul4bfl/fl小鼠进行交配,得到了分别在胰岛β细胞或胰岛δ细胞中特异性敲除Cul4b的两种小鼠模型。随后检测了两种敲除小鼠的葡萄糖代谢中的相关指标,发现只有δ细胞中特异性敲除Cul4b的小鼠,表现出糖代谢受损。其基础血糖值与对照小鼠相比没有显著差异,但是餐后血糖水平显著升高。结合细胞实验,发现在δ细胞中Cul4b缺失导致生长抑素分泌增加的这一过程中,L型钙通道Cav1.2和腺苷酸环化酶AC6发挥重要作用。进一步的研究发现,在胰岛δ细胞中,CRL4B-PRC2复合物通过和胰岛δ细胞的特异性转录因子HHEX相互作用,表观遗传调控Cav1.2和AC6的表达水平,从而调节生长抑素的分泌。并且长时程的高糖或者旁分泌因子UCN3可以通过调控CUL4B和EZH2的表达,引起L型钙通道Cav1.2和腺苷酸环化酶AC6的表达变化,最终在胰岛稳态和血糖调节中发挥重要作用;同时,在人的胰岛δ细胞中,也验证了CUL4B表达下调或活力降低会促进生长抑素的分泌。
  目的:
  本研究的目的是通过构建分别在胰岛β细胞或δ细胞中特异性敲除Cul4b的小鼠模型,来研究CUL4B在胰岛细胞中的具体功能与作用。并结合多种基因工具小鼠,应用体内和体外实验,细胞生物学,生物化学等多种手段,研究CUL4B对胰岛稳态的调控作用及其分子机制,以及在各种生理刺激条件下CUL4B的功能和相关的作用机制。
  方法:
  1.Cul4b条件敲除小鼠的获得与鉴定
  Ins2-Cre+/-Cul4b4fl/Y(胰岛β细胞中特异性敲除Cul4b)小鼠和对照小鼠是由Ins2-Cre+/-小鼠和Cul4bfl/fl小鼠交配得到的;而Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y(胰岛δ细胞中特异性敲除Cul4b)小鼠和对照小鼠是由Sst-Cre+/-小鼠和Cul4bfl/fl小鼠交配得到的。在小鼠出生后的3周或4周的时候剪鼠尾,用相关试剂盒提取小鼠基因组DNA,并使用对应的引物进行PCR,依据最终PCR产物的分子量来鉴定其小鼠基因型。
  2.检测敲除小鼠的糖代谢水平以及葡萄糖耐量
  用Ins2-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠或Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠进行实验,将得到的敲除小鼠和对照小鼠进行禁食不禁水饥饿16小时之后,测量这些小鼠的基础血糖值并进行记录。然后重新喂食2小时,再次测量血糖值并记录,将两种敲除小鼠的糖代谢水平分别与对照小鼠进行比较。类似的,将敲除小鼠和对照小鼠进行禁食不禁水饥饿16小时之后,测量小鼠的基础血糖值并进行记录。然后对这些小鼠依次进行称重,并根据小鼠的体重计算出各自需要注射的葡萄糖溶液的体积(2g/kg),在给小鼠腹腔注射完对应量的葡萄糖溶液的15分钟,30分钟,60分钟,120分钟后,分别测量小鼠的血糖值并进行记录,将两种敲除小鼠的血糖变化情况分别与对照组进行比较。
  3.检测敲除小鼠的胰岛形态
  用Ins2-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠或Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y小鼠进行实验,处死小鼠后迅速取出敲除小鼠和对照小鼠的胰腺,称重,4%多聚甲醛固定后,分别用浓度为10%,20%和30%的蔗糖溶液对胰腺进行梯度脱水处理,之后对胰腺组织进行包埋并切片染色,所使用的—抗为Insulin和Somatostatin,并用染料DAPI对细胞核进行染色。在荧光显微镜下观察染色结果并进行统计分析,检测这两种敲除小鼠分别与对照组相比,其胰岛密度,β细胞质量和δ细胞数目这三项指标是否有显著差异。
  4.检测敲除小鼠中的相关激素水平
  检测小鼠血浆中的激素水平时,将Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y敲除小鼠与对照小鼠进行禁食不禁水饥饿16小时,然后进行尾部取血。并将小鼠进行重新喂食2个小时,再次进行尾部取血。将这些尾部取血得到的血液样本在室温静置30分钟,接着进行4℃离心,用枪头小心地吸取上清,然后分别用Insulin ELISA试剂盒和Somatostatin ELISA试剂盒,按照试剂盒提供的操作手册进行实验,检测血浆中的胰岛素和生长抑素的水平。
  检测胰岛中的总激素含量时,将Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y敲除小鼠与对照小鼠的胰岛分离出来之后,首先需要用低糖完全培养基进行培养,待分离出来的胰岛恢复状态后,第二天用酸乙醇裂解培养过夜的敲除小鼠和对照小鼠胰岛,离心取上清用Insulin ELISA试剂盒检测胰岛素的总含量。或用100℃高温煮15分钟,离心取上清用Somatostatin ELISA试剂盒检测生长抑素的总含量。
  检测胰岛的激素分泌水平时,将Sst-Cre+/-Cul4bfl/Y敲除小鼠与对照小鼠的胰岛分离出来之后,先用低糖培养基培养过夜待恢复状态,第二天用mKRBB缓冲液饥饿胰岛1小时,然后分别用高糖(20mM Glucose)或高钾(105mM KC1)刺激胰岛一定的时间,取上清分别用Insulin ELISA试剂盒或Somatostatin ELISA试剂盒,按照试剂盒里提供的操作手册进行实验,来检测刺激后敲除小鼠和对照小鼠胰岛中,胰岛素和生长抑素的分泌水平。
  5.检测原代胰岛δ细胞内钙离子水平
  通过荧光标记分离得到Sst-Cre+/-GFPfl/+Cul4bfl/Y小鼠和对照小鼠的原代胰岛δ细胞,首先加入Fura-2/AM溶液孵育细胞后,利用钙成像仪器检测在340nm和380nm波长交替激发后产生的光强度比值(F340/F380),通过光强度比值可以反映出胰岛δ细胞内钙离子的浓度变化。在给予原代胰岛δ细胞高糖或高钾刺激后,可以通过分析光强度比值检测胰岛δ细胞在接受刺激后细胞内的钙信号的发生频率以及细胞内钙离子浓度的改变。
  6.CUL4B稳筛细胞系的构建以及相关细胞实验
  构建CUL4B敲低的TGP52稳筛细胞系,通过ELISA的方法检测高糖引起的生长抑素分泌和细胞内cAMP水平的变化,通过Western blot和qRT-PCR实验检测钙通道和腺苷酸环化酶相关基因的mRNA以及蛋白水平。构建CUL4B过表达的TGP52稳筛细胞系,通过免疫共沉淀技术研究CUL4B对Cav1.2和AC6的调控。
  7.染色质免疫共沉淀(CHIP)实验
  通过CHIP实验研究CRL4B-PRC2复合物对Cav1.2和AC6的调控机制。分别检测CRL4B的重要成分CUL4B和DDB1,以及PRC2的重要成分EZH2,是否会和Cav1.2和AC6的启动子区域有结合,同时检测δ细胞特异性转录因子HHEX在这一过程之中是否参与发挥作用。
  结果:
  1.研究发现,在小鼠的胰岛β细胞中特异性敲除Cul4b后,对其糖代谢水平以及葡萄糖耐量没有影响。而胰岛δ细胞特异性敲除Cul4b的小鼠,其餐后血糖水平与对照小鼠相比明显升高,且葡萄糖耐量受损。
  2.发现,对于胰岛δ细胞特异性敲除Cul4b的小鼠,高糖和高钾引起的胰岛素分泌水平与对照小鼠相比明显降低,而生长抑素的分泌水平明显升高。
  3.通过对敲除小鼠分离出来的原代胰岛δ细胞进行钙离子检测,发现胰岛δ细胞中特异性敲除CUL4B后,高糖和高钾所引起的δ细胞钙频率和钙信号变化,与野生小鼠的胰岛δ细胞相比都有显著升高。
  4.构建了CUL4B敲低的TGP52稳筛细胞系,检测了相关基因的mRNA水平以及蛋白表达情况。发现敲低CUL4B之后,L型钙通道Cav1.2和腺苷酸环化酶AC6表达与对照组相比明显升高。并且在CUL4B敲低的TGP52细胞系中,发现由葡萄糖所引起的细胞内cAMP水平与对照组细胞相比有着明显升高
  5.构建了CUL4B过表达的TGP52稳筛细胞系,通过免疫共沉淀实验发现CRL4B-PRC2复合物可以和HHEX发生相互作用,共同调控Cav1.2和AC6的表达,同时也证明了该复合物对Cav1.2和AC6的调控机制具有细胞特异性。
  结论:
  通过对胰岛δ细胞系TGP52进行生理刺激,发现CRL4B-PRC2复合物可以通过调控Cav1.2和AC6的表达水平,进而影响胰岛δ细胞中生长抑素的分泌,以及对β细胞的负反馈调节作用。
[硕士论文] 卯怡杰
外科学(肾脏移植) 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目前临床上常用血肌酐、尿素氮等传统指标来评估供肾质量和预测肾移植术后肾功能恢复情况,但是这些指标的特异性和稳定性较差。因此,找出一些具有高灵敏性、高特异性的可以有效指导供体选择和预测移植物后肾功能的生物标记物具有很高的临床应用价值。
  有研究已经报道了一些生物标记物在供体器官功能评估方面的作用,如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾脏损伤因子1(KIM-1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2)、尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(uNAG)等为代表的新型生物标记物可以评估肾脏功能、预测肾脏损伤,因为这些生物标记物可由肾脏或者大部分由肾脏分泌,且在肾脏损伤后这些生物标记物的尿液或者血液浓度变化及时,因此它们能及时反映肾小球和肾小管的损伤。
  综上所述,本研究将分析供受体血液、尿液标本中的生物标记物浓度与传统临床指标血肌酐等之间的联系以及与生物标记物在供肾的穿刺组织标本中的表达量之间的联系,找出、归纳和总结生物标记物在评估心脏死亡器官捐献的供肾质量和预测移植术后肾功能的规律性的关系。
  目的:
  研究和评估供、受体的新型生物标记物与心脏死亡器官捐献的供肾质量和这些生物标记物与移植术后肾功能之间的关系。筛选出满足以下三个条件的标记物:1、能在潜在供者中筛选出合适供者;2、能较传统临床指标更灵敏、更特异性的评估供肾质量;3、能提前提示或预判移植肾功能的恢复情况。
  方法:
  1.伦理要求
  2.研究对象
  供体纳入标准:汉族、年龄>14岁或<65岁,无传染病病史,符合DCD捐献条件的供体。受体纳入标准:需要接受肾移植手术的终末期肾脏病的患者;受体排除标准:年龄<18岁,诊断为肿瘤、肝炎等传染病的患者。共有27例供体和接受他们肾脏的54例受体纳入本次研究。
  3.实验标本获取及检测方法
  (1)供体入院后留取其在捐献当天捐献手术前(D0)的血清、尿液标本;受体留取移植手术前、手术后1天、3天、7天、14天的血清、尿液标本,血清、尿液标本收集后经过预处理和保存后以供分析;留取供肾移植术前的肾脏组织标本。
  (2)ELISA定量分析:ELISA法定量分析供受体血清、尿液标本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾脏损伤因子1(KIM-1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2)、尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(uNAG)的含量。
  (3)移植术前留取的供肾活检组织行苏木精-伊红染色(H-E染色)染色和免疫组化测定:供肾活检组织H-E染色后根据Randhawa标准分级:免疫组化检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾脏损伤因子1(KIM-1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2)、尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(uNAG)在供肾活检组织中的表达情况。
  4.其他数据的收集
  记录供受体的一般特征信息,比如性别、年龄、病史、体重(kg)、血肌酐、供体的死亡原因、供肾的冷缺血时间等基本信息。
  5.实验分组与数据分析
  (1)血清、尿液标本中生物标记物浓度
  ①根据供肾是否发生急性肾损伤将供体分为急性肾损伤组(AKI组)和非急性肾损伤组(非AKI组),比较两组血清、尿液标本中生物标记物含量差异。
  ②根据受体移植术后7天肌酐浓度将受体分为移植肾功能降低组(RGF组)和移植肾功能快速恢复组(IGF组),其所对应的供体也被分为RGF组和IGF组,分别分析供体两组之间和受体两组间的血清、尿液标本中生物标记物的含量差异,以及评估供、受体生物标记物与发生RGF之间的关系。以上两种分组如下图所示:
  (2)分析生物标记物在供肾活检组织中的表达量差异情况。
  6.统计学分析方法
  结果:
  1.血清、尿液标本中生物标记物浓度
  (1)供体AKI组和非AKI组比较:AKI组的血TIMP-2、血KIM-1、尿TIMP-2和尿KIM-1浓度比非AKI组增高(P值分别为0.001、0.043、0.005、0.047)。
  (2)供体RGF组与IGF组比较:RGF组的血NGAL、血TIMP-2比IGF组增高(P值分别为0.048、0.034)。
  (3)RGF的受试者工作特征曲线(ROC曲线):供体移植前(D0时)的血TIMP2+uNAG+Scr浓度曲线下面积为AOROC=0.871,P=004,单独的Scr浓度曲线下面积(AORUC=0.714,P=0.097)
  (4)受体术后第三天(D3)的血TIMP-2浓度与受体术后第7天eGFR、肌酐密切相关;做出受体术后第三天(D3)的血TIMP-2浓度对RGF的预测价值ROC曲线(AUROC=0.99,95%CI0.97-1.00,P<0.001)。
  2.生物标记物在移植前获取的供肾活检组织中的表达差异:
  共留有10个供肾活检组织标本,TIMP-2在10个活检组织中都有表达,依据半定量分析计分分析法(注:以染色强度和阳性细胞数的百分比综合计分,组织切片中胞质被染色为淡黄色至棕褐色者记为阳性细胞标志,染色强度与阳性细胞百分比的乘积记为统计总分,分为:0分为阴性,1-4分弱阳性,5-8分为中度阳性,9-12分为强阳性),结果如下:TIMP-2表达评分为0有6个,表达评分为1有2个,表达评分为2的有1个,表达评分为3有1个,在RGF组和IGF组中TIMP-2表达差异无统计学意义。
  结论:
  1.供体D0时的TIMP-2、KIM-1浓度能评估较好的评估供肾质量。
  2.供体D0时的血TIMP-2、uNAG、血肌酐浓度能诊断受体是否发生RGF(移植肾功能降低);血肌酐水平和供体发生RGF间的关系弱于血清TIMP-2和uNAG水平与RGF的关系,血清TIMP-2和uNAG能更好的预测RGF的发生。
  3.受体移植术后第三天的血TIMP-2浓度能提前预测术后7天的移植肾功能,即能诊断移植肾是否会发生RGF。
[硕士论文] 曹春静
生物工程 山东大学 2018(学位年度)
摘要:白蚁是一种网翅目的社会性昆虫,根据肠道是否存在鞭毛虫可以分为高等白蚁(无鞭毛虫)和低等白蚁(有鞭毛虫)。白蚁主要生活于阴暗潮湿的环境中,多以植物(木头、树叶等)以及植物降解物—腐殖质为食。由于其生活环境的复杂性,比较容易受到外来微生物的侵染,所以白蚁在协同进化过程中形成一种独特的免疫防御机制。此外,白蚁具有惊人的消化降解能力以及破坏性,并且具有高效的木质纤维素降解能力,所以白蚁具有丰富的消化酶基因,是发掘新功能基因以及新型水解酶的模式昆虫。
  本文的研究对象黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi),是一种与真菌共生的高等白蚁,广泛分布于我国南方。黄翅大白蚁能够特异性在白蚁巢内培养鸡枞菌并以此为食,因此与体外真菌和肠道微生物共同构成了三者共生体系。由于它比较特殊,实验室前期对其肠道各部分进行转录组测序,发现许多注释为木质纤维素的基因,包括内切葡聚糖酶(MbEG)、β-葡萄糖苷酶(MbBG)、甘露聚糖酶、漆酶等;此外,还有许多高表达的其他基因如β-1,3(4)-葡聚糖酶基因、几丁质酶基因等。其中MbEG、MbBG已成功异源表达,并对酶学性质进行了研究,但是关于白蚁来源的β-1,3(4)-葡聚糖酶和几丁质酶研究较少。为了探究这些基因在黄翅大白蚁中发挥的作用,我们进行了以下研究:
  1.对M.barneyi肠道各个部分的转录组数据进行总结分析,着重寻找一些高表达的功能基因。其中在转录组数据中共发现141个糖苷水解酶基因(GHs),分别属于29个家族,47个糖基转移酶基因(GTs),112个多糖裂解酶基因(PLs),6个糖酯酶基因(CEs),8个起辅助活性酶基因(AAs);206个与几丁质降解合成相关基因,24个固氮酶基因等。并且从中发现一些高表达的几丁质酶基因和β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,为了探究它们在白蚁中的功能,期望发掘新型水解酶,我们对其进行生物信息学分析,并进行了克隆表达以及酶学性质分析。
  2.β-1,3(4)-葡聚糖酶基因的克隆表达与酶学性质分析。对前期M.barneyi转录组数据中被注释为β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(Mbbgl)的序列进行生物信息学分析,并且通过q-PCR和RT-PCR等技术对其优势表达部位分析,确定该基因为M.barneyi自身来源。以M.barneyi前肠唾液腺的cDNA为模板,通过PCR技术扩增得到Mbbgl基因,全长1085bp,其中可读框(ORF)1035bp,编码349个氨基酸和一个终止密码子,有一个24个氨基酸组成的信号肽,预测的分子量大小为40.21kDa,去除信号肽后的分子量为37.65kDa,等电点(pI)为4.78。Blast分析发现该序列与台湾乳白蚁(Coptotermes formosanus)β-1,3(4)-葡聚糖酶序列同源性最高为83%,其次是内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)为81%。构建原核表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达和纯化。得到重组蛋白Mbbgl,底物特异性分析,其最适底物为昆布多糖。以昆布多糖为底物其最适温度和最适pH分别是50℃和5.5,对其动力学参数测定,其Vmax为21.83U/mg,Km为3.46mM。利用TLC分析Mbbgl作用方式,发现其不仅具有内切酶活性,而且还具有外切酶的活性,可以从非还原端降解昆布寡糖产生单糖,同时还有具有微弱的糖基转移酶的活性。由于其作用方式的新颖性,对其蛋白结构同源建模分析,并通过密码子优化使其能更好的在原核表达系统中表达。
  3.M.barneyi来源几丁质酶基因MbCht的表达。将黄翅大白蚁来源的表达量较高的3个几丁质酶基因尝试在毕赤酵母GS115中进行异源表达。结果显示MbCht基因可以在毕赤酵母中表达,Western blotting可以检测到信号,其中重组蛋白MbCht1有降解胶体几丁质的活性,但是活性较弱,MbCht2和MbCht3没有检测到活性。
  总之,本文首先对黄翅大白蚁转录组数据进行了总结分析,对β-1,3(4)-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因进行了克隆表达,并对重组酶进行了初步的酶学性质分析,利用同源建模分析了Mbbgl的蛋白结构。
[硕士论文] 王贵松
机械工程 山东大学 2018(学位年度)
摘要:随着现代社会的发展,科学技术取得了日新月异的成就,如何利用现有的科学技术手段提高人民的生活质量成为日益关注的焦点。失眠、精神疾病及脑力疲劳等已成为威胁人体健康的主要危害因素。脑电图(Electroencephalogram,EEG)可以直接反应大脑的神经活动状态,广泛应用于精神疾病、脑力疲劳以及失眠的监测、检测及治疗。脑电信号存在节律性极强的特点,不同的脑电节律代表大脑不同的生理和精神活动状态。脑电节律因具有“节律同步化”效应,如何调节脑电节律从而改变生物体的生理甚至精神状态是一项关系到人体健康的重要课题。次声作为一种与脑电频率相吻合的物理因子,与其他物理因子一样,可对生物体脑电带来深刻影响。探究次声波对于生物体脑电的影响及规律对于开展次声的积极应用具有重要意义,同时对于减少次声对于生物的危害和进行次声防护具有重要的价值。
  长期以来,关于次声的研究主要认为长时间、高强度的次声暴露会导致人体的各种不良反应,甚至对人体带来伤害。哲学的辩证思维认为事物都具有两面性:次声也不例外,适当的次声刺激也会对生物体带来积极影响。本文的研究内容主要包含以下4个方面:
  (1)经过查阅研究次声资料,通过分析对比现有次声暴露实验的原理及方式,总结造成次声有害作用或有益作用产生的差异性因素。根据本文拟研究的局部次声暴露大脑皮层实验的要求,设计并搭建次声局部暴露生物(新西兰兔)大脑皮层实验平台。
  (2)首先通过单一频率6Hz、10Hz、16Hz声压级为130dB的次声频率对比实验分析得出不同频率作用下脑电的变化特性规律;其次,通过10Hz不同声压级100dB、130dB的次声声压级对比实验分析得出不同声压级作用下的脑电的变化特性规律;最后,通过复合频率(8~13Hz)不同声压级下100dB、130dB的次声对比实验分析不同频率作用方式下脑电的变化特性规律与单一频率与复合频率相同声压级下脑电的变化特性规律。
  (3)利用快速傅里叶变换,实现脑电信号节律波功率谱的提取,并分析刺激前后不同节律脑电的功率谱变化,研究脑电信号多个节律的相对平均功率在实验过程中的变化规律,实现次声刺激下脑电节律波的线性特征分析。
  (4)利用统计学的单因素方差分析,研究次声波局部作用于生物体大脑皮层的影响及机理。
  基于脑电节律在受到外界刺激时会产生“节律同步化”的效应,利用次声局部作用于大脑皮层对于生物体的影响及实验结果;在对脑电节律的相对平均功率进行定性定量分析的基础上,利用统计学分析(独立样本t检验、单因素方差分析(ANOVA))分别对不同电极、样本、声压级、频率及性别判断次声引起变化的显著性。研究结果表明,130dB与100dB的次声相比,单一频率次声与复合频率次声相比,可明显诱发脑电产生节律变化,使脑电产生同步化效应,可明显调节生物体脑电的主要节律,改变生物体大脑的生理活动状态。不同样本之间在次声暴露时脑电节律存在巨大差异,需进一步分析研究。同时分析得出性别对实验结果无明显影响,不同电极之间的脑电节律相对平均功率不存在明显差异。
[硕士论文] 朱晓琳
内科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  N型乙酰胆碱受体(nAChRs)在哺乳动物小脑皮层神经环路中大量存在,尼古丁可以活化nAChRs并可以通过调节其它受体及递质传递来影响小脑皮层各种神经元的活动,但活化尼古丁受体对哺乳动物小脑皮层分子层感觉信息传递的影响还不清楚。因此,本研究将在活体动物上观察小脑表面局部灌流给予不同浓度的尼古丁对感觉刺激诱发小鼠小脑分子层场电位活动的影响,探索尼古丁对小脑皮层分子层感觉信息传导的影响机制。
  方法:
  选取周龄约为6-8的ICR小鼠,测量其体重并按照1.3g/kg的剂量在小鼠腹腔行乌拉坦麻醉。为了避免实验中小鼠呼吸道堵塞,待角膜反射消失后进行气管插管。将小鼠放置在定制的立体定位仪上,经一系列预处理后,小心的在小脑CrusⅡ区行钻孔术,直接约1-1.5mm,确保不伤及脑组织,并去除表面颅骨。在显微镜下小心去除硬脑膜。用特制吹风装置向同侧胡须垫吹风(30-60 ms,50-60psi)即为三叉神经感觉刺激,由计算机掌控吹风刺激并同步进行电生理记录;此次只采纳分子层场电位数据,饱含着20-30微升ACSF的电极,用来记载,其阻抗为4-6 MΩ;小脑皮层表面通过蠕动泵给予尼古丁进行灌流;经膜片钳放大器及数据软件收集记载感觉刺激诱发分子层场电位变化;应用Clampfit10.3软件进行数据分析,并采用SPSS17.0分析软件进行数据统计学分析,给药前后均数的比较采用T配对检验,P<0.05认为有统计学差异。
  结果:
  1.麻醉的小鼠,朝向其触须垫,给予鼓风处理,可诱发小脑区分子层产生场电位反应,呈现出在较大的正极性波P1之前有个短暂负极性波N1;在脑表面灌流Nicotine(1mM)后,小脑皮质分子层抑制性成分P1的振幅以及曲线下面积(AUC)明显降低(P<0.05)差异有统计学意义。
  2.尼古丁对吹风刺激引起的小鼠小脑分子层场电位的抑制性成分P1振幅值的降低存在浓度依赖性。浓度-反应曲线显示随着尼古丁浓度的增加吹风刺激引起的P1的振幅值的降低程度越明显,引起感觉刺激变化的最小浓度是10微摩尔,最大浓度为2毫摩尔,半数有效浓度(EC50)为1.62毫摩。
  3.尼古丁对感觉刺激诱发的分子层场电位反应的潜伏期没有显著影响,但导致抑制性成分P1的开始时间提前,波形上升时间明显延长,但波形延迟时间明显缩短。
  4.此外,尼古丁导致感觉刺激诱发小脑皮质分子层负极性波N1的振幅和AUC明显降低,提示尼古丁影响分子层神经环路的信息整合与传递。
  结论:
  尼古丁抑制小脑皮层分子层感觉信息传递与整合。
[硕士论文] 洪春美
内科学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:[目的]
  应用在体的电生理记录技术和神经药理学方法来研究促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)对感觉刺激诱发小鼠小脑皮层分子层场电位反应的影响机制。
  [实验材料与方法]
  选取周龄约为6-8的昆明小鼠,测量其体重并按照1.3g/kg的剂量在小鼠腹腔行乌拉坦麻醉。为了避免实验中小鼠呼吸道堵塞,待角膜反射消失后进行气管插管。将小鼠放置在定制的立体定位仪上,经一系列预处理后,小心的在小脑CrusⅡ区行钻孔术,直径约1-1.5mm,确保不伤及脑组织,并去除表面颅骨。在显微镜下小心取出硬脑膜,并使用蠕动泵将氧合的人造脑脊髓液(人造脑脊髓液,ACSF)连续滴注在暴露的脑表面。使用特殊的吹风机将头发(50-60毫秒,50-60磅/平方英寸)吹至同一胡须缓冲垫,作为由计算机刺激的三叉神经感觉,以控制头发刺激并同步电生理学记录;电生理记录选择分子层场电位,用于记录的电极填充ACSF20-30μL,使其电极阻抗为4-6MΩ。使用膜片钳放大器和数据软件记录分子层场电位的感觉刺激变化。数据分析使用Clampfit10.3软件进行。使用SPSS软件进行统计分析。使用T检验配对测试来比较施用前后的平均值。P<0.05被认为有统计学意义。
  [结果]
  (1)在麻醉状态下,小鼠触角垫的毛发刺激引起小脑分子层的场电位反应,其表现为短负极性波(N1)后的大正极性波(P1);在脑表面灌流CRF(300 nM)后,小脑皮质分子层抑制性成分P1的振幅和半宽值均显著增加,与给药前比较差异显著(P<0.05)。
  (2)脑表面灌流CRF影响P1的波形动力学,导致上升时间缩短,延迟时间增加,二者给药前后比较均有显著性差异(P<0.05)。
  (3) CRF对吹风刺激诱发小鼠小脑分子层场电位的抑制性成分P1振幅值的影响具有浓度依赖性。浓度-反应曲线显示随着CRF浓度的增加,吹风刺激引起的P1的振幅值的增加程度越明显,引起感觉刺激变化的最小浓度是10 nM,最大浓度为1μM,半数有效浓度(EC50)为234 nM。
  (4)在非选择性CRF-R阻断剂的存在下,CRF对对吹风刺激诱发小鼠小脑分子层场电位的抑制性成分P1振幅值的影响消失,P1的振幅值和半宽值没有升高,表明CRF通过活化CRF受体增加吹风刺激诱发小鼠小脑分子层场电位P1的振幅和半宽值。
  (5)在CRF-R阻断剂的存在下,脑表面灌流CRF对P1的波形动力学没有显著影响,上升时间和延迟时间与给药前比较均没有显著性差异。
  [结论]
  CRF通过活化CRF-R增强感觉刺激诱发的小鼠小脑皮层分子层场电位的抑制性成分P1,影响其波形动力学,提示应激刺激可通过CRF受体作用于小脑皮层分子层神经环路,影响外部信息的整合与传递。
[硕士论文] 胡莉
影像医学与核医学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:应用磁共振扩散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)和弥散峰度成像(diffusion kurtosis imaging,DKI)技术,研究健康青年人KIBRA-C等位基因携带者和非携带者的脑微观结构差异,探讨KIBRA基因多态性对其脑微观结构的影响,为进一步研究KIBRA基因多态性与阿尔茨海默病之间的相关性奠定基础。
  方法:入组标准:健康年轻志愿者,年龄18-30岁;(2)经中国人利手量表评价为右利手;(3)汉族且母语为汉语;(4)视力或矫正视力正常,无色盲;(5)无躯体、精神或内分泌疾病史;(6)无药物或酒精滥用史;(7)没有正在服用任何药物;(8)无MRI检查禁忌证;(9)常规头颅MRI扫描无器质性病变。选取符合入组标准的100例志愿者(平均年龄25±1.5岁,男性40例,女性60例),抽取外周血5ml,检测受试者KIBRA基因rs17070145位点C/T基因型;然后将志愿者分成两组,一组为KIBRA-C组被试,另一组为KIBRA-TT纯合子被试。所有被试者均进行MRI T2WI、3DT1、DTI及DKI序列扫描。DTI数据处理:首先进行图像预处理:图像格式转换,用dcm2niigui软件将原始DICOM数据转换为NII格式。然后用FSL4.0,(http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl)进行涡流校正、头动校正、剥脑,保证数据有较好的一致性。利用DTIFIT工具计算出轴向扩散系数(axial diffusivity,AxD)、径向扩散系数(radial diffusivity,RD)、平均扩散系数(mean diffusivity,MD)及部分各向异性性系数(Fractional anisotropy,FA)。将各受试者的FA图非线性配准到MNI空间平均FA模板图(FMRIB-58)。各被试者配准后的FA图压缩生成平均FA骨架图。然后将每个配准后的FA图投射到平均FA骨架图,生成各自的FA骨架。所有受试者的FA图非线性配准到AxD、RD及MD图,生成各个指标配准后的参数图并投射到平均FA纤维骨架。
  对DKI数据的处理,预处理同DTI数据处理。采用VBM8分割脑白质、灰质及脑脊液,用micron软件生成相应的灰质及白质MASK。用DKE(http://www.nitrc.org/projects/dke)软件生成平均峰度系数(MK)、轴向峰度系数(axial kurtosis,AK)、径向峰度系数(radial kurtosis,RK)、部分各向异性峰度系数(kurtosis fractional anisotropy,KFA)、部分各向异性性系数(FA)、平均扩散系数(MD),轴向扩散系数(AxD)、径向扩散系数(RD)参数图。比较C等位基因携带者与TT纯合子受试者两组之间脑白质及脑灰质的DTI、DKI参数差异。统计学分析,对C等位基因携带者与TT纯合子受试者两组DTI参数行基于体素的全脑非参数统计比较(randomize),排列值设为5000,P<0.05(threshold-free cluster enhancement,TFCE)有意义。应用SPM8统计学软件,对两组间的DKI参数进行双样本T检验,P<0.05为有统计学意义。
  结果:基于纤维束空间统计分析(Tract-Based Spatial Statistics,TBSS),KIBRA-TT纯合子与KIBRA-C等位基因携带者之间所有扩散参数均未发现明显统计学差异,P<0.01(TFCE校正)。基于DKI数据进行分析,KIBRA TT纯合子与KIBRAC等位基因携带者之间未发现明显统计学差异(P<0.05,FDR校正),当选择一个较为宽泛的阈值时(P<0.001,cluster size>10),在脑白质及脑灰质区均发现一些差异性趋势:脑白质区:KIBRA-C等位基因携带者在右侧中央后回白质AD,MD,RD升高,AK,MK降低;右侧侧脑室旁脑白质AD,MD,RD升高,KFA下降。脑灰质区:KIBRA-C等位基因携带者在右侧中央后回、岛叶的灰质AD,MD,RD升高;右侧中央后回灰质AK、MK(降低;右侧尾状核头FA及KFA降低;左侧海马旁回MK及RK升高。
  结论:本研究应用磁共振DTI及DKI技术并未发现KIBRA基因多态性对健康青年人脑组织微观结构的显著性影响,但在相对宽松阈值下,诸多重要脑区在扩散峰度指标上存在差异性趋势,这种差异随着年龄的增长是否显著,需要进一步验证。
[硕士论文] 王旭鑫
生理学 延边大学 2018(学位年度)
摘要:前庭器官是机体对空间位置和运动状态的重要感受系统,前庭神经核是第八对脑神经前庭窝神经中的神经终止核,其中前庭内侧核(MVN)是前庭反射的重要核团。刺激前庭器官可以影响血压、心率。反之,血压的改变同样影响前庭的功能。本实验室早期发现,急性低血压兴奋前庭神经核的过程中有谷氨酸(glutamate,Glu)参与。但在清醒大鼠状态下,硝普钠(SNP)诱发急性低血压情况下,前庭内侧核是否有神经递质多巴胺(dopamine,DA)及其D1受体的参与尚未见文献报道。
  本研究利用脑部微量透析和高效液相色谱法,观察MVN区DA含量的变化。同时利用免疫组织化学法和Western Blotting法,分析D1受体的表达情况。
  实验结果如下:
  1.单侧迷路破坏模型:前庭器官损伤后,眼震颤1d达到高峰,5d后恢复正常;头偏位在0.5 d出现之后并不减弱;躯体翻转在0.25 d加重,7d恢复正常。
  2.单侧迷路破坏后,测定MVN区DA含量,破坏侧0.5 d达到高峰,7d后恢复正常;破坏对侧0.25 d达到高峰,7d后恢复正常。
  3.前庭正常大鼠,SNP诱发急性低血压,DA含量增加。单侧迷路破坏后,破坏同侧DA含量无改变,破坏对侧增加。
  4.前庭正常大鼠,SNP诱发急性低血压,D1受体免疫阳性神经元微弱表达,对照组对称性表达。单侧迷路破坏14 d后,破坏对侧微弱表达,破坏侧表达增加。
  5.前庭正常大鼠,SNP诱发急性低血压,D1受体蛋白微弱表达,对照组对称性表达明显。单侧迷路破坏14d后,破坏对侧微弱表达,破坏侧表达明显。
  以上实验结果提示:
  急性低血压兴奋前庭神经核的过程中有DA及其D1受体的参与。
[硕士论文] 孙明琪
内科学(内分泌与代谢病学) 山东大学 2018(学位年度)
摘要:肥胖逐渐成为世界性公共健康难题,肥胖发生率逐年增高,尤其儿童和青少年肥胖的趋势越来越严重。引起肥胖的一个重要原因就是饮食,现在人饮食中包含越来越多脂肪。越来越多的研究显示肥胖成年男性存在睾丸功能下降,具体表现为精子数量及质量下降,雄性激素下降等。睾丸是重要生殖器官,主要功能就是产生精子和分泌睾酮。出生后,睾丸不能够产生精子,睾丸需要进一步发育和成熟,因此睾丸不同时期的功能存在差异。性成熟前的青少年时期是睾丸发育重要阶段,尤其青春期是睾丸发育的关键阶段。此时睾丸不能产生精子,睾丸内主要是精原细胞通过有丝分裂进行的增增殖,睾丸间脂质细胞产生少量雄性激素,睾丸生精功能和雄性激素水平是低的。性成熟后成人期睾丸内精原细胞进行分化为精母细胞并通过减数分裂产生精子,性成熟后的成人期睾丸生精功能和雄性激素水平升高的。由于性成熟前后两个阶段睾丸功能存在差异,我们提出性成熟前后两个阶段高脂喂养对于小鼠睾丸功能影响是否有差异。
  目的:
  观察不同性发育阶段高脂喂养对于小鼠睾丸功能的影响。
  方法:
  1.48只4周龄C57BL/6雄性幼鼠分为高脂肪饮食组(H组,n=24)和普通饮食组(N组,n=24)。小鼠8周龄时两组各选取8只小鼠评价睾丸相关功能,如观察精子计数、项体结构、血清睾酮、睾丸结构。同时雄性小鼠与8周龄C57BL/6雌性小鼠合笼,观察两组雌性小鼠怀孕及后代小鼠数量及体重。
  2.剩余普通饮食组(N组,n=16)8周龄小鼠分为继续普通饮食组(NN组,n=8)和高脂肪饮食组(NH组,n=8),剩余高脂肪饮食组(H组,n=8)8周龄小鼠分为继续高脂肪饮食组(HH组,n=8)和普通饮食组(HN组,n=8)。小鼠16周龄时评价睾丸功能,如精子计数、项体结构、血清睾酮、睾丸结构。同时雄性小鼠与8周龄C57BL/6雌性小鼠合笼,观察两组雌性小鼠怀孕及后代小鼠数量及体重。
  结果:
  1.H组与N组的小鼠相比,小鼠精子数量下降,睾丸细胞凋亡增加,精子顶体反应、血清睾酮和生殖能力未有变化。
  2.HN组与NN组的小鼠睾丸功能和生殖能力无明显差异。HH组、NH组与NN组的小鼠比较小鼠精子计数下降,顶体结构破坏增加,睾丸细胞凋亡增加,生殖能力下降。HH组和NH组各项结果无明显差异。
  结论:
  1.性成熟前高脂喂养小鼠睾丸功能较普通饮食小鼠下降。
  2.性成熟前高脂喂养小鼠恢复正常饮食睾丸功能恢复。
  3.高脂喂养对于性成熟睾丸功能影响较大。
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