绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 23961 条结果
[硕士论文] 刘晓蓉
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪δ冠状病毒(PDCoV)是近年发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起仔猪腹泻和肠道损伤。PDCoV为有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目,冠状病毒科,δ冠状病毒属成员。全长基因组约25.4kb,其基因组序列为5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3'UTR,编码15个非结构蛋白(nsp2-nsp16),4个结构蛋白和3个特异性辅助蛋白。研究证实感染脊椎动物的套式病毒目病毒(冠状病毒科和动脉炎病毒科)编码的内切核糖核酸酶(又称为NendoU)较为保守,在病毒的复制和转录中起着关键作用,并且已证实部分冠状病毒的内切核糖核酸酶(nsp15)和动脉炎病毒的同源蛋白nsp11能够拮抗干扰素(IFN)的产生。我们之前的研究发现PDCoV通过抑制RIG-I信号转导拮抗IFN-β的产生,而PDCoV nsp15是否参与拮抗IFN-β的产生尚不清楚。基于此,本课题以PDCoV nsp15作为研究对象,探究其对IFN-β产生的影响以及具体的作用机制。主要研究内容如下:
  1.PDCoV nsp15呈剂量依赖性抑制IFN-β的产生
  将不同剂量的PDCoV nsp15真核表达质粒与IFN-β荧光素酶报告质粒IFN-β-Luc、内参质粒pTK-Luc分别共转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析和RT-PCR检测,发现PDCoV nsp15显著抑制仙台病毒(SeV)诱导的IFN-β启动子激活以及IFN-βmRNA表达,并且呈剂量依赖性,提示PDCoV nsp15具有拮抗IFN-β产生的特性。
  2.PDCoV nsp15主要抑制NF-κB的活化
  IRF3和NF-κB是调控IFN-β产生的关键转录因子,为了探究PDCoV nsp15是否影响它们的活化从而拮抗IFN-β的产生,将nsp15的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现nsp15显著抑制SeV诱导的NF-κB活化并呈剂量依赖性,但对SeV诱导的IRF3的活化无显著影响;IRF3和p65的磷酸化及其核转运分别是IRF3和NF-κB激活的标志,Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明nsp15蛋白主要抑制SeV诱导的p65磷酸化和入核,不影响IRF3的磷酸化和入核。表明PDCoV nsp15主要通过抑制NF-κB的活化拮抗IFN-β的产生。
  3.PDCoV nsp15的关键酶活位点为His219、His234和Lys269
  根据PDCoV和其他冠状病毒nsp15的氨基酸序列同源性比对及结构同源性分析,推测PDCoV的NendoU结构域活性催化氨基酸位点为His219(H219)、His234(H234)和Lys269(K269)。通过定点突变的方法获得3个突变的nsp15基因,并将其和野生型nsp15基因分别克隆至原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6P-1-nsp15以及相应的突变体质粒(pGEX-6P-1-H219A/H234A/K269A),经IPTG诱导表达、纯化后,利用荧光共振能量转移试验(FRET)分析发现,与nsp15野生型蛋白相比,3个突变体蛋白的NendoU活性显著降低,说明His129、His234和Lys269是PDCoVnsp15的关键酶活位点。
  4.PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生不依赖其内切核糖核酸酶活性
  有报道某些冠状病毒nsp15和动脉炎病毒nsp11拮抗I型IFN的产生依赖其内切核糖核酸酶活性;也有研究表明动脉炎病毒nsp11潜在的细胞毒性会影响IFN的产生。为了探讨PDCoV nsp15对IFN-β产生的抑制作用是否依赖于其内切核糖核酸酶活性及细胞毒性,首先检测了PDCoV nsp15野生型和突变体的细胞毒性,发现野生型对细胞有一定的毒性作用,3种突变体对细胞几乎没有毒性。在此基础上,将表达PDCoV nsp15野生型及突变体(H219A、H234A和K269A)的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现,3个突变体与野生型一样均显著抑制SeV诱导的IFN-β产生,相互之间无显著差异;且主要抑制p65的磷酸化,而对IRF3的磷酸化无显著影响。进一步以突变体H234A为代表,检测了nsp15突变体对内源性IRF3和p65核转运的影响,结果与nsp15野生型一样,突变体H234A抑制了SeV诱导的p65入核,但不影响IRF3的入核。上述结果表明PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生和NF-κ3的活化不依赖其内切核糖核酸酶活性,也不是其细胞毒性所致。
[硕士论文] 程晨曦
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)属于杯状病毒科(Caltcivirdae)水疱疹病毒属(Vesivirus),是引起猫上呼吸道疾病的一种常见病原。FCV感染后的主要症状是口腔溃疡、打喷嚏、结膜炎、慢性胃肠炎等。近几年出现一些强毒株可引起急性全身性疾病,造成很高的死亡率,严重危害猫的健康。FCV感染宿主后,常常和其他的病原混合感染,这为其诊断带来了困难,因此建立快速高效的FCV检测方法已经迫在眉睫。
  VP1是FCV的衣壳蛋白,是主要的免疫保护性抗原,在诱导机体产生免疫应答过程中起着重要的作用。VP1分为A-F六个区,B区在125-397aa之间是保守区域,同时可诱导宿主产生非中和性单克隆抗体(MAb)。E区在427-524aa之间,又分为高变区和保守区域,可诱导宿主产生中和性单克隆抗体。本实验首先将FCV毒株FCV2280株的VP1的B、E区序列的重组质粒pET-B、pET-E分别转化到E coli BL21Star(DE3)表达菌,经IPTG诱导后均得到大量可溶性表达。纯化的VP1-B、VP1-E蛋白和FCV2280病毒粒子经Western blot检测,三者均具有良好的反应原性。将纯化的VP1-B、VP1-E蛋白分别与弗氏佐剂均匀混合免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术将小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫后的小鼠脾细胞融合。纯化的FCV2280病毒粒子作为包被抗原,建立间接ELISA方法筛选分泌抗VP1-B、VP1-E蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株系。经过3次亚克隆,共筛选到6株稳定分泌抗VP1-B、VP1-E蛋白的单抗株,其中有4株仅能识别VP1-B蛋白,分别命名为4G2、B1E5、B4G4、B4G5;2株稳定分泌抗VP1-E蛋白的单抗株,分别命名为E2F1、E2F6。IFA和Western blot结果表明4G2、B1E5、B4G4、B4G5、E2F1、E2F6均识别FCV2280、TIG-1、HRB-SS、F9,具有良好的反应性。6株MAbs经过用亚型试剂盒鉴定,重链均为IgG1,轻链均为Kappa链。将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔制备腹水,结果表明VP1-B MAbs4G2、B1E5、B4G4、B4G5单抗株腹水的效价约为16553600,VP-E MAbs E2F1和E2F6单抗株腹水的效价约为125600和112800,中和试验表明6MAbs单抗均无中和活性。
  为进一步鉴定VP1-B和VP1-E MAbs的抗原表位,分别将VP1-B逐步截短表达,Western blot结果表明4G2、B1E5、B4G4、B4G5识别的抗原表位均为126DDGSITA132,同时对VP1-E进行截短原核表达和合成短肽进行MAbs抗原表位鉴定,结果表明VP-E MAbs E2F1、E2F6识别的抗原表位均为467YICGSLQRAWG477。因此本研究制备的VP1-B MAbs属于同一株单抗,VP1-E MAbs也属于同一株单抗。与NCBI其他毒株氨基酸序列比对分析的结果表明126DDGSITA132不保守,而467YICGSLQRAWG477相对保守。根据序列比对合成126DDGSITA132和467YICGSLQRAWG477突变氨基酸的表位密码子进行原核表达,鉴定表位突变的氨基酸位点是否与制备的单抗反应,结果表明表位126DDGSITA132中的I130V和A132T突变后不与制备的单抗反应,表位467YICGSLQRAWG477中的S471A突变后仍能与制备的单抗反应。
  本研究制备的单抗对FCV的基础研究及流行病学调查具有重要的价值。
[硕士论文] 于菲菲
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:革兰氏阴性菌已经进化出多种蛋白质分泌系统,以输出或输入跨膜大分子来适应环境和存活。2006年,Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System,T6SS)首次在铜绿假单胞菌和霍乱弧菌中作为新型的细菌蛋白分泌系统被定义,并证明其与致病性有关且介导致病菌与宿主的相互作用。T6SS广泛存在于约四分之一的革兰氏阴性菌中,是一种多功能的注射装置,可以将效应分子传递至环境、真核宿主和原核竞争者。T6SS由跨膜复合物和类似噬菌体尾鞘的针管状结构组成。关于T6SS的结构研究中,普遍认为Hcp是T6SS的关键结构组分,以头对头或头对尾的方式聚合形成环状六聚体从而形成T6SS的内管道,在鞘收缩时推动T6SS靶向细胞以输送效应蛋白。作为T6SS结构重要组成部分的同时,Hcp的分泌作为T6SS发挥功能的标志。
  有关细菌分泌系统的结构和机制研究已取得重大进展。近年来,关于分泌系统在宿主一致病菌的互作中尤其是关于免疫应答的复杂作用己成为研究热点。细菌分泌系统传送效应分子来干扰宿主细胞的正常生理功能,以一定的方式影响炎性小体通路。本研究中,PCN033是分离于病猪的肠外致病性大肠杆菌,通过全基因组测序发现其含一套T6SS基因簇。如其他致病性大肠杆菌一样,PCN033的基因组中有3个hcp拷贝,其中两个位于T6SS基因簇内,另一个位于T6SS基因簇外,分别命名为hcp1、hcp2、hcp3。本实验室已构建了并保存了Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株,hcp作为T6SS发挥功能的标志,缺失hcp后,T6SS无法正常组装进而发挥作用,故本研究利用PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3两个菌株,对PCN033感染后的宿主应答及T6SS在激活炎症过程中发挥的作用进行了探究,主要内容如下:
  1.RNA-seq检测PCN033感染后RAW264.7的转录组变化
  选择小鼠巨噬细胞RAW264.7为PCN033的宿主细胞模型,对感染PCN033后宿主细胞RAW264.7内发生的转录组变化进行分析,发现了508个差异表达的基因,对差异基因进行功能分析,发现在GO数据库中,与之相关且有统计学意义的涉及2052项生物过程、133种细胞组分、211个分子功能及52种KEGG代谢通路。差异基因参与的KEGG代谢通路中与天然免疫相关的有NF-κB、TNF、Apoptosis、TLR、NLR等信号通路。
  2.PCN033激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体
  通过Western-blot检测PCN033感染后RAW264.7中NF-κB信号通路的激活情况和胞内蛋白NLRP3、NLRC4、ASC的表达情况。结果表明,随着感染时间增加,p65发生磷酸化、IκBα降解,NLRP3、NLRC4及ASC的表达均明显上调。这说明,PCN033感染后激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。
  3.T6SS在PCN033与宿主互作过程中的作用
  有文献报道T6SS能够促进小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用。对细胞培养液中的LDH进行检测,发现Δhcp1Δhcp2Δhcp3感染相对于PCN033感染后的细胞毒性显著降低,表明了T6SS对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用有促进作用。PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3以同样的剂量静脉注射小鼠后,通过ELISA测定小鼠血清中的IL-1β。发现相对于野毒株PCN033,缺失hcp后感染使得小鼠产生IL-1β的能力减弱,也就是说T6SS以一定的方式参与PCN033促进IL-1β的释放。进一步,我们对炎性因子的转录水平进行qRT-PCR检测,发现T6SS对促炎因子IL-1β、IL-18、CXCL3、TNF-α的表达有上调作用,说明T6SS确实有一定的促炎作用。经Western-blot检测,发现PCN033感染促进RAW264.7中caspase1的活化及pro-IL-1β的加工,且T6SS在此过程中发挥作用。另外我们发现T6SS参与PCN033感染激活宿主的NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。
[博士论文] 黄淑成
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胫骨软骨发育不良(Tibial dyschondroplasia,TD)是一种家禽的营养代谢性腿部疾病,主要在胫骨干骺端的肥大软骨细胞区出现非血管化和非钙化的不成熟的软骨细胞堆积在生长板,表现为软骨内骨化的异常。在1965年,该病最先在美国被Leach RM和MC Nesheim在青年肉鸡上发现并报道,随后在火鸡和鸭等家禽上也陆续发现,临床主要表现为不愿站立,腿部骨骼变形,行动缓慢并常常以双翅来辅助行走,严重者丧失行走能力,影响采食。禽类TD病在世界各国呈广泛分布,没有区域集中性或特意高发性,每年给全世界禽类行业造成不可估量的经济损失。由于发病原因的复杂性,增加了研究其机理的难度性,肉鸡发生TD的最根本的病因至今还不清楚。
  藏鸡(Tibetan chicken,TBC)主要生活在海拔2,200~4,100m的青藏高原农牧地区,是世界上在高海拔低氧环境生活历史最悠久的土著鸡种,且至今未见有藏鸡腿病的报道,这可能与其长期生活在高海拔低氧环境有关。研究指出肉鸡TD的发生与胫骨生长板血管生成的异常有关,而骨骼的形成过程都与血管生长的过程是紧密相关的。鉴于此,我们对高海拔藏鸡和低海拔肉鸡进行了对比研究,并验证高海拔低氧环境对低海拔肉鸡的胫骨生长发育的影响,也对肉鸡TD的发生是否与胫骨生长板血管生长抑制有关作进一步研究,同时更深入的研究肉鸡发生TD时,胫骨生长板血管生长过程是如何调控的以及血管生成的减少如何影响胫骨的生长和发育。主要研究内容如下:
  1.藏鸡与肉鸡在生产性能和骨骼发育上的对比研究
  与生活在低海拔肉鸡相比,藏鸡在骨骼生长方面是否存在什么特殊之处至今仍很大的未知。在同一月份内,120只1日龄健康高海拔TBC和低海拔爱拔益加肉鸡(Arbor Acres chicken,AAC)分别在两地进行饲养。结果显示:TBC的采食量、日增重和体重,以及胫骨的重量、胫骨的长度和胫骨生长板的宽度均显著低于低海拔AAC(p<0.05)。然而,胫骨的组织病理观察到藏鸡胫骨生长板区域血管的分布明显增多。qRT-PCR结果显示HIF-1α、VEGFA以及其受体VEGFR1和VEGFR2在藏鸡胫骨生长板上的表达量均显著高于低海拔AAC(p<005)。ELISA结果也显示类似的改变,整个试验期间藏鸡血清VEGFA的蛋白含量均高于低海拔AAC。血清中VEGFR2和IL-8蛋白含量除了第7天低于AAC,在第3天、第10天和第14天均显著高于AAC(p>0.05)。这些结果表明,高海拔缺氧环境对TBC的身体和胫骨的生长是抑制的。但藏鸡胫骨生长板区域分布丰富的血管,而且较高血管生成调控基因HIF-1α、VEGFA以及其受体的表达,这可能就是TBC不发生TD的原因。
  2.高海拔低氧环境对肉鸡胫骨生长板上HIF-1α/VEGF/VEGFR信号通路表达的影响
  藏鸡是青藏高原上一个土著的地方鸡种,能够对当地严酷的高原低氧含量、低气压、高寒的环境有很好的适应性。并且通过之前的研究发现藏鸡胫骨生长板区域拥有更丰富的血管分布,血管生长相关调控基因表达水平也较高。那么,高海拔低氧环境是否可以诱导胫骨生长板更多的血管分布还未深入研究。因此,本实验选取120只健康低海拔AAC,运输到高海拔地区西藏进行饲养,分为自然低氧组和正常氧气组进行试验。结果显示,在高海拔低氧环境下AAC的生产性能和体重都受到抑制,死亡率增加;另外,胫骨的重量和长度也不同程度受到抑制。然而,血液常规指标显示在低氧环境下AAC在第14天出现的红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)增加。值得注意的是,胫骨的组织病理学分析显示在自然低氧环境14天后AAC胫骨生长板区域血管密度显著增加。qRT-PCR和Western blot结果显示肉鸡在高海拔低氧的条件下,胫骨生长板上缺氧应激基因HIF-1α和血管生长相关基因VEGFA和VEGFR1的表达水平都有显著的过表达。ELISA检测血清蛋白含量进一步证实缺氧条件下可以增加血清中VEGFA、VEGFR2和IL-8的蛋白含量。这些结果说明,低海拔AAC生活在高海拔低氧环境下,可以通过调控机体缺氧应激基因HIF-1α和血管生长相关基因VEGFA和它的受体的表达,促进胫骨生长板肥大软骨细胞区血管分布的增加。
  3.HIF-1α/VEGF/VEGFR信号通路在福美双诱导的TD肉鸡上的作用机制
  TD是一种比较棘手的家禽腿病问题,组织病理显示在胫骨近端的生长板上出现大面积的非血管化和非钙化的“软骨楔”为特征,导致骨骼钙化不全,这可能与胫骨生长板血管生成异常有关。然而,血管生成抑制在肉鸡TD发生中所扮演的角色仍然还不清楚。通过福美双诱导肉鸡发生TD期间观察到肉鸡发生跛行,胫骨生长板增宽,呈白色的非血管区。对胫骨形态指标测量显示胫骨的重量和长度减少,生长板宽度及生长板宽度系数增加。组织病理显示AAC发生TD时,胫骨近端静止区和增殖区血管的分布没有显著改变,而肥大软骨细胞区血管的分布呈显著的减少并且软骨细胞大量死亡。另外,血常规指标也显示AAC发生TD时,RBC、Hb和Hct都显著减少。接下来通过qRT-PCR、Western blot和ELISA的方法分别检测胫骨生长板上和肉鸡血清中血管生成相关基因和蛋白的表达情况,结果显示:HIF-1α、VEGFA以及它的受体的基因表达和蛋白水平在第7天TD肉鸡组都显著的减少,并且这些基因的表达水平与胫骨生长板血管的分布呈极强的正相关。总之,这些发现说明AAC发生TD时,机体可能是通过下调胫骨生长板上血管生成相关基因和蛋白HIF-1α、VEGFA以及它的受体的表达,从而抑制胫骨肥大软骨细胞区血管的分布,导致家禽胫骨生长发育的抑制。
  4.VEGF/FGF/Ang-1/PDGF-BB及其受体在TD肉鸡胫骨血管形成过程中的作用机制
  先前的研究表明,骨骼是一种高度血管化的组织,并且依赖于血管生成与成骨形成之间的协调耦联。既然血管生成的抑制和肉鸡TD的发生具有极大的相关性,那么肉鸡TD发生时,胫骨生长板肥大区血管形成过程是如何被调控的仍不清楚。研究结果显示:AAC发生TD时,中胚层分化的标志性基因纤维母细胞生长因子2(FGF2)和受体FGFR1表达水平下降;血管岛形成标志性基因血管内皮生长因子(VEGF)和受体VEGFR1\VEGR2的血清蛋白浓度被显著降低;血管岛成熟相关基因的调控包括血管生成素(Ang1,Ang2)以及它们的内皮受体酪氨酸激酶Tie2等相关基因被抑制,这些或许将导致血管发生的推迟。另外,机体通过下调VEGFA和VEGFR1\VEGFR2受体基因和蛋白的表达,上调血小板源性生长因子(PDGF)-BB及受体PDGFR-β基因表达和血清蛋白水平的升高,导致胫骨生长板血管的异常增殖和成熟,血管生成的减少。总之,肉鸡发生TD时,血管生成的抑制可能是通过抑制血管发生和血管生成过程的相关调控基因和蛋白的表达,从而导致胫骨生长板上血管分布的减少。
  5.OPG/RANKL信号通路在TD肉鸡胫骨生长上的作用机制
  TD肉鸡血管形成的抑制势必会影响骨的正常形成,那么骨生成过程发生怎样的异常调控至今仍不清楚。研究结果显示:与正常组AAC相比,肉鸡发生TD时,肉鸡的体重,胫骨的骨量、长度和中央直径都显著减少,并且体重与胫骨的骨量呈正相关。组织病理和形态学结果显示TD肉鸡胫骨近端生长板肥大区血管分布显著减少,软骨细胞呈核固缩和核溶解,生长板宽度增加。血清生化结果显示AAC发生TD时血清碱性磷酸酶(ALP)活性受到抑制,钙磷平衡被破坏。另外,通过qRT-PCR和ELISA检测胫骨生长板和血清中调控骨骼生成相关基因和蛋白发现TD肉鸡胫骨生长板和血清中骨保护素(OPG)基因和蛋白的表达都显著受到抑制,核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达水平上调,这将促进其受体核因子-κB受体活化因子(RNAK)信号的激活。并且OPG的水平与胫骨生长板上血管的分布以及胫骨的生长呈正相关,RANKL呈负相关。这些结果说明肉鸡TD发生时,胫骨近端血管浸入的减少导致软骨细胞的死亡影响骨架的延伸,同时死亡软骨细胞在生长板肥大软骨细胞的堆积,在生长板处形成严重的损伤区域。另外,肥大软骨细胞区血管侵入的减少,血清钙磷水平的失调影响肥大区软骨基质的钙化。基因水平进一步说明,促进骨形成的OPG基因被抑制,而RNAKL基因的上调,促进RNAK信号激活破骨细胞的骨吸收功能,从而影响骨的转化,导致骨量的减少。
  总之,试验通过对藏鸡的研究首次揭示藏鸡不发生胫骨软骨发育不良的生理机制可能是通过长期的高海拔低氧环境适应,上调HIF-1α,VEGF以及其受体基因的表达,提高胫骨生长板上血管的侵入有关;而且,高海拔缺氧环境对肉鸡的影响进一步证实这一作用机制。另外,福美双诱导的肉鸡TD模型显示胫骨生长板上VEGF以及其受体VEGFR1和VEGFR2基因的异常表达,抑制胫骨生长板血管化与肉鸡TD发生存在极强的正相关,这一过程可能是通过血管发生与血管生成过程中相关调控基因的异常表达,从而抑制胫骨血管化的正常分布而实现的;重要的是,血管与骨的形成是紧密相偶联的,胫骨血管化的减少影响OPG/RANKL信号通路的不平衡的表达,血清中钙磷比的异常,最终影响骨的形成,引起胫骨骨量的减少。
[博士论文] 王婷
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:外泌体(Exosomes)是细胞向胞外分泌的一类双层膜包被的囊泡,直径为30-150nm。外泌体可以介导蛋白质或核酸的转运,从而参与多种生理或病理过程。以前的研究发现,某些病毒可以通过外泌体携带其基因组或病毒粒子,从而介导病毒在细胞之间的传递或建立感染。我们前期在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染细胞的分泌蛋白质组学研究时发现,PRRSV感染细胞后外泌体释放途径被激活。同时,国外学者发现,从PRRSV感染猪的血清中提取的外泌体中含有PRRSV部分编码蛋白。但是,外泌体是否能够携带PRRSV基因组RNA或病毒粒子从而介导病毒在细胞之间的扩散尚不清楚。因此,本研究开展了外泌体在PRRSV感染中的作用研究,发现PRRSV感染细胞的外泌体携带病毒的基因组RNA,分泌的外泌体可以建立感染。更重要的是,我们发现外泌体介导的PRRSV感染不能被PRRSV特异性中和抗体中和,是PRRSV逃逸中和抗体作用的一种策略。主要研究内容如下:
  1.PRRSV感染细胞释放的外泌体(PRRSV-exosome)提取与纯化
  为了获得无游离PRRSV污染的外泌体,我们先采用PEG沉淀法富集PRRSV感染细胞上清中的外泌体,经超高速离心去除杂蛋白,然后通过CD63磁珠免疫亲和法对提取的外泌体进行纯化。通过Western blot检测、电镜观察和免疫金标记技术对提取的外泌体纯度进行检测。Westem blot结果证实提取的外泌体含有外秘体标志蛋白CD9,CD63和Alix,但未检测到内质网标志蛋白GRP94;电镜下观察到提取的外泌体呈典型的囊泡结构,大小为30~150nm;免疫金标记技术能检测到外泌体的标记蛋白Alix,但检测不到PRRSV的病毒粒子蛋白nsp2和GP4。上述检测结果表明提取的外泌体纯度高,且无游离的病毒粒子污染。
  2.PRRSV-exosome包含病毒成分
  采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对纯化的外泌体进行分析,发现外泌体中含有216种宿主蛋白,大部分是以前报道的外泌体分泌蛋白。同时,我们还发现纯化的外泌体中含有PRRSV的3种结构蛋白(GP5、M和N),用针对这三种结构蛋白的单克隆抗体通过Western blot检测纯化的外泌体,证实这三种结构蛋白确实包含在纯化的外泌体中。进一步通过RT-PCR分析了纯化的外泌体中是否包含PRRSV基因组RNA,将PRRSV的基因组分成5个重叠的片段进行检测,可以成功扩增5个重叠的片段,提示纯化的外泌体中可能含有PRRSV的完整基因组RNA。
  3.PRRSV-exosome对允许细胞和非允许细胞均具有感染性
  将纯化的PRRSV-exosome接种PRRSV允许细胞PK-15CD163和Marc-145细胞,通过观察细胞病变、检测病毒蛋白表达和TCID50测定分析PRRSV-exosome是否具有感染性。结果发现,在两种细胞上均能观察到PRRSV所引起的典型细胞病变,间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot均能检测到PRRSV N蛋白表达,TCID50检测证实外泌体感染所获得的病毒滴度与PRRSV感染细胞所获得的病毒滴度无显著差异。进一步将PRRSV-exosome接种PRRSV的非允许细胞PK-15,同样能观察到典型的细胞病变和PRRSVN蛋白的表达,说明PRRSV-exosome在PRRSV允许细胞和非允许细胞上均能建立增殖性感染。
  4.外泌体释放抑制剂能抑制PRRSV-exosome介导的PRRSV传播
  采用Transwell system建立PK-15cD163和PK-15细胞的共培养模型,检测在共培养体系中加入外泌体抑制剂GW4869后两种细胞中PRRSV感染与增殖情况。Real-time PCR和Western blot检测发现,加入抑制剂后不影响PK-15CD163细胞中病毒基因组RNA水平和nsp2蛋白表达,而PK-15细胞中病毒RNA水平和nsp2的表达量均显著降低,说明外泌体释放抑制剂能抑制外泌体介导的PRRSV传播,同时也间接证实PRRSV-exosome能在PRRSV非允许细胞上建立增殖性感染。
  5.PRRSV中和抗体不能阻断PRRSV-exosome介导的PRRSV传播
  将PRRSV特异性中和抗体处理的PRRSV-exosome和PRRSV分别接种PK-15CD163细胞和Marc-145细胞,IFA和Westem blot检测PRRSV N蛋白或nsp2蛋白的表达,结果经中和抗体处理过的PRRSV所接种的细胞中N蛋白和nsp2蛋白表达均显著降低,而中和抗体处理过的PRRSV-exosome接种的细胞中N蛋白和nsp2蛋白表达均无明显变化。进一步采用Transwell system共培养PK-15cD163和Marc-145细胞,通过荧光定量RT-PCR检测中和抗体对PRRSV-exosome感染性的影响,结果与对照相比,两种细胞中PRRSV RNA水平无显著差异,并且在PK-15CD163和原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的共培养模型中也获得了同样的结果,说明中和抗体不影响PRRSV-exosome介导的PRRSV传播。
  6.PRRSV N蛋白可通过外泌体途径激活NF-κB信号通路并诱导炎症反应
  由于PRRSV感染细胞的外泌体含有病毒的N蛋白,而以前的研究证实PRRSVN蛋白具有诱导炎症反应的特性。为了探讨N蛋白是否可以通过外泌体途径介导炎症反应,将N蛋白的真核表达质粒转染HEK-293T细胞并从转染细胞上清中纯化外泌体(N-exosome),Western blot检测证实纯化的外泌体中含有N蛋白。用纯化的外泌体处理PK-15CD163细胞,检测NF-κB的激活和炎症因子表达,发现含有N蛋白的外泌体可激活NF-κB的荧光素酶活性、促进p65的磷酸化和核转运,IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES等炎症因子mRNA水平也显著上调,而且在PAM细胞上也观察到同样的结果,说明N-exosome可激活NF-κB信号通路并诱导炎症反应。
[博士论文] ANJUMAN ARA BHUYAN
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:牛病毒性腹泻(BVD)由是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的能严重影响牛群的健康状态和生产情况,可引起持续的经济损失,是全球最重要的牛传染病之一。BVDV为黄病毒科瘟病毒属成员,其致病机制独特且能引起免疫抑制,常导致该病防控失败。正确的免疫程序、准确的检测方法和清除持续感染动物等措施对于持续有效地防控该病十分重要。本研究构建了表达BVDV E2蛋白的重组干酪乳杆菌(L.casei)评估了其免疫原性,研究了干酪乳杆菌的抑制病毒增殖能力,同时还建立检测BVDV抗原的ELISA方法,为该病的预防与控制提供技术支持。
  1、表达BVDV囊膜糖蛋白E2重组干酪乳酸杆菌(L.casei/pELX1-E2)的构建和免疫原性评价
  1.1、重组干酪乳酸杆菌(L.casei/pELX1-E2)的构建
  BVDVE2蛋白可以诱导机体产生高水平的中和抗体,同时L.casei在腹泻病的防控中被广泛使用,常被用作异源基因表达载体。本研究首先通过RT-PCR扩增BVDV(NADL-AV67)的E2基因,将其克隆至pELX1载体,构建重组载体pELX1-E2。将构建好的重组载体转入大肠杆菌BL21感受态细胞中,通过SDS-PAGE和Western blot(WB)验证E2蛋白的表达。将重组载体pELX1-E2电转到L.casei感受态细胞中,得到重组菌株L.casei/pELX1-E2。通过SDS-PAGE和WB证实重组L.casei/pELX1-E2能成功表达E2蛋白。表达产物大小约为40kDa,且当菌液OD600值达到1.5时表达量最高。通过间接免疫荧光(IFA)试验证实E2蛋白表达于重组细菌的表面。
  1.2、用BALB/c小鼠评估疫苗株免疫原性。
  将小鼠随机分成5组,其中3组分别通过口服、鼻内和肌内注射等途径免疫等量的(1010CFU/mL)重组干酪乳杆菌(L.casei/pELX1-E2),另外2组分别口服含空质粒的干酪乳杆菌(L.casei/pELX1)和无菌PBS。两周后加强免疫,共免疫三次。在免疫后0、14、28、42天,尾静脉采血,检测IgG、IFN-γ和IL-12水平,收集粪便检测sIgA水平以评估黏膜免疫水平。使用105TCID50剂量的BVDV-1株攻击免疫鼠以评估疫苗的保护效力。与肌肉注射L.casei/pELX1-E2相比,口服或者鼻内注射L.casei/pELX1-E2能显著(P<0.01)提高黏膜sIgA、血清IgG、IFN-γ和IL-12水平,其中鼻内接种免疫效果最好。中和试验结果显示,该疫苗株能产生针对BVDV的中和抗体,效价为1∶128。由此可见,L.casei/pELX1-E2可以作为一种安全、有效的预防BVD的候选疫苗。
  2、L.caseiMCJ蛋白质代谢物(LPM)抑制BVDV-1感染MDBK细胞的研究。
  乳酸杆菌被广泛应用于人和动物胃肠疾病的预防和治疗。本试验使用MDBK细胞模型,研究LPM体外抗BVDV的作用。首先从L.casei培养液中提取其安全性和活性好的LPM;其次,测定了LPM对细胞的毒性,当LMP浓度达到3000μg/ml细胞活性仍高于80%,说明LPM的细胞毒性较小。空斑试验结果证明LPM可以有效抑制BVDV感染。为了研究LPM的抗病毒机制,分别在BVDV-1病毒感染前、感染时和感染后用LPM处理MDBK细胞。间接免疫荧光试验、定量RT-PCR和WB结果显示,经LPM处理后BVDV感染细胞的数量、病毒的拷贝数以及BVDV E2蛋白的表达量显著减少,在三种处理中,在BVDV感染的同时加入LPM抑制效果最好。本研究证明LPM具有潜在的抗BVDV作用。
  3、BVDV抗原检测夹心ELISA方法的建立
  3.1、重组蛋白的表达、单克隆抗体和多克隆抗体的制备。
  首先将BVDV的NS3和E2基因分别克隆到pET-30a(+),使用原核表达系统表达NS3和E2蛋白。将纯化的E2蛋白免疫四周龄BALB/c小鼠(n=5)。间接ELISA结果显示杂交瘤细胞(IB-10)产生的抗体可识别与E2蛋白和BVDV-1抗原,其效价为1∶12800。纯化用杂交瘤细胞免疫小鼠的腹水,获得E2蛋白的单克隆抗体。使用纯化的NS3蛋白免疫10周龄新西兰白兔制备针对NS3蛋白的多克隆抗体(PAb)。采用间接ELISA、WB和IFA试验鉴定MAb和PAb。
  3.2、抗原捕获ELISA反应条件的优化。
  使用棋盘滴定法确定能产生最高P/N值的反应条件。以兔抗NS3多克隆抗体为捕获抗体、鼠抗E2单克隆抗体为检测抗体。检测了25份BVDV阴性白细胞样品,根据平均OD值确定该方法的判定标准是OD值0.523。该ELISA可检测最低浓度为50ng/mL的BVDV蛋白的和103TCID50的病毒量。批间和批内变异系数分别为3.87%和6.90%。本AC-ELISA方法可以有效区分BVDV与引起牛和猪腹泻的其他病原,无假阳性结果。
  3.3、模拟阳性样品的检测。
  将BVDV人为加入白细胞样品、皮肤和肺样品中,用本方法、TaqMan qRT-PCR和传统RT-PCR同时检测计算Kappa值。本方法与这两种方法之间的Kappa值为0.86,1.0;0.86,0.72和0.72,0.85,检测结果具有高度一致性。表明一种敏感性和特异性较好的BVDV-1的抗原捕获ELISA方法已经建立,但还需要进一步的临床评价。
  结论:本研究用小鼠模型评估了表达BVDV E2蛋白的重组干酪乳杆菌的免疫原性,结果表明该重组菌有成为新的抗BVDV疫苗的潜力;发现干酪乳杆菌在体外具有抗BVDV的活性,表明干酪乳杆菌在预防BVDV感染中的潜在治疗功能本研究还建立了高灵敏度、特异性的抗原捕获ELISA。本研究为BVD的防控提供了新的手段。
[博士论文] 季爽
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:人的Mx2蛋白(又称MxB蛋白),全称人Ⅱ型黏病毒对抗蛋白(Myxovirus resistance proteinsⅡ),隶属于Mx蛋白家族。其家族中的Ⅰ型黏病毒对抗蛋白(Myxovirus resistance proteinsⅠ,Mx1,也称MxA)具有对抗多种RNA和DNA病毒能力,特别是在干扰素对抗正黏病毒科流感病毒的过程中扮演重要角色,是检测干扰素作用的标记分子。该家族的蛋白也因此得名。
  Ⅱ型黏病毒对抗蛋白,虽被命名为黏病毒对抗蛋白,但长久以来被认为不具有对抗黏病毒感染的能力。不仅如此,该蛋白也一直被认为不具有任何抗病毒的功能,而是在调控细胞的核质运输及细胞分裂周期等细胞固有功能中发挥作用。直到2013年,两篇Nature文章同时发现Mx2蛋白在干扰素诱导的对抗人免疫缺陷病毒(HIV-1)的感染中起关键作用。后续研究证实,该蛋白主要定位在细胞核膜上,并通过其N端结构域与病毒的衣壳蛋白(CA)结合,在衣壳蛋白参与的病毒基因组反转录之后、整合之前的复制阶段发挥重要的阻断功能。
  到目前为止的研究只发现了人Mx2蛋白的抗病毒功能,且只限于灵长类慢病毒,即人免疫缺陷病毒(HIV-1)以及一些猴免疫缺陷病毒(SIVs)。对非灵长类动物的逆转录病毒,如马传染性贫血病毒(EIAV),人的Mx2蛋白不具有限制作用。不仅如此,目前对非灵长类动物的Mx2蛋白的研究也没有发现其具有任何的抗病毒功能。本文对马Mx2蛋白的功能进行了研究。研究发现,马的Ⅰ型干扰素可以明显的上调马外周血来源的单核巨噬细胞(eMDM)中Mx2基因的表达水平。过表达实验证实,马的Mx2蛋白不仅能够限制人免疫缺陷病毒HIV-1等灵长类慢病毒的复制,而且也能限制非灵长类慢病毒EIAV的复制,但对伽玛逆转录病毒属的逆转录病毒(MLV)不具有明显的限制作用。基因敲减实验证实,马Mx2蛋白表达的敲低会减弱Ⅰ型干扰素对EIAV病毒的限制功能。通过构建截短蛋白和嵌合蛋白,证实马Mx2蛋白与人Mx2蛋白一样,其N端结构域是发挥限制功能的关键区域。有趣的是,间接免疫荧光实验发现,在病毒感染后该蛋白的细胞定位会发生改变,由原有的散在于细胞质中的定位变为以细胞核周为主的定位方式,并可以与进入细胞的病毒衣壳蛋白共定位。其N端缺失的突变体由于不能与衣壳蛋白结合而丧失抗病毒功能。人的Mx2蛋白因为不能与EIAV的衣壳蛋白结合,而不具有EIAV病毒的限制功能,印证了之前研究的结论。
  本研究首次证明了马Mx2具有抗灵长类动物慢病毒的活性,同时具有抗马属动物慢病毒EIAV的功能,是一种天然免疫种间限制因子,提示这一因子在物种天然免疫进化中扮演重要角色。这一发现丰富了对Ⅱ型黏病毒对抗蛋白的理解和作用机制的认识。
[硕士论文] 杜纳丽
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:弓形虫病是一种危害严重的人畜共患传染病,人和动物的弓形虫感染呈全球性分布,严重危害人类健康,且给畜牧业的发展造成了巨大的经济损失。而传统抗弓形虫药物几乎都存在着不能完全杀死虫体及包囊,停药后复发率较高以及对免疫功能缺陷患者基本无治疗效果等缺陷。因此,迫切需要研制和开发一种高效、低毒的抗弓形虫药物。弓形虫和疟原虫同属顶复门原虫,两者在蛋白转运、代谢途径有很多相似机制。ClpB是HSP100/Clp蛋白家族的一员,具有分子伴侣功能,其能瓦解蛋白聚集体和协同其它伴侣蛋白修复变性蛋白。ClpB通过溶解热胁迫下的蛋白聚集体,减少热激对细胞的伤害,与细胞的耐热性紧密相关。弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,广泛的寄生于哺乳动物和鸟类并暴露在各种寄生条件中。最近研究表明疟原虫PfClpB2定位于纳虫空泡膜上,为致死基因,证实该基因是治疗疟原虫的理想药物靶标。
  本研究通过对弓形虫数据库的分析比对鉴定了10个Clp家族假定蛋白,分为两大类:8个Hsp100/Clp分子伴侣家族和2个ClpP蛋白家族。ClpP蛋白家族成员可组成Clp蛋白酶的催化亚基;Hsp100/Clp分子伴侣家族成员组成Clp蛋白酶的调节亚基。为了进一步鉴定了弓形虫一类ATP依赖盼分子伴侣蛋白TgClpB1,TgClpB2和TgClpB3,将带有Flag标签的三个目的基因表达质粒转染到弓形虫野生型RH株中,我们发现TgClpm,TgClpB2和TgClpB3分别定位于虫体的细胞浆,线粒体和顶质体中。另外应用CRISPR/Cas9方法将TgClpB1和TgClpB2基因分别进行敲除并补回。结果表明尽管TgClpB1和TgClpB2的敲除在正常条件下不能影响虫体的生长和复制,但在热激条件下敲除TgClpB1基因却能显著抑制虫体生长。进一步分析表明在热激条件下TgClpB1基因的缺失还能显著影响虫体的入侵,生长和复制,但不影响其逸出,并且在热刺激的条件下,首次在弓形虫两个极端发现了TgClpB1蛋白聚集的情况,TgClpB2则无明显表型。而TgClpB3基因是位于弓形虫必不可少的顶质体膜相关蛋白。因此,TgClpB3很可能是极具潜力的抗弓形虫病潜在理想的药物靶点。
  综上所述,本研究利用基因缺失型虫株通过虫体的生长试验评价了TgClpB1、TgClpB2和TgClpB3基因对弓形虫生长发育的影响,鉴定三个ClpB家族蛋白作为抗弓形虫潜在药物靶点的潜力,为弓形虫新药的研发提供了新的路径和理论依据,更有利于推动弓形虫新药研发的进程。
[硕士论文] 郭杰
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:B7分子是免疫系统中重要的免疫调控分子,属于免疫球蛋白超家族成员。表达于抗原递呈细胞上的B7分子与相应受体结合提供T细胞活化的第二信号,调节T细胞的免疫应答。B7-H4是新发现的B7家族成员,在氨基酸水平上与其他B7家族成员有20-30%的同源性,通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上,属于Ⅰ型跨膜蛋白。B7-H4在mRNA水平上广泛地分布于各种组织中,但B7-H4蛋白在大部分组织表达是有限的,仅仅在活化的B细胞、抗原递呈细胞和单核细胞上有表达。B7-H4在各种恶性肿瘤中异常高表达,B7-H4在肿瘤微环境中的表达与肿瘤的免疫逃逸有关。
  目前,人们对B7-H4分子的研究主要集中于人和鼠上,对猪B7-H4(pB7H4)分子的研究却未见报道。本研究通过人B7-H4基因序列进行BLAST搜索,克隆了pB7-H4基因的编码区序列。通过RT-PCR和Real-time PCR方法探究了pB7-H4在各组织的表达情况。结果表明,我们成功克隆了pB7-H4基因ORF区域,其大小为849bp,编码282个氨基酸。生物信息学分析表明,pB7-H4蛋白分子量为30.7KDa,理论等电点为5.47,具有信号肽和跨膜区。实验结果显示,pB7-H4基因在健康猪淋巴结,睾丸,小肠,大肠,胆,肾,脾,腮腺,肝,心,肌肉,脑,肺,膀胱,胃上均有表达,其中在脾脏中相对表达量较高,在睾丸和肌肉中相对表达量较低。
  为了分析pB7-H4在免疫细胞上的表达,我们制备了抗pB7-H4的单克隆抗体。首先,根据克隆到的pB7-H4基因,设计特异性引物,通过PCR技术扩增pB7-H4胞外区基因片段。原核表达重组pB7-H4蛋白并用其免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选出了一株抗pB7-H4蛋白的单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株3C8,并对其进行了荧光标记。MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为IgG1。Western blot和流式细胞仪分析表明该MAb能与pB7-H4蛋白特异性结合。流式细胞仪分析猪外周血T淋巴细胞、巨噬细胞和肺泡巨噬细胞上pB7-H4的表达情况,结果表明,肺泡巨噬细胞和外周血巨噬细胞高表达pB7-H4分子,但是在T淋巴细胞中却检测不到pB7-H4的表达。为了进一步探究pB7-H4在猪肺炎支原体感染下的表达情况,本研究通过猪肺炎支原体感染实验,用制备的单抗对猪肺脏组织切片进行免疫组化染色,免疫组化结果显示,猪肺炎支原体感染下猪肺脏组织中pB7-H4的表达显著高于健康猪,这说明pB7-H4可能在猪肺炎支原体感染中发挥作用。
  综上,本研究首次克隆了猪免疫调控分子B7-H4基因,发现mRNA水平上pB7-H4广泛分布于健康猪的淋巴结、睾丸、小肠、大肠、胆、肾、脾、腮腺、肝、心、肌肉、脑、肺、膀胱和胃,其中脾脏中相对高表达,睾丸和肌肉中相对低表达。证明了pB7-H4分子在外周血巨噬细胞和肺泡巨噬细胞上高表达,在T淋巴细胞上检测不到表达。初步证明了猪肺炎支原体感染下肺脏组织中pB7-H4阳性细胞数增加。本研究为进一步研究pB7-H4分子的免疫学功能及其与疾病发生之间的关系提供参考。
[硕士论文] 谷文丽
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:H3亚型禽流感病毒对家禽生产影响虽不如高致病性禽流感病毒,但在病毒传播过程中,可为家禽体内的其他亚型禽流感病毒提供基因片段,因此加强H3亚型禽流感病毒的检测十分重要。而目前尚未有针对H3亚型禽流感病毒的快速检测方法,因此为建立针对H3亚型禽流感病毒的免疫学快速检测方法,本研究在对近几年H3亚型禽流感病毒流行株HA基因遗传进化差异以及病毒抗原性差异研究基础上,选择DK/GX/S10225/2015(H3N2)、DK/GZ/S1352/2015(H3N8)、DK/FJ/S1131/2015(H3N3)作为免疫原免疫6周龄BALB/c雌性小鼠开展H3亚型禽流感病毒HA单抗制备的研究,小鼠经禽流感病毒3次免疫后无菌取出脾细胞和骨髓瘤细胞在体外融合,通过血凝抑制方法筛选得到27株针对HA蛋白的单克隆抗体,分别命名为1E12、1F7、1-1C9、1-2G7、1-3C8、1-3G2、1-4B6、1-4E6、1-4E11、2F11、2-3G3、2-4B6、2-4F11、2-4H7、3B10、3C9、3-1A5、3-2A2、3-2D2、3-3F6、3-3G4、3-2H4、4A12、4H11、4-1B6、4-2F10和5-4D8,并对所筛选出的单克隆抗体进行一系列生物学特性分析。
  抗体亚类鉴定结果表明,单克隆抗体1-3C8的重链为IgM,单克隆抗体2-4F11、2-4H7、3-1A5、3-2A2、3-3F6的重链为IgG1,单克隆抗体1-1C9、1-3G2、1-4B6、1-4E6、2F11、3B10、3-2D2的重链为IgG2a,单克隆抗体1E12、1F7、1-2G7、1-4E11、2-3G3、2-4B6、3C9、3-2H4、4H11、4-2F10的重链为IgG2b,所有单克隆抗体的轻链均为κ链。特异性检测结果表明,抗体1-2G7、2-4H7、3-1A5、3-2A2、3-2H4与H6亚型禽流感病毒有一定的交叉血凝抑制反应,抗体1-2G7、1-4B6、3-2A2、3-2H4与H11亚型禽流感病毒有交叉血凝抑制反应,抗体1E12、1F7、1-1C9、1-3C8、1-3G2、1-4E6、1-4E11、2F11、2-3G3、2-4B6、2-4F11、3B10、3C9、3-2D2、3-3F6、3-3G4、4A12、4H11、4-1B6、4-2F10和5-4D8,与其他亚型禽流感病毒无交叉血凝抑制反应,有良好的针对H3HA的特异性。单克隆抗体1-4E6、1-3G2、3-3G4、1E12、2F11、3-3F6与不同进化分支和抗原性差异的H3亚型禽流感病毒均具有较高的血凝抑制价,具有较好的广谱性,经Western blot实验证实这6株单抗均与HA1蛋白结合。利用制备的广谱性单克隆抗体,建立了检测H3抗体的阻断ELISA方法,为H3亚型禽流感病毒的临床诊断提供了有效工具。
[硕士论文] 刘慧敏
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的可感染多种哺乳动物的急性传染病。猪是PRV的自然宿主,感染可造成怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎,新生仔猪急性死亡。PRV属于疱疹病毒科,具有疱疹病毒粒子的典型结构,其中,被膜层是一个复杂的蛋白网络,位于衣壳和囊膜之间。由UL37、UL48、UL49基因分别编码的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒复制及装配中执行着不同的生物学功能,研究这些蛋白的功能对新的抗病毒靶点筛选具有重要意义。然而,对这些蛋白进行检测和定位的方法还没有建立起来。
  本研究,首先将UL49、UL48、UL37基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS,并采用KCl染色切胶法纯化原核表达的蛋白。分别用真核质粒和纯化的蛋白作为抗原,对Balb/c小鼠进行3次免疫。通过细胞融合及单抗特性鉴定试验获得1株稳定分泌VP22蛋白单抗的杂交瘤细胞株3D6;2株稳定分泌VP16蛋白单抗的杂交瘤细胞株1D4、4B6;3株稳定分泌pUL37蛋白单抗的杂交瘤细胞株1E2、2G2、11C3。间接免疫荧光(ⅢA)和Western-blot试验表明,抗体株均可与相应蛋白特异性结合;经抗体亚类试剂盒鉴定,单抗亚类均为IgMκ;ELISA检测单抗的效价,1D4为1∶8000,11C3为1∶6000,3D6为1∶3000,4B6为1∶4000,1E2、2G2为1∶32000。
  测定PRV分离株HLJ-2013的病毒滴度,并将其(0.1MOI)接种于易感性细胞PK15,16h后收集细胞并制备免疫标记用超薄切片。将以上实验获得的单克隆抗体进行1∶50,1∶100,1∶200稀释作为一抗,商品化抗鼠金标抗体1∶100倍稀释作为二抗,进行感染细胞内伪狂犬病毒VP22、VP16、pUL37蛋白免疫标记和电镜检测。通过对免疫电镜结果的分析,筛选出在亚细胞水平结合特异性强的单克隆抗体株:3D6、1D4、1E2,其最佳稀释比例分别为:1∶100、1∶100、1∶200。
  综上所述,本研究成功制备出针对PRV被膜蛋白pUL37、VP16、VP22的单克隆抗体,为PRV结构研究提供了生物材料;利用单克隆抗体建立了在PRV感染细胞内pUL37、VP16、VP22蛋白的免疫胶体金标记方法,为这几种蛋白的功能及被膜装配机制的研究提供了技术手段。
[硕士论文] 梁甜甜
兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:新城疫(Newcastle disease,ND)是禽类重要的致死性病毒性传染病,其病原为新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)。NDV宿主范围广泛,可感染几乎所有鸟类。野鸟不仅是NDV的自然宿主,还在NDV传播和进化过程中扮演重要角色,所以野鸟源新城疫病毒是ND流行病学研究的一个重要部分,也是容易被忽视的部分。
  本研究中所用的20株NDV分离自黑龙江省和吉林省的野鸟样品。本研究对分离到的20株NDV进行了全基因组序列测定和遗传进化分析,并根据classⅡ类NDV的分子特征和遗传进化分析选出5株(基因Ⅲ型Mallard/CH/HLJ383/06、基因Ⅶd型WB/CH/HLJ/001/06、基因Ⅶb型Mallard/CH/HLJ127/06、WB/CH/JL01/07和Mallard/CH/HLJ363/05)进行致病性试验、单因子血清制备及抗原性分析。测序结果显示,20株NDV基因组长度有三种类型,分别为15186nt、15192nt和15198nt;其中15株NDV的F蛋白裂解位点为112RRQKRF117,1株NDV的F蛋白裂解点为112RRQRRF117,属于典型的强毒株裂解位点;其余4株NDV的F蛋白裂解位点为112ERQERL117,属于典型的弱毒株裂解位点。F基因遗传进化分析显示4株具有弱毒裂解位点的NDV属于classⅠ类b亚型;16株具有强毒裂解位点的NDV属于classⅡ类NDV,其中1株为基因Ⅲ型,4株为基因Ⅶd型,其余11株为基因Ⅶb型。遗传进化分析表明,与classⅠ分离株高度相似的NDV在野鸟和家禽均有分布,classⅠ分离株与classⅠ类5个参考株的全基因组及6个结构基因的开放阅读框架区核酸序列比对分析表明,classⅠ分离株与参考株之间存在一定差异。但classⅠ分离株与同亚型classⅠ类NDV之间遗传距离差异小于3%,具有较高的F基因核苷酸一致性,表明本研究中分离的4株classⅠ类NDV在遗传进化上并没有形成独立的分支,推测是中国classⅠ类b亚型NDV传播到野鸟并适应产生的。近几年我国广东、湖北、江西、吉林和贵州等地区分离到的classⅠ类NDV,与本研究的classⅠ类分离株高度相似,表明该基因亚型NDV目前在中国分布比较广泛。此外遗传进化分析表明,分离的classⅡ类基因Ⅲ型NDV与疫苗株Mukteswar遗传进化关系很近,但毒力强于Mukteswar。本实验分离的classⅡ类基因Ⅶb型NDV与2013年在以色列分离到的基因Ⅶb型NDV Pheasant/H-Israel/2013/746828遗传关系最近,分离的classⅡ类基因Ⅶd型NDV与2007年在塞尔维亚分离到的基因Ⅶd型NDV/Serbia/1038/2007遗传关系最近。与classⅡ类基因Ⅶ型分离株高度相似的NDV在野鸟和家禽均有分布,表明该基因型NDV可以在野鸟和家禽之间传播。
  致病指数测定结果显示Mallard/CH/HLJ383/06、WB/CH/HLJ/001/06、Mallard/CH/HLJ127/06、WB/CH/JL01/07和Mallard/CH/HLJ363/05的ICPI值均大于1,表明这5株分离株均为强毒株。对F48E9、Go/CH/HLJ/LL01/08、Mallard/CH/HLJ383/06、WB/CH/HLJ/001/06、Mallard/CH/HLJ127/06、WB/CH/JL01/07和Mallard/CH/HLJ363/05进行F蛋白和HN蛋白抗原位点分析发现,F蛋白抗原位点在不同基因型NDV之间仅有1个氨基酸不同,HN抗原位点在不同基因型NDV之间出现多个氨基酸不同。交叉中和试验结果显示,分离株Mallard/CH/HLJ363/05和Mallard/CH/HLJ383/06与F48E9具有明显的抗原差异;Mallard/CH/HLJ363/05与WB/CH/JL01/07具有明显的抗原差异,Mallard/CH/HLJ383/06与WB/CH/JL01/07具有明显的抗原差异;其它毒株之间抗原差异较小或没有差异,表明分离的基因Ⅶ型NDV与同一基因型毒株之间没有抗原差异或抗原差异较小。
  本研究表明,有多种不同基因型的NDV存在于野鸟群体中,包括ClassⅠ类和ClassⅡ类,既有强毒株,也有弱毒株,提示野鸟在新城疫病毒传播过程中具有重要作用。本研究为进一步研究野鸟在NDV流行病学中的作用及对我国新城疫的防控提供了依据。
[硕士论文] 高嘉聪
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:猪繁殖与呼吸综合征(porcme reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种重要传染病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失,其主要临床表现为妊娠母猪的繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸道症状。PRRSV为RNA病毒,其基因组在复制过程中容易发生突变,产生PRRSV变异株,并伴随着病毒生物学特性的改变。我国自1996年首次报道PRRSV后,相继出现一系列的PRRSV变异株,比如2006年爆发的高致病性蓝耳病变异株、近年来出现的NADC30-like PRRSV和GM-like PRRSV,毒株的多样性给PRRS的防控带来了很大的困难。
  为了解我国PRRSV的分子流行病学和遗传变异特征,本研究从临床样品中测得217条ORF5序列,以及从GenBank中获取的我国自1996年首次报道PRRSV以来至2016年12月的所有ORF5基因序列(n=2213,来自全国32个省份),并进行了系统分型和地理分布分析。结果表明我国北美洲型PRRSV可分为5个分支(lineage),分别为L1分支、L3分支、L5分支、L8分支和L9分支,各分支之间氨基酸同源性不超过90%。其中L8分支(HP-PRRSV)为我国PRRSV的主要分支,占所有毒株数量的856%;近年新出现的L1分支(NADC30-like PRRSV)与L3分支(GM-likePRRSV)毒株所占比例有明显的上升趋势。在L8分支(HP-PRRSV)中出现了与JXA1和HuN4等早期高致病性蓝耳病变异株差异较大的毒株,参照进化树拓扑结构,本研究以氨基酸同源性不超过965%为依据,将L8分支细分为7个亚分支(L81-L87),以便今后更好地监测HP-PRRSV的遗传变异情况。在此基础上,绘制出各省份出现的PRRSV分支情况,以及各分支PRRSV在各省总毒株中所占比例。同时参考毒株分离时间、遗传亲缘关系、猪只贸易等因素,绘制出不同分支PRRSV的可能的跨省传播路线。目前我国欧洲型PRRSV均为欧洲型L1分支。
  通过对北美洲型PRRSV全基因组序列(n=204)分析发现HP-PRRSV和经典PRRSV之间存在两个规律性的氨基酸突变,分别位于NSP9的第519位和第544位。基于HP-PRRSV HuN4株和经典PRRSV CH-1a株感染性克隆,构建了一系列的第519位或第544位氨基酸互换和缺失的突变病毒。发现缺失任何一个氨基酸都不能拯救出子代病毒。在Marc-145和PAM细胞上的复制动力学表明,以HuN4为骨架的突变病毒较其亲本复制效率明显降低,而以CH-1a骨架的突变病毒的复制效率明显提高。突变病毒的噬斑大小与其亲本病毒之间也存在明显差异。在仔猪感染实验中,通过感染突变病毒与亲本病毒的仔猪的临床症状、血清病毒载量、组织病理学和胸腺萎缩等指标检测,发现以HuN4为骨架的突变病毒对仔猪的致病性较其亲本明显降低。结果表明,NSP9中第519位和第544位的氨基酸是决定HP-PRRSV高复制效率以及高致病性的关键氨基酸。
  本研究较为系统地分析了我国1996年首次报道PRRS以来我国PRRSV的遗传变异情况,制定了高致病性PRRSV亚分支的分类标准,基本摸清了各省PRRSV本底,为我国PRRS的防控提供了理论支撑。首次鉴定出高致病性PRRSV的致病相关氨基酸位点,有助于了解高致病性PRRSV的分子致病机制。
[硕士论文] 卢曼曼
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:δ-冠状病毒(Deltacoronavirus,DCoV)是冠状病毒科的新成员,能够感染哺乳动物和禽类。2012年中国香港首次报道了猪δ-冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV),它能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,严重危害养猪业的健康发展。到目前为止,PDCoV感染宿主细胞的过程尚不清楚,病毒粒子与其特异性受体结合是感染发生的首要条件,因此鉴定出PDCoV的受体,有望从分子水平上阐明PDCoV入侵宿主细胞中分子机制,为新型疫苗研制提供理论支持,同时也为德尔塔冠状病毒的受体研究奠定了基础。
  不同种属间冠状病毒受体差异较大,本研究根据已有的研究基础,经过合理的推断,以已知的猪冠状病毒受体猪氨基肽酶N(pAPN)和唾液酸分子(Sialic acid)为研究对象,通过对PDCoV非易感细胞乳鼠肾细胞(BHK-21)过表达,及易感细胞猪睾丸细胞(ST)过表达和RNA干扰试验(siRNA),细胞受体阻断试验等进行验证。结果表明pAPN和Sialic acid分子对PDCoV在易感细胞ST中复制并无影响,其不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,这为PDCoV致病分子机理的研究带来了新的参考依据。
  相关研究表明冠状病毒识别相应的受体并成功进入到宿主细胞,是由纤突(Spike,S)蛋白完成的。S蛋白是一种大的Ⅰ型跨膜糖蛋白,按其功能不同,又将其分为位于N端的S1和位于C端的S2,而S1主要介导病毒与受体分子的结合。PDCoV能感染ST细胞,且能在ST细胞上繁殖,说明ST细胞表面存在PDCoV的受体分子。为进一步筛选鉴定PDCoV的受体,在此理论基础,本研究建立了PDCoV-S1蛋白真核表达纯化系统,使表达的PDCoV-S1蛋白接近天然蛋白的复杂构象,用免疫沉淀法(IP)法钓出ST细胞中与S蛋白相互作用的蛋白,经质谱鉴定筛选到了可能的受体分子,通过对其基因沉默、过表达,我们发现宿主蛋白热休克蛋白90AB1(pHSPCB)在PDCoV感染中起重要作用,结果表明pHSpCB上调表达促进PDCoV复制,pHSPCB被小分子干扰RNA敲低则抑制PDCoV复制,该蛋白有利于PDCoV在易感细胞ST细胞中增殖。
  本研究揭示了pAPN和Siac acid不是PDCoV的受体分子,而热休克蛋白90AB1(pHSPCB)能促进PDCoV感染猪睾丸细胞,本研究结果为PDCoV侵入机制提供了新的参考依据。
[硕士论文] 马芹
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus,AMDV)感染引起的自身免疫功能发生紊乱、衰竭的慢性持续性传染病。该病引起幼貂死亡和成年貂貂皮质量和生殖力下降,严重影响了水貂养殖业的发展。针对该病目前没有商品化疫苗,貂场主要通过定期筛查、检疫、淘汰阳性个体达到种群的净化。随着我国水貂养殖业的飞速发展,开展水貂的实验动物化研究迫在眉睫,开展疫病诊断和治疗制剂研究前景广阔。
  核酸适配体是从体外合成的寡核苷酸文库中利用指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的单链核苷酸分子(RNA或ssDNA),通过折叠形成高级结构,与特定靶标高效结合影响其生物学功能。核酸适配体以高亲和力、高特异性、易修饰、可大量合成、化学性质稳定等优势,在毒素、肿瘤细胞、致病菌和病毒等诊断技术研究中应用广泛。因此,核酸适配体作为单克隆抗体的有益补充,可为兽医病原微生物研究提供新思路和新工具。
  本研究采用磁珠SELEX技术筛选了AMDV VP2蛋白的核酸适配体。经过10轮筛选,获得与靶蛋白具有明显亲和力的富集文库。通过高通量测序、同源性比对和进化树分析,共得到4个不同分支,分别选取候选核酸适配体(AMDV-1#、AMDV-11#、AMDV-14#和AMDV-18#)进行特性分析。ELOSA试验结果显示AMDV-1#和AMDV-14#与靶蛋白具有良好的亲和力(Kd=565nM和Kd=247nM)和特异性(P<001)。通过比较AMDV-1#和AMDV-14#适配体的高级结构发现,两者存在共同序列“CCTATGCGTGCTACCGTG”,且该序列参与形成典型的茎环结构,该结构可能与适配体的特性直接相关。
  为了开发核酸适配体在AMDV检测上的应用价值,本研究建立了核酸适配体和单克隆抗体联合应用的双夹心ELOSA方法。通过优化反应条件,确定单克隆抗体的最佳工作浓度为10ng/μL,适配体浓度为1μM,该方法与犬细小病毒、犬腺病毒及BSA蛋白均无交叉反应,检测限度为50ng/μL,通过检测53份水貂粪便临床样品,该方法与PCR检测的总符合率为8966%。为了筛选得到具有抑制病毒复制的核酸适配体,本研究首先建立了AMDV-Utah株在CRFK细胞上的感染体系,MTT试验结果表明不同浓度适配体对细胞活性没有产生明显影响(P>005)。根据富集文库测序、序列进化分析结果,挑选15条序列开展抗病毒活性研究。结果表明,AMDV-12#可降低感染体系中约22%的病毒载量,而其它适配体对病毒复制的抑制作用不显著(P>005)。综上所述,本研究成功筛选得到针对AMDV VP2蛋白的核酸适配体,初步建立了基于核酸适配体的DAS-ELOSA方法,同时筛选得到具有抑制病毒复制的核酸适配体,可为AMDV的诊断和抗病毒研究提供新思路。
[硕士论文] 马骁
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是遍布全球,具有极度危害的一种传染病,世界范围内每年因狂犬病死亡的人数约为6万人,而其致病机制仍然未完全阐明。狂犬病的病原是狂犬病病毒(Rabies virus,RABV),RABV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssaviruses)的有囊膜病毒。RABV编码五种结构蛋白,核蛋白(N),大蛋白(L)基质蛋白(M),糖蛋白(G)和磷蛋白(P)。G蛋白是RABV最重要的结构蛋白之一,在RABV感染早期发挥重要作用,能与细胞膜上的受体相结合,介导RABV进入细胞内。
  衔接蛋白复合体(Adaptor Protein Complex,AP),是一个多聚体,其主要生理功能是分选货物蛋白到细胞膜上。目前在哺乳动物细胞内已经发现4种衔接蛋白复合体。AP2是细胞内最重要的衔接蛋白复合体,参与网格蛋白介导的内吞作用,起连接货物蛋白和网格蛋白的作用。
  实验室前期利用RNA干扰技术在人类全基因组水平上筛选了与狂犬病病毒(RABV)生命周期有关的宿主基因。筛选发现敲低AP2的μ亚基(AP2M1)表达,可以抑制RABV的感染。为研究AP2M1影响RABV感染的机制,本实验在人胚胎肾细胞(HEK-293)和人神经母细胞瘤(SK细胞)中敲低或过表达AP2M1,采用高内涵筛选、病毒滴度检测等方法分析在细胞中敲低或过表达AP2M1对狂犬病病毒感染率的影响。结果表明敲低AP2M1,RABV感染率显著下降;过表达AP2M1,RABV感染率上升。酸绕过实验证明AP2M1在RABV感染中发挥作用。采用激光共聚焦的方法观察发现RABV G蛋白与AP2M1无共定位。利用免疫共沉淀实验证明AP2M1与狂犬病病毒G蛋白无相互作用。综上所述,AP2M1基因是在RABV感染过程中发挥作用,但不是通过与RABV G蛋白的直接作用影响病毒的感染。本研究为阐明AP2M1在RABV生命周期中具体作用奠定了基础。
  水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis virus,VSV)也是弹状病毒科的一员,利用RNA干扰技术,在HEK-293细胞中敲低AP2M1,VSV感染被抑制;过表达AP2M1,提高VSV的感染率,说明AP2M1基因能影响VSV感染。本研究为寻找AP2M1基因以及AP2M1上下游调控基因的药物靶点,研究广谱抗病毒药提供了一定的理论基础。
[硕士论文] 杨丽君
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度接触性的肠道传染病,在临床上主要表现为猪的呕吐、腹泻和脱水,其中仔猪死亡率高达100%,严重威胁国内外养猪业的经济发展。尽管对PED的报道已有四十多年的历史,但有关该病的致病机制却知之甚少。
  本研究发现,PEDV感染细胞后可以引起表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的磷酸化,提示病毒感染可激活EGFR。已有文献报道EGFR在某些病毒感染中发挥重要作用,因此我们对EGFR在PEDV感染中的作用进行了解析。首先,我们运用EGFR配体EGF(Epidermal Growth Factor)特异性激活EGFR后测定其对PEDV感染的影响,结果显示活化的EGFR提高了病毒RNA水平和病毒滴度,表明EGFR可促进病毒感染。同时,EGFR过表达实验证实当EGFR功能增强时,病毒的感染效率增强,这提示EGFR参与PEDV感染。我们使用EGFR特异性抑制剂Erlotinib和Gefitinib进一步测定EGFR对PEDV感染的影响。间接免疫荧光检测结果表明EGFR抑制剂显著降低PEDV的感染效率,western blot、相对荧光定量PCR和TCID50结果证明随着抑制剂浓度升高,病毒蛋白表达水平、RNA水平和病毒滴度逐渐降低。此外,我们引入EGFR特异性siRNA,western blot结果证明EGFR内源性表达被敲低后可以抑制病毒蛋白的合成,相对荧光定量PCR和TCID50实验结果也显示EGFR表达量降低后病毒的RNA水平和滴度显著降低。上述实验结果证实在PEDV感染中,EGFR发挥重要作用。
  因此,我们对EGFR影响PEDV感染的分子机制进行了探索。首先,使用EGFR特异性的siRNA检测其对IFN-Ⅰ的影响。相对荧光定量PCR结果显示敲低EGFR后IFN-Ⅰ相关基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平均明显升高,表明抑制EGFR活性可以恢复细胞抗病毒活性来抑制PEDV感染。进而我们检测PEDV感染后EGFR下游分子STAT3的变化情况,western blot结果表明在PEDV感染中,STAT3也被磷酸化,提示病毒感染激活了EGFR及其下游分子STAT3。运用STAT3抑制剂或者STAT3特异性siRNA抑制STAT3活性或表达,相对荧光定量PCR结果显示当抑制STAT3功能时,干扰素相关基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平明显升高,提示抑制STAT3活性可促进干扰素产生。相对荧光定量PCR和western blot检测过表达STAT3对PEDV感染的影响,结果显示提高STAT3表达水平提高了PEDV的RNA和蛋白水平,表明STAT3的活化可促进PEDV的感染。最后,我们运用特异性siRNA敲低STAT3表达结合EGF处理激活EGFR的方法检测EGFR介导的促进病毒感染与STAT3的相关性。Western blot结果显示由EGFR活化引起的PEDV N蛋白增加却因STAT3的敲低而受到抑制,表明病毒感染诱导的EGFR活化可通过其下游分子STAT3介导的信号通路来拮抗细胞的抗病毒反应。
  本研究首次证明EGFR在PEDV感染中的作用,阐明了一种新的PEDV逃避机体抗病毒反应的机制,可能作为PEDV感染的治疗靶点。
[硕士论文] 谷晨晨
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:结核病是在全球范围内广泛传播的一种慢性、消耗性人畜共患传染病。鹿结核病主要由牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌引起,不仅给养鹿业造成严重损失,同时也是人结核病的主要传染源。
  目前皮内结核菌素(PPD)试验是诊断动物结核病的主要方法。但是鹿在接种卡介苗(BCG)后,PPD试验反应的特异性受到严重干扰,无法将BCG接种鹿与野毒株感染鹿区分开来。迄今为止,尚无有效的方法确诊野毒感染鹿结核病。研究表明,ESAT-6是结核病强毒株特有的特异性抗原,可用作自然感染鹿结核病的诊断抗原。Ag85是结核分枝杆菌最主要的分泌蛋白,有较好的抗原性。因此,本研究旨在通过表达纯化出ESAT-6和Ag85b,制备成能有效鉴别野毒感染与疫苗接种鹿的抗原,进而建立起快速检测鹿结核病的早期诊断方法。
  利用由结核病鹿肺组织中分离鉴定出的牛结核分枝杆菌染色体为模板,分别克隆出ESAT-6和Ag85b基因,将两种基因分别连接到pNC-HisE载体,构建出ESAT6-pNC-HisE和Ag85b-pNC-HisE表达载体。表达载体转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞,通过新霉素抗性平板筛选,以及PCR和限制性内切酶酶切鉴定,成功研制出表达ESAT-6和Ag85b的枯草芽孢杆菌工程菌株。
  将枯草芽孢杆菌工程菌株接种于新霉素抗性培养基中,应用枯草杆菌表达系统,分泌性表达目标蛋白,分别利用ESAT-6和Ag85b单抗,采用Western Blot方法检测,证明成功表达出ESAT-6和Ag85b。
  取枯草芽孢杆菌工程菌培养物上清,经超滤粗分离后,应用AKTA蛋白纯化系统,利用镍琼脂糖凝胶FF柱,对上清中带有His标签的目标蛋白进行分离纯化。纯化产物通过SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,表明已分别纯化出ESAT-6和Ag85b。
  应用斑点杂交方法,利用鹿结核病、鹿副结核病、鹿坏死杆菌病、鹿布氏杆菌病、鹿大肠杆菌病、鹿魏氏梭菌病的阳性血清,对纯化出的ESAT-6和Ag85b的抗原特异性进行评价,实验结果表明,ESAT-6和Ag85b均有较好的鹿结核病特异性,可作为鹿结核病的诊断抗原开发利用。
  本项研究成功研制出能够表达ESAT-6和Ag85b的枯草芽孢杆菌工程菌株,表达并纯化出了有较好特异性的ESAT-6和Ag85b,为区分卡介苗免疫和自然感染鹿结核病及鹿结核病早期诊断方法的建立提供技术支持。
[博士论文] 仝明薇
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:犬瘟热病毒(CDV)感染引起的犬瘟热(CD)是水貂致死性疾病中的主要传染病之一,给水貂养殖业带来了严重的经济损失。该病没有有效的治疗方法,主要通过疫苗免疫进行预防,但是越来越多的文献表明,免疫过疫苗的动物仍能够发病。如何有效防控CDV感染一直是研究者们关注的热点。病毒与宿主之间的相互平衡和制约决定了疾病进程和转归,因此更好的了解病毒-宿主之间相互作用关系有助于发掘潜在的抗病毒靶标。本研究首次利用iTRAQ技术对CDV感染前后的Mv.1.Lu细胞进行了比较蛋白质组学分析,并且对TLR3对CDV感染和复制增殖的影响和作用机制进行了研究,以期为有效防控水貂CDV感染提供一定的理论依据。
  为了揭示CDV与水貂细胞内蛋白之间的互作关系,我们利用蛋白质组学技术对CDV PS毒株感染前后24h的Mv.1.Lu细胞内的蛋白表达变化情况进行了分析。共鉴定到520个差异蛋白,包括151个上调蛋白和369个下调蛋白。利用DAVID和UniProt数据库进行功能富集分析表明,差异蛋白参与多种生物学过程。Network和KEGG通路分析显示差异蛋白主要涉及NF-κB信号通路,此外还参与了NLRs和TLRs等通路。进一步利用Western Blot和激光共聚焦显微镜检测了CDV感染后NF-κB P65的磷酸化和核转移情况,结果显示,CDV感染Mv.1.Lu细胞确实能够激活NF-κB信号通路。
  为了确定TLRs是否参与了CDV感染Mv.1.Lu细胞诱导的免疫应答过程,以及进一步研究TLRs在CDV感染Mv.1.Lu细胞诱导的NF-κB激活过程中是否发挥作用。本研究利用qRT-PCR技术首先检测了CDV感染Mv.1.Lu细胞后,TLR3,TLR7和TLR8mRNA的表达变化情况,同时利用MYD88抑制剂和TLR3抑制剂干扰相关蛋白的表达后,用双荧光素酶实验检测了CDV感染Mv.1.Lu细胞中TLRs对NF-κB相对活性的影响。结果表明TLRs确实参与了CDV感染Mv.1.Lu细胞的过程,同时也参与了CDV感染Mv.1.Lu细胞诱导的NF-κB激活过程。
  在上述研究基础上,进一步分析了TLR3对CDV复制增殖的影响及具体的作用机制。首先,利用RACE技术首次克隆了水貂TLR3全长基因,并成功构建水貂TLR3的真核表达质粒pCMV-myc-TLR3。随后利用TLR3过表达和TLR3抑制剂检测了不同处理下CDV的复制情况。结果发现,过表达TLR3能够抑制细胞中病毒mRNA和蛋白的合成,相反,抑制TLR3表达能够促进CDV的复制。为了揭示其中的作用机制,我们分析了CDV感染Mv1.Lu细胞中TLR3对IFN-β,Mx1和NF-κB表达的影响,并利用NF-κB抑制剂研究了NF-κB对CDV复制的影响。结果表明,TLR3能够促进CDV感染Mv.1.Lu细胞中IFN-β,Mx1和NF-κB的表达,而抑制NF-κB激活能够促进CDV繁殖。综合以上结果表明,TLR3在CDV PS感染Mv.1.Lu细胞中具有一定的抗病毒活性,可能是通过促进IFN-β和Mx1的产生以及促进NF-κB的激活来发挥抗病毒作用的。
  本课题从蛋白质组学入手比较了CDV感染Mv.1.Lu细胞前后对水貂细胞内蛋白质表达的影响,从总体水平分析了病毒-宿主细胞之间的复杂的网络互作关系,从而筛选出对CDV感染反应强烈且与免疫应答紧密相关的蛋白进行下一步研究。后续通过分子水平研究相关基因对CDV复制增殖的影响及作用机制。本研究结果有助于深入了解CDV感染宿主细胞诱导的天然免疫应答的分子机制,为发掘潜在的抗病毒靶标和有效防控水貂CDV感染提供了实验依据。
[硕士论文] 王莉莉
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是一种具有高度传染性的能够引起鸡慢性呼吸道疾病的病原体,感染鸡主要表现为咳嗽、喷嚏、气管罗音和鼻炎,给我国的养禽业造成了严重的经济损失。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是诊断MG感染的一种常用的血清学检测方法,目前国内还没有商品化的MG抗体ELISA检测试剂盒,在我国开展的MG血清学检测中通常使用进口试剂盒,但其检测成本很高、不适合大范围推广应用,这给我国MG的防控带来困难。因此,研究具有自主知识产权的MG抗体ELISA诊断试剂盒可为我国MG的流行病学监测及净化提供有效的诊断工具。
  在本实验室前期的研究基础之上,初步筛选出属于粘附素蛋白和热休克蛋白家族的五种脂质相关膜蛋白即P25、P33、P37、P60和P44。利用原核表达系统将其进行表达纯化,用多份MG阳性血清进行Westem blot分析,结果显示属于热休克蛋白家族的重组蛋白P60(rP60)与MG的阳性血清发生较强的特异性免疫反应,表明rP60具有较好的反应原性。
  将纯化的rP60作为包被抗原,建立rP60-iELISA方法,分别对抗原包被浓度、血清稀释倍数及作用时间、封闭液的选择及封闭条件、二抗稀释倍数及作用时间、cut-off值等反应条件进行优化,确定ELISA最适工作条件为抗原的包被浓度为2.5μg/mL;血清样品1∶80稀释37℃作用60mm;5%的脱脂乳37℃封闭2h,酶标二抗1∶10000稀释37℃作用30mm;TMB室温显色10mm;最适的cut-off值为032。为了评估rP60是否具有开发为试剂盒的潜力,对该方法的敏感性、特异性、重复性、准确性及其与商品化试剂盒的符合率、抗体持续期监测及保存期等性能进行评估,结果显示:该方法的敏感性为98%,最低检出上限为血清样品1280倍稀释;特异性为98%,与滑液支原体等几种常见的鸡源性呼吸道疾病的阳性血清无交叉反应;重复性试验结果表明,rP60-iELISA批内变异为1.54%~5.15%,批间变异系数为2.83%~5.98%,对8只疑似MG感染的临床样品进行病原学、分子生物学和血清学进行综合诊断,rP60-iELISA的检测结果与分离培养结果最接近;对临床收集的208份血清样品用rP60-ELISA和商品化试剂盒同时进行检测,两者总符合率为87.8%;rP60-iELISA最早可在鸡免疫疫苗后1周监测到MG抗体,与商品化试剂盒相比,该方法更适合早期检测,组装的试剂盒在4℃下保存8个月内,各试剂性状稳定,灵敏性和交叉反应检测结果变异系数均小于10%。上述结果表明,依据MG抗体间接ELISA方法组装的试剂盒,具有良好的敏感性、特异性、准确性、重复性和稳定性,有望为临床MG感染的诊断和防控净化提供一种准确、简便的检测工具。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部