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[博士论文] 胡曼丽
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:电针(Electroacupuncture,EA)是一种治疗疼痛的有效方法。通过传统物理和药理学手段已经确定许多参与针刺镇痛的神经核团和区域,但单个核团或区域并不能阐明针刺镇痛的神经机制,针刺镇痛激活的神经环路还有待研究。大量的研究表明电针可以诱导多种镇痛物质(如脑啡肽、内啡肽、强啡肽等)和抗镇痛物质(如胆囊收缩素、孤啡肽、血管紧张素Ⅱ等)的释放。显然,针刺镇痛是中枢多种物质共同作用的综合表现。由于在不同神经核团中神经元功能各异,神经元内信号分子参与调节针刺镇痛的机制还不清楚。因此,本研究旨在探索针刺镇痛的相关神经环路、物质及分子信号通路。
  1.针刺不同穴位激活的共同神经环路
  为探索针刺镇痛的相关神经环路,本研究通过标记激活的神经元,比较分析针刺不同穴位激活的中枢神经核团或区域。选取28只杂交雄性山羊(30±2kg),随机分为四组:空白对照组,“百会-三台”假针组,“百会-三台”电针组,双侧后三里电针组。电针组山羊电针1次(60Hz,30min);对照组山羊仅做保定处理;假针组山羊只扎针、不通电。采用钾离子透入法测定山羊痛阈。记录电针前后的山羊痛阈值,计算痛阈变化率。待测痛后山羊迅速处死,采取大脑和脊髓组织样。采用免疫酶组织化学方法检测尾核、伏核、外侧隔区、内侧隔区、下丘脑室旁核、下丘脑腹内侧核、弓状核、基底杏仁核、僵核、臂旁核、蓝斑、孤束核、垂体、中脑导水管周围灰质腹外侧(vlPAG)、中缝大核(NRM)、巨细胞网状核(Gi)和脊髓背角(SCDH)中c-Fos蛋白表达水平。
  试验结果显示,“百会-三台”和后三里电针组山羊痛阈在电针后显著升高(p<0.05)。“百会-三台”电针组山羊的痛阈变化率显著高于后三里电针组(p<0.05)。与空白组相比,电针后三里或“百会-三台”组穴都能诱导c-Fos免疫样阳性神经元在内侧隔区、下丘脑腹内侧核、弓状核、基底杏仁核、缰核、垂体前叶、臂旁核、蓝斑、vlPAG、NRM、Gi和SCDH内显著增加(p<0.05)。与后三里电针组相比,电针“百会-三台”组穴诱导c-Fos免疫样阳性神经元在基底杏仁核内显著增加(p<0.05),但在内侧隔区、下丘脑室旁核、缰核和SCDH内显著减少(p<0.05)。这些结果提示弓状核-中脑导水管周围灰质-中缝大核/蓝斑-脊髓背角和下丘脑-垂体是电针不同穴位激活的共同神经环路。
  2.电针山羊中脑导水管周围灰质基因差异表达
  为全面了解电针对中枢神经系统基因表达的影响,本研究采取电针山羊PAG进行转录组高通量深度测序,运用qPCR方法对测序结果进行验证,并通过侧脑室微注射技术进一步研究差异基因胸腺素β4在电针镇痛中的作用。选取三对纯种波尔山羊(30±2kg),按照配对试验方法进行同窝配对,每对山羊中一只接受电针为电针组,另一只接受对照处理为对照组。电针组山羊接受1次电针(60Hz,30min)。采用钾离子透入法测定山羊痛阈。记录电针前和电针0h和4h后的山羊痛阈,计算痛阈变化率。在4h测完痛阈后,6只山羊迅速处死,取PAG分别进行测序建库。利用生物信息学方法对电针组与对照组的差异表达基因进行功能富集分析。在qPCR验证试验中,选取测序结果中表达量高的15个差异基因进行验证。选取差异基因胸腺素β4进行进一步研究。在探索胸腺素β4(Tβ4)在电针镇痛中的作用试验中,分别建立生理模型和炎症模型进行侧脑室注射。在生理模型试验中,选取72只SD大鼠(250±20g)随机分为两组(n=36),即电针组与对照组,各组大鼠分别接受侧脑室注射1μg/μL Tβ4、0.1μg/μL Tβ4、0.01μg/μL Tβ4、Lip-Tβ4-siRNA(Tβ4沉默用siRNA)、Lip-C-siRNA(negative siRNA)或PBS(每6只大鼠注射同一种药物)。注射后,电针组大鼠接受1次电针。每组大鼠注射前和电针后测定鼠甩尾反射时间(TFL),计算TFL变化率。在炎症模型试验中,选取54只SD大鼠(250±20g)随机分为三组,即炎症电针组(CFA+EA,n=24)、炎症对照组(CFA+CON,n=24)和生理对照组(Saline+CON,n=6)。CFA+EA或CFA+CON组大鼠足底注射CFA(0.1mL/只),各组大鼠分别接受侧脑室注射0.1μg/μL Tβ4、Lip-Tβ4-siRNA、Lip-C-siRNA或PBS注射(每6只大鼠注射同一种药物)。生理对照组大鼠足底注射生理盐水(0.1mL/只),侧脑室注射PBS。CFA+EA组分别于0d、2d、4d、6d、8d、10d和13d施予电针。所有大鼠于足底注射药物前和注射后1d、3d、7d、14d测定足底机械痛闽(PWT),计算PWT痛阈变化率。
  结果显示,电针后电针组山羊痛阈显著高于对照组山羊痛阈(p<0.05)。测序分析得到2651个差异表达基因(DEGs),其中1709个基因上调,852个基因表达下调。这些差异基因富集在30条KEGG pathways和149条GO terms。进一步qPCR验证结果显示,甲硫脑啡肽、阿黑皮素原、前强啡肽原、κ-阿片肽受体、谷氨酸受体、兴奋性氨基酸转运体1、γ氨基丁酸B型受体、酸性纤维蛋白、芳香族氨基酸脱羧酶、突触结合蛋白1、安定绑定蛋白、前蛋白转换酶1抑制剂、胸腺素β4、胸腺素β10和前列腺F合酶基因的表达趋势与高通量测序结果一致,验证了测序结果的可靠性。测序结果提示,电针上调的谷氨酸受体及转运体、γ氨基丁酸受体及转运体、丝裂原激活的蛋白激酶、突触结合蛋白可能通过谷氨酸能突触、γ氨基丁酸能突触、MAPK、核糖体、泛素蛋白体等途径参与调节针刺镇痛。
  生理模型侧脑室注射结果显示,EA+Tβ4组大鼠TFL显著低于EA+PBS组大鼠TFL(p<0.05)。在炎性模型中,CFA+EA+Tβ4组大鼠PWT在注射CFA后第1d、7d和14d都显著低于CFA+EA+PBS组大鼠PWT(p<0.05)。CFA+EA+Lip-Tβ4-siRNA组大鼠PWT在注射CFA后第1d、3d、7d和14d都显著低于CFA+EA+PBS组大鼠PWT(p<0.05)。提示Tβ4在生理和炎症情况下都参与调节电针镇痛。
[硕士论文] 程仕强
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着健康观念变化和医学模式转变,中医药越来越显示出其独特的优势和不可替代的作用。红景天作为中医药应用历史悠久,被人们称为“雪域人参”。红景天苷是红景天根部的主要活性成分,具有多种药理功能,其在抵抗炎症和脂肪代谢中发挥重要作用,但其中机制尚不明确。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,可通过极化发挥抗炎或促炎的作用,同时巨噬细胞内的脂肪代谢与巨噬细胞的功能有着紧密的联系。已有研究证明,脂肪量和肥胖相关基因(FTO)能够抑制促炎细胞因子表达。为了更好了解巨噬细胞的功能和探索红景天苷的潜在药用功能,本研究探讨了红景天苷对巨噬细胞极化以及巨噬细胞内脂肪代谢重要调节分子的影响。
  本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究模型,用红景天苷(100μM)预处理1h后,以LPS(1μg/mL)或IL-4(20ng/mL)诱导巨噬细胞分别向M1与M2方向极化,通过RT-qPCR方法检测M1型极化标志基因iNOS、IL-6、IL-1β和M2型极化的标志基因ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平。结果显示iNOS、IL-6、IL-1βmRNA相对表达水平较LPS单独处理组显著下调,而ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平与IL-4单独处理组相比发生上调,说明红景天苷能够抑制巨噬细胞M1型极化和促进巨噬细胞M2型极化。通过Western blot方法检测Akt蛋白S473位点磷酸化水平,红景天苷能够抑制LPS诱导Akt S473位点的磷酸化水平,红景天苷可以通过影响巨噬细胞的Akt信号通路来调控巨噬细胞极化。使用红景天苷预处理后检测Poly(I:C)(5μg/mL)刺激巨噬细胞诱导的炎症关键基因iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,结果表明:iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平显著降低,说明红景天苷可能对病毒感染引起的炎症也具有保护作用。在巨噬细胞中超表达FTO,红景天苷预处理后,加入LPS刺激,检测促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平。结果显示IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平显著降低,说明超表达FTO能够抑制LPS引起的炎症因子的表达进而影响巨噬细胞的抗炎作用。为了更进一步研究红景天苷对巨噬细胞脂质代谢的影响,红景天苷预处理细胞,再加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO的mRNA表达水平。结果显示,FTO的mRNA表达水平降低,红景天苷对巨噬细胞炎症中的FTO有调控作用。使用红景天苷预处理,加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO/SREBP1c/CIDEc信号通路中脂肪合成的重要调节因子SREBP1c和促进脂滴合成的关键蛋白CIDEc的mRNA表达水平。结果显示,红景天苷能够抑制脂肪积累过程中关键基因SREBP1c和CIDEc的mRNA水平的表达,从而可能降低巨噬细胞中的脂质积累。
  总之,我们结果表明红景天苷可以调控巨噬细胞极化以及影响巨噬细胞内脂质代谢相关重要调节分子的表达,从而调控机体的炎症反应。
[硕士论文] 杨倩
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本课题从蕲春蕲艾(Artemisia argyi)根茎部分离纯化得到一株内生真菌命名为HCH285,之后进行菌种鉴定、bostrycin方法学构建,同时对该HCH285内生菌代谢产物和bostrycin进行安全性和活性分析,主要结果如下:
  1.HCH285菌种鉴定。利用微生物学与分子生物学两种方法对HCH285内生真菌进行鉴定。微生物形态学观察发现菌落呈圆形,生长初期为白色绒状毛且生长蓬松,后期逐渐成红色且菌落背面的红色产物也清晰可见。HCH285菌丝体为无色有隔菌丝。它产单个、球形或椭圆形、黑色光滑的分生孢子。此外通过分子生物学技术对其ITS序列测定确定该菌株属于黑孢霉属球黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)。
  2.HCH285内生菌产bostrycin分离制备方法建立。利用多种化学试剂对HCH285内生菌代谢产物提取,确定乙酸乙酯为最佳萃取试剂,以半制备液相进行化合物分离,优化卷线孢菌素bostrycin的HPLC制备方法,使用高效分析型液相检测分离纯度,其分离制备方法为:柱温∶30℃,进样体积∶700μL,流速∶3mL/min,流动相比例:甲醇∶0.3%甲酸=50∶50(v/v),检测时间∶30min,紫外检测∶02nm;采用400MHz核磁共振波谱仪进行结构鉴定确定为卷线孢菌素bostrycin。
  3.Bostrycin活性分析。Bostrycin抗氧化活性分析证明,对三种自由基抗性顺序由大到小为O2->DPPH->OH-。它的抗菌活性表明有较好的抗菌作用,对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌较好。CCK-8法体外抗癌活性研究表明对U251,B10F16癌细胞的半致死浓度分别为4.30μM和6.05μM。
  4.Bostrycin及HCH285菌代谢色素的安全性分析。引入秀丽隐杆线虫(C.elegans)为生测材料,以食品级红曲红色素为对照,研究对C.elegans各生理指标的影响。试验表明HCH285菌产色素对C.elegans的急性与慢性毒性、摄食与运动能力、生长发育状态、卵块孵化率,均没有明显抑制作用且与食品级红曲红色素作用效果一致,综合各指标显示500μg/mL内为安全剂量。以相同方法和指标,分析bostrycin对C.elegans作用,确定剂量在10μg/mL内无毒副作用。
[博士论文] 聂荣祖
食品科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文以柿单宁主要特征结构单元表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及其A型连接的二聚体(A型EGCG二聚体)为研究对象,旨在阐明A型EGCG二聚体具备较强抗淀粉样聚集活性的原因。首先,我们通过Thioflavin T(ThT)荧光、1-anilinonaphthalene-8-sulfonic(ANS)荧光、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色光谱和透射电子显微镜等手段系统证实了A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更强的抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成及解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的效果,并探究了A型EGCG二聚体发挥抑制作用的关键阶段。进一步通过构建PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维神经细胞毒性的抑制作用和调节机制。在此基础上,以Aβ40淀粉样多肽为模型,通过ESI-MS、核磁共振、分子对接等研究手段探索EGCG和A型EGCG二聚体与Aβ40淀粉样多肽的结合方式和相互作用位点。主要研究结果如下:
  1.EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维形成抑制作用的比较研究
  ThT荧光实验结果表明,牛胰岛素蛋白在pH2.0的含20%乙酸溶液中孵育8h可形成成熟的牛胰岛素淀粉样纤维。加入EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维的形成均可发挥显著的抑制作用,且抑制作用随着多酚浓度增大而增强。相较于EGCG单体,A型EGCG二聚体效果更好,当其浓度达到0.35mM时,可完全阻止牛胰岛素淀粉样纤维的形成。透射电子显微镜观察结果与ThT荧光实验结果相符。加入0.70mM的A型EGCG二聚体后,在透射电子显微镜中观察不到淀粉样纤维状结构,但有部分无定型聚集体形成。此外,采用动态光散射检测发现A型EGCG二聚体可保护一部分牛胰岛素蛋白继续以单体形式存在,同时生成了粒径约为295nm的无定型聚集体。ANS荧光、FTIR和圆二色光谱的研究结果表明,A型EGCG二聚体可较好地保护牛胰岛素蛋白的原始构象,阻止蛋白二级结构的改变及内部疏水性氨基酸的暴露。因此,我们推测与牛胰岛素蛋白单体结合并抑制蛋白结构改变是A型EGCG二聚体发挥抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成作用的机制之一。为了研究A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键时期,在牛胰岛素蛋白孵育过程的不同时期加入0.70mM的A型EGCG二聚体,从结果中可以看出,在0h和2h时加入0.70mMA型EGCG二聚体可完全抑制牛胰岛素蛋白疏水性氨基酸的暴露及牛胰岛素淀粉样纤维化聚集进程,并阻止原纤维的形成,促进无定型聚集体的形成,这表明A型EGCG二聚体不仅能够与牛胰岛素蛋白单体结合,还可与成核寡聚体结合,并破坏其原有结构,从而达到使其丧失继续形成原纤维的能力。然而,在4h时加入A型EGCG二聚体仅能部分抑制牛胰岛素淀粉样纤维的形成。因此,以上研究结果证实,牛胰岛素淀粉样纤维形成过程中的延滞期是A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键阶段。
  2.EGCG和A型EGCG二聚体对成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚作用的比较研究
  ThT荧光和ANS荧光检测结果表明A型EGCG二聚体可显著减少牛胰岛素淀粉样纤维疏水性氨基酸的暴露,且A型EGCG二聚体的解聚效果强于EGCG单体。透射电子显微镜的观察结果可进一步证实A型EGCG二聚体具有更强的解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的能力。通过SDS-PAGE电泳和Bradford法分别分析成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚产物分子量分布和上清液中可溶性蛋白含量变化,可以看到牛胰岛素淀粉样纤维解聚后形成了大量的分子量为10kDa到250kDa的聚集体,且A型EGCG二聚体加入后生成的可溶性蛋白浓度为加入EGCG时的3.68倍,这表明A型EGCG二聚体不仅对已形成的牛胰岛素淀粉样纤维具有更好的解聚效果,还能促进可溶性牛胰岛素寡聚体的大量形成。
  3.EGCG和A型EGCG二聚体对由牛胰岛素淀粉样纤维诱导形成的神经细胞毒性的抑制作用及机制
  选用PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性的抑制作用。MTT实验结果表明EGCG和A型EGCG二聚体可显著抑制牛胰岛素淀粉样纤维诱导产生的细胞毒性。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维引起的损伤。实验结果表明,相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞膜完整性,降低由牛胰岛素淀粉样纤维诱导的胞内过量Ca2+、活性氧(ROS)和一氧化氮(N0)浓度,阻止线粒体膜电位下降,提高胞内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化防御酶活性,抑制细胞内凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(Endo G)等凋亡相关蛋白的过量表达。因此,根据以上结果,我们推测清除细胞内过量的活性氧,并提高抗氧化防御酶活性是A型EGCG二聚体较好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性损伤的分子机制。
  4.以Aβ40淀粉样多肽为模型研究A型EGCG二聚体较强的淀粉样聚集抑制作用机理
  ThT荧光实验结果表明A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更显著的抑制Aβ40淀粉样纤维形成的能力。30μM的A型EGCG二聚体可完全抑制Aβ40淀粉样多肽疏水性氨基酸残基的暴露和Aβ40淀粉样纤维化聚集进程。透射电子显微镜的观察结果可证实上述结论,30μMA型EGCG二聚体可促使无定型聚集体的形成,同时完全阻止Aβ40淀粉样纤维形成。未修饰蛋白光催化交联法和MTT法的检测结果均证实A型EGCG二聚体可较好地抑制Aβ40寡聚体的形成及其诱导的神经细胞毒性。随后,我们采用荧光淬灭、ESI-MS、核磁共振和分子对接等研究手段检测多酚与Aβ40多肽之间的相互作用机制,结果表明EGCG与A型EGCG二聚体均可与Aβ40多肽主要通过疏水相互作用结合形成非共价复合物。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可与更多具有强烈聚集倾向的氨基酸残基结合,并与Aβ40多肽之间形成更多的非共价相互作用。最后,构效关系的研究结果表明多酚化学结构中的没食子酰基基团重要性强于羟基。
[博士论文] 丁舟
中医基础理论 湖北中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过对古籍中肾藏象相关内容的文献研究,详寻肾藏象学说的古籍内容,进行搜集整理、摘列分类、提炼归纳、总结研究;在全面认识古代肾藏象学说的基础上,整体把握肾藏象学说的理论内涵,阐述肾藏象学说的理论内容,以及肾藏象学说在临床中的应用,为肾藏象学说的理论研究、实验研究提供参考,为肾藏象系统脏器组织临床病变的诊疗提供指导。
  方法:
  1.摘录原文内容:参考《四库全书》、《中国中医古籍总目》、《中国医籍大辞典》、《中国医籍通考》、《宋以前医籍考》等古籍书目,集合符合纳入标准的历代名医著作;通读古代医籍文献,全面摘录与肾藏象内容相关的原文资料,学习、认识、理解与肾藏象内容相关的古代医籍文献资料的基本内涵和基本精神。
  2.归纳原文内容:参考现代医家对肾藏象相关文献的阐释,进一步理解肾藏象相关文献的基本内涵和基本精神,进而对已摘录的与肾藏象相关的文献原文进行分类、整理、研究,对古代文献典籍中的肾藏象内容进行归纳,系统整理古代文献典籍中的“肾藏象理论”相关内容。
  3.讨论与创新:在对古代文献典籍中的肾藏象理论深入研究的前提下,综合历代文献典籍的肾藏象理论内容,结合部分现代医家研究成果和现代医学内容,对肾藏象理论中的不同观点进行阐释、辨析,并补充自己的观点和见解。
  结果:
  1.古人对“肾”颇为重视,并且已经认识到肾脏器的数量为二,并对其位置、形状、质地等都有明晰的认识,而时至清末,对肾脏器的解剖认识更贴近于现代医学;古人对肾脏器解剖的认识,是一个对“肾”的解剖与生理功能相结合的探索过程,是肾藏象学说的基础。
  2.古代医家认为,与肾脏器相连的经络有与其直接相连的足少阴肾经经脉、足太阳膀胱经经脉、足少阴肾经经别、足太阳膀胱经经别、督脉;还有与其间接相连的冲脉、阴跷脉等。古代医家还认为肾脏器通过肾经、膀胱经与膀胱表里相连;通过任脉、冲脉、督脉与胞宫相连;通过足少阴肾经经脉、经筋、足太阳膀胱经经脉、络脉、督脉、冲脉等与二阴相连;通过肾脏本经经络、足太阳膀胱经、督脉、脊柱等与骨、髓、脑相连;通过足太阳膀胱经经脉与耳相连。围绕肾脏器构筑了一个由经络紧密连接诸多器官、组织的“藏”系统。系统内各器官、组织一起奠定了肾藏象系统“形”的物质基础,并一起完成了肾藏象系统的生理功能。
  3.古代医家所论述的“形”之病证,包括了多种肾藏象系统中组织器官的形体变化。究其病因病机,多因肾之精气亏损日久,累及“形”而致脏腑组织器官发生结构变化,其中暗含“气”损—“形”伤的病理变化机制,在治疗中可以通过养“精”益“气”之法,以培补“神”,调节“形”之异常变化。
  4.古代医家所述肾所藏之精,实际上包括了先天之精、后天水谷之精、脏腑之精、生殖之精等内涵。先天之精输布于包括肾器在内的形体官窍,统御形体的正常生长,其余部分则潜藏于肾;分布于脏腑的先天之精与水谷之精相结合,聚而成脏腑之精,是各脏腑功能正常的保障。在“肾藏精”的基础上,肾藏象系统发挥着主生长发育,主生殖,主髓、骨、脑,主齿、发,主唾等生理功能。
  5.古代医家所述之“肾气”,有别于“元气”“真气”,而更贴近于由“脏腑之精”化生的“脏腑之气”,充于肾藏象系统中的各个部分,是肾藏象系统正常生理功能的直接体现。如在肾主二阴、主耳、主天癸、主纳气、主水液等生理功能中,“肾气”都发挥着至关重要的作用。此外,从一元论角度而言,“精气”乃异名同质,二者可通过气化而相互转化,并通过此转化,在肾藏象系统及其他藏象系统中达到精气平衡的作用,即“精”“气”可统一于一元论之“气”,二者通过气化作用能够更好地表达肾藏象的生理功能。
  6.古代医家所讨论的“气”之病理病证,首先包括了“精”和“气”的异常。“精”或“气”不足,均可导致肾藏象系统中的组织、器官出现功能异常,产生多种临床病证。此外,“气”之病变一定程度上可以看作是“精”“气”之间的气化异常所致。所以临床还需注意“气化”不及或“气化”太过而出现的异常,如蛰藏不及与蛰藏太过、固摄不及与固摄太过等方面的病理表现。而在对“气”之病证的治疗上,应重视肾之“虚实”,可适当“填精益气”。
  7.中医学范畴中的神,包括了通过阴阳、五行学说等哲学认识来揭示其各“藏”的特性、特质的哲学之“神”,以及与五脏关系密切的精神情志活动的狭义之“神”。前者包括了肾的阴阳辨识、五行归属,恶燥、主蛰藏等生理特性,以及天人相应的“神”之道。后者包括了“在志为恐”、“肾藏志”。“神”之临床应用,需注重“精”与“神”的关系,尤其是养生方面,一定要从“神”的角度,注重“先天之精”的葆藏。
  结论:
  1.古代医家对肾脏器有比较明晰的解剖认识,并通过经络联系整体认识肾藏象系统中的器官、组织,肾“器”与“藏”系统器官一起共同构筑了肾藏象系统的“形”,为肾藏象系统生理功能的物质基础。
  2.古代医家阐释了肾藏象系统通过“器”“藏”合“形”,“精”“气”—“气”,以及情志之“神”,哲学之“神”的认识,构筑了“形”—“气”—“神”的生理体系。
  3.古代医家对肾藏象系统相关病证的探讨,总体而言,也可以分为“形”“气”“神”三个方面,其中,“气”以“气化”为重要病机,除“气化不及”之外,还有“气化太过”的病理变化,临床中需要注意“精”“气”之间的生理、病理关联,治疗时应恰当“填精益气”;“形”以“气”损—“形”伤为主要病变途径,在治疗中可以养“精”益“气”,调节“形”之异常变化;“神”与“先天之精”关系密切,尤其在养生指导方面,尤需重视“先天之精”的葆藏。
[硕士论文] 陈鹤炯
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:银杏黄酮是银杏叶中的主要活性成分。大量研究表明,占银杏叶中黄酮化合物比例较少的苷元型黄酮比其糖苷衍生物更具生物活性。目前银杏黄酮水解方法较大程度上限制了水解工艺的工业化,因此寻找新型催化剂也是银杏黄酮水解研究的一个新出路。本文对比了HZSM-5、Hβ和HY三种分子筛水解银杏黄酮的效果,筛选出合适的催化剂优化得到适宜的工艺条件。另外,本文使用HZSM-5分子筛为催化剂对银杏黄酮的水解过程进行动力学分析,为HZSM-5分子筛水解银杏黄酮的工业化推广提供理论支持;最后讨论溶剂萃取法和碱提取酸沉淀法在银杏黄酮苷元纯化上的应用。
  1.通过正交实验得到HZSM-5分子筛催化水解银杏黄酮的最佳工艺条件为:反应温度为140℃,反应时间为6h,银杏叶提取物(GBE)浓度为1.0mg·mL-1,催化剂用量为1.25g,溶剂为纯甲醇;Hβ分子筛催化水解银杏黄酮的最佳工艺条件为:反应温度为150℃,反应时间为8h,GBE浓度为0.8mg·mL-1,催化剂用量为0.50g,溶剂为95%的甲醇水溶液;通过多次实验认为HY分子筛不适合用于银杏黄酮的水解中。
  2.使用HZSM-5分子筛为催化剂,分析了银杏黄酮的水解过程,发现三种糖苷的水解过程均较好的符合一级反应动力学方程,r2基本全部大于0.95,并得到了三种糖苷的水解活化能。
  3.本文选择溶剂萃取法和碱提取酸沉淀法对黄酮苷元进行提纯。对比了石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇等五种有机溶剂的纯化效果,结果乙酸乙酯对黄酮苷元的纯化效果最好。通过单因素实验分析了碱提取酸沉淀法的纯化效果,得出实验范围内的最佳工艺条件为提取时使用氢氧化钠溶液调节pH为9,沉淀时使用盐酸调节pH为2,使黄酮苷元含量从17.13%上升到68.83%,苷元回收率为62.93%。
[硕士论文] 赵文龙
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:我国是世界上银杏叶的最大产地,银杏资源十分丰富。银杏叶中的银杏黄酮具有抗衰老、防止血管堵塞、降血压等功效,因此被广泛利用到药品、保健品等领域。目前市场产品主要是银杏黄酮含量为24%的银杏叶提取物,市场竞争激烈;为了提高产品的附加值,满足高端市场的需求,重要措施之一是通过优化提取精制工艺,增大提取物中银杏黄酮的含量。本文从原料银杏叶出发,研究提取精制银杏黄酮的方法,主要研究内容如下:
  1)本文建立了分光光度法和高效液相色谱法两种方法来测定提取物中银杏黄酮的含量。通过单因素实验对银杏黄酮提取过程的影响因素进行分析,考察了热回流提取法、超声辅助提取及水析过程对其提取率的影响,并通过正交实验得到了银杏黄酮提取过程最优的工艺参数为温度70℃、乙醇浓度70%、料液比为1∶15、提取时间30min、水析比为1∶5,此时提取率为95.3%,水析之后,银杏黄酮含量为4.5%,两个过程的总收率为92.7%。
  2)本文分别对AB-8大孔吸附树脂和聚酰胺树脂精制银杏黄酮过程进行了研究,采用静态实验考察了树脂的吸附特性,绘制了吸附动力学曲线及吸附等温线并进行了拟合;采用树脂的梯度洗脱实验确定了精制过程的工艺参数,并考察了上样浓度、上样流速的影响,绘制了渗透曲线和解吸曲线。AB-8大孔吸附树脂精制银杏黄酮的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂柱,先用浓度为20%的乙醇洗脱后再用80%的乙醇洗脱,即可得到含量为35.1%的银杏黄酮提取物,其收率为82.7%;聚酰胺树脂的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于聚酰胺树脂柱,先用10%的乙醇洗脱后再用60%的乙醇洗脱,即可得到含量为56.8%的银杏黄酮提取物,其收率为79.7%。
  3)本文对大孔吸附树脂与聚酰胺树脂联用纯化银杏黄酮进行了研究,考察了树脂联用顺序对产品的影响,使用正交实验确定了最佳工艺参数,并对树脂的重复使用稳定性进行了研究。树脂联用纯化银杏黄酮的最佳工艺参数为:使用乙醇水溶液作为洗脱液,先经AB-8树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为15%,第二次洗脱浓度为70%;后经聚酰胺树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为10%,第二次洗脱浓度为60%,即可得到含量为73.6%的银杏黄酮提取物,收率为64.0%。
[硕士论文] 付三
中药学 湖北中医药大学 2018(学位年度)
摘要:背景:灯盏花素是传统中药灯盏细辛黄酮类有效部位,收载于2015年版《中国药典》一部,其主要成分为灯盏乙素,含量高于90%,由其制作的中成药制剂广泛应用于临床治疗心脑血管疾病,疗效显著,国内外市场十分畅销。目前药典收录的灯盏花素提取纯化工艺采用了大量酸碱处理,会对生态环境造成严重污染。因此对灯盏花素提取纯化工艺进行改革研究,控制其产业化制备对生态环境造成的污染具有重要意义。此外,灯盏乙素能通过调节小胶质细胞的活化发挥抗炎作用,但其作用机制未阐明。因此探讨灯盏乙素抑制小胶质细胞活化的作用机制,可为脑缺血再灌注后损伤治疗策略提供理论依据。
  目的:改革灯盏花素提取纯化工艺,减少酸碱用量,减轻环境污染;探讨其抑制小胶质细胞活化的机制,为其在脑血管方面疾病的治疗作用提供理论基础。
  方法:取灯盏细辛粗粉,按照2015版《中国药典》所示方法,乙醇回流提取,提取液浓缩至1g/mL的含药量。用2mol/L NaOH调节浓缩药液pH至7.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;用5%HCl调节上清液pH至4.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;将上清液稀释至0.42g/mL的含药量,通过D101大孔树脂柱,2BV去离子水洗脱除杂,继续用3BV40%乙醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液回收乙醇并浓缩至3g/mL的含药量,用5%HCl调pH至2.5,静置,离心。沉淀用适量无水乙醇、去离子水、丙酮反复洗涤,干燥、粉碎后得到粗品。粗品经适量乙醇重结晶,丙酮洗涤,烘干,即得到灯盏花素提取物。使用液相质谱联用仪对所得样品分析鉴定。
  将灯盏乙素作用于LPS诱导活化的BV-2细胞,采用CCK-8法检测灯盏乙素对BV-2细胞存活率的影响。灯盏乙素(10-40μg/mL)预处理BV-2细胞1h,然后加入LPS(1μg/mL)诱导细胞活化。分别采用ELISA法和Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO释放量的影响。提取总RNA,采用实时荧光定量PCR检测灯盏乙素对LPS诱导BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS及COX-2mRNA表达的影响。采用原位免疫荧光染色法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB核转移的影响。采用Western blot技术检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB、MAPK、PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。
  结果:所得灯盏花素提取物经液质联用仪(HPLC-MS)分析,分别鉴定为:灯盏乙素,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷,野黄芩素。其中灯盏乙素含量为94.28%,其转移率为15.6%。
  CCK-8结果表明灯盏乙素(10-40μg/mL)对正常或者LPS诱导的BV-2细胞活力无明显抑制作用。ELISA、NO试剂盒及实时荧光定量PCR检测结果显示:LPS组与对照组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著升高;灯盏乙素(10-40μg/mL)组与LPS组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著降低。免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,LPS组可观察到NF-κB由细胞质向细胞核的转移,灯盏乙素组与LPS组相比,NF-κB由细胞质向细胞核的转移能明显被抑制。Western blot结果显示:LPS组与对照组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、PI3K、AKT、p38、JNK及ERK蛋白的磷酸化水平显著升高,总蛋白水平无明显变化,IκB总蛋白水平显著下降;灯盏乙素组与LPS组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、AKT、p38、JNK蛋白的磷酸化水平及Ikkβ总蛋白水平显著下降,IκB总蛋白水平显著升高,p65、Ikkα、p38、JNK、ERK、PI3K总蛋白水平及PI3K、ERK蛋白的磷酸化水平无明显变化。
  结论:本研究在《中国药典》收载灯盏花素制备工艺的基础上,对其进行了提取纯化工艺改革研究,取得可靠的技术参数,为其产业化制备工艺改革避免大量酸碱使用提供了实验依据,对于保护生态环境具有重要意义。此外其抑制神经炎症作用机制研究表明,灯盏乙素能通过抑制NF-κB通路的激活,抑制AKT,p38,JNK蛋白的磷酸化来调控相关mRNA的表达,抑制炎症因子的释放,从而抑制小胶质细胞的激活,起到神经保护作用。
[硕士论文] 赵树琪
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察褐藻多酚Eckol的抗肿瘤作用,并探讨其可能的作用机制,为Eckol在肿瘤防治中的应用提供实验依据。
  方法:
  1、Eckol的抗肿瘤作用研究:分别建立移植型S180腹水瘤及肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给予生理盐水或Eckol(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)7天。S180腹水瘤小鼠模型造模后继续给药15天,每天记录小鼠活动状态,记录小鼠生存天数。S180肉瘤荷瘤小鼠模型造模后继续给药10天,每天记录小鼠体重,记录小鼠生长曲线,最后一次给药1h后,处死小鼠,分离脾脏和胸腺,计算脾指数和胸腺指数;剥取肉瘤组织,称重;HE染色观察肿瘤组织病理变化;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡;以Western blot法测定瘤组织EGFR、Bcl-2、Caspase-3的表达水平。
  2、Eckol对S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能的影响:建立移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给药7天,造模后继续给药10天。取小鼠外周血血清,ELISA法检测IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平;以碳粒廓清法了解小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能;取外周血,流式细胞术测定小鼠外周血T细胞亚群分布;分离小鼠脾脏,磨碎后过滤、种板,ConA诱导脾细胞转化,MTT法检测Eckol对脾细胞转化的影响;免疫组化法测定CD11c阳性细胞在肿瘤组织中的分布,了解肿瘤组织树突状细胞浸润情况;从小鼠骨髓中获得小鼠骨髓来源的单核细胞,用含IL-4和GM-CSF20ng/ml的RPMI1640培养基培养7天,诱导分化为树突状细胞。收集细胞,流式三标法(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)检测髓源性树突状细胞表型。
  3、Eckol对Reg3A诱导人胰腺癌SW1990细胞过度增殖的影响:体外培养SW1990细胞,Eckol(0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml)处理细胞48h,加入50ng/ml的外源性Reg3A蛋白共处理24h后,MTT法检测细胞存活率。选取Eckol(5、10、20μg/ml)三个浓度组,Eckol处理细胞48h后,50ng/ml外源性Reg3A蛋白共处理24h,流式细胞术测定细胞周期;软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Real Time PCR法检测JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA表达;Western blot法检测JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、NF-κB、Cyclin D1蛋白水平表达。
  结果:
  1、Eckol的抗肿瘤效应:Eckol体内干预可延长移植型S180腹水瘤荷瘤小鼠生存天数;移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型中,Eckol呈剂量依赖性地降低肉瘤重量,升高脾指数,且不明显改变动物生存曲线。肿瘤组织HE染色结果显示,Eckol处理组中,肉瘤组织微血管减少,坏死增加,核固缩明显,癌巢周围发现单核细胞浸润。TUNEL染色结果显示,Eckol处理组肿瘤细胞凋亡增加。肿瘤组织内凋亡蛋白Caspase-3表达上升,抑凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白EGFR表达下降。提示Eckol体内抗肿瘤效应明显。
  2、Eckol对移植型S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能具有显著调节作用:ELISA结果显示,Eckol处理组S180肉瘤荷瘤小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ显著升高,提示Eckol能够调节Th1/Th2平衡,促进Th1介导的细胞免疫;此外,Eckol提高荷瘤小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能,促进脾淋巴细胞转化,调节外周血T细胞亚群比例。免疫组化及流式结果显示,Eckol能够促进肿瘤组织树突状细胞的浸润,且影响树突状细胞表型,促进髓源性树突状细胞成熟。提示,Eckol体内抗肿瘤效应极可能与其对荷瘤小鼠的免疫功能的调节作用相关。
  3、Eckol对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖的抑制作用:MTT法显示,5-20μg/ml Eckol对SW1990细胞增殖没有明显的体外抑制作用,但Eckol+Reg3A与Reg3A单独作用相比,细胞存活率下降。细胞周期检测发现,与Reg3A单独作用相比,Eckol+Reg3A组S期和G2/M期细胞减少,G0/G1期细胞增多。软琼脂克隆形成实验结果显示,Eckol+Reg3A组的克隆数比Reg3A组克隆数明显减少。Real Time PCR和Western blot结果发现,Reg3A可以上调JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达水平,而Eckol可浓度依赖性地抑制这些上调作用。提示,Eckol体外对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖具有抑制作用,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
  结论:
  1、Eckol具有显著抗肿瘤效应,其体内抗肿瘤效应的发挥可能与其调节荷瘤小鼠免疫功能密切相关。
  2、Eckol体外可抑制胰腺炎症相关介质Reg3A蛋白诱导的胰腺癌SW1990细胞过度增殖,提示Eckol对伴随炎症的胰腺癌的恶性进展具有潜在的抑制效应,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
[硕士论文] 江昌
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  癌症严重影响人类的身心健康,其发生发展是多因素长期作用的结果。而慢性炎症则是其中的重要因素之一。1863年,Rudolf Virchow发现肿瘤组织中存在一定量白细胞,由此将炎症与肿瘤联系起来,并提出炎症是肿瘤发生的原因。胃癌(GC)是全球第四常见的恶性肿瘤,同时GC引起的肿瘤性死亡在全世界肿瘤性死亡排第二。中国胃癌患者基数大,因此对于胃癌的治疗任重道远。胃癌与慢性胃炎关系密切,因此,是否可以通过应用免疫调节药物,调节胃癌炎性微环境是工作的重点。人参皂苷Rg3是人参的提取物之一,具有抗肿瘤活性。目前关于人参皂苷Rg3的抗肿瘤机制研究,大多数集中于其促肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖及阻滞细胞周期等作用上,有文献报道,人参皂苷Rg3可调节树突状细胞(DC)活性,在此基础上,考虑人参皂苷Rg3具有免疫调节的潜能。有文献报道,人参皂苷Rg3干预肿瘤细胞后,上清中IFN-γ表达升高,IL-4表达下降,而IFN-γ、IL-4与巨噬细胞的极化密切相关,同时,前期工作已经发现人参皂苷Rg3可以抑制肿瘤新生血管形成,已有大量研究表明肿瘤组织中的血管形成与TME中的TAM密切相关,故提出假说,人参皂苷Rg3可能通过调节巨噬细胞极化从而发挥其抗肿瘤功效。以巨噬细胞作为研究对象,通过TAM与胃癌细胞株MFC共培养体外模拟胃癌炎性微环境,观察人参皂苷Rg3对巨噬细胞极化的影响;利用胃癌腹腔转移瘤小鼠模型,探究人参皂苷Rg3能否通过其免疫调节作用改变胃癌炎性微环境,达到抑制肿瘤发展的目的。
  目的:
  1、确定人参皂苷Rg3对MFC细胞活力的直接影响。
  2、观察人参皂苷Rg3能否诱导巨噬细胞向M1极化。
  3、动物试验观察人参皂苷Rg3在体内抗肿瘤活性及对肿瘤组织中巨噬细胞极化的影响。
  方法:
  1、CCK-8实验:培养MFC细胞,接种96孔板,用以下浓度人参皂苷Rg3干预MFC细胞:25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。分别于干预24、48h后用CCK8试剂检测细胞活性。
  2、用条件培养液体外模拟胃癌微环境:用0μg/ml、25μg/m、50μg/ml、100μg/ml的人参皂苷Rg3溶液处理MFC细胞,48h后弃上清,更换为无血清DMEM细胞培养液,24h后收集各孔上清培养液并加入预先培养好的小鼠巨噬细胞RAW264.7中,再分别收集RAW264.7细胞和上清,细胞提取RNA和蛋白,RNA用于RT-PCR实验,检测RAW264.7细胞中iNOS、IL-12、IL-10的表达量;用Western blot法检测iNOS、IL-12、Arg-1蛋白的表达水平。
  3、建立615小鼠腹腔转移瘤模型:选择合适的腹腔灌注细胞数后,予以荷瘤,设立control组(空白组)、Rg3组、5Fu组、Rg3+5Fu组(联合组),在腹腔转移瘤模型建立成功后,给与相应药物干预,观察小鼠生存时间,取小鼠眼眶血、腹腔积液做后续ELISA实验,取腹腔肿瘤标本做免疫组化。
  结果:
  1、人参皂苷Rg3干预MFC细胞后,细胞活力降低,Rg3浓度越高,细胞活力越低。
  2、RT-PCR实验表明,不同浓度人参皂苷Rg3作用MFC细胞所得条件培养液处理RAW264.7细胞后,MFC CM(未用药物干预的条件培养基)处理组同IL-4处理组iNOS、IL-12、IL-10表达量相仿;其余组RAW264.7细胞的iNOS、IL-12表达量随着人参皂苷Rg3浓度的增加也逐步增加;而IL-10的表达随着人参皂苷Rg3浓度的增加逐渐降低。Western blot实验提示,不同浓度人参皂苷Rg3作用MFC细胞所得条件培养液处理RAW264.7细胞后,随着人参皂苷Rg3浓度的增加,所得到的条件培养液处理RAW264.7细胞后,其iNOS和IL12的表达呈上升趋势,而Arg1表达则呈下降趋势。
  3、Rg3组与control组相比较,两组肿瘤组织中CD68阳性比例接近,而Rg3组CD11c阳性比例明显增高、CD206的阳性比例明显降低;将联合组同5Fu组进行对比,可见两组肿瘤组织中CD68阳性比例接近,联合组CD11c阳性比例明显增高、而CD206的阳性比例明显降低;将5-Fu同control组对比,二者CD68、CD11c、CD206阳性比例均相仿。提示人参皂苷可诱导TME巨噬细胞向M1型巨噬细胞发生极化,抑制巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞。Rg3可延长小鼠生存时间,但其效果不如5Fu,联合治疗具有协同作用,可进一步延长小鼠生存时间。
  结论:
  人参皂苷Rg3在体外可抑制MFC细胞增殖,且具有剂量依赖性,体内具有抗肿瘤活性。细胞实验及动物实验均提示其机制可能与Rg3诱导巨噬细胞向M1极化,改善胃癌炎性微环境相关。
[硕士论文] 石伟林
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  表没食子儿茶素表没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最丰富的成份,前期研究报道,EGCG具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,但其具体的作用机制还不明确。本研究旨在探讨EGCG抑制乳腺癌细胞迁移及炎症反应的分子机制,为EGCG的进一步开发及其在乳腺癌临床防治中的应用提供科学依据。
  方法:
  1.研究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响
  用不同浓度的EGCG(5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,分别在24h、48h、72h采用Alarmar blue染色法检测细胞活性,确定EGCG最适的作用浓度和时间。按照上述实验确定EGCG作用于乳腺癌细胞的合适浓度和时间,依次处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,进行划痕和Transwell实验,进而探究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响。
  2.EGCG影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过RT-qPCR和Western blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的表达水平,同时检测肿瘤抑制基因SCUBE2的表达变化,分析SCUBE2与迁移相关基因表达的关系。
  3.证明EGCG是通过影响SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移
  首先,利用免疫组化技术,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2的蛋白表达水平,确定SCUBE2与乳腺癌发生发展的关系;然后,构建SCUBE2基因的shRNA重组慢病毒载体,筛选得到干扰SCUBE2的稳转乳腺癌细胞系,检测干扰SCUBE2对E-cadherin和Vimentin基因表达的影响;最后,EGCG处理敲降SCUBE2的稳转细胞,采用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。
  4.确定EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区DNA甲基化实现的
  利用重亚硫酸盐处理及克隆测序的方法,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2启动子区的DNA甲基化水平差异。EGCG处理乳腺癌细胞后,与对照组比较,分析SCUBE2基因启动子区甲基化程度的改变,同时通过RT-qPCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin基因的表达,证明EGCG能够影响SCUBE2启动子区DNA的甲基化,进而影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达。
  5.探究EGCG对乳腺癌细胞炎症因子释放的影响
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和MCP-1的表达水平;此外,采用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用含EGCG培养基培养,检测细胞因子的变化,分析参与EGCG抑制细胞因子释放的可能信号通路。
  结果:
  1.细胞活性检测结果显示,当EGCG浓度为20μM、作用时间达到24h时,乳腺癌细胞活力受到显著抑制(p<0.05),因此本研究随后以此条件开展实验。划痕和Transwell结果表明,EGCG能够显著抑制LPS诱导的乳腺癌细胞迁移(p<0.01)。
  2.EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用,伴随着迁移相关标志基因E-cadherin的上调和Vimentin的下调,此外,我们发现肿瘤抑制基因SCUBE2显著上调,由此我们推测SCUBE2基因可能与EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用有关。
  3.免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,SCUBE2在乳腺癌组织中的表达明显降低,说明SCUBE2的低表达能够促进肿瘤的发生发展。干扰SCUBE2基因后,E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,说明SCUBE2在E-cadherin和Vimentin的上游对其进行调控。用EGCG处理干扰了SCUBE2的稳转细胞系后,我们发现EGCG的抑制作用减弱,证明EGCG是通过上调SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移。
  4.SCUBE2启动子区的DNA甲基化程度在乳腺癌组织中显著高于癌旁组织(p<0.05),这与基因表达检测结果一致。EGCG处理乳腺癌细胞后,检测SCUBE2的甲基化变化,结果显示EGCG可以显著降低SCUBE2的甲基化比率(p<0.05),由此说明EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区甲基化实现的。
  5.ELISA结果显示,EGCG处理能够显著抑制炎症相关因子(IL-6和MCP-1)的表达。用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用EGCG处理,我们发现EGCG对炎症相关因子表达的调控作用与单独S3I-201处理组相比变化不显著,因此,我们推测EGCG可能通过STAT3信号通路来调控乳腺癌相关炎症因子的表达。
  结论:
  EGCG通过影响SCUBE2启动子区的甲基化水平来实现对其表达的调控,SCUBE2进而通过调节迁移相关基因(E-cadherin和Vimentin)的表达,最终抑制乳腺癌细胞迁移。此外,EGCG可能通过STAT3信号通路来抑制的乳腺癌相关炎症因子的表达。
[硕士论文] 苏继源
内科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景及目的:
  动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)被看作是导致急性心脑血管事件发生发展最主要的病因,其核心病理表现为富含脂质的斑块,目前尚缺乏可快速稳定和消退斑块的措施。根据中医理论,AS属于痰瘀互结的范畴,脉络被腹中之痰浊所阻塞后,日久营血瘀滞,就此形成痰浊瘀血相凝之结块。本课题组前期实验证实:“痰瘀同治”方药(下文简称复方中药)可有效抑制AS的进展,但机制与他汀不同。已知胆汁酸肠肝循环是体内胆固醇代谢的关键环节,重吸收的胆汁酸是机体生成胆固醇的重要前体,故经肠道重吸收入血的胆汁酸也可被视为“腑中之痰浊”。我们前期研究发现:复方中药干预AS模型小鼠后,可显著抑制胆汁酸的重吸收,加速其自粪便排出,同时保持末端回肠粘膜结构完整。故此,本研究目的在于探究“痰瘀同治”方药祛除腹中痰浊抑制AS发生和发展的新机制,为传统中医药防治心脑血管疾病提供新策略和新方法。
  研究方法:
  1、人结肠腺癌Caco-2单层细胞模型建立及评价:于Transwell细胞小室内接种Caco-2细胞,培养至21天,此过程中通过不同时间点连续监测跨上皮细胞电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化来明确单层细胞构建成功,将细胞随机分为空白对照组、胆汁酸刺激组及复方中药预干预+胆汁酸刺激组。
  2、复方中药对Caco-2细胞胆汁酸吸收的影响:1)复方中药对胆汁酸跨膜转运作用的研究:通过柱前衍生反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)定量分析各组Caco-2单层细胞模型对胆汁酸的跨膜转运情况;2)复方中药对胆汁酸吸收作用机制的研究:基于上述细胞模型,各组给予不同处理后,通过qRT-PCR和Western Blot定量分析细胞内胆汁酸吸收相关基因mRNA及蛋白的表达水平。
  3、复方中药对Caco-2单层细胞模型屏障功能及细胞氧化应激水平的影响:1)复方中药对Caco-2细胞屏障功能保护作用的研究:在上述Caco-2细胞模型中,各组给予不同处理后,评估各组荧光染料渗透率和TEER的变化,分析上述干预对Caco-2单层细胞渗透性的影响;随后通过qRT-PCR和Western Blot分析细胞间紧密连接相关基因mRNA及蛋白表达水平的变化;2)复方中药对细胞氧化应激水平影响的研究:通过荧光探针法和流式细胞术定量分析上述Caco-2单层细胞模型中ROS的生成以及凋亡的差异。
  研究结果:
  1、Caco-2单层细胞模型的建立及评价:Transwell小室内培养Caco-2细胞9天时TEER值已达到(510.93±44.54)Ω·cm2,当细胞培养至19天和21天时,TEER值显著高于500Ω·cm2的模型建立标准。Caco-2细胞培养至8天时,单层细胞顶端(apical side,AP)ALP活性与底端(basolateral side,BL)相比显著升高(P<0.05),当细胞培养至19天与21天时,Transwell小室两侧ALP活性的比值进一步扩大,达到2.68∶1、3.44∶1。
  2、复方中药抑制胆汁酸吸收的作用机制研究:1)与相应的胆汁酸刺激组相比,复方中药预处理可以显著降低胆酸(cholic acid,CA)、甘氨胆酸(glycocholic acid,GCA)以及牛磺胆酸(taurocholic acid,TCA)在Transwell细胞小室下室中的浓度(P<0.05),但对DCA无显著作用(P>0.05);2)究其机制而言,复方中药预处理可对抗CA、GCA以及TCA三者导致的Caco-2细胞顶端钠依赖性胆汁酸转运体(apical sodium dependent bile acid transporter,ASBT)、有机溶质转运体β(organic solute transporter,OSTβ)mRNA及蛋白表达水平的升高(P<0.05),但对回肠胆汁酸结合蛋白(ileal bile acid binding protein,IBABP)的mRNA表达无显著影响(P>0.05);复方中药预处理对脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)刺激所引起的ASBT和OSTβmRNA及蛋白表达水平的改变无显著影响(P>0.05),但可对抗IBABP mRNA表达水平的下降(P<0.05);复方中药预处理可对抗GCA以及TCA所导致的OSTαmRNA表达水平的升高(P<0.01),但对CA、DCA无显著影响(P>0.05),提示:复方中药可有效抑制Caco-2细胞对胆汁酸的吸收,但对于不同胆汁酸其抑制作用和机制有所差异。
  3、复方中药对肠道上皮细胞屏障功能保护作用的研究:1)与单纯胆汁酸刺激组相比,复方中药预处理可显著抑制CA、DCA以及GCA导致的细胞渗透性增加(P<0.05)以及TEER值的降低(P<0.05),上述保护作用伴随紧密连接蛋白中咬合蛋白(occludin,Ocln)和闭锁小带蛋白2(zonula occluden2,ZO2)mRNA及蛋白表达水平的显著上调(P<0.05),但对TCA刺激所导致的改变无显著影响(P>0.05);2)在闭合蛋白1(claudin1,Cldn1)mRNA的调控方面,复方中药预处理可显著改善GCA和TCA导致的表达降低(P<0.01),但对CA和DCA的病理作用无显著影响(P>0.05);在ZO1mRNA的调控方面,复方中药预处理可显著改善DCA、GCA和TCA导致的表达降低(P<0.01),但对CA无显著影响(P>0.05);3)复方中药预处理可显著降低CA、DCA和GCA刺激所诱导的细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增高(P<0.05)以及细胞凋亡(P<0.01),但对TCA无显著影响(P>0.05)。提示:复方中药可提供一定的肠道黏膜的保护作用,其对抗不同胆汁酸的保护作用以及机制有所差异。
  研究结论:
  本研究在前期动物在体实验的基础上进一步探讨复方中药抑制胆汁酸吸收及改善肠道上皮细胞屏障功能作用的机制,揭示了:1)复方中药可以有效抑制肠道上皮细胞对胆汁酸的吸收,该作用可能主要是通过下调ASBT和OSTβ基因mRNA及蛋白的表达来实现,其是复方中药抑制胆汁酸吸收的潜在作用靶点;2)复方中药能够显著对抗胆汁酸所引起的肠道屏障功能失调,上述保护作用可能主要是通过调节紧密连接蛋白Ocln和ZO2的表达以及抑制细胞内氧化应激水平和凋亡来实现。综上所述,复方中药可通过抑制胆汁酸在肠道的重吸收及维持肠道上皮细胞屏障功能,即祛除“腑中之痰浊”,从而发挥其降脂抗AS的作用。
[硕士论文] 于宗民
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  基于甘草酸与HMGB1的对接研究结果,及HMGB1与抑郁行为发生的研究进展,本课题选择与蛋白HMGB1相互作用的核心骨架甘草次酸(甘草酸的苷元部分)为先导结构进行优化修饰并考察衍生物的抗抑郁活性。在保留甘草次酸五环三萜母核结构,主要药效基团11位羰基及30位羧基的前提下,重点对甘草次酸A环展开结构修饰。借鉴已有报道中关于三萜酸A环与杂环稠合可提高抗炎活性的研究,尝试将不同杂环结构与甘草次酸A环稠合进而考察这些衍生物的抗抑郁活性。期望A环特定稠合杂环结构及侧链结构的引入能够增强目标化合物与HMGB1的相互作用,同时通过调节目标化合物的脂水分配系数,改善其透过血脑屏障的能力进而更利于其发挥抗抑郁活性,为寻找新型抗抑郁先导化合物提供新的证据。
  方法与结果:
  1、甘草次酸衍生物的设计与合成。通过酯化、氧化、亲核取代、环合及水解反应在甘草次酸A环引入吡唑环、取代吡唑环、吲哚环、取代吲哚环及异噁唑环,得到16个甘草次酸衍生物。以甘草酸、甘草次酸及甘珀酸为阳性对照,在RAW264.7细胞上通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测目标化合物抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β释放的能力,同时检测了目标化合物对NO释放能力的影响。结果表明,N-苯基取代吡唑稠合类衍生物在30μM和10μM浓度条件下表现出较好的抗炎活性。根据这一结果,进一步选择“N-苯基取代吡唑”作为优选结构进行修饰,通过在苯基上引入不同性质的取代基,共合成得到了21个全新结构的N-苯基取代吡唑A环稠合甘草次酸衍生物。所有关键中间体及目标化合物结构均经核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱确证。
  2、甘草次酸衍生物的体外活性研究。将合成得到的衍生物及阳性对照药共计39个化合物在RAW264.7细胞和BV2细胞上进行抗炎活性测试。采用流式细胞技术检测目标化合物抑制RAW264.7细胞释放炎性因子TNF-α、IL-6的能力。结果表明,在30μM和10μM浓度条件下,GA-21T、GA-25T、GA-51T等20个N-苯基取代吡唑稠合类衍生物表现出较强抗炎活性,其中衍生物GA-21T、GA-51T在10μM浓度以下仍能表现出一定的抗炎活性。进一步将抗炎活性较好的20个衍生物在BV2细胞上通过ELISA检测其抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放的能力。结果表明,衍生物GA-25T在BV2细胞上表现出较好的抗炎活性,特别是在10μM浓度条件下,其抗炎效果和氟西汀相当。综合两种细胞的筛选结果,最终确定衍生物GA-21T、GA-25T、GA-51T为优选化合物(三个优选化合物与HMGB1的结合实验正在进行中)。
  3、优选化合物的体内抗抑郁活性评价。采用LPS造模后脑内直接给药以及rHMGB1造模后腹腔给药两种方式来评价优选化合物的体内抗抑郁活性。LPS造模后脑内直接给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以明显改善LPS诱导的抑郁样行为。rHMGB1造模后腹腔给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以明显改善rHMGB1诱导的抑郁样行为。进一步体内实验研究正在进行中。
  4、优选化合物的计算机模拟分子对接研究。通过计算机模拟分子对接技术将优选化合物GA-21T与HMGB1进行模拟对接研究。从分子对接角度阐述优选化合物与HMGB1的结合模式,结果表明优选化合物GA-21T与HMGB1之间有氢键作用,且与甘草酸和甘草次酸的结合模式相似。进一步对接研究正在进行中。
  结论:
  综上所述,本研究以甘草次酸为先导化合物,通过对其A环进行杂环稠合修饰及引入侧链结构,共合成得到了36个甘草次酸衍生物。体外抗炎活性测试表明部分目标化合物具有显著抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放的能力。进一步体内抗抑郁活性评价显示,优选化合物GA-21T可以明显改善LPS及rHMGB1诱导的抑郁样行为。本论文的研究内容具有重要的参考价值,研究结果为寻找新型基于活性天然产物HMGB1抑制剂型抗抑郁先导化合物提供了新的证据。进一步体内抗抑郁活性验证及优选化合物与HMGB1结合活性测试实验正在进行中。
[硕士论文] 杨文军
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着核能技术的不断探索与开发,电离辐射的应用已经广泛深入到生活中的各个方面。这也不可避免的引起公众对电离辐射对身体健康的潜在不利影响的关注。增殖分化旺盛的细胞对电离辐射的敏感程度比较高,比如男性生殖细胞,其作为电离辐射的敏感细胞之一,较容易受到电离辐射引起的损伤,从而对男性的生育能力造成影响。因此迫切需要探索相关可以增强机体抗电离辐射能力的药物来保护工作环境长期处于电离辐射人群的生殖健康。
  姜黄素是一种从姜黄的根茎中分离出来的酚类化合物,具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等生物学作用。研究证实氧化应激在电离辐射诱导的生殖系统损伤中发挥了关键作用,但是姜黄素是否能在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用尚未报道。本课题主要探究了姜黄素在电离辐射致男性生殖系统损伤中的防护作用以及可能的作用机制。
  本课题使用BALB/c雄性小鼠作为动物模型,探究姜黄素对电离辐射损伤男性生殖系统的保护作用。实验结果表明不同剂量的单次电离辐射导致了小鼠的生殖系统损伤。与未辐射的正常小鼠相比,经电离辐射处理后的小鼠睾丸重量以及附睾尾部精子的浓度出现显著降低,HE染色显示电离辐射破坏小鼠睾丸组织正常的生理结构;用TUNEL法检测睾丸组织内的凋亡情况,结果发现电离辐射显著增加了睾丸组织内的凋亡。同样在细胞水平上检测了电离辐射对小鼠精母细胞的影响。结果表明电离辐射处理后细胞的活力出现显著下降,细胞凋亡率明显升高。4Gy的单次辐射剂量破坏了精母细胞正常的线粒体膜电位。辐射后小鼠睾丸以及精母细胞内caspase-3的蛋白水平均升高。接着探究是否姜黄素能够减弱电离辐射对生殖系统造成的损伤。口服姜黄素可显著提高辐射后小鼠睾丸附睾尾部精子浓度,降低睾丸组织内生精细胞的凋亡情况。细胞实验同样发现姜黄素预处理可以显著降低电离辐射引起的细胞活力下降以及细胞凋亡,改善线粒体膜电位。上述实验结果表明姜黄素对电离辐射后的生殖系统具有保护作用。4Gy的单次电离辐射破坏了小鼠以及精母细胞的氧化应激系统之间的平衡。电离辐射处理后,小鼠睾丸内SOD、Total GSH表达水平出现显著降低,MDA和ROS水平显著上升。姜黄素预处理可以明显增加SOD、Total GSH的活性,降低MDA和ROS水平。
  在明确姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用的基础上,进一步探索其发挥保护作用的具体机制。Nrf-2/HO-1信号通路是机体内重要的抗氧化通路,前面的实验结果表明姜黄素预处理可以显著改善小鼠以及细胞内的氧化应激状态。基于这个实验结果,设想Nrf-2/HO-1信号通路参与姜黄素在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤的保护过程。实验结果显示姜黄素预处理可以显著增加精母细胞以及小鼠睾丸组织内Nrf2的蛋白水平,促进Nrf2蛋白从胞浆向胞核内的转移。在精母细胞内对Nrf2基因进行干扰后显著降低了姜黄素对精母细胞的保护作用。
  总而言之,本研究首次报道了姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用。其发挥保护作用的机制可能与通过调控Nrf-2/HO-1抗氧化信号通路维持机体氧化应激状态平衡有关。姜黄素作为祖国传统中草药,其具有副作用小,原料易获取等优点,有可能开发成为一种新的抗辐射损伤防护剂。
[硕士论文] 楼棪
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨转移是乳腺癌患者肿瘤发展的终末期。多达70%的BC患者在尸体解剖时可见骨转移灶。骨转移病灶主要是溶骨性的,因为BC细胞可以调节骨肿瘤微环境。乳腺癌细胞分泌的细胞因子可以进一步促进破骨细胞分化成熟,促进破骨活动,破骨细胞活动增强可释放更多的因子刺激乳腺癌细胞,进一步促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,进一步促进转移病灶的发展。形成一个“恶性循环”。目前治疗BC骨转移的策略主要集中在打破这种“恶性溶骨循环”。绝大多数乳腺癌产生溶骨性骨转移。该过程的特征在于过度活化的破骨细胞形成和随后的骨破坏。BC细胞在定植于骨之后,甚至之前,可形成一个复杂的多基因程序性“恶性溶骨循环”,重塑骨微环境,促进癌症发展。IL-6,PTHRP(甲状旁腺激素相关蛋白)和TNFα(肿瘤坏死因子α)等BC细胞分泌的细胞因子可刺激成骨细胞,上调RANKL/OPG(骨保护素)比例,从而进一步刺激髓系破骨细胞前体细胞的分化。同时其他细胞因子如IL-11(白细胞介素11)和OPN(骨桥蛋白)也能直接促进其向破骨细胞分化。活化的破骨细胞降解骨基质,并释放主要储存在骨基质中的TGFβ(转化生长因子β),BMPs(骨形态发生蛋白)和IGFs(胰岛素样生长因子),反过来,促进BC进展。
  有研究已经证明了乳腺癌细胞系中PAF及其受体PTAFR的表达。在肿瘤微环境中,PAF由浸润的炎症细胞和肿瘤细胞本身分泌和积累,形成自分泌循环。PTAFR是G蛋白偶联受体(GPCR)。PAF/PTAFR信号通路激活导致复杂的细胞反应,包括细胞运动的增加,IL-6(白细胞介素6)和MMP(基质金属蛋白酶)表达的上调以及NF-κB信号的激活。迁移能力的增加是癌细胞形成转移性病变的重要特征,包括骨转移。已发表的文献和我们的结果都揭示了PAF处理后乳腺癌细胞的迁移能力增加。
  在本实验中,我们首先通过生物信息学分析提供了PAF/PTAFR信号通路在调节BC骨转移和破骨细胞生成中起重要作用的线索。
  在目前的研究中,我们证明PAF可以促进BC细胞迁移并诱导BMMs分化。海风藤酮可以减弱这两个过程,并且表现出很小的细胞毒性,可以被认为是BC骨转移的潜在治疗剂。与“恶性溶骨循环”相比,PAF能够通过两种平行方式促进BMMs分化为破骨细胞。一方面,PAF能刺激BC细胞上调IL-6,IL-11,MMPs和NF-κB等下游信号,进一步激活破骨细胞生成。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。在目前的研究中,我们证明了海风藤酮可以抑制BC诱导或PAF直接刺激破骨细胞生成。海风藤酮处理后破骨细胞分化标记的表达均下调。这个过程主要是由于NF-κB激活的抑制。
  总之,海风藤酮可能是一种有效的策略,通过阻断PAF/PTAFR信号通路,减弱乳腺癌形成的溶骨性骨转移。
[硕士论文] 吴然
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:中药复方化学成分的分析和鉴定有助于揭示复方的药效物质基础,从而进一步阐明其多成分、多靶点、多途径的作用特点。但由于复方中体外化学成分结构的多样性,体内活性成分复杂的基质效应以及代谢产物的微量性等特点,如何全面、高效地分析和鉴定中药复方的体内外化学成分是中医药现代化研究的关键问题。
  芪精升白颗粒(Qi-Jing-Sheng-Bai granule,QJSB)是治疗放化疗之后白细胞减少症的中药升白剂,该方由黄芪、鹿角胶、西洋参、淫羊藿、当归、黄精、墨旱莲、枸杞子、补骨脂、鸡血藤十味药材按照6∶1∶2∶3∶2∶2∶3∶2∶2∶6的比例配伍而成,临床效果显著。由于芪精升白颗粒体内外主要化学成分研究不明确,限制了其作用机制的科学阐释,更阻碍了芪精升白颗粒的产业化与国际化。
  本课题以芪精升白颗粒为研究对象,综合运用各种指导理论及先进技术,从芪精升白颗粒体外成分、入血原型成分及其代谢产物等多个方面阐明其潜在的活性物质。具体研究内容如下:
  采用超高效液相串联高分辨质谱的数据采集技术结合UNIFI数据处理平台对芪精升白颗粒的体外化学成分进行鉴定。首先,建立芪精升白颗粒的in-house数据库平台:通过对十味组方药材化学成分进行文献调研,共检索出1501个化合物,并对各化合物的结构式、分子量、分子式等具体信息汇总;其次,对已知化学成分进行表征:利用UNIFI软件对in-house数据库与复方提取液的质谱数据进行匹配分析,通过总结不同结构类型化合物的质谱裂解规律结合对比标准品和参考文献的方法,共从芪精升白颗粒中鉴定出138个化学成分,其中包括6对同分异构体;最后,对未知化学成分进行解析:基于已知成分的裂解规律,利用中性丢失检索和特征碎片检索等数据挖掘技术对未知化学成分分析,共从复方中鉴定5个环黄芪醇型皂苷类化合物。综上所述,利用以上分析策略共从芪精升白颗粒复方提取液中鉴定出143个成分,包括5个未知化学成分,以上化合物按照结构可分为黄酮类(56个)、皂苷类(51个)、香豆素类(5个)、木脂素类(3个)、酚酸类(6个)、生物碱类(3个)、氨基酸类(2个),并将化合物归属到单味药材与相应色谱峰中。
  在体外化学成分研究的基础上,以血清药物化学为指导理论,对芪精升白颗粒入血原型成分及其代谢产物进行详细分析。通过多元统计分析软件对给药大鼠血清和空白大鼠血清进行差异性分析,两组的差异变量即为原型入血成分和代谢产物。首先,鉴定原型入血成分:通过扣除空白大鼠血清中基质峰,给药大鼠血清与芪精升白颗粒提取液的共有色谱峰即为原型入血成分,结合体外化学成分in-house数据库以及标准品对比的方法,在给药大鼠血清中共鉴定出24个原型入血成分,包括黄酮类(13个)、酚酸类(2个)、皂苷类(6个)、香豆素类(1个)、氨基酸类(2个)化合物。其次,建立芪精升白颗粒代谢产物数据库:利用软件MetaboLynx对入血原型成分在体内的代谢反应进行预测,共得到382个潜在代谢成分,从而建立芪精升白颗粒代谢产物库;最后,鉴定代谢产物:通过扣除芪精升白颗粒提取液中的共有色谱峰,给药大鼠血清与空白血清中的差异性色谱峰即为代谢产物,结合代谢产物数据库与中性碎片丢失检索以及提取离子流等数据挖掘技术,在给药大鼠血清中共鉴定18个代谢产物,包括异黄酮类(6个),异戊烯基黄酮类(6个),酚酸类(2个),二氢黄酮类(2个),皂苷类(2个)化合物,主要涉及的体内生化反应为水解反应、氧化反应、羟基化反应、葡萄糖醛酸化反应和磺酸化反应等。
  综上所述,本课题对芪精升白颗粒体内外化学成分进行全面系统的分析,从而为其质量控制以及作用机制研究提供科学的数据支持。此外,本研究所建立的整体分析策略为其他中药复方等复杂系统的成分分析提供了借鉴意义。
[博士论文] 邹玉明
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性、自身免疫性疾病,以滑膜过度增殖和炎症细胞浸润为特点,导致关节的慢性炎症以及继发软骨和骨的侵蚀。类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)是炎性滑膜的重要组成部分,是类风湿关节炎发病过程中相关病理损伤的关键参与者。
  传统的改变病情抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs),如甲氨蝶呤,病人的长期使用会产生耐药性,在一部分病人的应用过程中逐渐失去效果。近年来生物制剂的大力发展和应用极大革新了RA的治疗,临床上常常将生物制剂与DMARDs联合应用于RA患者,更好的控制和缓解了病情。尽管生物制剂改善了对传统DMARDs不敏感病人的治疗,但是生物制剂价格昂贵、需要胃肠外给药、增加感染和癌症的风险是其缺点。因此继续发展和筛选治疗RA的临床新药物具有重要意义。
  苦参碱是从一类传统中草药苦参等植物中提取出的生物活性碱,它有一系列的药理学活性,如有抗肿瘤、抗炎与免疫调节、抗病毒、抗纤维化、抗寄生虫、心血管保护、抗骨质疏松等。但是目前为止,苦参碱还没有发展为应用于临床的药物,这与其给药剂量大,药物活性低有关。在苦参碱结构基础上研发的苦参碱衍生物MASM[(6aS,10S,11aR,11bR,11cS)210-Methylamino-dodecahydro-3a,7a-diaza-benzo(de)anthracene-8-thione]表现出比苦参碱更好的药理学活性。已有文献报道苦参碱衍生物MASM具有抗炎、免疫调节、抗肝纤维化、放射保护等作用,但是还没有研究评估其对RA的治疗是否具有治疗作用。本研究从行膝关节置换的RA病人身上获取炎性滑膜组织,体外分离培养获取人源性原代RA-FLSs,在体外建立RA细胞模型,以及建立胶原诱导的小鼠关节炎模型,通过体外和体内实验评估苦参碱衍生物MASM对RA治疗的潜在药用价值。
  方法:
  1.胶原酶消化法体外分离培养出入源性原代RA-FLSs,并在传代培养的第三代对细胞进行流式鉴定;
  2.用CCK8实验探究苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs体外增殖的影响;
  3.实时荧光定量RCR实验探究苦参碱衍生物MASM对IL-1β激活的RA-FLSs炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8以及基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3、MMP-13基因表达的影响;
  4.AnnexinⅤ-FITC/PI双染后用流式细胞仪检测MASM对RA-FLSs细胞凋亡的影响;
  5.用苦参碱衍生物MASM预处理后,IL-1β激活RA-FLSs细胞48小时后:JC-1染色,流式细胞仪检测RA-FLSs细胞线粒体膜电位的下降;提取蛋白(cytochrome c提取胞浆蛋白检测),Western blot检测凋亡的线粒体通路相关蛋白Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved caspase9、pro-caspase3、cleaved caspase3、Cleaved PARP;Caspase3活性试剂盒检测RA-FLSs细胞中capsase3活性;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光及westemblot检测RA-FLSs自噬相关标记物p62、Beclin-1、LC3的表达变化;
  7.利用自噬抑制剂CQ抑制自噬后,观察苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡诱导作用的影响;
  8.苦参碱衍生物MASM预处理后,继续用IL-1β激活RA-FLSs,蛋白收样后Western blot检测磷酸化Akt及总Akt蛋白表达水平;
  9.MAPKs和NF-κB信号通路与RA发病密切相关。用苦参碱衍生物MASM预处理RA-FLSs后,IL-1β短时间处理激活RA-FLSs中MAPKs和NF-κB信号通路。总蛋白抽提后,Western blot检测MAPKs信号通路中的磷酸化Erk1/2、磷酸化JNK、磷酸化p38以及相应总蛋白的表达水平;核蛋白抽提试剂盒分离胞浆蛋白和核蛋白,分别检测核蛋白中NF-κB/p65入核水平以及胞浆蛋白中IκBα的表达变化;将DBA/1小鼠分为正常组、阳性CIA对照组、低剂量(苦参碱衍生物MASM10mg/kg组)和高剂量组(苦参碱衍生物MASM30mg/kg组)。
  10.用Ⅱ型胶原诱导小鼠建立RA动物模型——胶原诱导的关节炎模型。实验组灌胃给药,对照组给生理盐水1次/天;关节炎炎症指数评分对关节红肿的临床表现进行评分,诱导28天后每两天统计一次;
  11.收集小鼠组织样本,固定、脱钙、切片后HE染色观察小鼠足踝部关节组织病理改变,并对滑膜炎症进行评分;
  12.收集小鼠组织样本,固定后行Micro-CT扫描,三维重建后观察小鼠足爪部整体骨损伤并进行评分;
  13.眼眶取血,室温凝固后离心收集血清,ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;
  14.切片样本进行TNF-α免疫组化染色,观察各组间关节局部TNF-α表达水平。
  结果:
  1.胶原酶消化培养法从可以从滑膜组织中培养出RA-FLSs,经过细胞换液和传代可以获得细胞成分较为均一、形态类似成纤维细胞的细胞成分。经CD90标定后流式鉴定,CD90阳性细胞>90%,表明获取细胞大部分为RA-FLSs,可以用于后续实验;
  2.CCK8实验表明苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs的增殖,且体现出剂量和时间依赖性;
  3.IL-1β可以激活RA-FLSs,诱导其炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8)以及MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-13)的表达明显升高,苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs上述炎症因子和MMPs的表达,且随着给药浓度的升高,抑制作用增强;
  4.MASM预处理1小时后,IL-1β继续刺激RA-FLSs48小时,流式细胞仪检测AnnexinⅤ-FITC/PI双染,结果显示5~20μM苦参碱衍生物MASM可以明显诱导RA-FLSs细胞凋亡,呈剂量依赖性;
  5.Jc-1染色后流式检测RA-FLSs线粒体膜电位的下降,随着MASM浓度的增加,线粒体膜电位的下降呈递增趋势;Western-blot检测凋亡的线粒体途径相关蛋白,结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降、促凋亡蛋白Bax的表达升高、胞浆内细胞色素c蛋白水平升高、下游的cleaved caspase9表达升高,pro-caspase3表达下降而cleaved caspase3表达升高,凋亡标志物Cleaved PARP的表达升高,且所有蛋白的表达水平均与苦参碱衍生物MASM的给药剂量相关;可以明显提高caspase3的活性,且呈剂量依赖性,与蛋白表达结果相符;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光结果显示苦参碱衍生物MASM可诱导RA-FLSs中LC3的点状聚集;Western blot检测自噬相关蛋白标志物p62、Beclin-1、LC3的结果显示,5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以导致p62的表达下降,而Beclin-1、LC3B-Ⅱ的表达升高;
  7.用CQ阻断细胞自噬后,苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡促进作用得到进一步加强;
  8.Western blot检测相应处理后RA-FLSs细胞内磷酸化Akt和Akt总蛋白表达结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理可以抑制Akt的磷酸化,但是对Akt总蛋白的表达影响不大;
  9.Western blot检测MAPKs和NF-κB信号通路蛋白结果显示,IL-1β2ng/ml处理30分钟可以激活RA-FLSs,明显诱导Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,5~20μM苦参碱衍生物MASM可以抑制Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,且在20μM时抑制作用最明显,但对Erk1/2、JNK和p38总蛋白的表达影响不大;IL-1β2ng/ml处理RA-FLSs30mins可以明显减小胞浆中IκBα的表达水平,诱导NF-κB/p65入核,而5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以剂量依赖性扭转这一趋势。
  结论:
  苦参碱衍生物MASM可以抑制RA发病过程中的关键细胞RA-FLSs炎症因子以及MMPs的表达,抑制RA-FLSs细胞增殖,通过线粒体途径促进RA-FLSs凋亡,并且可以明显上调RA-FLSs中细胞自噬的水平。此外,通过自噬抑制剂CQ抑制RA-FLSs中的细胞自噬,可以进一步增强苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs凋亡诱导作用。此外,苦参碱衍生物MASM可以明显抑制RA-FLSs中与RA发病密切相关的MAPKs以及NF-κB信号通路的信号转导。在体内实验部分发现,苦参碱衍生物MASM可以缓解CIA小鼠动物模型中的关节局部和全身的炎症水平以及关节的组织破坏。综上所述,苦参碱衍生物MASM是治疗RA的潜在药物,具有进一步研发的价值。联合应用苦参碱衍生物MASM以及自噬抑制剂CQ或HCQ,有可能进一步增强其对RA的治疗效果,但仍需进一步研究进行评估。
[博士论文] 李娇
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:海洋无脊椎动物在特殊的海洋环境中经过长期的进化,形成了复杂的代谢体系,能产生独特的化学物质,不仅可以用于动物自身防御,还为人类疾病治疗提供大量用于临床或临床前研究的候选药物。在对海洋无脊椎动物研究的过程中,越来越多的研究发现有些次生代谢产物的真正来源是这些动物的共附生微生物,因此学者的目光转移到了海洋微生物上,近年来,海洋来源微生物尤其是海洋真菌的研究得到了快速发展。海洋真菌的次级代谢产物结构多样新颖,也是活性物质的重要来源,不仅可为新药研发提供先导化合物,还可通过微生物发酵解决先导药物的来源问题。
  基于以上前提,以及作为课题组从海洋无脊椎动物及其共附生微生物中寻找先导化合物工作的延续,本文对采自中国西沙海域的四种无脊椎动物隋氏蒂壳海绵Theonella swinhoei、冷柳珊瑚属珊瑚Iciligorgia sp.、豆荚软珊瑚属珊瑚Lobophytum sp.、短足软珊瑚属珊瑚Cladiella sp.进行了以活性为导向的化学成分研究;运用化学和活性相结合的手段对分离自海洋无脊椎动物的15株真菌进行了筛选,得到2株有研究价值真菌菌株Aspergillus ochraceopetaliformis、Stemphylium lycopersici,并对这2株真菌进行了化学成分研究;最后,结合参考文献本文对分离得到的部分化合物进行了酶抑制、调节免疫T细胞增殖、调节破骨细胞分化、抗肿瘤干细胞样细胞、抗真菌的活性筛选,部分化合物显示出良好的生物活性。
  运用正、反相硅胶柱色谱层析、葡聚糖凝胶柱层析、高效液相等多种色谱分离纯化方法,从以上6种样品的提取物中共分离得到105个化合物;依靠核磁共振、质谱、计算ECD等多种结构鉴定手段,并结合文献检索,鉴定了这些化合物的结构,分离得到的化合物类型包括甾体类、二萜类、倍半萜类、聚酮类、醌类、肽类、其他类。其中新化合物31个,包括6个4-亚甲基甾体化合物(h1~h4、h6~h7),4个9,10-开环甾体(f19、f20、f26、f27),1个9,11-开环甾体(f38),12个eunicellin型二萜(f1~f5、f8~f14),6个西松烷型二萜(d1~d6),1个蒽醌类化合物(s1),1个酰胺类化合物(s10)。
  从隋氏蒂壳海绵Theonella swinhoei中分离得到12个化合物,其中6个甾体化合物h1、h2、h3、h4、h6、h7为新化合物,二萜化合物h11为首次从海绵中分离得到,化合物h12为首次从该属海绵中分离得到。
  从冷柳珊瑚属珊瑚Iciligorgia sp.中分离得到49个化合物,其中12个eunicellin型二萜(f1~f5、f8~f14)、4个9,10-开环甾体化合物(f19、f20、f26、f27)和1个9,11-开环甾体化合物(f38)为新化合物,eunicellin型二萜化合物f15为新天然产物。经检索,本文是对冷柳珊瑚属Iciligorgia sp.化学成分的首次报道。
  从豆荚软珊瑚属珊瑚Lobophytum sp.中分离得到9个化合物。其中6个西松烷型二萜(d1~d6)为新化合物,二萜二聚体化合物d8和倍半萜化合物d9为首次从该属珊瑚分离得到。
  从短足软珊瑚属珊瑚Cladiella sp.中分离得到8个化合物,均为已知倍半萜类化合物,其中化合物b1、b4、b5、b6、b7为首次从该属珊瑚中发现,化合物b3之前都是从陆地中发现的,本文为首次从海洋生物中发现。
  从苔海绵共附生曲霉属真菌Aspergillus ochraceopetaliformis中分离得到17个化合物。所得化合物类型涉及聚酮、倍半萜、萘醌、肽类等,均为已知化合物,结构类型多样,说明这种真菌的代谢途径的多样性。
  从蕾二歧灯芯柳珊瑚的共附生真菌Stemphylium lycopersici中分离得到10个化合物:macrosporin2-O-α-D-glucopyranoside(s1),macrosporin(s2),dihydroaltersolanol B(s3),alterporriol U(s4),2-phenylethyl-α-D-glucopyranoside(s5),(S)-2-hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)propanoic acid(s6),latifolicinin C(s7),methyl4-hydroxybenzoate(s8),methyl4-hydroxybenzoate(s9),methyl(E)-4-(5-hydroxy-3-methylpent-2-enamido)butanoate(s10)。其中新化合物2个,包括1个蒽醌类化合物(s1)和1个链状酰胺类化合物(s10),苯烷基糖化合物s5为该属真菌首次分离得到。
  对化合物h1~h4和h7有针对性地进行了(h)p300酶抑制活性测试,化合物h1对与多种疾病相关的组蛋白乙酰转移酶(h)p300显示出中等的抑制活性,IC50值为8.84μM。为该类化合物进行(h)p300构效关系研究提供了依据。
  采用刀豆蛋白激活的小鼠脾脏原代CD4+T细胞模型测试了30个冷柳珊瑚中分离得到的甾体化合物f19~f45、f47~f49对CD4+T细胞增殖的调节作用,结果显示,13个化合物f19~f21、f23~f25、f26、f28、f30、f31~f34在给药第五天和第七天都显著抑制CD4+T细胞的增殖;六个化合物f35~f37、f43、f44、f48在给药七天对CD4+T细胞显示出抑制作用;化合物f38给药第七天起促进作用,化合物f45给药第五天起促进作用但第七天作用消失。CD4+T细胞是免疫系统中一种重要的免疫细胞,免疫系统与艾滋病、炎症、排异反应、肿瘤等多种疾病的发生发展相关,因此这些活性化合物可以作为潜在的免疫调节剂进行深入研究。
  从冷柳珊瑚中发现的甾体化合物与骨质疏松替代疗法的雌激素结构类似,而且骨代谢疾病的发生与免疫系统也息息相关,因此本文对这些甾体化合物进行了破骨细胞分化活性的筛选。采用TRAP染色的方法,测试了22个甾体类化合物f20~f22、f24~28、f35~37、f39~f45、f47~f49对原代小鼠骨髓单核巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化的影响。测试结果显示,4个化合物f37、f39、f47、f48显示出抑制BMMs向破骨细胞分化的活性,8个受试化合物f24~f26、f40、f42~f45显示出促进破骨细胞分化的活性。破骨细胞与骨质疏松、骨硬化等骨代谢疾病密切相关,对破骨细胞分化有调节作用的化合物可以作为骨代谢疾病治疗的潜在活性物质进行研究。
  另外,本文采用CCK-8方法,对16个9,10-开环甾体化合物f19~f34、5个二萜化合物d7、d8、d9、t11、t12,3个肽类化合物t13、t16、t17,1个内酯化合物t6,进行了肝癌Huh7干细胞样细胞的生长抑制活性测试。结果显示,化合物f19、f20、f21、f22、f24、f25、f27、f28、f31、f33、f34、t11的IC50值在21.5~62.7μM,其他受试化合物对肝癌Huh7干细胞样细胞无生长抑制活性。
  最后,本文采用抗真菌实验,对37个化合物t3~t6、t9~t14、t16、t17、f19、f22、f24~f26、f28、f32~f34、f36~f39、f43、f47、b1、b2、d7~d9进行了抗真菌活性评价,结果显示,化合物对白假丝酵母菌(Candida albicans)和近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)均无抑菌作用(MIC80>64μg/ml)。
  本研究共分离得到105个化合物,其中新化合物31个,扩充了对应结构类型的种类和数量,为课题组寻找活性先导化合物提供了物质基础。本研究对分离得到的部分化合物运用活性模型进行了活性评价,筛选出1个p300抑制剂h1,21个对CD4+T细胞增殖有调节作用的化合物,12个调节破骨细胞分化的活性化合物,12个肝癌Huh7干细胞样细胞生长抑制剂。为化合物的生物活性研究和结构优化提供了科学依据,丰富了中国海洋天然产物的研究资料。
[博士论文] 陈瑞兵
生药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:板蓝根是十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的根,具有良好的抗病毒活性。中成药板蓝根颗粒被广泛用于治疗风热感冒,咽喉肿痛,病毒性感染以及传染病流行期间的预防。其有效成分是以直铁线莲宁B(clemastanin B)和落叶松脂素-4-O-葡萄糖苷(lariciresinol-4-β-D-glucopyranoside)为代表的木脂素群(lignans)。木脂素是一类由两分子苯丙素(C6-C3单体)通过氧化耦合反应(oxidative coupling reaction;酚类氧化自由基反应,phenoxy radical coupling reaction)聚合而成的衍生物,一般含有多个手性中心,多数木脂素具有旋光性。在植物体内氧化耦合反应常常存在位置选择和立体选择(regio-and stereoselectivity),使得木脂素主要以一种立体构型存在。有效成分直铁线莲宁B和落叶松脂素-4-O-葡萄糖苷是以(+)-落叶松脂素((+)-lariciresinol,(+)-Lar)为母核的糖苷。因此阐明板蓝根体内木脂素生物合成立体选择性的产生机制和生物学意义,对于板蓝根的定向代谢工程具有重要的意义。
  本研究从菘蓝木脂素氧化耦合反应的位置选择性和立体选择性出发,从根中克隆得到两个编码指导蛋白(dirigent protein,DIR)的基因,即IiDIR1和IiDIR2,以及松脂醇还原酶基因(IiPLR1),通过体外酶活实验和过表达毛状根系,通过体内外酶活性实验发现了IiDIR1和IiDIR2在木脂素合成中的位置选择性,还发现IiDIR1、IiDIR2均为(-)-DIR,与IiPLR1共同决定了菘蓝根中落叶松脂素生物合成的立体选择性。进一步筛选得到一个直接调控木脂素代谢转录因子IiAP2/ERF008,通过体外电泳迁移率试验(EMSA),酵母单杂交试验(Y1H)和过表达毛状根系证明其可以通过结合IiDIR1启动子并上调其表达,进一步激活木脂素代谢,从而提高菘蓝毛状根中木脂素的含量。
  本研究首先对菘蓝毛状根转录组数据进行分析,一共筛选得到19条DIR蛋白(IiDIR1~IiDIR19),进一步通过生物信息学分析,时空表达实验和亚细胞定位实验,从19条IiDIR中筛选得到2条潜在参与(-)-松脂醇((-)-pinoresinol,(-)-Pin)生物合成的DIR蛋白,命名为IiDIR1和IiDIR2。
  为了阐明DIR蛋白的体外催化功能,使用毕赤酵母(Pichia pastoris)对IiDIR1和IiDIR2进行真核表达,并通过镍琼脂糖亲和层析技术对蛋白进行纯化,通过蛋白免疫印迹(western blotting)验证了纯化蛋白的特异性,最终得到浓度分别为0.3mg ml-1(IiDIR1),0.5mg ml-1(IiDIR2)的纯化蛋白。体外酶活性实验发现IiDIR1和IiDIR2能够实现氧化耦合反应过程的位置选择和立体选择,指导合成(-)-Pin。综上本研究首发现菘蓝IiDIR1和IiDIR2均为(-)-松脂醇合成指导蛋白((-)-pinoresinol forming DIR,(-)-DIR),而非(+)-松脂醇((+)-pinoresinol,(+)-Pin)合成指导蛋白((+)-pinoresinol forming DIR,(+)-DIR),参与(-)-Pin的合成。
  为了阐明IiDIR1和IiDIR2的体内生物学功能,本研究使用发根农杆菌C58C1和过表达载体(pHB-X-myc)通过叶盘转化法成功构建并获得IiDIR1和IiDIR2过表达的菘蓝毛状根系(IiDIR-OVX和IiDIR2-OVX)。在菘蓝IiDIR-OVX和IiDIR2-OVX毛状根中,木脂素代谢整体上调。在基因水平,包括DIR在内的木脂素代谢途径基因表达量显著上调;在代谢水平,显著提高了毛状根中木脂素和木质素的积累,对木脂素立体选择性产生了影响。因此本研究首次证明IiDIR1和IiDIR2在木脂素生物合成过程中,除了参与氧化耦合反应的位置选择和立体选择外,作为关键酶(key enzyme)还能够激活上调木脂素和木质素的代谢。
  为了阐明松脂醇还原酶1(IiPLR1)对木脂素旋光性形成的影响,使用大肠杆菌(E.coli.)对其进行原核表达和纯化,获得浓度为5μg ml-1的纯化蛋白。体外功能显示IiPLR1能够连续催化两步反应,首先无选择性地催化(+)-Pin和(-)-Pin分别生成(+)-Lar和(-)-落叶松脂素((-)-lariciresinol,(-)-Lar)。然后进一步选择性地催化(-)-Lar生成(+)-开环异落叶松脂素((+)-secoisolariciresinol,(+)-SLar),较弱地催化(+)-Lar生成(-)-开环异落叶松脂素((+)-secoisolariciresinol,(-)-SLar),第二步反应过程中发生了旋光性的改变。
  进一步结合体内和体外酶活性实验首次证明IiDIR1和IiDIR2作为(-)-DIR除了参与氧化耦合反应合成(-)-Pin外,还能够协同IiPLR1,提高反应效率,增加产物含量。尤其是IiDIR2可以选择性地显著提高(+)-SLar的合成。本研究首次证明DIR除了参与松脂醇(pinoresinol,Pin)的生物合成外,还参与到落叶松脂素(lariciresinol,Lar)和开环异落叶松脂素(secoisolariciresinol,SLar)的生物合成中,拓展了对DIR蛋白功能的认识。
  基于木脂素和木质素对植物在逆境环境下的生长具有保护重要作用,对毛状根进行不同生物和非生物胁迫的处理,通过实时定量PCR技术(qPCR)对木脂素途径基因表达水平进行检测,发现IiDIR1和IiDIR2对于非生物盐胁迫NaCl,氧胁迫H2O2以及生物胁迫鞭毛蛋白(flg22)的响应极为强烈。在不同激素处理条件下,IiDIR1和IiDIR2的表达同时处于多种植物激素的调控网络中,受到乙烯(ET),莱莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)的协同或拮抗调控。IiDIR1和IiDIR2均受到ET和MeJA的上调作用,ABA能够抑制IiDIR1的表达,却能促进IiDIR2的表达。在逆境胁迫试验中发现IiDIR1和IiDIR2的过表达毛状根比野生型毛状根具有更多的生物量积累和更快的生长速率。由此本研究暗示IiDIR1和IiDIR2通过木脂素和木质素的代谢,对菘蓝毛状根抵御逆境胁迫具有一定作用。
  为了探究IiDIR1和IiDIR2对激素的响应机制,对IiDIR1和IiDIR2的启动子进行分析,发现IiDIR1的启动子区域具有保守的GCC-box,提示IiDIR1是通过乙烯应答转录因子(AP2/ERF)对外界环境做出响应的。通过转录组数据分析,共得到119条IiAP2/ERF转录因子,通过生物信息学分析方法,进一步定位得到一个潜在调控IiDIR1的转录因子IiAP2/ERF008。qPCR分析证明该转录因子对逆境胁迫和植物激素的响应模式与IiDIR1完全一致。在体外EMSA和Y1H证实BERF008可以稳定高效地结合IiDIR1启动子的GCC-box。在体内,成功构建并获得IiERF008的过表达毛状根系(IiERF008-OVX),在IiERF008-OVX毛状根中,包括IiDIR1在内的木脂素合成基因表达量显著上调,木脂素含量显著提高。结合体内外实验充分说明IiAP2/ERF008能够通过顺式作用元件GCC-box调控IiDIR1的表达水平,进一步调控菘蓝根中木脂素的代谢,从而对植物激素或逆境胁迫做出响应。
  综上所述,本研究对菘蓝木脂素的生物合成和生物学功能进行了详细深入的讨论。发现IiDIR1和IiDIR2能够指导(-)-Pin合成,均为(-)-DIR;还发现IiPLR1能够无选择性地催化(+)-Pin或(-)-Pin产生等量的(+)-Lar或(-)-Lar,进一步选择性地催化(-)-Lar生成(+)-SLar,对(+)-Lar的反应活性很低;在此基础上,发现IiDIR1和IiDIR2能够协同IiPLR1继续参与下游木脂素代谢中Lar和SLar的合成,拓展了对DIR蛋白功能的认识;研究发现IiDIR1和IiDIR2除调节木脂素代谢外,还可以调节木质素代谢,暗示对于增加毛状根生物量和抵御外界胁迫具有重要作用;研究阐明菘蓝IiDIR1和IiDIR2处于多种激素和逆境胁迫的调控网络中,并通过IiAP2/ERF008转录因子的直接调控作用对激素和逆境胁迫做出响应,对于进一步解析菘蓝木脂素的抗逆功能具有借鉴意义;本研究基于IiDIR1、IiDIR2和IiAP2/ERF008的生物学功能,进行了基因过表达毛状根的代谢工程研究,IiDIRI、IiDIR2即使为(-)-DIR,却仍然显著提高了毛状根中有效物质前体(+)-Lar的含量。综上所述IiDIR1、IiDIR2和IiAP2/ERF008是兼具改良菘蓝木脂素含量和逆境抗性的十分有潜力的靶标基因,对于后期开发高活性产物积累的菘蓝优质品种具有重要的理论意义和应用价值。
[硕士论文] 孔周扬
中药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:植物内生真菌是指在生活史中的某一个阶段存在于健康植物组织内部,不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌。
  丹参是双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物,是一种常用的药用植物,具有活血祛瘀,通经止痛,清心除烦,凉血消痈之功效;三尖杉是一种常绿乔木,亚热带特有植物,产于浙江、安徽南部、福建、江西、湖南等省区,具有驱虫,消积,抗癌的功能,用于治疗咳嗽,食积,蛔虫、钩虫病。而次生代谢产物是指某些微生物生长到稳定期前后,以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢物为前体,通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂的化合物。目前大量的研究表明内生真菌次生代谢产物种类丰富、结构新颖、生物活性多样,是一座为人类提供生物活性物质的宝库。本课题组致力于药用植物内生真菌生物多样性、化学多样性和宿主相关性的研究。在前期研究中,课题组从丹参和三尖杉中分别分离并鉴定出了深绿木霉菌,分别编号为D16和S361,其中D16能产生丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA,而在S361次生代谢产物中并没有发现丹参酮类的物质。查阅文献后发现,有报道显示在不同宿主中生长的其它属的同种内生真菌能产生和宿主活性成分类似的次生代谢产物,猜想在D16和S361的次生代谢产物中是否也会出现类似的现象。
  本文对分离自浙江省建德市三尖杉的深绿木霉菌株(Trichoderma atroviride S361)和分离自陕西商洛丹参的深绿木霉菌株(Trichoderma atroviride D16)进行了系统的次生代谢产物及其生物学活性研究。
  采用大米培养基对D16菌株进行发酵培养,采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱等方法对其发酵培养物中的次生代谢产物进行分离纯化,采用各种波谱数据(NMR,MS,IR,CD)以及文献对照等手段进行鉴定,共分离鉴定化合物17个,包括3个新化合物(3个倍半萜类的化合物)和14个已知化合物(包括了5个酯类化合物,2个酸类化合物,1个酚类化合物,1个醇类化合物,1个酮类化合物,3个倍半萜的化合物,1个二萜类化合物)。
  采用大米培养基对S361菌株进行发酵培养,采用硅胶柱色谱、OD柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱仪等方法对其发酵培养物中的次生代谢产物进行分离纯化,采用各种波谱数据(NMR,MS,IR,CD)以及文献对照等手段进行鉴定,共分离鉴定化合物16个,包括4个新化合物(2个酰胺类的化合物,1个倍半萜类的化合物,1个二萜类的化合物)和12个已知化合物(包括了3个内脂类的化合物,1个酚类的化合物,3个生物碱类的化合物,3个倍半萜的化合物,1个二萜类化合物,1个醌类的化合物)。
  在广泛查阅文献后,推测萜类的5个新化合物具有抗炎活性,采用LPS刺激的方式对相关化合物进行了抗炎生物活性测试,发现它们均没有抗炎活性。
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