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[博士论文] MUHAMMAD MAHMOOD AHMED
CROP BIOTECHNOLOGY 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着世界人口的增长,人们对棉花的需求也越来越大,导致棉花育种工作的主要目标是保障棉花纤维产量的稳定。由于单铃籽棉重是由多重产量性状决定,因此提高棉花的产量是一个巨大的挑战。产量和纤维品质共同调控棉铃发育。解析调控棉铃大小农艺性状的遗传和生物学机制,对棉花研究者来说仍是一个巨大的挑战。为了解析其遗传机制,一个通过种间杂交获得的小棉铃突变体BS41,在调控单铃籽棉重,皮棉重,百粒重等性状表现出杂种衰败。通过多重标记的检测,在12染色体上鉴定到了一个稳定的调控位点,qSCW-c12。在后代BC2F4群体中,这个位点qSCW-c12在AD-A12_07和AD-FM_44标记之间,大小为0.89cM。
  一个主效的杂交衰败多效性位点(qSCW-c12),其在多个连续的群体中被证实调控棉铃的大小和产量性状。通过连续的精细定位,在12号染色体上将其缩小到0.89cM遗传区间,与之相对应是包含11个基因的180Kb的物理区段。同源比对也测到了一个40个碱基插入缺失位点在AD-FM_44克隆序列,在与SCW紧密连锁的GhBRH1_A12基因的上游341的位置。通过在BS41中超表达GhBRH1_A12和Li1的转录组分析显示,其在棉铃发育早期调控棉花纤维的发育。忽略其生长抑制,BS41表现出油菜素甾醇平衡在棉铃发育过程中,即BR信号受抑制,导致在BS41中GhBRH1_A12下调表达。
  本研究表明GhBRH1_A12在调控BR平衡中发挥了重要的作用,其可能通过在棉花中影响棉铃的大小调控植株的生长发育和棉铃的发育。GhBRH1_A12作为一个决定棉铃重,皮棉重和百粒重的候选基因,通过调控BR信号路径影响衣分,纤维密度和单铃种子数。总的来讲,通过精细定位和图位克隆的SCW调控位点qSCW-c12,鉴定到了GhBRH1_A12候选基因,一个BR响应的RING结构域包含E3连接酶。
  在具有完整注释信息的四种棉花基因组中我们预测了BRH1基因。BRH1基因的遗传多样性,结构和功能变异被强调,在AtBRH1多肽中发现两个结构域,一个是推测的具有信号传导作用的跨膜螺旋(TMH)结构域,一个是具有E3连接酶活性的RING锌指结构域。四种棉花基因组中完整的注释信息有利于BRH1候选基因的预测。在陆地棉、海岛棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉中分别预测到16、4、7、8个BRH1基因。利用转录组数据测定棉花基因组中BRH1基因在根,叶,茎,花瓣,花药,柱头,胚珠,10天,20天纤维和种子的组织表达模式。在第1天和第3天,野生型比Li1中观察到更高的GhBRH1_A12转录本丰度。这些发现表明GhBRH1_A12可能在棉铃发育早期通过调控纤维发育来参与调控SCW。
  细胞中的分子过程可以通过一种重复的DNA序列,既微卫星定位,由于其长度变异和基序的不完整性。这种遗传变异的机制在不同的有机体中得到了广泛的研究。然而,基因组内容复制的进化过程主要被植物所占据,关于非编码的DNA还了解的很少。本研究第一次详细在植物界的5个分类学家族的13个植物物种中,研究了在基因组合的基序的不完整模式。
  我们研究了不同种类植物的基因组范围内的基序不完整模式,并利用各种分析工具,研究了微卫星重复密度、不完整程度和长度等特征关系。此外,比较基因组学方法有助于探索在棉花进化中微卫星的保守性。根据我们的研究结果,在棉花中,长基序重复的较慢衰减导致第二高频率的5nt基序占主导。此外,2nt的重复在四倍体棉花中有一个较快的衰减速率。与可可相比较发现,“AT”重复变得越来越少在分化过程中,因为棉花这一分之在现在的棉花驯化过程中经历了全基因组复制和多倍体化的过程。
  这项研究的结果可能对探索简单的非编码遗传元素的相对进化足迹,如重复,通过对棉花基因组特异性特征的进化,提供了参考。类似地,短的基序重复出现了快速的减少,伴随棉花进化的过程2nt重复急剧减少,“AT”在四倍体棉花中减少的最为激烈。然而,如果对目前的研究结果加以考虑,对“AT”基序的衰减热点全面分析,以及四个基因组的不完整性,可以揭示其对基因调控要素的影响,是进一步了解其基础机制的必要条件。
[博士论文] 沈钰森
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜(Brassica napus L.,2n=38,AACC)是世界上重要的油料作物,为人类提供了食用油、为动物提供了蛋白饲料、也为工业发展提供了生物质能。理想株型的甘蓝型油菜品种可以提高植株对光能的利用、便于合理密植及适宜机械化收获,是我国当前油菜育种的重要目标。开展甘蓝型油菜株型相关性状的QTL定位及遗传调控机制解析,可为分子定向育种奠定基础。本研究利用甘蓝型油菜和荠菜(Capsella bursa-pastoris)杂交产生的分枝紧凑的异源渗入系为亲本之一,构建了DH群体和高密度的SNP遗传连锁图,进行了分枝角度的QTL定位及候选基因预测,发现控制株高、第一分枝高、茎秆直径与开花期的共定位QTL,主要结果如下:
  1.DH群体与高密度遗传连锁图谱的构建
  以紧凑分枝的渗入系Y689和甘蓝型油菜品种Westar为亲本、利用小孢子培养技术构建了包含208个株系的YW-DH群体,用60K SNP芯片进行基因分型,构建了一张包含3,073个SNP标记的高密度遗传连锁图谱,总长为2,242.14cM,平均标记密度为0.73cM。将SNP标记比对到甘蓝型油菜参考基因组上,发现A02和C02染色体上存在易位现象,而在A06,A08,C01和C07染色体上存在明显的染色体缺失,显示渗入系在培育过程中可能发生了较大的基因组变异。
  2.分枝角度性状的QTL定位
  2014-2016年将YW-DH群体在半冬性、冬性和春性的六个环境中种植并考察了分枝角度性状,结合群体的基因型数据,在全基因组范围内共检测到17个QTL,其中位于A03上的QTL(qBA.A03-2)能被重复检测到,解释10.21%-13.21%的表型变异;位于C03染色体上的两个相邻的QTL(qBA.C03-3和qBA.C03-4)也能被重复检测到,分别解释10.55%-21.73%和14.02%-17.21%的表型变异。与他人的结果对比表明,这三个都是新发现的主效QTL。候选基因预测生长素早期响应基因SAUR30(BnaC03g14890D)和SA UR55(BnaC03g16420D)可能参与调控油菜分枝角度大小。
  3.株高、第一分枝高、茎秆直径和开花期的主效QTL共定位
  对YW-DH群体中株高、第一分枝高、茎秆直径和开花期多年多点的表型考察发现,这四个性状相互间存在显著相关性。其中株高与第一分枝高、茎秆直径和开花期的相关系数分别为0.67、0.76和0.61;第一分枝高与茎秆直径和开花期的相关系数分别是0.53和0.68;茎秆直径与开花期的相关系数是0.54。
  对这四个性状进行QTL定位,检测到调控株高的主效QTL有5个,解释平均表型变异10.81%-22.97%;调控第一分枝高的主效QTL有5个,解释平均表型变异9.69%-21.99%;调控茎秆直径的主效QTL有5个,解释平均表型变异11.19%-16.58%;调控开花期的主效QTL有4个,解释平均表型变异11.76%-30.89%。在这19个主效的QTL中,有11个是新发现的QTL,包括调控株高的3个,调控第一分枝高的3个和调控茎秆直径的5个;并且这19个主效QTL都分布在A02和A07染色体的末端,在A02上1.4-24.6cM和A07上104.0-122.2cM处形成两个QTL簇。将这两个QTL簇内的QTL用元分析的方法进行区分和整合,分别得到3个和4个控制两个或以上性状的共定位QTL。为探究这几个性状的遗传基础(调控基因是紧密连锁或一因多效),我们进行了条件QTL分析。结果表明位于A02染色体上的QTL簇内控制四个性状的基因可能是一因多效;位于A07染色体上的QTL簇内控制四个性状的基因可能存在紧密连锁。这为主效QTL的进一步精细定位及其在分子育种中的合理利用提供了有价值的参考。
[硕士论文] 张景瑜
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:苎麻是中国重要的天然纤维作物之一。为避免与粮食作物争地,苎麻的种植区域逐渐向条件相对恶劣的山坡地转移。为保障苎麻的纤维产量和品质,进行苎麻抗逆研究十分重要,尤其是抗旱研究。苎麻抗逆相关基因的鉴定、克隆、功能解析及利用等研究,可为苎麻抗逆育种研究提供宝贵的基因资源,为苎麻抗逆分子机制研究奠定基础。转录因子是调控植物应激反应过程的重要参与者,在抗逆研究中有非常广泛的应用。脱水应答元件结合因子DREB基因是AP2/EREBP基因家族的5个亚家族之一,在植物响应多种非生物胁迫过程中发挥重要的调控作用,但其在苎麻抗逆相关基因的研究中还未见报道。本研究以苎麻优质品种“华苎5号”为试验材料,从实验室建立的转录组数据库中获取苎麻DREB基因序列,运用生物信息学分析对苎麻DREB全长基因进行鉴定,利用qRT-PCR技术研究了它们在干旱、高盐、高温、低温等胁迫处理下的苎麻叶片和根系中的表达模式。此外,还克隆了部分苎麻DREB基因并分析序列结构。主要结果如下:
  (1)从6个转录组数据库中筛选得到了20条具有全长编码序列的苎麻DREB基因,依次命名为BnDREB1-BnDREB20。参照拟南芥和桑树DREB氨基酸序列,对20条BnDREB氨基酸序列进行聚类分析,发现这些序列分别聚在DREB转录因子家族的5个亚组,其中A1亚组8条,A2亚组4条,A4亚组4条,A5亚组2条,A6亚组2条。对BnDREB蛋白序列进行保守元件预测,共检索出10个Motif元件,其中,Motif3和Motif1共同构成了BnDREB蛋白序列的保守结构域;分布在不同亚组中的其余Motif元件则发挥着各自的功能。BnDREB蛋白序列理化性质分析发现,各氨基酸序列长度在184-383之间,分子量在20659.21-42907.60Da之间,等电点在4.70-10.16之间,表明BnDREB蛋白序列理化性质差异较大;不同亚组之间无明显规律性差异。亚细胞定位预测发现,所有基因均定位在细胞核,有9条基因同时定位在细胞核和细胞质。克隆得到了7条基因,通过绘制内含子-外显子基因结构图发现,只有2条基因分别具有1个内含子,其余均只有1个外显子而无内含子。
  (2)在干旱、高盐、高温、低温等4种胁迫处理的过程中,苎麻植株的表型变化及响应速度存在差异。BnDREB基因在苎麻叶片和根系中的表达模式不同,几乎所有根系中的基因自胁迫3h至12h都始终显著下调表达,而叶片中基因的表达模式却相当复杂。此外,分析不同亚组间基因的表达规律,发现各亚组基因并不因含有特异性的蛋白序列保守元件而具有不同的表达模式,相同亚组内基因的表达模式也不完全一致,推测苎麻DREB转录因子对非生物胁迫响应过程的调控可能非常复杂。
  (3)部分基因具有比较特别的表达模式,如BnDREB5在叶片中自低温胁迫3h至12h始终显著下调表达,在根系中却始终显著上调表达,明显异于其他基因在苎麻两个部位中的表达模式;BnDREB19在4种胁迫下的苎麻叶片中均始终显著上调表达;BnDREB11在干旱、高盐、低温等3种胁迫下的苎麻叶片中均始终显著上调表达;BnDREB9、BnDREB10、BnDREB16在高盐、高温、低温等3种胁迫下的苎麻叶片中均始终显著上调表达。这些基因将作为优选基因进行后续研究,以期为苎麻品种的分子改良提供候选基因。
[硕士论文] 曾妮
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:硼是植物生长发育所必需的微量营养元素,其在植物细胞壁的构成、碳水化合物的运输和代谢、生殖器官的建成和发育等方面起到重要作用。Expansin是植物细胞壁的重要组成部分,通过调控纤维素微纤丝之间的非共价键,使细胞壁聚合物发生膨压诱导的蠕变,最终促进细胞伸展,以此缓解各种环境因子对细胞的压力。本研究利用生物信息学等方法分析了甘蓝型油菜expansin基因家族的结构特征,利用甘蓝型油菜硼高效和低效品种不同硼处理转录组数据鉴定了该基因家族的表达模式,采用营养液培养等方法研究了不同硼处理硼高效和低效品种根尖细胞形态、细胞壁组分和expansin基因表达的差异。取得的主要结果如下:
  (1)明确了甘蓝型油菜expansin基因家族的结构特征
  利用拟南芥expansin家族基因的基因组序列和十字花科基因组数据库BRAD,鉴定出109个甘蓝型油菜expansin家族成员。这些BnaEXPs基因分布在19条染色体上,基因长度680-17442bp,编码的氨基酸长度160-381aa。系统进化树表明BnaEXPs家族基因可分为EXPA、EXPB、EXLA和EXLB等4个亚家族,分别含79、21、5和4个成员。GO(Gene ontology)功能分析显示BnaEXPs家族基因参与的生物学过程主要为植物细胞壁组成和有性繁殖,且亚细胞定位均位于细胞外。
  (2)低硼胁迫甘蓝型油菜硼高、低效品种expansin基因家族的表达谱具有显著差异
  利用课题组前期获得的甘蓝型油菜硼高效品种(青油10号,QY10)和硼低效品种(Westar10,W10)不同组织部位(根、新叶和老叶)不同硼处理(25μMB和0.25μMB)转录组数据分析了BnaEXPs家族基因的表达模式,结果表明缺硼胁迫时,QY10根、新叶和老叶中分别有40、18和30个BnaEXPs基因显著上调或下调表达;W10根、新叶和老叶中分别有27、24和41个BnaEXPs基因显著上调或下调表达。QY10和W10相比,正常硼处理根、新叶和老叶中分别有26,9和17个BnaEXPs基因存在显著差异表达;低硼胁迫时,根、新叶和老叶中分别有7,4和18个expansin基因存在显著差异表达。利用DeGNServer在线工具对转录谱数据进行共表达基因网络分析,预测出16个BnaEXPs种子基因(seedgene)及其互作基因。利用硼高效QTLs的物理位置区间与甘蓝型油菜expasin家族基因的物理位置进行比较分析,检测到10个位于硼高效QTL区间内的expansin基因,其中BnaC04.EXPA6a、BnaC04.EXPA6b和BnaA03.EXPA8等3个expansin基因为seed gene。定量PCR分析结果显示BnaC04.EXPA6b在低硼胁迫QY10根中的表达量显著高于W10,可能与甘蓝型油菜的低硼耐受性相关。
  (3)初步揭示了甘蓝型油菜硼高、低效品种响应低硼胁迫的生理差异及其与expansin基因表达的关系
  低硼条件下,苗期W10的叶片和根系生长严重受阻,植株总干重、总根长、根表面积、根体积和根尖数均显著低于QY10,但硼、钙含量和钙硼比在缺硼QY10和W10的相同组织部位无显著差异。微分干涉相差(DIC)显微镜显示低硼胁迫QY10伸长区细胞长度显著大于W10。利用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)分析细胞壁组分,发现低硼胁迫QY10根细胞壁的果胶甲基酯化度降低,蛋白质含量、果胶含量和纤维素含量均增加,而W10根细胞壁中果胶含量和果胶甲基酯化度增加,蛋白质含量保持不变,纤维素含量降低,且低硼胁迫处理W10根细胞壁中果胶含量和果胶甲基酯化度均显著高于QY10。定量PCR分析结果表明长期低硼胁迫QY10根中BnaC04.EXPA4和BnaC04.EXPA6b的表达量均显著高于W10,是调控低硼耐受性高低的关键基因。甘蓝型油菜响应缺硼胁迫时,硼高效品种因根系细胞壁中纤维素含量和expansin活性比硼低效品种高,而果胶含量和果胶甲基酯化度比硼低效品种低,因此根系细胞壁的稳定性和延伸性较低效品种更好,通过根细胞的相对稳定扩展,使植株最终表现出更强的低硼耐受性。
[博士论文] AYAZ ALI KEERIO
CROP GENETICS AND BREEDING 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:世界对棉花的需求正在快速的增长,其远远大于世界人口的增长速率。因此,全球的棉花育种一直以来主要集中于在增加棉花的产量的基础上改良棉花的纤维品质。棉花的纤维品质和产量性状是复杂的数量性状。由于不同的群体类型和亲本,导致纤维和产量性状之间存在着复杂的遗传相关性。因此,同时对棉花纤维品质和产量进行遗传改良,是棉花育种工作者的一个长期目标。陆地棉是世界范围内广泛种植的栽培种,产量高,纤维品质适中,但是其遗传基础狭窄。而棉花野生种的遗传基础广泛,具有优异的农艺性状,因此可以利用棉花野生种增加陆地棉的遗传多样性。
  在本研究中,以陆地棉4105为轮回亲本,毛棉为供体亲本构建了一个包含107个家系的棉花导入系群体。本研究的目的1)在多环境中对这个导入系群体的表型进行评估;2)鉴定纤维品质和产量性状的QTL;3)发掘染色体上的QTL簇。这个导入系群体在两年三环境中被评估。总的来说,这个导入系群体是非常丰富的遗传材料,具有很大的遗传多样性。At亚组的导入片段的覆盖度高于Dt亚组。导入片段覆盖了棉花基因组的35.54%。A13染色体的覆盖度,这个遗传区域在未来的育种中可以重点关注。表型分析表明,毛棉的导入片段显著地影响的棉花的纤维品质和产量。大约有一半的家系的纤维品质和产量都得到了提高。
  本研究利用高通量测序技术总共产生265.20兆的数据,并鉴定SNP标记。预实验确保了标记的密度,一致性及有效性,并过滤低深度的SLAF标签,最终3157个高质量的SNP被鉴定。这些SNP的分布是不均匀的,在At亚组上有1816个SNPs,在Dt亚组上有1341个SNPs。
  总共鉴定了74个QTLs,其中包含30个纤维品质的QTLs,44个产量QTLs。47个QTLs在At亚组,27个QTLs在Dt亚组。总的来说,有69个标记与74个QTLs相关联,其中40个标记与产量相关,29个与纤维品质相关。分析加性效应发现,44个QTLs的加性效应为正。此外,一些QTLs簇也被鉴定,主要分布在A01,A09,A13,D02和D10染色体上。这些QTL簇至少包含2个或2个以上的不同性状的QTLs。其中,在染色体A01和A13上的QTLs簇中分别包含5个QTLs,主要涉及的性状为纤维长度,衣分,铃数,百粒重,株高和籽指。
  结果表明,SLAF测序方法在基因分型和开发标记方面是非常高效。此外,这个陆地棉与毛棉的导入系群体在解析纤维品质和产量性状方面非常有效。这些鉴定的QTLs将会对陆地棉的遗传改良起到极大的促进作用。
[硕士论文] 金诚
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物油脂不仅为人体提供能量与营养,也是重要的工业原料。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国第一大油料作物,菜籽油是我国食用油的主要来源之一。近年来,食用植物油消费总量不断提高,提高油菜种子含油量是保障我国食用植物油供需平衡的关键因素。了解油菜种子油脂合成调控机制可以为油菜高油育种提供理论支持。
  本研究从500余份油菜种质资源挑选出2个“双低”油菜材料中双11号(ZS11,高含油量)和WH5557(低含油量)并利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定了不同发育阶段种子的脂肪酸含量及组成。结果表明,ZS11与WH5557成熟种子的含油量和脂肪酸组成具有明显差异,并且在种子发育过程中ZS11油脂积累速度显著快于WH5557。
  利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(MALDI-MSI)分析了成熟种子不同组织(外子叶、内子叶与胚根)中三酰甘油(TAG)与磷脂酰胆碱(PC)的含量与组成。结果显示,不同组织之间的TAG与PC的含量与组成存在显著差异,脂质分布具有空间分布差异性。同时通过电喷雾质谱串联质谱(ESI-MS/MS)分析了种子中的TAG及PC各组成成分的mol%,此结果与MALDI-MSI的结果总体一致,表明MALDI-MSI结果是可靠的。在显微镜下分离成熟种子的外子叶、内子叶及胚根并提取脂质,利用液相色谱电喷雾质谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测了种子各组织的脂质含量及组成成分。结果表明,不同组织中脂质含量与组成具有显著差异。此结果与MALDI-MSI结果一致,进一步验证了MALDI-MSI结果的可靠性。
  收集发育34天的种子,提取种子不同组织的RNA并进行转录组测序。转录组数据表明,糖酵解、脂肪酸从头合成、TAG合成、脂滴形成等油脂代谢途径中多个关键基因的表达量均存在差异。以上结果表明,油脂合成过程中的关键基因的表达水平对不同种类脂质的空间分布起着一定的作用。而2个材料中蛋白质、可溶性糖及淀粉含量的差异则暗示了WH5557种子中的碳更倾向于积累到碳水化合物中,这可能是造成其含油量低的原因之一。
  此外,为了更高效地分析油菜脂质代谢物,实现高通量脂质组分析,我们开发并建立了基于高分辨质谱UPLC-TripleTOF的脂质组高通量分析方法。相比于传统的脂质组分析方法,此方法具有高效、快速、样品需求量少和准确度高等特点。基于此方法,我们分析了ZS11的根、茎、叶、叶柄及发育中的种子的脂质含量及组成成分。结果表明,基于UPLC-TripleTOF的脂质组分析方法重复性良好,可以对甘油酯、磷脂和糖脂等13类脂(总计146个脂质分子)进行准确地定性与定量。油菜中不同器官及不同发育阶段种子的脂质组的测定为脂质组学的研究提供了参考依据。基于UPLC-TripleTOF的脂质组学分析方法可成为高通量脂质组分析的重要手段。
[硕士论文] 谢赛
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,全球变暖引发的区域性高温是导致农作物雄性不育的重要因素之一,并且严重威胁农业生产。研究表明GhCKI在响应高温导致棉花雄性不育方面具有重要功能,因此为了进一步解析高温胁迫导致棉花雄性不育的败育机理,通过酵母双杂筛选出与GhCKI互作的GhACBP4(acyl-CoA-binding protein4)蛋白,并且从超表达GhCKI拟南芥花蕾和棉花H05(高温敏感型)花药的磷酸化蛋白质组中筛选出3种ACBP4的磷酸化肽段。因此,本研究主要解析GhACBP4在花药中的功能,主要结果如下:
  1、经过序列分析发现,在陆地棉基因组中GhACBP4存在6个同源基因。组织表达模式分析表明Gh_A13G0893/Gh_D13G1134在花药中优势表达。然而转基因材料proGh_A13G0893::GUS的组织表达模式表明,该基因在花药、胚珠和萌发后的种子中高量表达。而且,高温诱导表达模式分析表明,在花药开裂期(ADS,>24mm花蕾)GhACBP4同源基因总体的表达量受高温诱导后可能会下调表达。
  2、综合比较6个同源基因的表达水平和3种磷酸化肽段,选取Gh_A13G0893做进一步的功能研究。在超表达Gh_A13G0893和Gh_A13G0893-3'UTR-RNAi特异干涉棉花材料中,都出现了雄性不育的表型。在Gh_A13G0893-3'UTR-RNAi不育材料中GhACBP4的6个同源基因表达量均降低,可能与拟南芥acbp4acbp5突变体败育表型相一致。借助透射电镜观察超表达不育材料的花药,在绒毡层降解时期,小孢子内部缺乏淀粉和脂滴,内壁缺失,而且绒毡层中没有脂滴;在花药开裂期,花粉外壁没有含油层。
  3、相比野生型,超表达GhACBP4不育材料的花药中脂肪酸含量下降。并且野生型YZ1和H05的花药中脂肪酸的含量受高温胁迫后也发生显著变化。利用薄层层析发现,在超表达GhACBP4不育材料的花药和高温诱导H05的花药中,脂质的含量也显著变化。这些结果表明超表达GhACBP4不育的表型同高温诱导野生型败育的表型具有相似性。
  4、为了验证GhCKI和GhACBP4是否存在互作,并了解它们发生互作的位置,通过酵母双杂、双分子荧光互补实验和双分子荧光素酶互补实验发现,GhCKI和GhACBP4存在互作,同时这两个蛋白共定位于过氧化物酶体中。然而,如果将GhACBP4蛋白的501和517氨基酸位点由丝氨酸(S)突变为甘氨酸(A)后,含有501位点突变的GhACBP4就不能与GhCKI发生互作,但含有517位点突变的GhACBP4与GhCKI仍有微弱互作。
  5、在原核表达过程中发现,带有His标签的GhACBP4蛋白可能具有多种磷酸化修饰状态,进而无法在体外被GhCKI磷酸化。
  6、经过综合分析,推测GhACBP4过量表达会激活GhCKI转录,导致大量GhACBP4蛋白被GhCKI磷酸化;而GhACBP4的活性可能降低,或被降解。当GhACBP4转录水平受到抑制,其蛋白水平也降低。并且,在高温诱导条件下,这两种情况可能同时存在。因此,这可能造成过氧化物酶体中脂质转运发生异常,最终导致花粉败育。
[博士论文] BASIR UL HAQ
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一种重要的植物次生代谢物,它在调节植物根的生长、根毛发育、芽枝产生、植物共生菌的互作等生理过程中都发挥着重要作用。通过对拟南芥、豌豆、水稻和矮牵牛的芽枝突变体研究已经鉴定出多个参与独脚金内酯合成和信号传导的关键基因,然而,其在大豆中是如何合成以及信号是如何传导等却仍然并不清楚。
  鉴于独脚金内酯如此重要而它们的生物合成底物(类胡萝卜素)又是普遍存在的,因此在本研究中,我们主要对大豆基因组中控制独脚金内酯合成和信号传导相关的基因进行了鉴定。我们首先在大豆基因组中找到MORE MAXILLARY BRANCHING(MAX)的同源基因:GmMAX1s,GmMAX2s,GmMAX3s,GmMAX4;然后根据表达水平对这些基因进一步筛选,最后挑选出四个基因在根中表达量相对较高,且与根中独脚金内酯合成相关。为了进一步研究GmMAX的基因功能,我们挑选GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a作为候选基因并借助相关突变体材料进行了深入研究。在拟南芥中,通过突变体、突变体互补以及超表达株系对这四个基因进行了功能鉴定,并鉴定了它们在芽枝、株高、叶形、主根长度、毛状发根、表皮毛数目和长度等表型中的作用。我们发现在互补材料中不仅外在表型得到了恢复,而且突变体植株中被破坏的激素平衡比如所有突变体中JA和ABA的含量显著降低,生长素在atmax1,atmax3,atmax4中显著偏高等变化也恢复到正常水平。而在超表达转基因株系中,相比于野生型其激素含量及平衡又被打破。
  非生物逆境对许多作物的产量产生不利的影响,因此我们也在转基因拟南芥和大豆根毛中检测独脚金内酯合成和信号转导相关基因的功能。在独脚金内酯合成和信号转导相关基因的拟南芥突变体atmax1,atmax2,atmax3,atmax4中,发现在干旱条件下突变体的存活率比野生型有显著降低,同时发现超表达独脚金内酯合成和信号转导途径的GmMAXs基因同对照超表达GUS基因相比,可以显著提高根毛的抗旱性。表型分析发现突变体也表现出对干旱胁迫更为敏感的表型。这些结果表明独脚金内酯合成途径和信号转导途径在干旱胁迫中起着重要作用。
  GmMAXs的材料根毛形态的变化,发现转基因阳性株系的根毛显著长于对照组。转录组分析发现这些基因超表达后许多激素相关基因的表达也都发生显著变化。与之对应,GmMAX1a,GmMAX3b和GmMAX4a超表达材料根毛中ABA含量减少,JA含量增加;GmMAX1a和GmMAX4a超表达株系根毛中生长素含量增加,而GmMAX3b超表达株系的根毛中生长素含量并未检测到明显差异。GmMAX2a超表达株系与GUS对照材料相比ABA和JA含量都显著增加,IAA含量降低,而在抑制株系GmMAX3b-KD则观察到完全相反的表型。
  同时,我们也在大豆的超表达和抑制株系中检测了这些基因对结瘤的影响。超表达GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a的株系(GmMAX1a-OE,GmMAX2a-OE,GmMAX3b-OE和GmMAX4a-OE)中结瘤数目增多,而在GmMAX3b的抑制株系(GmMAX3b-KD)中结瘤数目减少。GmMAXs转基因发根中几个关键结瘤基因的表达水平也发生了改变。说明独脚金内酯相关的GmMAXs系列基因正调控结瘤。另外,我们也发现在B.japonicaUSDA110菌株处理48h后,超表达株系中的结瘤早期基因如GmNSP1a,GmNSP1β表达量显著高于GUS对照组。
  另外,亚细胞定位显示独脚金内酯合成相关的GmMAX1a-GFP,GmMAX3b-GFP,GmMAX4a-GFP融合蛋白定位在叶绿体,信号传导相关的GmMAX2a定位于细胞核。该研究不仅揭示了独脚金内酯合成和信号转导途径在大豆中的保守性,还表明独脚金内酯跟其他激素之间的互作可能在控制植物发育及大豆结瘤中发挥重要的作用。GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a参与的独脚金内酯合成和信号传导可能通过影响根毛形成及与根瘤菌互作来调控大豆的结瘤。
[博士论文] 王转茸
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:菌核病是由核盘菌引起的一种严重威胁油菜产量和品质性状的真菌性病害。核盘菌通过向寄主植物分泌细胞壁降解酶CWDEs、多聚半乳糖醛酸酶PGs和病原菌相关的分子PAMPs等与寄主植物建立侵染关系。为了抵御病原菌的侵染,植物进化出一类多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIPs来抑制PGs的活性。本研究在甘蓝型油菜7-5(低抗)、P61-5(高感)和T45(高感)材料中超表达水稻的OsPGIP2基因,通过分子鉴定和抗性鉴定筛选出了16个菌核病抗性显著提高的T1代转基因家系,之后继续对转基因家系的T2、T3和T4代进行分子鉴定、菌核病抗性鉴定、种子品质性状和千粒重的考察,最终获得了菌核病抗性显著改良且遗传稳定的转基因油菜种质资源。此外,利用RNA-seq技术分析了转基因和非转基因家系核盘菌侵染后的差异表达基因,提出转基因甘蓝型油菜中由OsPGIP2介导的抗病调控网络。主要研究结果如下:
  1.转基因家系中OsPGIP2的拷贝数鉴定和表达量分析
  对16个转基因家系进行Southern blot检测,确定7-5B、7-5C、7-5D、7-5G、7-5H、7-5J、T45B#1、T45B#2和T45C为单拷贝插入植株,7-5A、P61-5A、P61-5B#1和P61-5B#2为双拷贝插入植株,7-5M含有5个拷贝。qPCR检测发现,在不同转化事件的转基因家系中,OsPGIP2基因的表达水平存在较大差异;在同一转化事件中,OsPGIP2基因的表达量无显著性差异;在含有5个拷贝的7-5M家系中,OsPGIP2基因的表达量最低。同时,T2和T3代抗病性鉴定显示,除了7-5M家系,其它转基因家系菌核病抗性与非转基因对照相比都提到了显著提高。这些结果表明OsPGIP2基因已成功整合到甘蓝型油菜基因组中,OsPGIP2基因的低拷贝插入事件能够增加甘蓝型油菜的抗病性,而多拷贝插入事件易导致目的基因沉默。
  2.OsPGIP2转基因家系的抗病性鉴定与种子千粒重和品质性状分析
  T4代转基因家系离体叶片接菌72hpi的菌斑面积都显著小于非转基因家系;喷菌丝存活率实验显示转基因家系具有良好的苗期抗性;成株期模拟极端疾病压力实验证明转基因家系的发病率低于非转基因家系;在离体茎秆接菌和田间茎秆接菌实验中,转基因家系菌斑长度都显著小于非转基因家系。成株期接种核盘菌后,转基因家系种子中芥酸和蛋白质的含量与非转基因家系相比无显著差异,而转基因家系种子千粒重和含油量都显著高于非转基因家系。以上结论证明,转化OsPGIP2基因能够改良甘蓝型油菜7-5、T45和P61-5的苗期和成株期菌核病抗性,同时能够保证种子的千粒重和品质性状更少的受到菌核病影响。
  3.解析OsPGIP2介导的防卫反应途径
  RNA-seq结果显示,OsPGIP2介导的抗病反应主要依赖于调节与RLKs(receptor-like kinases)、细胞内钙和离子转运、过氧化物产生和H2O2清除相关基因、JA/ET及生长素、转录因子、疾病防卫反应相关基因、细胞壁重建、CYP/GSH/Histone、碳源代谢和转运等相关的植物先天免疫反应路径。DAB staining和qPCR结果显示,OsPGIP2转基因家系中H2O2的积累和氧化还原反应相关基因的表达都显著高于非转基因家系。OsPGIP2转基因家系茎秆细胞壁单糖含量的测定结果显示,油菜茎秆中阿拉伯糖、木糖、纤维素、甘露糖和木质素的含量随花期的发展逐渐增加,在终花期OsPGIP2转基因家系的纤维素、半纤维素和甘露糖的含量都显著高于非转基因家系,说明转入OsPGIP2可能影响细胞壁糖类组成相关途径来提高油菜的菌核病抗性。
  4.SsPGs和OsPGIP2互作分析
  油菜叶片提取物培养核盘菌发现,核盘菌在加入OsPGIP2转基因叶片提取物的培养基上生长显著延缓,菌丝排布紧密,而对照中核盘菌生长快,菌丝排列松散。qPCR检测接菌茎秆中的核盘菌致病基因SsPGs的表达量显示,OsPGIP2转基因家系中SsPGs的表达显著低于对照。比较OsPGIP2与核盘菌PGs之间互作的亲和性发现,OsPGIP2与SsPG3和SsPG6的亲和性高于OsPGIP2与SsPG1和SsPG5的亲和性。利用Splite luciferase(LUC)互作实验进一步证实OsPGIP2能够与SsPG3和SsPG6互作,而不与SsPG1和SsPG5互作。
  综上所述,在油菜中超表达OsPGIP2能显著增强甘蓝型油菜的苗期和成株期菌核病抗性,而不损害种子的千粒重和品质性状。OsPGIP2转基因家系的叶提取物能延迟病原菌侵染,从而增强其对核盘菌的抗性。组成型表达OsPGIP2可增加活性氧的产生,提高茎秆细胞壁纤维素、半纤维素和甘露醇的含量,并影响油菜先天免疫反应相关基因的表达。同时,OsPGIP2蛋白能与核盘菌SsPG3和SsPG6发生互作,表明OsPGIP2在转基因甘蓝型油菜防卫反应机制中起着重要作用。
[硕士论文] 赵丽
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜生产中,产量、抗倒性表现优良品种所具有的特征对后期选育新品种有重要借鉴意义。本试验于2015-2017年采取多点试验方法,选用20个品种,在长江流域(武汉、黄冈、武穴、南昌、昆明、成都、南京)生态区种植,筛选出不同类型品种,同时研究与品种相关的关键农艺性状,探索气象因子(日照时数、温度、有效积温、太阳辐射量、降雨量等)与产量、倒伏关系。
  1.高产适应性强与低产适应性弱油菜产量均受到地上生物量、单株角果数影响,限制低产适应性弱油菜产量提高的因素同时有根茎粗、分枝数,故选育高产品种时,可优先考虑增加植株单株角果数、地上生物量,在保证较大单株角果数、地上生物量基础上,增加植株分枝数、根茎粗。茎秆生化成分中,油菜低产适应性弱特性受茎秆中纤维素、木质素含量的影响,高产适应性强特性与纤维素、木质素无明显相关性,当油菜茎秆中纤维素含量较多,木质素含量较少,有助于提高低产适应性弱品种的产量。低产适应性弱品种产量易受到环境因子的影响,影响地上生物量关键气象因子为太阳辐射量、降雨量、日均温差,其中降雨量为影响地上生物量的关键指标(Y=55.5187+1.4873X1-1.6843X3-3.1133X4,R2=0.7403,其中Y、X1、X3,X4分别代表地上生物量、苗期、花期、角果期降雨量),苗期降雨量较多,花期、角果期降雨量较少,有利于地上生物量的提高;影响单株角果数的关键气象因子为太阳辐射量、日照时数、平均温度,其中日照时数为影响单株角果数的主要指标(Y=-107.4756-41.0334X1+51.4413X4+57.3412X5,R2=0.7974,其中Y、X1、X4、X5分别代表单株角果数、苗期、角果期、全生育期日照时数),苗期日照时数相对较少,角果期、全生育期日照时数相对较多,有利于增加油菜产量。
  2.高抗适应性强品种与低抗适应性弱品种影响抗倒性主要因素为抗折力,限制低抗适应性弱品种抗倒性增强的因素同时有分枝高、株高,故选育高抗品种,可优先考虑增强植株茎秆抗折力,在保证植株较大茎秆抗折力基础上,降低植株分枝高、株高。茎秆生化成分中,高抗适应性强品种与低抗适应性弱品种均受到茎秆中纤维素含量影响,低抗适应性弱品种倒伏指数同时受到茎秆中木质素含量的影响,故增强低抗适应性弱品种抗倒伏能力可首先增加植株茎秆纤维素含量,其次考虑木质素含量的增加。低抗适应性弱品种倒伏性状易受到环境因子的影响,影响分枝高关键气象因子为日均温差、太阳辐射量、日照时数,最关键影响因子为日温差(Y=192.0558-5.2729X2-7.8765X3,R2=0.8271,其中Y、X2、X3分别代表分枝高、薹期、花期日温差),薹期、花期较大日温差有利于增加植株抗倒性;低产适应性弱品种株高主要受到太阳辐射量、日照时数、降雨量的影响,最关键影响因子为降雨量(Y=130.0967+8.3776X1+15.4994X2+9.8460X5,R2=0.8616,其中Y、X1、X2、X5分别代表株高、苗期、薹期、全生育期降雨量),苗期、薹期、全生育期降雨量不宜过多。
  3.品种中影响产量最关键指标为单株角果数;影响倒伏最关键指标为抗折力,故单株角果数177.8个-209.2个可作为长江流域高产且生态适应性好的品种选择的指标,抗折力99.1N-121.8N可作为长江流域高抗且生态适应性好的品种选择的指标。抗折力、纤维素可作为协调产量、抗倒性的综合指标,油菜茎秆抗折力较大、纤维素含量较多,则产量较高,抗倒性较强,适宜的抗折力在99.1N-121.8N,纤维素含量在24.67%-30.11%。
[博士论文] 黄聪
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:陆地棉为世界纺织业提供了最多的天然纤维,是我国最重要的经济作物之一。生育期、株型、产量和纤维品质等是陆地棉重要的农艺性状,关乎到棉花的经济价值和生产方式。这些性状为复杂的数量性状,受到微效多基因的控制,通过传统的育种方法很难改良。解析这些性状的遗传基础对实现高效的陆地棉分子育种具有重要意义。
  关联分析作为近年来发展起来的一种检测QTL的高效手段,被得到广泛应用。本研究主要基于两个群体关联分析解析陆地棉生育期、株型、产量和纤维品质性状的遗传基础。
  1基于503份种质资源全基因组关联分析解析陆地棉重要农艺性状的遗传基础
  本研究广泛收集了中国国内的503份陆地棉种质资源,这些种质资源主要包括国内的5个主要棉区的栽培品种以及美国和前苏联引进的品种。利用CottonSNP63K芯片以及一张己发表的基于该芯片构建的高密度遗传图谱对503份材料进行基因分型,筛选获得了11975个高质量的多态性SNP。群体的多态性系数和遗传多样性系数均值分别为0.332和0.391。通过估算群体的连锁不平衡水平,发现LD衰减距离为6.1cM(r2=0.1)。经过STRUCTURE模拟、PCA分析和绘制N-J进化树,将503种质资源划分成了3个明显的亚群。考察获取了503份种质材料8个环境共16个重要农艺性状的表型值。利用11975个SNP标记和BLUP后的表型值,选择能够很好地控制假阳性的混合线性模型MLM(Q+K)进行全基因组关联分析。16性状共检测到324个显著关联的SNPs,解释率范围为3.17%-9.04%。参考LD衰减距离将324个显著关联到的SNPs划分为160个QTLs,其中有7个QTLs在最近的研究中被报道。有28个QTL区间和11个处于连锁的QTLs与多个性状关联,表现出位点或基因的多效性,通过绘制QTL网络图展示了性状与QTL之间的网络联系。此外,参考基因组织表达信息和已报道基因的功能,分别筛选出了336和18个可能的候选基因。在一个LD衰减较快的位点上,鉴定到了一个可能跟LP相关的候选基因(Gh_D08G2376)。
  2基于8亲本MAGIC群体的关联分析解析陆地棉重要性状的遗传基础
  构建了一个8亲本的陆地棉MAGIC群体,群体大小为960个株系(MLs)。MAGIC群体及亲本在2013-2015年共进行了5个环境的表型实验,考察了14个重要农艺性状。性状的的遗传力在PMs和MLs中的变化范围分别为0.11-0.87和0.17-0.85。比较表型的变异范围,发现单环境和BLUP的表型值中,MLs的变异范围都高于PMs,说明MLs比PMs的表型变异更丰富。
  在研究前期,利用PMs从本实验室发表的高密度的陆地棉-海岛棉遗传图谱上筛选获得284个高质量且多态性好的SSR标记。基于284个SSR标记对MLs进行基因分型。SSR标记遗传多样性系数在PMs和MLs中的平均表现为0.415和0.463,MLs的遗传变异比亲本丰富。此外,通过PCA分析发现MAGIC群体没有明显的群体结构。估算MAGIC群体的LD水平,衰减距离为0.76cM(r2=0.1)。利用忽略群体结构干扰的混合线性模型MLM(K)将14个性状BLUP的值与SSR标记关联,在p<0.01水平上检测到139个显著关联的SSR标记。显著位点的解释率范围为0.71%-7.23%。139个位点覆盖了96个SSR标记,有40个标记在前人的研究中被报道,6个被报道的结果与本研究结果一致。另外有26个SSR标记同时关联到多个性状,表现出位点多效性。此外,我们发现了9个热点位点,这对后续的遗传研究和指导育种具有非常重要的价值。
  为了深度对MAGIC群体进行基因分型,基于表型和219对SSR标记挑选出了一个较小的MAGIC群体(SMLs),群体包含372株系。在2016年增加了一个地点的SMLs的表型试验。利用SLAF-seq技术对PMs和SMLs进行基因分型获得60495个SNPs。估算SMLs的连锁不平衡水平,当r2衰减到0.1时,LD衰减距离为600kb。利用SNP基因分型数据和SMLs的表型数据进行全基因组关联分析。14个性状6个单环境和BLUP的表型数据共检测到975个显著关联的SNP,覆盖400个QTLs,对表型变异的解释率范围为5.08%-53.80%,平均值为11.01%。其中有30个QTLs在多个环境中被检测到,另外有88个QTL区表现出位点多效性。参考组织表达模式数据库,在144QTL区间内筛选到了271个相关组织特异表达的基因,此外鉴定到18个功能已知的基因位于相关性状的QTL区间内,这些基因可以作为候选基因。
[硕士论文] 刘红玲
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是世界上极其重要的油料作物和纤维作物。在整个生长周期中,棉花会遭受各种各样昆虫的为害,严重影响棉花的品质和产量。在棉花和昆虫长期的博弈中,棉花形成了复杂的防御体系来应对昆虫的袭击。昆虫取食植物时,植物会产生伤口(Wounds),同时植物也可以感知昆虫口腔分泌物(OS),进而产生防御响应。本研究中,对棉花进行机械损伤后,在机械伤口处滴加昆虫口腔分泌物(W+OS)和水(W+W),比较在OS是否存在的情况下,植物转录水平上的差异,来探究OS在植物响应昆虫中的作用。从转录组获得的差异表达基因中选取9个,利用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除,且对其中的LOX基因进行基因家族进化分析,本研究主要结果如下:
  1.对发生机械损伤和昆虫口腔分泌物处理的棉花进行比较转录组分析
  对转录组测序得到的reads进行过滤、拼接、组装和样品间基因差异表达分析。在这两种口腔分泌物处理的样品中,下调表达的基因数量均多于上调表达的基因数量。GO(Gene Ontology)富集分析中,差异表达基因主要富集于“酶的催化活性”、“转运蛋白”、“转录调节因子”和“对刺激的响应”等类别。W+OS和W+W处理的样品中,茉莉酸(JA)和茉莉酸-异亮氨酸(JA-Ile)的含量随着时间的推移均升高,但是W+OS处理的植物中,JA和JA-Ile含量比W+W高1倍多。两种口腔分泌物处理的共同差异基因主要富集在“倍半萜和三萜生物合成”、“苯丙烷代谢”和“类黄酮生物合成”等抗虫代谢路径。这些结果意味着,由于鳞翅目昆虫口腔分泌物的存在,棉花调整体内基因的表达,以应对昆虫的继续危害,并且印证了口腔分泌物在棉花-昆虫互作中起着重要的作用。
  2.基因的遗传转化和LOX基因家族的全基因组鉴定和进化分析
  由棉花与鳞翅目昆虫互作的转录组数据,筛选到LOX(脂氧合酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)、Gols(肌醇半乳糖苷合成酶)和MIPS(肌醇-1-磷酸合酶)等9个差异表达基因,利用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除。通过全基因组分析,在四个已测序的棉种雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉中分别鉴定了18、13、23和28个LOX基因。系统进化分析将LOX基因家族基因分为三个亚组,9-LOX,Ⅰ类13-LOX和Ⅱ类13-LOX。在同一个亚组内,LOX基因结构相似。陆地棉中的23个LOX基因,随机的分布在14条染色体上。这些生物信息分析结果为今后棉花LOX基因的功能研究奠定了基础。
[博士论文] 孙程明
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜是世界三大油料作物之一,是我国食用植物油的重要来源。人口的不断增长对食用油的产量增加提出了更高的要求。株高和分枝角度是油菜重要的株型性状,适度紧凑的分枝角度能提高油菜的种植密度,合适的株高能增强植株的抗倒性。因此,解析两个性状的遗传机制,挖掘优良的等位基因对株型育种具有重要价值。本研究中我们利用Illumina60K SNP芯片对520份甘蓝型油菜材料进行基因分型,在重庆、长沙、南京和武汉多点调查群体的分枝角度和株高。最终利用3种关联模型对2个性状进行了全基因组关联分析,主要研究结果如下:
  (1)经过Genome Studio软件的质控,剔除分型不明确的或多拷贝的SNP,最终得到19,167个高质量SNP标记。利用Structure软件和筛选出的SNP标记计算群体结构,将关联群体分为2个亚群。群体平均亲缘关系值为0.061,表明群体株系间的亲缘关系较弱。
  (2)当r2=0.1时,A,C亚基因组及全基因组的LD衰减距离分别是1,046、7,882kb和6,660kb。通过Haploview软件共检测到2,315个单倍型域(Haplotype Block),总长177.4Mb,占油菜已组装基因组的20.9%。A亚基因组的单倍型域总长只占全基因组单倍型总长的24.8%,显著少于C亚基因组的75.2%。9个单倍型域长度超过3Mb,除了一个在A06,其余分布在C亚基因组的5条染色体上。这6个超长单倍型域横跨或靠近着丝粒,与染色体的反转录转座子富集,基因密度低的区域重叠。
  (3)520份甘蓝型油菜株系在4个环境中的分枝角度变异范围广,单个环境极端自交系间差异最高达43.3°,广义遗传力是78.5%。利用GLM、MLM和A-D test三种模型,最终检测到56个显著位点,联合解释51.1%的表型变异。在53个关联区域预测到77个候选基因,包含SGR2、SGR4、SGR8、SGR9、LAZY1、TIR1、AFB5、TAR2和ARF10等拟南芥已报道基因的同源基因。
  (4)520份甘蓝型油菜株系在6个环境的株高表型变异范围广,从48.33cm到228.39cm,广义遗传力高达85.2%。利用GLM、MLM和A-D test三种模型,共检测到68个显著位点,联合解释42.3%的表型变异。在65个关联位点附近预测到95个候选基因,包含油菜已报道基因BnRGA和GA2ox8以及拟南芥GA20ox1、GA20ox2、GA2ox3、GA2ox4、GAMT1、DET、DWF、BRI、BAK1、CYP90C1、CYP90D1、UGT73C5、AB CB1和PAO5等已报道基因的同源基因。
  (5)利用QTL侧翼标记的引物序列,将已发表的7个连锁群体和2个关联群体的株高QTL锚定至油菜参考基因组。本研究的70.5%关联位点与已报道的QTL重叠,29.4%位点在至少2个定位群体中得到验证。78.3%GLM和71.4%A-D test的关联位点与已报道的QTL重叠。
  (6)以高杆组作为参照群,在矮杆组中进行XP-CLR分析,预测到107个受选择区域,长度从10kb到250kb,总长5.1Mb,占油菜已组装基因组的0.8%。本研究中的24关联位点与受选择区域重叠。
[硕士论文] 张倩雯
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:磷是植物生长发育必需的大量营养元素。在种子发育阶段,植酸(肌醇六磷酸)是种子中磷的主要贮存形式,对植物感知体内磷水平和维持无机磷的稳态起到关键作用。但是,植酸容易与金属阳离子螯合,形成植酸盐。由于人和单胃动物的消化道不含植酸酶,无法分解植酸盐,从而降低金属元素的可利用性,引起微量元素缺乏症。同时,植酸盐随粪便排出体外,造成磷资源的浪费,流入江海湖泊甚至导致水体富营养化。油菜是我国主要的油料作物,其主产区土壤有效磷较低。此外,菜籽饼(粕)常用来作为饲料。因此研究甘蓝型油菜种子植酸积累的遗传特性,对油菜磷高效研究和低植酸育种具有重要意义。课题组前期利用甘蓝型油菜60K Illumina SNP芯片对甘蓝型油菜关联分析群体进行基因分型分析,最终获得19397个高质量SNP标记。本研究利用铁沉淀法测定油菜关联分析群体390个品种种子植酸浓度和含量,结合SNP标记对甘蓝型油菜种子植酸浓度和含量进行全基因组关联分析。同时测定不同磷水平下,甘蓝型油菜BnaTNDH群体182个株系以及亲本Tapidor和宁油7号种子植酸浓度和含量,基于BnaTNDH群体2041高密度遗传连锁图谱定位了油菜种子植酸相关的QTL。结合前期油菜苗期营养液培养和纸培根形态性状,分析种子植酸浓度、植酸含量与苗期根形态性状的相关性。主要结果如下:
  1.油菜关联分析群体种子中植酸浓度与含量呈正态分布,具有较大的遗传变异。利用TASSEL5.0软件,构建GLM和MLM模型进行植酸含量相关性状的全基因组关联分析,共检测到35个与种子植酸浓度、植酸含量关联的显著SNP位点,解释表型变异范围为5.33%-7.29%,分别分布在甘蓝型油菜A2、A3、A4、A5、A6、A9、A10、C1、C2、C3、C4、C7和C8染色体。这些SNP位点表型贡献率较低,表明油菜种子植酸浓度和含量可能是由微效多基因控制。在A09染色体上,重复检测到一个与种子植酸含量显著关联的SNP(Bn-Scaffold000321-p23083),对SNP标记LD区间内的基因进行分析,预测了4个候选基因,它们分别参与了磷的吸收转运,种子中植酸的合成运输。该SNP位点附近紧密连锁的5个SNP形成8种不同的单倍型,其中单倍型C(AANAA)是植酸含量较低的单倍型,单倍型E(AAYNA)是植酸含量较高的单倍型。
  2.本研究测定了低磷(LP,9P2O5kg/ha)和正常磷(HP,90P2O5kg/ha)处理BnaTNDH群体182个株系种子植酸浓度和植酸含量,结合BnaTNDH群体2041高密度遗传连锁图谱,共检测到6个油菜种子植酸相关的QTL,分别分布在A3、A9和C6连锁群。以欧洲冬油菜品种Darmor-bzh的基因组为参考基因组,对QTL区间的基因进行GO富集分析,结合拟南芥注释,预测了5个候选基因,这些基因的功能主要与植酸合成、硫酸盐转运和磷饥饿响应有关。
  3.甘蓝型油菜BnaTNDH群体种子植酸浓度与纸培无磷处理的地上部鲜重和地上部干重呈负相关。甘蓝型油菜关联分析群体种子植酸含量与纸培无磷处理地上部干重、根干重、主根长和总根长呈正相关。由于相关性系数较低,只具有统计学意义,不具有生物学意义。种子植酸浓度、植酸含量与苗期根形态性状的相关性需要进一步通过生理试验验证。
[博士论文] 李洪戈
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜是世界上最重要的油料作物之一,中国油菜种植面积和菜籽产量均居世界前列。油菜株型对其产量具有重要影响,分枝角度是决定油菜株型的主要性状之一。此外,分枝角度还影响油菜的种植密度和机械化收获。茎秆倒伏是油菜的两种倒伏类型之一,其不仅与油菜株型密切相关,而且还会造成油菜产量损失和菜籽品质降低。鉴于分枝角度和茎秆倒伏性状对于油菜生产的重要影响,了解其分子作用机制和挖掘优良候选基因对于油菜的遗传改良显得尤为重要。本研究首先利用两个甘蓝型油菜分离群体对分枝角度和茎秆抗折力性状进行遗传分析研究,随后利用472份甘蓝型油菜构建的关联作图群体对分枝角度和茎秆倒伏相关性状(茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数)进行全基因组关联分析,最后对在分枝角度和茎秆抗折力性状上存在显著差异的甘蓝型油菜进行转录组测序分析。主要研究结果如下:
  1.分枝角度性状的遗传分析
  利用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析方法,对甘蓝型油菜2个分离群体F2和F2∶3的分枝角度性状分别进行遗传分析,结果显示F2代分枝角度性状的最适模型是1MG-AD模型,而F2∶3代是1MG-A模型,即分枝角度受到一对主基因控制,主基因间具有加性-显性效应或只具有加性效应。
  2.分枝角度的全基因组关联分析
  利用芸薹属60K SNP芯片对关联作图群体进行群体结构分析,结果显示472份甘蓝型油菜能够分配到3个亚群,分别包含64份、199份和209份材料。单倍型块分析表明,甘蓝型油菜基因组上存在2423个单倍型块,总长度为181.53Mb,覆盖28.28%的染色体区域。此外,大的单倍型块(≥1Mb)往往位于C基因组并且在着丝粒附近富集。油菜植株随着分枝部位的逐渐升高,分枝角度也逐渐增大,植株中部3个分枝的角度值最能够代表全株分枝的角度。分枝角度在作图群体中存在广泛的表型变异。利用MLM和MRMLM两种模型分别鉴定到46和38个与分枝角度显著关联的QTL,对表型变异的累计解释率分别为62.2%和66.2%。在这些QTL中,分别鉴定到73和64个候选基因,包括在油菜中第一次鉴定桷Bna.TAC1(BnaC04g00780D)、Bna.SGR1(BnaC08g25070D)、Bna.SGR3(BnaA06g35880D和BnaC09g19750D)和Bna.SGR5(BnaA06g34390D)。
  3.分枝角度差异材料的转录组分析
  对2个分枝角度存在显著差异的油菜材料进行转录组测序分析,在两个材料分枝的背地侧和近地侧之间共同上调的基因中鉴定到49个与生长素反应相关的差异表达基因,其中包括Bna.YUCCA6(BnaC09g03930D)和Bna.IAA19(BnaC03g39170D);在共同下调的基因中鉴定到32个与生长素反应相关的差异表达基因,包括Bna.AXR3(BnaCnng41350D)和Bna.SGR5(BnaC07g48900D)。另外,5个TCP1基因(BnaA02g13010D、BnaA07g26270D、BnaA07g25110D、BnaC06g26860D、BnaC06g28330D)在2个材料的背地侧组织中共同上调表达,2个YABB Y2基因(BnaA06g04870D和BnaC08g13560D)共同下调表达,并且这些共同表达基因在分枝的背地侧和近地侧的差异表达倍数存在差异。联合GWAS和RNA-seq分析,共同鉴定到22个基因,包括1个Bna.TAC1(BnaA05g01220D)和2个Bna.LAZY1(BnaA10g19550D和BnaC03g06250D)。
  4.茎秆抗折力的遗传分析
  甘蓝型油菜两个分离群体6个世代(P1、P2、F1、B1∶2、B2∶2和F2∶3)茎秆抗折力的联合遗传分析显示,该性状的最适模型为MX2-ADI-ADI,即两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型;该性状受两对主基因和微效多基因共同控制,以主基因遗传为主,两个群体的平均主基因遗传率分别为19.46%和69.93%。两对主基因的加性效应和显性效应在一个群体中作用方向相反,而在另一个群体中作用方向相同,同时还存在多种上位性效应。两个群体中环境变异占到表型变异的54.68%和13.23%,说明环境对茎秆强度的影响较大。
  5.茎秆倒伏性状的全基因组关联分析
  茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数4个茎秆倒伏相关性状在作图群体中存在广泛的表型变异。四个性状间存在显著相关。关联分析分别检测到与茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数显著关联的26、18、17和13个QTL,并在这些位点中鉴定到29、19、18和25个候选基因,包括茎秆抗折力的候选基因Bna.ESK1(BnaC08g26920D)和Bna.CESA6(BnaA09g06990D)、茎秆直径的候选基因Bna.EXPA16(BnaC08g26400D)和Bna.BRX(BnaA08g07050D)、茎秆强度的候选基因Bna.FRA2(BnaC02g23170D)和Bna.ARF2(BnaA05g14370D)以及倒伏系数的候选基因Bna.CEL5(BnaA07g10240D)和Bna.IRX14-L(BnaA07g12000D)。
  6.茎秆抗折力差异材料的转录组分析
  在花期和角果前期对高、低茎秆抗折力材料进行RNA-Seq分析,发现在花期上调表达的基因有1679个、下调表达的有2586个,在角果期上调表达的基因706个、下调表达的414个。在2个发育时期发现一个共同上调表达的基因Bna.TBL1(BnaC01g23560D)和一个共同下调表达的基因Bna.ARF2(BnaA05g14370D)。鉴定到7个差异表达的转录因子,包括MYB类的MYB26、MYB43、MYB61和MYB85,WRKY类的WRKY47以及KNAT7。权重基因共表达网络分析(WGCNA)和GO富集分析发现,‘绿色’模块内的基因或主要在花期参与茎秆强度的调控并且主要通过参与纤维素的合成与代谢途径来完成。联合RNA-Seq、GWAS和WGCNA鉴定到Bna.ARF2(BnaA05g14370D)、Bna.CESA6(BnaA09g06990D)和Bna.FRA8(BnaC04g39510D)3个重要的候选基因。
[硕士论文] 石笑蕊
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜是世界上最重要的油料作物之一。油酸作为一种单不饱和脂肪酸,是油菜脂肪酸的重要组成部分。高油酸菜籽油因具有较高的食用品质、营养价值、存储和加工品质,在食用、工业和药用领域都具有极其重要的作用,成为品质育种的重要目标之一。本研究以高油酸的甘蓝型油菜J-3111为供体亲本,采用传统回交育种结合分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection,MAS)的策略,期望选育出具有受体亲本621R、L-135R(恢复系)和616A、195-14A(不育系)遗传背景的高油酸恢复系和不育系。主要结果如下:
  1.分别构建621R×J-3111、L-135R×J-3111、616A×J-3111、195-14A×J-3111四个组合的BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC3F2、BC3F3、BC4F1、BC4F2世代群体。通过前景标记和背景标记的选择,分别获得616A和195-14A BC3F3世代的高油酸可育双纯合基因型(RfpRfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)(恢复系)单株22株和19株,高油酸不育双纯合基因型(rfprfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)(不育系)单株30株和19株;分别获得616A和195-14A BC4F2世代基因型为RfpRfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a(恢复系)的单株7株和24株,基因型为rfprfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a(不育系)的单株l株和18株;分别获得621R和L-135R BC4F2世代的纯合高油酸基因型(RfpRfpBnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)(恢复系)单株1株和16株。结合田间表型挑选10株(616A的2株可育株和2株不育株、195-14A的2株可育株和2株不育株和L-135R的2株可育株)背景最接近相应轮回亲本的纯合高油酸基因型的单株进行重测序分析。重测序结果表明,10个单株基因组绝大部分区域与相应的轮回亲本无差异,背景回复率达97.93%-99.45%,且油酸位点位于序列差异区段内。
  2.利用气相色谱法测定39株中选单株自交种子和亲本种子的油酸含量。高油酸亲本材料(油酸基因型BnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)的油酸含量为76.14%,受体亲本(基因型BnaA.FAD2.ABnaA.FAD2.A)的油酸含量在61.11%-65.32%之间,7份高油酸杂合(基因型BnaA.FAD2.ABnaA.fad2.a)中选单株自交种子的油酸含量在67.37%-70.57%之间,32份高油酸纯合(基因型BnaA.fad2.aBnaA.fad2.a)中选单株自交种子的油酸含量在68.15%-75.18%之间。中选单株的油酸含量显著的高于受体亲本。
  3.考察10个与受体亲本遗传背景最接近的中选单株的角果长度(silique length,SL)、每角果粒数(number of seeds per silique,NSS)和干粒重(thousand seed weight,TSW)等产量性状,结果显示其主要产量性状都分别与受体亲本(616A、195-14A、L-135R)无显著差异。
[硕士论文] 韩少卿
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)基因家族编码一类小的分泌肽,广泛参与植物细胞间的信号转导、细胞增殖分化、自我调节以及响应外界刺激。目前,已在拟南芥、水稻、大豆、番茄和杨树等植物中鉴定了大量的CLE基因家族成员,而在油菜中还没有进行过系统地分析。在本研究中,我们对甘蓝型油菜的CLE基因家族成员进行了系统地鉴定和生物信息学分析,利用体外多肽处理的方法对一些油菜特异的CLE基因功能进行验证,并对BnCLE基因的组织表达特异性进行了分析。主要结果如下:
  1.在甘蓝型油菜全基因组中共鉴定出116个CLE基因家族成员,其中包括5个含有多个CLE基序、7个未注释的新基因。并对它们进行了信号肽、等电点、分子量大小和基因结构等特征的分析。
  2.染色体定位分析发现,A和C亚基因组各包含53和61个BnCLE基因。整体上,BnCLE基因总是成对的出现在两个亚基因组的同源区域。BnCLE基因家族的扩张方式以大片段复制为主(68%,79/116),其次为全基因组随机转录事件(27%,31/116),串联重复的形式很少(5%,6/116)。
  3.通过多序列比对和进化树构建,并参照拟南芥中AtCLE基因的功能将BnCLE基因分为三大类:A类主要作用于侧根的生长发育,B类主要维持根和茎顶端分生组织的干细胞动态平衡,C类主要对维管束的发育发挥作用。
  4.对5个含有多个CLE基序基因进行分析,发现它们各含有2-5个CLE基序,都主要在子房和角果中的表达量较高,暗示它们可能参与了种子的生长发育。
  5.共发现45个BnCLE基因具有29种新的CLE基序。通过体外多肽处理实验对其中的27种CLE多肽进行了功能验证,发现大部分多肽中的氨基酸变异并未导致其功能的显著分化,而少数CLE基序的变化会导致其功能的改变。
  6.对48个基因进行了组织表达特异性分析,发现大部分BnCLE基因存在一定的组织表达特异性,同时一些BnCLE基因的不同拷贝间出现表达分化。
  以上研究结果为油菜中深入开展CLE基因功能、鉴定油菜特异的CLE基因奠定了理论基础。
[硕士论文] 周灿
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:何首乌(Polygonum multiflorum(Thunb.))野生资源近年来日益减少,而其人工栽培尚缺乏科学的指导。本试验选址于湖北省十堰市丁家营镇,采用“3414”不完全施肥方案,测定了不同时期不同施肥处理下何首乌的部分生长指标、生理指标、活性成分含量和单株产量,研究了何首乌不同部位药用成分动态积累的规律和化学指纹图谱,旨在摸索出配方施肥对何首乌生长发育及品质形成的影响,为实现何首乌优质、高产栽培提供理论依据。主要研究结果如下:
  1.何首乌主茎在每年9月之前生长较快,之后进入块根膨大期,地上部分生长变缓而地下干物质积累迅速增加。与N0P0K0(试验对照)相比,施肥处理显著增加何首乌主茎茎粗和地下干物质积累量,其中N3P2K2处理对何首乌主茎生长的促进作用最为显著,而N2P2K2处理对何首乌地下干物质积累的促进作用最为显著,说明合理的氮、钾配比施肥可促进何首乌生长、提高产量。
  2.与N0P0K0处理相比,施肥处理可提高何首乌总氮、总钾、总磷以及可溶性总糖含量,各指标均在N2或N3配合K2或K3水平下达到最大值,说明中、高水平的氮肥和钾肥处理有利于何首乌植株的养分累积。
  3.二苯乙烯苷在何首乌不同部位中含量高低顺序为:未膨大根>块根>茎>叶,其中根部二苯乙烯苷的含量在第1年和第2年期间持续增加,进入第3年后含量变化幅度较小;茎中的二苯乙烯苷含量在每年9月之前迅速增加,而进入块根膨大期后呈现下降趋势;叶中的含量极低。
  各施肥处理均显著提高何首乌各部位的二苯乙烯苷含量,在N1P2K2处理下达到最大值,说明低氮和中钾的施肥处理最有利于何首乌植株累积二苯乙烯苷。
  蒽醌类物质在何首乌不同部位中含量高低顺序为:未膨大根>块根>茎>叶。何首乌根部结合大黄素、结合蒽醌和总蒽醌的含量在第1年和第2年期间持续增加,进入第3年后含量显著下降;相比之下结合大黄素甲醚和游离蒽醌的含量在3年期间的变化较小。茎中结合大黄素、结合蒽醌和总蒽醌含量在每年9月之前迅速增加而进入块根膨大期后有一定程度的下降;叶中的含量极低。
  各施肥处理均显著提高何首乌中蒽醌类物质的含量,其中大黄素和大黄素甲醚分别在N3和K3水平达到最大值,说明高水平的氮和钾分别最有利于何首乌植株中大黄素和大黄素甲醚的累积。
  4.生长2年的何首乌单株产量(根干重)在N2P2K2处理下达到最大值302.53g,较N0P0K0处理增加了142.90%,说明中氮和中钾的施肥处理最有利何首乌产量的增加。第3年内何首乌单株产量增加幅度明显不如第2年,且活性成分的含量无增反减,因此,十堰地区何首乌人工栽培的最佳采收期为移栽后第2年冬季。
  5.化学指纹图谱的实验结果证明了不同施肥处理下何首乌块根中的成分组成一致,但含量存在一定差异,总体相似性很高;未膨大根亦然。何首乌块根和未膨大根指纹图谱的比较结果表明,块根和未膨大根中成分组成基本相同,且未膨大根中的各组分含量更高。
  本研究结果表明,综合考虑何首乌产量与质量,十堰地区人工栽培何首乌最适施肥量为每年每公顷施纯氮153.85kg、有效磷112.5kg、有效钾95.36kg,最佳采收期为扦插苗移栽后第2年冬季。此外,试验中发现何首乌未膨大根与其主要药用部位块根中物质成分基本相同且含量更高,具有深度开发的价值。
[硕士论文] 张军
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是主要的纤维作物,也是重要的油料作物。在不占据额外的耕地面积和不降低纤维品质的前提下,通过基因工程技术提高种子含油量、降低棉酚含量,从而改善棉籽油品质增加我国植物油的供应。二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油合成最后一步反应酶,它的表达水平与油脂含量密切相关,前人的多项研究证明异源表达DGAT能显著的提高植物种子的含油量。本研究克隆了芝麻、蓖麻、油葵和花生4种油料作物的DGAT1基因,利用酿酒酵母表达体系验证功能后,转化至棉花以创造高油种质。另外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除棉花色素腺体形成基因GoPGF,创造无腺体的新种质,为解析腺体形成调控机理以及腺体与棉酚的关系提供了重要的研究材料。主要结果如下:
  (1)生物信息学分析表明克隆4种油料作物SiDGAT1、RcDGAT1、HaDGAT1、AhDGAT1基因均具有DGAT1特征,且酵母表达体系表明四种作物来源的DGAT1均有DGAT酶活性;
  (2)在棉花中过表达SiDGAT1、RcDGAT1、HaDGAT1、AhDGAT1,根据Southern杂交结果,分别筛选到4、8、11、10个单拷贝转化事件,并且在棉花中均可正常表达;
  (3)SiDGAT1转基因棉花T2代Si-94、Si-99两个转化株系与对照相比含油量分别提高6.37%、7.41%,百粒重提高11.16%、4.94%;
  (4)对SiDGAT1转基因棉花进行脂质组分析,共鉴定到8大类型、26个亚类、902种脂质分子,筛选到25个差异脂质分子,其中包括14种TAG,碳原子数在56个以上、分子质量900以上的甘油三酯呈增长趋势(R2=0.6771、R2=0.6987);
  (5)利用CRISPR/Cas9敲除棉花色素腺体形成基因GhPGF_A12、GhPGF_D12,阳性植株无腺体表型率100%,叶片棉酚含量下降98.8%,并且无腺体表型可遗传。
[硕士论文] 王岳
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在油菜杂种优势利用实践中,甘蓝型油菜(Brassica napus L.)波里马细胞质雄性不育(polima cytoplasmic male sterility,简称pol CMS)是油菜最重要的雄性不育类型之一。杨光圣等(1995,1998)在两个甘蓝型油菜品种杂交后代中发现了低温可育、高温不育的温敏型波里马细胞质不育(Temperature-sensitive polima cytoplasmic male sterility,简称pol TCMS)现象。借在此基础上,选育出制种产量高、容易繁殖的pol TCMS两用系,并陆续组配“华油杂10号”等几十个通过国审或省审的杂交油菜新品种。这表明pol TCMS具有广阔的应用前景。
  杨光圣等(1997)对pol TCMS进行了较深入的研究,结果显示细胞核中的多个数量基因可能调控其温度敏感性。为了进一步深入研究pol TCMS的育性转换机制,本研究将温度敏感型不育系(Y402)和稳定可育型(Rf48)两种甘蓝型油菜在花芽分化的关键时期,分别置于25℃和10℃条件下培养,在育性转换的关键时期提取0.5mm花蕾RNA。通过转录组分析,对比鉴定出温度特异调控pol TCMS育性转换的相关基因;同时结合pol CMS恢复基因研究进展,初步探讨了pol TCMS受温度调控的分子机制。
  结果总结如下:
  1、通过Illumina HiSeq-150平台测序产出Raw data共155.893G,过滤后获得Clean data共154.736G。通过Hisat2将Clean data与甘蓝型油菜中双11的参考基因组进行比对,比对率在90%左右。通过StringTie进行转录本组装得到199589个unigenes,总长度267Mbp。
  2、研究中通过联合使用Ballgown和DEseq2进行差异表达基因分析,将高温样本与低温样本进行比较,以FDR<0.01,差异表达倍数2倍以上(即|Log2Ratio|>1)为阈值并过滤掉低质量unigenes,共得到Y402差异表达基因910个,其中上调基因439个、下调基因471;Rf48差异表达基因1808个,其中上调基因990个、下调基因818个。
  3、用Blast2GO对Y402的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析发现,高温环境下Y402下调基因功能集中在细胞组成、合成代谢、生殖生长三类,上调基因功能集中在光合作用、氧化还原反应等能量供给相关分类。KEGG富集分析结果与GO富集分析结果一致,并富集到pol CMS育性变化相关基因orf224/atp6所在的氧化磷酸化途径。该途径存在一个重要基因MSTRG.5508.4,其在高温环境下沉默,在低温环境下有较高表达量,认为其可能是本研究中高温环境下造成pol TCMS育性转化的关键基因。
  4、通过双重比对的方法,在Y402差异表达基因中筛选与育性相关基因。结果发现pol CMS育性保持基因rfp在高温下表达量下调;在生殖生长阶段赋予花蕾耐热性的基因SPL1和SPL12在高温下表达量下调;在减数分裂前期调控花药发育相关基因ROXY1、MYB65和ER等在高温下表达量下调。
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