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[硕士论文] 张倩
果树学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:根结线虫(Meloidogyne spp)是影响世界作物安全生产的重要病害,同时也是造成桃树“短寿病”和“重茬病”的重要致病因素之一,其中尤以南方根结线虫(Meloidogyne incognita)危害最为广泛和严重。培育抗根结线虫桃品种是控制南方根结线虫病害的绿色安全、经济高效措施。对桃抗根结线虫基因进行全面系统研究,探索抗病基因在免疫系统中的位置和作用,为认识桃抗根结线虫的本质奠定基础。本课题组前期围绕红根甘肃桃1号(Prunus kansuensis L)抗南方根结线虫基因进行了大量的基础工作研究建立了一种快速鉴定桃对根结线虫抗性的方法,确定了桃表观形态发生变化的重要时期,利用‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’构建了桃连锁图谱,将抗根结线虫基因定位在2号染色体,完成‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’南方根结线虫侵染后各时期的转录组测序,用二代分子标记定位红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因,将抗性基因定位至NBS29(6cM)和SRAPs标记M4E11-100(20cM)之间。为更精确对红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因定位,本研究将继续进行该抗性基因的定位和发掘工作,为抗病品种的利用提供思路,同时为抗病育种工作奠定理论依据。
  本研究首先以BC1代构建抗、感基因池进行BSA测序。而后用‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’杂交F1自交构建F2代分离群体,利用BSA测序结果以及KASP基因分型确定抗性候选位点区段,深入分析基因序列以及基因表达量,逐步发掘控制红根甘肃桃1号抗南方根结线虫的关键基因。通过以上试验,本研究初步明确了控制红根甘肃桃1号抗南方根结线虫的候选关键基因,获得的主要结果如下
  1、利用亲本为‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’的BC1群体构建抗、感混池,以全基因组重测序为基础进行性状BSA定位,共检测到2,442,036个SNPs。筛选亲本中纯合且F1中杂合的SNP位点,共挑选出1,569,564个多态性标记。选择‘红根甘肃桃1号’作为参考亲本,分析计算两个子代池的△SNP-index。选择95%置信水平下,在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP位点,得到候选的77个多态性标记位点。
  2、利用15个SNPs对302份F2代材料进行KASP基因分型,共获得3883个位点的基因型,占总位点数的857%。独立性检验结果表明SNP3(CHR24905737)、SNP5(CHR25397749)、SNP7(CHR25582276)与红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因相关性最高。
  3、利用不同侵染时期的‘红根甘肃桃1号’、‘贝蕾’根部样品,对25个候选基因进行基因表达分析,结果发现关键候选基因ppa020745m在红根甘肃桃1号中随根结线虫侵染表达量升高,在侵染后12h表达量显著升高,在贝蕾中基本不表达。其上游启动子序列在抗病种质中存在一个35bp的缺失。在250个F2后代中进行验证,结果表明在86个抗病后代中该片段均缺失,115个抗病后代测序时该缺失片段处为双峰,推测该缺失片段在抗病材料中为缺失或杂合,在49个感病后代中该片段存在。
[博士论文] 周喆
果树学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:苹果再植病是一个复杂又难以解决的历史性问题,也是保障我国苹果产业可持续健康发展必须解决的问题。筛选抗重茬苹果砧木品种是目前防治苹果再植病最为环保且有效的途径。开展苹果砧木中参与调控抗再植病相关基因的筛选及作用机制研究,对于通过基因工程手段选育苹果再植病抗性砧木具有重要意义。以往研究表明,苹果再植病的关键发病因子主要是真菌,几丁质是真菌细胞壁的重要组成成分。模式植物研究结果显示,植物的几丁质受体蛋白可通过识别几丁质而触发植物的免疫反应,从而对随后的病原菌侵染表现出抗性。本研究借鉴了模式植物的研究成果,通过生物信息学分析,结合两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种(G935与B9)的转录组分析结果,成功获得了抗苹果再植病相关基因MdCERK1,并通过qPCR、pull-down及质谱测序等技术对该基因的表达特性及相互作用蛋白进行了筛选,获得了以下主要的研究结果:
  1.使用Pythium ultimum分别对两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种进行侵染,通过RNA-seq筛选差异表达基因来获得在苹果再植病抗病中起关键作用的目标基因。因为CERK(chitin elicitor receptor kinase)基因包含的胞外LysM(lysin motif)结构域,对几丁质的识别具有特异性。理论上,CERK基因对苹果再植病真菌性病原菌具有广谱抗性,具有很高的研究意义和应用价值,所以我们选择其作为进一步研究的目标基因。
  2.在利用qPCR研究基因表达时,需要内参基因对实验过程进行校正,而当前有关苹果根组织响应不同胁迫条件后的基因表达尚少有研究。所以我们利用了我们的转录组数据,选择了10个表达水平变化最小的基因和5个之前有过报道的内参基因。然后采用Delta Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper等分析方法对这15个基因在不同实验条件与不同基因型根组织中的稳定性进行了分析。结果表明,MDP0000095375、MDP0000147424、MDP0000233640、MDP0000326399和MDP0000173025等5个基因无论是非生物胁迫还是生物胁迫条件下都较为稳定,可以用作相关研究的内参基因。
  3.利用已公布的苹果基因组数据库GDR和The Apple Genome and Epigenome,鉴定苹果LysM基因家族成员。通过系统的鉴定,共得到30个苹果LysM家族成员。使用在线工具ExPASy Proteomics Server对MdLysM蛋白的基本信息进行预测。根据聚类分析可将这些基因分为A、B和C三组,且C组又可进一步被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个亚族,说明它们的功能可能已经发生了分化,基因结构的复杂程度与进化树聚类存在联系。MdLysM蛋白结构域预测的结果及基因结构分析的结果均与进化树聚类结果吻合。序列相似性及对MD09G1111800的基因组结构、结构域组成的序列分析以及其对外源几丁质的响应等结果显示,MD09G1111800是AtCERK1的同源基因,因此我们将其命名为MdCERK1。
  4.组织特异性表达分析显示,相比花、果实、种子等组织来说,MdCERK1还是主要在根、叶等营养组织中表达。立枯丝核杆菌侵染的苹果根组织中MdCERK1的转录调控模式证明,MdCERK1是一个功能性模式识别受体(pattern recognition receptor protein,PRR)。pull-down结果显示,GST-MdCERK1具有几丁质分子绑定能力,进一步从生化角度上证明了其就是苹果中的几丁质受体蛋白基因。其在不同抗性品种均能响应病原侵染,但是调控模式存在差异。
  5.使用pull-down联合质谱筛选到MdCERK1可能的互作蛋白PR4,进一步解析MdCERK1的抗病信号转导机制。
  综合以上所有的数据,得到结论,MdCERK1是一个几丁质绑定受体类激酶,主要在苹果营养器官中发挥作用,并且在响应苹果再植病病原菌侵染中发挥重要作用。
[硕士论文] 刘建雄
农业电气化与自动化 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柚子重量分级是柚子采后处理的重要环节,然而现有分级设备多为适用于工厂的大型通用果品重量分级装备,园地分拣仍以人力为主。因此,开发适用于中小农户的柚子称重分级设备对于提高生产效率具有重要意义。该文提出小型模块化柚子称重分选方案,设计了由上果机构、疏离机构、分选机构组成的分选线,编写了基于LABVIEW与MATLAB的数据采集与分析软件,设置6个柚子重量等级,设计了基于PLC的分选机构控制程序,以实现自动上果、自动单排化、电子称量与智能分选,理论分选速度为6000个/小时,用户可根据需要选择是否为称重分级核心模块搭配其他机构;此外,针对柚子单果重量大而导致的对称重传感器的冲击载荷和称重信号干扰,开展了信号分析区间均值重量预测的称重算法研究与基于BP神经网络的称重算法研究。主要研究结果如下:
  1.设计了小型模块化柚子重量分选机,分选机上果机构由具有挡板的带式输送机构成,上果机底部设置果箱收集倾倒的柚子,疏离机将柚子单排化后有序进入分选机构,分选机构对柚子进行电子称量,自动分级。
  2.搭建了分选系统控制电路和通讯电路。分选机硬件上使用单点式悬臂梁传感器产生重量信号,信号经电压变送器放大后送入数据采集卡,采集卡以串口通讯形式与PC连接,将采集电压信号以数字量形式传入PC,PC通过LABVIEW与MATLAB软件分析处理后得到重量,重量通过PC送入PLC内,PLC根据编好的分级程序对柚子进行等级判断,光电开关作为柚子到来触发装置,触发信号将传入PLC,当满足当前等级时PLC输出分选执行信号控制电磁铁动作,实现柚子分选。
  3.开发了分选系统电子称量软件,设计了基于LABVIEW与MATLAB的滤波算法与重量预测模型,设计了符合分级标准的分级程序和上位机界面等。
  4.动态称重装置固有频率测量,采用单位脉冲方式作用于称重装置,将输出信号进行傅里叶变换观察信号频率情况,测试显示称重装置有一个频率为39Hz的较强共振峰,此外频域图中还有一个较弱频率为54Hz的共振峰。称重装置空载试验,在三种速度下测试空载信号,结果表明不同速度下信号主频大小不同,在0.33m/s时主频为82Hz,在0.4m/s时为85Hz,在0.5m/s时为90Hz,且主频峰值随速度变大而变大。动态称重信号分析,使用5种数字滤波器对信号滤波,分析滤波后信号重量预测结果,结果表明,使用IIR滤波器、FIR滤波器与小波去噪均具有较好精度,其中使用IIR滤波器误差最小,而使用自适应滤波器误差最大。数字滤波算法执行时间分析,IIR程序运行时间为0.9ms,FIR程序运行时间为2.78ms,小波去噪程序运行时间为3.085ms,NLMS程序运行时间为12.4ms,RLS程序运行时间为39.6ms。基于BP神经网络进行重量预测,选择动态称重信号特征变量,建立神经网络模型,利用模型对数字IIR滤波后信号进行重量检测,试验中最大平均误差和最大误差均出现在速度为0.5m/s时,BP神经网络算法误差较均值法更小,且最大平均误差为2.17%,最大误差为4.56%,分选准确率为92.3%。
[硕士论文] 吴艳迪
果树学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:褪黑素是一种吲哚胺类激素,广泛存在于大多数有机体中。作为一种抗氧化剂和自由基清除剂,褪黑素可参与调节动、植物体内多种生理功能。人体可通过外源摄入褪黑素含量丰富的水果以增加血液中内源褪黑素含量和抗氧化能力。葡萄作为一种经济栽培果树,营养价值丰富,目前有关葡萄中内源褪黑素含量变化的研究不多。本研究调查了不同胁迫条件和不同发育时期对葡萄内源褪黑素含量的影响,并且对葡萄中褪黑素合成基因进行初步的筛选,结合qRT-PCR技术分析果实不同发育阶段褪黑素合成基因的表达模式,进一步探究褪黑素及其前体物质的含量与褪黑素合成基因之间的相关性,此外还克隆了葡萄5-羟色胺-N-乙酰转移酶(SNAT)基因的CDS序列,采用原核表达系统在大肠杆菌中诱导该基因产生可溶性蛋白,初步研究了葡萄SNAT基因的特性和酶学功能。主要研究结果如下:
  1.干旱胁迫和盐胁迫下葡萄幼苗根系和叶片中褪黑素含量较对照组均显著增加,且胁迫程度越强增幅越大。用120mmol/l的Nacl溶液处理葡萄幼苗,6d后幼苗根系和叶片中褪黑素含量分别达到627.25和3220.42pg/g,均为相应对照组幼苗根系和叶片中褪黑素含量的7倍。10%聚乙二醇PEG6000模拟的干旱胁迫处理葡萄幼苗,6d后其根系和叶片中褪黑素含量也远远高于对照组。
  2.不同发育阶段的葡萄果实中均检测到褪黑素的存在。果实开始转色后,褪黑素含量上升,在转色末期,褪黑素含量降低,随着果实逐渐成熟又表现出上升的趋势,在转色初期含量达到最高峰,为1.32±0.06ng/g FW。而且在果实发育过程中,褪黑素合成前体物质——色胺和5-羟色胺含量变化趋势与褪黑素一致,均在转色初期含量最高。
  3.以水稻褪黑素合成基因为模板,采用同源比对方法对从葡萄基因组中初步筛选了4个Vv TDC基因,7个VvT5H基因,3个Vv NAT基因,5个VvASMT基因作为葡萄褪黑素合成候选基因,在果实发育过程中VvT5H1、Vv T5H5、VvT5H7、VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNA T3、VvASMT1、VvASMT2等基因的表达模式和褪黑素含量相一致,而VvTDC1、VvASMT5基因的表达量变化趋势与褪黑素不完全一致。
  4.克隆了葡萄SNAT基因全长CDS序列,长741bp,编码246个氨基酸,与其他植物SNAT基因编码的氨基酸序列存在较高的相似性。采用原核表达方法诱导得到葡萄SNAT可溶性蛋白。体外酶活测试表明,重组SNAT蛋白具有N-乙酰基转移酶的活性,能够将乙酰基从乙酰辅酶A转移到5-羟色胺。系统发育树结果表明,葡萄SNAT基因与羊SNAT基因亲缘关系较远,与拟南芥、水稻等单子叶被子植物的亲缘关系较近。
[博士论文] 宋放
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柑橘根系根毛稀少,严重依赖与丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhzial Fungi,AMF)形成菌根来吸收土壤养分。除了AMF,根际其他微生物也能够促进植物生长,同时提高植物对病原菌入侵、干旱、寒冷和高盐和重金属等生物或非生物胁迫的抗性。因此,系统鉴定柑橘根系微生物尤其是AMF的群落结构,并探讨其功能和调控对柑橘生产具有重要的实践意义。本研究采用高通量测序技术鉴定了柑橘根系的AMF群落结构以及柑橘响应菌根共生的miRNA,并通过超表达或干涉技术对关键miRNA进行了功能验证,为深入研究菌根共生形成的分子机制提供了依据。利用微生物组和宏基因组技术对柑橘根系微生物群落的结构和功能及其受黄龙病侵染的影响进行了鉴定。本研究主要研究结果如下:
  1.柑橘根系AMF群落鉴定及其主要影响因素分析
  以来自8个柑橘产区的柑橘实生苗及不同嫁接组合为材料,通过对柑橘根系AMF的18S rRNA基因片段进行454焦磷酸测序,鉴定了柑橘AMF的遗传多样性,并且评估了生境、砧木和接穗基因型对AMF群落结构的影响。通过测序我们从77个柑橘根系样品中总共得到740000条有效序列,对应产生1028个AMF的OTU分子种。这些序列被进一步注释到75个AMF种中,其中66个都属于球囊霉属,说明球囊霉属真菌为柑橘AMF的优势菌属。主成分分析(PCA)表明:柑橘AMF群落结构受到生境和寄主基因型的显著影响,其中生境是最主要的影响因素。有意思的是,尽管AMF与砧木根系存在直接接触,但我们发现柑橘接穗基因型可能比砧木基因型对AMF群落结构的影响更大,意味着接穗可能通过代谢物运输或其他途径远距离调控菌根共生形成。
  2.柑橘响应菌根共生miRNA的鉴定及功能分析
  以常用柑橘砧木枳为材料,采用Small RNA测序鉴定了枳根系响应丛枝菌根共生的miRNA。结果共鉴定到148个己知miRNA和15个新miRNA,其中20个miRNA及miRNA*受到菌根诱导或抑制表达。这20个差异表达miRNA包括了两个已知共生相关的miRNA(miR171b和miR167h),以及可靶定丛枝菌根共生相关基因(如GRAS家族基因RAD1和RFCb)的miRNA,如miR473,miR1446b/c和miR477a/c。为验证这些miRNA的功能,我们选取miR477a构建了超表达及STTM载体并遗传转化枳获得了阳性植株,为下一步表型鉴定提供了材料。此外,我们找到了其在苜蓿中的同源miRNA(miR5037a/b/c),定量PCR发现miR5037a/b/c在苜蓿中同样受到菌根诱导表达。由于miR5037a/b/c有3个前体但只有1个成熟体,我们分别构建了3个超表达载体和1个STTM载体并转化苜蓿毛状根。表型检测发现miR5037的超表达植株的菌根侵染率与丛枝丰度均轻微上升但未达显著水平,而miR5037的STTM转基因株系的菌根侵染率与丛枝丰度均显著下降,说明miR5037a/b/c可能参与了丛枝菌根共生调控。
  3.柑橘根系微生物群落结构鉴定及其对黄龙病侵染的响应
  以赣州柑桔科学研究所同一果园健康和感染黄龙病的枳砧纽荷尔脐橙根系为材料,通过对细菌16S rRNA特异区段进行高通量测序,鉴定了柑橘根系内生及根际细菌群落结构,并分析了感染黄龙病对柑橘根系细菌群落的影响。我们从16个柑橘根系及根际样品中获得1010116条有效序列,总共鉴定到2464个细菌OTU。其中变形菌门细菌在柑橘根系内生及根际细菌群落均为优势菌种,占总OTU数的37.42%,占总序列数的58.25%,说明变形菌门细菌为柑橘根系微生物群落的优势菌。与健康树相比,感染黄龙病的树其根系的细菌总丰度和多样性无显著性差异,但部分细菌种类的相对丰度发生了显著变化从而影响细菌群落结构。其中与抗病相关的拟无枝酸菌属和与降解相关的鞘氨醇盒菌属在感染黄龙病的柑橘根系中的丰度均显著上升,暗示这两类菌参与了黄龙病胁迫响应过程。
  4.基于宏基因组学的柑橘根际微生物群落结构及功能鉴定
  本研究以赣州柑桔科学研究所同一果园健康和感染黄龙病的枳砧纽荷尔脐橙根际土壤为材料,采用宏基因组测序鉴定柑橘根际微生物群落结构及功能,同时检测黄龙病侵染对柑橘根际微生物功能的影响。我们对16个样本测序后总共获得102474个基因。通过基因注释,我们总共检测到43个门类,1167个属以及3571个种的微生物类群,说明柑橘根际微生物群落具有极高的多样性,并且宏基因组方法在属和种水平测序精度较高。柑橘根际宏基因组中细菌基因占总基因数的99.59%,其中变形菌门是基因数最多的菌种门。柑橘根际微生物群落的功能主要为氨基酸转运和代谢、能量产生与保存、水化合物运输与代谢、细胞壁/薄膜/膜生物合成、转录、信号转导机制等。受黄龙病侵染影响的柑橘根际微生物中超过74%的丰度差异基因均参与代谢相关通路,其中丰度最高的三个通路为代谢通路、不同环境中细菌代谢、次级代谢产物生物合成,说明黄龙病侵染对柑橘根际微生物的代谢功能具有重要影响。在黄龙病侵染的柑橘根际微生物群落中麦芽糖酶、β-葡糖苷酶、磷酸葡萄糖异构酶、烯醇酶和丙酮酸激酶这些降解糖分的关键酶的丰度均显著降低,而降解芳香烃类化合物的乙醛脱氢酶和4-草酰巴豆酸异构酶的丰度则显著升高。该结果表明,黄龙病侵染引起的柑橘韧皮部的筛管堵塞会减少柑橘根系分泌物,并导致柑橘根际微生物群落中以根系分泌的代谢物为主要碳源的细菌丰度的降低;另外根系因为缺乏碳水化合物而坏死,增加了土壤中难降解的木质素等芳香烃类化合物的含量,从而导致降解芳香类化合物的丛毛单胞菌属、雷氏菌属、鞘氨醇盒菌属和鞘氨醇杆菌属的丰度增加。因此我们推断黄龙病侵染能够通过改变柑橘根际分泌物以及根际的环境条件来改变其群落结构。
[硕士论文] 陈晨
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:以钾低效基因型西瓜早佳(ZJ),钾高效基因型西瓜勇士(YS)为材料,通过构建不同嫁接组合以及外源施用生长素类似物(NAA)、生长素极性运输抑制剂(NPA和TIBA),以正常钾(3mM)为对照,对低钾(0.01mM)条件下三方面进行了研究:(a)ZJ和YS根系构型差异及生长素相关转运基因的表达特点;(b)不同西瓜接穗对砧木根系钾吸收和生长素含量的影响;(c)外源生长素及抑制剂对ZJ和YS钾吸收的影响。研究结果如下:
  1.研究了低钾对西瓜根系构型特点、以及钾吸收和生长素转运基因的影响,结果表明,在受到低钾处理12d后,ZJ和YS幼苗均受到抑制,但YS受到的抑制程度相对较轻。ZJ和YS在低钾下根系和叶片的钾含量比对照均下降,ZJ根系及叶片的钾含量下降幅度大于YS,高亲和钾吸收基因Cla012760(HAK5)在YS中的表达量相对于对照上调幅度更大,生长素转运基因Cla017975(AUX1)、Cla018455(PIN1)等在YS植株根系内的相对表达量更高,暗示了生长素可能在西瓜钾吸收中发挥作用。
  2.研究了不同接穗对西瓜幼苗生长、钾吸收和生长素含量及转运基因表达量的影响,结果表明,耐低钾西瓜YS作为接穗提高了低钾敏感西瓜ZJ在低钾下的适应能力,与Z/Z自嫁相比,Y/Z西瓜幼苗的根系总长、根系体积、根系表面积以及根尖数量均有所增加,叶片和根系的组织钾含量也显著提高,低钾下根系和叶片生长素的含量均显著增加,相关基因Cla012760(HAK5),Cla017975(AUX1),Cla018455(PIN1),Cla01887(PIN2)的相对表达量显著提高,表明植株对低钾的耐受型与其地上部分通过生长素调控钾的吸收存在联系。
  3.研究了外源生长素类似物NAA、生长素运输抑制剂NPA和TIBA对ZJ、YS根系生长及钾吸收能力的影响,结果表明,正常钾条件下,NAA能够提高ZJ和YS根系及叶片钾含量,但在低钾条件下对ZJ和YS的影响存在差异,从根系构型和基因表达的结果看,YS对外源NAA更为敏感,可能与本身内部已经具有较高的生长素含量有关。抑制剂NPA、TIBA对正常和低钾下ZJ和YS生长存在抑制作用,NPA和TIBA处理同时提高了低钾下ZJ和YS的根系钾含量,降低了叶片钾含量。
  本研究结果表明,嫁接西瓜接穗能通过生长素调控砧木根系生长和钾吸收,但是详细的作用机制还需要进一步研究。
[硕士论文] 肖壮
农业电气化与自动化 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着我国经济的快速发展和人们消费水平的普遍提高,葡萄产业得到了很大的发展,葡萄已成为我国最受欢迎的水果之一。但是我国葡萄商品化处理程度低,一直制约着葡萄产业向规模化和产业化的方向转变。葡萄为穗状结构、果粒较多、果实柔软、易碰伤,故葡萄产后加工存在较大困难。目前,我国绝大多数地区仍采用人工分级方法,利用简陋的工具根据经验分级。人工分级效率低下、成本高、强度大,因此,市场迫切需要葡萄品质在线检测分级技术及装备。
  本文以葡萄的一个品种——红提为研究对象,运用机器视觉技术,建立了红提果粉附着率和红提果粒尺寸的在线分级模型,设计了一套红提在线检测与分级硬件与软件系统,具体研究内容如下:
  (1)搭建了红提图像采集试验平台。在一个试验用环形运输线上,搭建红提图像在线采集装置,设计了尺寸大小为600×450×450mm3的暗箱,暗箱顶端的切槽保证了夹持机构的持续运输,暗箱内的光电传感器感知红提串并触发相机,实现红提图像的连续采集;分析对比了多种不同光源的优缺点,选用了环形光源和前光源的照明方式;为能够同时提取红提形态轮廓和颜色特征,选用了能同时获取红提彩色图像和近红外图像的工业相机和镜头。
  (2)研究了红提果粉附着率等级的判别方法。在图像的预处理阶段,采用了归一化超绿法,去除了红提图像中的绿色果梗信息的干扰;采用交互式取点的方法,提取了果粉及果肉区域的颜色特征,分别采用朴素贝叶斯、BP神经网络和SVM支持向量机的方法建立了果粉的判别模型,通过比较发现,SVM支持向量机模型检测时间短,预测准确率高,应用于果粉的在线识别可行。通过对比人工的分级结果,红提果粉附着率的分级准确率为93%。
  (3)研究了红提果粒尺寸检测和分级方法。采用了基于形态学的开闭重构和局部极大值的方法,采集到近红外图像每粒果粒表面光斑位置,获取果粒中心位置坐标,完成果粒的粗定位。采用梯度分割算法,获取每粒果粒轮廓像素点,但一些轮廓重叠严重的像素点仍会干扰目标果粒的拟合,因此设计了一种随机最小二乘的椭圆拟合算法,提取目标果粒尺寸,并完成果粒的精确定位。经过与人工实测分级结果的验证,本研究设计的红提尺寸检测和分级准确率为91%,实现了整串红提果粒大小的自动分级。
  (4)针对红提果粉和尺寸的检测和分级模型,设计了基于机器视觉的在线控制系统和检测软件。在线控制系统主要包括了电机控制系统和图像采集控制系统,分别实现了环形运输生产线速度的实时控制和红提图片的在线采集。在线检测软件是利用VS软件中MFC控件设计的,其主要功能包括了上位机的协议设定、实时显示红提图像、监测串口通信状态和获取红提果粉和尺寸模型的分级结果等。
  (5)设计了一套红提在线检测分级流水线装备。流水线装备主要包括输送装置、图像采集装置、分级踢出装置和分拣装置。输送装置采取了环形悬挂输送链式的设计方法,保证了红提运输的稳定性,模拟了实际生产应用的场景;设计了具有棘齿自锁功能的夹持机构,方便了红提上下料过程,减少了人工工作量;设计有固定缺口形状的分级踢出装置实现了对红提自动连续的分选;设计由多个皮带滚筒组合成的分拣装置,实现了对应等级的红提分拣。
[硕士论文] 李艺潇
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:红菜薹(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.purpurea Hort.2n=2x=20),为十字花科芸薹属白菜变种之一,起源于我国长江流域,因其花茎鲜嫩多汁,颜色鲜艳,富含对人类身体有益的花青苷而深受广大消费者的喜爱。在其茎基部多发侧枝,类似禾本科作物的分蘖,为红菜薹产量的主要构成因素。因此,研究红菜薹分蘖性状的遗传规律以及克隆相关基因,对于红菜薹丰产性育种具有重要的实践意义。本课题以多分蘖的红菜薹自交不亲和系L-100为母本,以少分蘖的菜心自交系L-101为父本,构建F1、F2、BCP1、BCP2四个遗传世代,对分蘖性状进行了六世代联合遗传分析。同时,将QTL-seq(极端池简化基因组测序技术)与传统遗传连锁分析的方法相结合,利用F2分离世代对控制分蘖相关的QTL位点进行了基因定位。主要结果如下:
  1、红菜薹分蘖性状的遗传分析。通过六世代联合分析,可知红菜薹分蘖性状符合D模型,即一对加性-显性主基因+加性-显性-上位性多基因模型,分蘖性状相较于不分蘖性状为显性性状。主基因在BCP1、BCP2、F2三个分离群体中的遗传率为21.63%、1.17%、36.1%,而多基因遗传率分别为47.98%、32.2%和53.52%。各个世代的多基因遗传率显著高于主基因遗传率,该性状以多基因遗传为主。三个分离群体遗传率的平均值为64.2‰整体遗传率适中,在对分蘖选择过程中可在早世代大群体进行选择。
  2、红菜薹分蘖性状的QTL定位。在F2群体中挑选极端表型单株构建极端池进行简化基因组测序,生物信息学分析显示,在A07染色体物理距离18Mb-25Mb范围内出现了明显的SNP不平衡现象,所以推断A07染色体物理距离18Mb-24Mb范围内可能存在控制红菜薹分蘖的一个QTL位点。因此,我们进一步利用遗传连锁分析的方法验证QTL-seq分析的准确性。通过两亲本间测序的分析对比结果,共设计InDel和CAPS分子标记236对。使用两亲本及两极端池对这些标记进行筛选,并最终获得11对多态性标记。利用筛选到的11对连锁标记对185株F2单株进QTL分析,结果显示:在标记InA0740和InA0788之间存在控制分蘖的QTL位点,可解释16%的表型变异。这两个标记对应的物理位置分别为18.91Mb和21.1Mb,与QTL-seq结果吻合。将控制分蘖的位点初步定位在A07染色体物理距离为18.91M-21.1M的目标区段。
  3、红菜薹分蘖性状的候选基因预测。通过查阅文献及基因注释,在目标区域内获得6个候选基因。我们对这6个基因在两亲本的不同组织部位的相对表达量进行了分析,结果表明TCP1同源基因Bra004212在多分蘖亲本的腋芽处的相对表达量是少分蘖亲本的16.1倍,TSF同源基因Bra004117在两亲本间不同部位的相对表达量都存在差异,多分蘖亲本分别是少分蘖亲本的16.29倍、3.56倍和10.59倍。TCP1属于TCP转录因子家族主要在拟南芥的子叶叶柄、叶尖,叶脉以及分枝处表达,与叶和茎的伸长有关,TSF为调控开花的四个主要基因之一,但有研究指出其能够在短日照下影响拟南芥侧芽的伸长。结合基因注释及表达量分析可推测Bra004212及Bra004117作为该位点的候选基因。
  为进一步分析候选基因,采用TA克隆的方法获得Bra004212和Bra004117的CDS序列。使用MegAlign软件对两基因在两亲本间的差异进行分析。分析结果显示Bra004212在两亲本间存在两个单碱基突变,导致了两个氨基酸的变化,Bra004117在两亲本间仅在CDS序列存在一个SNP突变,且该突变为同义突变,并没有引起氨基酸序列的变化。
  4、F2.3单基因家系群体的构建。为了进一步克隆分蘖性状相关的目的基因,首先构建F2.3家系群体。利用连锁分子标记InA0740和InA07234筛选和鉴定来自F2分离群体的230个单株,选取标记检测均为杂合带型的单株,自交后获得F2∶3家系后代。盛花期对家系的分蘖性状进行统计调查,根据分蘖数将其划分为三个等级,筛选分离比符合3∶1的F2∶3家系分离群体,最终得到单基因家系分离群体106-216。
[硕士论文] 邹雪园
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:采用水肥一体化技术,发展节水、节肥、省工的蔬菜种植模式是节本增效、可持续发展的有效途径。本研究根据2016年田间试验结果,2017年调整施肥计划,大白菜和西兰花农户习惯施肥(CN)和滴灌、喷灌全量施肥(DH、SH)的N、P2O5、K2O为240-240-300kg/hm2,大白菜的喷灌施肥和滴灌施肥均设置两个梯度的减肥处理,分别为192-192-240kg/hm2(DL和SL)和216-216-270kg/hm2(DM和SM);西兰花的滴灌施肥和喷灌施肥也设置两个梯度的减肥处理,分别为144-144-120kg/hm2(DL和SL)和192-192-210kg/hm2(DM和SM);并设置不施肥对照CK。以比较两种蔬菜滴灌和喷灌施肥效果的差异,为大白菜和西兰花水肥一体化技术提供理论依据和应用参考。主要研究结果如下:
  (1)较习惯施肥CN,滴灌和喷灌施肥均增加了大白菜地上部生物量、包心重、包心高、包心周长。滴灌施肥DL、DM、DH分别比CN增产22.8%、42.0%和59.3%,喷灌施肥SL、SM、SH分别比CN增产35.0%、55.0%和66.3%。滴灌和喷灌施肥提高大白菜维生素C含量,SH处理增加幅度最大,增幅达38.2%;滴灌施肥的硝酸盐与习惯施肥无显著差异,喷灌处理的硝酸盐比习惯施肥略高,但都在安全标准范围之内。这说明喷灌施肥SH处理对提高大白菜产量和改善品质的效果最好。
  (2)较习惯施肥CN,滴灌施肥和喷灌施肥均显著提高大白菜氮、磷、钾肥的利用率,喷灌施肥SM和SH处理的氮、磷、钾的利用率则分别增加了184.4%和205.5%、123.7%和121.7%以及103.8%和111.4%,且二者之间差异不显著。
  (3)较习惯施肥CN,滴灌和喷灌施肥能促进西兰花花球的生长,增加花球重量,滴灌施肥DH处理增产8.6%,喷灌施肥SM和SH处理分别增产8.3%和19.6%。滴灌和喷灌施肥对西兰花维生素C影响都不大。滴灌施肥(DL、DM、DH)的花球硝酸盐含量分别降低了27.5%、24.9%和16.9%;喷灌SL处理的花球硝酸盐含量降低了20.5%,SM和SH的花球硝酸盐含量略有上升,但都在安全标准范围之内。综合产量和品质,喷灌施肥SH处理表现最好。
  (4)较习惯施肥CN,西兰花滴灌DH处理的氮、磷、钾肥料利用率分别增加了11.9%、23.0%和18.9%;喷灌SL、SM和SH处理的氮、磷、钾肥料利用率分别增加41.0%、38.2%和53.5%,30.9%、29.1%和50.7%,59.1%、56.4%和36.8%。说明西兰花喷灌SH处理的肥料利用率最高。
  (5)较习惯施肥CN,滴灌施肥(DH、DM、DL)导致种植大白菜后0~10cm和10~20cm土壤剖面的硝酸盐分别降低5.06%~37.01%和15.2%~32.6%,喷灌施肥(SH、SM、SL)相应剖面的硝酸盐则分别降低了12.0%~32.3%和23.8%~40.1%;两者均显著降低了表土的电导率以及有效磷、速效钾和碱解氮含量,但对有机质影响不大。滴灌和喷灌施肥也显著降低了种植西兰花后土壤剖面的硝酸盐含量以及表土电导率、有效磷、速效钾的含量,这与大白菜表现基本一致。
  综上所述,与农户习惯施肥相比,滴灌施肥和喷灌施肥处理均能增加大白菜和西兰花的产量、改善品质、提高肥料利用率、降低土壤剖面硝酸盐含量和表土(0-10cm and10-20cm)的电导率EC。且喷灌施肥比相同施肥量的滴灌施肥效果更好。因此,大白菜和西兰花的种植推荐采用喷灌施肥模式,全生育期均分8次施肥,依次施肥比例分别为肥料总量的5%、5%、10%、15%、20%、20%、15%、10%。
[硕士论文] 王锦杰
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)是世界上栽培范围最广的食用菌之一。香菇病毒是香菇生产上较重要的一类潜在隐患。本研究采用dsRNA和RT-PCR检测技术,首次系统分析了中国香菇野生种质及栽培种质中dsRNA病毒携带情况,并对新发现dsRNA/病毒进行了克隆和分子特征分析,在此基础上,对其中主要病毒的分子变异和群体结构进行了分析。取得的具体研究结果如下:
  (1)以215个中国香菇种质资源包括90株栽培菌株和125株野生菌株为试验材料,采用dsRNA检测技术对dsRNA/病毒携带情况进行了调查。研究结果表明,分别在57个栽培菌株和84个野生菌株中检测到dsRNA条带,检测率分别为63.33%(57/90)和67.20%(84/125)。共检测出dsRNA带型有10条,大小分别为12.0kb(dsRNA-1)、10.0kb(dsRNA-2)、2.4kb(dsRNA-3)、2.3kb(dsRNA-4)、2.1kb(dsRNA-5)、2.0kb(dsRNA-6)、1.9kb(dsRNA-7)、1.8kb(dsRNA-8)、1.6kb(dsRNA-9)、0.6kb(dsRNA-10)。进一步对这些条带进行分离与随机克隆,除dsRNA-7外,其他9条dsRNA均获得了其部分或全长基因组序列。序列分析结果表明,dsRNA-1为前人报道的L.edodes mycovirus HKB(LeV-HKB)病毒,dsRNA-2可能是LeV-HKB的一个变种或缺陷型,dsRNA-3和dsRNA-4为L.edodes partitivirus1(LePV1)病毒,dsRNA-6为一种新发现双分体病毒,dsRNA-5和dsRNA-9为一种新的双节段病毒、dsRNA-7和dsRNA-8为一种新发现双分体病毒。dsRNA-10具体属性仍然未知。这10条dsRNA条带在215个供试菌株中共组成12种带型组合(带型Ⅰ~Ⅻ),其中带型Ⅰ(仅由dsRNA-1)、带型Ⅱ(dsRNA-1、dsRNA-3和dsRNA-4)和带型Ⅺ(dsRNA-3和dsRNA-4)检测率最高,分别为26.5%(57/215)、16.3%(35/215)、17.7%(38/215),其他带型检测率均低于0.1%。以上结果表明,中国香菇种质资源中LeV-HKB和LePV1为2种主要病毒,以单独或复合感染的方式存在。进一步采用RT-PCR技术对香菇种质资源中这2种主要病毒进行了检测。结果表明,除部分携带有LeV-HKB的菌株和少数携带有LePV1的菌株dsRNA检测和RT-PCR检测结果不一致外,其他菌株用这2种方法检测的结果基本一致。相比较而言,LeV-HKB在栽培菌株中检测率高于野生菌株,而LePV1在野生菌株中检测率要高于栽培菌株。此外,栽培菌株和野生菌株中dsRNA携带情况与菌株地理来源和遗传背景没有明显相关性。
  (2)以香菇核心种质资源中鉴定携带有LePV1病毒的27个香菇菌株为材料,根据LePV1基因组序列分别设计了能够扩增该病毒dsRNA-3和dsRNA-4的全长基因组引物,对这27个LePV1分离物进行了全基因组克隆与测序。结果表明,dsRNA-3均克隆得到了其全长2380bp的序列,克隆得到的dsRNA-4由于3'端poly(A)尾腺嘌呤数目的差异导致得到的序列存在差异,分别为2225bp-2231bp。进一步对这27个LePV1分离物和1个分离于生产上表现异常的香菇菌株SX12的LePV1分离物采用序列分析软件Clustal X2.0进行了相似性比较,结果表明,这28个LePV1相似性非常高,其中dsRNA-3和dsRNA-4的核苷酸相似性分别为98.84%、98.57%,氨基酸相似性分别为99.61%、99.46%。dsRNA-3和dsRNA-4的核苷酸变异均在基因组上分布不均一,相比较而言,非翻译区较编码区更为保守;这28个分离物之间的变异主要为同义突变,非同义突变较低,RdRp和CP的非同义突变率分别为6.7%和5.3%;来源于SX12的LePV1分离物与其他27个分离物仅在RdRp上存在1个氨基酸差异。系统进化分析结果表明,这28个菌株聚为2类,其中大部分LePV1分离物与来源于SX12的分离物共24个聚为亚型Ⅰ,另外4个菌株(EFISAAS0351、YAASM3334、L12、Hunong-1)聚为亚型Ⅱ,相比较而言,亚型Ⅱ比亚型Ⅰ遗传多样性更为丰富。此外,这些分离物的分子聚类结果与地理来源不存在相关性。
  本项研究为从源头(菌种)上控制香菇病毒病害发生提供重要信息,也为追踪类似病毒病害的发生、流行监控等发面奠定重要理论基础。
[硕士论文] 位高生
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:针对当前福建省平和县琯溪蜜柚施肥过量问题,以酸柚砧木白肉琯溪蜜柚为试验材料,以前期问卷调查结果为依据设置氮磷最高施肥量:N1.60kg/(株·年),P2O51.30kg/(株·年),结合平和当地土壤养分状况和琯溪蜜柚需肥特性,以30%梯度递减氮肥用量,设高氮(N1)、中氮(N2)和低氮(N3);以35%梯度递减磷肥用量,设高磷(P1)、中磷(P2)和低磷(P3),采用双因素交互设计以及田间试验方法,研究分析了氮磷减量施肥对琯溪蜜柚果实产量、品质以及树体和土壤养分的影响,为建立试验区琯溪蜜柚化肥减量与提质增效技术,推进当地琯溪蜜柚产业绿色高效发展提供依据和技术指导。获得的主要结果如下:
  (1)2016年,各氮磷减量施肥处理均比施肥量最高的N1P1处理有不同程度的增产,增产率在27.04%-58.93%之间。2017年,与N1P1处理相比,其他氮磷减量施肥处理的产量增减不一,其中N1P2、N1P3、N3P1和N3P3处理产量有所下降,以N1P2处理下降幅度最大,达20.11%;N2P1、N2P2、N2P3和N3P2处理产量有所上升,以N2P3处理上升幅度最大,达11.55%。在不同氮磷水平下,随着氮肥施用量的降低,产量均呈现先增加后降低的趋势,而随着磷肥施用量的降低,均以低磷水平(P3)下的产量最高。
  (2)综合2016年和2017年琯溪蜜柚内外果实品质结果可知,减少氮磷肥施用,可以提高果实出汁率、可食率、可溶性固形物、固酸比和维生素C含量,并降低纵横比、单果重、果皮厚和可滴定酸含量;与氮水平相比,磷水平对琯溪蜜柚各品质指标的影响相对较小;氮磷水平及交互作用对各品质指标的影响因时间不同而有所差异。总体而言,N2P2、N2P3和N3P1处理的果实品质相对较好,其中主成分分析的综合得分以N2P3处理最高,达1.65,其果实品质也相对较好。
  (3)果肉磷、钾、镁含量和果皮磷、钙、镁含量在不同氮水平之间无显著差异,果肉氮、磷、钾、钙、镁含量以及果皮氮、磷、钾含量在不同磷水平之间无显著差异。整体来说,氮磷减量施肥对琯溪蜜柚果肉和果皮氮、磷、钾、钙和镁含量的影响较小。此外,果皮钙、镁含量高于果肉,而果肉的磷含量高于果皮,果肉和果皮的氮、钾含量基本相当。
  (4)2016年和2017年两年5、7、9、11月琯溪蜜柚叶片氮、磷、钾、钙和镁含量结果表明,各处理叶片中氮、磷、钾和镁含量均在5月份相对较高,在7月份和9月份有所下降,在11月份相对稳定或略有上升;叶片钙含量随叶龄增加而增加。根据丰产琯溪蜜柚叶片矿质养分诊断标准,2016年和2017年各月份叶片氮、磷、钾和钙的含量均值基本均处在适宜范围,而镁含量均值相对较低。
  (5)2016年-2017年各处理表层土壤有机质、碱解氮和交换性钙、镁含量均高于亚表层土壤;各处理表层和亚表层土壤速效磷含量较高,且其磷环境均处于高风险等级,面临磷素面源污染的风险较大;各处理表层和亚表层土壤速效钾含量均处于丰富范围内,甚至有超标的风险,当地果农也应重视钾肥施用过量的问题;氮磷减量施肥以及于3月上中旬撒施钙镁混合物有助于缓解因过量施肥造成的土壤酸化并可有效补充土壤交换性钙镁含量。
  (6)综合考虑,建议对土壤磷处于高风险的果园,氮肥减量30%,磷肥减量70%,即氮肥(纯N)1.12kg/(株·年),磷肥(P2O5)0.39kg/(株·年);土壤磷环境风险相对较低的果园,氮肥减量30%,磷肥减量35%,即氮肥(纯N)1.12kg/(株·年),磷肥(P2O5)0.85kg/(株·年)。
[硕士论文] 陈世伟
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:番茄(Solanum lycopersicum)是我国种植十分广泛的一类蔬菜作物,并主要采用温室种植。番茄芽期和苗期抗寒能力对于露天种植时节省资金投入、减少农业经济损失有十分重要的作用。番茄的起源中心是安第斯山脉,当前栽培番茄的祖先是樱桃番茄。番茄是一种喜温作物,经过不断的驯化,番茄在一生不同生长阶段的抗寒能力都有了提升。本研究对252份番茄重测序材料在15℃和25℃下进行发芽实验,对其发芽指数进行了统计,并利用关联分析,最终候选了一个番茄种子萌发期抗寒基因(Cold Resistance,SlCR1)。主要的实验结果如下:
  1.在萌发期抗寒基因SlCR1的编码区内,存在1个SNP位点与材料的表型差异紧密相关,这个SNP位点位于SlCR1的编码区,在抗寒材料中,该位点的碱基趋向于G,在抗寒敏感材料中,该位点的碱基趋向于A,该位点上单碱基的改变使得氨基酸发生了变化。其启动子序列在材料间没有差异。同时,极端材料表达量在15℃和25℃下没有差异,说明编码区序列的变化是造成极端材料间性状表型差异的原因。
  2.转基因功能验证表明,超量表达SlCR1转基因株系(T2代)的萌发速率指数(GRI)降低,而萌发速率指数越低,种子就可以越早地突破低温胁迫发芽,表明SlCR1可以提高番茄芽期的抗寒水平,促使种子萌发。对超量表达转基因株系幼苗进行低温处理发现,其萎蔫程度低于野生型对照WT。超量表达SlCR1能提高番茄幼苗时期耐受冷害胁迫的能力,表明了SlCR1能够正向调控番茄萌发期和苗期的抗寒性。
  3.酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)实验表明:SlCR1和一个转录因子SlPP2-B1互作,SlPP2-B1是F-box转录因子家族中的一个基因,F-box蛋白是泛素连接酶E3中的一员。SlPP2-B1可以在多个组织中表达,在绿果、花和茎表皮的表达较高。在低温胁迫下,番茄抗寒材料中LA1777中,SlPP2-B1表达量迅速显著升高。超量表达SlPP2-B1转基因系在芽期的抗寒表现与WT无差异,但其在苗期的抗寒能力低于WT。这表明,该基因负调控番茄苗期的抗寒性。
  4.将SlPP2-B1在AC中进行超量表达后,在其转基因T1代检测SlCR1的表达量,发现SlCR1的表达量降低,与之相反的是,而在SlCR1的T1代超量表达植株中,SlPP2-B1的表达量升高,说明二者可能存在反馈调节机制。
  5.SlPP2-B1与一个电压门控型阴离子通道蛋白VDAC1互作。与此同时,VDAC1与ShCIGT互作。VDAC蛋白在植物的逆境响应中有十分重要的作用。ShCIGT不与SlPP2-B1互作,也不与SlCR1互作。
[硕士论文] 张祺恺
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是世界范围内重要的园艺作物,枯萎病和根腐病等土传病害是限制西瓜产业发展的瓶颈,采用嫁接可提高西瓜对土传病害的抗性。南瓜是适合西瓜嫁接的砧木材料,但目前对砧用南瓜的资源评价和利用研究尚不够深入。本课题对南瓜资源的耐旱性和根腐病抗性进行鉴定,以期筛选出优异的种质资源,为进一步砧木选育奠定基础。针对部分南瓜作为砧木嫁接后导致西瓜果实品质下降的问题,本课题选用对嫁接西瓜果实品质影响较小和较大的南瓜砧木材料,以西瓜自交系97103为接穗,以自嫁为对照,通过对果实膨大停止期和商品成熟期的果肉样品的转录组和代谢组进行分析,来研究不同砧木对嫁接西瓜果实品质形成的影响,获得的主要结果如下:
  1.对不同南瓜种质一叶一心时期的性状进行评价。以126份南瓜种质为材料,包括33份中国南瓜(C.moschata),93份印度南瓜(C.maxima)。以2份商业砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’作为对照,进行南瓜种质资源嫁接适宜时期(一叶一心时期)的性状调查与评价,发现27份材料下胚轴长度较商业砧木等同或更短;大部分南瓜种质资源材料都具有与商业砧木同等茎粗或大于商业砧木,仅有13份材料下胚轴茎粗较细;31份材料具有比对照商业砧木更大的子叶展开角度;9份材料具有与商业砧木相似的子叶叶绿素相对含量;18份材料具有与商业砧木类似大小的子叶长宽积。
  2.对不同南瓜种质资源的耐旱性进行评价。选用94份南瓜种质为材料,包括29份中国南瓜(C.moschata),63份印度南瓜(C.maxima),以及2份商业砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’,对材料进行耐旱性鉴定。幼苗3叶1心期时进行干旱处理,计算干旱胁迫指数、株高胁迫指数、茎粗胁迫指数和干物质胁迫指数,使用UPMGA法(非加权算数平均法)对所得结果进行聚类分析,将南瓜种质资源按耐旱等级分为6类。18份材料属于最耐旱材料;14份材料为次耐旱类材料;13份材料为较耐旱类材料;7份材料为最不耐旱材料;24份材料为次不耐旱类材料;18份材料为较不耐旱材料。
  3.对不同南瓜种质资源的根腐病抗性进行评价。选用45份南瓜种质资源为材料,包括25份中国南瓜(C.moschata),18份印度南瓜(C.maxima)和2份商业砧木‘青研1号’(C.maxima×C.moschata)和‘京欣砧4号’(C.maxima×C.moschata)。使用孢子悬浮液蘸根法对南瓜种质材料进行根腐病抗性鉴定,经过对病害的分级统计及病情指数计算,筛选出R7S11-4、R7S20、R7S82等19份高抗根腐病材料和R7S21-1、R7S28-2、R7S06等26份中抗根腐病材料。
  4.研究不同南瓜砧木对嫁接西瓜果实的影响。以10份南瓜材料为砧木与97103嫁接,筛选出2份对西瓜果实品质影响具有差异的材料。发现L12为砧木嫁接后对西瓜果实品质无显著影响,L9嫁接后显著降低西瓜果实可溶性固形物含量,嫁接组合L12/97103的西瓜果实中的果糖含量和葡萄糖含量显著高于嫁接组合L9/97103的西瓜果实,而苹果酸含量显著低于后者。
  5.研究L9和L12砧木在转录水平对西瓜果实品质的影响。南瓜砧木L9在转录水平影响了嫁接西瓜果实的柠檬酸代谢、果糖与甘露糖代谢和蔗糖与淀粉代谢途径,导致西瓜果实品质变差,而L12并未在以上途径对西瓜果实产生影响,所以对西瓜果实品质无影响。
  6.研究L9和L12砧木在代谢水平对西瓜果实品质的影响。南瓜砧木L9影响了西瓜果实果糖与甘露糖代谢与柠檬酸循环,导致西瓜果实品质变差,而L12在代谢水平仅在柠檬酸代谢上对西瓜果实产生影响,所以对西瓜果实品质无显著影响。
[硕士论文] SABA HAMEED
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai]是一种重要的经济作物。果实是西瓜的产品器官,决定着西瓜的经济价值。揭示西瓜果实发育过程中调控机制可以为西瓜遗传改良提供有价值的信息。热激转录因子(Hsfs)在植物发育过程中发挥着重要的调控作用。Hsfs是否参与西瓜果实发育的调控尚不清楚。针对这一问题,本课题在对西瓜Hsf家族基因进行全基因组鉴定的基础上,进一步分析了基因结构、系统发育关系、进化历史,以及在果实发育过程中的表达谱,获得了如下结果:
  1.在西瓜基因组中鉴定出24个ClHsfs基因,编码蛋白序列长度为192到782个氨基酸,其DNA结合结构域在西瓜、黄瓜和拟南芥等物种中具有高度的保守性。在寡聚化结构域中,Hsfs存在可变的连接子和HR-A/B区域。基于DNA结合结构域和寡聚化结构域之间的接头长度和插入HR-A/B区域的氨基酸残基数目不同,将ClHsfs分为3类,即A类(54.17%),B类(37.50%)和C类(8.33%)。
  2.ClHsfs基因在11个西瓜染色体上分布不均匀。4个ClHsf位于chr5和chr1上,3个位于chr10上,2个位于chr3、chr8、chr7、chr9和chr11上,1个分别位于chr2、chr4和chr6上。在西瓜中,有58.33%的Hsfs经历过复制事件。复制模型分析显示ClHsfs包含9个片段复制基因对和3转座复制基因对。ClHsfs中小规模的片断和转座复制在这个基因家族的适度扩张中发挥了关键的作用。选择压力分析表明,所有重复的ClHsfs基因主要受纯化选择的影响。ClHsfs基因复制的时间可以追溯到179-312百万年前。推测B类Hsfs是古代群体,发展为陆地植物后扩展到A类和C类群成员。
  3.利用转录组数据分析了ClHsf基因在西瓜果皮、果肉和种子中的表达。在果皮中,ClHsf-17(A2)在授粉后10天表达量最高。在白色-粉红色及红色肉果期,ClHsf-02(B1)和ClHsf-23(C1)在果肉中具有中丰度表达。ClHsf-24(A9)在种子成熟阶段表达量高。在ClHsf启动子序列中,Skn-1基序,GCN4基序和CAT-box出现的频率相对较高。
[硕士论文] 耿树文
园艺 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:茄子(Solanum melongena L)是我国重要的果菜类蔬菜作物,凭其丰富的营养和可口的风味,高产和可观的经济效益,为大众所喜爱,栽培面积和总产量逐年增加。不同地区人们对茄子品种类型的消费习惯差异很大,而果实顶端形状作为茄子重要的商品性状近年来越来越受到消费者重视。本研究以圆顶材料283为母本,尖顶材料284为父本,进行杂交、回交和自交试验,获得六世代遗传群体为材料,通过比较不同的果顶形状测量方法选择更优良的果顶测量方法,利用主基因+多基因混合遗传模型研究遗传规律,结合果顶数据进行QTL定位分析。具体研究结果如下
  1、采用目测分级法和Tomato Analyzer软件分析法分别对果顶进行测量,目测分级法将茄子果顶划分为圆凹、圆、钝尖、尖4类,制定目测分级法中的果顶形状比样板,对茄子果顶形状进行目测分级,Tomato Analyzer软件分析法将储存的照片导入Tomato Analyzer中,设置成果顶测量选项,必要时对软件识别的果顶点进行微调,获取准确的果顶数据。最后进行试验对比,发现Tomato Analyzer软件分析法获取的果顶数据更加精确可行。
  2、茄子果顶的遗传至少受两对加性-显性-上位性主基因控制且环境条件对茄子果顶有一定的影响,可能一些涉及到环境条件响应的也会部分影响到茄子果顶的形状。在B1、B2和F2三个分离群体中,F2群体中主基因遗传率和稳定性比较高,育种过程中适合在F2群体进行果顶形状的选择。
  3、构建了包含4734个标签的高密度茄子遗传图谱,利用构建的高密度遗传图谱和Tomato Analyzer分析软件测量得到的F2单株果顶数据进行了QTL定位,在茄子5号连锁群Marker1322249和Marker2732214之间定位到了1个QTL位点fe51,定位区间是6002cM。在10号连锁群中找到了2个QTL位点,分别Marker897334和Marker894480之间的QTL位点fe101,区间范围为205cM,和位于Marker4365090和Marker2070220之间的QTL位点fe102,区间范围是305cM。
[硕士论文] 杨鑫
园林植物与观赏园艺 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)是一种被人们广泛栽培的行道树种,它有很多优点,如栽培容易、生长迅速、树形挺俊、冠大荫浓、抗病虫害等。但是,二球悬铃木在每年春末夏初之时,大量花粉随风飞洒,同时隔年的种球散开脱落,造成“飘粉飞毛”现象,严重影响人们的工作生活,很大程度上限制了推广应用。
  本研究通过分析悬铃木AGAMOUS(AG)基因第二内含子的表达特性,进而驱动细胞毒素基因培育不育转基因植株的策略,来解决悬铃木花粉和种毛污染问题。我们先通过TAIL-PCR的方法分离得到二球悬铃木AG基因第二内含子,然后用内含子驱动GUS基因和毒性基因构建融合表达载体,转化烟草与拟南芥对内含子的表达特性和功能进行分析鉴定,主要研究成果如下:
  1.AG基因第二内含子具有调控AG基因特异表达的特性,因此克隆了二球悬铃木
  AG同源基因PlacAG基因4644bp第二内含子的序列,命名为PlacAGI,利用生物信息学的方法对PlacAGI序列的调控元件做了初步的预测分析,分析结果证明PlacAGI包含了大量的组织特异调控元件。
  2.构建了fPlacAGI∷GUS,rPlacAGI∷GUS,fPlacAGI-mi35S∷GUS,rPlacAGI-mi35S∷GUS融合表达载体并转化了烟草与拟南芥,通过对转基因植株的组织进行GUS染色检测,结果发现在转GUS表达基因的烟草和拟南芥的雌蕊和雄蕊中GUS特异表达,在其它部位GUS基因未表达。这表明PlacAGI具有严格的组织特异性,能够调控连接在其下游的基因在花的第三、四轮器官特异表达。
  3.构建了不育植物表达载体fPlacAGI∷Barnase-mi35S-Barstar,rPlacAGI∷Barnase-mi35S-Barstar,fPlacAGImi35S∷Barnase-mi35S-Barstar,rPlacAGImi35S∷Barnase-mi35S-Barstar并转化烟草,得到四种载体的转基因阳性植株,通过对阳性植株的表型观察与分析,结果表明,AG基因第二内含子能够特异的调控连接在其下游的Barnase基因特异的表达于转基因烟草的雄蕊和心皮,导致这两轮花器官消融。同时,转化烟草出现强表型和弱表型之分,强表型植株花的第二、三、四轮花器官均消融,花直接早落;弱表型植株仅第三、四轮花器官消亡。同时还发现悬铃木AG基因第二内含子正向与反向插入载体对其功能的行使有影响,正向插入时转基因烟草的表型更为明显。还发现PlacAGI具有微弱的启动子功能,在其下游没有连接60bp35S核心启动子片段的情况下也能特异的启动紧连在其下游的表达基因特异表达。
[硕士论文] 李晓兰
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:城郊农业是我国现代农业的重要板块,近年来由于城郊工业化推进、化肥不合理施用等原因导致城郊蔬菜重金属污染及硝酸盐含量过高问题比较突出,这不仅大大降低蔬菜的品质和安全,同时这些污染物也会通过食物链积累危害人体健康。本文依托武汉市典型城郊蔬菜种植区,以常见蔬菜品种为研究对象,通过盆栽试验和田间试验探究减少30%无机肥施用量和配施有机肥前提下配施DMPP(3,4-二甲基吡唑磷酸盐)和甲壳素对蔬菜硝酸盐和Cd含量的影响,旨在为解决城郊蔬菜硝酸盐含量过高和Cd污染提供理论依据。主要结果如下:
  1.与推荐施肥相比,减少30%化肥施用量可显著降低蔬菜中硝酸盐含量,其中叶菜类蔬菜和果菜类蔬菜降幅分别为16.75%和25.52%,蔬菜产量分别降低14.02%和1.4%;蔬菜中可溶性糖与Vc含量随施肥量减少而降低,可溶性蛋白含量无显著变化;叶菜中N、K吸收量随施肥量减少显著降低,但果菜中N、P、K吸收量变化不显著;化肥施用量减少30%,对土壤基本理化性质无影响,但能提高N、P、K肥利用率至少3个百分点。
  2.减少30%化肥施用量时,单施及配施DMPP和甲壳素,蔬菜中硝酸盐含量显著降低了23.49%-55.36%,降低效果为DMPP+甲壳素>DMPP>甲壳素;DMPP和甲壳素单施及配施对叶菜类蔬菜产量影响不显著,但可显著提高果菜类蔬菜产量,其中DMPP处理果菜类蔬菜增产率最大为34.23%。DMPP和甲壳素单施或配施均能改善土壤性能,提高土壤有机质含量,虽有降低叶菜类蔬菜氮磷钾的吸收量的趋势但可显著增加果菜类蔬菜氮、磷、钾吸收量(除DMPP处理外);DMPP与甲壳素配施果菜类蔬菜当季N、P、K肥利用率分别提高了15.64、7.63、19.51个百分点。
  3.推荐施肥时,DMPP和甲壳素单施及配施,蔬菜硝酸盐含量降低了9.86%-49.86%,降低效果为DMPP+甲壳素>DMPP>甲壳素,蔬菜Cd含量降低了9.2%-30.22%;蔬菜增产率为果菜类蔬菜>叶菜类蔬菜,其中甲壳素在叶菜类蔬菜上应用效果最优,增产率为19.66%,DMPP+甲壳素在果菜类蔬菜中应用效果最显著,增产率为64.79%。DMPP和甲壳素单施及配施均能改善蔬菜Vc、可溶性蛋白与可溶性糖含量(除果菜中可溶性糖外);DMPP和甲壳素单施及配施均能提高土壤有机质含量,促进土壤速效养分的释放,显著提高蔬菜NPK积累量及N、P、K肥肥料利用率,其中果菜类蔬菜当季肥料利用率增幅大于叶菜类蔬菜。
  4.配施有机肥,蔬菜硝酸盐和Cd含量降幅分别为4.5%-24.1%和12.95%-22.59%,蔬菜Vc、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有增加的趋势。配施有机肥叶菜类蔬菜产量提高了5.62%,蔬菜氮、磷、钾吸收量、土壤中速效氮、磷、钾含量及有机质含量均有上升趋势,并且使用有机肥,使N、P、K肥当季利用率提高了5.65个百分点。
  5.配施有机肥时,DMPP和甲壳素单施及配施,蔬菜中硝酸盐和Cd含量分别降低了11.5%-52.6%和17.95%-41.35%,DMPP+甲壳素处理降低蔬菜硝酸盐含量显著优于单施处理,但DMPP+甲壳素在果菜类蔬菜上降镉效果最优,甲壳素处理在叶菜上的降镉效果最优;DMPP和甲壳素配施及单施,均能改善蔬菜品质,提高土壤中有机质等养分含量,提高了氮磷钾肥当季利用率,其中以DMPP和甲壳素配施处理试验效果最优,N、P、K肥当季利用率分别提高了34.64、13.77、52.83个百分点。
  综上所述,减量施肥和配施有机肥时应用DMPP和甲壳素,可同时降低蔬菜中硝酸盐和Cd积累,改善蔬菜品质,提高肥料当季利用率,促进城郊蔬菜安全生产。
[硕士论文] 刘明磊
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的园艺蔬菜作物,辣椒对不同农业气候有很强的适应性,广泛种植于世界各地。辣椒果实中维生素C、维生素A、维生素B6含量丰富,是人们膳食营养的重要组成部分。辣椒果实的形状、大小、色泽、口味丰富多样,这种多样性使其成为果实发育生物学研究的一个重要模型。辣椒与其他茄科植物相比基因组庞大(约3.3Gb)且重复序列占比高(81%)、病毒诱导的基因沉默困难、遗传转化体系不成熟,种种原因致使辣椒相关研究进展缓慢。此外,缺乏一个综合性的辣椒生物信息平台也在一定程度上阻碍了辣椒组学的研究。
  基于前人的研究成果和本研究团队新的测序数据及其分析结果,本研究构建了PepperHub辣椒组学生物信息平台,其主要研究成果如下:
  1.下载已公布的CM334辣椒和Zunla辣椒的基因组序列和基因注释文件,组装并注释pacbio三代重测序得到的“6421”株系辣椒基因组数据,利用GBrowse基因浏览器可视化各组数据,结合本地安装的BLAST工具和建立的辣椒文库共同构建Gemome模块。
  2.处理分析测序得到的根、叶、花、果实在不同发育时期的转录组数据和根、叶喷施脱落酸、赤霉素等生长调节剂或高盐、低温等逆境处理后的转录组数据。基于分析后的数据,利用Perl语言、R语言编写脚本展示基因在各个组织的不同发育时期的表达状况和基因在喷施生长调节剂后和不同非生物胁迫下的表达状况,比较基因在各个组织的不同发育时期的表达差异和基因在喷施生长调节剂后和不同非生物胁迫下的表达差异,构建某一基因与其相关基因的共表达网络。
  3.利用已发表的辣椒sRNA数据库和miRNA列表编写sRNA注释文件和miRNA注释文件,并用GBrowse可视化不同辣椒sRNA和known miRNA、novel miRNA在基因组中的分布。同时构建miRNA靶基因数据库,检索特定名称、特定序列的miRNA在辣椒基因组中的靶基因。
  4.分析处理辣椒基因组重测序数据,找出辣椒基因组的SNP和InDel位点,并用其生成注释文件。用GBrowse读取注释文件,可视化SNP和InDel位点。建立SNP、InDel数据库,查询特定区域的SNP、InDel位点。
  5.使用HTML、CSS、JavaScript、Perl等工具和语言将各个功能模块整合成一个综合性辣椒生物信息平台——PeperHub。
[硕士论文] 刘越
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是世界范围内广泛种植的重要园艺作物,在早春露地栽培以及反季节设施栽培中常常遭遇低温胁迫。研究西瓜在低温胁迫下的基因表达模式,鉴定差异表达基因的功能,有助于进一步了解西瓜低温响应及调控机制,为西瓜耐低温遗传改良提供理论支撑和基因资源。WRKY转录因子家族成员数量多且具有重要功能,不仅影响植物生长发育过程,还能够对植物面临的各种胁迫产生响应并发挥调控作用。低温胁迫下的西瓜转录组数据分析结果显示,多个WRKY家族基因的表达模式发生了显著改变,表明WRKY能够响应低温胁迫,但这些基因是否具有调控西瓜耐低温的功能,目前尚不清楚。针对这一问题,本研究在分析西瓜WRKY基因家族特征的基础上,鉴定了2个受低温胁迫诱导显著上调表达的WRKY基因Cla018059和Cla021170的功能,获得了以下研究结果:
  1.西瓜WRKY转录因子家族鉴定和特征分析。利用隐马尔可夫模型,在西瓜基因组上鉴定出57个WRKY转录因子家族成员,根据家族成员在染色体上的位置,依次命名为ClWRKY1~ClWRKY57。蛋白序列比对及系统发生分析表明,57个ClWRKY转录因子中,55个具有保守的7肽WRKYGQK DNA结合结构域,另外2个的WRKY结构域分别为WRKYGKK和KSRKRQV;所有ClWRKY转录因子的锌指结构为C2H2或C2HC类型。根据结构域的数量和锌指结构的类型,ClWRKY家族被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ族,各有11、39和7个成员。根据蛋白序列的保守性和进化关系,Ⅱ族可进一步分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe族。基因结构分析表明,ClWRKY基因序列长度在0.7kb~7kb之间,主要集中在1kb~3kb。ClWRKY家族成员的外显子含量为2~6个。共线性分析表明,ClWRKY转录因子家族基因中发生了18组复制事件,其中3组是转座复制,15组是片段复制,片段复制是ClWRKY家族基因扩增的主要模式。复制基因的Ka/Ks值均小于1,发生复制的ClWRKY家族基因在进化过程中受到纯化选择。
  2.西瓜ClWRKY转录因子家族基因的表达谱分析。西瓜果实发育转录组数据分析表明,除ClWRKY1外,其余56个ClWRKY基因在果实中均有表达,其中50个在果肉中表达,52个在果皮中表达,54个在种子中表达。低温胁迫处理的西瓜转录组数据分析表明,19个ClWRKY基因受低温胁迫诱导呈现显著差异表达,其中7个下调表达,12个上调表达。显著上调表达的基因中,Cla018059(ClWRKY55)和Cla021170(ClWRKY20)的log2FC值最大,表明其对低温胁迫更敏感。因此本课题对这2个基因进行了进一步的研究。
  3.低温相关西瓜ClWRKY基因的功能鉴定。构建了亚细胞定位表达载体pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY20和pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY55并注射到烟草表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜发现ClWRKY20和ClWRKY55均定位于细胞核。构建了ClWRKY20和ClWRKY55的T1代超表达烟草植株OE20和OE55。对转基因植株进行4℃低温处理,通过对表型、冷害指数、相对电导率及丙二醛含量等指标的分析发现,超表达ClWRKY20基因提高了烟草植株的低温耐受性,而超表达ClWRKY55基因增强了烟草植株对低温的敏感性。抗氧化酶系统活性的检测表明,低温胁迫处理后的OE20植株具有更高的SOD、POD和CAT活性,表明ClWRKY20可能是通过提高植株的抗氧化能力来提高低温耐受性。OE55植株的SOD、POD和CAT活性均低于野生型植株,表明ClWRKY55可能通过削弱抗氧化能力来降低植株的低温耐受性。
[硕士论文] 杨郭阳
观赏园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)是一种集观赏、食用和药用等功能于一身的多年生水生草本植物,具有重要的经济和文化价值。荷花产业化发展的关键在于培育具有多种优良观赏性状的新品种,目前杂交育种依然是荷花新品种选育的常用方式。效率低、周期长,观赏性状遗传机理复杂,直接找到控制这些性状的关键基因十分困难。
  为挖掘控制荷花株型相关性状的遗传因子,本研究以小株型品种‘艳阳高照’为父本,大株型品种‘建选-35’为母本,构建了135株目标性状分离良好的F1代作图群体,利用SSR、InDe1分子标记技术,构建了荷花遗传连锁图谱。将株型性状分解为立叶高、花柄高、叶长、叶宽、花径5组紧密相关的表型性状,通过对5组表型性状进行测量和统计分析,用复合区间作图法检测相关QTLs位点,主要结果如下:
  (1)利用210对多态性引物(SSR引物150对、InDe1引物60对),135株荷花F1代为作图群体,构建了包含145个标记,11个连锁群的荷花遗传连锁图谱,该图谱覆盖基因组长度625.0cM,标记间平均图距4.31cM。其中LG1遗传距离为99.1cM,标记数量最多,为91个;LG11遗传距离为33.9cM,标记数量最少,仅有2个。
  (2)共检测到14个QTLs位点,可解释表型变异系数为6.6%~12.0%。其中控制立叶高性状的QTLs位点最多为6个,控制花径的QTLs位点为4个,控制叶长的QTLs位点为2个,控制花柄高、叶宽的QTLs位点各有1个。
  总之,本研究构建的荷花遗传连锁图谱,14个荷花株型相关性状QTLs位点,将为荷花其他观赏性状的研究奠定理论和实践的双重基础,对指导荷花株型相关性状的分子标记辅助育种具有重要意义。
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