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[硕士论文] TAN KIAN ANN
AQUACULTURE 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:乌鳢(Channa argus)是中国水产养殖里重要的土著鱼类品种,其生长速度快、适应性能力强、养殖产量高等特点。乌鳢在东南亚各国的市场需求不断提高,是中国水产养殖行业外贸出口的主要淡水鱼之一,经济价值较高。在自然环境中,乌醴生命力强,极少患病。随着乌鳢的水产养殖规模不断的扩大和养殖密度的提高,导致乌鳢的病害频发,受影响的范围越来越广,造成养殖户们巨大的损失。主要感染乌鳢发病的病菌原是鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae),又称结节病。诺卡氏菌(Nocardia sp.)是革兰氏阳性菌,此菌属兼性细胞内病原。被诺卡氏菌感染的病鱼起初的体表没出现明显的症状,其反应变得迟钝、食欲不断的下降、乌鳢一直上浮水面;随着病情越发严重,部分的鱼体表逐渐变黑、腹部不断膨大、鳍条出现充血症状,心、脾、肾、肝等内脏器官都会出现直径1-5mm的乳白色结节,有些病鱼还会有眼球凸起、肛门红肿和腹水等的症状。
  本研究以被鰤诺卡氏菌感染的乌鳢为研究对象,使用Illumina高通量测序技术对被鰤诺卡氏菌感染的乌鳢的头肾组织进行转录组深度的测序。应用短序列组装软件Trinity对测序结果进行从头组装,建立转录组数据库;将转录组数据与NR、KEGG、KOG和Swiss-Prot等蛋白数据库进行序列对比;将得到的序列进行GO功能注释和KEGG代谢通路分析;SSR重复序列注释和预测编码蛋白框(CDS)进行分析;对实验组和对照组的差异基因表达水平进行深度分析,筛选出与感染鰤诺卡氏菌相关的一些基因。然后对非特异性免疫系统的二个经典的信号通路进行分析,研究其信号通路Toll样受体的信号通路(TLR)和NOD样受体的信号通路(NLR)。主要研究结果如下:
  经过RNA-Seq测序,对照组和实验组分别获得35779908和36574025的clean reads,组装获得133999条最长16393bp和最短224bp的unigenes。其N50值和N90值分别是1460和315。所获得的unigenes与四大蛋白数据库进行blastx比对,发现有106319条unigenes(占79.34%)被注释,其中分别有5753unigenes通过GO功能注释(4.29%)、KEGG通路分析有5885条unigenes(4.39%)、NR有54886条unigenes得到注释(40.97%)、Swiss-Prot有39795条的unigenes(29.69%)。1509条的unigenes被归类到分子功能、生物过程以及细胞组成。49070条的unigenes被归类至KOG数据库的26个种类里。KEGG分析里有5885条的unigenes被注释到335个通路中,这些335个通路可以归类到代谢通路、环境信息处理通路、遗传信息处理通路、细胞进程通路、生物系统通路和人类疾病通路。本研究中所注重的Toll样受体的免疫应答信号通路和Nod样受体的免疫应答信号通路。通过blastx比对,预测到CDS的unigenes总共有40342条。利用SSR软件microSatellite(MISA)软件的分析,结果发现有6种碱基重复的种类。这六种碱基重复分别是单碱基重复(13849个)、2个碱基重复(9203个)、3个碱基重复(3222个)、4个碱基重复(433个)、5个碱基重复(55个)和6个碱基重复(15个)。通过转录组的差异表达基因分析,发现3912条的unigenes有显著的表达差异。其中有1552条的unigenes表达上调(39.67%)而2360条的Unigenes表达下调(60.33%)。Toll样受体的免疫应答信号通路发现有19个unigenes有显著表达差异,其中12条表达上调和7条表达下调。NOD样受体免疫信号通路中有10个unigenes表现差异,有3条unigenes表现上调而7条unigenes表现下调。
  随机选取7个toll样受体信号通路和9个nod样受体信号通路的基因进行qRT-PCR验证。Toll样受体途径的基因有TLR7,MAP2K4,NFKBIA,TAK1,IL8,FOS,和IL12,而Nod样受体途径的基因是IKKA,NF-KB p105,TNFAIP3,IL8,IL6,IL1B,HSP90A,ASC,和MAP3KIP1。经过qRT-PCR验证,结果表明了这些基因和转录组的差异基因几乎一致。通过组织病理学观察,被鰤诺卡氏菌感染后的乌鳢头肾发现有结节形成、肝细胞出现脂肪变性、脾脏组织的出现破裂、鱼鳃组织退化和分解、心脏组织发生病变和部分心肌组织出现退化。
[硕士论文] 姜鹤
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:β-防御素(3-defensin,BD)是一种富含半胱氨酸具有广谱抗菌活性的阳离子短肽。目前研究发现,BD可以趋化免疫细胞迁移,在机体免疫调节中发挥重要作用。本研究通过对团头鲂β-防御素1(MaBDl)进行表达和纯化,获得团头鲂β-防御素1重组蛋白,研究其对团头鲂白细胞,尤其是巨噬细胞的趋化作用和炎症细胞因子表达的影响。实验结果如下:
  1.构建原核重组表达载体pET-32a-MaBD1,通过IPTG诱导表达MaBD1重组融合蛋白。将该蛋白利用Ni2+亲和层析方法纯化后,再经肠激酶酶切及纯化,获得MaBD1重组蛋白。使用MaBD1重组蛋白进行抑菌实验,结果显示MaBD1重组蛋白对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌活性。
  2.采用Percoll非连续梯度离心法分离团头鲂头肾白细胞,再利用贴壁方法分离纯化巨噬细胞,采用光镜和透射电子显微镜进行鉴定,结果显示:团头鲂头肾白细胞主要包括:中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞。贴壁巨噬细胞铺展或伸长呈各种形状,细胞核圆形和椭圆形,多数偏于细胞一侧。巨噬细胞表面标志CD68在贴壁巨噬细胞中高表达。
  3.用Transwell法检测MaBD1的体外趋化活性,发现MaBD1重组蛋白对白细胞,尤其是巨噬细胞具有明显趋化作用。为进一步了解MaBD1趋化功能位点,分别合成N端(MaBDPl)和C端(MaBDP2)MaBD1多肽,N端的趋化活性显著高于C端。
  4.将MaBDPl注射团头鲂腹腔,观察MaBDP1对体内白细胞以及巨噬细胞趋化活性,结果显示MaBDP1对体内白细胞和巨噬细胞都有趋化作用。在2d500ng/mL MaBDP1对白细胞具有趋化作用。而在3d1000ng/mL MaBDP1对巨噬细胞趋化作用明显。qPCR检测MaBDP1对促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)表达影响结果显示:脾脏,头肾和体肾中IL-1β表达量在6h和72h表达量显著升高,肝胰腺中IL-1β表达量在6h表达量显著升高;脾脏,头肾和体肾中TNF-α表达量在72h显著升高,肝胰腺中TNF-α表达量在6h显著升高。表明MaBDP1可以促进IL-1β和TNF-α的表达,增强机体的炎症反应。
[硕士论文] 马辰婕
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:随着抗菌药物在水产养殖中的广泛使用,水产养殖源细菌的耐药性逐渐变强,耐药多样性也渐渐增加,进而促使动物细菌性疾病的控制效果变差。气单胞菌是主要的水产动物致病菌之一,容易引起败血症、疖疮和溃疡等出血性疾病。抗菌药物的使用,是诱导气单胞菌耐药性的主要因素。本文以水产养殖源气单胞菌为研究对象,对其耐药性、耐药基因的分布特征及传播机制进行研究分析。
  本研究中,49株气单胞菌对8类17种抗菌药物的药敏结果显示,对AMX的耐药率高达100%,对SMZ、TMP、SXT和RIF的耐药率介于60%~90%之间,而对CTX、NEO、DOX以及喹诺酮类的ENR、NOR和OFL的耐药率均低于15%;在所有菌株中,41株菌株对3类及以上的抗菌药物具有抗性,24株菌株对9种及以上抗菌药物具有抗性。
  最小抑菌浓度(MIC)检测结果显示,TMP和SMZ的MIC50值最高(2048μg/mL),其余按MIC50值高低依次为STR(64μg/mL)、CHL(32μg/mL)、NEO(16μg/mL)、TET(16μg/mL)、FFL(16μg/mL)、DOX(4μg/mL)、ENR(1μg/mL)。最小杀菌浓度(MBC)检测结果显示,TET、TMP、SMZ ENR和NEO的MBC50与MIC50相等,CHL、STR和DOX的MBC50(64、256、和8μg/mL)则高于MIC50。抑菌圈直径与MIC值的相关性研究发现,两者之间均呈对数或指数负相关。
  25种耐药基因的PCR检测结果显示,基因组中,blaTEM的检出率最高(83.7%);其次是sul1和aadA,检出率分别是69.4%和61.2%;再者是arr2/3、aphA1、tetC、sul2、dfrA5和floR,检出率均高于40%。质粒中,sul1的检出率最高,为51%;其次是aphA1与aadA,分别为40.8%和38.8%; blaTEM、tetB、qnrB、qnrS、dfrA7、cat1和cmlA均未检出,其余耐药基因检出率均在35%以下。
  5类可移动元件的PCR检测结果显示,在基因组中,intI1检出率最高(65.3%);其次是IS26、ISCR2和tnpU,分别是63.3%、57.1%和51%;其余均低于50%。质粒中,intI1检出率依旧最高,为57.1%;其次是IS26、ISCR2和merA,检出率介于20%~35%之间;其余均低于15%。在1型整合子的可变区中,共发现13种基因盒排列,dfrA12-orfF-aadA2比例最高。ISCR2的可变区主要为两种:ISCR2+glmM+sul2(10株)和ISCR2-like+ str+strA+ sul2(2株)。
  本研究中共获得16株大肠杆菌转化子、21株气单胞菌转化子和4株大肠杆菌接合子。转化实验结果显示,耐药基因aadA、aphA1、sul2、tetA和floR较易通过转化的方式传递给大肠杆菌,其中tetA基因阳性转化子均表达四环素抗性;维氏气单胞菌转化子新增表型以RIF抗性为多,嗜水气单胞菌转化子多新增STR、KAN和CHL抗性,结果表明这4种药物抗性较易通过转化在种内进行传播。接合实验结果显示,只有嗜水气单胞菌成功与大肠杆菌接合,基因strA-B和oR较易通过接合在种间进行传播,且基因型阳性接合子均表达出对应抗性。此外,所有的转化子与接合子中,ISCR2的检出率均是最高的。
[硕士论文] 刘岚萍
生物学 集美大学 2017(学位年度)
摘要:小G蛋白是重要的分子开关,可以调节细胞分裂、细胞骨架形成、囊泡运输、核质运输等多种细胞功能,在免疫中发挥重要作用。本研究克隆得到大黄鱼Rac1、Rac2、Rac3、Rab7和Rab5A(分别称为lycRac1、lycRac2、lycRac3、lycRab7和lycRab5A)的cDNA序列,通过与基因组序列图比对获得完整的基因序列,分析了这些基因的分子特征、组织表达特性,以及LPS、PolyI∶C、副溶血弧菌等刺激后大黄鱼肝脏、脾脏和肾脏中的表达变化并对利用免疫胶体金技术对肝脏中表达的lycRAC2进行亚细胞定位,利用GST-Pulldown和质谱鉴定研究了与lycRAB5A互作的蛋白质。主要结果如下:
  1、RAC蛋白包括3个类型,分别为Rac1、Rac2和Rac3。lycRac1的cDNA全长2329 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac2的cDNA全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸;lycRac3的cDNA全长2182 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。氨基酸多重比对显示,lycRac1与海龟(Chelonia mydas)、斑马鱼(Maylandiazebra)和红鳍东方纯(Takifugu rubripes)的Rac1基因有高相似性;lycRac2与尖吻鲈(Lates calcarifer)、亚马逊花鳉(Poecilia formosa)和剑鱼(Xiphophorusmaculatus)同源性高;lycRac3与牛(Bostaurus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)和蓝鲶鱼(Ictalurus furcatus)有较高同源性。通过基因组分析发现lycRac1有6个外显子,5个内含子;lycRac2有7个外显子,6个内含子;lycRac3有7个外显子,6个内含子。进化树分析表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3均与鱼类Rac1、Rac2和Rac3聚成一支。利用荧光定量PCR技术检测三个基因在组织中的表达量,发现它们在所有检测的组织中均可以表达,其中,lycRac1在心脏中的表达量最高,血液和脑中也有较高的表达,头肾中的表达量最低;lycRac2在头肾中的表达量最高,肾脏和脾脏中也有较高的表达,肌肉中的表达量最低;lycRac3在血液中的表达量最高,脾脏和脑中也有较高的表达,肠中的表达量最低。大黄鱼受到Lpopolysaccharide,Polyinosinic Polycytidylic acid和VibrioParahemolyticus刺激后lycRac1、lycRac2和lycRac3在肝脏、脾脏、头肾中的表达量有不同程度的升高,纯化的lycRAC2蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。免疫电镜结果表明,lycRAC2亚细胞定位于细胞间质。以上结果表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3可能是与免疫相关的基因,它们在应对细菌感染中发挥不可或缺的作用,lycRAC2的亚细胞定位进一步说明lycRac2与信号传递有关。
  2、Rab7是属于Ras家族的小G蛋白,lycRab7的cDNA全长2218bp,开放阅读框(ORF)624 bp,编码207个氨基酸。氨基酸多重比对结果显示,lycRab7与斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)、家兔(Oryctolagus cuniculus)的Rab7基因同源性较高。通过基因组分析发现,lycRab7有5个外显子,4个内含子。系统进化树分析表明,lycRab7与其它鱼类可以聚成一支。实时荧光定量PCR结果显示,lycRab7在12个组织中均有表达,其中脑中的表达量最高,血液和心脏中也有较高的表达,胃中的表达量最低。大黄鱼受到LPS、polyI∶C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏和头肾中lycRab7的表达量均明显上调。纯化的lycRAB7蛋白制得多抗,Western-blot结果显示多抗特异性较高。以上结果表明,lycRab7在抵御细菌入侵中发挥重要作用。
  3、Rab5A是Ras家族的一员,已得到纯化的lycRAB5A蛋白,根据GST pull down结果可知,lycRAB5A蛋白与腺苷三磷酸酶(Calcium-transporting ATPase)、肌酸激酶(Creatine kinase M-type)、肌动蛋白(Actin,alpha skeletal muscle)等蛋白互作。结果表明lycRAB5A与其他蛋白协同在机体免疫中发挥作用。
[硕士论文] 孙保贞
动物学 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:抗菌肽是在甲壳动物先天性免疫中发挥重要作用的几类小分子肽的总称,其中crustin是很重要的一类抗菌肽。本研究中,我们旨在研究日本对虾(MarsupenaeusJaponicus)在感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)时,类甲壳肽(crustin-like)基因所发挥的免疫功能。通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE),从日本对虾体内克隆到一条全长为660 bp的cDNA序列,软件推测分析显示该基因的开放阅读框大小为507bp,编码一个含有168个氨基酸残基的蛋白,基因3'末端含有一条Poly(A)尾巴,5'和3'的非编码区分别为72 bp和81 bp,推测出蛋白质的相对分子质量为16.22 kDa,pI为8.37。氨基酸序列比对和进化树分析显示crustin-like基因主要存在于甲壳动物中的对虾及少部分螃蟹中,其中在日本对虾发现的crutstin-like与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)亲缘关系较近。
  通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测基因表达的组织特异性发现crustin-like在鳃内表达量最高,在血淋巴、肝胰腺、肌肉和消化腺内表达量较低。通过double-strand RNA(dsRNA)干扰技术,体外构建dsRNA表达载体,将纯化后的dsRNA注射到对虾体内,成功地抑制了crustin-like基因的表达。对已知重要的免疫相关基因的检测结果显示,在crustin-like被沉默后,对虾先天性免疫系统中多个免疫相关基因的表达受到影响,其中Immune deficiency homolog(IMD)、Rab7、L-lectin、mitogen-activated protein kinase(MAPK)、p53、prophenoloxidase(proPO)和Rho基因的表达显著下调,而nitric oxide synthase(NOS)、myosin及Tumor necrosisfactor-α(TNF-α)基因的表达显著上调。对虾免疫活性试验显示,在抑制crustin-like基因的表达后,对虾血细胞总数显著减少,酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著减低。以上结果说明crustin-like对细胞吞噬作用、凋亡和部分免疫通路有显著的影响。
  进一步研究发现,在感染溶藻弧菌后,crustin-like基因的表达显著上调。统计死亡率发现,沉默crustin-like基因的表达后,对虾感染弧菌后累计死亡率显著增加。结果说明对虾crustin-like有明显的抗弧菌的作用。血细胞吞噬试验结果显示,对虾crustin-like基因被沉默后,对虾血细胞对溶藻弧菌的吞噬率显著升高,血淋巴细胞凋亡率显著升高,结果说明溶藻弧菌在感染对虾时可能会利用crustin-like来逃避对虾血细胞对弧菌的吞噬作用,这一现象还有待进一步的研究。
  在感染WSSV后12-72 h,crustin-like基因的表达显著升高。WSSV拷贝数检测和Kaplan-Meier生存分析结果显示crustin-like基因被沉默后,WSSV拷贝数显著降低,对虾存活率显著升高。抑制crustin-like基因的表达后,对虾血细胞对WSSV的吞噬率显著降低,对虾血细胞的凋亡显著升高。以上结果说明对虾crustin-like可以抑制细胞凋亡,而WSSV有可能利用crustin-like抑制细胞凋亡的功能来促进病毒粒子在对虾体内的复制。本文首次揭示了类甲壳肽在对虾病毒感染中有着重要作用,为研究对虾的先天性免疫和WSSV感染宿主的机制提供了重要的理论依据。
[硕士论文] 李启蒙
兽医 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,我国贝类养殖种类和养殖模式越来越多样化,养殖技术逐渐成熟,养殖面积不断扩大,贝类产业已成为我国水产业的重要支柱。但是,以弧菌为主要致病菌的微生物对贝类养殖产业带来严重危害。夏季的7、8月份是贝类弧菌病的高发季节,由弧菌引起的水生动物疾病流行面积广,发病率高,对水产养殖业造成严重的经济损失,一直是水产领域研究的一大热点。
  本试验对山东省主要贝类养殖区的养殖贝类和野生贝类进行了弧菌的流行病学调查。通过细菌分离、生化鉴定、16s-rDNA的克隆以及序列分析比对等方法,对分离的弧菌的生物学特性进行了初步研究。掌握了贝类弧菌的流行特点及规律,为预防疾病的发生提供了依据。自潍坊寿光,威海乳山、文登,青岛胶南,日照,滨州无棣,东营河口等地区采集了不同的贝类,包括青蛤、文蛤、扇贝、椭螺、尖螺、竹蛏、织纹螺、四角蛤、牡蛎、沙蛤、蓝蛤、花蛤、毛蚶、魁蚶、扁玉螺、贻贝等。从样品中分离出27种弧菌,8种其它细菌,共222株。经测序分析比对,主要有哈氏弧菌(Vibrio harveyi),溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 Vibrio chagasii、Vibrio azureus、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、杭州弧菌(Vibrio hangzhouensis)等。结果显示,哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的检出率较高,分别占20%、18%、21%;其他弧菌相对较少。胶南地区副溶血弧菌和溶藻弧菌检出率较高;无棣哈氏弧菌和溶藻弧菌检出率较高,而副溶血弧菌检测率很低;河口、日照、寿光三个地区的三种弧菌的检出率都比较高,均在15%-35%之间。
  结果表明,弧菌是导致贝类发病的主要病原菌之一,对青蛤、文蛤、毛蚶、竹蛏、沙蛤的危害相对严重。其中哈氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌分离出的菌株较多;哈氏弧菌主要分离自青蛤、文蛤、竹蛏、沙蛤、毛蚶;副溶血弧菌主要分离自文蛤、竹蛏、沙蛤、花蛤、毛蚶,沙蛤最多。溶藻弧菌在青蛤、文蛤检出率较高,其次为毛蚶。不同弧菌在不同贝类中的检出率有很大差异,在不同地区中的检出率也存在很大差异。
  对分离的哈氏弧菌、副溶血弧菌及溶藻弧菌进行了药敏试验。抗菌药物包括:阿米卡星、庆大霉素、萘定酸、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、四环素、多西环素、头孢噻吩、头孢呋辛、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林、氯霉素、复方新诺明、氟苯尼考,共17种。结果表明,三种弧菌都对氨苄西林和阿莫西林的耐药率较高,对其他药物的敏感程度不同,也有耐药菌出现。
  本试验对哈氏弧菌和副溶血弧菌主要毒力基因进行检测,哈氏弧菌主要毒力基因为luxR、toxR、vhhA、vhhB、vhpA、vhpB、toxS、flaA、pap6;副溶血弧菌主要毒力基因为tdh、trh、ureC、vscC2、vcrD2。结果表明,80%的哈氏弧菌检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB;副溶血弧菌毒力基因tdh、trh和ureC的检出率在20%左右。
  本研究查明了2016年度山东省贝类弧菌病的流行情况,为贝类弧菌病的预警提供了依据;通过对哈氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌的药敏试验,探明了贝类弧菌的抗菌谱,为贝类弧菌病的防控提供了用药依据。
[硕士论文] 付天增
预防兽医学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:链球菌(streptococcal spp.)是水产养殖业中的重要病原菌之一,由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)所引发的细菌性疾病在世界水产养殖业中很普遍,由此带来了巨大的经济损失。目前预防和治疗链球菌病的主要方法仍是消毒剂和抗生素等,但是此种方法会存在食品药物残留、细菌耐药性等食品安全问题。
  细菌灭活疫苗是通过福尔马林杀死病原体所制备的一种生物制品。链球菌灭活疫苗能使罗非鱼产生有中和、清除病原微生物及其产生的毒素作用的抗体,产生的体液免疫的免疫反应,对细胞外感染的链球菌有较好的免疫保护效果。
  本文研究海豚链球菌灭活疫苗和无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫保护率,以及交叉保护效果。将制备的海豚链球菌灭活疫苗和无乳链球菌灭活疫苗采用腹腔注射的方式进行免疫,测定了血清抗体效价,酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶、溶菌酶的活性,白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、Caspase3等细胞因子在头肾、后肾和脾脏的的表达量和对罗非鱼的免疫保护率。罗非鱼第二次免疫14天后,免疫无乳链球菌灭活疫苗组和海豚链球菌灭活疫苗组抗体、ACP、SOD、LZM水平及头肾中Caspase-3、TNF、IFN,后肾中IL-1、TNF、IFN,脾脏中Caspase-3、IFN相对表达量显著(P<0.05)高于PBS组;罗非鱼攻毒试验7天后,试验组抗体、ACP、AKP水平及头肾中IL-1、Caspase-3、IFN,脾脏中Caspase-3、TNF相对表达量显著高于对照组(P<0.05);试验组存活率显著高于对照组(P<0.05)。
  无乳链球菌灭活疫苗和海豚链球菌灭活疫苗组具有良好的免疫保护率,相对存活率分别为92.9%和93.3%,并且二者具有交叉保护作用,无乳链球菌灭活疫苗组交叉保护作用显著高于海豚链球菌灭活疫苗组(P<0.05)。
[硕士论文] 罗伟
水产养殖 广西大学 2017(学位年度)
摘要:罗非鱼是中国淡水养殖的重要品种,主要在广东、海南、广西、云南及福建等省份养殖。近年来由于规模化养殖模式的推广和养殖环境恶化,导致病害频发,其中以无乳链球菌病的危害最大。目前尚无报道罗非鱼感染无乳链球菌的途径及侵染靶器官。开展罗非鱼感染无乳链球菌后的动态病理学及免疫酶活性变化研究工作,可以为更深入研究无乳链球菌的致病机理和防控药物研发提供理论依据。本研究采用注射、灌胃、浸泡三种方式对吉富罗非鱼进行无乳链球菌(HN016菌株)感染,观察三种方式感染后病原菌在吉富罗非鱼体内的分布规律及病理变化,同时研究不同种群罗非鱼感染无乳链球菌后血液及肝脏组织中免疫相关酶的变化规律。主要结论如下:(1)采用注射、灌胃、浸泡三种方式对吉富罗非鱼进行人工感染,其中注射和灌胃均出现典型的无乳链球菌病临床症状,注射组的死亡周期最短,感染后12h出现死鱼,感染后24h出现死亡高峰,死亡率最高,达到92.5%;灌胃组感染后5h出现死鱼,感染后48h出现死亡高峰,死亡率为90%;而浸泡组感染后仅出现轻微发病症状,没有出现死鱼。(2)在吉富罗非鱼感染无乳链球菌后体内病原菌分离方面,注射组和灌胃组感染后2h在脾脏、肝脏、前肾、胃、腮、皮肤和肌肉组织中均可分离出病原菌,感染后5h在两组的脑组织中均可分离出病原菌,感染后8h两组均已表现出明显的发病症状,此时体内各组织的病原菌浓度达到峰值;而浸泡组感染后8h才在体内各组织中分离出病原菌,但它们的浓度均低于相同时期的注射组和灌胃组。(3)对吉富罗非鱼进行注射、灌胃、浸泡三种方式感染无乳链球菌,取感染后2h、5h、8h、12h、24h的鳃、肠、脾脏、肝脏组织进行苏木精-伊红染色法(H.E染色法)染色及免疫组织化学定位。H.E染色结果显示:三种方式在感染后早期(2-5h)鳃、肝脏、脾脏、肠组织均已经出现明显病变,其中鳃表现为基部上皮细胞增生及鳃小片坏死,脾脏为含铁血黄素增多、巨噬细胞弥漫性浸润以及血管变细,肝脏为出现空泡变性、毛细血管破裂,肠为肠绒毛断裂、黏膜下层细胞结构被破坏;三种方式的病变程度依次为注射组>灌胃组>浸泡组。免疫组化定位结果显示:灌胃感染后病原菌强阳性信号先在肠组织出现,注射组为脾脏组织,浸泡组为鳃组织。(4)采用腹腔注射方式对吉富罗非鱼抗病选育系、百桂品系吉富罗非鱼及奥尼罗非鱼感染无乳链球菌(HN016菌株),分析感染后三种罗非鱼血液及肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、总抗氧化能力(T-AOC)等免疫相关酶活性变化。结果显示:三个不同种群罗非鱼肝脏组织ACP、AKP、LZM、SOD、T-AOC酶活力均呈现先升高再降低的趋势,而CAT酶活力呈现先下降再升高的趋势;而感染24h后CAT、ACP、AKP、LZM活力在三种罗非鱼血液中均表现出上升的趋势。
[硕士论文] 张梦慈
农业推广渔业 广西大学 2017(学位年度)
摘要:鱼类脂肪肝病使罗非鱼容易遭受外源致病因子导致感染而大规模死亡,给养殖者造成极大的经济损失,阻碍了罗非鱼养殖业的发展。本实验通过投喂高脂饲料建立罗非鱼非酒精脂肪肝模型为基础,进行了垂盆草对该类模型罗非鱼保肝药效作用的研究及对肝细胞和肾细胞细胞凋亡抑制作用的探讨,为垂盆草在预防高脂投喂导致的脂肪肝病提供了实验依据。根据前期研究,将实验用的罗非鱼平均分为3个组,每组设3个平行组。分别为正常组、高脂组、垂盆草组。每日的9:00am和5:00pm,进行连续6周的投喂。3个组的罗非鱼在投喂6周后随机抽取每组15尾,采集血清、观察脏器官的变化并采集肝胰脏组织样本,检测6周后实验罗非鱼脏器官损伤程度的主要生理生化指标,利用H.E染色技术观察肝脏细胞的变化情况,判断垂盆草针对以高脂饲料为基础投喂罗非鱼所致脂肪肝病的预防效果。采用TUNEL检测方法对石蜡包埋过的三组罗非鱼肝脏和肾脏切片通过荧光显微镜观察细胞变化情况,通过计算得出凋亡率并作比较。所得结果如下:经过6周的喂养,高脂组罗非鱼与基础组相比,从血液指标的测定上来看:高脂组提高了罗非鱼血清中的AST、ALT、TG、CHOL、LDH、TBA以及MDA水平(P<0.05),同时提高了CAT、SOD、T-AOC以及GLOB、ALP免疫指标的含量(P<0.05);而降低了ALB的含量。从肝胰脏指标的测定上来看:高脂组罗非鱼提高了罗非鱼肝胰脏中转氨酶活性、MDA含量以及肝胰脏和肠道中消化酶水平(P<0.05),也提高了抗氧化指标CAT、SOD含量(P<0.05);从肝脏和肾脏细胞凋亡检测可知:高脂组罗非鱼不论是肝细胞还是肾细胞,凋亡率上均显著高于基础组(P<0.05)。实验6周期间相对高脂组罗非鱼,从血液指标的测定上得出:垂盆草组显著降低了实验罗非鱼血清中的AST和ALT水平(P<0.05),并抑制了高脂饲料造成血清TG、CHOL、LDH和TBA水平的升高(P<0.05),对于抗氧化指标和免疫指标测定存在显著差异(P<0.05);从肝胰脏指标的测定上得出:降低了罗非鱼肝胰脏中转氨酶活性以及MDA含量(P<0.05),并提高了CAT、SOD、T-AOC水平(P<0.05);从肝脏和肾脏细胞凋亡检测可得:垂盆草组罗非鱼不论是肝细胞还是肾细胞,凋亡率上均显著低于高脂组(P<0.05)。然而垂盆草组各项指标与基础组相比基本没有显著差异(P>0.05)。通过本实验可知,基础组与高脂组所测得的结果趋同,普遍显著高于高脂组,说明了往饲料中添加垂盆草能预防吉富罗非鱼脂肪肝病,且药效作用显著。体现在减轻了吉富罗非鱼肝胰脏组织的损伤、促进组织修复、降低了血脂浓度以及提高了机体的抗氧化能力,同时降低了肝脏和肾脏的细胞凋亡率。
[硕士论文] 刘丹
生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:急性肝胰腺坏死病(AHPND)是一种新出现的严重的对虾病,并且它是由含有毒性质粒的弧菌菌株引起的。该病已经造成了全世界对虾养殖业的大规模减产。所以一种高效准确的检测方法对于AHPND致病菌的检测和预防至关重要。在本研究中,基于副溶血弧菌OmpU建立了免疫磁珠捕获-PCR的方法用于检测AHPND致病菌株。得到的研究结果如下:
  首先通过对AHPND致病菌外膜蛋白OmpU进行基因克隆,得到基因序列,然后对弧菌OmpU进行生物信息学分析,发现其在弧菌中高度保守,并且种内的保守性更高,存在多个共同抗原表位,所以推测OmpU在弧菌中具有交叉免疫原性,可以作为弧菌免疫分离的靶标。
  进一步用已有的副溶血弧菌来源的OmpU的异源表达重组工程菌对目标蛋白进行表达纯化及验证后,制备多克隆抗体。然后用Western blotting和Whole cell ELISA分析副溶血弧菌OmpU在弧菌种内及种间的免疫学特性,结果显示副溶血弧菌OmpU抗体能与包括AHPND致病菌在内的弧菌产生种内、种间的交叉反应,与非弧菌细菌不产生或产生较弱的反应,同时Whole cell ELISA也证实了OmpU抗体能够识别弧菌的OmpU抗原表位。综合说明弧菌OmpU是一种交叉抗原,可以作为免疫磁珠分离的靶标,其抗体可以用来制备免疫磁珠分离弧菌。
  以外膜蛋白OmpU用作免疫捕获靶标分离AHPND病原体,然后以AHPND质粒的两个毒性基因(pirA和pirB)的特异性片段作为PCR引物,研究建立弧菌免疫磁珠捕获-PCR检测体系。本研究首先评价了该体系检测性能:对制备的免疫磁珠进行了捕获效率的检测,发现对于AHPND致病菌的捕获效率均大于90%,并且纯培养的检测灵敏度均为101CFU/mL;而干扰实验表明在捕获缓冲液pH为3至9和盐浓度为1%至5%之间时免疫磁珠捕获-PCR检测体系仍然稳定;在非AHPND致病菌存在的情况下检测灵敏度没有显著差异。
  进一步,通过实验室模拟建立水,沉积物和虾样品的人工感染模型,评价了免疫磁珠捕获-PCR检测体系的灵敏度仍然可达到相同的101CFU/mL。最后,在对实际环境样品检测的过程中,评价了该检测体系的可靠高效,并且在检测中分离患病对虾体内的细菌时得到两株AHPND致病菌株,经鉴定该菌株为哈维氏弧菌和副溶血弧菌。因此,该方法可用于海洋和水产养殖业中对于AHPND致病菌的快速检测,进一步实现预防和监测水产养殖中的AHPND传播。
[硕士论文] 吴凡
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国的“四大家鱼”之一,也是重要的经济淡水养殖鱼类。但在养殖过程中由于各种病害的影响使其成活率极低,给养殖人员带来的严重的经济损失。其中,由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵袭而引发的细菌性败血症是在草鱼养殖过程中严重危害其机体健康的疾病之一。主要组织相容性复合体(MHC)存在于所有的脊椎动物中,是机体免疫反应中参与抗原呈递的重要组成部分,其中包含许多不同的基因。本文中通过本地Blast来获取草鱼MHCⅠ区的基因组信息,并将其与人类MHC以及其他鱼类的MHCⅠ区在基因组层面上进行比对分析,了解MHC在不同物种中的共同点有助于进化分析,采用RT-PCR技术检测MHCⅠ区基因在健康草鱼各组织的表达情况,并通过实时荧光定量PCR检测草鱼在嗜水气单胞菌感染后4、12、24、48及96h,MHCⅠ区免疫相关基因在脾脏和肾脏中的表达情况,以为草鱼的抗病育种提供理论基础和科学数据,本文主要研究结果如下:
  1.草鱼MHCⅠ区基因组成
  经分析得到草鱼MHCⅠ区共有21个基因,全长为350Kb,其中包含3个MHCIa基因、5个PSMB基因、3个TAP2基因、2个TAPBP基因以及BRD2、FABGL、COL11A2、RXRB、KNSL2、ZBTB22、DAXX、 FLOT1这8个基因。
  2.草鱼MHCⅠ区与其他脊椎动物的基因组比对分析
  通过人类、大西洋鲑(Salmo salar)、草鱼、斑马鱼(Danio rerio)、青鲻(Oryziaslatipes)以及日本河豚(Tetraodontidae)的MHCⅠ区基因组比对发现了两个比较保守的共线性区域,根据它们所在的位置分为在人类中经典的MHCⅡ区和延伸的MHCⅡ区,其中经典的MHCⅡ区包含PSMB8、PSMB9、PSMB10、TAP2、BRD2、FABGL、COL11A2以及RXRB在内的8基因,延伸的MHCⅡ区包含KNSL2、ZBTB22、DAXX、 TAPBP以及FLOT1这5个基因,其中KNSL2、ZBTB22、DAXX、 TAPBP这4个基因在鱼类中有共线性关系。
  3.MHCⅠ区抗原呈递相关基因生物信息学分析
  通过NCBI查找得到草鱼TAPBP的396个氨基酸序列,通过SMART在线预测及Clustal X2比对分析发现其存在TAPBP保守的Ig V和Ig C区域,在N-端的31位和106位都有保守的半胱氨酸,在Ig V和Ig C这两个区域存在典型的半胱氨酸和色氨酸(C192、W211、C270和C314、W327、C378),人类中115位的半胱氨酸在鸟类和鱼类中被丝氨酸所代替。用DNAMAN软件将草鱼PSMB9的cDNA序列翻译得到190个氨基酸,用SMART在线预测得到1-178的氨基酸为Proteasome的蛋白结构域,通过Clustal X2软件进行氨基酸比对分析发现鱼类、哺乳动物和两栖类的Proteasome结构域高度保守。在NCBI中查找得到草鱼MHCⅠ的342个氨基酸,用SMART在线预测得其结构域,1-16位为信号肽,17-192位为MHCⅠ蛋白结构域,208-281位为IGc1功能区,297-319位为蛋白质跨膜区。通过MEGA7.0进行TAPBP、PSMB9和MHCⅠ这三个基因物种间的进化分析发现,草鱼均与鲤科鱼类的关系最近,与其他鱼类关系较远,与其他脊椎动物关系最远。
  4.草鱼MHCⅠ区基因的组织表达特征
  用半定量RT-PCR方法检测了草鱼MHCⅠ区BRD2、KNSL2、RXRB、TAPBP、FABGL、MHC Ia、PSMB6、PSMB9以及TAP2等9个基因在健康鱼各组织的表达情况。除了FABGL和PSMB6基因在肾脏表达量最高外,其它基因都在血液中的表达量最高。其中参与MHCⅠ类分子抗原呈递途径的TAPBP、MHC Ia、PSMB9以及TAP2基因的表达情况基本相同,而且都在免疫组织脾脏和肾脏中有较高表达。
  5.草鱼MHCⅠ区BRD2、MHC Ia、PSMB9以及TAP2在细菌感染后表达量变化
  通过实时荧光定量RT-PCR检测看草鱼肾脏和脾脏中MHCⅠ区免疫相关基因在嗜水气单孢菌感染后的表达情况。BRD2表达量分别在感染后12h和24h在肾脏和脾脏中达到最高;MHC Ia表达量在脾脏和肾脏中都先上升后下降,并都在24h达最大值;PSMB9表达量在脾脏先上升后下降,在12h达最大值,在肾脏中则先下降后上升,在24h达最大值;TAP2在脾脏和肾脏中整体呈先下降后上升的趋势,在24h都达最大值,并最后都回调至正常范围。
  本研究结果初步获得草鱼MHCⅠ区基因组结构及基因表达特征,为后续草鱼疾病防治以及抗病育种等研究奠定了理论基础。
[硕士论文] 宁东敏
控制工程 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:随着经济的发展和市场需求增长,水产养殖日益规模化,细菌性鱼病是制约水产养殖业发展的关键问题。目前针对细菌性鱼病一般采用抗生素类药物进行防治,若用药量偏少达不到防治效果,相反的若用药量过多不仅增加成本,而且容易造成环境污染同时危及人类健康。因此研究致病菌感染模型,可以为科学指导抗生素使用提供理论基础。利用机器视觉技术探究鱼类活力与致病菌浓度之间的关系,能避免人工操作耗时耗力且容易出现失误的情况,在此基础上设计一种实验平台,对建立感染模型和发展水产养殖业具有重要的现实意义。
  论文在分析机器视觉应用和细菌性鱼病防治现状基础上,设计一种基于机器视觉的水产养殖致病菌感染模型实验系统,并建立致病菌感染模型。论文主要研究内容分为四个部分:
  (1)针对人工检测鱼类活力耗时耗力且容易判断失误的问题,提出一种基于机器视觉的鱼类活力检测方案,获取鱼类视频信息,通过目标检测跟踪技术获取其运动轨迹并计算相关活力参数;
  (2)针对实验过程中细菌繁殖导致菌浓度增加的情况,提出一种细菌浓度控制方案,通过稀释操作来维持实验系统内致病菌浓度恒定;
  (3)根据实验需求搭建实验系统平台,主要包括三个部分,视频采集模块负责采集鱼类视频信息;水质监测模块用以保证实验系统内水质环境稳定;用户监控中心实现实时监控、视频序列处理、活力参数结果显示等功能;
  (4)利用搭建好的系统平台进行致病菌培养、致病菌浓度控制、致病菌感染鱼类等一系列实验。对相关实验数据进行分析和处理,以此为基础建立致病菌感染模型。
  研究结果表明:论文所设计实验系统利用机器视觉可以成功地对实验鱼类的活力进行检测;利用致病菌浓度控制方案较好地维持系统中细菌浓度恒定,均达到了预期效果;最后在上述各个实验基础上初步建立致病菌感染模型。
[博士论文] 覃初斌
动物营养与饲料科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:疾病暴发,如气单胞菌引起的鱼类出血病,已经成为目前限制鱼类养殖业健康发展的主要问题。益生菌在促进动物生长、维持机体肠道健康、增强免疫防御功能及保护宿主免受病原菌感染等方面起重要作用。本文通过转座子基因突变文库的构建、目的基因筛选、基因敲除、转录组、无菌斑马鱼模型以及菌群转接模型等方法分别对气单胞菌的感染机制、益生菌促生长及其抗气单胞菌感染机制进行了研究。主要研究内容和结果如下:
  一、气单胞菌感染机制的研究
  2009-2014期间从中国华南地区出血病爆发塘口的病鱼中分离得到的病原菌一共有五种:维氏气单胞菌(A.veronii)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、简氏气单胞菌(A.jandaei)、舒氏气单胞菌(A.schubertii)及水生气单胞菌(A.aquariorum),其中维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌是二种最重要的病原菌。另外,维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的混合感染是引起华南地区鱼类败血症爆发的主要原因,维氏气单胞菌是造成感染的前提条件。采用浸浴模型和腹腔注射模型对气单胞菌毒力进行评价,结果发现,在浸浴模型中维氏气单胞菌表现出最强的毒力,而嗜水气单胞菌的毒力相对较弱;而在腹腔注射模型中,嗜水气单胞菌的毒力远远高于维氏气单胞菌,注射嗜水气单胞菌后10-18h内斑马鱼死亡率为100%,而注射维氏气单胞菌96h后死亡率仅为10-40%;在混合感染过程中,由维氏气单胞菌Ⅱ型分泌系统分泌的气溶素(aerolysin)可以对斑马鱼头部口腔周围以及肠道部位造成严重的损伤,使嗜水气单胞菌等其他细菌通过损伤部位进入到斑马鱼体内,产生败血症。用气溶素基因敲除的维氏气单胞菌斑马鱼感染,不会产生肠道损伤及死亡;RtxA基因的ACD结构域敲除后,嗜水气单胞菌毒力明显降低(P<0.01),证明了Aer和RtxA分别在维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的致病性上起着关键作用。
  二、益生菌促进斑马鱼生长作用的机制研究
  益生菌的促生长效果:评价了五种乳杆菌,包括鼠李糖乳杆菌LGG(L.rhamnosus LGG)、鼠李糖乳杆菌20300(L.rhamnosus20300)、干酪乳杆菌BL23(L.casei BL23)、植物乳杆菌1149(L.plantarum JCM1149)及嗜酸乳杆菌1132(L.acidophilus JCM1132)对斑马鱼的促生长效果,结果发现干酪乳杆菌BL23和鼠李糖乳杆菌20300以106CFU/mL连续浸浴21d或35d后可以显著提高斑马鱼的体重(P<0.05);进一步研究发现,BL23活菌(106CFU/mL)连续浸浴处理斑马鱼幼鱼14d或28d后,可显著提高其体重(P<0.05),而热灭活BL23不能提高斑马鱼的体重;数字基因表达谱分析(DGE)发现BL23活菌可以参与调节斑马鱼PPAR信号通路、氨基酸代谢、脂肪酸代谢以及固醇类激素的合成等,从而促进斑马鱼生长发育。
  三、益生菌促进斑马鱼抵御气单胞菌感染的机制研究
  干酪乳杆菌BL23浸浴处理刚孵化的斑马鱼3d后,再用维氏气单胞菌攻毒,结果发现BL23可以显著提高斑马鱼的存活率(P<0.01),结合无菌斑马鱼模型和菌群转接实验表明,BL23抗气单胞菌感染的机制与改变肠道菌群无关,而与其菌体本身相关。进一步研究发现,BL23细胞提取物胞外多糖-蛋白复合物(EPSP)由40-45KD大小蛋白和α-由鼠李糖(α-Rha),α-葡萄糖(α-Glc),β-N乙酰葡萄糖(β-GlcNAc)和β-N乙酰半乳糖(β-GalNAc)组成的胞外多糖所组成。用10-20μg/ml EPSP处理无菌斑马鱼,3d后用维氏气单胞菌攻毒,结果发现EPSP处理组无菌斑马鱼的死亡率显著低于对照组(P<0.001);另外EPSP可以上调斑马鱼肝脏细胞系tlr1和tlr2的表达,并调节促炎因子和抑炎因子基因的表达(P<0.05)。以上结果表明,乳酸菌BL23EPSP的抗感染作用与其通过TLR1/TLR2信号通路增强斑马鱼免疫应答密切相关。
[博士论文] 万全元
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:由模式识别受体(pathogen recognition receptors,PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen-asociated molecular patterns,PAMPs)而引起的天然免疫反应是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线。当病毒进入细胞后会被细胞内的PRR——维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)样受体(RIG-Ⅰ like receptors,RLRs)家族成员识别,而激活下游一系列信号,导致干扰素调节因子(interferon regulatoryfactor, IRF)3和IRF7的磷酸化激活和二聚体的形成,从而起始Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ)的产生,最终诱导下游抗病毒效应蛋白的表达和获得性免疫反应的激活。RLR家族的两个重要的成员RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化基因5(melanomadifferentiation-associated gene,MDA5)具有广泛的识别病毒核酸的功能,在抗病毒先天性免疫中起到非常重要的的作用。但有意思的是,RIG-Ⅰ同源基因在某些鱼类[如大黄鱼(Pseudosciaena crocea)]、鸡(Gallus gallus)和中国树鼩(Tupaia belangerichinensis)的基因组中没有被鉴定到,而MDA5同源基因几乎存在于所有被研究的脊椎动物中。这似乎暗示RIG-Ⅰ和MDA5的功能存在冗余性。目前的研究表明RIG-Ⅰ与MDA5在识别的核酸类型上存在差异,对某些病毒的识别存在冗余,但人们对二者在Ⅰ型IFN诱导作用方面的差异性却知之甚少。
  草鱼(grass carp,Ctenopharyngodon idella)是我国“四大家鱼”之一,其养殖业长期以来受到各种疾病的困扰。由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)病毒——草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病严重影响着草鱼种的成活率,因此GCRV和草鱼抗病毒免疫系统长期以来受到科研人员的广泛关注。在研究过程中,草鱼的RIG-Ⅰ和MDA5基因也被克隆和鉴定出来,并且被证明在抗GCRV感染中发挥着积极的作用。最近,随着高通量测序技术的发展,草鱼的IFN成员被充分地挖掘并鉴定出来。草鱼Ⅰ型IFN包括四个成员,即IFN1、IFN2、IFN3和IFN4;而Ⅱ型IFN包含两个成员,即IFN-γrel和IFNγ。人们对其他鱼类各IFN的研究表明不同的IFN在功能上存在差异,但对各IFN的诱导通路的认识还比较模糊,草鱼这6种IFN在细胞中的相对表达模式也还不清楚。因此我们想利用草鱼肾细胞系(C.idella kidney,CIK)为研究对象,来探究草鱼IFN的表达特征;重点用GCRV感染CIK细胞,来研究草鱼RIG-Ⅰ和MDA5在IFN诱导方面的差异性。
  我们利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和双荧光素酶报告试验技术,发现未受到免疫刺激的CIK细胞中IFN1和IFN3基因相对表达量较高,IFN-γrel和IFNγ基因表达量居中,IFN2和IFN4基因表达量较低;在GCRV或dsRNA类似物poly(I∶C)刺激细胞后,各IFN和代表性IFN刺激基因(IFN-stimulatedgenes,ISGs)的表达量在草鱼MDA5过表达细胞中显著高于RIG-Ⅰ过表达细胞;而且MDA5过表达比RIG-Ⅰ过表达更为强烈地促进了各IFN启动子活性。为了探究产生这种现象是否与IRF3和IRF7相关,我们又利用细胞活力检测、RT-qPCR和免疫印迹(immunoblotting,IB)技术证明了草鱼IRF3和IRF7在GCRV感染后由细胞质向细胞核迁移,并在细胞抗GCRV感染过程中发挥着重要的作用。
  随后我们使用半定量(semi-qPCR)、双荧光素酶报告试验、IB技术发现,在细胞未受到免疫刺激时,RIG-Ⅰ和MDA5的过表达不会影响IRF3和IRF7的表达;但在细胞受到免疫刺激时,RIG-Ⅰ和MDA5的过表达会在蛋白水平上显著促进IRF3和IRF7的表达,并上调了它们的磷酸化水平。之后,我们使用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和IB技术深入研究了草鱼RIG-Ⅰ和MDA5对IRF3和IRF7的影响。结果发现,RIG-Ⅰ和MDA5过表达促进了IRF3和IRF7的丝氨酸磷酸化;不同的是,MDA5同时也促进了IRF7的苏氨酸磷酸化,但RIG-Ⅰ却抑制了IRF7的苏氨酸磷酸化。这一现象导致的结果是:RIG-Ⅰ和MDA5过表达促进了IRF3与IRF7的异源二聚化,同时MDA5过表达也促进了IRF7的同源二聚化,但RIG-Ⅰ过表达却削弱了IRF7的同源二聚化作用。随后为了探究草鱼IRF3和IRF7二聚化对各IFN表达的影响,我们运用了双荧光素酶报告试验。结果表明:IRF3的同源二聚化仅促进了IFN1的启动子活性,而IRF3和IRF7的异源二聚以及IRF7的同源二聚更为广泛而强烈地促进了Ⅰ型IFN的启动子活性。由此说明了IRF7的同源二聚在Ⅰ型IFN启动诱导中的重要作用,也阐明了RIG-Ⅰ比MDA5对IFN表达的诱导作用弱的分子机制。最后,我们又利用RT-qPCR技术证明MDA5过表达诱导的白介素4(in terleukin4,IL-4)和IL-12p40基因表达量显著高于RIG-Ⅰ过表达所诱导的表达量,从而为MDA5诱导了更高的Ⅱ型IFN基因表达提供了理论依据。
  本研究表明草鱼MDA5比RIG-Ⅰ诱导的IFN免疫反应更为强烈,为RIG-Ⅰ和MDA5在功能上的冗余性提供了证据,同时也解释了为什么RIG-Ⅰ同源基因可以在某些脊椎动物中缺失而不至于过多影响其先天性免疫应答。
[硕士论文] 周红霞
水产养殖 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)是广受我国消费者认可的名优鱼类,具有很高的营养价值和经济价值,它抗病力较强,生长迅速,经济价值高,深受消费者的喜爱。然而,随着工厂化养殖模式的不断发展和养殖环境的日趋恶化,疾病越来越成为制约半滑舌鳎养殖业健康发展的关键因素,其中以半滑舌鳎溃疡病和烂尾病最为常见,生产上这两种病常常并发。
  江苏某企业工厂化养殖半滑舌鳎患严重溃疡病,体表、头部呈现不同大小、溃烂程度不一的溃疡灶,体表粘液增多,严重发病鱼创面大且溃烂出血,病鱼濒死,部分伴有烂尾现象。本研究从病灶处分离、纯化了优势菌株,随后对优势菌进行了病原鉴定、生化分析、药敏试验以及致病性探究。
  1、半滑舌鳎溃疡相关细菌的分离与分子鉴定
  本研究用绵羊血平板从严重溃疡病半滑舌鳎溃疡处分离到两种优势菌株HX0416和HX1316,其中HX0416优势更为明显,且形成清晰的β-溶血环,而HX1316不溶血,两株菌均为G?短杆菌;经16S rRNA基因鉴定,确认两株菌同属气单胞菌属,且HX1316为中间气单胞菌(Aeromonas media);通过建立基于管家基因gyrB基因的鉴定方法,进一步鉴定气单胞菌HX0416为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。
  2、溃疡相关气单胞菌的生物学特性及其药物敏感性
  分离菌HX0416具有氧化酶阳性、O/129耐受、吲哚试验阳性、精氨酸双水解酶阳性、发酵葡萄糖产酸产气,发酵蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖,且能水解七叶灵,进一步确认该分离菌为杀鲑气单胞菌。而且该菌株只对API20NE项目中的脲素、癸酸、己二酸、柠檬酸和苯乙酸这5个鉴定项目反应阴性,其它鉴定项目均为阳性,结合其β-溶血的特点,发现其与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种最为接近;中间气单胞菌HX1316的生化特性大多与HX0416相同,只在几个项目存在差异,如精氨酸双水解酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、β-葡萄糖苷酶、L-脯氨酸芳胺酶、古老糖、D-山梨醇、COURMARATE和谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶等。
  药敏实验表明,杀鲑气单胞菌菌株HX0416对环丙沙星、氯霉素、美洛培南、头孢曲松、庆大霉素、头孢吡肟、恩诺沙星和诺氟沙星等8种抗生素敏感,而对硫酸新霉素、利福平、氟苯尼考、土霉素、氨苄西林、磺胺甲噁唑等6种抗生素具有抗性,尤其是对氨苄西林和磺胺甲噁唑耐药严重;中间气单胞菌HX1316对氯霉素、利福平、美洛培南、头孢曲松、庆大霉素、头孢吡肟等多种药物比较敏感,但是对环丙沙星、硫酸新霉素、恩诺沙星、红霉素、土霉素、多西环素、氨苄西林、诺氟沙星、磺胺甲恶唑等具有抗性,尤其是对环丙沙星、土霉素、氨苄西林、诺氟沙星和磺胺甲恶唑耐药严重。该研究结果可为半滑舌鳎溃疡病的防治提高参考。
  3、溃疡相关气单胞菌的致病性分析
  人工感染实验表明,两种菌对半滑舌鳎均具有致病性,但是,中间气单胞菌HX1316对健康舌鳎的致死率明显低于杀鲑气单胞菌HX0416,可见,半滑舌鳎的溃疡症状应主要由优势杀鲑气单胞菌感染所致;SDS-PAGE电泳分析显示,杀鲑气单胞菌在56KD左右有一条高表达的蛋白条带,质谱分析显示其主要组分为气单胞菌气溶素,而中间气单胞菌HX1316没有出现明显的高表达蛋白条带,因此,推测杀鲑气单胞菌强于中间气单胞菌的致病性可能是由杀鲑气单胞菌高表达气单胞菌气溶素所导致。
  综合以上分析以及杀鲑气单胞菌的一般致病特点,我们认为优势杀鲑气单胞菌为半滑舌鳎溃疡的主要致病菌,气溶素为其重要致病因子。以上研究结果将为半滑舌鳎溃疡相关疾病的致病机制及其防治提供参考。
[硕士论文] 焦亚琴
基础兽医学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:鲤鱼由于缺氧和应激反应,易使其在长途运输、繁殖、培育、手术、捕捞和销售等环节中造成伤害,使用麻醉剂能有效降低鱼类的伤亡率,从而提高水产品的价值。因此,寻找高效、经济、低毒和无残留危害的鱼类麻醉剂已成为研究热点。丁香酚来源于植物,常被用作食品添加剂和调味剂,价格低,对鱼有良好的麻醉作用。但目前丁香酚在鱼血浆和组织中检测方法不完善,还无法评价其麻醉鲤鱼后的食用安全性,阻碍了其在鲤鱼麻醉运输中应用。为探讨丁香酚麻醉鲤鱼后鱼肉食用的安全性以及丁香酚麻醉效果与中枢药物浓度的关系,本研究开展了建立高效液相色谱测定鲤鱼血和组织中丁香酚含量方法的研究、丁香酚麻醉鲤鱼最适浓度和治疗指数的研究、丁香酚在鲤鱼血浆中消除规律的研究、丁香酚在鲤鱼组织中消除规律的研究和丁香酚麻醉鲤鱼的PK-PD模型的研究,以期为确定丁香酚麻醉鲤鱼后是否食用安全和新型安全鱼类麻醉剂的研发提供支持。
  结果:
  1.高效液相色谱检测鲤鱼血浆及组织中丁香酚含量方法的建立。该方法前处理采用甲醇、乙腈作为提取剂和除去蛋白,高速离心和过滤的形式去除固体颗粒,正己烷进行脱脂。色谱条件为:流动相比例为甲醇-乙腈-水(31:31:38),流速为1 mL/min,紫外吸收为280 nm,柱温为35℃,进样量为20μL。结果显示:丁香酚浓度在0.041~21.2μg/mL范围内,与峰面积比值有良好的线性关系,R2均大于0.999,各组织标准曲线线性关系良好。各组织中丁香酚的检测限分别为:肝脏中为0.173μg/ml、肌肉中为0.173μg/ml、脑中为0.063μg/ml、肾脏中为0.173μg/ml、血浆中为0.008μg/ml,在鲤鱼各组织中的平均回收率为86.7%-98.1%,相对标准偏差(RSD,relative standard deviation)为0.005%-2.768%,表明本方法灵敏度、精密度、重现性、稳定性均较好,添加回收率高,完全适用于鲤鱼血浆和组织中丁香酚含量的测定。
  2.在24℃水温条件下,用于药浴0.75±0.1kg鲤鱼的丁香酚乳剂最适麻醉浓度为35mg/l、半数有效量为26.374mg/l,半数致死量为424.384mg/l,治疗指数为16.091。治疗指数相对较高,表明丁香酚乳剂用于鲤鱼的麻醉较为安全。
  3.在24℃水温条件下,血浆中丁香酚浓度在0.25~1h间浓度变化最大,随着药浴浓度的增加,鲤鱼血中丁香酚消除时间延长。以20mg/l的丁香酚乳剂药浴鲤鱼,24h时,血浆中的丁香酚已检测不到;以35mg/l的丁香酚乳剂药浴鲤鱼,48h时,血浆中的丁香酚已检测不到;以75mg/l的丁香酚乳剂药浴鲤鱼,48h时,血浆中的仍有微量的丁香酚(0.060μg/ml)。
  4.丁香酚在血浆中浓度变化:在24℃水温条件下,随药浴浓度的增加,血浆中丁香酚初期浓度越大;以最适麻醉浓度(35mg/l)的丁香酚乳剂药浴鲤鱼时,血浆中丁香酚的Cmax为16.955μg/ml,t1/2α为0.085 h,t1/2β为4.156 h,AUC(0-t)为18.081mg/L· h。丁香酚在鲤鱼血浆中的分布符合二室模型,其药代动力学方程为C=28.573e-1.236t+2.695e-0.226t。
  5.丁香酚在组织中的浓度变化:在24℃水温条件下,以35mg/l浓度的丁香酚乳剂药浴鲤鱼,肌肉中的浓度最低,并且随时间变化而变化的幅度最小;脑中的浓度在初期远高于肌肉,在0.25~0.5h高于肝和肾,其余时间的浓度以及浓度变化与肌肉相近;肝中浓度最高,肾浓度次之,除0.25~0.5h小于脑以外,其余时间的浓度均高于肌肉和脑。在0.5h内肝、肾、脑中丁香酚浓度快速下降,以后消除速度减慢。48h时,丁香酚在各组织中均不能被检测到。
  6.根据国家标准(GB2760-96)规定的丁香酚在肉类中的安全添加量为40-2000 mg/kg,以及48h后丁香酚在各组织中均不能被检测到的结果,可得出在使用35mg/l浓度的丁香酚乳剂药浴鲤鱼时,鲤鱼肌肉食用是安全的,不需要设立休药期。
  7.以最适麻醉浓度35mg/l的丁香酚乳剂药浴0.75±0.1kg鲤鱼,鲤鱼脑中浓度在0.5h内升高很快,并在0.25-0.5h达到峰值,随后快速下降。当脑中浓度达到19.371±6.878μg/g,鲤鱼开始进入麻醉状态,当脑中浓度达到81.881±6.879μg/g时,鲤鱼到达深度麻醉,当脑中浓度降至61.455±4.137μg/g时,鲤鱼开始进入苏醒期;而与之对应的血浆中浓度分布为为4.516±1.056μg/ml、18.471±2.454μg/ml和12.657±1.772μg/ml。
[博士论文] 徐洁皓
特种经济动物饲养 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:中华鳖(Pelodiscus sinensis),俗称甲鱼,是中国传统的淡水养殖品种。近几年来,由于养殖密度增加、养殖环境日益恶劣,中华鳖在养殖过程中遭受了各类病原微生物的侵害。这些病原微生物往往能引起养殖物种的大量死亡,给养殖户造成巨大的经济损失,威胁水产养殖业的可持续发展。目前主要采用化学药物防治疾病,而化学药物的不规范使用会带来较大的食品安全隐患,并危害生态环境。免疫防治作为一种更加安全环保的防控手段,开始逐渐成为研究热点。肠道是动物重要的免疫器官,是机体抵抗外源微生物的第一道防线。研究中华鳖的肠道粘膜免疫系统,有助于更好地了解中华鳖的免疫防御机制,并为制作口服纳米疫苗提供理论基础。研究中采用组织学、分子生物学以及转录组学的方法系统研究了中华鳖肠道粘膜免疫系统,确定了肠道主要的免疫细胞,揭示了肠道对外源刺激物产生免疫应答的的分子机制,分析了参与粘膜免疫的重要蛋白多聚免疫球蛋白受体的免疫应答反应,并在以上免疫机理的基础上,研制了一种运载病原菌外膜蛋白的纳米口服疫苗,并检测了其对中华鳖的免疫应答反应。具体研究结果如下:
  1.中华鳖肠道粘膜免疫相关细胞的形态学观察和研究
  利用透射电子显微镜观察了中华鳖肠道横切面,发现肠道存在着大量的上皮内淋巴细胞和杯状细胞。将外源温和气单胞菌和LPS诱导中华鳖,利用HE染色和PAS染色方法分别观察和统计肠道绒毛上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数目变化,结果发现该两种免疫细胞数目在肠道前段、中段和后段,均表现为先上升后下降的趋势,且在48h数目达到最大值,显著高于生理盐水对照组(P<0.05)。同时还利用荧光定量PCR技术来检测外源诱导物LPS和温和气单胞菌对肠道免疫球蛋白IgM和IgD的基因表达的影响,结果发现IgM基因表达量上升,而IgD基因的表达量变化不明显。
  2.转录组学方法研究中华鳖肠道粘膜免疫机制
  利用组织切片及转录组学技术深入分析外源LPS诱导中华鳖肠道的免疫应答机制。结果显示,LPS刺激48h后,肠道的免疫相关细胞杯状细胞和上皮内淋巴细胞数目显著上升,说明外源LPS引起了肠道免疫应答。利用转录组学技术,发现外源LPS诱导组和生理盐水对照组之间存在着748个差异表达基因,包括361个表达量上调的基因和387个表达量下调的基因,其中有48个基因被鉴定与免疫相关,这些基因属于82个GO terms和14个途径。
  3.中华鳖pIgR基因的克隆及其对外源刺激的免疫应答
  通过氨基酸结构以及同源性分析,发现中华鳖pIgR基因能够编码591个氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为65.7kDa和7.38,包含有胞外区、跨膜区以及胞内区,其中胞外区包括了四个结构域;pIgR与其他爬行动物的同源性较高,鸟类、哺乳类和两栖类次之,而与鱼类的同源性最低。通过荧光定量PCR,显示pIgR基因在各组织器官中的表达量从高到低依次为:小肠、食道、大肠、肝脏、心脏、肌肉、脾脏、胃和肾脏;在胚胎发育过程中,该基因的表达量呈现一个先上升后下降的趋势,在孵化31d时达到最大值。受到外源刺激物温和气单胞菌和LPS诱导后,pIgR mRNA的表达量在食道、胃、小肠和大肠中均有显著上调后又逐渐恢复正常水平的变化趋势。Western blotting和免疫组化结果显示,pIgR蛋白在肠上皮细胞细胞质中表达,且小肠组织pIgR蛋白表达会随着LPS诱导上调,说明该蛋白在中华鳖粘膜免疫中具有重要作用。
  4.中华鳖口服纳米疫苗及免疫效果的研究
  利用离子交换法制备得到一种羧甲基壳聚糖纳米颗粒,羧甲基壳聚糖和CaCl2的最佳配比为:0.5mg/mL与2mg/mL,制备得到的纳米颗粒平均粒径为229.07±4.28nm,多分散系数PDI仅为0.070±0.02,颗粒粒径小、分散性好、颗粒均一,具有较好的安全性、稳定性以及对肠道的通透性。从嗜水气单胞菌中提取主要蛋白大小为43kDa和38kDa的外膜蛋白,利用羧甲基壳聚糖纳米粒包埋该蛋白制备得到一种纳米口服疫苗,以生理盐水、羧甲基壳聚糖纳米粒以及外膜蛋白作为对照,通过组织化学和荧光定量PCR技术来检验口服纳米疫苗的免疫效果,结果发现纳米疫苗的免疫效果高于外膜蛋白和羧甲基壳聚糖,且二次强化免疫也能引起机体肠道的免疫反应。
[博士论文] 陈文捷
水产动物医学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:鱼类神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)也称为β野田病毒(betanodavirus),是野田病毒(Nodaviridae)家族的一员。NNV感染导致的疾病称为病毒性神经坏死症(viral nervous necrosis,VNN)或者病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathy and retinopathy, VER),最初分离自患病的海洋鱼类,现在已在120多种不同的养殖和野生鱼类中被报道,严重危害着水产养殖业。近年来,越来越多的证据表明NNV开始在淡水鱼类中流行,感染实验也表明很多淡水鱼类容易受到NNV感染。虽然各国学者在NNV感染的预防和治疗方面投入了大量的研究,但对NNV致病的分子机制还没有完全阐明。通过研究赤点石斑神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)感染敏感细胞系的microRNA(miRNA)表达谱和转录组测序,可以获得大量RGNNV和宿主相互作用的信息,这些结果将有助于了解RGNNV的复制和致病机制,进而为VER的综合防控提供新的策略。虽然目前已经建立了一些对NNV敏感的细胞系,但来自鱼类神经组织的敏感细胞系还很少,因此,寻找来自鱼类神经组织的NNV敏感细胞系是十分必要的。
  本研究首先以斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)鳍条细胞系(Grouper fin cells,GF-1)为对象,利用RNA-Seq技术(Illumina)测定了GF-1细胞在RGNNV感染后3和24小时(hour,h)的miRNA表达谱。随后分别研究了GF-1细胞和来自纹月鳢(Channa striatus)鱼苗的SSN-1细胞(striped snakehead fish cells)在RGNNV感染后3和24 h的转录组,在转录组分析的基础上,进一步对NNV感染导致的细胞凋亡途径进行分析,并对两个转录组进行了比较研究。我们还采用鳜脑细胞(Chineseperch brain,CPB),研究了CPB对RGNNV的敏感性,并在此基础上研究了鳜对RGNNV的敏感性。研究结果如下:
  1.通过solexa深度测序研究RGNNV感染后GF-1细胞的miRNA表达谱,利用miRDeep2 v2.0.5软件将测序结果与斑马鱼基因组比对,一共鉴定出了220种已知miRNA,预测了18种新的miRNA。利用IDEG6软件,分别在RGNNV感染后3和24 h的GF-1细胞中鉴定到了51和16种差异表达的miRNA(Differentiallyexpressed miRNA,DE-miRNA);对DE-miRNA的靶基因进行预测、功能注释及分析,这些靶基因与广泛的生理调控有关,如转录调控、氧化还原、蛋白水解、细胞凋亡和免疫应答等。通过随机挑选了6个新预测的miRNA进行RT-PCR验证,结果表明这些新的miRNA在GF-1细胞中能够表达。通过随机挑选了6个DE-miRNA进行qRT-PCR验证,这些DE-miRNA的表达趋势与测序结果一致,表明miRNA组测序结果可信;验证了4个DE-miRNA(miR-1,-30b,-150,-184)对RGNNV复制的影响,qRT-PCR和Western blot表明过表达这四种miRNA可以显著地促进RGNNV在GF-1细胞中的复制。
  2.通过HiSeq2500测序,一共从四个GF-1细胞样品中获得127,259,258 cleanreads,经De novo拼接一共获得了111,860条平均长度为624 bp的unigene;通过blast比对,一共有35,390 unigene(31.64%)得到注释。差异表达基因(Differentiallyexpressed gene,DEG)筛选表明,感染后3和24 h分别有226和117个DEG。进一步对凋亡通路的DEG进行分析,推测RGNNV诱导GF-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的Bax和Drp1蛋白来进行;对5个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,结果与HiSeq2500测序的结果一致,证实转录组结果是可信的;通过发光法检测Caspase-3,-8和-9的活性,结果表明RGNNV感染可以导致GF-1细胞中Caspase-3,-8,-9活性的显著升高。
  3.经HiSeq2000测序,一共从四个SSN-1细胞样品中获得253,338,544 cleanreads,经De novo拼接一共获得了93,372条平均长度为829 bp的unigene。通过blast比对,一共有18,974 unigene(20.32%)得到注释。DEG筛选表明,感染后3和24 h分别有2,640和3,211个DEG;对凋亡通路的DEG进行分析,结果表明RGNNV诱导SSN-1细胞的凋亡可以通过线粒体凋亡途径中的EndoG蛋白来进行;对7个随机挑选的DEG的进行qRT-PCR验证,与转录组测定的结果相符,表明测序结果是可信的;通过Annexin V-FITC/PI和DAPI染色,证实RGNNV感染或过表达EndoG可以导致SSN-1细胞的凋亡。
  4.比较RGNNV诱导GF-1和SSN-1细胞凋亡的途径,在RGNNV感染GF-1和SSN-1细胞的转录组研究中,外源性凋亡途径相关基因的表达都没有发生显著的上调。在内源性凋亡途径方面,RGNNV感染后GF-1细胞中Bax以及Drp1的表达水平显著升高,而SSN-1细胞在RGNNV感染后,EndoG的表达水平显著升高,这三种蛋白都参与线粒体介导的细胞凋亡。此外,在内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激反应方面,RGNNV感染后,Bip的表达水平在GF-1和SSN-1细胞中都发生了显著上调,最终导致线粒体介导的细胞凋亡。由此我们推测RGNNV感染可以通过线粒体和内质网介导的凋亡途径来诱导细胞凋亡,具体的机制还需要进一步研究。
  5.评估了来自淡水鱼类鳜脑组织的细胞系CPB对RGNNV的敏感性。qRT-PCR检测表明RGNNV在CPB细胞中可以良好地复制。Annexin V-FITC/PI和DAPI两种染色途径证实RGNNV感染可以导致CPB细胞的凋亡。进一步评估鳜对RGNNV的敏感性,通过眼球注射,RGNNV可以感染鳜并导致鳜出现神经症状,表现为游泳异常;对鳜脑组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察,感染的鳜脑组织出现大量的细胞空泡化;电镜(electronic microscope,EM)扫描发现在感染的鳜脑组织里有大量紧密排列的病毒粒子,并且大量线粒体出现了肿胀,这一现象与线粒体膜电位损失是否有关还需要进一步的研究。对RGNNV敏感的淡水鱼类脑细胞株CPB的发现,将为RGNNV的致病性研究提供有力的工具。
[博士论文] 发蒙
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:鲶科鱼类广泛分布在除南极洲以外的其他大陆上,在世界各地被养殖了好几个世纪。鲶科鱼类作为世界鱼类产业的重要物种,具有较高的市场价值。鲶科鱼类在养殖过程中饱受病毒和细菌疾病的侵害,造成了严重的经济损失,影响其产量。学者们报道了几种能大规模造成鲶科鱼类死亡和发表的病毒和细菌性疾病。目前认为鱼类通过建立物理和生化免疫系统来应对入侵的微生物。然而,免疫系统组成成分十分复杂,相关酶和信号通路会有效的保护鱼体。已从鲶科鱼类中分离出多种免疫相关蛋白和酶,它们的免疫活性在包括黏膜层和分泌物在内的各种器官中被阐明。本研究报道了斑点叉尾鮰在受到斑点叉尾鮰病毒(CCV)感染后的免疫应答反应,和重组激活基因2(RAG2)的发现及在黄颡鱼中的抗菌作用。此外,还在黄颡鱼中发现了一种炎性因子CYPA并研究了其在粘膜免疫的作用。
  斑点叉尾鮰病毒(CCV)可以对斑点叉尾鮰幼鱼造成致死性感染,从而导致巨大的经济损失。CCV的基因组已经完成测序,其患病率是有据可查的。然而,CCV致病的分子机理却很少有报道。在此,斑点叉尾鮰卵巢细胞(CCO)感染CCV后,利用RNA测序技术分析转录组草图。总的来说,从73231128个测序读取中得到72686438个清洁读取,这些序列进一步组装为747168个contigs。把这些contigs拼接成49119个单基因簇,其中20912个单基因簇可以在NR数据库中找到,并匹配到15911个蛋白质,18333个序列可以在SwissProt数据库发现,并匹配到14625独特的蛋白质。与对照组相比较,我们从中发现了3641个差异表达基因,包括260个上调基因和3381个下调基因。为了验证这些基因的表达,我们采用qRT-PCR技术分析了16个差异表达基因。对差异表达基因及其相关的细胞信号通路进行分析显示,这些差异基因确实与CCV感染后引起的细胞凋亡相关,细胞凋亡的发生进一步用标准的细胞凋亡实验来阐明。结果表明,在斑点叉尾鮰卵巢细胞中,CCV可以诱导肿瘤坏死因子(TNF)介导外源性凋亡途径(而不是线粒体内源性凋亡途径)。这项研究有助于我们认识CCV发病机制,同时有助于预防斑点叉尾鮰受到CCV感染。
  重组激活基因2(RAG2)与RAG1一起调节了V(D)J免疫球蛋白重组(IG)和T细胞受体(TCR)基因。RAG2是一种脊椎动物适应性免疫反应的关键因子,解析RAG2功能特性有助于了解它在黄颡鱼中对病原体的生物应答。在本研究中,黄颡鱼的RAG2基因已经被成功克隆和鉴定,并且研究了它的表达情况。结果显示,黄颡鱼RAG2基因的开放阅读框(ORF)有1596 bp大小,编码了531个氨基酸,分子量为59.86 kDa。与其他物种进行多序列比对和系统进化分析表明了它的保守区和经典分类学和进化。我们检测RAG2蛋白的表达以及制备了anti-rag2兔多克隆抗体。随后,在不同组织中对其转录水平和蛋白水平进行了检测,其中,胸腺组织、脾脏和头肾具有相对较高的表达水平。此外,经爱德华氏菌感染后,在淋巴组织中观察到重组激活基因(RAG2)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。我们的研究表明,在黄颡鱼中,rag2可能参与了对细菌感染的免疫应答。
  鱼的皮肤黏液是抵抗病原体入侵与多种抗微生物酶的动态屏障,包括亲环素A(CypA),一种具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性的多功能蛋白。除了各种免疫功能,CypA可以诱导硬骨鱼类白细胞体外迁移。在目前的研究中,通过质谱分析法,我们在黄颡鱼皮肤粘液中已经发现了几种新的免疫相关蛋白。我们用蛋白质印迹的方法在其中检测到了CypA基因。在皮肤粘液中,CypA对黄颡鱼白细胞有很强趋化活性。有趣的是,在黄颡鱼CypA基因中,第69个氨基酸位点天冬酰胺(类似哺乳动物中的精氨酸)对于白细胞的吸引是非常关键的位点。这些发现不仅解释了皮肤粘液中多种酶的结构,同时说明了CypA基因是抗炎症治疗法的关键因子。
[硕士论文] 詹柒凤
水产养殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:NK-LYSIN是机体自然杀伤细胞(natural killer cells,NKL)和毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)分泌的小分子阳离子抗菌肽,同人类颗粒溶素granulysin是同源多肽,具有广谱的抗菌活性,对细菌、真菌、病毒、癌细胞等均有生物活性。组蛋白H2A是真核生物体细胞染色质中的一种结构蛋白,是先天性免疫的组成成分之一,其衍生的多肽片段的杀菌作用已成为目前的研究热点。
  团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的淡水养殖品种,随着养殖规模的扩大,集约化程度的提高以及养殖环境的恶化,导致各类疾病频发。其中,对团头鲂养殖影响最大的疾病是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的细菌性败血症,可造成鱼体各部位充血、溃疡、腹腔积水和肝脏发白等症状,从而导致鱼体大量死亡。另外,现阶段还没有很好的药物可以控制,养殖业中则主要使用抗生素提高鱼体免疫力,但抗生素会造成药物残留和细菌耐药性,严重影响水产业的发展和人类健康,新型抗菌药物的研发成为热点。
  本研究从团头鲂转录组中钓取到2个NK-lysin基因(nkla和nklb)和1个H2A基因,通过PCR扩增和测序验证其ORF序列,并分析序列特征。采用荧光定量PCR技术检测其在团头鲂胚胎发育不同时期以及成鱼组织和嗜水气单胞菌感染后免疫组织中的表达。构建团头鲂2个NK-lysin基因的原核表达载体,转入大肠杆菌中进行重组表达,并对其表达条件进行优化,为进一步研究NK-lysin的功能奠定了基础。本研究的主要结果如下:
  1.团头鲂3个抗菌肽基因(nkla、nklb和H2A)的序列分析
  nkla ORF全长369bp,编码122个氨基酸,DNAstar预测其等电点为6.71,分子质量为14kDa; nklb ORF全长411bp,编码136个氨基酸,DNAstar预测其等电点为6.72,分子质量为15.6kDa。多氨基酸序列比对分析显示,nkla和nklb的N端均含有信号肽,6个高度保守半胱氨酸,可形成3对分子内二硫键,以及1个SapB结构域,序列分析发现它属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族成员。系统进化分析显示,团头鲂NK-lysin基因与斑马鱼亲缘关系最近,其次是半滑舌鳎和斑点叉尾鮰。组蛋白H2A基因ORF全长387bp,编码128个氨基酸,DNAstar预测其等电点为10.92,分子质量为16.2kDa。H2A氨基酸序列不含跨膜结构域及信号肽,且其序列十分保守,不同物种间序列相似性极高。
  2.团头鲂3个抗菌肽基因在不同发育时期及成鱼各组织中的表达
  荧光定量PCR结果显示,nkla和nklb在胚胎发育的不同时期广泛表达。在胚胎发育的初始阶段,nkla和nklb呈低表达,而在出膜期时,nkla和nklb表达量快速上升。其中,nkla在眼球色素出现期达到最高表达,nklb在出膜后1d时达到最高值。H2A也在胚胎发育期广泛表达,且在出膜后7d达到最高值。
  在健康团头鲂各组织中,nkla在脾脏中表达量极高,为其他组织中的数百倍,而在肌肉、血中表达量极低,在肝脏、脑、肾脏、头肾、肠、鳃和心中均有明显表达;nklb则在肠中表达量相对较高,在脾脏、头肾表达相对较低,在其他组织中均表达。nkla和nklb不同的表达模式暗示着不同的NK-lysin可能存在功能上的分化。H2A在血中表达量最高,脑中其次,其他组织中表达量相对较低。
  3.团头鲂3个抗菌肽基因在嗜水气单胞菌感染后的表达
  嗜水气单胞菌感染后,团头鲂nkla和nklb两个基因在不同组织中的表达变化模式相似:在头肾中,nkla在感染后表达显著性下降,nklb则在4h、24h及120h时呈显著下降水平;在肝脏中,均在4h时上升到最高水平,而后回落;在脾脏中,则在72h升到最高水平,120h恢复正常;在肠中,nkla和nklb表达量在4h时显著降低,并分别在72h和24h时达到最高值,120h回到正常水平。nkla和nklb在主要免疫组织中的表达变化,暗示着它们可能在团头鲂抵抗嗜水气单胞菌侵染过程中发挥重要作用。H2A基因在肝脏和肠中的表达量均呈上升趋势,在脾脏和肾脏中,H2A的表达则是先呈下降趋势,而后显著上升。
  4.团头鲂nkla和nklb的原核表达
  成功构建了3种nkla和nklb的原核表达载体,转入到BL21(DE3)宿主菌中,获得原核表达菌株,对IPTG浓度、温度和诱导时间等各条件进行优化。在pET32a-NKLA和pET32a-NKLB重组表达体系中,融合蛋白NKLA只在沉淀中表达,NKLB则在上清和沉淀中表达,但该表达体系不稳定。而对于pET28a-NKLA和pET28a-NKLB表达体系,NKLA没有表达,NKLB在沉淀中只有少量表达。在pGEX-NKLA和pGEX-NKLB表达体系中,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量分别为38.2kDa和39.7kDa,且该表达体系较稳定。选择诱导时间为8h,在不同IPTG终浓度和各温度条件下,融合蛋白表达量没有明显差异,其中融合蛋白NKLA在37℃下IPTG浓度为0.05mmol/L时,目的蛋白占菌体总蛋白比率最高,为33.8%;NKLB融合蛋白在37℃下IPTG浓度为0.02mmol/L时,这一比率最高,为48.8%。
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